PL113258B1 - Process for preparing novel derivatives of 2-aryl-1h-perimidine - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania no¬ wych pochodnych 2-arylo-lH-perimidyny o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza grupe o wzorze 2 lub 3, w których to wzorach R1 oznacza znajdujaca sie w pozycji ineta lub para grupe o wzorze -CF3, -OCF3, -SCF3 lub -OC2F5 oraz ich farmakologicznie dopuszczalnych soli.Znane sa 2-podstawione-lH-perimidyny i 2-podsta- wione-2,3-dwuwodoro-lH-perimidyny, które róznia sie od zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku.W artykule zamieszczonym w The Proc. Am. Assn.Caner Res. 3, 319 (1962) przedstawiono aktywnosc w ha¬ mowaniu rozwoju raka 2-(3,4-dwuchlorofenylo)-lH-benzo [d,e] chinazoliny, która w nomenklaturze stosowanej w niniejszym opisie jest takim samym zwiazkiem jak 2- (3,4- -dwuchlorofenylo)-lH-perimidyna. Publikacja ta wyraznie podaje, ze zwiazek „nie jest aktywny przy stosowaniu doustnym".W J. Het* Chem. 1, 108 (1964) przedstawiono nastepne badania zainspirowane przez ten artykul, w wyniku których wytworzono szereg 2-arylo-2,3-dwuwodoro-lH-perimidyn.Naleza do nich: 2-(p-chlorofenylo)-2,3-dwuwodoro-lH- -perimidyna, 2-(3,4-dwuchlorofenylo)-2,3-dwuwodorq-lH- -perimidyna i 2-(p-bromofenylo)-2,3-dwuwodoro-lH-peri- midyna. W publikacji tej nie wspomniano o jakiejkolwiek uzytecznosci tych zwiazków.Uzytecznosc powyzszej serii zwiazków jest jednakze przedstawiona w J. Mcd. Chem. 9 (4) 599 (1966). Trzy omawiane zwiazki wykazuja nieznaczna aktywnosc prze- ciwnowotworowa.Artykul w J. Org. Ghcm. 36, nr 11, 1477 (1971) opisuje 10 15 20 30 miedzy innymi, 2-podstawione-lH-perimidyny oraz ich sole z kwasem p-toluenosultonowym, obejmujace 2-fenylo- -lH-perimidyne, 2-(p-chlorofenylo)-lH-perimidyne i 2-(p- -metylofenylo)-lH-perimidyne oraz ich sole p-tolueno- sulfonianowe. Nie ma informacji odnosnie uzytecznosci.Podobnie w The Reakts. Sposobnost Org. Soedin. 6 (1) 47—54 (1969) (ang.) opisano 2-fenylo-lH-perimidyne, 2- - (p-tolilo)-lH-perimidyne, 2- (p-bromofenylo)-lH-perimi- dyne i 2-(m-bromofenylo)-lH-perimidyne, przy czym nie podano zadnego zastosowania.Obydwie nastepne publikacje dotycza glównie nowej syntezy 1,2-dwupodstawionych perimidyn. W opisie pa¬ tentowym ZSRR nr 504770 wspomniano o perimidynach, „które posiadaja aktywnosc biologiczna i moga znalezc zastosowanie w medycynie". Nie ma jednak zadnego wyjasnienia potwierdzajacego prawdziwosc tej informacji i wydaje sie, ze odnosi sie ona tylko do 1,2-dwupodsta¬ wionych zwiazków.W Khim. Farm. Zhur. 11 (5) 87—93 (1977) opisano dzialanie na osrodkowy uklad nerwowy 1,2-dwupodstawio¬ nych perimidyn i 2-(3,4-dwumetoksyfenylo) perimidyny.* Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku róznia sie od zwiazków przedstawionych w tych publikacjach tym, ze sa niepodstawione w pozycji 1 i maja inne podsta¬ wniki w pierscieniu fenylowym. Ponadto, zwiazki wytwa¬ rzane sposobem wedlug wynalazku hamuja reakcje odpor¬ nosciowe u ssaków, a takiego zastosowania nie sugeruje ani dzialanie na osrodkowy uklad nerwowy ani aktywnosc w hamowaniu rozwoju raka.Sposób wytwarzania nowych pochodnych 2-arylo-lH- 113 258113 258 *) Srednie wartosci dla grup skladajacych sie z 5 myszy.**) Próba kontrolna Próba z podawa- GVH — niem zwiazku •100- Procent hamo¬ wania Próba kontrolna Próba kontrolna GVH — wspólgenetycz- nosc ***)p<0,01 w porównaniu z próba kontrolna GVH.Poniewaz stwierdzono, ze w praktyce obie próby kon¬ trolne, zarówno na wspólgenetycznosc jak i normalna, zmienialy sie w kolejnych testach niewiele, przyjeto dla obliczen srednia wartosc (4,8) dla grupy 20 myszy, pocho¬ dzaca z przeliczenia wartosci z 4 oddzielnych grup kon¬ trolnych. Wyniki uzyskane z reakcji przeszczep-gospodarz przy stosowaniu zwiazków wytwarzanych sposobem we¬ dlug wynalazku zestawiono w tablicy 3.Tablica 3 Wplyw badanych zwiazków na reakcje GVH Zwiazek chlorowodorek 2-(p-trójfluoro- metylofenyIo)-lH- -perimidyny (doustnie) Próba kontrolna Dawka (mg/kg x x 13) 25 12,5 ^ 6,2 3,1 1,6 — Mg sledzio¬ ny/g ciezaru myszy (srednia, + standar¬ dowy blad) 4,75±0,42b 6,62 ±1,17 5,67±0,51d 4,96±0,31dc 5,66±0,33d 8,64 ±1,10 Procent hamo¬ wania* w reak¬ cjach GVH 101 53 . 77 96 78 a) Próba kontrolna Próba z podawa- GVH — niem zwiazku Próba kontrolna Próba kontrolna GVH — na wspólgenetycz¬ nosc b) p<0,005 c) p<0,01 d) p<0,05 •100= Procent hamo¬ wania 8 Wywolywany adjuwantem tesz na zapalenie stawów u szczurów.Chlorowodorek 2- (p-trójfluorometylofenylo)-lH-perimi- dyny testowano na zdolnosc hamowania obrzeku tylnej 5 lapy i uszkodzen kosci wywolanych podawaniem szczurom adjuwanta.W celu ilosciowego oznaczenia hamowania obrzeku spo¬ wodowanego zapaleniem stawów wywolanych podaniem adjuwanta, wyrózniano dwie fazy stanu zapalnego: 1) pier- 10 wsza i druga dla tylnych lap przy podawaniu zwiazku, oraz 2) druga przy niepodaWaniu zwiazku,'która zwykle zaczynala sie ujawniac po okolo 9 dniach od wywolania zapalenia. Zmniejszenie tego ostatniego typu zapalenia jest wskazówka wystepowania aktywnosci immunosupresyjnej, 15 jak to zostalo opisane przez Chang'a w Arth. Rheum., 20, 1125—1141 (1977).Jako typowy zwiazek przeciwzapalny stosowano dla celów porównawczych fenoprofen (30 mg/kg), zgodnie z tym co zostalo opisane przez Nickander*a i wspólpraco- 20 wników w Fed. Proc. Annual FASEB Mtgs., kwiecien 1971,.ABS 205.Zapalenie stawów wywolywano adjuwantem u szczurów plci meskiej szczepu Lewis-Wistar o ciezarze 200—210 g, droga jednokrotnej iniekcji pod podeszwe w prawa tylna 25 lape 0,1 ml 0,5% zawiesiny zabitego cieplem, liofilizowac nego Mycobacterium tuberculosis (Calbiochem-Perrigen-C) w oleju parafinowym. Jest to modyfikacja metody opisanej przez Wintera i wspólpracowników w Arth. Rheum. 9, 394—397 (1966). Takiemu traktowaniu poddano jedynie 30 jedna grupe 5 szczurów (grupa kontrolna TB). Inna grupa 5 szczurów nie poddanych powyzszemu traktowaniu byla grupa normalna, kontrolna. Kazdy testowany zwiazek zawieszano w 1% karboksymetylocelulozie i podawano za pomoca sondy grupom szczurów po 5 sztuk, w dawkach 35 dziennych wynoszacych 30 mg/kg, rozpoczynajac od pierw¬ szego dnia po wstrzyknieciu adjuwanta i kontynuujac podawanie w ciagu 17 dni od wstrzykniecia adjuwanta (17 dawek). Objetosc lap mierzono metoda wypierania rteci, stosujac cisnieniowy "przekaznik Statham i wolto- 40 mierz cyfrowy. Objetosc lap szczurów, którym wstrzy¬ kiwano i nie wstrzykiwano adjuwant mierzono 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 i 18 dnia. Po skrwaieniu zwierzat 18 dnia wy¬ konywano zdjecie rentgenowskie.Wyniki pomiarów objetosci lap szczurów, którym nie 45 podawano zwiazków,w dniach od 9 do 18, podano w tablicy 4.Tablica 4 Pomiary objetosci lap szczurów, którym nie podawano zwiazku, od 9 do 18 dnia Próba 1 Normalna kontrolna Próba TB Fenoprofen 2-(p-trójfluorometylofenylo)-lH- -perimidyna 9 dzien 1,99 ± 0,063 1,94 ± 0,028 1,97 ± 0,023 1,93 ± 0,081 11 dzien 2,13 ± 0,08 2,02 ± 0,037 2,11 ± 0,07 1,95 ± 0,079 14 dzien 2,08 ± 0,053 2,69 ± 0,106 2,38 ± 0,099 2,13 ± 0,148 16 dzien | 18 dzien | 2,15 ± 0,056 3,26 ± 0,202 2,7 ± 0,107 2,35 ± 0,233 3,01 ± 0,95 1 3,65 ± 0,227 2,67 ± 0,128 (23% hamowania)* 2,53 ± 0,39 (69% hamowania)*| *) % hamowania = 1 -»- objetosc w próbie z podawaniem zwiazku objetosc w próbie - normalnej objetosc w próbie TB objetosc w próbie - normalnej x 1009 Wiekszosc badan zdjec rentgenowskich lap obu powyz¬ szych grup szczurów wykazaly brak uszkodzen kosci u zwie¬ rzat, którym podawano chlorowodorek 2-(p-trójfluoro- metylofenylo)-lH-perimidyny. -Natomiast obserwowano .uszkodzenia kosci w grupie kontrolnej TB.Sposób wedlugwynalazku ilustruja nastepujaceprzyklady.Przyklad I. Wytwarzanie chlorowodorku 2-(p-trój- fluorometylofenylo)-lH-perimidyny / Do 500 ml benzenu dodaje sie podczas silnego mieszania w temperaturze pokojowej, jednoczesnie roztwór 31,64 g (0,20 mola) 1,8-dwuaminonaftalenu w 500 ml benzenu oraz roztwór 20,8 g (0,20 mola) chlorku p-trójfluorome- tylobenzoilu w 500 ml benzenu. Calosc miesza sie w ciagu okolo 0,5 godziny, oddziela osad i uciera go z* metanolem.Otrzymuje sie 24,6 g (wydajnosc 35%) produktu w postaci chlorowodorku o temperaturze topnienia 210 °C (z roz¬ kladem) i widmie masowym m/e 312.Analiza elementarna dla C!8H12N2C1F3: obliczono: C-61,99; H-3,47; N-8,03; Cl-10,17; F-16,34%; znaleziono: C-61,75; H-3,59; N-8,02; Cl-10,45; F-16,70%.Przykladu. Wytwarzanie chlorowodorku 2-(m- -trójfluorometylofenylo)-lH-perimidyny.Powtarza sie postepowanie z przykladu I, poddajac reakcji 15,82 g (0,10 mola) 1,8-dwuaminonaftalenu i 20,8 g (0,10 mola) chlorku m-trójfluorometylobenzoilu. Otrzy¬ muje sie 33,3 g (wydajnosc 95,4%) chlorowodorku 2- - (m-trójfluorometylofenylo) -lH-perimidyny o tempera¬ turze topnienia 280°C (z rozkladem) i widmie masowym m/e312.Analiza elementarna dla CjgH^NaClFa: obliczono: C-61,99; H-3,47; N-8,03%; znaleziono: 'C^61,68; H-3,59; N-8,13%.Przyklad III. Wytwarzanie fluorowodorku 2- (p- -trójfluorometoksyfenylo)-lHperimididyny.W 25 ml toluenu rozpuszcza sie 1,52 g (0,0096 mola) 1,8-dwuaminonaftalenu a nastepnie dekantuje. 2 g (0,0096 mola) fluorku p-trójfluorometoksybenzoilu rozpuszcza sie równiez w 25 ml toluenu. Obydwa roztwory dodaje sie równoczesnie do 25 ml toluenu. Mieszanine reakcyjna miesza sie przez okolo 4 godziny, po czym poddaje chro¬ matografii cienkowarstwowej, która wykazuje, ze reakcja jest zakonczona. Mieszanine saczy sie a uzyskany zólty • osad suszy otrzymujac 2,72 g (wydajnosc 81,4%) produktu o temperaturze topnienia 195°C (z rozkladem) i widmie masowym m/s 325 z mniejszymi pikami przy 361 wska¬ zujacymi na obecnosc sladowych ilosci -OCFCi2.Analiza elementarna dla C18H12F4N20: obliczono: C-62,07; H-3,47; N-8,04; F-21,82%; znaleziono: C-61,81; H-3,58; N-8,13; F-21,59%.Przyklad IV. Wytwarzanie chlorowodorku 2-(p- -trójfluorometylotiofenylo)-lH-perimidyny.Powtarza sie postepowanie z przykladu III, poddajac reakcji 14,5 g (0,092 mola) 1,8-dwuaminonaftalenu i 22,2 g (0,092 mola) chlorku p-trójfluorometylotiobenzoilu. Otrzy¬ muje sie 31,86 g (wydajnosc 91,0%) produktu o tempera¬ turze topnienla 276°C (z rozkladem) i widmie masowym m/e344. Produkt zawiesza sie w 500 ml toluenu i miesza przez okolo 2 godziny, a nastepnie oddziela przez odsacze¬ nie otrzymujac 30,6 g (wydajnosc 87,4%) produktu o tem¬ peraturze topnienia 270 °C (z rozkladem). Produkt ten ponownie zawiesza sie w 750 ml toluenu, gotuje przez 2 godziny i oddziela przez Odsaczenie otrzymujac 29,7 g (wydajnosc 84,8%). 3 258 10 Analiza elementarna dla C18H]2C1F3N2S: obliczono: C-56,77; H-3,18; N-7,36%; znaleziono: C-56,57; H-3,37; N-7,40%.Przyklad V. Wytwarzanie chlorowodorku 2-(p-pie- ciofluoroetoksyfenylo)-lH-perimidyny.Powtarza sie postepowanie z przykladu III, poddajac reakcji 1,04 g (0,00656 mola) 1,8-dwuaminonaftalenu i 1,8 g (0,00656 mola) chlorku p-pieciofluoroetoksybenzoilu otrzymuje sie 2,25 g (wydajnosc 82,7%) produktu o tem¬ peraturze topnienia 240 °C (z rozkladem) i widmie ma¬ sowym m/e 378.Analiza elementarna dla C19H12C1F5N20: 15 obliczono: C-55,02; H-2,92; N-6,75; F-22,90%; znaleziono: C-54,82; H-3,15; N-6,49; F-23,20%.Przyklad VI. Wytwarzanie 2,3-dwuwodoro-2-(p- -trójfluorometylofenylo)-1H-perimidyny.Roztwór zawierajacy 15,8 g (0,10 mola) 1,8-dwuamino- 20 naftalenu, 17,4 g (0,10 mola) aldehydu p-trójfluoromety- lobenzoesowego i 1 litr ksylenu ogrzewa sie w stanie wrzenia pod chlodnica zwrotna przez 24 godziny, odparowuje sie rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem otrzymujac 37,5 g surowego produktu, który oczyszcza sie na zelu 25 krzemionkowym i eluuje toluenem. Uzyskuje sie 22,93 g (wydajnosc 73%) produktu o temperaturze topnienia 119—122°C i widmie masowym m/e 314.Analiza elementarna dla C18H13N2F3: obliczono: C-68,78; H-4,17; N-8,91%; 30 znaleziono: C-68,69; H-4,40; N-9,11%.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych 2-arylo- -lH-perimidyny o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza 35 grupe o wzorze 2, w którym R1 oznacza znajdujaca sie w po¬ zycji meta lub para grupe o wzorze -CF3 oraz ich farmakolo¬ gicznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, ze 1,8-dwu- aminonaftalen o wzorze 4 poddaje sie kondensacji z po¬ chodna acylowa o wzorze 5, w którym R1 ma wyzej podane 40 znaczenie a X oznacza atom.fluoru, chloru lub bromu. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 1,8-dwu- aminonaftalen poddaje sie reakcji z chlorkiem p-trójfluoro- metylobenzoilu, otrzymujac 2- (p-trójfluorometylofenylo)- -lH-perimidyne. . 45 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 1,8- -dwuaminonaftalen poddaje sie reakcji z chlorkiem m- -trójfluorometylobenzoilu, otrzymujac 2-(m-trójfluorome- tylofenylo)-lH-perimidyne. 4. Sposób wytwarzania nowych pochodnych 2-arylo-lH- 50 -perimidyny o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza grupe o wzorze 3, w którym R1 oznacza znajdujaca sie w pozycji meta lub para grupe o wzorze -CF3, oraz ich farmakologicznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, ze 1,8-dwuaminonaftalen o wzorze 4 poddaje sie konden- 55 sacji z aldehydem o wzorze 5, w którym R1 ma wyzej podane znaczenie, a X oznacza atom wodoru. 5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze 1,8- -dwuaminonaftalen poddaje sie reakcji z aldehydem p- -trójfluorometylobenzoesowym, otrzymujac 2,3-dwuwodo- 60 ro-2-(p-trójfluorometylofenylo)-lH-perimidyne. 6. Sposób wytwarzania nowych pochodnych 2-arylo-lH- -perimidyny o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza grupe o wzorze 2, w którym R1" oznacza znajdujaca sie w pozycji meta lub para grupe o wzorze -OCF3, -SCF3 65 lub -OC2F5 oraz ich farmakologicznie dopuszczalnych soli,113 258 -perimidyny o ogólnym wzorze 1, w którym R ma wyzej podane znaczenie, polega wedlug wynalazku na tym, ze 1,8-dwuaminonaftalen o wzorze 4 poddaje sie kondensacji ze zwiazkiem o ogólnym wzorze 5, w którym R1 ma wyzej podane znaczenie a X oznacza atom fluoru, chloru, bromu lub wodoru.We wzorze 1, atom wegla grupy o wzorze 2 lub 3 znaj¬ duje sie zawsze miedzy dwoma atomami azotu tak, ze wzór ogólny 1 oznacza tylko dwa typy struktur okreslonych wzorami 6 i 7, w których R1 ma wyzej podane znaczenie.Zwiazki o wzorze 6 otrzymuje sie wówczas, gdy X oznacza atom fluoru, chloru lub bromu a zwiazki o Wzorze 7 otrzy¬ muje sie wtedy, gdy X oznacza atom wodoru. Odpowiednie informacje mozna znalezc w J. Het. Ghem. 1, 108 (1964), J. Org. Chem. 36 (11), 1477 (1971) oraz w cytowanych tam odnosnikach Wiekszosc wyjsciowych zwiazków o wzorze 5 jest znana i wszystkie wytwarza sie typowymi sposobami. Fluorki m- i p-trójfluorometoksybenzoilu otrzymuje sie na drodze chlorowania m- lub p-metoksybenzoesanu alkilu i reakcji otrzymanego chlorku m- lub p-trójchlorometoksybenzoilu z mieszanina SbF3 i SbCl3.Chlorki m- lub p-trójfluorometylotiobenzoilu otrzymuje sie na drodze reakcji m- lub p-jodobenzoesanu alkilu z Hg(SCF3)2, hydrolizy otrzymanego m- lub p-trójfluoro- metylotiobenzoesanu alkilu i przeksztalcenia wolnego kwasu w chlorek kwasowy za pomoca np. SOCl2.Chlorki m- lub p-pieciofluoroetoksybenzoilu wytwarza sie nastepujaco: m- lub p-bromofenol acyluje sie bezwo¬ dnikiem kwasu trójfluorooctowego otrzymujac trójfluoro- octan m- lub p-bromofenylu, który poddaje sie reakcji z SF4 z wytworzeniem bromku m- lub p-pieciofluoro- etoksyfenylu. Zwiazek ten przeksztalca sie w odpowiedni kwas na drodze reakcji z butylolitem i C02, a nastepnie w chlorek kwasowy w reakcji z SOCl2. Odpowiednie alde¬ hydy, stosowane w procesie wytwarzania zwiazków o wzorze 7 otrzymuje si^ z halogenków kwasowych znanymi spo¬ sobami.Zwiazki o ogólnym wzorze 1 znajduja zastosowanie do hamowania reakcji odpornosciowych u ssaków. W zakres tego hamowania wchodzi hamowanie reakcji odpornoscio¬ wych wystepujacych w przypadku, gdy organizm ssaka wytwarza przeciwciala i aktywne komórki w odpowiedzi na obecnosc obcego bialka. Dzialanie immunosupresyjne wykorzystuje sie praktycznie w rózny sposób. Podstawowe zastosowanie ma miejsce podczas transplantacji organów, ale mozna je takie z powodzeniem wykorzystywac w terapii róznych schorzen, znanych pod wspólna nazwa chorób autoagresywnych. Naleza do nich takie jak autoagresywna niedokrwistosc hemolityczna, idiopatyczna purpura trom- bocytopeniczna, liszaj rumieniowaty, toczen watrobowy, toczen nerkowy, zapalenie klebków nerwowych, zespól zapalenia nerek, zespól Goodpasture'a, ziarniak Wegenefa, stwardnienie skóry, choroba Sezary'ego, luszczyca, zapa¬ lenie jagodówki, goscowe zapalenie stawów, wrzodowe zapalenie okreznicy, zapalenie tarczycy, swinka i zapalenie, jader.Zwiazki a wzorze 1 mozna podawac doustnie lub poza¬ jelitowe. Dokladna ilosc podawanego srodka aktywnego zmienia sie w zaleznosci od rodzaju zwiazku. Omawiane zwiazki maja jednak tak wysoki indeks terapeutyczny, ze skuteczne, nietoksyczne dawki obejmuja w kazdym przy¬ padku bardzo szeroki zakres. W zaleznosci od sposobu testowania, wielkosc dawek dla bardziej aktywnych zwia- 15 20 25 30 zków wynosi w przypadku malych ssaków <1,6 do 25 mg/kg dziennie.Dla innych zwiazków wielkosc dawki dziennej w 'przy¬ padku malych ssaków wynosi do 100 mg/kg lub wiecej. 5 Biorac po uwage zaleznosc miedzy dawkami dla malych i duzych zwierzat obserwowana w przypadku innych leków, obliczona skuteczna dawka dla ludzi powinna od¬ powiednio wynosic 0,5—10 mg/kg i byc nizsza dla malych ssaków. Na przyklad dawka dzienna dla ludzi srodka 10 immunosupresyjnego azatioprinu wynosi na ogól *1—2 mg/kg a dla myszy w przyblizeniu 50 mg/kg (patrz Cancer Chemotherapy Reports, 50, 219, 1966).Zwiazki o wzorze 1 korzystnie podaje sie w postaci preparatów farmaceutycznych. Typy preparatów far¬ maceutycznych sa dobrze znane w farmacji. W celu sporza¬ dzenia preparatu zawierajacego aktywny zwiazek o wzorze 1, wybrany zwiazek miesza sie z nosnikiem, takim jak laktoza, dekstroza, sacharoza, sorbit, mannit, skrobia, guma arabska, fosforan wapniowy, alginiany, guma tra- gantowa, zelatyna, metyloceluloza, talk, stearynian mag¬ nezu lub ciekla parafina. Preparaty mozna sporzadzic w postaci tabletek, zawiesin lub kapsulek. Dla stosowania pozajelitowego zwiazki przygotowuje sie w postaci roz¬ tworów do iniekcji.Korzystny preparat zawiera dawke jednostkowa prze¬ znaczona do podawania doustnego w celu uzyskania dzia¬ lania immunosupresyjnego, to znaczy zawiera w poje¬ dynczej dawce immunosupresyjna, nietoksyczna ilosc zwiazku aktywnego, wynoszaca od okolo 10 do okolo 1000 mg, oraz rozcienczalnik farmaceutyczny.Zwiazki o wzorze 1 badano w nastepujacych testach.Badanie hemoagultynacji u myszy po podaniu doustnym. Grupom skladajacym sie z- pieciu myszy 35 o ciezarze 20 g, plci meskiej losowo wybranym z rasy Swiss, podano w postaci iniekcji dozylnej 5 x 107 czerwo¬ nych cialek krwi owcy. Cialka do powyzszej iniekcji spo¬ rzadzono z krwi cielat przechowywanej w roztworze Ai- sever'a droga trzykrotnego przemycia 0,85% roztworem ^ chlorku sodowego i nastepnie zawieszenia tez w 0,85% roztworze chlorku sodowego. Dziewiec dawek dziennych kazdego testowanego zwiazku rozpuszczonego w glikolu polietylenowym 400 podawano doustnie, stosujac dawke 0,1 ml i rozpoczynajac podawanie trzy dni przed wstrzy- 45 kniecjem czerwonych cialek krwi.Stosowano kilka róznej wielkosci dawek kazdego zwiazku z dwukrotnym nadmiarem. Grupom kontrolnym myszy otrzymujacych czerwone cialkav krwi podawano dziewiec * dziennych dawek nosnika zamiast leku. Po uplywie szesciu 50 dni od wstrzykniecia antygenu myszy skrwawiano przez uklucie w serce i zbierano surowice z kazdej grupy 5 myszy* Po calkowitej dezaktywacji zebrana surowice badano na' zawartosc hemaglutynin, stosujac .standardowe poste¬ powanie i mieszanine dwukrotnych seryjnych rozcienczen 55 testowanej surowicy za pomoca roztworu chlorku sodowego z 0,5% zawiesinami czerwonych cialek krwi owcy, w plas¬ tykowych tackach. Po inkubowaniu w tackach w ciagu 3 godzin w temperaturze 37 °C oceniano poziom hema- glutynacji. Czterokrotne (75%) lub wieksze zmniejszenie 60 poziomu przeciwcial w surowicy testowanej, w stosunku do surowicy kontrolnej, przyjmowano za wynik znaczacy.Wyniki wyrazono w postaci najmniejszej dawki skutecznej (MED), którym to mianem okresla sie- najnizsza dawke leku wywolujaca. 75% lub wieksze zmniejszenie poziomu 65 przeciwcial.113 258 5 6 Wyniki testów zwiazków o wzorze 1 na ich zdolnosc zmniejszania wytwarzania przeciwcial zestawiono w ta¬ blicy 1. Stosowany klinicznie srodek immunosupresyjny azatioprin (Imuran) w powyzszym tescie wykazywal wartosc MED wynoszaca -100 mg/kg x 9.Tablica 1 Zwiazek chlorowodorek 2- (p-trójfluorometylo- fenylo)-1H-p erimidyny chlorowodorek 2- (m-trójfluorometylo- fenylo)-1H-perimidyny fluorowodorek 2- (p-trójfluorometoksy- fenylo)-lH-perimidyny chlorowodorek 2- (p-trójfluorometylo- fenylo)-lH-perimidyny chlorowodorek 2- (p-pieciofluoroetoksy- fenylo)-lH-perimidyny MED mg/kg x 9 (doustnie) 6,25 100 <100 <100 100 Indywidualne badanie surowicy. W tych testach zmodyfikowano poprzednie postepowanie, stosujac grupy po 10 myszy zamiast 5. Myszy skrwawiano jak poprzednio ale miano surowicy oznaczano indywidualnie a nie grupowo.Dla kazdej grupy 10 myszy obliczano srednie wartosci hemaglutynin (log2 ze standardowym bledem) oraz wartosci p za pomoca testu Studenta, odnoszac te wartosci do grupy kontrolnej. Najmniejsza dawke leku (p <0,05) obnizajaca w sposób znaczacy miano przeciwcial przyjmo¬ wano za punkt koncowy. Leki podawano doustnie lub podskórnie w dziesieciu dziennych dawkach, rozpoczyna¬ jac podawanie trzy dni przed wstrzyknieciem czerwonych cialek krwi. Leki zawieszano w nosniku skladajacym sie z roztworu chlorku sodowego zawierajacego 0,125% metylocelulozy i 0,2% niejonowego emulgatora. Ozna¬ czanie przeciwcial (hemaglutynin) wykonywano po uplywie siedmiu dni od wstrzykniecia czerwonych cialek krwi.Typowe wyniki otrzymane podczas indywidualnego tes¬ towania surowicy z zastosowaniem reprezentatywnych zwiazków o wzorze 1 przedstawiono w tablicy 2.Tablica 2 Aktywnosc immunosupresyjna zwiazków (Indywidualne badanie surowicy) , Zwiazek J ¦¦"* chlorowodorek 2-(p- -trójfluorometylofeny- lo)-lH-perimidyny fluorowodorek 2- (p- -trójfluorometoksy- fenylo)-lH-perimidyny chlorowodorek 2-(p- -trójfluorometylofeny- | lo)-lH-perimidyny | Sposób podawania doustnie podskórnie - doustnie doustnie Dawka w punkcie koncowym (p<0,05) w mg/kg x 10 | 1 * 1 <1,6 <1,6 12,5 5,0 1 10 15 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Reakcja przeszezep-gospodarz (GVH). W tescie tym myszom szczepu mieszanego F!(C57BL x C3H) podawano pozajelitowo komórki sledziony myszy szczepu (C57BL). Myszy biorcy nie odrzucaly wstrzyknietych komórek, gdyz hybryda rozpoznawala antygen ze szczepu C57BL od jej homozygotycznych rodziców jako „swój".Wstrzykniete komórki'wywoluja jednak reakcje w stosunku do tkanki biorcy na skutek obecnosci obcego, pochodzacego od C3H antygenu. W rezultacie tego sledziona biorcy powiekszala sie. Immunosupresja zapobiega lub zmniejsza powiekszanie sledziony. Tak wiec, ciezar sledziony jest miara reakcji GVH i jej hamowania w wyniku immuno¬ supresji.Stosowano zmodyfikowana metode Simonsen'a opisa¬ na w Ann. N.Y. Acad. Sci., 73, 834 (1958). Uzyskiwano duze porcje komórek sledziony bez stosowanego powszech¬ nie recznego rozdrabniania sledziony, stosujac mieszal¬ niki Waring'a z odwróconymi ostrzami tnacymi. Dwu¬ krotne, trwajace po szesc sekund, mieszanie rozdrabnialo sledziony (porcje od 25 myszy C57BL w 25 ml roztworu chlorku sodowego) wystarczajaca dla zwolnienia komórek z tkanki lacznej. Tkanke laczna usuwano poprzez saczenie przez tkanine bawelniana o róznej grubosci. Uzyskana w ten sposób zawiesine komófek standaryzowano stosujac licznik komorowy Leyy^go-Hausse^a i otrzymujac 6 X X 108 jadrzastych komórek w mililitize. Grupom po 10 myszy szczepu C57B1 x C3H o ciuezarze 16—18 g wstrzy¬ kiwano dootrzewnowo 1 ml zawiesiny komórek dawcy.Zwiazki rozpoczynano podawac doustnie lub podskórnie w ilosci 0,2 ml trzy dni przed wstrzyknieciem komórek i podawano lacznie w ciagu 13 dni. Zwierzeta kontrolne otrzymywaly tylko komórki i nosnik. Sledziony usuwano i wazono po uplywie 10 dni od wstrzykniecia komórek.Wyniki przedstawiono jako stosunek mg ciezaru sledziony do gramów ciezaru ciala.Poniewaz wstrzykiwanie myszom biorcom komórek wspólgenetycznych, to znaczy myszy C57BL x C3H, wywoluje w malym stopniu rozrost sledziony, ciezary sledziony tych zwierzat przyjeto jako miare 100% hamo¬ wania reakcji GVH podczas obliczania procentu hamowania przez zwiazki immunosupresyjne. Sposób obliczania przed¬ stawia tablica 3 dla myszy, którym podawano zwiazek immunosupresyjny.Ta Podawany zwiazek 1-(6-metoksy-2-ben- zotiazolilo)-2-fenylo- mocznik (J. Med.Chem., 12,1016—1018, 1969), 12,5 mg/kg x x 13, doustnie Nie podawano (próba kontrolna GVH) Nie podawano (próba kontrolna na Wspól- genetycznosc) Nie podawano (nor¬ malna próba kontrolna) blica 3 Mg sledziony/g ciezaru ciala (± standardo¬ wy blad)* . ,6,86 ± 0,80*** 11,55 ± 1,01 5,20 ± 0,37 4,16 ± 0,17 Procent hamowania** - 74 0 100 — |113 258 11 znamienny tym, ze 1,8-dwuaminonaftalen o wzorze 4 poddaje sie kondensacji z pochodna acylowa o wzorze 5, w którym R1 ma wyzej podane znaczenie a X oznacza atom fluoru, chloru lub bromu. 7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze 1,8- -dwuaminonaftalen poddaje sie reakcji z fluorkiem p- -trójfluorometoksybenzoilu, otrzymujac 2- (p-trójfluorome- toksyfenylo)-lH-perimidyne. 8. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze 1,8- -dwuaminonaftalen poddaje sie reakcji z chlorkiem p-trój- fluorometylotiobenzoilu, otrzymujac 2- (p-trójfluorometylo- tiofenylo)-lH-perimidyne. 10 12 9. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze 1,8- -dwuaminonaftalen poddaje sie reakcji z chlorkiem p- -pieciofluoroetoksybenzoilu, otrzymujac 2- (p-pieciofluoro- etoksy)-lH-perimidyne. 10. Sposób wytwarzania nowych pochodnych 2-arylo-lH- -perimidyny o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza grupe o wzorze 3, w którym R1 oznacza znajdujaca sie w pozycji meta lub para grupe o wzorze -OCF3, -SCF3 lub -OC2F5 oraz ich farmakologicznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, ze 1,8-dwuaminonaftalen o wzorze 4 poddaje sie kondensacji z aldehydem o wzorze 5, w którym R1 ma wyzej podane znaczenie, a X oznacza atom wodoru.NH-R wzor Ro-*-x / wzór i ,V 2 NH / wzór 3 n\\mt wzór ?V 4 wzór S wzór 6 wzór LDD Z-d 2, z. 1093/1400/81, n. 90 + 20 egz.Cena 100 zl PL PL PL

Claims (2)

1.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych 2-arylo- -lH-perimidyny o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza 35 grupe o wzorze 2, w którym R1 oznacza znajdujaca sie w po¬ zycji meta lub para grupe o wzorze -CF3 oraz ich farmakolo¬ gicznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, ze 1,8-dwu- aminonaftalen o wzorze 4 poddaje sie kondensacji z po¬ chodna acylowa o wzorze 5, w którym R1 ma wyzej podane 40 znaczenie a X oznacza atom.fluoru, chloru lub bromu.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 1,8-dwu- aminonaftalen poddaje sie reakcji z chlorkiem p-trójfluoro- metylobenzoilu, otrzymujac 2- (p-trójfluorometylofenylo)- -lH-perimidyne. . 453. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 1,8- -dwuaminonaftalen poddaje sie reakcji z chlorkiem m- -trójfluorometylobenzoilu, otrzymujac 2-(m-trójfluorome- tylofenylo)-lH-perimidyne.4. Sposób wytwarzania nowych pochodnych 2-arylo-lH- 50 -perimidyny o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza grupe o wzorze 3, w którym R1 oznacza znajdujaca sie w pozycji meta lub para grupe o wzorze -CF3, oraz ich farmakologicznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, ze 1,8-dwuaminonaftalen o wzorze 4 poddaje sie konden- 55 sacji z aldehydem o wzorze 5, w którym R1 ma wyzej podane znaczenie, a X oznacza atom wodoru. 5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze 1,8- -dwuaminonaftalen poddaje sie reakcji z aldehydem p- -trójfluorometylobenzoesowym, otrzymujac 2,3-dwuwodo- 60 ro-2-(p-trójfluorometylofenylo)-lH-perimidyne. 6. Sposób wytwarzania nowych pochodnych 2-arylo-lH- -perimidyny o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza grupe o wzorze 2, w którym R1" oznacza znajdujaca sie w pozycji meta lub para grupe o wzorze -OCF3, -SCF3 65 lub -OC2F5 oraz ich farmakologicznie dopuszczalnych soli,113 258 -perimidyny o ogólnym wzorze 1, w którym R ma wyzej podane znaczenie, polega wedlug wynalazku na tym, ze 1,8-dwuaminonaftalen o wzorze 4 poddaje sie kondensacji ze zwiazkiem o ogólnym wzorze 5, w którym R1 ma wyzej podane znaczenie a X oznacza atom fluoru, chloru, bromu lub wodoru. We wzorze 1, atom wegla grupy o wzorze 2 lub 3 znaj¬ duje sie zawsze miedzy dwoma atomami azotu tak, ze wzór ogólny 1 oznacza tylko dwa typy struktur okreslonych wzorami 6 i 7, w których R1 ma wyzej podane znaczenie. Zwiazki o wzorze 6 otrzymuje sie wówczas, gdy X oznacza atom fluoru, chloru lub bromu a zwiazki o Wzorze 7 otrzy¬ muje sie wtedy, gdy X oznacza atom wodoru. Odpowiednie informacje mozna znalezc w J. Het. Ghem. 1, 108 (1964), J. Org. Chem. 36 (11), 1477 (1971) oraz w cytowanych tam odnosnikach Wiekszosc wyjsciowych zwiazków o wzorze 5 jest znana i wszystkie wytwarza sie typowymi sposobami. Fluorki m- i p-trójfluorometoksybenzoilu otrzymuje sie na drodze chlorowania m- lub p-metoksybenzoesanu alkilu i reakcji otrzymanego chlorku m- lub p-trójchlorometoksybenzoilu z mieszanina SbF3 i SbCl3. Chlorki m- lub p-trójfluorometylotiobenzoilu otrzymuje sie na drodze reakcji m- lub p-jodobenzoesanu alkilu z Hg(SCF3)2, hydrolizy otrzymanego m- lub p-trójfluoro- metylotiobenzoesanu alkilu i przeksztalcenia wolnego kwasu w chlorek kwasowy za pomoca np. SOCl2. Chlorki m- lub p-pieciofluoroetoksybenzoilu wytwarza sie nastepujaco: m- lub p-bromofenol acyluje sie bezwo¬ dnikiem kwasu trójfluorooctowego otrzymujac trójfluoro- octan m- lub p-bromofenylu, który poddaje sie reakcji z SF4 z wytworzeniem bromku m- lub p-pieciofluoro- etoksyfenylu. Zwiazek ten przeksztalca sie w odpowiedni kwas na drodze reakcji z butylolitem i C02, a nastepnie w chlorek kwasowy w reakcji z SOCl2. Odpowiednie alde¬ hydy, stosowane w procesie wytwarzania zwiazków o wzorze 7 otrzymuje si^ z halogenków kwasowych znanymi spo¬ sobami. Zwiazki o ogólnym wzorze 1 znajduja zastosowanie do hamowania reakcji odpornosciowych u ssaków. W zakres tego hamowania wchodzi hamowanie reakcji odpornoscio¬ wych wystepujacych w przypadku, gdy organizm ssaka wytwarza przeciwciala i aktywne komórki w odpowiedzi na obecnosc obcego bialka. Dzialanie immunosupresyjne wykorzystuje sie praktycznie w rózny sposób. Podstawowe zastosowanie ma miejsce podczas transplantacji organów, ale mozna je takie z powodzeniem wykorzystywac w terapii róznych schorzen, znanych pod wspólna nazwa chorób autoagresywnych. Naleza do nich takie jak autoagresywna niedokrwistosc hemolityczna, idiopatyczna purpura trom- bocytopeniczna, liszaj rumieniowaty, toczen watrobowy, toczen nerkowy, zapalenie klebków nerwowych, zespól zapalenia nerek, zespól Goodpasture'a, ziarniak Wegenefa, stwardnienie skóry, choroba Sezary'ego, luszczyca, zapa¬ lenie jagodówki, goscowe zapalenie stawów, wrzodowe zapalenie okreznicy, zapalenie tarczycy, swinka i zapalenie, jader. Zwiazki a wzorze 1 mozna podawac doustnie lub poza¬ jelitowe. Dokladna ilosc podawanego srodka aktywnego zmienia sie w zaleznosci od rodzaju zwiazku. Omawiane zwiazki maja jednak tak wysoki indeks terapeutyczny, ze skuteczne, nietoksyczne dawki obejmuja w kazdym przy¬ padku bardzo szeroki zakres. W zaleznosci od sposobu testowania, wielkosc dawek dla bardziej aktywnych zwia- 15 20 25 30 zków wynosi w przypadku malych ssaków <1,6 do 25 mg/kg dziennie. Dla innych zwiazków wielkosc dawki dziennej w 'przy¬ padku malych ssaków wynosi do 100 mg/kg lub wiecej. 5 Biorac po uwage zaleznosc miedzy dawkami dla malych i duzych zwierzat obserwowana w przypadku innych leków, obliczona skuteczna dawka dla ludzi powinna od¬ powiednio wynosic 0,5—10 mg/kg i byc nizsza dla malych ssaków. Na przyklad dawka dzienna dla ludzi srodka 10 immunosupresyjnego azatioprinu wynosi na ogól *1—2 mg/kg a dla myszy w przyblizeniu 50 mg/kg (patrz Cancer Chemotherapy Reports, 50, 219, 1966). Zwiazki o wzorze 1 korzystnie podaje sie w postaci preparatów farmaceutycznych. Typy preparatów far¬ maceutycznych sa dobrze znane w farmacji. W celu sporza¬ dzenia preparatu zawierajacego aktywny zwiazek o wzorze 1, wybrany zwiazek miesza sie z nosnikiem, takim jak laktoza, dekstroza, sacharoza, sorbit, mannit, skrobia, guma arabska, fosforan wapniowy, alginiany, guma tra- gantowa, zelatyna, metyloceluloza, talk, stearynian mag¬ nezu lub ciekla parafina. Preparaty mozna sporzadzic w postaci tabletek, zawiesin lub kapsulek. Dla stosowania pozajelitowego zwiazki przygotowuje sie w postaci roz¬ tworów do iniekcji. Korzystny preparat zawiera dawke jednostkowa prze¬ znaczona do podawania doustnego w celu uzyskania dzia¬ lania immunosupresyjnego, to znaczy zawiera w poje¬ dynczej dawce immunosupresyjna, nietoksyczna ilosc zwiazku aktywnego, wynoszaca od okolo 10 do okolo 1000 mg, oraz rozcienczalnik farmaceutyczny. Zwiazki o wzorze 1 badano w nastepujacych testach. Badanie hemoagultynacji u myszy po podaniu doustnym. Grupom skladajacym sie z- pieciu myszy 35 o ciezarze 20 g, plci meskiej losowo wybranym z rasy Swiss, podano w postaci iniekcji dozylnej 5 x 107 czerwo¬ nych cialek krwi owcy. Cialka do powyzszej iniekcji spo¬ rzadzono z krwi cielat przechowywanej w roztworze Ai- sever'a droga trzykrotnego przemycia 0,85% roztworem ^ chlorku sodowego i nastepnie zawieszenia tez w 0,85% roztworze chlorku sodowego. Dziewiec dawek dziennych kazdego testowanego zwiazku rozpuszczonego w glikolu polietylenowym 400 podawano doustnie, stosujac dawke 0,1 ml i rozpoczynajac podawanie trzy dni przed wstrzy- 45 kniecjem czerwonych cialek krwi. Stosowano kilka róznej wielkosci dawek kazdego zwiazku z dwukrotnym nadmiarem. Grupom kontrolnym myszy otrzymujacych czerwone cialkav krwi podawano dziewiec * dziennych dawek nosnika zamiast leku. Po uplywie szesciu 50 dni od wstrzykniecia antygenu myszy skrwawiano przez uklucie w serce i zbierano surowice z kazdej grupy 5 myszy* Po calkowitej dezaktywacji zebrana surowice badano na' zawartosc hemaglutynin, stosujac .standardowe poste¬ powanie i mieszanine dwukrotnych seryjnych rozcienczen 55 testowanej surowicy za pomoca roztworu chlorku sodowego z 0,5% zawiesinami czerwonych cialek krwi owcy, w plas¬ tykowych tackach. Po inkubowaniu w tackach w ciagu 3 godzin w temperaturze 37 °C oceniano poziom hema- glutynacji. Czterokrotne (75%) lub wieksze zmniejszenie 60 poziomu przeciwcial w surowicy testowanej, w stosunku do surowicy kontrolnej, przyjmowano za wynik znaczacy. Wyniki wyrazono w postaci najmniejszej dawki skutecznej (MED), którym to mianem okresla sie- najnizsza dawke leku wywolujaca. 75% lub wieksze zmniejszenie poziomu 65 przeciwcial.113 258 5 6 Wyniki testów zwiazków o wzorze 1 na ich zdolnosc zmniejszania wytwarzania przeciwcial zestawiono w ta¬ blicy 1. Stosowany klinicznie srodek immunosupresyjny azatioprin (Imuran) w powyzszym tescie wykazywal wartosc MED wynoszaca -100 mg/kg x 9. Tablica 1 Zwiazek chlorowodorek 2- (p-trójfluorometylo- fenylo)-1H-p erimidyny chlorowodorek 2- (m-trójfluorometylo- fenylo)-1H-perimidyny fluorowodorek 2- (p-trójfluorometoksy- fenylo)-lH-perimidyny chlorowodorek 2- (p-trójfluorometylo- fenylo)-lH-perimidyny chlorowodorek 2- (p-pieciofluoroetoksy- fenylo)-lH-perimidyny MED mg/kg x 9 (doustnie) 6,25 100 <100 <100 100 Indywidualne badanie surowicy. W tych testach zmodyfikowano poprzednie postepowanie, stosujac grupy po 10 myszy zamiast5. Myszy skrwawiano jak poprzednio ale miano surowicy oznaczano indywidualnie a nie grupowo. Dla kazdej grupy 10 myszy obliczano srednie wartosci hemaglutynin (log2 ze standardowym bledem) oraz wartosci p za pomoca testu Studenta, odnoszac te wartosci do grupy kontrolnej. Najmniejsza dawke leku (p <0,05) obnizajaca w sposób znaczacy miano przeciwcial przyjmo¬ wano za punkt koncowy. Leki podawano doustnie lub podskórnie w dziesieciu dziennych dawkach, rozpoczyna¬ jac podawanie trzy dni przed wstrzyknieciem czerwonych cialek krwi. Leki zawieszano w nosniku skladajacym sie z roztworu chlorku sodowego zawierajacego 0,125% metylocelulozy i 0,2% niejonowego emulgatora. Ozna¬ czanie przeciwcial (hemaglutynin) wykonywano po uplywie siedmiu dni od wstrzykniecia czerwonych cialek krwi. Typowe wyniki otrzymane podczas indywidualnego tes¬ towania surowicy z zastosowaniem reprezentatywnych zwiazków o wzorze 1 przedstawiono w tablicy2. Tablica 2 Aktywnosc immunosupresyjna zwiazków (Indywidualne badanie surowicy) , Zwiazek J ¦¦"* chlorowodorek 2-(p- -trójfluorometylofeny- lo)-lH-perimidyny fluorowodorek 2- (p- -trójfluorometoksy- fenylo)-lH-perimidyny chlorowodorek 2-(p- -trójfluorometylofeny- | lo)-lH-perimidyny | Sposób podawania doustnie podskórnie - doustnie doustnie Dawka w punkcie koncowym (p<0,05) w mg/kg x 10 | 1 * 1 <1,6 <1,6 12,5 5,0 1 10 15 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Reakcja przeszezep-gospodarz (GVH). W tescie tym myszom szczepu mieszanego F!(C57BL x C3H) podawano pozajelitowo komórki sledziony myszy szczepu (C57BL). Myszy biorcy nie odrzucaly wstrzyknietych komórek, gdyz hybryda rozpoznawala antygen ze szczepu C57BL od jej homozygotycznych rodziców jako „swój". Wstrzykniete komórki'wywoluja jednak reakcje w stosunku do tkanki biorcy na skutek obecnosci obcego, pochodzacego od C3H antygenu. W rezultacie tego sledziona biorcy powiekszala sie. Immunosupresja zapobiega lub zmniejsza powiekszanie sledziony. Tak wiec, ciezar sledziony jest miara reakcji GVH i jej hamowania w wyniku immuno¬ supresji. Stosowano zmodyfikowana metode Simonsen'a opisa¬ na w Ann. N.Y. Acad. Sci., 73, 834 (1958). Uzyskiwano duze porcje komórek sledziony bez stosowanego powszech¬ nie recznego rozdrabniania sledziony, stosujac mieszal¬ niki Waring'a z odwróconymi ostrzami tnacymi. Dwu¬ krotne, trwajace po szesc sekund, mieszanie rozdrabnialo sledziony (porcje od 25 myszy C57BL w 25 ml roztworu chlorku sodowego) wystarczajaca dla zwolnienia komórek z tkanki lacznej. Tkanke laczna usuwano poprzez saczenie przez tkanine bawelniana o róznej grubosci. Uzyskana w ten sposób zawiesine komófek standaryzowano stosujac licznik komorowy Leyy^go-Hausse^a i otrzymujac 6 X X 108 jadrzastych komórek w mililitize. Grupom po 10 myszy szczepu C57B1 x C3H o ciuezarze 16—18 g wstrzy¬ kiwano dootrzewnowo 1 ml zawiesiny komórek dawcy. Zwiazki rozpoczynano podawac doustnie lub podskórnie w ilosci 0,2 ml trzy dni przed wstrzyknieciem komórek i podawano lacznie w ciagu 13 dni. Zwierzeta kontrolne otrzymywaly tylko komórki i nosnik. Sledziony usuwano i wazono po uplywie 10 dni od wstrzykniecia komórek. Wyniki przedstawiono jako stosunek mg ciezaru sledziony do gramów ciezaru ciala. Poniewaz wstrzykiwanie myszom biorcom komórek wspólgenetycznych, to znaczy myszy C57BL x C3H, wywoluje w malym stopniu rozrost sledziony, ciezary sledziony tych zwierzat przyjeto jako miare 100% hamo¬ wania reakcji GVH podczas obliczania procentu hamowania przez zwiazki immunosupresyjne. Sposób obliczania przed¬ stawia tablica 3 dla myszy, którym podawano zwiazek immunosupresyjny. Ta Podawany zwiazek 1-(6-metoksy-2-ben- zotiazolilo)-2-fenylo- mocznik (J. Med. Chem., 12,1016—1018, 1969), 12,5 mg/kg x x 13, doustnie Nie podawano (próba kontrolna GVH) Nie podawano (próba kontrolna na Wspól- genetycznosc) Nie podawano (nor¬ malna próba kontrolna) blica 3 Mg sledziony/g ciezaru ciala (± standardo¬ wy blad)* . ,6,86 ± 0,80 PL PL PL