PL167344B1 - Sposób otrzymywania proteinazy serynowej - Google Patents

Abstract

Sposób otrzymywania proteinazy serynowej, na drodze hodowli bakterii z rodzaju Bacillus, polegający na tym, że wysterylizowane podłoże, zawierające substancję stanowiącą źródło skrobi oraz ewentualnie kazeinę, zaszczepia się inokulumwyhodowanym uprzednio na podłożu o składzie analogicznym jak skład podłoża hodowli produkcyjnej i prowadzi hodowlę produkcyjną w obecności odpieniacza, w czasie której podłoże poddaje się mieszaniu i napowietrzaniu, znamienny tym, że przed sterylizacją składnik podłoża stanowiący źródło skrobi upłynnia się enzymatycznie lub na drodze hydrolizy kwasowej, ewentualnie w obecności pozostałych składników za wyjątkiem kazeiny, z której przygotowuje się odrębnie wodny roztwór o pH = 8-10, który miesza się z pozostałymiskładnikami podłoża dopiero po upłynnieniuskrobi i skorygowaniu pH do wartości 5,5, po czym tak przygotowane podłoże sterylizuje się przy pH = 6,3 - 6,7, zaś w czasie hodowli produkcyjnej podłoże napowietrza się stosując różne dawki powietrza w różnych etapach hodowli.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania proteinazy serynowej na drodze hodowli bakterii w rodzaju Bacillus.

Znane sposoby otrzymywania proteinazy serynowej na drodze hodowli bakterii z rodzaju Bacillus polegają na zaszczepieniu wyhodowanym wcześniej inokulum uprzednio zalkalizowanego i następnie wysterylizowanego podłoża hodowlanego zawierającego, między innymi, substancję stanowiącą źródło skrobi, na przykład mąkę ziemniaczaną oraz ewentaalnie kazeinę i hodowli produkcyjnej w obecności dużych ilości odpieniaczy, w czasie której podłoże poddaje się mieszaniu oraz napowietrzaniu z wysoką, stałą przez cały czas intensywnością.

Niedogodnością tych sposobów jest to, iż przez cały czas prowadzenia hodowli podłoże napowietrza się z jednakową, wysoką intensywnością, co znacznie podwyższa koszt procesu biosyntezy oraz sprzyj a silnemu pienieniu podłoża w czasie hodowli, co z kolei wiąże się z koniecznością stosowania znacznych ilości odpieniaczy. Stosowane w tych sposobach wieloskładnikowe podłoża oparte na mące ziemniaczanej i kazeinie wymagają stosowania alkalicznego pH przed sterylizacją i ich skład sprzy'a także silnemu pienieniu. Nadto stosunkowo niska jest wydajność większości z tych sposobów.

Sposób otrzymywania proteinazy serynowej, na drodze hodowli bakterii z rodzaju Bacillus, polegający na tym, że wysterylizowane podłoże, zawierające substancję stanowiącą źródło skrobi oraz ewentualnie kazeinę zaszczepia się inkulum wyhodowanym uprzednio na podłożu o składzie analogicznym jak skład podłoża produkcyjnego i prowadzi hodowlę produkcyjną w obecności odpieniacza, w czasie której podłoże poddaje się mieszaniu i napowietrzaniu, według wynalazku charakteryzuje się tym, że przed sterylizacją składnik podłoża stanowiący źródło skrobi upłynnia się enzymatycznie lub na drodze hydrolizy kwasowej ewentualnie w obecności pozostałych składników za wy'ątkiem kazeiny, z której przygotowuje się odrębnie roztwór wodny o pH = 8 - 10,który miesza się z pozostałymi

167 344 składnikami podłoża dopiero po upłynnieniu skrobi i skorygowaniu pH do wartości 5,5, po czym tak przygotowane podłoże sterylizuje się przy pH = 6,3 6,7, zaś w czasie hodowli produkcyjnej podłoże napowietrza się stosując różne dawki powietrza w różnych etapach hodowli.

Do co najmniej 8 godziny hodowli produkcyjnej powietrze doprowadza się w ilości nie większej niż 0,7 części objętościowych na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 minuty, do conajmniej 24 godziny hodowli doprowadza się powietrze w ilości nie większej niż 1,5 części objętościowych na 1 część objętościową podłoża na 1 minutę, zaś w końcowym etapie hodowli produkcyjnej powietrze doprowadza się w ilości nie większej niż 0,7 części objętościowych na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 minuty.

Sposób według wynalazku zapewnia uzyskanie nieoczekiwanie wysokich wydajności proteinazy serynowej sięgających 18-25 mjA (cm³) określonych metodą Ansona, wobec hemoglobiny o pH = 1θ,2). Nadto w sposobie według wynalazku zmniejszono około 10-krotnie, w stosunku do znanych sposobów, zużycie odpieniaczy oraz zmniejszono do minimum zużycie powietrza stosowanego do nadtleniania podłoża, co w sumie znacznie poprawia ekonomikę procesu produkcji proteinazy.

Sposób według wynalazku ilustruje bliżej niżej podany przykład nie ograniczając jego zakresu.

Przykład. Do 700 dm3 wody pitnej dodano 30 kg kazeiny i całość, w trakcie mieszania, podgrzewano do temperatury 90°C utrzymując pH na poziomie 8,0 - 9,0 za pomocą 20% roztworu KOH, aż do całkowitego rozpuszczenia kazeiny. Równolegle, w fermentorze o pojemności całkowitej 6 m3, przygotowano pozostałą część pożywki w następujący sposób: do fermentora wprowadzono 2 m3 wody pitnej, 140 kg mąki ziemniaczanej, 84 kg namoku kukurydzianego, 70 kg laktozy, 70 kg ZnSOą x 7H2O, 4,5 kg CaCl2 x 6H2O, 5,25 kg KH2PO4, skorygowano pH do 6, podgrzano zawartość fermentora do temperatury 50°C, dodano 175 cm³ enzymu alfa-amylazy BANL i ponownie ogrzewano zawartość fermentora w czasie 5 minut w temperaturze 80°C, następnie podgrzano do temperatury 90°C i schłodzono do temperatury 30°C oraz podwyższono pH do 5,5 za pomocą 20% roztworu KOH.

Roztwór kazeiny schłodzony do temperatury 30°C dodano do pozostałej części pożywki przygotowanej w fermentorze i po uzupełnieniu zawartości fermentora wodą pitną do

3,5 m3 i skorygowaniu pH za pomocą 20% roztworu KOH do wartości 6,5, prowadzono sterylizację podłoża w czasie 30 minut w temperaturze 121°C. Po schłodzeniu wysterylizowanego podłoża ustawiono jego pH na poziomie 8,1 za pomocą jałowego, 20% roztworu KOH. Jako materiał posiewowy do zaszczepienia podłoża hodowlanego użyto 90 dm3 14-godzinnego inokulu, otrzymanego w hodowli bakterii Bacillus subtilis lBTC-3 na podłożu o składzie opisanym wyżej, mieszanym z szybkością 180 rpm, napowietrzanym ze stałą intensywnością 1 część objętościową powietrza na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 minuty, prowadzonej przy nadciśnieniu 50 kPa w temperaturze 30°C. Hodowlę produkcyjną prowadzono w temperaturze 30°C, nadciśnieniu 50 kPa, przy szybkości obrotowej mieszadła 130 rpm. Podczas hodowli produkcyjnej podłoże hodowlane napowietrzano w następujący sposób: w ciągu pierwszych 5 godzin doprowadzono 0,6 części objętościowych powietrza na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 minuty, od 6 do 29 godziny hodowli wprowadzano 1 część objętościową powietrza w czasie 1 minuty, a od 30 do 36 godziny hodowli wprowadzano 0,7 części objętościowych powietrza na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 minuty. Do gaszenia piany stosowano odpieniacza UCON LB-625, którego zużyto około 3 dm3. Aktywność otrzymanej w ten sposób proteinazy serynowej (oznaczona metodą Ansona, wobec hemoglobiny o pH = 10,2) w trzech kolejnych hodowlach prowadzonych w opisany wyżej sposób wynosiła odpowiednio:

22,2 mjA/cm3, 18,5 mjA/cm3 i 23,2 mjA/cm3.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,50 zł

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania proteinazy serynowej, na drodze hodowli bakterii z rodzaju Bacillus, polegający na tym, że wysterylizowane podłoże, zawierające substancję stanowiącą źródło skrobi oraz ewentualnie kazeinę, zaszczepia się inokulum wyhodowanym uprzednio na podłożu o składzie analogicznym jak skład podłoża hodowli produkcyjnej i prowadzi hodowlę produkcyjną w obecności odpieniacza, w czasie której podłoże poddaje się mieszaniu i napowietrzaniu, znamienny tym, że przed sterylizacją składnik podłoża stanowiący źródło skrobi upłynnia się enzymatycznie lub na drodze hydrolizy kwasowej, ewentualnie w obecności pozostałych składników za wyjątkiem kazeiny, z której przygotowuje się odrębnie wodny roztwór o pH = 8-10, który miesza się z pozostałymi składnikami podłoża dopiero po upłynnieniu skrobi i skorygowaniu pH do wartości 5,5, po czym tak przygotowane podłoże sterylizuje się przy pH = 6,3 - 6,7, zaś w czasie hodowli produkcyjnej podłoże napowietrza się stosując różne dawki powietrza w różnych etapach hodowli.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do co najmniej 8 godzinnej' hodowli produkcyjnej powietrze doprowadza się w ilości nie większej niż 0,7 części objętościowych na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 minuty, do co najmniej 24 godzinnej hodowli produkcyjnej powietrze doprowadza się w ilości nie większej niż 1,5 części objętościowej na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 minuty, zaś w końcowym etapie hodowli produkcyjnej powietrze doprowadza się w ilości nie większej niż 0,7 części objętościowych na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 minuty.