NO862999L

NO862999L - Lipidblanding for membranfluidisering.

Info

Publication number: NO862999L
Application number: NO862999A
Authority: NO
Inventors: Meir Shinitzky
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1985-07-26
Filing date: 1986-07-25
Publication date: 1987-01-27
Also published as: AU6057986A; JPS6284028A; CA1296640C; EP0213724A1; FI863050A0; AU594066B2; FI863050A; NO862999D0

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et preparat som øker membranfluiditeten i biologiske membraner, fremgangsmåter for fremstilling av preparatet og en fremgangsmåte for behandling eller prevensjon av forskjellige mangler ved bruk av preparatet.

Mange mangler hos mennesker og andre pattedyr har forbindelse med reduksjoner i fluiditeten (det resiproke av mikroviskositeten~<1>) i biologiske membraner. Fluiditeten i biologiske membraner bestemmes ved deres- struktur og kjemiske sammensetning og spesielt molforholdet mellom kolesterol og fosfolipider (C/PL), molforholdet mellom sfingomy-

elin og lecitin (S/L) og graden av umettethet i fosfolipidacylkjedene (Shinitzky and Henkart, Int. Rev. Cytol., 60:121 (1979); Cooper, J., Supramol. Struct., 8:413 (1979)).

Ved mange mangler forbundet med en reduksjon i membranfluiditeten medfører patogenese endringer i membranlipidsammensetningen eller en lipidmetabolisme (Cooper, N. Eng. J. Med., 297:371 (1977)). Disse endrin-

ger er i mange tilfeller korrelert til en økning i membranlipidmikroviskositeten til forskjellige vev på grunn av en økning i C/PL/ eller S/L

eller en reduksjon i graden av umettethet av fosfolipidacylkjedene eller en kombinasjon av disse tre ting. Lipidperoksydering kan også påvirke dynamikken i cellemembranproteinene og som et resultat i overte fysiologiske funksjoner (Sagai and Ichinose, Life Sei., 27:731 (1980)). Det følgende er en liste over mangler som er forbundet med lipidubalanse,

alle som kan henføres til lipidmanipuleringer:

1) Aldring og senesens (Yamamoto, Lipids, 3:284 (1968); Rivnay et al., Mech. Age, Dev., 10:71 (1979); Heron et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:7463 (1980); Araki og Rifkind, Life Sei., 26:2223 (1980); Hershkowitz et al., Progress in Brain Research, Elsevier-North Holland (i trykk); Ronser et al., Adv. Lipid Res. 10:262 (1972); 2) Abstinenssymptomer av medikament- og alkoholavhengighet (Johnson et al., Mol. Pharmacol., 15:739 (1979); Chin og Goldstein, Science, 196:684 (1979); Littleton og John, J. Pharm. Pharmac, 29:579 (1977);

Heron et al., Biochem. Pharmacol., i trykk (1982)). 3) Hyperlipidemiske . mangler slik som hypertensjon, aterosklerose, gallesten, cirrose og obesitet (Montenav et al., Biochem. Biophy. Res.

Comm., 100:660 (1981); Cooper, N., Engl. J. Med., 297:371 (1977;

Miettinen et al., Lancet, 2:835 (1972)).

4) Sperma infertilitet (Davis et al., Biochem. Biophys. Acta, 558:257

(1979); Davis, Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 152:257 (1976)). 5) Uparret immunfunksjon slik som aldring, obesitet og visse tilfeller av alergi (Rivnay et al., Mech. Age. Dev., 12:119 (1980); Rivnay et al., Mech. Age. Dev., 10:71 (1979)).

Det er også vist at synaptiske membranmikroviskositet øker som et resultat av de kirkurgiske eller kjemiske lesjoner av spesifikke veier i hjernen (Heron et al., Biochem. Pharmacol., i trykk (1982)). Disse funn kan gjelde andre degenerative eller organiske skader slik som Alzheimers sykdom, Parkinsonisme, Tardive dyskinesia, Huntington's chorea, tremor, atakai og epilepsi og visse tilfeller av mental retardasjon (Borri et al., Neurology, 17:172 (1967);, Hooghwinkel et al., Neurology, 18:408

(1968); Ueno et al., J. Neurol. Sei., 56:89 (1982)), alt som i prinsippet kunne behandles ved lipid manipulering.

Det er også generelt akseptert at visse mentale mangler, slik som mani, depressjon og schizofreni henger sammen med en kjemisk ubalanse i omdanningsgraden av neutrotransmittorer i hjernen. Det er tegn som tyder på at biogene aminer (dopamin, norefinfrin og serotonin) primært er involvert. Reseptorer og membranbundne enzymer som har å gjøre med omdanningen av disse transmittorer, kan endres ved endring av membranfluiditeten (Hershkowitz et al., Progress in Brain Research, Elsevier-Northe Holland, i trykk; Heron et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:7463 81980): Herom et alø., i Reveptors and Their Neutransmitters,

utg. Littauer et. al., John Wiley, London (1980); Heron et al., Eur. J. Pharmacol., 72:361 (1981)), og faller derfor også innenfor kategorien mangler som skyldes lipid manipulering.

Modulering av funksjonen ved lipidmanipulering kan også utføres in vitro. Dette skulle kunne anvendes på modulering av viral infektivitet for bruk

av vaksiner (Pal et al., Biochemistry, 20:530 (1981), og antigenisitet (Shinitzky og Souroujon, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 76:4438 (1979)), som kunne redusere ve,vrejeksjonen og lette transplantasjoner.

Tidligere ble slike mangler hyppig behandlet ved å innarbeide et høyt innhold lecitin (fosfatidyl kolin) i pasientens diett. I de fleste tilfeller er imidlertid innarbeiding av lesitin i dietten ikke funnet å være spesielt effektiv for å bøte på symptomer i forbindelse med lipidubalanse og i å gjenopprette membranlipidfluiditeten til det normale. Uheldigvis har dietiske lecitindoseringsnivåer som har hatt en viss virkning i å øke membranfluiditeten ofte hatt ugunstige virkninger på pasientens mave.

Det forblir således et behov i denne teknikk for en spesifikk, spesielt aktiv blanding lipider med effektive membranfluidiseringsevner. Fig. 1 er et skjematisk forstørret riss av en kylomikrolignende partikkel-form, oppstått når preparatet ifølge oppfinnelsen dispergeres i vandig oppløsning. Fig. 2 er et grafisk diagram som viser virkningen av forskjellige lipidblandinger på membranfluidiseringen hos humanerytrocytmembraner. Fig. 3 er et grafisk diagram som viser virkningen av forskjellige lipidblandinger på membranfluidiseringen hos humanlymfocytmembraner.

Fig. 4 er en grafisk illustrasjon av kolesterolfjernende evner i forskjel-

lige lipidblandinger med musetymocyter.

Fig. 5 er en grafisk illustrasjon av virkningen på humanlymfocytmem-branfluidisering av fosfatidylkolin sammenlignet med preparatet ifølge oppfinnelsen. Fig. 6 er en grafisk illustrasjon av virkningen av forskjellige lipidblandinger på kolesterolfjerning fra mennekselige lymfocyter. Fig. 7 er en grafisk illustrajson av virkningene av en diett inneholdende preparatet ifølge oppfinnlsen på immunresponsevnene hos rotter. Fig. 8 er et diagram som viser virkningen av en diett inneholdende preparatet ifølge oppfinnelsen på immunresponsevnene til et første humansubjekt. Fig. 9 er et diagram som viser virkningen av en diett inneholdende prapratet ifølge oppfinnelsen på immunresponsevnene til andre humansubjekt. Fig. 10 er et diagram som viser virkningen av en diett inneholdende preparatet ifølge oppfinnelsen på immunresponsevnene til et tredje humansubjekt.

I henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringes det et preparat bestående i det vesentlige av ca. 7 vekt-deler nøytrale lipider og ca. 3 vekt-deler fosforlipider, hvori de nøytrale lipider i det vesentnlige består av glyserider og fosforlipidene i det vesentlige består av fosfatidylkolin og fosfatidyletanolamin. Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av preparatet, en metode for å øke fluiditeten i et biologisk membran ved bruk av preparatet, en metode for å redusere membrankolesterolinnholdet ved bruk av preparatet og en fremgangsmåte for behandling eller forhindring av tilstander som er mediert av mera-branlipidubalansen, tilstander som kan tilskrives membranlipidmani-pulering, eller tilstander som stammer fra en økning i membranmikro-viskositeten.

De nye preparater ifølge oppfinnelsen er en spesiell lipidblanding som er overraskende effektiv for å øke fluiditeten i biologiske membraner.

Fosfatidylkolin, lecitin, er et vanlig membranfluidiseringsmiddel i naturen. Når imidlertid fosfatidylkolin innføres i blodet dannes det stabile bisjikt eller integrater i serumlipoproteinene, begge av hvilke er langsomme ved å bevirke cellemembranfluiditet. Som et resultat, når fosfatidylkolin alene innføres i blodstrømmen, blir mesteparten brutt ned i leveren før mulig-heten til å bevirke cellemembranfluiditet.

Det er imidlertid oppdaget at membranfluidiseringshastigheten på grunn

av fosfatidylkolin merkbart kan økes når fosfatidylkolin løst integreres i strukturer som letter lipidutveklsingsprosessen mellom membran og serum. Dannelsen av disse strukturer optimaliseres ved en spesiell lipidblanding ifølge foreliggende oppfinnelse.

Uten å ønske å være bundet av noen spesiell teori, antas det at effektiviteten til foreliggende preparat forklares av dannelsen av løst integrerte lipidstrukturer i en vandig oppløsning (f.eks. blod) som er utilstrekkelig stabilt in vivo til effektivt å lette translokalisering av membrankolesterol og eventuelt innføre eksogene fosfolipider i cellemembranene.

En spesiell lipidblanding ifølge oppfinnelsen består i det vesentlige av nøytrale lipider (NL) og fosfolipider (PL) i et vektforhold på ca. 7:3 der fosfolipidene i det vesentlige består av fosfatidylkolin (PC) og fosfatidyletanolamin (PE). Fordelaktig er fosfolipidene tilstede i den spesielle lipidblanding i et forhold på ca. 2 vekt-deler fosfatidylkolin og 1 vekt-

del fosfatidyletanolamin for å gi en lipid blanding et forhold 7:2:1 på vektbasis av nøytrale lipider, fosfatidylkolin og fosfatidyletanolamin.

Fosfatidyletanolamin er et natrulig fosfolipid som er funnet å destabili-sere lipidbisjikt og kan disintegrere stabile fosfatidylkolinliposomer. Imidlertid er det også funnet at blandinger av fosfatidylkolin og fosfatidyletanolamin alene har en tendens til å presipitere i vandige oppløs-ninger og er derfor ikke spesielt brukbare som membranfluidiserende midler in vivo.

Det er derfor funnet at en stabil emulsjon i en vandig oppløsning kan dannes med en blanding av fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin og nøytrale lipider bestående i det vesentlige av glyserider. En stabil emulsjon av disse lipider som dannes i en vandig oppløsning består av en cylomikronlignende struktur der glyseridene tjener som en hydrofob bærer på overflaten av hvilke fosfatidylkolin- og fosfatidyletanolaminmolekylene tilfeldig er spredd, se fig. 1.

Den spesifikke lipidblanding ifølge oppfinnelsen er funnet å danne disse cylomikronlignende strukturer i vandige oppløsninger (f.eks. blod) og er funnet å være et spesielt potent middel for å redusere membrankolesterolinnholdet og/eller å øke membranfluiditeten.

Lipidkomponentene inkludert i et preparat ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis avledet fra .naturlige kilder slik som eggeplomme, soyabønner, plante- eller animalsk materiale eller blandinger derav, og oppnås aller helst fra eggeplomme.

De nøytrale lipider som benyttes i lipdblandingen ifølge oppfinnelsen består i det vesentlige av glyserider. Den naturlige lipidkomponent i blandingen kan inneholde små mengder ikke-essensielle lipidurenheter som forblir forbundet med glyseridene under isolering av de naturlige lipider. Disse urenheter kan f.eks. inkludere 2-3 vekt-% kolesterol og 1-2 vekt-

% fosfolipider forskjellige fra fosfatidylkolin og fosfatidyletanolamin. Glyseridene kan inkludere monoglyserider, diglyserider og triglyserider, imidlertid er det foretrukket at triglyserider er tilstede i en større vektmengde enn noen annen type glyserid. Det er spesielt foretrukket at over 50 vekt-% av glyseridene er triglyserider.

Det er således oppdaget at den vesentlige bestanddel i en spesielt potent

lipid membranfluidisør i det vesentlige består av nøytrale lipider og fosfolipider, fosfatidylkolin og fosfatidyletanolamin, og at en 7:3 vekt-blanding av disse nøytrale lipider og fosfolipider er spesielt effektiv med henblikk på fluidisering av biologiske membraner.

Fluiditeten i biologiske membraner kan økes in vivo ved oral, intravenøs

eller topisk administrering. Alternativt kan membranfluiditeten økes in vitro ved å bringe membranet i kontakt med preparatet ifølge oppfinnelsen. Å bringe biologiske membraner i kontakt med preparatet ifølge oppfinnelsen resulterer i en reduksjon av kolesterolnivåene i membranene og kan øke fosfatidylkolinnivåene i membranene, noe som fører til en økning i membranfluiditet. Som vist i eksemplene nedenfor øker den spesielle lipidblanding ifølge oppfinnelsen vesentlig og hurtig fluiditeten i biologiske membraner. Videre er den spesielle blanding relativ stabil in vivo og således brukbar for effektivt å øke membranfluiditeten i en organisme.

Preparatene ifølge oppfinnelsen er egnet for in vivo-bruk i pattedyr, slik

som hos mennesker, for behandling eller prevensjon av tilstander som medieres ved membranlipidubalanse, tilstander som skyldes membranlipid-manipulering eller tilstander som er et resultat av en økning i membran-

mikroviskositeten. Som beskrevet i det av offentligheten eide US-

PS 4.474.773 inkluderer disse tilstander:

a) forskjellige symptomer på aldring og senesens (f.eks. tap av mentale funksjoner og libido, øket ømfindtlighet overfor bakterielle kontamineringer osv.); b) dysfunksjoner av immunsystemet; c) allergier; d) mentale mangler slik som bipolar affektivmangel (manisk depressjon) og schizofreni o.l.; e) mental retardering; f) neurologiske mangler, slik som" Alzheimers sykdom, Parkinsonisme, Tardive dyskinesia, Huntingtons chorea, tremor, ataksi, epelepsi

o.l.;

g) hyperlipidemiske tilstander, slik som hypertensjon, aterosclero-

se, gallesten, cirrose og obesitet o.l.; h) abstinens fra alkohol og andre medikamenter;

i) toleranse til alkohol og andre medikamenter.

Preparatet er også brukbart for å forbedre immunfunksjonen i normale eldre pasienter.

For in vivo-behandlingen av et biologisk membran som er tilstede hos et pattedyr slik som mennekset, kan preparatet ifølge oppfinnelsen administreres til pattedyret i en farmasøytisk effektiv mengde tilstrekkelig til å

øke lipid fluiditeten for biologiske membraner.

Preparatet ifølge oppfinnelsen kan suspenderes i en farmasøytisk aksepta-

bel bærer slik som saltoppløsning og administreres til pattedyrparenterat, f.eks. ved intravenøs injeksjon eller infusjon, for behandling eller prevensjon av de ovenfor nevnte tilstander. Preparatene kan også administreres oralt til pattedyr i form av farmasøytisk aksepterbare bærere, slik som næringsmidler (som et diett-supplement), såvel som andre former for oraladministrering, slik som ved hjelp av kapsler eller

tabletter i kjente farmasøytiske akseptable bærere. Når adminitreringen av preparatet ifølge oppfinnelsen skjer i dietten (ved bruk av næringsmiddel som bærer) er det foretrukket at dietten ikke inneholder andre lipider for å maksimalisere membranfluidiseringsegenskapene til preparatet. Eksempler på diett-supplementer som inneholder preparatet inkluderer gelatinkapsler og næringsmiddelstykke. Alternativt kan preparatet pakkes separat for forbruk efter oppløsning av preparatet i en ikke-lipid væske.

Preparatet ifølge oppfinnelsen er også egnet for behandling for tørr hud, eksempler og andre hudmangler. For hudmangler blir preparatet ifølge oppfinnelsen administrert topisk i bærere slik som kremer, salver o.l., eller i en pute.

Fluiditeten for biologiske membraner kan økes in vitro ved å bringe membranene i kontakt med preparatet ifølge oppfinnelsen. Eksempler på

in vitro membranmanipuleringer inkluderer behandling av sperminfertili-

tet, lettelser av vevtransplantasjoner og modulering av viralinfektiviteten for bruk ved vaksineringer.

I henhold til en utførelsesform består et preparat ifølge oppfinnelsen av

en farmasøytisk akseptabel bærer og en 7:3 vekt-bladning av nøytrale lipider, henholdsvis fosfolipider, der de nøytrale lipidene i det vesetntlige består av glyserider og fosforlipidene i det vesentlige består av fosfatidylkolin og fosfatidyletanolamin. Fosfolipidene er fortrinnsvis tilstede i et forhold på ca. 2 vekt-deler fosfatidylkolin og 1 vekt-del fosfatidyletanolamin.

Foreliggende oppfinnelse angår videre en fremgangsmåte for fremstilling

av et preparat, hvilket preparat er effektivt ved å ekstrahere kolesterol fra og å øke membranfluiditeten i biologiske membraner. Metoden omfatter å blande ca. 7 vekt-deler nøytrale lipider og ca. 3 vekt-deler fosfolipider der de nøytrale lipider i det vesentlige består av glyserider og fosfolipidene i det vesentlige består av fosfatidylkolin og fosfatidyletanolamin. Fordelaktig foreligger fosfolipidene i preparatet i et forhold på ca. 2 vekt-deler fosfatidylkolin og 1 vekt-del fosfatidyletanolamin. Fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin og de nøytrale lipider, i det vesent-

lige glyserider, kan erverves fra kommersielle kilder og blandes som angitt ovenfor. De nøytrale lipider kan alternativt fremstilles fra natur-

lige kilder som eggeplomme, slik som f.eks. vist i eksempel 1 nedenfor.

4

Oppfinnelsen skal illustreres ytterligere ved de følgende eksempler som ikke skal ansees begrensende.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av forskjellige blandinger av nøytrale lipider,

fosfatidylkolin og fosfatidyletanolamin.

Fosfatidylkolin (PC) og fosfatidyletanolamin (PE) begge fra høneegge-plomme og >99% rene, ble oppnådd kommersielt.

Nøytrale lipider (NL) fra eggeplomme ble isolert som følger: En høneegge-plomme på ca. 20 ml ble først blandet med 180 ml isopropanol og efter 1

time ved romtemperatur supplert med 200 ml kloroform og blandet i ytterligere 1 time. Presipitatet ble fjernet ved filtrering og det totale lipidekstrakt ble gjenvunnet ved fordamping av supernatanten. Lipidet ble så oppløst i 50 ml varm etanol og blandet med 1 liter 1 M Kcl i vann i en separasjonstrakt. Det øvre sjikt av det nøytrale lipidet ble separert, vasket to ganger med destillert vann og så tørket ved lyofilisering. Tynn-sjiktkromatografi og kjemisk analyse indikerte over 90% glyserider, hovedsakelig triglyserider, 2-3% kolesterol og 1-2% fosfolipider.

7:2:1 preparatet ifølge oppfinnelsen (7:2:1-blanding) ble fremstilt ved å blande 7 vekt-deler av de fremstilte nøytrale lipider, 2 vekt-deler kjøpt fosfatidylkolin og 1 vekt-del kjøpt fosfatidyletanolamin.

Andre blandeforhold for de ovenfor angitte utgangsstoffer ble fremstilt

for sammenligningsstudier med 7:2:1-blandingen ifølge oppfinnelsen. Resultatene av disse studier er angitt i eksemplene nedenfor.

EKSEMPEL II

Sammenligning av virkningene av forskjellige lipidblandinger

på membranfluiditeten hos humanerytrocyter og - lymfocyter. Humanerytrocyter og -lymfocyter ble underkastet forskjellige lipidbe-handlinger for å sammenligne effektiviteten av 7:2:1-blandingen ifølge oppfinnelsen med andre blandingsforhold.

I alle lipidbehandlingene ble polyvinylpyrrolidon (PVP, MW 40.000, Sigma) benyttet som hydrofob bærer. PVP-mediet bestod av 3,5% PVP, 1% storfeserumalbumin og 0,5% glukose i fosfatbufret saltoppløsning pH 7,4 (PBS).<3>H-natriumborhydrid (20 Ci/mmol) og<3>H-kolesterol (40 Ci/mmol)

-ble innkjøpt fra Amersham.

Lipidene ble innført i PVP-mediet ved 1:100 fortynning av en etanolopp-løsning mens i kontroll PVP-medium 1% etanol ble innarbeidet.

Humanerytrocyter og -lymfocyter ble isolert fra nytrukket heparinisert blod ved standard Ficoll-Hypaque sedimenteringsteknikk (se f.eks. Boyum,

A., Sean. J. Clin. Invest., 21:77-89 (1968) og så vasket to ganger med PBS. 5 x IO<7>erytrocyter eller 3 x IO<6>lymfocyter pr. ml PVP-medium inneholdende 0,5 mg/ml lipid ble inkubert ved 37"C under mild rysting i løst tildekkede glassampuller. De behandlede celler ble vasket en gang med PBS og så med 0,25 M C-bromid og en gang til med PBS. Vaskingen med 0,25 M Cs-bromid ble funnet å fjerne spor av lipid addert til celleoverflaten slik dette verifiseres med lipidblandinger inneholdende-<3>H-NL,<3>H-PC og<3>H-PE.

For merking av celler med 3H -kolesterol ble inkubering med PVP-medium inneholdende 10 pg/ml<3>H-kolesterol gjennomført under de ovenfor angitte betingelser, og tillatt å fortsette inntil det var nådd en økning på

ca. 1% i membrankolesterol.

Standardteknikken med stabil tilstandsfluoressens ble depolarisering med 1,6-difenyl 1,3,5-heksatrien (DPH) som en sonde, benyttet for å måle membranfluiditeten (se f.eks. Shinitzky, M. og Barenholz Y., Biochim. Biophys. Acta, 515:367-394 (1978), og Shinitzky, M. og Yuli, L, Chem. Phys, Lipids, 30:261-282 (1982).

Erytrocytmembraner i en sluttfortynning på 1:200 eller intakte lymfocyter

(2 x 10° pr. ml) i PBS ble merket med DPH og graden av fluoressenspolarisering, P, ble bestemt som tidligere beskrevet av Shinitzky, M. og Inbar, M., Biochim. Biophys. Acta, 433:133-149 (1976). Den empiriske

a. lineære skala 2P/(0,46-P) ble benyttet som en egnet presentasjon av membranlipidmikroviskositeten.

Det impermeable reagens 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre, TNBS, ble benyttet for å måle tilgjengeligheten av PE på den ytre overflate av - lipidstrukturene. Lipidblandinger (0,5 mg/ml) i PBS ble sonikert i 5 minutter i fravær av og i nærvær av 0,1% Triton X-100. Dette detergens ble påført for disintegrering av lipidelementene for å danne permeable blandede miceller. Til 1 ml av hver av blandingene ble det satt 10 pl 100 mg/ml TNBS (kommersielt farvefritt natriumsalt) i vann. I andre 1 ml prøver som tjente som referanser, ble 10 pl vann tilsatt. Efter 2 timers inkubering ved romtemperatur ble den optiske densitet ved 420 nm i de TNBS-merkede prøver i fravær av 0,Dpg5og i nærvær av Triton X-100 (O.Dtriton) målt mot deres referanseprøver i triplikat. Forholdet O.<D.p>B5/O.D.^r^onble tatt som andelen av PE tilgjengelig for TNBS-merking.

Membranfluidiseringspotensen for de forskjellige NL - PC-PE-blandinger ble prøvet på humanerytrocyter og -lymfocyter. Blandingene var alle 0,5 mg/ml og bestod av fosfolipidene PC og PE (2:1) og økende mengder NL. De oppnådde resultater med disse to celletyper er vist i figurene 2 og 3. Fig. 2 viser fluidisering av humanerytrocytmembraner (5"IO<7>celler/ml) med forskjellige NL - PC-PE-blandinger (0,5 mg/ml) efter 18 timers inkubering ved 35 °C. Resultatene er vist som middel ± S.D. for graden av DPH fluoressenspolarisering, P, oppnådd for membranprøver fra 10 mennesker. Resultatene oppnådd med PC alene under de samme tilstander (0) er inkludert for sammenligning. Fig. 3 viser fluidiseringen av humanlymfocytmembraner (3*10^ celler/ml) med NL - PC-PE-blandinger eller med PC (ø) (0,5 mg/ml) efter 3 timers inkubering ved 37 °C. Resultatene er vist i fig. 2.

Som vist i figurene 2 og 3, er membranfluidiseringsprofilen i begge celler bemerkelsesverdig lik og indikerer at blandingen av NL-PC-PE 7:2, blanding 721, er den mest potente membranfluidisator.

EKSEMPEL III

Sammenligninger mellom virkningen av forskjellige lipid-

blandinger på membranfluiditeten hos musetymocyter.

Forskjellige lipidpreparater og fosfatidylkolin alene ble sammenlignet med 7:2:1-blandingen fremstilt i eksempel I med henblikk på virkningen av ekstraheringshastigheten for kolesterol fra plasmamembraner av musetymocyter. 3H -kolesterol ble innarbeidet i celleplasmamembranene ved utbytting med det eksterne medium. Reduksjonshastigheten i radioaktive tellinger ved inkubering med lipid inneholdende medium ble bestemt. Resultatene er vist i fig. 4.

I kontrollforsøket (ingen lipidbehandling-øvre panel fig.4) representerte reduksjonshastigheten i 3H-kolesterol utbyttingshastigheten med kontroll-mediet som skulle taes som basislinje. Resultatene er middel ± SD av triplikater.

Fig. 4 viser klart at 7:2:1-blandingen ifølge oppfinnelsen er mest effektiv når det gjelder ekstraheringsgrad av overskytende kolesterol fra celle-membraner av de prøvede blandinger.

EKSEMPEL IV

Membranfluidiseringsvirkninger av 7:2:1- bladningen

ifølge oppfinnelsen sammenlignet med fosfatidylkolin alene.

I et studie tilsvarende eksempel II, ble fluidiseringseffektene av 7:2:1-bladningen sammenlignet med fosfatidylkolin alene ved bruk av humanlymfocyter. Fig. 5 viste økningen i fluidisering av humanlymfocyter inkubert ved romtemperatur med 0,5 mg/ml 7:2:1-blanding for forskjellige tidsrom i forhold til PC. Resultatene oppnådd med kontrollmedier er også innarbeidet.

Sim vist i fig. 5 medierer 7:2:1-blandingen sin effekt innen et relativt kort inkuberingstidsrom selv ved romtemperatur og er markert mer potent enn PC alene.

EKSEMPEL V

Kolesterolfjerning ved forskjellige blandinger av lipider.

I et forsøk tilsvarende eksempel III, ble humanperifere blodlymfocyter med 3H-kolesterol i membranene inkubert ved 37"C med forskjellige NL-PC-PE-blandinger. 2:1-blandinger av PC-PE ble blandet med økende mengder NL og sammenlignet i prøven. Radioaktiviteten pr. cellepopula-sjon ble målt efter 0 og 3 timers inkuberingstid og resultatene er presentert som forholdet mellom tellingene pr. minutt ved disse tidsrom.

Som vist i fig. 6 er 7:2:1 -bladningen den mest potente for kolesterol-ekstrahering sammenlignet med alle andre" prøvede blandinger.

EKSEMPEL VI

Virkningen av 7:2:1- diett sammenlignet med

standarddiett hos rotter.

Virkningen av 7:2:1 diett på immunkompetansen til unge (3-5 måneder) og gamle (22-24 måneder) rotter ble undersøkt i et kontrollert studium. Dietten bestod av "Purina"-f r pluss eller minus 4-6 vekt-% 7:2:1-blanding i løpet av 1 måned. Mitogene stimuleringer av splenocyter ble bestemt for hvert individuelle dyr med Con A. Splenocyter fra dyrene ble prøvet in vitro for mitogenrespons ved Con A stimulering av -tymidin-innarbeiding. Resultatene er presentert i fig. 7 for hver individuelle rotte som middel ± S.D. i triplikater.

Som indikert i fig.7 er splenocyter fra gamle rotter på en standarddiett betydelig mindre responsive til mitogenstimulering enn splenocyter fra unge rotter. 7:2:1-diett i de gamle øket splenocytresponsiviteten med ca.

en faktor 5 til et nivå tilsvarende det som ble funnet hos de unge dyr. Splenocyter fra de unge ble kun aktivert noe av 7:2:1-dietten. Tilsvarende resultater ble også oppnådd med lymfeknuteceller fra mus og rotter.

Den totale gjenopprettelse av immunkompetansen ved 7:2:1-dietten ble undersøkt ved økning i overlevelse av gamle dyr infisert med patogene bakterier. Den midlere evne for disse gamle dyr til å greie infektiøse sykdommer ble øket markert med 7:2:1-dietten og nådde et nivå tilsvarende det til de unge dy.r.

EKSEMPEL VII

Immunologisk studium hos mennesker under anvendelse av 7:2:1- supplementert diett.

Dette immunologiske studium involverte deltagere over 75 år som var immunundertrykket men som ikke viste noen organisk sykdom og som ikke tok immunosuppresive medikamenter. Den mitogene respons på perifere blodlymfocyter ble prøvet hos hver av deltagerne minst 3 ganger 3 uker før de gikk inn i studiet for godt å definere deres prinsipielle immunkompetanse. Et 7:2:1-blandingssupplement på 10-15g ble gitt hver mogen i en periode på flere uker, og responsiviteten for perifere blodlymfocyter mot mitogener ble prøvet med noen dagers mellomrom. 7:2:1-dietten ble så stanset, og virkningen på mitogenstimulering ble målt 7 dager senere. Typiske resultater oppnådd hos 3 deltagere er vist i figurene 8, 9 og 10 som viser responsiviteten for perifere blodlymfocyter mot PHS-stimulering før, under (///////) og efter 7:2:1 dietten hos subjektene. Som vist i fig. 8, 9 og 10, ble det efter flere dagers 7:2:1 dieett observert en signifikant økning i responsen på mitogener. Efter ca. 3 uker nådde den et nivå karakteristisk for det som finnes hos unge mennesker. Efter opphørt diett sank lymfocytresponsiviteten mot det opprinnelige basalnivå.

Claims

Preparat, karakterisert ved at det i det vesentlige består av 7 vekt-deler naturlige lipider og ca. 3 vekt-deler fosfolipider,

hvori de naturlige lipider består i det vesentlige av glyserider og de naturlige fosfolipider består i det vesentlige av fosfatidylkolin og fosfatidyletanolamin.
2.

Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at fosfolipidene er tilstede i et forhold på ca. 2 vekt-deler fosfatidylkolin og 1 vekt-del fosfatidyletanolamin.
3.

Preparat ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at fosfolipidene og de nøytrale lipider er avledet fra naturlige kilder.
4.

Preparat ifølge krav 3, karakterisert ved at den naturlige kilde er eggeplomme, soyabønner eller blandinger derav.
5.

Preparat ifølge krav 3, karakterisert ved at de naturlige kilder er eggeplomme.
6.

Preparat ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at glyseridene omfatter triglyserider.
7.

Preparat ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at av glyseridene er triglyseridene tilstede i en større mengde av noen annen type glyserider.
8.

Preparat ifølge krav 7, karakterisert ved at over 50

- vekt-% av glyseridene er triglyserider.
9.

Preparat ifølge krav 4, karakterisert ved at de naturlige lipider omfatter en fraksjon av eggeplomme og at frakjsonen omfatter ca. 90 vekt-% glyserider, fra ca. 2-3 vekt-% kolesterol og fra ca. 1-2 vekt-% fosfolipider.
10.

Preparat ifølge krav 9, karakterisert ved at over 50% av glyseridene er triglyserider.
11.

Fremgangsmåte for å øke fluiditeten i et biologisk membran omfattende å bringe membranet i kontakt med et preparat ifølge krav 1 og 2.
12.

Fremgangsmåte for å justere kolesterolinnholdet i et biologisk membran,

karakterisert ved at den omfatter å bringe membranet i kontakt med et preparat ifølge krav 1 og 2.