NO822995L

NO822995L - Ny lipidfraksjon, dens fremstilling og farmasoeytisk preparater inneholdende fraksjonen

Info

Publication number: NO822995L
Application number: NO822995A
Authority: NO
Inventors: Meir Shinitzky; David Heron; David Samuel
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1981-09-04
Filing date: 1982-09-03
Publication date: 1983-03-07
Also published as: US4474773A; AU8778282A; JPS58126812A; IL63734A; JPH0786088B2; FI823013A0; FI823013L; AU555915B2; EP0074251A1; EP0074251B2; FI75270B; FI75270C; EP0074251B1; IL63734A0; DE3262884D1

Description

Foreliggende oppfinnelse—^xrgår en IxeTTTgangsitiåte

for fraksjonering av lipider fra naturlige kilder til forskjellige reaksjoner og den angjeldende fraksjon er en med et i det vesentligeøket potensial for fluidisering, såvel som for gjen-oppretting av forringede funksjoner av biologiske membraner, sammenlignet med andre lipidpreparater. Oppfinnelsen angår videre de således separerte fraksjon samt farmasøytiske preparater inneholdende slike fraksjoner. Oppfinnelsen har videre forbindelse med behandling av forskjellige mangler i forbindelse med abnormaliteter i strukturen og dynamikken for menbra-ner, slik som ved aldring, dysfunksjon av immunsystemet, mentale og neurologiske mangler, medikamentavhengighet og alkoholisme, og hyperlipidemiske mangler, slik som gallesten; hypertensjon og atherosclerose. In vivo behandlingen omfatter inngivelse av en effektiv mengde av slike fraksjonerte lipider. Behandlingen av andre dysfunksjoner, slik som sperminfertilitet, kan også gjennomføres in vitro.

Andre og ytterligere gjenstander ved oppfinnelsen vil bli åpenbare ut fra det følgende.

)

Lipidfluiditeten (den resiproke verdi av mikroviskositeten-n) for biologiske membraner, bestemmes av deres struk-tur og kjemiske sammensetning, og spesielt av molforholdet mellom kolesterol og fosfolipider (C/PL), molforholdet mellom sphingomyelin og lecitin (S/L) og graden av umettethet i fosfo-'lipisacylkjedene (Shinitzky og Henkart, "Int. Rev. Cytol.", 60, 121 (1979); Cooper, J,. "Supramol. Struct." 8, 413 (1978)).

Menbranlipidfluiditeten bestemmer i sin tur mange av de fysiologiske egenskaper for reseptorer, (Muller og Shinitzky", Brit. J. Haematol". 42, 355 (1979); Heron et al., ^'Proc. nati. Acad. Sei." USA, 77, 7463 (1980); Heron et al.,

i "Receptors and their Neurotramsmitters", utgitt av Littauer et al., John Wiley, London (1980); Heron et al., "Eur. J. Pharmacol" (i trykk), antigener (Shinitzky og Sourojon, "Proe. Nati. Acad. Sei." USA, 76, 4438 (1979) enzymer "Dandermann, '"Biochim. Biophys, Acta", 515, 209 (1978); Rimon et al., "Nature", 270, 267 (1977), transportbærere (Kimelbert, "Biochem. Biophys. Acta", 413 (1975), ionekanaler (Stephens og Shinitzky, "Nature", 270, 267 (1977), og ribosomer (Towers et al.,

"Biochem. Biophys. Acta", 287, 3 0-1—f±-97-2-)-7—sess-eaf-feu-ndet til disse membraner i hjernen og andre organer. Dette forhold ble nylig oppsummert i utstrakt grad, (Shinitzky, "Physiol. Rev." i trykk).

Sluttresponsen for målceller avhenger derfor av de strukturelle og dynamiske egenskaper for membranene, som bestemmes av deres 1ipidsammensetning. Man kari derfor for-vente en optimale lipidfluiditet for den maksimale respons for hver målcelle, (Heron et al., "Proe. Nati. Acad. Sei.", USA, 77, 7463 (1980); Heron et al., i "Receptors and their Neurotransmitters", utgitt av Littauer et al., John Wiley, London (1980); Yuli et al., "Biochemistry", 20, 4250, (1980); Shinitzky, "Physiol. Rev.", i trykk).

Ved mange mangler medfører patogenese forandringer i membranlipidsammensetningen eller lipidmetabolisme (Cooper, "N. Engl. J. Med.", 297, 371 (1977)). Disse forandringer er korrelert i mange tilfeller til en økning i membranlipid-mikroviskositeten for forskjellige vev på grunn av en økning i forholdet C/PL eller S/L, eller en reduksjon i graden av umettethet for fosfolipidacylkjedene eller en hvilken som helst kombinasjon av disse tre. Lipidperoksydering kan også påvirke dynamikken.for cellemembranproteiner og som et resultat fysiologiske funksjoner "Sagai og Ichinose, "Life Sei.", 27, 731 (1980)). Det nedenfor anførte er en liste av slike mangler mediert av lipidubalanser, av hvilke alle kan henfø-res til 1ipidmanipuleringer: (1) Aldring og senescence (Yamamoto, "Lipids", 3, 284 (1968); Rivnay et al., "Mech. Age. Dev." 10, 71 (1979); Heron et al., skal utgis: se også tabell 4 i denne spesifikasjon; Araki og Rifkind, "Life Sei." 26, 2223 (1980); Hershkovitz et al., "Progress in Brain Research", Elsevier-North Holland i trykk); Ronser et al., "Adv. Lipid Res." 10, 262 (1972) . (2) Tilbaketrekningssymptomer med henblikk på medikament- og alkoholavhengighet (Johnson et al., "Mol. Pharmacol.", 15, 739 (1979); Chin og Goldstein, "Science", 196, .684 (1979); Littleton og John, "J. Pharm. Pharmac.",

29, 579 (1977); Heron et al., " Broe; hem, PtørTnatn3T"7~i~ trykk

(1982); (se også tabell 3 i denne spesifikasjon).

(3) Hyperlipididemiske mangler slik som hypertensjon, aterosclerose, gallesten, cirrhose og obesity (Montenay et al., "Biochem. Biophy. Res. Comm." 100, 660

(1981); Cooper, N., "Engl. J. Med.", 297, 371 (1977); Miettinen et al., "Lancet" 2, 835 (1972). Se også tabell 8

i denne spesifikasjon.

(4) Sperminfertilitet (Davis et al., "Biochim. Biophys. Acta", 558, 257 (1979); Davis, "Proe. Soc. Exp. Biol. Med." , 152, 257 (1976)) . (5) Forringet immunfunksjon slik som ved aldring, obesitet og visse tilfeller allergi (Rivnay et al., "Mech. Age. Dev.", 12, 119 (1980); Rivnay et al., "Mech. Age. Dev." 10, 71 (1979). Se også tabell 9 i denne spesifikasjon.

Det er også vist at synaptisk membran mikrovisko-sitet øker som et resultat av kirurgiske eller kjemiske le-sjoner av spesifike veier i hjernen (Heron et al., "Biochem. Pharmacol.", i trykk (1982)). Disse funn kan også gjelde

for andre degenerative eller organiske skader, slik som Alzheimer's sykdom, Parkinsonisme, tardiv dyskinesi, Huntington's chorea, tremor, ataxia og epilepsi samt visse tilfeller av mental forsinkelse, av hvilke alle i prinsippet skulle kunne behandles ved lipidmanipulering.

Det er også generelt akseptert at visse mentale mangler, slik som mani, depresjon og schizofreni har forbindelse med kjemisk ubelanse i overgangsgraden for neurotransmit-torer i hjernen. Det er indisier til å foreslå at de bioge-netiske aminer (dopamin, norephinephrin og serotonin) primært er involvert. Reseptor- og membranbundne enzymer som har å gjøre med disse transmittorers overføring, kan forandres ved forandringer i membranfluiditeten, (Hershkowitz et al., "Progress in Brain Research",Elsevier. North Holland, i trykk; Heron et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." USA 77, 6463

(1980); Heron et al., i "Receptors and their Neurotransmitters", utgitt av Littauer et al., John Wiley, London (1980);Heron et al., "Eur. J. Pharmacol.", 72, 361 (1981), adn faller derfor også inn i kategorien av mangler somH?å<*>n~"tiTskrives lipid manipuleringer.

Modulering av funksjonen ved lipidmanipulering,

kan også utføres in vitro. Dette kan være anvendelig på modulering av viral infektiviteten for bruk i vaksiner, (Pal et al., "Biochemistry" 20, 530 (1981), og antigenisitet, (Shinitzky og Souroujon, "Proe. Nati. Acad. Sei.", USA 76, 4438 (1979)), som kan redusere vevawisning og lette transplantasjoner.

Søkeren har funnet at noen av disse ugunstige virkninger som medieres ved lipidubalanse.r, kan rektifiseres ved en form for "membrane engineering", ved bruk av en aktiv fraksjon av lipider fra naturlige kilder. Denne fraksjon

(som inneholder en vesentlig andel leeitin) kan arbeide via forskjellige mulige mekanismer: (1) Ekstraksjon av overskytende kolesterol ved

passiv translokasjon (Cooper, "J. Supramol. Struct'.' 8, 413 (1978); Miettinin et al., "Lancet", 2, 835

(1972); Morrison, "Geriatrics" 13, 12 (1958);

Cooper et al., "J. Clin. Invest." 55, 115 (1975)). (2) Utbytting med membranlipider med høyere mikro-viskositet "Wirtz og Zilversmit, "Biochim. Biophys. Acta" 193, 105 (1969) . (3) Netto innarbeiding inn i eller erstatning av skadede lipider (f.eks. peroksyderte) (Bakardjieva et al., "Biochemistry" 18, 3016 (1979)). Dette kunne gjenopprette strukturen og funksjonen av de-genererte membraner. (4) Forløpere i forskjellige metabolske veier (f. eks. prostaglandiner, vitamin D og acetylkolin).

Imidlertid er dietter med et høyt innhold av leeitin og som hyppig anbefales for et antall mangler (Cobb et al., "Nutr. Metab.", 24, 228 (1980); Blass (Cornall-Burke Rhabili-tation Center); Gershon (Lafayette Clinic, Detroit); Heyman (Duke University Med. Center); Sullivan et al., (M.I.T. and Tufts Univ.), i "Proceedings of the International Study Group on the Pharmacology of Memory Disorders Associated with Aging", Zvirich (1981)), ikke meget effektive til^a™lette symptomer i forbindelse med lipidubalanser og i å gjenopprette membranlipidfluiditeten til normal verdi. Grunnene til dette er ennu ikke klare. Det synes som om det tidligere fore-slåtte for disse licitinbehandlinger og som er basert enten på dens acetylkolinforløper-rolle eller på den høye grad av umettethet, kun dekker et mindre aspekt ved dette bildet, (Herring et al., "Biochim. Biophys. Acta" 602, 1 (1980);

Shinitzsky og Henkart, "Int. Rev. Cytol." 60, 121 (1979)).

Det er plausibelt at prosessen med lipidmanipulering kombinerer forskjellige prerekvisitter, slik som de følgende: (1) Fluidisering gjennomføres ved en godt defi-nert andel av lipidene, mens resten tjener som i det vesentlige bærere som letter trans-porten og absorbsjonen inn i membranene. (2) Sammensetningen av den aktive og bærerkomponen-ten er av definerte fysikokjemiske karakteristika, slik som overflatedensitet og ladnings-fordeling . (3) Disse karakteristika kunne være optimale for riktig transport, forbundet med celleoverflater, disintegrering, utladning eller utbytting, som styrt av punktet for den gjensidige påvirkning. (4) De forskjellige lipidkomponenter kunne virke syntergistisk for å bevirke de ovenfor beskre-vne aktiviteter. (5) Graden av umettethet er optimal, dvs. det har de nødvendige fluiditetskarakteristika (overgang fra fullt mettet til monoumettet er den mest kritiske for fluidiseringsevnen, mens overgang fra mono- til polyumettethet ikke i vesentlig grad forandrer fluidiseringsevnen, (Hubbel og McConnell, "J.Am.Chem.Soc.", 93,

314 (1971); Stubbs et al., "Biochemistry" 20,

4257 (1981)), og ennu ikke for umettet, så-ledet mindre tilbøyelig til oksydasjon.

Ifølge oppfinnelsen ti-lvei&br4:ft<g>-as--d&fe-=@-n—nu fremgangsmåte for fraksjonering av lipider og fortrinnsvis av lipidekstrakt, fra naturlige kilder, til minst to fraksjoner,

en av hvilke er ment for benyttelse for formålet ifølge oppfinnelsen, med et vesentlig høyere potensial for membranfluidisering enn andre preparater. Denne fraksjon kalles heretter "aktivt lipid" (AL), og er et nytt stoff, som karakteriseres ved en høy potens for membranfluidisering.

Oppfinnelsen angår videre bruken av AL ved behandling av forskjellige sykdommer og anomale tilstander i pattedyr og også i mennesker, og farmasøytiske preparater for slik behandling. Bland de forhold som kan behandles ved hjelp av preparatene ifølge oppfinnelsen, er de følgende: 1. Forskjellige symptomer med aldring og senescence (dvs. tap av mentale funksjoner og libido, øket tilbøyelighet til bakteriekontarninasjon osv.); 2. Dysfunksjoner i immunsystemet; 3. Allergier;

4. Mental mangler, slik som manisk depresjon og schizophreni

5. Mental tilbakeståenhet; 6. Neurologiske mangler, slik som Alzheimer's sykdom, Parkinson--isme, tardiv dyskinesi,Huntington's forea, tremor, ataxi, epilepsi o.1.; 7. Hyperlipidemiske tilstander, slik som hypertensjon, atherosclerose, gallesten, cirrhose og obesitet, o.l.; 8. Symptomer på tilbaketrekning fra alkohol og andre medikamenter ;

9. Forhindring av toleranse overfor medikamenter.

Oppfinnelsen angår videre bruken av AL (in vitro eller in vivo) ved behandling av infertilitet, viral og mikro-biell kontaminasjon, og reduksjon av vevantigenisiteten som kan redusere vevrejeksjon og lette transplantasjoner o.l.

Oppfinnelsen angår videre behandling av de ovenfor angitte mangler ved inngivelse (enten in vivo eller in vitro)

av effektive mengder AL med en vesentlig øket kapasitet for membranfluidisering, sammenlignet med andre lipidpreparater.

Fraksjoneringen gjennom-før-e-s—ved—ap-pl^saing av- - - en lipidekstrakt fra en biologisk kilde,(f.eks. eggeplomme, soyabønne)' i et egnet oppløsningsmiddel, fordamping av opp-løsningsmiddelet til i det vesentlige total tørr tilstand,

og utfelling av en fraksjon av de oppløste lipider ved til-setning av et organisk oppløsningsmiddel, og gjenvinning av den ønskede fraksjon fra den overstående væske ved fordamping av oppløsningsmidlet. Denne fraksjon supplementeres med en 0,5%-ig (vekt/vekt) tocopherol- eller enhver annen antioksydant. Alternativt gjennomføres fraksjoneringen ved behandling av lipidkjilden som nevnt ovenfor med et egnet opp-løsningsmiddel, fjerning av precipitatet og deretter oppløs-ning av dette igjen i et egnet oppløsningsmiddel, og gjenvinning av den ovenstående væske, .den ønskede fraksjon gjen-vinnes deretter fra den ovenstående væske enten ved fordamping av oppløsningsmidlet eller ved precipitering i kald tilstand, og deretter fordamping av spor av oppløsningsmidlet. Denne fraksjon supplementeres også med eri 0,5%-ig (vekt/vekt) tocopherol- eller enhver annen egnet antioksydant.

De tre foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen er som følger: (1) Lipidekstrakt fra eggeplomme (f.eks. rålecitin) oppløses i kloroform, fordampes til så og si tørr tilstand, aceton tilsettes for å bevirke utfelling av en viss del av lipidene og overstående væske fjernes, fordampes og oppløs-ningsmidlet fjernes til totalt tørr tilstand og etterlater en fraksjon på ca. 5 vekt-% av den opprinnelige mengden av ubehandlet eggeplomme som er den ønskede AL fraksjon. En antioksydant, slik som tocopherol tilsettes til en endelig konsen-trasjon på ca. 5% på vekt-basis. Analyse av lipidsammensetningen av denne fraksjon (preparat 1) er gitt i tabell 1. (2) En naturlig lipidkilde (f.eks. eggeplomme, slyabønne) blandes først med aceton for å fjerne overskytende uønsket lipid. Precipitatet behandles deretter igjen med aceton og den overstående væske samles, fordampes til totalt tørr tilstand og etterlater en fraksjon på ca. 10-15 vekt-% av den opprinnelige mengde av ubehandlet eggeplomme, og som er den ønskede AL fraksjon. En antfoksydant,~"sTik som tocopherol tilsettes til en sluttkonsentrasjon på ca. 0,5% på vekt-basis. Analyse av lipidsammensetningen i denne fraksjon (preparat 2) er også gitt i tabell 1. Blant andre oppløs-ningsmidler som kan benyttes, skal nevnes: kloroform-metanol 1:1 (v/v), heksan, tetrahydrofuran, acetonitril, etanol, metanol, dietyleter og dietylketon. (3) En naturlig lipidkilde (f.eks. eggeplomme, soya-bønne) blandes først med aceton for å fjerne overskytende uønskede lipider. Precipitatet behandles deretter igjen med aceton og overstående væske samles og avkjøles til under 0°C hvoretter den ønskede AL fraksjon i en mengde på ca. 10 til 15 vekt-% av den opprinnelige mengde ubehandlet eggeplomme felles ut og samles. En antioksydant, slik som tocopherol tilsettes til en sluttkonsentrasjon på ca. 0,5% på vektbasis. Analyse av lipidkonsentrasjonen fra denne fraksjon (preparat 3) er gitt i tabell 1 og 2. Blandtvandre oppløsningsmidler som kan benyttes, skal nevnes: kloroform:metanol 1:1 v/v, heksan, tetrahydrofuran, acetonitril, etanol, metanol, dietyleter og dietylketon.

Lipidene ekstraheres fra en mengde på 10 g tørket eggeplomme ved først å blande med 50 ml aceton. Precipitatet fjernes og behandles deretter med 50 ml kloroform og oppløs-ningen som inneholder lipidekstrakten samles.Kloroformen fjernes deretter under redusert trykk til så og si tørr tilstand. En mengde på 50 ml kald, (5-10°C) aceton tilsettes, og dette resulterer i utfelling av hovedandelen av lipidene i løpetvav 1-3 timer. Precipitatet kasseres, overstående væske samles, og acetonen fordampes totalt. Tilbake blir den ønskede fraksjon av AL, aktive lipider, i en vekt på 0,8-1,2 g. Denne fraksjon supplementeres med 0,5% på vekt-basis av tocopherol. Sammensetningen av dette preparat (#1) er gitt i tabell 1.

En modifisert prosedyre, (#2), som gir tilsvarende resultater beskrives nedenfor: 10 ml fersk eggeplomme blandes med 30-4 0 ml aceton og omrøres i 5 minutter ved romtemperatur. Precipitatet samles og ekstraheres med 30-4 0 ml frisk aceton ved 40-45°C i 30-60 minutter, fiv<p>rsfå<p>nrl<p>vmV<p-->^iii1<p>s og fordampes til totalt tørr tilstand. Det forblir den ønskede fraksjon på 1,0 - 1,5 aktive lipider, AL. Denne fraksjon supplementeres med 0,5% tocopherol. Sammensetningen for dette preparat, (=&2) er også gitt i tabell 1.

Preparat #3 fremstilles som følger:

Et volum frisk eggeplomme blandes med 2-3 volumer aceton inneholdende 1 mg/ml vitamin E (a-tocopherolacetat)

ved romtemperatur i 5 minutter. Det faste stoff separeres og,behandles med to volumer frisk aceton med temperaturen 4 0-45°C i 1 time. Acetonekstrakten separeres fra den faste rest ved hurtig filtrering, og avkjøles til -20°C i 16 timer, hvor-ved AL felles ut. Det aktive lipid separeres ved hurtig filtrering, vaskes med etanol og tørkes godt (under vakuum). Produktet supplementeres med 0,5% vitamin E. Utbyttet er 10-15

g fra 100 g våt eggeplomme.

Aktiviteten for AL som lipidfluidiseringsmiddel demonstreres ved de følgende forsøk. Musenjernemembraner

(uren mitokondrisk fraskjon — fremstilt fra museforhjerne)

ble inkubert med lipiddispersjon i 50 mM tris-HCl bugger med pH 7,4 inneholdende 3,5% polyvinylpyrrolidon (PVP) (0,2 mg/ml)

i 30 minutter ved romtemperatur, undder stadig omrøring

(Heron et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." USA 77, 7463 (1980). Sluttkonsentrasjonen for lipidene var 0,04 mg lipider pr.

mg P2ITI membraner. Menbranene ble derettter vasket godt og lipidmikroviskositeten (n) i henhold til Chinitzky og Barenholz, "Biochem. Biphys. Acta" 515, 367 (1978). Kolesterol og fosfolipidinnholdet ble bestemt i henhold til Bartlett, "J. Biol. Chem." 234, .466 (1959), og Brown et al., "Anal. Chem" 26, 367,

(1954). Det kan klart ses i tabell 3 at AL er overlegen alle andre lipider som ble prøvet med henblikk på fluidiserings-potensen. ' Det fremgår også av tabell 3 at fluidiseringen gjennomføres både ved kolesterolekstraksjon og ved netto innarbeiding av fosfolipidene. Tilsvarende forsøk med muse-nyreceller ble gjennomført. Cellene (10^/ml) ble inkubert med lipiddispersjon (0,3 mg/ml) i fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) inneholdende 3,5% PVP i 2 timer ved 30°C og grundtig vasket..(Shinitzky et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." USA 76, 5313 (1979). Resultatene er oppsummert i tabell 4. Igjen kan det klart ses at AL er meget mere potent enn PC med henblikk på fluidiseringskapasitet.

Resultatene representerer den midlere+ S.D. for minst 10 forsøk, hver med en forskjellig sats AL.

I tillegg til å kunne være brukbar i in vitro manipuleringer, slik som beskrevet ovenfor, kan de ovenfor angitte AL fraksjoner benyttes som en aktiv bestanddel i medikamenter inngitt til varmblodige pattedyr for behandling av

forhold der strukturen og dynamikken for.-membxaaL4pldene

er forringet.

De effektive mengder av fraksjonen varierer med

de forhold som behandles, og pasientens behov, effektive meng-. der for varmblodige pattedyr er imidlertid i størrelsesorden

1 til 20 g pr. pasient pr. dag. De nye fraksjoner inngis

fortrinnsvis intravenøst i i form av en lipidsuspensjon i saltoppløsning (10-100 mg/ml).

For in vitro manipulering ligger de effektive mengder i størrelsesorden 50-200 mg/10 celler i 1 ml medium. Slike in vitro manipuleringer kan benyttes for å behandle sperminfertilitet, lette vevtransplantasjoner eller for å modulere viralinfektiviteten for bruk i vaksiner.

Underbyggende resultater.

(1) Reduksjon av tilbaketrekningssymptomer i morfinavhengige mus.

Fire grupper hann Balb/C mus ble subcutant injisert med morfin (mellom 4 0 og 2 00 mg/kg daglig i 8 dager).

På den 9. dag ble hver gruppe injisert intraperitonealt med (a) saltoppløsning (0,3 ml), (b) dipalmitoyl leeitin (et syntetisk fullt mettet membranforstivende middel), (c) AL

ved intraperitoneal injeksjon, eller (d) AL gitt i kosten. Alle fire grupper ble deretter injisert med 2,5 mg/kg naloxon, en morfinantagonisk kjent å presipitere tilbaketrekningssymptomer. Disse symptomer ble deretter notert i et observasjonskammer og resultatene er vist i tabell 5.

Mikroviskositeten for de synaptiske membraner

fra forskjellige regioner av hjernen, ble målt ved fluore-scenspolarisering ved bruk av difenylheksatrien (DHP) som prøve, ved den metoden som er beskrevet av Shinitzky og Barenholz, "Biochim. Biophs. Acta" 515, 367 (1978). Resultatene er også gitt i tabell 5, og kompatible med den antagelse av membranviskositeten (ri) økes under kronisk morfininntak. Dette skyldes sannsynligvis en økning i C/PL for å kompensere for fluidiseringsvirkningene av medikamentet. Lignende resultater er angitt av andre, (Johnson et al., "Mol.Pharmacol . " 15, 739 (1979); Chin og Goldstein, Science 196, 684

(1977) for alkohol addiksjon.

Det fremgår av tabell 5■at tilbaketrekningssymptom-ene ble forsterket av dipalmitoyl leeitin (som induserer enøkning i membran mikroviskositeten), og redusert, eller nesten

så og si eliminert, av AL - begge når de ble injisert eller gitt i kostholdet, med samtidige reduksjoner i membranviskositeten.

Som nevnt ovenfor, involerer kronisk alkoholisme også øket kolesterol i synaptiske membraner, for å kompensere for-alkoholens fluidiserende virkning, og derfor kan alkohol tilbaketrekning også være gjenstand for behandling med AL.

Fordi tilslutt adapsjonsprosessen (dvs. toleransen) for morfin og andre medikamenter, involverer økning i C/PL mol forholdet i membranene, kan AL, gitt i forbindelse med slike medikamenter som morfin osv., forhindre utvikling av toleranse og derfor en redusert potens for slike medikamenter. Dette aspekt kan være av avgjørende betydning, f.eks. i tilfeller med alvorlig kreft der pasienten gis morfin for å lette smertene.

Verdiene representerer den midlere + S.E.M. fra fire separate forsøk. "n" er det totale antall prøvede dyr. Mikroviskosi-tet (n) verdiene for hippocampus og caudate fra naive mus (n=20) var 5.80+0,03 og 6.10+0,05. 1. Prosentandel dyr som viser kontinuerlig og sterk skjelving i forlappene (mer enn 70 tilfeller). 2. Prosent dyr som viste alvorlig diarémed bløt, flytende avføring.

3. Prosentandel dyr som viste mer enn 10 tilfeller.

4. Prosentandel dyr som viste mer enn 5 tilfeller.

Andre symptomer slik som snusing, biting og annet var også mindre fremtredende i AL-gruppene sammenlignet med saltoppløsning eller dipalmitoyl leeitin. Generelt var AL-gruppene meget rolige mestparten av tiden og med svakere symptomer, mens dipalmitoyl leeitin-gruppene var opphisset og aggresive selv før naloxon-injeksjonene, og viste etterpå de mst alvorlige symptomer av alle grupper.

Signifikantsnivåer for Student t-test:

2. Reversering av mikroviskositeten for hjernemembraner hos det gamle dyr ved AL diett.

Fire grupper mus ble benyttet ved dette forsøk, i et klassisk T-kvadrat oppsett. To grupper besto av unge (2-3 mnd.) og to av gamle (24-27 mnd.), mus, hvilken gruppe ble behandlet med AL gitt i kosten (blandet med Purina Chow)

i 10-12 dager. Resultatene er vist i tabell 6.

Disse data representerer midlere +_S.D. verdier for 4-5 separate forsøk, hver gruppe inkludertee 4-6 dyr. Tallene i parentes representerer antallet determinasjoner, utført i

duplikat på prøver fremstilt fra ~2--poGied^--dy^eh^erner.

<*>- p<0,01 gammel' (kontroll) sammenlignet med

ung (kontroll).

t - p<0,01 gammel (AL) sammenlignet med gammel

(kontroll),

n.s. - ikke signifikant,

<**>- ung ((AL) sammenlignet med ung (kontroll).

Det ses klart ,at AL reverserer hyperviskositeten for forskjellige hjernepreparater fra gamle dyr, spesielt fra SPM ■ (synaptiske plasmamembraner) og mitochondria, mens de som tas fra unge dyr, ikke ble påvirket i det hele tatt av AL behandlingen. Tilsvarende "foryngelse" effekter ble funnet også i bindekarakteristika for reseptorer, slik som serotoninreseptorer og i proteinfosforlering (Hershkowitz et al.,) "Progress in Brain Research", Elsevier-North, Holland, i trykk) i hjerner for gamle dyr, mens ingen virkning av AL behandlingen.: på unge dyr ble observert. Dette fakt. impliserer at hos unge dyr med normale membranmikro-viskositet, har en beladning med lipider (f.eks. AL behandling) , ingen virkning på grunn av effektive reguleringspro-sesser. Hos alderde dyr, er imidlertid "egenviskøs tilpas-ning" (Sciensky, "J.Cell.Biol., 85, 166 (1980)), forringet. Dette impliserer at det ikke er noen fare for AL overdose fordd overskytende AL enten fjernes eller kompenseres for ved forandringer i andre lipider. De kliniske implikasjoner for disse resultater er åpenbare.

Det skal nevnes at i alle tilfeller med dyrebehand-ling (ved diett) kunne det ikke observeres noen påvisbare toksiskéi eller bivirkninger.

Til slutt skal det nevnes at proteinsyntese ved membranbundne ribosomer ble funnet å være vesentlig redusert i gamle dyrs cerebellum. Disse forandringer skuldes sannsynligvis forandring i membransammensetninger og strukturen.

Preliminære resultater viste at behandlingen av gamle dyr med AL (i diett) forårsaket en ikke-spesifik, generell økning i proteinsyntesen i disse dyrs cerebellum. 3 . Virkning av AL på immunf unksj- o- nen-«—-—■—-———

Hovedimmunmekanismen som arbeider mot bakterielle infeksjoner er inntak av bakterier på grunn av makrophager. Søkeren har fulgt denne prosess etter behandling med AL in vitro. Resultatene for representative forsøk er vist i tabell 7.

AL ble tilsatt til fullblod (heparinblod) fra gamle eller unge donorer til en sluttkonsentrasjon på 4 00 yg/ml. Blodet ble deretter inkubert ved 37°C i opp til 2 timer. 0,9 ml fullblod, enten behandlet eller ubehandlet, fra andre donorer, ble deretter tilsatt til 0,1 ml 1:1000 fortynning av en 0,6 O.D. (62 0 nm) suspensjon av staph. aureus i PBS. Ved de indikerte tidsrom, ble 10 yl av den ovenfor angitte blanding tilsatt til 5.5.3 agar, holdt ved 6 0°C. Agar-blod blandingen ble deretter kraftig rørt ved høy hastighet og helt i en petri skål og tillatt avkjøling. Platene ble inkubert over natt ved 35°C og koloniene tellet den følgende morgen (Kensel et al., "J.Infect. Dis." 131, 584 (1975)).

Antallet kolonier indikerer antallet overlevne bakterier. Det kan klart ses at antallet overlevne kolonier ble sterkt redusert når det gjaldt blod fra yngre donorer, noe som antyder en effektiv immun respons. AL hadde ingen effekt i disse tilfeller. Når det gjelder blod fra gamle donorer, ble antallet overlevne kolonier kun lett redusert, noe som indikerte en forringet immu-n-re-spe-r^v-~~A5i-4iadde en "foryngende" virkning på immunsystemet, noe som viste en gjenoppretning av funksjonen. De kliniske implikasjoner er åpenbare. 4. Virkning av AL på human lymfocyttaktivitet in vitro.

Perifere blodlymfocytter fra gamle menn (70-75 pr) ble blandet med bestrålte lymfocytter fra unge (30-40 år)

i en klassisk prøve med blandede lymfocytter (MLC) . Sensiti— sering av lymfocyttene ble gjennomført ved innarbeiding av H-thymidin. I nærvær av 0,2 mg/ml ALøket tymidininnarbei-ding på grunn av lymfocyttene fra gamle menn med 70-300%,

noe som indikerte en markert økning av den immunologiske respons.

5. AL virkning på hypertensive rotter.

Spontant hypertensive hunnrotter (SHR) ble plukket ut fra Charles Rivers (N.Y.) og oppdratt lokalt inntil de var 5 mnd. gamle. En gruppe på 10 rotter mottok en diett supplementert med 5% på vektbasis AL i 3 uker. Kontrollgruppen på 9 rotter ble matet på samme måte men uten AL supplement. Det midlere arterieblodtrykket (M.A.B.P.) ble deretter målt. I kontrollgruppen var M.A.B.P. 125 +16 mmHg mens den for AL-behandlede dyr var 110+12. AL reduserte signifikant (p<0,05) MABP for hypertensive rotter. Samtidig reduserte den også mikroviskositeten for P2ITImembraner, hentet fra striatum fra 6,5+0,2 poise ved 25°C til 5,5+

0,2 poise. Det var ingen signifikant forskjell mellom de to grupper når det gjaldt hjertehastighet eller vekt.

6. Andre virkninger av AL.

Preliminære resultater antydet at de forskjellige symptomer av amfetamininduserte phykose hos rotter ble lettet eller sogar eliminert ved hjelp av AL (oppnådd i samarbeid med G. Ellison, Brain Research Ins., USA.)

7. Prosedyre for fremstilling av aktivt lipid.

A. Materialer: Ferske store hønseegg, destillert aceton;

0,1 g/ml tocopherolacetat (vitamin E) i etanol, 0,1 m MgCl2, 0,1 CaCl2i vann (saltoppløsning).

B. Prosedyre:

(1) Bland 1 liter eggeplomme (ca. 60 egg) med 1 liter destillert aceton, 5 ml vitamin E ved romtemperatur i 5 minutter. Fang precipitatet i en glasstrakt. (2) Overfør presipitatet til 2 liter aceton, forvarmet til 45°, i et termostatstyrt bad..Tilsett 60 ml saltoppløsning og bland godt ved 4 5° i 1 time-. Filtrer hurtig gjennom den sintrede glasstrakt og fang opp væske. (3) Overfør væsken til et aceton—tørris kjølebad (-60 --7 0°C) hvoretter det dannes et precipitat. Etter 3 timer i kald tilstand samles precipitatet ved hurtig filtrering. Vektforholdet mellom fosfolipider og glycerider bør være ca. 1:3. Dette bestemmes ved fosfatanalyse og bør undersøkes for hver produksjonsmålestokk (se kommentarene). (4) Tin opp precipitatet ved oppvarming og overfør det til en fordampningsbeholder og tilsett 5 ml vitamin E. Slammet fordampes til totalt tørr tilstand under sterkt vakuum inntil det ikke er tilbake spor etter aceton. Produktet overføres til brune beholdere. Utbyttet er ca. 1 g pr. egg. (5) Det hele analyseres for fosfat (se nedenfor), mul-tipliseres med 2 6 som gir den- omtrentlige vekt av fosfolipidene. Dette bør utgjøre ca. 25-50% av den totale vekt.

C. Kommentarer:

Prosedyren som er beskrevet er for laboratorie-målestokk og visse variasjoner kan tenkes for større målestokker. Hovedvariantene er volumet aceton (2), volumet av tilsatt saltoppløsning (2) og kjøleopp-settet og lengden (3). Søkeren har funnet at 2 0-30% fosfolipider er optimalt, selv om spesielle formål vil kreve et annet fosfolipidnivå. Idag har søkeren de tekniske informasjoner om hvordan man skal komme frem til endelige fosfolipidinnhold på mellom 5 og 75%. I prinsippet er det mulig å fremstille enhver mellomligjg^d^J^D^s^xutrasjon _ved å blande fosfolipidsatser med høy og lav konsentra-sjon.

D. Analyser.

(1) Fosfolipider. Denne forbindelse bestemmes ved fosforprøver i henhold til Bartlett, "J. Biol. Chem." 234 466 (1959) med en modifikasjon ifølge Bottcher et al., "Anal. Chim. Acta", 24 203 (1961). Molet fosfor tilsvarer mol fosfolipid. Den gjen-nomsnittlige molekylvekten for fosfolipider settes som 800, derfor er vekten av fosfolipider 26 ganger vekten av fosfor som oppnås ved analysene. (2) Glycerider. Denne analyse er ikke lett, og er i virkeligheten ikke vesentlig, fordi over 90% AL er satt sammen av fosfolipidglycerider og de sistnevnte kan bestemmes ved hjelp av fosfolipidinnholdet. Metoden er gitt i Kates, "Techniques of Lipidology", s. 373-374. (3) Dispergerbarhet. De hovedsakelig fysikalske karakteristika for AL er evnen til å danne en homogen dispersjon i vann. 500 mg AL blandes i 5 ml vann og anbringes i et ultralydbad og behandles i 3 min. Det dannes en melkelignende suspensjon som er stabil i minst noen dager. En slik dispersjon bør være basis for utgangsmaterialet for intravenøs injeksjon. (4) Biologisk potens. AL øker responsiviteten for leukocytter mot mitogener (f.eks. Con A). Dette kan påvises enten in vivo eller in vitro. Idag er det å følge in vivo prøven mest'tilfredsstillende. Blod trekkes av fra en 5 - 8 mnd. gammel hunnkanin og benyttes umiddelbart for mitogene stimulerings-prøver. Umiddelbart etter blodtapping, blir 2 00 mg ultralydbehandlet AL i 2 ml saltoppløsning injisert intravenøst til den samme kanin. 24 timer senere tappes blod av igjen, og man prøver den mitogene respons. Over en 2-gangers øking av mitogen respons antyder en potent AL sats.

Claims

1. Preparat omfattende en lipid fraksjon avledet fra naturlige kilder (AL), karakterisert ved at den inneholder 40-80 vekt-% glycerid, 3-5 vekt-% kolesterol, 10-30 vekt-% leeitin (fosfatidyl cholin), 5-15 vekt-% fosfatidyl etanolamin og 2-51 vekt-% negativt ladede fosfolipider, idet forholdet mellom umettede og mettede fettsyrer er minst 1:1.

2. - Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at den inneholder 60-70 vekt-% glycerid, 3-5 vekt-% kolesterol, 15-25 vekt-% leeitin (fosfatidyl cholin), 5-10 vekt-% fosfatidyl etanolamin og 2-3 vekt-% negativt ladede fosfolipider, idet forholdet mellom umettede og mettede fettsyrer er minst 1:1.

'3. Preparat ifølge krav 2, karakterisert ved at fettsyresammensetningen for lipidene er følgende: Palmitinsyre 35-45%, oleihsyre 35-45%, linoleinsyre 5-10%, stearinsyre 5-7%, palmitileinsyre 2-3%, arachidoninsyre 0,2-1%.

4. Preparat ifølge krav 3, karakterisert ved at forholdet mellom umettede og mettede fettsyrer er minst 2:1.

5. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at de som additiv inneholder en effektiv mengde av en fysiologisk akseptabel antioksydant.

6. Preparat ifølge krav 2, karakterisert ved at de som additiv inneholder en effektiv mengde av en fysiologisk akseptabel antioksydant.

7. Preparat ifølge krav 3, karakterisert ved at de som additiv inneholder en effektiv mengde av en fysiologisk akseptabel antioksydant.

8. Preparat ifølge krav 4, karakterisert ved at de som additiv inneholder en effektiv mengde av en fysiologisk akseptabel antioksydant.

9. Preparat ifølge kraven e 5- 8, k a r_ a ._k_t ,e r i - sert ved at det inneholder fra ca. 0,2 til ca. 2 v vekt-% tocopherol som antioksydant.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av en aktiv lipidfraksjon AL, karakterisert ved at den omfatter å behandle en naturlig lipidkilde med en organisk væske for å fjerne uønskede lipider, samling av precipitatet og ny ekstrahering av precipitatet med aceton, fjerning av overstående væske og gjenvinning fra denne, av den ønskede fraksjon AL ved utfelling under 0°C.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av en aktiv lipidfraksjon AL som omfatter behandling av en lipidkilde med en organisk væske, oppsamling av precipitatet og reekstrahering av dette med aceton, fjerning av overstående væske og gjenvinning fra denne av den ønskede fraksjon AL ved fordamping av aceton.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10 eller 11, karakterisert ved at den organiske væske er aceton.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 10 eller 11, karakterisert ved at utgangsmaterialet er eggeplomme eller soyabønne eller disses urene lipidekstrakter.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at utgangsmaterialet er eggeplomme eller slyabønne eller disses, urene lipidekstrakter.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 10 eller 11, karakterisert ved at en antioksydant tilsettes til fraksjonen AL.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at en antioksydant tilsettes til fraksjonen AL.

17. Farmasøytisk preparat for oral inngivelse, karakterisert ved . at den som aktiv bestanddel inneholder en farmasøytisk effektiv mengde av et preparat ifølge kravene 1, 2, 3 eller 7.

18. Farmasøytisk preparat f or~oT"åT~Tnn'gi ve Tse 7" karakterisert ved at den som aktiv bestanddel inneholder en farmasøytisk effektiv mengde av et preparat ifølge krav 9.

19. Preparat ifølge krav 1, 2, 3 eller 7, i form av en lipid suspensjon i saltoppløsning (10-100 mg/ml), for in-travenøs injeksjon.

20. Preparat ifølge krav 9, i form av en lipid suspensjon i saltoppløsning (10-100 mg/ml), for intravenøs injeksjon .

21. Preparat ifølge kravene 1,2,3 eller 7, for oral inngivelse hvor lipidfraksjonen AL foreligger i en mengde fra 1 - 20 g pr. enhetsdoseform.

22. Preparat ifølge krav 9, for oral inngivelse hvor ■lipidfraksjonene AL foreligger i en mengde fra 1 - 20 g pr. enhetsdoseform.

23. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1, 3, 5 eller 8, karakterisert ved at lipidfraksjonen AL foreligger i en mengde av fra 0,05 til 2 mg/ml for in vitro behandlinger.