NO870237L - Fremgangsmaate og system for liposominhalering. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører medisinavlevering ved inhalering, og spesielt, et forbedret medisinavleveringssystem og en fremgangsmåte for anvendelse av liposom-innesluttedelegemidler.

Følgende referanser er innbefattet heri ved henvisningstall .

1. Hollenbeck, R.G., et al, i "Pharmaceutics and Pharmacy Practice" (Banker, G.S., et al, red.), J.P. Lippincott, Philadelphia (1982), s. 355-358.

2. Szoka, F., Jr., et al, Ann Rev Biophys Bioeng (1980), 9j467.

3. Szoka, F., Jr., et al, Proe Nati Acad Sei (USA) (1978) 75^4167.

4. Hollenbeck, R.G., op eit, s. 382-291.

Inhalering tilveiebringer en effektiv fremgangsmåte for avlevering av en rekke legemidler, innbefattende nasale dekongestionsmidler, legemidler som er nyttige ved behandling av astma og andre bronkial- og pulmonar-tilstander (referanse 1). En åpenbar fordel ved inhalering ved behandling av nasale, bronkiale eller pulmonare tilstander er evnen til å avlevere legemidler direkte til stedet for legemiddelvirkningen. En beslektet fordel er den raske inntreden av den terapeutiske virkningen, sammenlignet med andre administreringsfremgangsmåter, såsom intramuskulær eller oral fremgangsmåte. For legemidler som er utsatt for nedbrytning i gastrointestinaltrakten, eller som av annen grunn ikke kan administreres oralt, kan inhalering være foretrukket av en rekke grunner sammenlignet med intravenøs eller intramuskulær injeksjon. Andre legemidler, såsom nitroglyserin, hvis primære medisinvirkning er systemisk, kan også avleveres effektivt ved inhalering.

Ved en kjent fremgangsmåte for administrering av et legemiddel ved inhalering oppløses legemiddelet i et egnet oppløsningsmiddel som kan aerosoliseres, slik at det dannes en tåke av småpartikler. Legemiddelopp-løsningen kan aerosoliseres ved hjelp av en pneumatisk eller ultralyds-forstøver, eller mer hensiktsmessig, ved hjelp av en selvstendig forstøver som drives ved hjelp av gasstrykk fra en fluorkarbondrivgass. Inhalering av den aerosoliserte tåken, dvs. trekking av tåken fra munnen eller nesen inn i luftrøret virker slik at de legemiddelholdige aerosolpartiklene avsettes på forskjellige områder av luftrøret, innbefattende det øvre nasofaryngalområdet, trakeobronkialområdet og pulmonarområdet. I det sistnevnte området har legemiddelet mulighet til rask absorpsjon i blodstrømmen for systemisk virkning.

Velkjent innen teknikkens stand er inhaleringssystemer hvori et legemiddel administreres i partikkelform, enten som et tørt pulver eller som en mikronisert suspensjon i et egnet bæreroppløsningsmiddelsystem. Typisk er legemiddelt en vannoppløselig forbindelse som er suspendert i mikronisert form i et drivmiddeloppløsningsmiddel av fluorkarbontypen. Etter aerosolisering tapes det meste av drivmiddeloppløsningsmiddelet ved støtfordampning og erstattes av fuktighet i luftrøret, dette fører til avsetning av hydratiserte, mikroniserte partikler.

Begge typer av inhaleringssystemet omtalt ovenfor er basert på avlevering av legemiddelet i en fri form på posisjoner i luftrøret. Som sådant anvendes legemiddelet raskt, og i tilfellet pulmonar avsetning opptas det systemisk ved avsetningsstedet. På grunn av dette raske medisinopptaket og anvendelsen kan det være nødvendig å administrere legemiddelet med korte intervaller for å opprettholde et ønsket terapeutisk dosenivå ved virkningsstedet. Et beslektet problem er begrens-ningen av mengden av legemiddel som kan administreres sikkert ved hver inhalering, spesielt i tilfellet med et legemiddel som har uønskede systemiske bivirkninger. Dette problemet' illustreres ved en rekke p-adrenerantagonisttypebronkodilatorer som også gir markert takykardi. Selv ved relativt lave doser av disse legemidlene kan den stimulerende virkningen av legemiddelet på hjertet være en plage for pasienten. Et ytterligere problem knyttet til administreringen av mikroniserte partikler er irritasjonen som disse partiklene kan forårsake i luftrøret.

I den senere tid er det foreslått et liposom-inhaleringssystem for administrering av et legemiddel i luftrøret i liposom-innkapslet form (UK patetsøknad nr. 2,145,107A). En liposom-aerosol dannes ved å blande lipid og vandige komponenter i en beholder med to kamre, deretter aerosoliseres blandingen ved at det tvinges gjennom en dyse. Blande- og aerosoliseringstrinnene er effetktive for dannelse av en liposom-aerosol hvori den del av legemiddelet, som kan være inneholdt i enten lipid- eller vann-komponenten, er tilstede i liposom-innkapslet form. Denne oppfinnelsen har den ulempen at in situ liposom-dannelse, og spesielt effektiviteten for medisininnkapsling i liposomene, er sterkt variabel, avhengig av graden av blanding av de to komponentene like før aerosolisering, de relative mengdene av de to komponentene som blandes, og muligens temperatur- og fuktighetsbetingelser som eksisterer under liposom-dannelsen. Som et resultat kan de relative prosentandelene av fritt og liposom-innkapslet legemiddel, og også den samlede mengden legemiddel som avleveres være meget variabel.

Det er et generelt formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte og et system for liposom-legemiddelinhalering som i vensentlig grad overvinner problemene og begrensningene knyttet til innretninger og fremgangsmåter ifølge teknikkens stand for administrering av legemidler ved inhaleringsfremgangsmåten.

Et spesifikt formål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe en slik fremgangsmåte og et system for anvendelse ved avlevering av et vannoppløselig, liposom-gjennomtrengelig legemiddel, og spesielt et system som kan lagres over et lengere tidsrom før anvendelse.

Nok et formål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte og et system hvori hastigheten for medisinfrigivelse i luftrøret kan kontrolleres selektivt, avhengig av lipid-sammensetningen av liposomene som inn-kapsler legemiddelet.

Oppfinnelsen innbefatter en fremgangsmåte for moderering av de innledende (kortvarige) og forlengde (langvarige) legemiddel-ni vå virkningene av et legemiddel administrert ved inhalering. Legemiddelet tilveiebringes i en form hvori det er hovedsakelig innkapslet i liposomene av en liposom-suspensjon, og suspensjonen aerosoliseres i en form som er egnet for inhalering. Ifølge et trekk ved oppfinnelsen reduserer eller eliminerer sekvestreringen av legemiddelet hovedsakelig i en liposom-innkapslet form med langsom frigivelse i stor grad uønskede legemiddel-opphopningsvirkninger på grunn av raskt systemidk opptak av det administrert legemiddelet. Systemet tillater følgelig større mengder av legemiddel og administreres i en enkelt dose med færre bivirkninger. I systemet tilveiebringer det frie legemiddelet en belastningsdose, og det liposom-innkapslede legemiddelet tilveiebringer avlevering over et lengere tidsrom.

Ifølge et annet trekk ved oppfinnelsen formuleres liposomene, slik at det oppnås en valgt hastighet for frigivelse av innkapslet legemiddel, som anvendes for å oppnå kontrollerte systemiske nivåer av legemiddelet. Halveringstidene for medisinfrigivelse, målt in vitro, kan variere fra en halv time eller mindre, for liposomer hvis fosfolipid-acylkjedekomponenter er relativt korte og/eller umettede, til seks dager eller mer, for liposomer hvis fosfolipid-acylkjedekomponenter er relativt lange og/eller mettede.

Systemet ifølge oppfinnelsen innbefatter en suspensjon av liposomer inneholdende et legemiddel hovedsakelig i innkapslet form, og en innretning for aerosolisering av en på forhånd valgt mengde av suspensjonen, i en form som er egnet for inhalering.

To utførelser av systemet er utformet for administrering av vann-oppløselige legemidler, spesielt liposom-gjennomtrengelige legemidler. I det første fremstilles liposomene i en vandig, pastalignende suspensjon inneholdende mer enn 50% innkapslet vann, og derfor mer enn 50% innkapslet legemiddel etter likevektsinnstilling for legemiddel mellom indre liposomal- og ytre bulkfasedeler av pastaen. Pastaen blandes med minst 1-2 volumdeler av et avleveringsmedium i et blandkammer, og aerosoliseres før legemiddeldiffusjon over liposomalbarrieren i vesentlig grad reduserer prosentandelen liposom-innkapslet legemiddel. Avleveringsmediet kan være et vandig medium, i dette tilfellet kan de fortynnede liposomene aerosoliseres ved hjelp av pneumatisk- eller ultralydenergi„ Alternativt kan pastaen være fortynnet med et avleveringsmedium i form av fluorkarbondrivmiddel, for anvendelse i en selvstendig aerosolinnretning.

I en andre generell utførelse består liposom-suspensjonen i systemet av legemiddelholdige liposomer disepergert i et fluorkarbonoppløsningsmiddel. Prosentandelen liposom-innkapslet legemiddel, som eksisterer i en likevektstilstand i suspensjonen er relativt høy på grunn av den høyere fordelignen av legemiddelet i den innkasplede, vandige delen enn i det ytre, ikke-vandige fluorkarbonmediet. Liposomene kan være suspendert i fluorkarbonen enten i tørket partikkelform, eller som en emulsjon av vandige liposom-pastapartikler. Pastaen inneholder, som allerede angitt, legemiddelet hovedsakelig liposom-innkapslet form. Liposom/drivmiddelsuspensjonen kan avleveres i utmålt doseform fra en konvensjonell, selvstendig forstøver.

Disse og andre formål og trekk ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå klarere fra den følgende detaljerte beskrivelsen av oppfinnelsen i forbindelse med de vedlagte tegningene.

Figur 1 er en grafisk fremstilling som viser prosent beskyttelse mot acetylkolin-indusert bronkokonstriksjon i et dyr etter administrering ved inhalering av fritt metaproteranolsulfat (MPS) (åpne firkanter) eller MPS-innkapslet i liposomer som har relativt lange (fylte sirkler) eller relativt korte (åpne sirkler) in vitro halveringstider for legemiddelavgivelse;

figur 2 er en grafisk fremstilling som viser prosentøkning i hjertehastighet i et dyr etter administrering av MPS som i figur 1.

Figurene 3A og 3B er grafiske fremstillinger som viser prosentøkning i hjertehastighet i et behandlingsobjekt etter behandling med fritt MPS (åpne firkanter i figurene) og MPS innkapslet i liposomer med relativt høye (3A) og lave (3B) hastigheter for legemiddelfrigivelse; og

figur 4 viser plasmakonsentrasjoner av MPS i et behandlingsobjekt etter administrering av fritt legemiddel (åpne firkanter) og legemiddel innkapslet i hvert av liposom-preparatene ifølge figur 3.

I. Liposom - suspensjon

Liposom-suspensjonen ifølge oppfinnelsen sammensettes slik at den inneholder (a) et valgt legemiddel hovedsakelig i liposom-innkapslet form, og (b) en lipidsammensetning utformet for å gi en ønsket legemiddel-frigivelseshastighet når suspensjonen administreres i luftrøret.

IA nedenfor vedrører relasjonen mellom liposom-tolagskomponentene og legemiddel-f rigivelseshastigheter.

IB beskriver fremgangsmåter for fremstilling av liposomer inneholdende innkapslede legemidler. Fremgangsmåter for fremstilling av liposom-suspensjoner inneholdende et legemiddel i hovedsakelig liposom-innkapslet form er diskutert i avsnittene IC-IE.

IA. Lipid- komponenter og legemiddel- frigivelseshastigheter

I studier gjennomført i forbindelse med foreliggende oppfinnelse og angitt i eksemplene I—III ble virkningene av lipid-acylkjedelengde og graden av umettethet, lipidladning og nærvær av sterol på in vitro legemiddel-avgivelseshastigheter fra liposomer undersøkt. Av faktorer som ble undersøkt er den viktigste acylkjedelengde og graden av umettethet i fosfolipidet (lipidene) som danner liposomene. Undersøkelsen gjengitt i eksempel I viser at in vitro halveringstiden for legemiddel-avlevering (et mål for tiden som kreves for at halvdelen av det liposom-innkapslede legemiddelet skal frigis fra liposomene ved inkubering in vitro) kan variere med en faktor på 100 eller mer, avhengig av acylkjedelengde og grad av umettethet. I førti forskjellige fosfatidylkolin (PC) lipider og lipid-blandinger som ble undersøkt, førte økning av enten acylkjede-lengden eller graden av metning av fosfolipidacylkjedene til lengere halveringstider for legemiddelavlevering, de størte økningene ble observert når liposomene innbefattet en betydelig andel av lipider hvis overgangstemperatur (Tc) ligger over den temperaturen hvorved halveringstidene for avlevering ble målt, f.eks. 37 "C.

Studier av virkningen av lipid-ladning på f rigivelseshastigheter for legemiddel, angitt i eksempel II, viser at tilsatsen av et negativt ladet lipid, såsom fosfatidylglyserol (PG), ved et mol-forhold på ca. 10%, gir en svak til moderat økning av halveringstiden for avgivelse. Lipid-ladningseffekten er noe avhengig av graden av metning og kjedelengden i de ladede og uladede lipidene som anvendes for fremstilling av liposomene, ladningseffekten gir en større økning i avleveringshastighet for legemiddelet når liposomene er dannet av hovedsakelig kortere og/eller umettede lipider, og. gir mindre virkning i tilfellet lenger-kjedede og/eller mettede lipider.

Virkningen av sterol, enten kolesterol eller den negativt ladede kolesterol, hemisuksinat, på legemiddelavgivelsen fra liposomer er studert i eksempel III. En første undersøkelse innbefattet liposomer dannet med ett av åtte PC lipider eller lipid-blandinder og kolesterol, ved et PC/kolesterolmol-forhold på 60:40. Generelt ble kolesterol funnet å ha en modererende virkning på acylsammensetningen av fosfolipidet, idet den svakt økede halveringstiden for legemiddelavgivelse i liposomer inneholdende hovedsakelig umettede og kortere-kjedede PCer, og ga en betydelig reduksjon i halveringstidene for legemiddelavgivelse i liposomer inneholdende hovedsakelig lengere-kjedede og mer umettede fosfolipider. Denne modererende virkningen kan skyldes den kjente effekten for kolesterol ved at den nedsetter fluiditeten av umettede membraner (hvilket ville gi lengere halveringstider for avgivelse) og øker fluiditeten for mettede membraner (hvilket vil gi kortere halveringstider).

En negativt ladet sterol, såsom kolesterolhemisuksinat, synes når den sammensettes med uladede fosfolipid(er), å ha liten virkning på avlever-ingshastighetene for legemidler sammenlignet med det som observeres i liposomer dannet av uladede fosfolipider og kolesterol (eksempel III). Overraskende øker imidlertid halveringstidene for medisinavlevering som observeres i liposomer bestående av uladede fosfolipider og kolesterol i betydelig grad ved tilsats av negativt ladet fosfolipid (10 mol-% PG). Som det fremgår fra resultatene gjengitt i tabell 5 i eksempel III, øket tilsatsen på 10 mol-% PG til liposomer som også inneholder PC (50 mol-%) og kolesterol (40 mol-%) halveringstiden for legemiddelavgivelse med mer enn en faktor to, og i noen tilfeller mer enn en faktor tre, sammenlignet med det som observeres for liposomer bestående av PC og kolesterol alene. Kombinasjonen av et nøytralt fosfolipid, såsom PC, et ladet fosfolipid, såsom PG, og kolesterol synes åvære spesielt fordelaktig for å oppnå et område av halveringstider for legemiddel, målt ved 37"C, på mellom ca. 2 og 24 timer.

Lipidene som danner liposomene kan naturligvis innbefatte andre fosfolipider og steroler enn modellipidene som er benytteti de ovenfor nevnte undersøkelsene, og kan også innbefatte andre typer lipider, såsom glykolipider og sfingolipider, som er kompatible med liposom-dannelse. En liste over lipider som er vanlig benyttet for liposom-fremstilling er gjegitt på side 471 i referanse 2. Liposomene kan også være sammensatt slik at de inneholder forskjellige typer legemiddel-beskyttende eller lipid-beskyttende midler, såsom antioksydanten ot-tokoferol, som typisk innbefattes i en megnde på 1,0 mol-% i liposomene beskrevet ovenfor.

En annen faktor ved utformingen av liposomene som har en valgt avgivelseshastighet for legemiddel er intraksjonen mellom legemiddelet og liposom-dobbeltlaget (lagene). Undersøkelsene gjengitt i eksemplene I —III innbefatter et vannoppløselig legemiddel, metaproterenolsulfat (MPS), som er innesluttet i liposomer hovedsakelig i innkapslet form, dvs. i det vandige veskulærrommet i liposomene. For mer lipofile legemidler, som viser tendens til fordeling i den lipide dobbeltlagsfasen av liposomet, kan de relative virkningene av acylkjedelengder og metning, sterolinnhold, og lipid-ladningstetthet gi noe andre virkninger på avgivelseshastigheten for legemiddelet. Fremgangsmåtene beskrevet i eksemplene I—III for bestemmelse av virkningene av forskjellige lipid-sammensetningsparametre på halveringstidene for legemiddel-frigivelse er anbefalt for bestemmelse av lipid-sammensetningsvirkninger på avgivelse av andre valgte lipid— oppløslige eller vann-oppløselige legemidler.

IB. Liposom - f r emstilling

Liposomene kan fremstilles ved en rekke teknikker, såsom de som er angitt i referanse 2. Valget av liposom-fremstillingsmåte vil delvis avhenge av naturen av legemiddelet som skal innkapsles. Som angitt ovenfor innbefatter "legemiddel" et hvilket som helst farmakologisk aktivt middel som har et virkningssete i lutrøret, eller er terapeutisk aktivt når det opptas systemisk fra luftrøret. Slike legemidler kan innbefatte antibiotika, peptidhormoner, enzymer, enzyminhibitorer, anti-tumormidler, bronkodilatorer, allergener, anti-histaminer og biogeniske forbindelser, såsom steroider og prostaglandiner.

For diskusjonsformål betraktes tre generelle klasser avlegemidler. Den første klassen er vannoppløselige, liposom-gjennomtrengelige legemidler som er kjennetegnet ved en tendens til foretrukket fordeling i den vandige delen av liposom-suspensjonen, og likevektsinnstilling over tid, mellom de indre liposomale rommene og den ytre bulkfasen av suspensjonen. Tiden som kreves for likevektsinnstilling er naturligvis relatert med legemiddel-frigivelseshastigheten for liposomene, og vil derfor variere avhengig av lipid-sammensetningen av liposomene. Som angitt ovenfor er halveringstider for legemiddel-frigivelse på mellom et par timer og dager typisk. Videre vil hvert legemiddel ha sin egen karak-teristiske frigivesleshastighet, avhengig av legemiddel-størrelse, ladning, og evne til vekselvirkning med liposom-membranen. Eksempler på legemidler i denne klassen innbefatter terbutalin, albuterol, atropinmetylnitrat, kromolynnatrium, propanolol, flunoisolid, ibuprofin, gentamycin, tobermycin, pentamidin, peicillin, teofyllin, bleomycin, etoposid, kaptoprel, n-acetylcystein og verapamil.

En andre generell klasse av legemidler er legemidler som er vannopp-løselige, men liposom-ugjennomtrengelige. For det meste er dette peptid-eller proteinmolekyler, såsom peptidhormoner, enzymer, enzyminhibitorer, apolipoproteiner, og karbohydrater av høyere molekylvekt, disse er kjennetegnet ved langvarig stabilitet av innkapslingen. Eksempler på forbindelser i denne klassen innbefatter kalsitonin, atriopeptin, cx-1 antitrypsin (proteaseinhibitor), interferon, oksytocin, vasopressin, insulin, interleukin-2, superoksyd-dismutase, vevsplasminogenaktivator (TPA), plasma faktor 8, epidermisk vekstfaktor, tumornecrosefaktor, lungeoverflateaktivt protein og lipokortin.

I den tredje klassen av legemidler er lipofile molekyler som viser tendens til fordeling i den lipide dobbeltlagsfasen av liposomene, og som derfor er forbundet med liposomene hovedsakelig i en membran-innkapslet form. Legemidlene i denne klassen er definert ved en olje/vann fordelingskoeffisient, målt i en standard olje/vannblanding, såsom oktanol/vann, på større enn 1 og fortrinnsvis større enn ca. 5. Repre-sentative legemidler innbefatter prostaglandiner, amfotericin B, progesteron, isosorbid-dinatrat, testosteron, nitroglyserin, estradiol, doksorubicin, beklometason og estere, vitamin E, kortison, deksametason og estere, DPPC/DPPG fosfolipider og betametasonvalerat.

En foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av legemiddelholdige liposomer er fremgangsmåten med revers fasefordampning beskrevet i referanse 3 og i U.S. patent nr. 4,235,871. I denne fremgangsmåten blandes en oppløsning av liposom-dannende lipider med et mindre volum av et vandig medium, og blandingen dispergeres, slik at det dannes en vann-i-olje-emulsjon. Legemiddelet som skal innkapsles tilsettes enten til lipid-oppløsningen eller det vandige mediet. Etter fjernelse av lipid-oppløsningsmiddelet ved fordampning omvandles den resulterende gelen til liposomer, med en innkapslingseffektivitet, for et vannoppløselig legemiddel, på opp til 50%. Revers fasefordampningsvesiklene (REVene) har typisk gjennomsnittlige størrelser mellom ca. 2-4 um og er hovedsakelig oligolamellære, dvs. inneholder ett eller få lipid-dobbeltlagskall. Den oligolamellære naturen av vesiklene kan lette legemiddelutstrømningen og følgelig bidra til en lavere halveringstid for utstrømning for et innkapslet legemiddel.

En enkel lipis-hydratiseringsfremgangsmåte for fremstilling av multi-lamminære vesikler (MLVer) kan være foretrukket når høy legemiddel-innkapslingseffektivitet ikke er ønsket. I denne fremgangsmåten fordampes en blanding av liposom-dannende lipider oppløst i et egnet oppløsningsmiddel i en beholder, slik at det dannes en tynn film, som deretter dekkes av en vandig oppløsning av legemiddelet. Lipid-filmen hydratiseres slik at det dannes MLVer, typisk med størrelse mellom ca. 0,1 til 10 pm. Som ved REV-fremgangsmåten tilsettes legemiddelt som skal innkapsles enten til de innledende lipidene eller til hydratiserings-mediet, avhengig av dets oppløselighet i vann. Prosent samlet legemiddel-materiale som kan innkapsles i MLVene, beregent som forholdet mellom innkapslet legemiddel og samlet legemiddel benyttet i vesikel-fremstillingen, er typisk mellom ca. 5-20% for vann-oppløsleige legemidler. Som det fremgår i eksemplene I—III er innkapslingseffektiviteten til en viss grad avhengig av lipid-sammensetningen.

Etter liposom-fremstiling kan dispersjonen behandles ved ekstrudering for å redusere den samlede liposom-størrelsen og størrelseshetrogeniteten. Reduksjon av liposom-partikkelstørrelsen kan være viktig for å oppnå effektiv aerosolisering av liposomene, og for maksimalisering av legemiddel-avsetningen i en ønsket del av luftrøret. Forsøk gjennomført for å underbygge foreliggende oppfinnelse tyder på at liposomene som inneholdes i envandig suspensjon kan aerosoliseres effektivt i form av liposom-holdig, vandig ■ partikkeltåke, hvor liposomene er betydelig mindre enn ca. 1 um i diameter. Vedrørende innretning av liposomene til et spesielt område av luftrøret er det fordelaktig å fremstille liposomer hvis størrelse er kompatible med et ønsket størrelsesområde for tåkepartikler. F.eks. vil tåkepartikkelstørrelser på større enn ca. 5 pm fremme avsetning i de øvre områdene av luftrøret, og partikkelstørrelser på mellom ca. 0,5-1,5 um vil fremme avsetning i nedre pulmonarområder av luftrøret. Generelt er liposomer som har partikkelstørrelser mindre enn ca. 1 pm kompatible med et vidt område av tåkepartikkelstørrelser, f.eks. 1-10 pm. Som detvil fremgå nedenfor, hvor liposomene aerosoliseres i form av en vandig tåke, kan den virkelige størrelsen av partikler som bærer liposomene være mye større enn for liposomene selv, og følgelig er den aktuelle liposom-størrelsen mindre viktig for målrettingen.

En effektiv størrelsesbestemmelse-fremgangsmåte innbefatter ekstrudering av en vandig suspensjon av liposomene gjennom en polykarbonatmembran som har en valgt uniform porestørrelse, typisk 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 eller 1 pm (referanse 3). Porestørrelsen av membranen tilsvarer grovt den største størrelsen av liposomer fremstilt ved ekstrudering gjennom denne membranen, spesielt hvor preparatetekstruderes to eller flere ganger gjennom den samme membranen. Denne fremgangsmåten for liposom-størrelsesbestemmelse benyttes ved fremstilling av liposomene beskrevet i de mange eksemplene nedenfor. En senere fremgangsmåte innbefatter ekstrudering gjennom et asymmetrisk, keramisk filter. Denne fremgangsmåten er detaljert beskrevet i søkerens U.S. patentsøknad vedrørende liposom-ekstruderingsfremgangsmåte, søknad nr. 829,710, inngitt 13. februar 1986.

Liposomene kan videre behandles for å fjerne uinnkapslede legemidler og/eller annet oppløst materiale. Konvensjonelle separasjonsteknikker, såsom sentrifugering, diafiltrering og molekylarsiktkromatografi er egnede. Separasjonstrinnet bør utføres etter størrelsesbestemmelse, idet denne fremgangsmåten selv kan gi liposom-oppbrytning og frigivelse av innkapslet legemiddel. Det bør understrekes at fjernelse av fritt legemiddel vil være nødvendig for å fjerne vann-oppløselige, liposom-ugjennomtrengelige legemidler fra liposom-dispersjonen. I tilfelle et lipofilt eller liposom-gjennomtrengelig legemiddel kan den relative prosenten av fritt legemiddel i en liposomsuspensjon reduseres ved konsentrering av lipososmene, ifølge fremgangmsåter beskrevet i avsnitt

IC.

IC. Liposom- suspensjon: Ugjennomtrengelige vann- oppløselige legemidler

Ifølge et viktig trekk ved oppfinnelsen inneholder liposom-suspensjonen som administreres iluftrøret det terapeutiske legemiddelet av interesse hovedsakelig i en liposom-innkapslet form. Med dette forstås at minst ca. 50%, og frotrinnsvis ca. 70% av legemiddelet inneholdes i en liposom-tilknyttet form, dvs. enten innkapslet eller membran-innesluttet form. For vann-oppløselige, liposom-ugjennomtrengelige legemidler kan suspensjonen være en fortynnet liposom-dispersjon hvori bare ca. 5-30% av det samlede vandige volumet er innkapslet i liposomene.

En fortynnet suspensjon av av liposomer kan lett fremstilles, som ovenfor, ved å danne liposomer i nærvær av legemiddelet, størrelses-bestemmelse om ønsket, deretter fjernelse av fritt legemiddel fra suspensjonen. Den endelige konsentrasjonen av innkapslet legemiddel bør fortrinnsvis være slik at de vandige liposom-rommene er iso- eller hypo-osmotiske med hensyn på omgivelsene i luftrøret, for å forhindre liposom-skade ved svelling ved avleveringsstedet. Den endelige konsentrasjonen av liposomer i suspensjonen reguleres for å tilveiebringe en valgt mengde liposom-innkapslet legemiddel i et gitt volum av aerosolisert spary. Hvor, f.eks. en maksimal mengde legemiddel skal avleveres i et gitt suspensjonsvolum bør konsentrasjonen av innkapslet legemiddel være nær isotonisitet, og suspensjonen konsentreres til mellom ca. 20-30% innkasplet vandig volum, dvs. den høyeste liposom-konsentrasjonen som tillater direkte aerosolisering.

ID. Liposom- suspensjon: Gjennomtrengelige vann- oppløselige legemidler

Hvor det vannoppløselige legemiddelet også kan trenge fritt gjennom den liposomale barrieren er det nødvendig å fremstille suspensjonen i en form hvori legemiddelt er henvist hovedsakelig til liposomene, etter fullstendig likevektsinnstilling av legemiddelet mellom de indre liposomale- og ytre bulkfase-områdene av suspensjonen. Denne betingelsen oppnås, ifølge ett trekk ved oppfinnelsen, i en vandig liposom-pasta hvori det innkasplede volumet av vandig medium er større enn ca. 50% og fortrinnsvis ca. 70- 75% av det samlede suspens jonsvolumet, hvilket reflekterer den til-nærmede prosentandelen liposom-innkapslet legemiddel.

I en foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av pastaen konsentreres en relativt fortynnet liposom-dispe r sjon, fremstilt som ovenfor, ved ultrafiltrering, og mer foretrukket, ved tangensiell-strømningsultra-filtrering. En multifilterapparatur for utførelse av filtreringsprosessen er beskrevet i søkerens patentsøknad med tittel "Liposome Concentrate and Method", inngitt 7. mai 1986. Kort uttrykt resirkuleres dispersjonen kontinuerlig gjennom en filtreringsinnretning av ramme- og platetypen som har én eller flere filtreringsenheter, hver bestående av en sentral filtratskjerm og et par filtere anbragt på den øvre og nedre siden av skjermen. Dispersjonen pumpes under trykk gjennom begge membranene, og vandig medium trekkes gjennom filterne over en trykkradient på typisk ca. 34,5-172,4 kPa, høyere gradienter er påkrevet etter som det resirkulerte materialet blir mer konsentrert. Materialet resirkuleres gjennom systemet inntil en ønsket liposom-konsentrasjon oppnås. Denne kan være så høy som 70-75% liposomer, uttrykt i prosent av liposom-innkapslet volum. Ultrafiltreringsmembranene som benyttes i innretningen kan være konvensjonelle membraner, såsom polysulfon, nylon eller celluloseacetatmembraner som har en størrelsesgrense på mellom ca. 10.000-100.000 dalton.

Andre konsentrsjonsfremgangsmåter, såsom tørking og sentrifugering for å pelletisere liposomer, kan også benyttes for å fremstille liposom-konsen-tratet ifølge oppfinnelsen, selv om ultrafiltrering er foretrukket på grunn av fordelene med sterilitet, kapasitet for stort volum og relativt milde betingelser som liposomene eksponeres mot.

I en annen generell utførelse emulgeres liposom-pastaen ovenfor i et drivmiddel-oppløsningsmiddel, slik at det dannes en dobbel emulsjon av liposomer suspendert i konsentrert for i vandige emulsjonspartikler som selv er suspendert i drivmiddel-oppløsningsmiddelet.

Drivmiddel-oppløsningsmiddelet er et hvori (a) liposomer kan suspenderes uten skade på lipid-integriteten av partiklene, og (b) legemiddelet har en relativt lav fordelingskoeffisient med hensyn på vann, slik at bulken av legemiddelet forblir forbundet med liposomene. I eksempel V nedenfor undersøkes stabiliteten av liposom-emulsjoner i seks fluorkarbondrivmidler. Drivmidlene som ble undersøkt er: "Freon 11" (CCI3F), "Freon 12" (CC12F2), "Freon 22" (CHC1F2), "Freon 113" (CCL2FCC1F2), "Freon 114" (CC1F2CC1F2) og "Freon 115" (CC1F2CF3). Tre forskjellige sammensetninger ble undersøkt, og alle viste god stabilitet i Freon 113, 114 og 115. Best stabilitet ble oppnådd med liposomer inneholdende umettede acylkjedefosfolipider. Det registreres at Freon 114 og 115 kan blandes i andeler som gir et egnet damptrykk ved romtemperatur for en aerosol-beholder. Dimetyleter, et annet velkjent drivmiddel-oppløsningsmiddel, kan tilsettes til et fluorkarbon-drivmiddel for å øke oppløsningsmiddel-tettheten, men mengden tilsatt må overvåkes omhyggelig for å forhindre oppløsningsmiddelskade på liposomene.

For å danne den doble emulsjonen tilsettes liposom-pastaen ovenfor til drivmiddel-oppløsningsmiddelet, ved en endelig volumkonsentrasjon på fortrinnsvis ca. 5-30%. Blandingen kan videre inneholde et emulgerings-middel, såsom "Tween-80", for å øke stabiliteten av emulsjonen. Kraftig blanding, f.eks. ved ultralydbehandling, benyttes for å danne den endelige emulsjonen.

I en annen utførelse fremstilles liposomsuspensjonen ved å dispergere tørkede liposomer, i pulverisert form eller på partikkelform, i et drivmiddel-oppløsningsmiddel av typen angitt ovenfor. De tørkede liposomene innbefatter fortrinnsvis et bulkdannelsesmiddel, som tilsettes for å forbedre sammensetningen på flere måter: Middelet forbedrer male-egenskapene for det tørkede materialet, og øker også tettheten av partiklene, slik at det oppnås bedre dispersjon i relativt tette fluorkarbondrivmidler. Bulkdannelsesmiddelet kan også virke slik at det beskytter liposomene og det innkapslede legemiddelet mot drivmiddelet, og tilveiebringer større partikkelkohesjon i den suspenderte formen. Det finnes også tegn på at bulkdannelsesmiddelet reduserer membranskaden ved tørking og dehydratisering, slik at mindre fritt legemiddel produseres når de tørkede liposomene rehydratiseres i den fuktige omgivelsen i lungen. Videre forbedrer bulkdannelsesmiddelet, på grunn av den hydroskope naturen, hydratiseringen under passasje gjennom luftveiene. Foretrukne stabiliseringsmidler innbefatter en rekke mono- eller disakka- rider, såsom glukose, mannitol, trehalose, sukrose og laktose, som tåles godt i luftrøret.

Fremgangsmåter for fremstilling av liposomer inneholdende slike bulk-dannelsesmidler i innkapslet form er beskrevet i søkerens patentsøknad vedrørende "Stabilized Liposome/Amphotericin Composition and Method", søknad nr. 781,395, inngitt 17. oktober 1985. Ved en fremstillings-fremgangsmåte tilsettes en oppløsning av vesikel-dannende lipider i et organisk oppløsningsmiddel til partikler av buldannelsesmiddel, og lipid— oppløsningsmiddelet fordampes, idet lipidene avsettes som et belegg på partiklene. Fremstillingsfremgangsmåten følger nå de ovenfor angitte MLV-fremgangsmåtene, med tilsats av hydratiserende medium som gir MLVer med oppløst bulkdannelsesmiddel inneholdt i den innkapslede og den ytre bulkfasevandige delen. Ikke-innkapslet middel kan fjernes før dehydratisering av liposomene.

Diposom-dispersjonene eller pastaen dehydratiseres ved kjente teknikker, som kan innbefatte lyofilisering eller spraytørking under vakuumbeting-elser. Etter tørking oppdeles liposomene i partikler ved maling e.l., til en endelig størrelse på mindre enn ca. 5 um, og fortrinnsvis mindre enn ca. 1 um. Liposom-pulveret tilsettes til drivmiddel-oppløsningsmiddelet i en endelig konsentrasjon som fortrinnsvis er 1-10 vekt-%.

D. Liposom- suspensjon: Lipid- oppløselige legemidler

Liposom-suspensjonen for anvendelse med lipofile legemidler er en vandig suspensjon hvis lipid-konsentrasjon er minst tilstrekkelig til å sikre at 50% eller mer, og fortrinnsvis 70% eller mer av legemiddelet er i den lipide (liposom-dobbeltlags) fasen av suspensjonen, og inne i liposomene. Liposom-konsentrasjonen som kreves vil avhenge av fordelignskoef-fisienten for legemiddelet, såvel som andre faktorer nevnt ovenfor. Dersom legemiddel-fordelingskonstanten bare er noe større enn 1 må suspensjonen konsentreres til en pastalignende konsistens, hvori ca. halvparten eller mer av det samlede vandige volumet er liposom-innkapslet. Med fordelingskoeffisient på ca. 10 vil en langt mer fortynnet, vandig oppløsning være mulig. Naturligvis er omfanget av tillatt for-tynning også begrenset av behovet for å innkapsle en tilstrekkelig legemiddeldose i en relativt liten mengde av aeosolisert materiale.

II. Aerosolisering av liposomer

Foreliggende inhaleringssystem innbefatter også en innretning for aerosolisering av liposom-suspensjonen i en form egnet for inhalering. Disse innretningene er omtalt nedenfor i forbindelse med de tre generelle typene av liposom-suspensjoner som forstøves.

IIA. Fortynnede liposom- suspensjoner

Pneumatiske forstyrrere som er utformet for atomisering av vandig prøve er kommersielt tilgjengelige, og fungerer ved velkjente fremgangsmåter, som f.eks. angitt i eksempel IV. Typisk utføres forstøvningsoperasjonen ved et trykk på ca. 34,5-103,4 kPa, og de vandige partiklene som dannes ligger typisk i området fra 2 til 6 um. Innretningen kan kontrolleres slik at det dannes en målt mengde aerosoliserte liposomer, ifølge kjente operasjonsvariabler (referanse 4).

Fomrdi aerosoliseringsfremgangsmåten kan resultere i mekanisk oppbrytning av en liposom-suspensjon kan det være viktig å fastslå at forstøvningsprosessen ikke i betydelig grad påvirker liposom-integritet og -størrelse. Virkningen av aerosolisering ved hjelp av en pneumatisk forstøver på liposom-partikkelstørrelsen og tapet av innkapslet materiale er gjengitt i eksempel IV. Her ble det undersøkt fire liposom-sammensetninger med halveringstider for legemiddel-avgivelse in vitro varierende fra 206 minutter til 5.256 minutter, og hver med en opprinnelig partik-kelstørrelsesfordeling på ca. 0,180-0,300 pm, vedrørende størrelsesendring og tap av innkapselt materiale etter aerosolisering ved 34,5 kPa. Som gjengitt i tabell 7 i eksempel IV ble ingen endring i liposom-størrelse eller tap av innkapslet materiale observert for tre av preparatene, og bare et lite tap av innkapslet materiale og en moderat økning i størrelse ble observert for liposomer med den laveste halveringstiden for medisin-utst rømning.

En annen innretning egnet for aerosolisering av en vandig suspensjon av liposomer, og fortrinnsvis en relativt fortynnet suyspensjon inneholdende mindre enn ca. 25-30% innkapslet vandig volum, benytter ultralydenergi for å bryte opp et bærerfluid til en fin tåke av vandige partikler. Ultralydforstøvningsinnretningen er funnet å gi en liposom-aerosoltåke hvis partikkelstørrelse er tilnærmet den samme som dannet ved hjelp av en forstøver med komprimert luft, dvs. mellom ca. 2-6 um. Virkningen på liposom-størrelse og retensjon av innkapslet materiale ved ultralyds-aeosolisering ble undersøkt i en undersøkelse svarende til den som er omtalt ovenfor, og er også gjengitt i eksempel IV nedenfor. Resultatene av denne undersøkelsen, sammenfattet i tabell 8 i eksempel IV, stemmer overens med resultatene fra den tidligere undersøkelsen, og viser at aerosoliseringsprosesen har i det vesentlig ingen virkning på liposom-størrelsen eller frigivelsen av innkapslet materiale, bortsett fra en relativt liten effekt på liposomene sammensatt hovedsakelig av korte lipider med umettede acylkjeder.

IIB. Liposom- pastasuspens joner

For aerosolisering av en liposom-pasta av typen benyttet for avlevering av et vannoppløselig, liposom-gjennomtrengelig legemiddel blandes pastaen først med et bæreroppløsningsmiddel, slik at det dannes en fortynnet dispersjon som kan aerosoliseres. Bæreroppløsningsmiddelet kan være et vandig medium, i dette tilfellet fortynnes pastaen til en form som er egnet for spraying, f.eks. ved hjelp av en pneumatisk eller ultralyds-forstøver. Mengden fortynningsmiddel som tilsettes er tilstrekkelig til å fortynne pastaen til en spraybar dispersjon, som fortrinnsvis inneholder mindre enn ca. 30% samlet, innkapslet volum. Dersom det antas at pastaen har et innledende innkasplet volum på 70-75% av det samlede pastavolumet, fremgår det at et gitt volum av pastaen må fortynnes med minst én eller to volumdeler av fortynningsmiddel.

Alternativt kan bæreroppløsningsmiddelet være et drivmiddel-oppløsnings-middel, som når det blandes med liposompastaen, danner enten en pasta-i-drivmiddelemulsjon av typen beskrevet ovenfor i avsnitt ID, eller en skummet pastablanding dannet ved å innføre drivmiddel under trykk i pastaen. Volumforholdet mellom pasta og drivmiddel er fortrinnsvis mellom ca. 10-30%, dette gir en emulsjon eller skumsammensetning som lett kan aerosoliseres.

En egnet aerosoliseringsinnretning for fremstilling og spraying av emulsjonen innbefatter (1) separate kammere for oppbevaring av pastaen og bærervæsker, (2) et blandkammer hvor utmålte mengder av de to væskene blandes, og (3) innretning for aerosolisering av innholdet av blandkammeret. Medisininnretninger utformet for lagring av to forskjellige væsker isolert fra hverandre, og for periodisk tømming av væskene i kontakt med hverandre er kjent, som f.eks. beskrevet i U.S. patent nr. 3,325,056. Der hvor innretningen virker slik at pastaen blandes med et vandig bærermedium kan den pneumatiske energien eller ultralydsenergien som benyttes for å oppnå aerosolisering også benyttes for å bevirke rask og fullstendig blanding av de to fluidene. Frigivelsesinnretningen innbefatter ventilstruktur som står i kontakt med blandkammeret, slik at frigivelse av innholdet av blandkammeret tillates gjennom en dyse. Her skal det bemerkes at blande- og sprayetrinnene utføres i relativt rask rekkefølge, før betydelig lekkasje av innkapslet legemiddel inn i den vandige bæreren kan finne sted, dvs. mens legemiddelet fremdeles er hovedsakelig i liposom-innkapslet form.

Dersom det anvendes en selvstendig forstøver inneholdende et drivmiddel-bærerfluid kan de to fluidene blandes under betingelser som forårsaker rask oppbrytning av pastaen ved forgassning eller skumming, like før den forgassede blandingen føres gjennom en dyse for å oppnå aerosolisering. Alternativt kan innretningen drives slik at den inneslutter pastaen i emulsjonsform i det flytende drivmiddelet, like før blandingen støtes ut. Frigivelsesinnretningen er en ventilstruktur som står i forbindelse med blandkammeret, slik at innholdet i kammeret som står under selv-frembragt trykk får slippe ut gjennom dysen. Drivmiddel-oppløsnings-middelet er fortrnnsvis en fluorkarbon eller fluorkarbon/dietyleter-blanding, som omtalt ovenfor, som ikke i seg selv forårsaker betydelig liposom-nedbrytning. Siden liposomene imidlertid er i kontakt med oppløsningsmiddelet bare i en kort blande- og sprayeperiode er problemer forbundet med liposom-nedbrytning og legemiddel-fordeling over den liposomale barrieren mindre alvorlig hvor bulkfasen av liposom-suspensjonen i seg selv er et drivmiddel-oppløsningsmiddel, dvs. hvor liposomene innledningsvis sammensettes i et drivmiddel-oppløsningsmiddel.

IIC. For f r emstilte liposom - / drivmiddelsuspensjoner

Beholderinnretninger med ventil for aerosolisering av partikkelformig materiale suspendert i et drivmiddel-oppløsningsmiddel er velkjente. Disse innretningene drives generelt ved at det tilføres en partikkelsuspensjon til et utmålingskammer, og innholdet av kammeret tvinges gjennom en dyse under trykk, slik at en utmålt mengde av suspensjonen aerosoliseres. Ved foreliggende oppfinnelse er partikkel-/drivmiddelsuspensjonen enten en suspensjon av tørkede partikkelformige liposomer, eller en suspensjon av liposom-pastaemulsjonspartikler, fremstilt som angitt i avsnitt ID ovenfor. Med begge typer av emulsjoner kan partikkel-separasjon fra drivmiddelet ved henstand kreve at beholderen ristes kraftig før bruk, for å resuspendere liposomene uniformt i oppløsnings-middelet. Det skal bemerkes at tilnærmet alle selvstendige aerosol-innretninger krever kraftig risting før anvendelse.

III. Terapeutiske anvendelser

En rekke tilstander og sykdommer i luftrøret, innbefattende nasal-kongestion, astma og andre bronkospasme tilstander, nasalbetennelse og vaskulær hodepine, kan behandles ved legemiddelinhaleringsterapi ifølge foreliggende oppfinnelse. Eksempler på legemidler som er nyttige ved behandling av tilstander og sykdommer i luftrøret er gjengitt i referanse 1, og innbefatter nasale dekongesjonsmidler såsom propylheksedrin og metylheksylamin; respirasjonsstimulerende midler såsom epinefrin, isoproteranol og metaproteranol og isoetarin; kortikosteroider såsom deksametason og beklometason; og andre medikamenter såsom kromolyn, natriumacetylcystein og ergotamintartrat.

Ved fremstilling av lipsomer for målretting av et legemiddel til luftrøret sammensettes liposomene slik at det dannes en valgt in vitro medisin-frigivelseshastighet, fortrinnsvis målt ved ca. 37 °C, slik at det oppnås en kontrollert legemiddelfrigivelse ved målsetet i luftrøret. Det er vist i avsnitt IA hvordan lipid-sammensetningsfaktorer kan varieres for å oppnå halveringstider for in vitro legemiddelfrigivelse varierende fra så kort som en halv time eller mindre opp til flere dager. Ifølge et annet viktig trekk ved oppfinnelsen kan liposom-sammensetningen varieres selektivt for å moderere uønskede systemiske bivirkninger som observeres når legemiddelet opptas systemisk fra avsetningsstedet i pulmonarområdet av luftrøret. Generelt vil de samme lipid-sammensetningsfaktorene som fører til lengere halveringstider for legemiddelfrigivelse være effektive for reduksjon av systemiske legemiddelnivåer som observeres kort etter administrering av legemiddelet ved inhalering. For, f.eks. å frembringe en reduksjon i innlednede systemiske legemiddelnivåeffekter kan lipo somene sammensettes med en større prosentandel av langkjedede og/eller mettede acylkjedefosfolipider.

Anvendelsen av fremgangsmåten og systemet ifølge oppfinnelsen for behandling av bronkokonstriksjon er illustrert i eksempel VI nedenfor. Dyrene som ble undersøkt ble behandlet ved inhalering med MPS i fri form eller inkapslet i ett av to liposomer med forskjellig smamensetning - det ene hadde en halveringstid for in vitro medisinfrigivelse på 250 minutter og det andre en halveringstid for utstrømning på ca. 1.150 minutter. Begge liposom-sammensetningene ble avlevert i vandige aerosolpartikler hvori legemiddelet var inneholdt hovedsakelig i innkapslet form, og mengden av MPS avlevert var tilnærmet den samme for både liposom-innkapslet og fritt MPS. Etter legemiddeladministrering ble graden av beskyttelse mot bronkokonstriksjon frembragt ved hjelp av aerosoler av acetylkolin-oppløsning målt tilnærmet hvert 15. minutt i et tidsrom på fire timer. Typiske resutlater for to dyr, som representerer gjennomsnittet av tre forsøk for både det frie legemiddelet og de to liposom-innkapslede legemiddelsammensetningene er vist i figur 1. De gjennomsnittlige beskyttelsesverdiene i prosent er angitt ved åpne firkanter for det frie legemiddelet, ved fylte sirkler for liposom-sammensetningen med lang halveringstid (1.150 minutter), og ved åpne sirkler for liposom-sammensetningen med kort halveringstid (250 minuter). Som det fremgår av resultatene ga både fritt og liposom-innkapslet legemiddel tilnærmet den samme graden av beskyttelse som det frie legemiddelet.

Den ovenfor nevnte MPS inhaleringsbehandlingen illustrerer også evnen av liposom-innkapslet MPS til å beskytte dyret mot takikardi, en relativt alvorlig systemisk bivirkning som observeres når MPS administreres ved inhalering i fri form. Virkningen av fritt legemiddel og liposom-innkapslet legemiddel på prosentøkning i hjertehastighet under den fire timers perioden etter MPS administrering ved inhalering ble også målt. Typiske resultater, som represneterer gjennomsnittet av tre forsøk for hvert av fritt legemiddel og de to liposom-innkapslede legemiddelsammensetningene er vist i figur 2. Som i figur 1 er resultatene svarende til fritt legemiddel angitt ved åpne firkanter, liposom-sammensetningen med lang halveringstid ved fylte sirkler, og liposomene med kort halveringstid ved åpne sirkler. Som det fremgår av figuren ga fritt legemiddel en tilnærmet 90% økning i hjertehastighet i løpet av ca. 5 minutter fra legemiddel-administrering, og denne hjertehastigheten avtok gradvis over observasjonsperioden på fire timer til et nivå på 50%.

Derimot ga behandling med den samme kons ent r j sonen av legemiddel, men inneholdt i liposom-preparat, en innlednede økning i hjertehastighet observert i løpet av den første halve timen etter legemiddeladministrering, på mellom 20-30%. Denne hastigheten forble i det vesentlige konstant i løpet av perioden op fire timer, hvilket tyder på at en relativt liten mengde legemiddel avleveres i anvendelig form innledningsvis, men at dette avleveres til absorpsjonsstedet med en relativ konstant hastighet over en forlenget legemiddel-avleveringsperiode.

Liposom-preparatet med kort halveringstid (åpne sirkler i figur 2) beskyttet også mot høy innledende hjertehastighetsøkning og viste i det vesentlige konstante systemiske legemiddelnivåer i løpet av overvåkningsperioden på fire timer. Det er interessant at den målte hjertehastigheten for preparatet med kort halveringstid var uniformt ca. to ganger høyere enn for preparatet med lang halveringstid under overvåkningsperioden.

En lignende gruppe forsøk ble utført for å måle de terapeutiske og systemiske bivirkningene som oppstår ved administrering av liposom-innkapslet MPS til bedøvede marsvin. Undersøkelsen innbefattet de fire liposom-preparatene: (1) EPG/EPG/kolesterol/cx-T (5:1:1:0,1), som har en halveringstid for MPS frigivelse på 250 minutter (eksempel III); (2) DSPC/DSPG/kolesterol/oc-T (5:1:1:0,1), som har en halveringstid for MPS frigivelse på 1148 minutter (eksempel III); (3) DPPC/DPPG/cx-T (5:1:1:0,1), som har en halveringstid for MPS frigivelse på 941 minutter (eksempel III); og (4) DPPC/DPPG/a-T (9:1:0,1), som har en halveringstid for MPS frigivelse på 5256 minutter (eksempel II). Hvert preparat inneholdt 1% MPS, hovedsakelig i innkapslet form.

Dyrene ble tilført ett av de fire liposom-preparatene, eller saltvann (som en kontroll) eller fritt legemiddel. Dyrene i hver forsøksgruppe ble stailisert i 15 minutter etter bedøvelse, deretter ble det administrert kontrollert volum av aerosol ved intubering i et tidsrom på 2 minutter. Ved 15, 45, 90 og 105 minutter etter aerosoltilførselen fikk dyrene en dose av histamin, i løpet av et tidsrom på 15 sekunder, slik at det ble forårsaket en transient, astmalignende bronkokonstriksjon. Dyrene ble overvåket med hensyn på luftveisresistens, dynamisk "compliance", hjertehatighet og blodplasmanivåer av MPS ved intervaller på 30 minutter i løpet av et tidsrom på to timer etter aerosoladministrering. Luftveis - resistansen og målingen av den dynamiske "compliance" angir graden av beskyttelse som tilveiebringes ved MPS behandlingen mot den histamin-induserte bronkokonstriksjonen. Preparat 1, med en relativt høy frigivelseshastighet (lav halveringstid for medisinfrigivelse) var tilnærmet like effektiv som et legemiddel i forebyggelse av forøket luftveisresistens og dynamisk "compliance", mens preparatene 2 og 3, begge med middels hastigheter for legemiddelfrigivelse, viste terapeutiske virkninger som var mellomverdiene for fritt legemiddel og saltvannskontrollprøven. Det er interessant at preparat 4, som har den laveste legemiddel-frigivelseshastigheten in vitro, lignet på preparat 1 og fritt legemiddel år det gjelder beskyttelse mot luftveisresistens og dymnamisk "compliance" økning. Forklaringen på denne anomalien kan være at DPPC/DPPG-lipidne i preparat 4 liposomene er dominerende fosfolipider i luftrøret, og derfor kan utveksle fosfolipider med eller bli intergrert i lipid-membranene ved målsetet relativt raskt, med ledsagende frigivelse av legemiddelet. Denne antagelsen understøttes av resultatene fra systemisk legemiddelvirkning, omtalt nedenfor, som indikerer at preparat 4 liposomer gir systemiske legemiddelnivårer som ligger mellom de for preparat 1 og de for preparatene 2 og 3. Det er også mulig at DPPC og DPPG lipidene i preparat 4 liposomene er terapeutisk effektive, uavhengig av frigivelsen av MPS.

Prosent økning i hjertehastighet tilveiebringer, som i den tidligere undersøkelsen, et mål for den systemiske virkningen av legemiddelet. Som det fremgår i figurene 3A og 3B gir fritt MPS (åpne firkanter i figurene) en høy innledende økning i hjertehastighet, som deretter faller langsomt i løpet av de neste 90 minuttene til et nivå ca. 20% ovr normalt. Denne prosentvise økningen er mye midnre når legemiddelet administreres i innkapslet form, enten i preparat 1 liposomer (åpne sirkler i figur 3A), eller i preparat 4 liposomer (lukkede sirkler i figur 3B). I samsvar med den tidligere undersøkelsen var videre det mer stabile liposompreparatet (4). vesentlig mer effektivt for reduksjon av den uønskede hjertestimuleringsbivirkningen enn preparat 1 liposomene. Selv om det ikke er vist i figurene ga de to mellomliggende preparatene 2 og 3 hjvertehastighetsøkninger, som en gjenspeiling av systemiskelegemiddel-nivåer, som begge var betydleig lavere enn for preparat 4. Virkningen av liposomer ved reduksjon av MPS nivåer i blodstrømmen etter legemiddelavlevering til lunkgene fremgå mer dramatisk fra plasma MPS konsentrasjonsnivåene gjengitt i figur 4. Med fritt legemiddel var plasma-legemiddelnivåer tilnærmet 80 ng/ml innlednigsvis, med en langsom reduksjon i løpet av en to timers periode til ca. 20 ng/ml. Med alle liposom-preparatene var derimot plasma-legemiddelnivåene fastholdt ved et i det vesentlige konstant nivå under ca. 10 ng/ml under hele forsøks-perioden.

Resultatene ovenfor demonstrerer to viktige trekk ved oppfinnelsen. Det første er liposomenes evne til å moderere de innledende og forlengde legemiddel-nivåvirkningene av et legemiddel administrert ved inhalering. Dvs. at liposomene fungerer ved å "flate ut" legemiddel-frigivelseskurven som observeres for fritt legemiddel ved innledende reduksjon av legemiddel-nivåvirkningene og opprettholdelse av forhøyede legemiddelnivåer over et forlengdet tidsrom. Det andre trekket er evnen til å kontrollere eller regulere legemiddel-f rigivelseshastigheter in vivo ved anvendelse av liposomer som har en egnet valgt in vitro legemiddel-frigivelseshastighet. Som det fremgår i systemet ovenfor kan den valgte hastigheten for legemiddelfrigivelse varieres opp til ca. en faktor 2 ved egnet valg av liposomer hvis in vitro legemiddel-frigivelshastigheter varierer med en faktor i området 4-5.

Ved sammensetning av liposomer for anvnedelse ved inhaleringsbehandling er det naturligvis nødvendig å oppnå en terapeutisk effektiv dose av legemiddel under tidsrommet for forlenget legemiddelfrigivelse, og av denne grunn kan liposomer som har svært lange halveringstider for legemiddelfrigivelse være terapeutisk suboptimale. Ved bronkokonstrik-sjonsbehandlingen beskrevet ovenfor tyder den sammenlignbare terapeutiske virkningen av liposom-innkapslet MPS, med hensyn på fritt legemiddel, på at selv liposomer med lang halveringstid fungerer slik at legemiddelet frigis ved en konsentrasjon som er optimal eller tilnærmet optimal for terapeutisk virkning.

Ifølge et viktig trekk ved oppfinnelsen er inhaleringssystemet og fremgangmsåten beskrevet ovenfor fordelaktig for avlevering av legemiddelet systemisk, såvel som lokal avlevering i luftrøret. De kontrollerte legemiddel-f rigivelseshastighetene for et systemisk virkende vannoppløselig legemiddel (MPS) er vist ovenfor. Lipid-oppløselige legemidler, som hovedsakelig inneholdes i lipid-dobbeltlagsområdet av liposomer, blir gradvis forbundet med endogene lungelipider, med liposom-avsetning i det nedre luftrøret, og i denne formen kan legemidlene traversere blod-gassbarrieren og tre inn i pulmonarsirkulasjonen via konsentrasjonsavhengig diffusjon.

Avlevering av legemidler i en hovedsakelig liposom-assosiert form løser en rekke problemer som oppstår når legemiddelet administreres i fri eller hovedsakelig fri form. I tillegg til de legemiddelmodrerende og ved-varenede-frigivelsestrekkene angitt ovenfor virker liposomene slik at de beskytter legemiddelet mot oksydasjon og beskytter luftrøret mot potensielt irriterende legemidler, spesielt legemidler som, på grunn av oppløselighetsegenskaper, må administreres i mikronisert form.

I en anvendelse for intrapulmonar legemiddelavlevering avleveres oc-1-protease til lunge-interstitium i liposom-innkapslet form for å stanse utviklingen av lunge-emfysem. Liposomene virker slik at de beskytter protease-inhibitorens tertiære struktur mot oksydasjon, og letter dens transport over lungecellemembranene.

Et eksempel på en spesifikk anvendelse for systemisk legemiddelavlevering er innkapsling og avlevering av nitroglyserin, en hjertekardilator som benyttes for å lette symptomene på angina pectoris. Legemiddel-preparatet vil typisk inneholde ca. 30-40% fritt legemiddel, som raskt kan absorberes av lungeblodstrømmen og transporteres direkte til hjertet, legemiddelets primære virkningssete, og tilveiebringe øyeblikkelig lettelse for brystsmerten forbundet med angina. De gjenværende 60-70% eller mer av det liposom-innkapslede legemiddelet frigis langsomt, ved en hastighet som kontrolleres av liposom-sammensentingen, slik at det oppnås forlenget hjertekar-dilatering, og følgelig fravær av brystsmerte i et lengere tidsrom.

Oksytocin, et peptid-hormon som induserer og forsterker styrken av livmormuskel-kontraksjoner under fødsel kan sammensettes og avleveres på en måte som tilsvarer den beskrevet for nitroglyserin. Den avleveres idag ved intravenøs infusjon, en prosess som krever plassering og opprettholdelse av en venekanyle, en ofte vanskelig prosedyre som begrenser pasientens bevegelse og posisjon. Aerosoler av liposom - oksytocinpreparat ville tilveiebringe øyeblikkelig og vedvarende avlevering til den systemiske sirkulasjonen, tilsvarende det som tilveiebringes ved IV infusjon, uten å begrense pasientens bevegelse.

Fra de ovenstående fremgår det hvordan forskjellige formål og trekk ved oppfinnelsen oppnås. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater administrering av lipid- eller vannoppløselige legemidler, under betingelser som gir kontrollert frigivelse av legemiddelet ved målsetet. Den kontrollerte frigivelsen av legemiddel kan tjene det formål å utvide tidsintervallet mellom legemiddeladministreringer, moderere korte og langvarige cykliske variasjoner i legemiddelnivåer, enten ved stedet for avsetning eller systemiske legemiddelnivåer, og/eller i vesentlig grad redusere uønskede systemiske bivirkninger.

Liposomene som benyttes i fremgangsmåten og systemt ifølge oppfinnelsen kan sammensettes slik at det oppnås en ønsket, kontrollert frigivelseshastighet for legemiddel, ved at liposomene sammensettes slik at en valgt in vitro legemiddel-utstrømningshastighet oppnås.

Inhaleringsfremgangsmåten og -systemet er kompatible med en rekke forskjellige aerosoliseringsfremgangsmåter som tillater administrering ved inhalering av lipospomer i aerosoler med forskjellig partikkelstørrelse og forskjellig form, varierende fra store, vandige partikler til relativt små, pulveriserte liposom-preparater.

Toksisitetsstudier gjennomført i forbindelse med oppfinnelsen viste ingen negative virkninger av liposomer administrert ved inhalering. Under betingelsene for undersøkelsen ved akutt (fire timers) eksponering mot en enkelt dose av aerosoliserte liposomer, forekom ingen statistisk signifi-kante forskjeller mellom en fosfat-bufret saltvannsoppløsning (blindprøve) og to liposom-eksponerte musepopulasjoner i kroppsvekt, vekt av frisk, utskåren lunge, og lysmikroskopiske histopatologiske funn.

De følgende eksemplene er ment å illustrere forskjellige trekk og anvendelser av foreliggende oppfinnelse, men begrenser ikke oppfinnelsens omfang.

Eksempel I

Virkning av lipid- kjedelengde og metning på legemiddel- utstrømning Metaproteranolsulfat (MPS) ble oppnådd fra Vinchem Inc. (Chatham, NJ); oc-tokoferol (cx-T), fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO); og ^- C sukrose fr Amersham Co. (Arlington Hts, IL). Egg-fosfatidylkolin (EPC), soya-fosfatidylkolin (SPC), hydrogenert egg-fosfatidylkolin (HEPC), hydrogenert soya-fosfatidylkolin (HSPC), dioleoyl-fosfatidylkolin (DOPC), dimyristoyl-fosfatidylkolin (DMPC), dipalmitoyl-fosfatidylkolin (DPPC), og distereoyl-fosfatidylkolin (DSPC) ble oppnådd fra Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL). 8 PC lipidene har overgangstemperaturene (Tc) og fettacylkjede-sammesetningene gjengitt i tabell 1 nedenfor, hvor lipider som har større acylkjedelengder og/eller grad av metning er arrangert i avtagende rekkefølge.

For hvert av de 8 PC-lipidene ble multilamellære vesikler (MLVer) fremstilt ved å oppløse 350 umol av det valgte PC-lipidet med 1 mol-% cx-T i kloroform. Det, oppløste lipidet ble inndampet til tørrhet under vakuum i en rundbunnet kolbe slik at det ble dannet en lipid film på kolbeveggene. En 5 ml oppløsning inneholdende 20 mg/ml MPS og 1,1 x IO? cpm 14c -sukrose i fosfat-bufret saltvannsoppløsning (PBS), pH 7,2, 290 mOsm, ble tilsatt til kolben for å dekke filmen. Ved avslutningen av en 2-timers hydratiseringsperiode ble liposomene (MLVene) som var dannet ekstrudert trinnvis to ganger, hver gang gjennom et 0,4 og 0,2 um polykarbonatfilter med uniform porestørrelse (Bio-Rad; Richmond, CA). Uinnkapslet MPS og sukrose ble fjernet ved passasje av de ekstruderte MLVene gjennom en "Sephadex G-75"-gel-utelukkelseskolonne. Den prosentvise innkapslingen av MPS varierte fra en lav verdi på ca. 0% for DMPC MLVer til en høy verdi på 21% for DPPC MLVer (tabell 2). Innkapsling av<14>c_sukrose varierte fra en lav verdi på 0,2% for DMPC MLVer til en høy verdi på 18% for DPPC MLVer.

For å måle lekkasje av innkapslede oppløste stoffer fra MLV-preparatene, ble hvert preparat inkubert ved 37 °C i et tidsrom på opp til 42 timer. Like store prøver ble tatt ved jevne mellomrom under inkuberingsperioden på 42 timer og ble ført gjennom en gel-utelukkelseskolonne, og lipidet, MPS, og sukrosen tilstede i liposomtoppen, ble analysert ved konvensjonelle fremgangsmåter. Tapet av lipid-assosiert legemiddel under forløpet av inkuberingen ble benyttet for å bestemme halveringstiden for legemiddelutstrømning (ti/2) for hvert preparat, beregnet som tiden som kreves for at legemiddel/lipid-forholdet faller til halve verdien. De beregnede halveringstidene for utstrømning, uttrykt i minutter, er angitt i tabell 2 nedenfor.

Som det fremgår fra resultatene i tabell 2, kan hastigheten for utstrøm-ning av legemidler fra MLVene selektivt økes fra en halveringstid på ca. 22 minutter til en tid som ikke viser noen vesentlig lekkasje i løpet av et tidsrom på 42 timer, ved å øke lengden og graden av metning av acylkjedene i fosfolipidene som utgjør liposomene. En sammenligning av halveringstidresultatene i tabell 2 med overgangstemperaturresultatene i tabell 1, viser at hvert av MLV-preparatene som har en relativt høy halveringstid for utstrømning (lenger enn 500 minutter) består av en PC hvis overgangstemperatur ligger høyere enn temperaturen hvorved liposomene ble inkubert. Intete betydelig tap av den relativt ugjennomtrengelige<l>^c-sukrosen fra liposomene Me detektert i løpet av inkuberingsperioden på 42 timer, dette indikerer at den observerte legemiddel-utstrømningen ikke skyldes liposomnedbrytning.

Eksempel II

Virkning av ladede lipider på legemiddelutstrømning

Egg-fosfatidylglycerol (EPG), dioleylfosfatidylglycerol (DOPC) og distearoylfosfatidylkolin (DSPC) ble oppnådd fra Avanti Plar Lipids (Birmingham, AL).

Liposomer (MLVer) inneholdende lipidpreparatet angitt til venstre i tabell 3 nedenfor, ble fremstilt i det vesentlige som beskrevet i eksempel I med utgangspunkt i innledende konsentrasjoner på 312 pmol av den valgte PC, 35 umol av den valgte PG, og 3,5 umol c<-T. For hver lipidsammensetning ble den tørkede filmen hydratisert i 5 ml av MPS/- sukroseoppløsningen beskrevet i eksempel I, og liposomene ble størrelses-sorterte ved ekstrudering gjennom polykarbonatfiltere og separert fra ikke-innkapslet materiale ved molekylarsikt-kromatografi, som ovenfor. Prosentandelene av innkapslet MPS er gjengitt i den midtre kolonnen i tabell 3. En sammenligning av innkapslings resultatene fra tabell 2 og 3 viser at nærværet av 10% PG generelt øker legemiddelinnkapslingseffek-tivitetene. Denne effekten ble også observert for 14c -sukrose-innkapsling.

De åtte MLV-fraksjonene ble alle inkubert ved 37°C i 42 timer,og halveringstidene for legemiddelutstrømningen ble bestemt fra de målte tapene av legemiddel ved flere intervaller i løpet av inkuberingsperioden på 42 timer. De beregnede halveringstidene for utstrømningshastighet er gjengitt til høyre i tabell 3.

Tilsatsen av 10 mol-% PG til liposom/lipidblandingen hadde en av to effekter relativt til PC'er alene (eksempel I). For de kortere, mer umettede PC-acylkjedene, ble det observert en økning i halveringstid for MPS-lekkasje som et resultat av den negative ladningen som tilføres dobbeltlaget av PG. Med de mettede lipidene med lengre kjedelengder, synes den viktigere faktoren å være graden av acylkjedeumettethet for tilsatt PG - f.eks. i tilfelle EPG, reduksjon av den samlede membran-metningen og følgelig reduksjon av målte halveringstider for MPS-lekkasje. Der hvor et PG-derivat av den samme metningskjedelengden som PC'en ble benyttet (DPPG/DSPG), oppsto tilsvarende eller lengre halveringstider enn med PC alene. Som i eksempel I, ble det ikke observert noe betydelig tap av 14c -sukrose i noen av preparatene.

Eksempel III

Virkning av kolesterol på legemiddelutstrømning

Åtte liposom-MLV-preparater inneholdende en av de åtte PCene angitt til venstre i tabell 4, kolesterol (CH), og oc-T i et molforhold på 6:4:0,1, og inneholdende innkapslet MPS og<14>C-merket sukrose, ble fremstilt som i eksempel I. MLV-preparatene ga, etter ekstrudering gjennom 0,4 og 0,2 polykarbonatmembraner og behandling med molekylarsikt-kromatografi for

å fjerne uinnkapslet materiale, den prosentvise innkapslingen av MPS angitt i midtre kolonne i tabell 4.

De åtte MLV-fraksjonene ble alle inkubert i et tidsrom på 42 timer for å bestemme halveringstiden for legemiddelutstrømning ifølge fremgangsmåtene beskrevet ovenfor. De beregnede halveringstidene er gjengitt til høyre i tabell 4.

I nærvær av 40 mol-% kolesterol var halveringstidene for legemiddelut-strømning forbundet med umettede lipider med kortere kjede lengre enn de som ble oppnådd for PC alene. For de mer mettede lipidene med lengre kjedelengde, reduserte 40 mol-% kolesterol halveringstidene i betydelig grad sammenlignet med de som ble observert for PC alene.

Virkningen av kolesterol og PG ble undersøkt i en tilsvarende type undersøkelse ved anvendelse av MLVer bestårende av 50 mol-% av en valgt PC, 10 mol-% av en valgt PG, 40 mol-% av en kolesterol, og 0,1 mol-% oc-T, som angitt til venstre i tabell 5. Legemiddelinnkapslings-resultatet for de åtte MLV-preparatetene og de tilsvarende halveringstidene for legemiddelutstrømning er vist i henholdsvis midtre og høyre kolonne i tabell 5. Som det fremgår, øker nærværet av 10 mol-% PG i betydelig grad halveringstidene for legemiddelutstrømning for hvert PC-lipid med hensyn på ■ lipidsammensetningen i tabell 4 inneholdende bare PC og kolesterol.

Endelig ble åtte liposom-preparater inneholdende ett av PC-lipidene angitt til venstre i tabell 6 (60 mol-%); kolesterolhemisuccinat, en negativt ladet sterol (40 mol-%), og 0,1 mol-% a-T fremstilt som angitt ovenfor. CHHS ble oppnådd fra Sigma Chem Co. (St. Louis, MO). De åtte preparatene ga innkapslingseffektivitetene og halveringstiden for legemiddelutstrømning angitt henholdsvis i midtre og høyre kolonne i tabell 6 nedenfor. Som det fremgår ga nærværet av 40 mol-% kolesterol hemisuccinat uniformt høyere innkapslingseffektiviteter. Halveringstiden er generelt noe høyere enn de som ble observert med de tilsvarende liposompreparatene innbefattende 40 mol-% kolesterol (tabell 4 ovenfor), men betydelig lavere enn de tilsvarende lipidpreparatene inneholdende 40 mol-% kolesterol pluss 10 mol-% PG.

Eksempel IV

Aerosolisering av vandige liposom- suspensjoner

I dette avsnittet undersøkes virkningen på liposom-integritet, bedømt vbed tapet av innkapslet materiale og endring i liposomstørrelse, ved aerosolisering av en vandig liposom-suspensjon.

Fire liposom-preparater ble undersøkt. Prepat nr. 1 hadde en sammensetning EPC/CH/a-T, ved et molforhold på 6:4:0,1; preparat nr. 2 en sammensetning av DSPC/CH/oc-T, ved et molforhold på 6:4:0,1; preparat nr. 3 en sammensetning av DPPC/DPPG/CH/oc-T, ved et molforhold på 5:1:4:0,1; og preparat nr. 4 en sammensetning av DPPC/DPPG/a-T, ved et molforhold på 9:1:0,1. De fire prepartene representerer et bredt område av halveringstider for legemiddelutstrømning, målt som i eksemplene I-III ovenfor, som angitt i tabell 7 nedenfor. Liposomene ble fremstilt i det vesentlige som beskrevet i eksempel I, bortsett fra at den vandige oppløsningen benyttet ved fremstilling av liposomene inneholdt karboksyfluorescein (129Emol) i steden for MPS og 14C -merket sukrose. Hvert av de fire liposom-preparatene ble ekstrudert to ganger, hvert gjennom en 0,4 og 0,2 pm polykarbonatmembran for å gi i det vesentlige homo-gene partikkelstørrelser i partikkelstørrelsesområdene angitt nedenfor i tabellene 7 og 8 etter at liposom-suspensjonene var separert fra uinnkapslet materiale ved omfattende dialyse. Den endelige konsentrasjonen av liposomer i den vandige suspensjonen var 70 umol samlet lipid pr. ml

PBS.

For hvert lipid-preparat ble liposom-størrelsesfordeling og prosent innkapsling målt før aerosolisering (B), etter aerosolisering (A) og i suspensjonen som ble igjen i forstøveren (R). Størrelsen av liposomene i suspensjonen ble bestemt ved anvendelse av en laser partikkelstør reises-måler modell 200 fra Nicomp Instruments (Hyak-Royco, Menlo Park, CA). Maskinen ble med mellomrom kalibrert med monodisperse lateksperler tilveiebragt av fabrikanten for anvendelse som ekstern standard.

Prosent innkapslet karboksyfluorescein ble bestemt ved standard fremgangsmåte.

Resultater vedrørende størrelse og prosent innkapsling for liposom-preparater før og etter aerosolisering ved hjelp av den pneumatiske forstøveren, er gjengitt i tabell 7 nedenfor. Innretningen som ble benyttet var en De Vilbiss nr. 646 pneumatisk forstøver (Somerset, PA), drevet ved 103,4 kPa. Som det fremgår fra resultatene ga aerosolisering av liposomene bare et lite tap av innkapslet materiale, varierende fra ca. 8% for liposom-preparatet som hadde den laveste halveringstiden for utstrømning til ca. 1% for materiale som hadde den høyeste halveringstiden for utstrømning. Ingen betydelig endring i størrelsesfordelingen for liposomer ble observert for noe av de fire liposom-preparatene etter aerosolisering.

Effekten på integriteten av de fire liposom-preparatene ved aerosolisering ved hjelp av en ultralysdforstøver ble også undersøkt. Forstøveren som ble benyttet var en DeVilbiss "Pulmasonic Model 25" ultralydsforstøver (Somerset, PA) drevet ved en kraftmodus på 3 kHz. Prosent karboksyfluorescein-innkapsling og størrelsesfordeling målt som angitt ovenfor, er gjengitt i tabell 8 nedenfor for hvert av de fire preparatene, målt før (B) og etter (A) aerosolisering og for materialet som finnes igjen i forstøv-eren (R). Resultatene er i det vesentlige identiske med resultatene oppnådd for de samme preparatene aerosolisert ved hjelp av en innretning med komprimert luft.

Eksempel V

Liposom- stabilitet i fluorkarbondrivmidler

I dette avsnittet undersøkes stabiliteten av tre liposom-preparater i klorfluorkarbondrivmiddel-oppløsningsmidler. Det første liposom-preparatet, betegnet som sammensetning 1, inneholdt DPPC/DPPG/oc-T ved et molforhold på 9:1:0,1; det andre preparatet, betegnet sammensetning 2, inneholdt EPC/EPG/cx-T ved et molforhold på 9:1:0,1; og det tredje preparatet, betegnet sammensetning 3, besto av EPC/EPG/CH/a-T ved et molforhold på 5:1:4:0,1. Liposomene ble fremstilt i det vesentlige som beskrevet i eksempel I, bortsett fra at den vandige oppløsningen som ble benyttet ved fremstilling av MLVene inneholdt bovinserumalbumin (BSA) og 1 uM karboksyfluorescein (CF). MLV-preparatene, ekstrudert to ganger gjennom hver av en 0,4 og en 0,2 um polykarbonatmembran ble pelletisert ved sentrifugering for å fjerne uinnkapslet materiale, og resuspendert i PBS til en endelig lipid-konsentrasjon på ca. 20 pmol/ml. De seks drivmiddel-oppløsningsmidlene som ble benyttet var "Freon 11"

(CC13F) "Freon 12" (CC12F2), "Freon 22" (CHC1F2), "Freon 113"

(CC12FCC1F2), "Freon 114" (CC1F2CC1F2)' og "Freon 115" (CC1F2CF3).

En vandig suspensjon av hvert preparat i PBS (3 ml) ble tilsatt til hvert av de 6 fluorkarbon-oppløsningsmidlene (10 ml) i en flaske under trykk, og flaskene ble ristet på en mekanisk rister i 24 timer for å opprettholde en vann-i-olje-emulsjon. Etter risteperioden fikk de flytende bulkfasene i hver flaske gjendannes ved sedimentering, og den øvre vandige fasen ble fjernet ved avsugning. Liposomene i den vandige fasen ble pelletisert ved sentrifugering, og resuspendert til den opprinnelige lipid-konsentrasjonen i PBS. En del av de resuspenderte liposomene ble undersøkt vedrørende partikkelstørrelsesfordeling, i det vesentlige som beskrevet i eksempel IV. En kontrollprøve, som ikke ble eksponert mot fluorkarbon, men forøvrig håndtert på identisk måte som de andre prøvene, viste en størrelsesfordeling på mellom ca. 180 og 250 nm. De forskjellige prøvene som hadde vært eksponert mot de seks drivmiddel-oppløsningsmidlene falt generelt innenfor to størrelsesområder: de som hadde størrelser i det vesentlige tilsvarende kontroll-liposom-størrelsene, det vil si mellom ca. 150 og 300 um; og de som hadde vesentlig større størrelser (400-500 um eller større). Resultatene, gjengitt i tabell 9 nedenfor, viser at to av tre preparater var stabile i "Freon 12", at alle tre var stabile i "Freon 114" og "Freon 11", og at MLVer inneholdende vesentlige mettede lipider (sammensetning 1) generelt er mer stabile i fluorklorkarbondrivmidler enn de som inneholder hovedsakelig umettede og/eller kortere kjedede lipider (sammensetninger 2 og 3).

De pelletiserte og resuspenderte liposomene ble også undersøkt vedrørende frigivelse av BSA, som representerer en markør med relativt høy mole kylvekt, og karboksyfluorescein, som representerer en relativt liten innkapslet markør. For hvert forsøk ble en porsjon av de resuspenderte liposomene analysert ved konvensjonelle fremgangsmåter med hensyn på den aktuelle markøren. Markørkonsentrasjonene er uttrykt i tabell 9 som mengdre markør pr. umol av samlet lipid i prøven analysert (ug av BSA, umol av CF). "ND" i tabellen betyr "ikke detekterbar". Som det fremgår fra resultatene i tabellen, er tapet av kapslet materiale generelt korrelert med forøket liposom-størrelse, begge disse faktorene typer på instabilitet av liposomer i det spesielle fluorklorkarbonoppløs-ningsmidlet. Imidlertid viste både preparat 2 og 3 betydelig tap av innkapslet materiale uten betydelig størrelsesendring ved eksponering mot "Freon 113".

Eksempel VI

Behandling av bronkokonstriksjon

I dette eksemplet undersøkes den terapeutiske virkningen av fritt og liposom-innkapslet metap rote ranol sul fat på bronkokonstriksjon indusert vedaerosoler av acetylkolin (ACH).

To hunder av blandingsrase, en hannhund på 20 kg og en hunnhund på 30 kg ble bedøvet med en innledende i.v. pilleinjeksjon av natriumtiopental (10 mg/kg kroppsvekt) og natriumpentabarbital (20 mg/kg kroppsvekt) og etterfølgende piller av natriumtiopental hvert tredje minutt, eller etter behov, for å holde hunden i en bedøvet tilstand over et tidsrom på 4 timer. Dyrene ble intubert med et endotrachealrør med mansjett, plassert på en varmevekslet pute og kunstig ventillert ved hjelp av en konstant-volum respirator med værelsesluft ved en frekvent på 30 cykler/minutt. Et spiserørs-ballongkateter ble innført i spiserøret, forbundet med den ene utgangen på en differensiell-trykktransducer, og anbragt i midtområdet av brystet for å gi en maksimal negativ trykkinnbøyning under innåndning. Luftstrøm ble overvåket ved hjelp av en pneumotakograf forbundet med endotrachealrøret og respiratoren og forbundet med en differensielltrykk-transducer. Transpulmonartrykket ble overvåket ved hjelp av en differensiell-trykktransducer, en kanal var forbundet med en sidearm av tran-chealrøret og den andre med spiserørsballongkateteret. Strøm- og trykk-signalene ble angitt kontinuerlig på et oscilloskop.

Liposom-preparater med en lipid-sammensetning på DSPC/DSPG/CH/oc-T ved et molforhold på 5:1:4:0,1 (preparat 1) og EPC/EPG/CH/a-T ved det samme molforholdet (preparat 2), begge innkapslende metaproteranolsulfat ved en endelig 2% legemiddelkonsentrasjon, ble fremstilt som i eksempel III. Som det fremgår fra tabell 5 ovenfor, har preparat 1 en halveringstid for legemiddelutstrømning på ca. 1150 minutter, og preparat 2 på ca. 250 minutter. Fritt MPS ble administrert som en 2% oppløsning i PBS. Flytende aerosoler av acetylkolinoppløsninger tilstrekkelig til å frembringe transient bronkokonstriksjon, gjenspeilet ved en 2-10 gangers økning i samlet pulmonarresistans, ble administrert via endotrachealrøret før, og med ca. 5 minutters intervaller etter, aerosoladministrering av enten fritt eller lipsom-innkapslet metaproterand, begge deler i doser svarende til en samlet mengde på ca. 2,4 mg MPS. Alle aerosoler, innbefattende acetylkolinaerosolen, fritt-legemiddelaerosolen og liposom-aerosolen, ble generert med en pneumatisk forstøver ("Bird nr. 158", Somerset, PA), ifølge fabrikantens spesifikasjoner ved 103,4 kPa. Aero-solpartikkelstørrelsesbestemmelse utført med en "Mercer Cascade Impactor" (InTox Products, NM), viste partikkeldiametre for masseaero-dynamisk aerosol i området 2-6 um.

Virkningene det frie legemidlet og liposom-aerosolene på bronkokonstriksjon ble målt tilnærmet hvert 15. minutt i 4 timer etter innledende legemiddeladministrasjon. Forsøket ble gjentatt tre ganger for hvert fritt og liposom-innkapslet legemiddelpreparat for hvert dyr, og gjennomsnittet av verdiene ble beregnet. Resultatene oppnådd for hund nr. 1 er vist i fig. 1, og er uttrykt som prosent beskyttelse mot ACH-indusert bronkokonstriksjon. Hvert punkt på kurven representerer middelverdien ± standardavviket for middelverdien fra resultatene oppnådd i tre forsøk. Som det fremgår fra figuren, viste fritt legemiddel (åpne firkanter), preparat 1 (fylte sirkler) og preparat 2 (åpne sirkler) alle i det vesentlige den samme graden av beskyttelse mot ACH-indusert bronkokonstriksjon. Dersom noen tendens kan sies å fremgå fra resultatene, er dette at det liposom-innkapslede legemidlet synes å være mer effektiv i tidsrommet mellom 2-4 timer etter legemiddeladministrering. Tilsvarende resultater ble oppnådd for den andre hunden som ble behandlet.

Eksempel VII

Systemisk legemiddelavlevering ved inhalering

De systemiske legemiddelnivåene av MPS administrert ved inhalering i enten fri eller liposom-innkapslet form, ble undersøkt ved å overvåke endringen i hjertehastighet frembragt ved administrering av legemidlet ved den eksperimentelle fremgangsmåten beskrevet ovenfor i eksempel VI. For hvert dyreforsøk gjennomført i eksempel VI, ble det foretatt hjertehastighetsmålinger tilnærmet hvert 15. minutt i tidsrommet på 4 timer etter legemiddeladministrering. Hjertehastigheten ble målt kontinuerlig på et oscilloskop ved hjelp av hudnåler med ledninger og registrert med jevne mellomrom på en polygraf. Resultatene oppnådd for hvert av tre forsøk med hvert av de tre legemiddelpreparatene (fritt legemiddel og legemiddel innkapslet i liposomer med lang og kort halveringstid) ble midlet og avsatt som prosent økning sammenlignet med normal hjertehastighet i hviletilstand. Resultatene for ett av de behand-lede dyrene er vist i fig. 2. Som i fig. 1 representerer hvert punkt middelverdien standardavviket for middelverdien fra resultatene oppnådd i tre forsøk. Som det fremgår i figuren, ga det frie legemidlet en økning på mer enn 90% i hjertehastighet i løpet av de første fem minuttene etter legemiddeladministrering, og den målte hjertehastigheten avtok gradvis over måleperioden på 4 timer til et nivå på ca. 50% forøket hjertehastighet. Preparat 1 (liposomer med lang halveringstid) viste en innledende hjertehastighetsøkning på mellom ca. 20-30% og forble innenfor dette området over i det vesentlige hele måleperioden. Preparat 2 (liposomer med kort halveringstid) ga en innledende hjertehastighets-økning på ca. 40%, og også dette nivået holdt seg i det vesentlige konstant over overvåkningsperioden på 4 timer.

Mens foretrukne utførelser av oppfinnelsen her er beskrevet, skal det understrekes at forskjellige endringer og modifikasjoner kan utføres uten at oppfinnelsens omfang overskrides.

Claims (20)

1. System for administrering av et legemiddel, ved en kontrollert legemiddel-f rigivelseshastighet, via luftrøret, karakterisert ved at det innbefatter: en suspensjon av liposomer inneholdende legemidlet i hovedsakelig liposom-innesluttet form, hvor fosfolipidsammensetningen av liposomene er sammensatt slik at det oppnås en valgt hastighet for legemiddelfrigivelse fra liposomer når disse administreres i luftrøret, og en innretning for aerosolisering av en valgt mengde av suspensjonen, i en form egnet for inhalering.

2. System ifølge krav 1, karakterisert ved at legemidlet er et vannoppløselig, liposom-gjennomtrengelig legemiddel, og suspensjonen er en vandig suspensjon hvori mer enn 50% av legemidlet er innkapslet i liposomene.

3. System ifølge krav 2, karakterisert ved at suspensjonen er en liposom-pasta hvori mer enn 50% av den vandige fasen er innkapslet i liposomene, og innretningen innbefatter et blandekammer hvori et utmålt volum pasta blandes med minst 1-2 volumdeler av avleveringsmediet like før aerosolisering.

4. System ifølge krav 3, karakterisert ved at innretningen innbefatter separate kammere for oppbevaring av pasta og avleverings-medier, et blandekammer hvori pastaen og avleveringsmediet blandes, og innretning for frigivelse av innholdet av blandekammeret gjennom en dyse slik at innholdet aerosoliseres.

5. System ifølge krav 4, karakterisert ved at avleveringsmediet er et vandig medium og frigivelsesinnretningen innbefatter ventilstruktur operativt forbundet med en pneumatisk eller ultralyds-energikilde.

6. System ifølge krav 4, karakterisert ved at avleverings - innretningen innbefatter et fluorkarbondrivmiddel, og frigivelsesinnretningen innbefatter ventilstruktur for frigivelse av innholdet av blandekammeret, under trykk, gjennom nevnte dyse.

7. System ifølge krav 6, karakterisert ved at drivmidlet er valgt fra gruppen bestående av CCI2 F2 , CCIF2 CCIF2 og CCIF2 CF3 .

8. System ifølge krav 1, karakterisert ved at legemidlet er et vannoppløselig legemiddel, liposomsuspensjonen innbefatter liposomer suspendert i et fluorkarbondrivmiddel, og innretningen innbefatter ventilstruktur for frigivelse av suspensjonen under trykk generert ved hjelp av drivmidlet.

9. System ifølge krav 8, karakterisert ved at drivmidlet er valgt fra gruppen bestående av CCI2 F2 , CC1F2 CC1F2 og CCIF2 CF3 .

10. System ifølge krav 8, karakterisert ved at liposomene er suspendert i dehydratisert partikkelform i drivmidlet.

11. System ifølge krav 8, karakterisert ved at liposomene er emulgert og suspendert i en konsentrert pastalignende form som partikler i fluorkarbondrivmidlet.

12. System ifølge krav 1, karakterisert ved at legemidlet er et vannoppløselig, liposom-gjennomtrengelig legemiddel som har uønskede systemiske bivirkninger, og suspensjonen inneholder mer enn ca.

70% av legemidlet i liposom-innkapslet form.

13. System ifølge krav 12, karakterisert ved at legemidlet er metaproterenolsulfat eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

14. System ifølge krav 1, karakterisert ved at hastigheten for legemiddelfrigivelse fra liposomene ved administrering i luftrøret er proporsjonal med frigivelseshastigheten for legemidlet in vitro, og fosfolipidsammensetningen av liposomene er sammensatt slik at det oppnås en valgt in vitro halveringstid for legemiddelutstrømning på mellom ca. 250 og 1200 minutter.

15. System ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes ved administrering av et vannoppløselig, liposom-gjennomtrengelig legemiddel valgt fra gruppen bestående av terbutalin, albuterol, atropinmetylnitrat, kromolynnatrium, propranalol, flunoisolid, ibuprofin, gentamycin, tobermycin, pentamidin, penicillin, teofyllin, bleomycin, etoposid, kaptoprel, n-acetylcystein og verapamil.

16. System ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes ved administrering av et vannoppløselig, liposom-ugjennom-trengelig legemiddel valgt fra gruppen bestående av kalsitonin, atriopeptin, oc-1 antitrypsin (proteaseinhibitor), interferon, vasopressin, insulin, interleukin-2, superoksyddismutase, vevsplasminogenaktivator (TPA), plasma faktor 8, epidermisk vekstfaktor, tumornecrosefaktor, heparin, lungeoverflateaktivt protein og lipokortin.

17. System ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes ved administrering av et lipidoppløselig legemiddel valgt fra gruppen bestående av prostaglandiner, amfotericin B, progesteron, isosorbiddinitrat, testosteron, nitroglycerin, estradiol, doksorubicin, beklometason og estere, vitamin E, cortison, deksametason og estere, DPPC/DPPG-fosfolipider og betametasonvaleret.

18. Fremgangsmåte ved behandling av en tilstand eller sykdom som innbefatter trinnene (1) valg av et vannoppløselig legemiddel som er aktivt ved behandling av tilstanden eller sykdommen, og (2) administrering av legemidlet ved inhalering i luftrøret, hvor det oppnås moderering av systemiske legemiddelnivåvirkninger med hensyn på de som frembringes når legemidlet administreres i fri form, og det oppnås en valgt hastighet for legemiddelfrigivelse i luftrøret, karakterisert ved at den innbefatter: tilveiebringelse av en suspensjon av liposomer inneholdende lege midlet i hovedsakelig liposom-innkapslet form, hvor fosfolipidsammensetningen av liposomene er sammensatt slik at det oppnås en valgt hastighet for legemiddelfrigivelse fra liposomer ved administrering i luftrøret, og aerosolisering av liposomene i en form egnet for inhalering.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at legemidlet er en bronkodilator, og mengden av legemiddel frigjort i blodstrømmen er 20% eller mindre enn frigjort i blodstrømmen innledningsvis når en ekvivalent mengde av legemidlet administreres i fri form.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at legemidlet er metaproterenol eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.