Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowej monokariotycznej grzybni Coriolus yer¬ sicolor (Fr.) Quel., bedacego znanym podstawcza- kiem, nalezacym do rodzaju Coriolus rodziny Polyporaceae.Znana jest przydatnosc polisacharydów, otrzy¬ mywanych droga ekstrakcji Coriolus yersicolor (Fr.) Quel., wzglednie jego kultury, jako podsta¬ wowych skladników przy produkcji leków lub zywnosci i napojów. Czyniono rózne próby pro¬ dukowania tego podstawczaka droga wysokowy- dajnej sztucznej hodowli, lecz mimo to nie istnieje dotad korzystny sposób rozmnazania podstawczaka z duza wydajnoscia.W toku badan, majacych na celu uzyskanie wy- sokowydajnego rozmnazania Coriolus versioolor (Fr.) Quel., nieoczekiwanie stwierdzono, ze gdy hodowle w zanurzeniu tego podstawczaka polaczy sie z mechaniczna obróbka typu scinania lub roz¬ cierania w cieklym srodowisku, podstawczak traci swa spoista budowe, bedaca cecha charakterystycz¬ na jego morfologii wewnetrznej i zmienia sie w grzybnie monokariotyczna. Uzyskana tym sposo¬ bem monokariotyczna grzybnia jest trwala i ma te szczególna wlasciwosc, ze wykazuje wyjatkowo duza predkosc rozmnazania w porównaniu ze znana grzybnia dwukariotyczna.Przedmiotem wynalazku jest przeto sposób wy¬ twarzania nowej trwalej monokariotycznej grzybni Coriolus yersicolor (Fr.) Quel., nie wykazujacej budowy spoistej, a cecha tego sposobu jest to, ze pelna brzeczke fermentacyjna, zawierajaca aktyw¬ nie rozmnazajaca sie dwukariotyczna grzybnie Coriolus yersicolor (Fr.) Quel., 5% wagowych gli- kozy i 0,75% wagowego ekstraktu drozdzy, poddaje sie w trakcie hodowli obróbce mechanicznej droga scinania lub rozcierania, przy czym obróbke me¬ chaniczna, majaca charakter ciagly lub okresowy, prowadzi sie oo najmniej raz w czasie trwania calego procesu hodowli, wewnatrz lub na zewnatrz naczynia fermentacyjnego* Na rysunku fig. 1 przedstawia krzywa rozmna¬ zania w napowietrzanej i poddawanej mieszaniu hodowli monokariotycznej grzybni, otrzymanej z Coriolus yersicolor (Fr.) Quel. sposobem wedlug wynalazku i dla porównania podobna krzywa roz^ mnazania znanej grzybni dwukariotycznej, fig. 2 i 4 przedstawiaja mikrofotografie grzybni dwu¬ kariotycznej, otrzymanej ze skosu kultury Coriolus yersicolor (Fr.) Quel., a fig. 3 przedstawia mikro¬ fotografie grzybni monokariotycznej, otrzymanej sposobem wedlug wynalazku.Na wykresie na fig. 1 wartosci stezenia grzybni (g) litr w pozywce odlozono na osi rzednych, a dlugosc czasu hodowli (godziny) na osi odcietych.Krzywa (I) odpowiada krzywej wzrostu grzybni dwukariotycznej, a krzywa (II) krzywej wzrostu grzybni monokariotycznej.Uwaza sie na ogól, ze grzyby bedace grzybami jadalnymi wytwarzaja basidiospory, które kielkujac 105 104s 105 104 4 tworza pierwotna grzybnie, zawierajaca zwykle monokariony, po czym grzybnia ta zlewa sie, two¬ rzac grzybnie wtórna, zawierajaca dwukariony.Twierdzi sie, ze monokariotyczna grzybnia nie ma zdolnosci wytwarzania owocników, która to zdol¬ nosc ma grzybnia dwukariotyczna. Brak jest in¬ formacji o rozmnozeniu monokariotycznej grzybni z zarodników Coriolus versicolor (Fr.) Quel. Co wiecej, biala napowietrzna grzybnia, otrzymywana w toku badan droga hodowli zarodników, byla grzybnia dwukariotyczna i prawdopodobnie jest to zwiazane z faktem, iz monokariotyczna grzybnia z zarodników ulega bardzo szybkiej przemianie w grzybnie dwukariotyczna.Monokariotyczna grzybnie, otrzymana z grzybni dwukariotycznej sposobem wedlug wynalazku, mozna utrzymac w stanie trwalym, wykazujacym znaczne róznice w stosunku do istniejacej grzybni dwukariotycznej. W tablicy przedstawiono róznice miedzy monokariotyczna grzybnia Coriolus versi- color (Fr.) Quel., wytworzona sposobem wedlug wynalazku i grzybnia dwukariotyczna.Tablica Przedmiot 1 badania " * Postac 1. Hodowla w 1 zanurzeniu 2. Hodowla na plytce Badania mikro- 1 skopowe 3. Tworzenie sie budowy spo- 1 istej 4. Ksztalt 1 grzybni 1 Wlasciwosci 1 fizjologiczne 1 i biochemiczne . Predkosc roz- 1 mnazania 6. Przyswajanie celulozy 7. Azotan pota¬ sowy jako | jedyne zródlo azotu Grzybnia dwukario¬ tyczna 2 Brak rozpro¬ szenia Tworzy sie grzybnia na¬ powietrzna Zaobserwo¬ wano Dluga i cienka Mala Wynik do¬ datni Brak wzrostu 1 Grzybnia mo- 1 nokariotycz- na wytworzona sposobem wedlug 1 wynalazku 1 1 3 1 Rozproszenie Brak grzybni 1 napowietrz- 1 nej 1 Nie zaobser¬ wowano Krótka i o wiele grubsza niz grzybnia 1 dwukario¬ tyczna 1 Duza I Wynik slabo 1 dodatni 1 Wzrost 1 | 1 8. Witamina Bi 9. Mleczko lak¬ musowe w po¬ zywce 2 Potrzebna Odczyn kwasny 3 Niepotrzebna Brak odczynu kwasnego Dalsze fakty, stwierdzone w zwiazku z podanymi w tablicy wlasciwosciami poszczególnych grzybni, sa nastepujace. Zwykla grzybnia dwukariotyczna, otrzymana znanym sposobem z hodowli Coriolus versicolor (Fr.) Quel., ma na ogól postac grudek.Pochodzaca z hodowli monokariotyczna grzybnia nie tworzy grudek i kultura jej staje sie metna, tak jak papkowata zawiesina w wodzie, co sta¬ nowi oczywista róznice w stosunku do zwyklej grzybni dwukariotycznej. Sposób liczenia jader w komórce, który zostal opracowany do konca po raz pierwszy w zwiazku z wynalazkiem polega na zastosowaniu nastepujacych srodków i metod: Najpierw do grzybni podstawczaka dodaje sie utrwalajacego plynu Helly'ego, a nastepnie grzyb- nie odstawia sie zwykle na okolo 24 godziny, po czym przemywa sie ja woda do odbarwienia. Tak otrzymana grzybnie zanurza sie w In roztworze kwasu solnego i roztwór ten podgrzewa do tempe¬ ratury 60°C. Po ochlodzeniu grzybni do tempera- so tury pokojowej i przemyciu woda, zanurza sie ja w roztworze kwasu azotowego o 20—50-krotnym rozcienczeniu, po czym ponownie przemywa woda.Czas zanurzenia w roztworze kwasu solnego wy¬ nosi 10—20 minut, a w roztworze kwasu azotowego kilku minut. Otrzymane w ten sposób wlókniste komórki rozposciera sie na szkielku przedmioto¬ wym, pozostawia na nim do czasu wyparowania wilgoci, a nastepnie dodaje kroplami roztwór Giemsa'ego. Po zakonczeniu zabarwiania roztwo- 40 rem (w przyblizeniu po 10 minutach), komórki przemywa sie ostroznie woda, a nastepnie suszy.Wysuszone komórki bada sie pod mikroskopem powiekszajacym 1000-krotnie, liczac okragle zabar¬ wione na czerwono plamki odpowiadajace jadrom. 45 Tak wiec dzieki policzeniu zabarwionych na czer¬ wono plamek okreslic mozna liczbe jader w jednej komórce.Stosowany tu „utrwalajacy plyn Helly'ego" jest roztworem, którego podstawe sporzadza sie, roz- 50 puszczajac 2,5 g dwuchromianu potasowego, 1 g siarczanu sodowego i 5 g chlorku rteciowego w 100 ml wody. Do tego roztworu podstawowego do¬ daje sie bezposrednio przed uzyciem formaliny w ilosci 5 ml na 100 ml roztworu. 55 „Roztwór Giemsa'ego" jest roztworem do bar¬ wienia jader, otrzymywanym przez rozpuszczanie 3 g blekitu II eozyny i 0,8 g blekitu w 250 ml gliceryny podczas ogrzewania ich do temperatury 60°C, nastepnie przez dodanie 250 ml alkoholu me¬ go tylowego, odstawienie mieszaniny na 24 godziny i odsaczenie roztworu. Przed uzyciem otrzymany w ten sposób roztwór podstawowy rozciencza sie, dodajac buforowego roztworu kwasu fosforowego (wartosc pH=6,4—6,8) w ilosci 100 ml na 3 ml fi5 roztworu podstawowego.W wyniku pomiarów, prowadzonych powyzsza metoda, stwierdzono, ze liczba jader w jednej ko- rr.órce zwyklej grzybni w postaci grudek wynosi 2, podczas gdy w jednej komórce zawiesinowej grzyb¬ ni, wytworzonej sposobem wedlug wynalazku, znaj¬ duje sie jedno jadro.Sposób wedlug wynalazku mozna realizowac na¬ stepujacymi drogami: (1) W przypadku poddawania dwukariotycznej grzybni Coriolus versicolor (Fr.) Quel. hodowli wstrzasowej, grzybnie rozciera sie za pomoca sta¬ lych ziarnistych materialów, np. szklanych kulek. (2) W przypadku poddawania dwukariotycznej grzybni hodowli ciaglej w zanurzeniu, grzybnie poddaje sie scinaniu za pomoca elementu miesza¬ jacego. (3) Pelna brzeczke hodowlana otrzymana z ho¬ dowli grzybni dwukariotycznej i zawieraja aktywnie rozmnazajaca sie grzybnie dwukariotyczna wydo¬ bywa sie okresowo z naczynia fermentacyjnego (co najmniej raz) i poddaje sie scinaniu lub roz¬ cieraniu w homogenizatorze do momentu, w któ¬ rym przestaja byc widoczne grudki grzybni, a na¬ stepnie zhomogenizowana pelna grzeczke hodowlana umieszcza sie znowu w naczyniu fermentacyjnym i podejmuje hodowle.Podczas wytwarzania monokariotycznej grzybni w wyzej podanych warunkach korzystne jest do¬ datkowe zastosowanie nastepujacych metod poste¬ powania: (I) Stosuje sie wzbogacone odzywianie za pomoca pozywki o stezeniu 1,5—3 razy wyzszym od steze¬ nia zwyklej pozywki, np. za pomoca pozywki, za¬ wierajacej 5% wagowych glikozy i 0,75% wago¬ wego ekstraktu drozdzy.(II) W hodowli w zanurzeniu utrzymuje sie atmos¬ fere o zmniejszonym cisnieniu czastkowym tlenu.„Zmniejszenie cisnienia czastkowego tlenu" uzyskac mozna uszczelniajac naczynie fermentacyjne lub wdmuchujac do naczynia gaz obojetny, np. azot lub dwutlenek wegla.(III) Hodowle w zanurzeniu prowadzi sie w spo¬ sób ciagly, zasilajac ja dodatkowo ciekla pozywka.Dwukariotyczna grzybnie Coriolus versicolor (Fr.) Quel. mozna latwo przeprowadzic w grzybnie monokariotyczna, stosujac wyzej opisane drogi (1)—(3), bez stosowania dodatkowych metod lub w odpowiednim polaczeniu z metodami (I)—(III).Jesli grzybnia otrzymana w jednym zabiegu hodowlanym prowadzonym sposobem wedlug wy¬ nalazku nie jest jeszcze grzybnia calkowicie mo¬ nokariotyczna, to wówczas stosuje sie technike zwana „stopniowym przenoszeniem,\ Stopniowe przenoszenie polega na tym, ze prowadzi sie ko¬ lejne zabiegi hodowlane, az do uzyskania brzeczki hodowlanej, zawierajacej grzybnie calkowicie mo¬ nokariotyczna, przy czym jako hodowle posiewowa w danym zabiegu stosuje sie czesc pelnej brzeczki hodowlanej, otrzymanej w poprzednim zabiegu.W kazdym kolejnym zabiegu hodowla posiewowa zawiera coraz wiecej grzybni monokariotycznej i coraz mniejsza ilosc grzybni dwukariotycznej.Stwierdzono, ze monokariotyczna grzybnia Cor¬ iolus versicolor (Fr.) QueL, otrzymywana sposobem wedlug wynalazku, zachowuje zawsze jednakowa postac i wlasciwosci, o ile spelnione sa wyzej po¬ dane warunki wytwarzania tej grzybni. Oznacza to, ze monokariotyczna grzybnia, wytwarzana spo¬ sobem wedlug wynalazku, odtwarza sie jako iden¬ tyczna monokariotyczna grzybnia w nastepnym pokoleniu, zachowujac wlasciwosci monokario- tycznej grzybni, podane w tablicy.W hodowli na plytce lub w hodowli powierzch¬ niowej (stacjonarnej) monokariotycznej grzybni grzybnia napowietrzna tworzy sie z trudnoscia, lecz powstaje, gdy hodowle prowadzi sie w ciagu kilku miesiecy. Ta napowietrzna grzybnia jest grzybnia dwukariotyczna i gdy zaszczepia sie ja w eelu wy¬ tworzenia owooników, uzyskuje sie owocniki wlasnie Coriolus versicolor (Fr.) Quel., a wiec otrzymana grzybnia jest identyczna z grzybnia wyjsciowa.Z faktów tych wynika, ze monokariotyczna grzybnia Coriolus versicolor (Fr,) Quel., wytwo¬ rzona sposobem wedlug wynalazku, pochodzi od wyjsciowej dwukariotycznej grzybni Coriolus versi- color (Fr.) Quel.Monokariotyczna grzybnia, wytworzona sposobem wedlug wynalazku, jest nowa grzybnia, po raz pierwszy otrzymana sposobem wedlug wynalazku.Zostala ona nazwana Coriolus versicokr GX-101-3 i zlozona do depozytu jako FERM-P nr 3686.Charakterystyczne wlasciwosci monokariotycznej grzybni Coriolus versicolor (Fr.) Quel., wytworzo¬ nej sposobem wedlug wynalazku, przedstawiano w tablicy, lecz najwieksze znaczenie tych grzybów dla przemyslu zwiazane jest z duza predkoscia ich rozmnazania/Predkosc ta jest 1,5—10 razy wieksza od predkosci rozmnazania wyjsciowej grzybni dwu¬ kariotycznej, a oczywiscie tak duza predkosc jest bardzo korzystna w warunkach produkcji przemy¬ slowej.Monokariotyczna grzybnie, wytworzona wedlug wynalazku, mozna stosowac do tych samych celów co dwukariotyczna grzybnie Coriolus versicolor (Fr.) Quel. Mozna z niej np. otrzymywac zawierajacy azot polisacharyd, poddajac monokariotyczna grzybnie ekstrakcji zawierajacym wode modium, takim jak woda, rozcienczony roztwór alkaliczny lub rozcien¬ czony roztwór kwasny. Taki zawierajacy azot poli¬ sacharyd mozna stosowac do produkcji leków, np. srodka przeciwnowotworowego, srodka zwieksza* jacego odpornosc, srodka przeciwwirusowego, srod¬ ka przeciwgrzybicznego, leku przeciwtradowego, leku wzmagajacego apetyt itp.Przez niskotemperaturowa ekstrakcje rnonokarifr- tycznej grzybni, wytworzonej sposobem wedlug wynalazku, mozna otrzymac takze rózne rodzaje enzymów, np. proteaze, amylaze itp. Co wiecej, sama grzybnie lub jej ekstrakty albo pozostalosci mozna stosowac do zywnosci i napojów, jako pasze dla zwierzat i nawóz dla roslin.Poza wyzej wymienionymi zastosowaniami grzyb¬ nie, wytworzona sposobem wedlug wynalazku, mozna stosowac do tych wszystkich celów, do któ¬ rych uzywa sie Coriolus versicolor (Fr.) QueL Wynalazek zilustrowano w przykladach, które nie stanowia jednak zadnego ograniczenia zakresu tego wynalazku. 19 tt 39 40 45 50 55 M105104 , F r*zjr Jfc l^&dcfei&r Wytwarzanie inonokariotycznej grzyl^m lf^b ml ^ cie&lej pozywki, zawierajacej. 5% Wagoi^-ch: glikezy. i 0,75°/g wagowego ekstraktu drezdiy (produtowanego , przez Kyokuto Seiyaku K^g3?^rCQ, I4d.),;odmierza sie pipeta do stozkowej fcolby; $ .pojerjanosci 500 ml i p© dwudziestominu- towym wyjalawianiu para wodna • w temperaturze I20-C, ftpeywlc^ zaszczepia- sie 1. ml zawiesiny grzybni, otrzymanej przez zdyspergowanie grzybni Coriolus Nastepnie rozpoczyna sie Lpd^wie wstrzasowa w temperaturze 25°C, sto¬ sujac $aies&anie; ,zj predkoscia 200 obrotów/minute.Grzybnia, z fetórej sporzadza sie zawiesine do za- szczep^enia rpezyw^ki%pochodzi z dwudziestodniowej Stacjonarnej hodowli, prowadzonej w temperaturze ^C ^ pozywce,^wierajajcej ..&!* wagowe glikozy i 0,5% wagowego ekstraktu drozdzy, a przygoto¬ wuje, sie* ja droga rozdrobnienia powlok! grzybnio- we w 6Q mj fizjologicznego roztworu soli, przy cgym^goz^ce^fcsnie prowadzi sie w ciagu & minut ^afc^orctojca; $a|teftzadla o predkosci obrotowej 6000 obrotów/minute. t :Po uplywie 3 dali od momentu rozpoczecia ho¬ dowli wstrzasowej czesc brzeczki hodowlanej wy- 4Qtewa,- $ie Zi naczynia iermentacyjnego i zawarta w ojej grzybnie obserwuje. po • zabarwieniu pod mikrosjbepemy Obserwacja taka: wykazala, ii; bada¬ na grzybnia jest grzybnia dwukariotycznrj. nastepnie pelna brzeczka; hodowlana rozciera sie •w?ciagu L0 minut w mieszalniku homogenizujacym (pjo&ikcji v.J3a&uma;jWorks), pracujacym z pred¬ koscia;; obrotowa ¦-HHWM) obrotów/minute, Poddana te*mu zabi^owi peina brzeczke hodowlana,, zawie¬ rajaca aktywnie; rozmnazajaca sie grzybnie^umiesz- cza sie zaaowu w kolbie stozkowej o pojemnosci 500, ml i;natychmiast, podejmuje hodowle wstrza¬ sowa, .w Podanych powyzej-.warunkach. Calkowity 'czas trwania hodowli wynosi 7 dni. Tak wyhodo¬ wac grzybnia nie ma zwartej budowy i tworzy niewiele grzybnie * napowietaeziia w zwyklym sro- d$$S$sfeil aga$u wr;hóddwli na,plytce. Wyniki badan mikroskopowych po zabarwieniu przeprowadzonym nizej podanym sposobem wykazuja, iz. otrzymana grzybmai;dfcsfcrcalkowicie" monokariotyczna.Barwienie. 1 ml brzeczki* Jzawierajacej grzybnie, otrzymana w wyzej opisany .sposób, miesza sie z Ifl mi wody, a hastepnie poddaje soidzielaoiu w? wirówce w ciagu 5 minut, z predkoscia2000^500$O] Ciecz znad osadu, usuwa sia a grzybnie;¦ przenosi do probówki, do której dodaje sie utrwalajacy plyn Helly'ego i odstawia na 24-godziny. Oddzielone komórki przemywa sie 10 ml wody do odbarwienia, a nastepnie umieszcza je w 10 ml In kwasu sol¬ nego; Lcgrzewa w wciagu 15 minut w temperaturze 60?CV:'Chlodzi do temperatury pokojowej i prze¬ mywa 10 ml wody. Nastepnie zanurza sie je w 1(J ml twodnego roztworu kwasu azotowego o 20—50 krotnym rozcienczeniu i przemywa 2—3 razy 10 ml wody. ^ -irnr-\ Otrzymane wlókniste komórki rozposciera sie na szkielko*, przedmiotowym w celu wysuszenia na powietrzu, po *czym nanosi sie Tfia nie kilka kropli roztworu Giemsa'ego i po uplywierl5 minut prze¬ mywa ostroznie woda i suszy,r Podczas obserwacji komórki o tak zabarwionym id rs 40 45 50 55 60 jadrze pod mikroskopem powiekszajacym1000-kfot- nie, kazde jadro widoczne jest w postaci okraglej, zabarwionej na czerwono plamki. Tak wiec liczbe jader mozna latwo okreslic policzywszy okragle, zabarwione na czerwono plamki w jednej idarnórce grzybni. Otrzymana grzybnia nie zakwasza miaczkr* lakmusowego i nie wykazuje zdolnosci uplyniania zelatyny.Rozmnazanie monokariotycznej grzybni.Slój fermentacyjny o pojemnosci 20 litrów, za¬ wierajacy 12 litrów cieklej pozywki hodowlanej, w której znajduje sie 5% wagowych glikozy i * 0,75 wagowego ekstraktu drozdzy, wyjalawia sie para wodna, po e-zym pozywke zaszczepia sie przez zmieszanie jej z 1 litrem wodnej zawiesiny mono- kariotycznej grzybni, otrzymanej w wyzej opisany sposób. * Grzybnie hoduje sie, doprowadzajac do slcia powietrze z predkoscia 0,5 litra na 1 litr cieklej pozywki na 1 minute i stosujac mieszanie z predkoscia 550 obrotów/minute w temperaturze ±2°C Bezposrednio po zaszczepieniu w 1 litrze pozywki hodowlanej znajduje sie 0,5 g grzybni (w przeliczeniu na sucha mase).Dla porównania, w identycznych warunkach pro¬ wadzi sie hodowle grzybni dwukariotycznej. Gdy porównano predkosci rozmnazania grzybni mono- kariotycznej i grzybni dwukariotycznej, biorac pod uwage czas potrzebny do uzyskania stezenia grzyb¬ ni a g/litr, stwierdzono, ze grzybnia dwukario- tyczna osiaga to stezenie w czasie czterokrotnie dluzszym od czasu hodowli grzybni monókario- tycznej (fig. 1). Uzyskano równiez potwierdzenie faktu, ze wydajnosc rozmnazania monokariotycznej grzybni przewyzsza o okolo 20Vo wydajnosc roz¬ mnazania grzybni dwukariotycznej.Przyklad II. 100 ml wodnej pozywk-Miodow- kmej^zawierajacej(50/o wagowych glikozy i 0,75% ekstraktu drazdzyr: umieszcza sie w kolbie stozko¬ wej o polemftosci 500 ml i po wyjalowieniu ter¬ micznym zaszczepia ja .grzybnia za poxoca drutu platynowego zakonczonego petelka, a nastepnie prowadzi sie w ciagli 3 dni hodowle wstrzasowa w temperaturze 25±2°C. Do zaszczepienia stosuje sie grzybnie szczepu CM 101 Coriolus versicolor (Fr.) Quel.,* zlozona do depozytu jako FERM-F nr 2412, bedaca grzybnia calkowicie dwukario- tjftezna* {fig. 2). Jest to tak zwany pierwszy' etap hoik*wlif :a *gri£bnia- otrzymana w tym etapie ma po*iac grudfco*tarta i je^ grzybnia cafk^wicie clwtt- karfctyc»f.Pelna brzedzfee. hofoWlana, zawier#|C%f grti&Hto* wata grzybnie, poddaje sie w ciagtiPfe mktilt homo¬ genizacji droga scinania w mieszairiiku hómogeni^- zujacym (produkcji Sakuma Works), otrzymujac brzeczke pozbawiona grudek. Cala ilosc tej zhomo- gcnizowanej pelnej brzeczki hodowlanej poddaje sie dalszej hodowli w temperaturze 25±2°C w ciagu 4 dni. Jest to tak zwany drugi etap hodowli, a grzybnia otrzymana w tym etapie zawiera jeszcze nieco grudek, jednak obserwacja po zabarwieniu wykazuje, iz przewazajaca czesc grzybni jest grzybnia monokariotyczna. Stezenie calej grzybni w tak otrzymanej pelnej brzeczce hodowlanej wy¬ nosi 11 g/litr brzeczki.Dwa powyzsze etapy (etap pierwszy i etap drugi)105 104 16 s';anowia tak zwany pierwszy zabieg hodowlany.Pelna brzeczke hodowlana otrzymana w tym za¬ biegu, zawierajaca grzybnie, majaca czesciowo postac grudek i skladajaca sie z przewazajacej ilosci grzybni monokariotycznej i niewielkiej ilosci grzybni dwukariotycznej, poddaje sie w ciagu minut homogenizacji w mieszalniku homogeni¬ zujacym, po czym 1 ml tak zhomogenizowanej brzeczki stosuje sie jako hodowle posiewowa w drugim zabiegu hodowlanym.W pierwszym etapie drugiego zabiegu 100 ml wodnej pozywki hodowlanej, zawierajacej 5% wagowych glikozy i 0,75% wagowych ekstraktu drozdzy, umieszcza sie w stozkowej kolbie o po¬ jemnosci 500 ml, kolbe i jej zawartosc wyjalawia sie termicznie, t pozywke zaszczepia sie 1 ml hodowli posiewowej, otrzymanej w pierwszym za¬ biegu i w ciagu 3 dni prowadzi sie hodowle wstrzasowa w temperaturze 25 ±2°C. Otrzymana w tym etapie pelna brzeczka hodowlana zawiera o wiele mniej grudek grzybni w porównaniu z brzeczka, otrzymana w pierwszym etapie pierw¬ szego . zabiegu, a po dziesieciominutowej homoge¬ nizacji w mieszalniku homogenizujacym grudki te calkowicie znikaja. Cala ilosc tak zhomogenizowa- nej pelnej brzeczki hodowlanej,.zawierajacej prze¬ wazajaca ilosc grzybni monokariotycznej i nie¬ wielka ilosc grzybni dwukariotycznej, poddaje sie w ciagu 3 dni hodowli wstrzasowej w tempera¬ turze 25 ±2°C (drugi etap drugiego zabiegu).Grzybnia, otrzymana w tym etapie, ma wyglad drzewnej papki, a jej obserwacja mikroskopowa po zabarwieniu wykazala, iz jest to grzybnia zasadni¬ czo calkowicie monokariotyczna. Stezenie tej grzyb¬ ni w pelnej brzeczce hodowlanej, otrzymanej w drugim zabiegu, wynosi 11 g/litr.Otrzymana w drugim zabiegu pelna brzeczke hodowlana, zawierajaca grzybnie zasadniczo cal¬ kowicie monokariotyczna, poddaje sie w ciagu minut homogenizacji w mieszalniku homogeni¬ zujacym i 1 ml tak zhomogenizowanej brzeczki stosuje sie jako hodowle posiewowa w trzecim zabiegu hodowlanym.W pierwszym etapie trzeciego zabiegu powtarza sie tak postepowania, opisany w przypadku pierw¬ szego etapu drugiego zabiegu, z ta róznica, ze hodowle prowadzi sie w ciagu 2 dni. Drugi etap trzeciego zabiegu polega na tym, ze pelna brzeczke hodowlana, otrzymana w pierwszym etapie, homo¬ genizuje sie w ciagu 5 minut w mieszalniku homo¬ genizujacym i poddaje trzydniowej hodowli wstrza¬ sowej w temperaturze 25 ±2°C. Grzybnia, otrzy¬ mana w tym etapie, ma wyglad drzewnej papki, a jej obserwacja mikroskopowa po zabarwieniu wykazala, iz jest to grzybnia calkowicie mono¬ kariotyczna. Stezenie grzybni w pelnej grzeczce hodowlanej, otrzymanej w drugim etapie trzeciego zabiegu, wynosi llg/iitr.Otrzymana w drugim etapie trzeciego zabiega pelna brzeczke hodowlana, zawierajaca grzybnie calkowicie monokariotyczna, homogenizuje sie w ciagu 5 minut w mieszalniku homogenizujacym i 1 ml tak zhomogenizowanej grzybni stosuje sie jako hodowlana posiewowa w czwartym zabiegu hodowlanym. Pierwszy etap czwartego zabiegu prowadzi sie w identyczny sposób jak pierwszy etap trzeciego zabiegu, a drugi etap rózni sie od drugiego etapu trzeciego zabiegu tylko tym, ze hodowle prowadzi sie w ciagu 2 dni. Grzybnia w pelnej brzeczce hodowlanej, otrzymanej w czwartym zabiegu, ma v/yglad drzewnej papki i w dalszym ciagu jest gnybnia calkowicie mono¬ kariotyczna (nie zaszla przemiana w grzybnie dwukariotyczna). Stezenie grzybni w brzeczce po io czwartym zabiegu wynosi 12g/litr. Oznacza to, ze szybkosc rozmnazania grzybni monokariotycznej (stezenie 12 g/litr po dwudniowym pierwszym etapie i dwudniowym drugim etapie czwartego za¬ biegu (jest wieksza od szybkosci rozmnazania grzyba ni dwukariotycznej (stezenie 11 g/litr po trzydnio¬ wym pierwszym etapie i czterodniowym drugim etapie pierwszego zabiegu).Grzybnia, otrzymana w czwartym zabiegu ho¬ dowlanym, nie tworzy grudek i nie zmienia postaci zblizonej wygladem do drzewnej papki, w zwiazku z czym w przypadku stosowania jej jako hodowli posiewowej w nastepnych zabiegach hodowlanych dodatkowa homogenizacja jest zbedna.Obserwowana pod mikroskopem,komórka grzyba nie ma budowy spoistej, stwierdzonej u zwyklej grzybni dwukariotycznej i jest okolo dwukrotnie szersza od tej grzybni. Z przeprowadzonych metoda z przykladu I pomiarów liczby jader wynika, ze otrzymane komórki sa komórkami grzybni calko-. wicie monokariotycznej, co przedstawiono na mi¬ krofotografii na fig. 3.Gdy hodowle grzybni kontynuuje sie w iden¬ tycznych warunkach jak w poprzednim zabiegu hodowlanym, z monokariotycznej grzybni powstaje grzybnia rozmnozona, wykazujaca wszystkie wlasci¬ wosci identyczne z wlasciwosciami monokariotycz¬ nej grzybni, przedstawionymi w tablicy. Stwier*. dzono równiez, ze predkosc rozmnazania monokar¬ iotycznej grzybni jest ponad dwukrotnie wyzsza niz 40 w przypadku grzybni dwukariotycznej. g wysuszonej monokariotycznej grzybni, otrzy¬ manej podanym wyzej sposobem, ekstrahuje sie 300 ml goracej wody w temperaturze 95—100°C w ciagu 3 godzin. Ekstrakt zateza sie pod zmniej- 45 szonym cisnieniem w temperaturze 30°C, a nastep^ nie miesza z metanolem. Wytracony osad odsacza sie i suszy, otrzymujac 0,2 g proszku o szarej barwie. Chemiczna analiza tego proszku wykazala, iz jest to zawierajacy azot polisacharyd o duzym 50 ciezarze czasteczkowym. Polisacharyd ten podany myszy zaszczepionej miesakiem typu 180 wykazal wysoka czynnosc przeciwnowotworowa.Przyklad III. 100 ml cieklej pozywki, zawie¬ rajacej 5% wagowych glikozy i 0,75% wagowego 55 ekstraktu drozdzy, umieszcza sie w stozkowej kolbie o pojemnosci 500 ml, zawierajacej 8 g szkla¬ nych kulek o srednicy 2^5 mm i po wyjalowieniu termicznym zaszczepia sie pozywke dwukariotyczna grzybnie Coriolus versicolor (Fr.) QueL, identyczna co jak w przykladzie I. Zaszczepianie prowadzi sie za pomoca platynowego drutu zakonczonego petelka, a zaszczepiona pozywke poddaje sie w ciagu 7 dni hodowli wstrzasowej w temperaturze 25±2°C.Stezenie rozmnozonej grzybni w pelnej brzeczce 65 hodowlanej wynosi 11,3 g/litr, a mikroskopowa11 12 obserwacja zabarwionych komórek grzybowych wykazala, iz jest to grzybnia, zawierajaca przewa¬ zajaca ilosc grzybni monokariotycznej i niewielka ilosc grzybni dwukariotycznej. 1 ml tak otrzyma¬ nej pelnej brzeczki hodowlanej zaszczepia sie 100 ml pozywki o wyzej podanym skladzie i pro¬ wadzi hodowle wstrzasowa w kolbie, zawierajacej szklane kulki w ciagu 6 dni w temperaturze ±2°C. Otrzymana grzybnia nie miala zwartej budowy wlasciwej dla grzybni dwukariotycznej, a jej szerokosc byla póltorakrotnie wieksza od szerokosci grzybni dwukariotycznej. Obserwacja mikroskopowa zabarwionej grzybni potwierdzila, ze jest to grzybnia monokariotyczna. 1 ml otrzy¬ manej pelni brzeczki hodowlanej, zaszczepia sie 100 ml pozywki o wyzej podanym skladzie i pro¬ wadzi hodowle wstrzasowa w kolbie o pojemnosci 500 ml, zawierajacej szklane kulki w ciagu 5 dni w temperaturze 25±2°C. Tak otrzymana grzybnia nie ma spoistej budowy, a obserwacja mikrosko¬ powa po zabarwieniu wykazala, ze jest to grzybnia monokariotyczna. 1 ml otrzymanej pelnej brzeczki hodowlanej zaszczepia sie 100 ml cieklej pozywki, zawieraja¬ cej 5% wagowych glikozy i 0,75%wagowego ek¬ straktu drozdzy. Hodowle wstrzasowa prowadzi sie w ciagu 4 dni w kolbie o pojemnosci 500 ml, nie zawierajacej zadnych stalych ziarnistych materia¬ lów, w temperaturze 25±2°C. Stezenie otrzymanej grzybni wynosi 10,5 g/litr brzeczki, a obserwacja mikroskopowa po zabarwieniu potwierdza, ze jest to grzybnia calkowicie monokariotyczna.Gdy hodowli wstrzasowej, prowadzonej w ciagu 4 dni, od poczatku bez uzycia szklanych kulek, poddaje sie identyczna jak powyzej ilosc zwyklej dwukariotycznej grzybni Coriolus versicolor (Fr.) Quel, (zlozonej do depozytu jako FERM-P nr 2412), stosujac pozywke, zawierajaca 5% glikozy i 0,75% wagowego ekstraktu drozdzy, to otrzymana grzyb¬ nia jest grzybnia równiez dwukariotyczcia, a jej stezenie w brzeczce hodowlanej wynosi, okolo 7 gAitr. Jest wiec oczywiste, iz zdolnosc rozmna¬ zania sie grzybni monokariotycznej jest znacznie wieksza niz grzybni dwukariotycznej.Przyklad IV. 100 ml cieklej pozywki, zawie¬ rajacej 5% wagowych glikozy i 0,75% wagowego ekstraktu z drozdzy, umieszcza sie w kolbie stoz¬ kowej o pojemnosci 500 ml i po wyjalowieniu zaszczepia pozywke grzybnia dwukariotyczna Cor¬ iolus versicolor (Fr.) QueL (szczep CM-101, zlozony do depozytu jako FERM-P nr 2412). Hodowle wstrzasowa prowadzi sie w ciagu 3 dni w tempe¬ raturze 25±2°C, po czym pelna brzeczke hodowlana poddaje sie w ciagu 5 minut homogenizacji w mie¬ szalniku homogenizujacym (produkcji Sakuma Works) z predkoscia obrotowa 10000 obrotów/mi¬ nute. Zhomogenizowana pelna brzeczke hodowlana umieszcza sie ponownie w kolbie stozkowej o po¬ jemnosci 500 ml, po czym kolbe umieszcza sie w torbie polietylenowej i uszczelnia torbe tak, by do kolby nie dostawalo sie powietrze z zewnatrz.Hodowle prowadzi sie w temperaturze 25±2°C w ciagu 4 dni, po uplywie których w powietrzu, znajdujacym sie w torbie, stezenie CO2 wynosi 5°/o objetosciowych. 1 ml pelnej brzeczki hodowlanej, otrzymanej w tej hodowli, zaszczepia sie 100 ml cieklej pozywki o skladzie identycznym jak w pierwszym zabiegu i hodowle wstrzasowa prowadzi sie w temperatu- rze 25±2°C w ciagu 4 dni. Nastepnie pelna brzecz¬ ke hodowlana homogenizuje sie w ciagu 5 minut w mieszalniku homogenizujacym z predkoscia obrotowa 10000 obrotów/minute. Tak zhomogenizo¬ wana pelna brzeczke hodowlana umieszcza sie znowu w kolbie stozkowej o pojemnosci 500 ml i po umieszczeniu kolby w torbie polietylenowej podejmuje sie hodowle wstrzasowa, trwajaca 4 dcii w temperaturze 25±2°C. Trzeci i czwarty zabieg hodowlany prowadzi sie w identyczny sposób, przy czym jako hodowle posiewowe stosuje sie pelne brzeczki hodowlane, otrzymane odpowiednio w drugim i trzecim zabiegu. Po zakonczeniu czwartego zabiegu obserwacja mikroskopowa za¬ barwionej grzybni wykazuje, iz jest to grzybnia monokariotyczna. Prawdopodobnie ze wegledu na odizolowanie hodowli od otoczenia w drugim etapie poszczególnych zabiegów rozmnazanie grzybni jest nieco zahamowane, totez stezenie grzybni po kaz¬ dym zabiegu wynosi 6—7 g/litr brzeczki.Przyklad V. 100 ml cieklej pozywki, zawie¬ rajacej 5% wagowych glikozy i 0,75% wagowego ekstraktu drozdzowego, umieszcza sie w stozkowej kolbie o pojemnosci 500 ml i po wyjalowieniu termicznym zaszczepia pozywke grzybnia, otrzy- mana ze skosu kultury Coliorus versicolor (Fr.) Quel. (szczep CM-103 zlozony do depozytu jako FERM-P nr 2414) (fig. 4). Hodowle wstrzasowa w temperaturze 25±2°C prowadzi sie w ciagu 7 dni, otrzymujac rozmnozona grzybnie dwukariotyczna :5 o stezeniu 10,8 g/litr brzeczki.Tak otrzymana grzybnie dwukariotyczna zaszcze¬ pia sie 20 litrów cieklej pozywki, zawierajacej 10% wagowych glikozy i 1,5% wagowego ekstraktu drozdzy, stosujac 0,01% wagowo-objetosciowego 49 grzybni (w przeliczeniu na sucha mase). Hodowle w zanurzeniu w naczyniu fermentacyjnym, w któ¬ rym temperatura wynosi 25±2°C, prowadzi sie sto¬ sujac mieszanie za pomoca mieszadla lopatkowego o predkosci obrotowej 500 obrotów/minute. Po 7 *5 dniach.hodowli stezenie grzybni w brzeczce wynosi ,2 g/litr^ a, obserwacja mikroskopowa po zabar¬ wieniu wykazuje, ze grzybnia sklada sie w przewa¬ zajacej czesci z grzybni monokariotycznej a w nie¬ wielkiej czesci z grzybni dwukariotycznej, 2,0 ml 50 tak otrzymanej pelnej Drzeczki hodowlanej zaszcze¬ pia sie 20 litrów cieklej pozywki, zawierajacej $% wagowych glikozy i 1,5% wagowego ekstraktu drozdzy i drugi zabieg hodowlany prowadzi sie w naczyniu fermentacyjnym, wyposazonym w mie- 55 szadlo o predkosci obrotowej 500 obrotów/minute, w temperaturze 25±2°C, w ciagu 0 dni.Grzybnia, otrzymana w drugim zabiegu, zawiera jedynie nieznaczna ilosc grzybni dwukariotycznej i sklada sie niemal wylacznie z grzybni mono- eo kariotycznej. Trzeci i czwarty zabieg prowadzi sie w identycznych warunkach w ciagu odpowiednio i 4 dni, stosujac do zaszczepiania 20 ml pelnej brzeczki hodowlanej, otrzymanej odpowiednio w drugim i trzecim zabiegu. Obserwacja mikrosko- e5 powa zabarwionej grzybni' z trzeciego zabiegu105 104 13 14 wykazala jedynie minimalna ilosc grzybni dwu- kariotycznej, podczas gdy w grzybni z czwartego zabiegu nie wykryto jej wcale. Grzybnia z czwar¬ tego zabiegu miala wyglad papki drzewnej, a jej stezenie wynosilo 11,5 g/litr brzeczki. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL