FI75270B

FI75270B - Foerfarande foer framstaellning av en terapeutiskt aktiv lipidfraktion (al).

Info

Publication number: FI75270B
Application number: FI823013A
Authority: FI
Inventors: Meir Shinitzky; David Heron; David Samuel
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1981-09-04
Filing date: 1982-09-01
Publication date: 1988-02-29
Also published as: EP0074251B2; FI75270C; DE3262884D1; JPH0786088B2; US4474773A; JPS58126812A; EP0074251B1; AU555915B2; FI823013L; IL63734A; NO822995L; AU8778282A; FI823013A0; EP0074251A1; IL63734A0

Description

75270

Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen lipidijakeen (AL) valmistamiseksi - Förfarande för framställning av en terapeutiskt aktiv lipidfraktion (AL)

Oheisen keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti aktiivisen lipidijakeen (AL) valmistamiseksi, joka lipidijae sisältää 40 - 80 painoprosenttia glyseridejä, 3-5 painoprosenttia kolesterolia, 10 - 30 paino-% lesitiiniä (fosfati-dyylikoliini), 5-15 paino-% fosfatidyylietanoliamiinia ja 2-5 paino-% negatiivisesti varautuneita fosfolipidejä, jolloin tyydyttyinättömien rasvahappojen suhde tyydytettyihin rasvahappoihin on vähintään 1:1.

Biologisten kalvojen lipidifluiditeetin (mikroviskositeetin käänteisarvo-π) määrää niiden rakenne ja kemiallinen koostumus ja erityisesti kolesterolin moolisuhde fosfolipideihin (C/PL), spingomyeliinin moolisuhde lesitiiniin (S/L) ja fosfolipidin asyyliketjujen tyydyttyinättömyysaste (Shinitzky ja Henkart,

Int.Rev.Cytol. 60, 121 (1979); Cooper, J. Supramol Struckt.

8, 413 (1978)).

Kalvon lipidifluiditeetti vuorostaan määrää monet näihin kalvoihin aivoissa ja muissa elimissä sitoutuneiden reseptoreiden (Muller ja Shinitzkym, Brit.J.Haematol.

42, 355 (1979); Heron, et. ai., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 77, 7463 (1980); Heron et ai., teoksessa "Receptors and their Neurotransmitters", toim. Littauer et ai.,

John Wiley, Lontoo (1980); Heron et. ai., Eur.J.Pharmacol.

(in press), antigeenien (Shinitzky ja Sourojon, * 2 75270

Proc . Natl. Acad. Sei . USA, 7_6, 4438 (1979)) , entsyymien (Sander-mann, Biochim.Biophys. Acta , 515, 209 (1978); Rimon et ai.»

Nature, 270 . 267 (1977 )) / ku ljetusaineiden (transport carriers) (Kimelberg, Biochim . Biophys . Acta , 413 , (1975 )) , ionikanavien (Stephens ja Shinitzky, Nature, 270 , 267 (1977)) /ja ribosomien (Τον/es et al., Biochim. Biophys . Acta , 287 , 301 (1972)) fysiologiset ominaisuudet. Tästä aiheesta on äskettäin tehty laaja katsaus (Shinitzky, Physiol. Rev. in press).

Kohdesolujen lopullinen reaktio riippuu sen vuoksi niiden kalvojen rakenteellisista ja dynaamisista ominaisuuksista, jotka niiden lipidikoostumus määrää. Sen vuoksi voidaan odottaa, että kunkin kohdesolun maksimaalisessa reaktiossa on lipidifluiditeetti optimaalinen (Heron et ai., Proc.Natl.

Acad.Sci. USA, 7463 (1980); Heron et ai., teoksessa "Receptors and their Neurotransmitters", toim. Littauer et ai., John Wiley, Lontoo (1980); Yuli et ai., Biochemistry, 20 , 4250 , (1980); Shinitzky, Physiol. Rev., in press).

Monissa taudeissa liittyy patogeenisuuteen muutoksia lipidin koostumuksessa tai lipidien metaboliassa (Cooper, N.Engl.J.Med., 29 7 , 371 (1977)). Nämä' muutokset korreloitavat useassa tapauksessa erilaisten kudosten kalvolipidien mikroviskositeetin kasvuun, joka johtuu C/PL- tai S/L-suhteen kasvusta tai fosfolipidin akryyliketjujen tyydyttämättömyysasteen pienenemisestä tai mistä tahansa näiden kolmen yhdistelmästä. Lipidien peroksidaatio voi myös vaikuttaa solukalvon proteiinien dynamiikkaan ja siten näkyviin fysiologisiin toimintoihin (Sagai ja Ichinose, Life Sei., 2J_, 731 (1980)). Seuraavassa on luettelo tällaisista lipidien epätasapainojen välittämistä häiriöistä, joihin kaikkiin voidaan vaikuttaa lipidejä manipuloimalla: (1) Ikääntyminen ja vanhentuminen (Yamamoto, Lipids, 3, 284 (1968); Rivnay et ai., Mech. Age.Dev. _10, 71 (1979);

Heron et ai., ei vielä julkaistu; kts. myös taulukko 4 tässä selityksessä; Araki ja Rifkind, Life Sei. £6, 2223 (1980);

Hershkov/itz et ai., Progress in Brain Research, Elsevier-North li 3 75270

Holland, in press); Ronser et al. , Adv.Lipid Res. 1JD, 262 (1972).

(2) Lääke- ja alkoholiaddiktion vieroitusoireet (Johnson et ai., Mol. Pharmacol., JL5, 739 (1979); Chin ja Goldstein, Science, 196, 684 (1979); Littleton ja John, J.Pharm.Pharmac. , 29, 579 (1977); Heron et al., Biochem, Pharmacol, in press (1982); (kts. myös taulukko 3 tässä selityksessä)).

(3) Hyperlipeemiset taudit, kuten hypertensio, ateroskleroosi, sappikivet, kirroosi ja liikalihavuus (Montenay et al.,

Biochem.Biophy.Res.Comm. 100, 660 (1981); Cooper, N., Engl.J. Med., 292, 371 (1977); Miettinen et al., Lancet 2, 835 (1972). Kts. myös taulukko 8 tässä selityksessä ) .

(4) Siittiöiden hedelmättömyys (Davis et al., Biochim.Biophys. Acta, 55J3 , 257 (1979); Davis, Proc. Soc. Exp . Biol. Med. , 152 .

257 (1976)).

(5) Heikentynyt immuuni funktio, kuten vanhentuessa, liikalihavuudessa ja eräissä allergiatapauksissa (Rivnay et al., Mech.Age. Dev., _1£» 119 (1980); Rivnay et al., Mech.Age.Dev. Π), 71 (1979). Kts. myös taulukko 9 tässä selityksessä).

Olemme myös osoittaneet, että synaptisen kalvon mikroviskositeetti kasvaa aivojen spesifisten reittien kirurgisten tai kemiallisten vammojen johdosta (Heron et al., Biochem. Pharmacol., in press (1982). Nämä havainnot voivat koskea myös muita degeneratiivisia tai orgaanisia vaurioita, kuten Alzheimer'in tautia, Parkinsonismia, hidasta liikuntahäiriötä, Huntington'in tanssitautia, vapinaa, ataksiaa, epilepsiaa ja eräitä tapauksia henkisestä jälkeenjäämisestä, joita kaikkia voitaisiin periaatteessa hoitaa lipidimanipulaation avulla.

Yleisesti on myös hyväksyttyä, että tietyt mielitaudit, kuten mania, depressio ja skitsofrenia liittyvät kemialliseen epätasapainoon aivojen neurotransmitterien vaihtumisnopeudessa.

75270

On olemassa viitteitä, että kyseessä ovat pääasiallisesti biogeeniset amiinit (dopamiini, norefinefriini ja serotoniini). Reseptoreihin ja kalvoihin sitoutuneita entsyymejä, joista on kyse näiden transmit te reiden vaihtumisessa , voidaan muuttaa muuttamalla kalvon fluiditeettia (Hershkowitz et ai., Progress in Brain Research, Elsevier-North Holland, in press; Heron et ai., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 77, 7463 (I960); Heron et ai., teoksessa "Receptors and their Neurotransmitters", toim. Littauer et ai., John Wiley, London (1980); Heron et ai., Eur . J. Pharmacol. , 72, 361 (1981)),ja siten myös nämä sisältyvät siihen tautiluokkaan, joka sopii lipidimanipu-laatioihin.

Lipidimanipulaatioilla tapahtuva toiminnan säätäminen voidaan suorittaa myös in vitro. Tätä voitaisiin Soveltaa virusten infektoivuuden säätämiseen rokotuskäyttöä varten (Pal et ai., Biochemistry 2J3, 530 (1981), ja antigenisyydeen säätämiseen (Shinitzky ja Souroujon, Proc . Natl. Acad. Sei . , USA 7_6, 4438 (1979)), mikä saattaisi pienentää kudoshyljintää ja auttaa transplataatioita.

Olemme havainneet, että eräitä 1ipiditasapainojen välittämiä haitallisia vaikutuksia voitaisiin korjat'a "membrane ί. c ' i i. engineering"-tekniikalla käyttämällä luonnonlähteistä saatua lipidien vaikutusjaetta. Tämä jae (joka sisältää oleellisen osan lesitiiniä) voi toimia usean mahdollisen mekanismin kautta: (1) Ylimääräisen kolesterolin uuttaminen passiivisen translokaa-tion kautta (Cooper, J. Supramol. Struct. , £, 413 (1978);

Miettinen et ai., Lancet, 2, 835 (1972); Morrison, Geriatrics 13, 12 (1958); Cooper et ai., J.Clin.Invest. 55, 115 (1975)).

(2) Vaihtuminen mikroviskositeetiltaan suurempien kalvolipidien kanssa (Wirtz ja Zilversmit, Biochim.Biophys. Acta 193, 105 (1969)) .

(3) Nettoliittyminen vaurioituneisiin lipideihin (esimerkiksi 5 75270 perhapettuneisiin) tai niiden korvaaminen (Bakardjieva et ai., Biochemistry 1J3, 3016 (1979)). Tämä voisi palauttaa degeneroituneiden membraanien rakenteen ja toiminnan ennalleen.

(4) Prekursorit eri metaboliareiteissä (esimerkiksi prostaglan-diinit, vitamiini D ja asetyylikoliini).

Runsaasti lesitiiniä sisältävät ruokavaliot, joita usein suositellaan moniin tauteihin (Cobb et ai., Nutr.Metab., 24, 228 (1980); Blass (Cornall-Burke Rehabilitation Center); Gershon (Lafayette Clinic, Detroit); Heyman (Duke University Med. Center); Sullivan et ai., (M.I.T. ja Tufts Univ.), teoksessa ''Proceedings of the International Study Group on the Pharmacology of Memory Disodere Associated with Aging", Ziirich (1981)), eivät kuitenkaan kovin tehokkaasti lievitä oireita, jotka liittyvät lipidien epätasapainoihin, eivätkä palauta kalvon lipidifluiditeettia normaaliksi. Syyt tähän eivät ole vielä selviä. Näyttää siltä, että aikaisemmin ehdotetut näiden lesitiinihoitojen perustelut, jotka perustuvat joko sen asetyy1ikoliinin prekursorirooliin tai suureen tyydyttämättömyyteen, kattavat vain pienehkön osan tästä lähestymistavasta (Herring et ai., Biochim.Biophys.Acta 602 , 1 (1980); Shinitzky ja Henkart, Int. Rev. Cytol. 60, 121 (1979)).

Luultavaa on, että lipidimanipulaatio yhdistää useita ennakkoehtoja, kuten seuraavat: (1) Fluidisaation saa aikaan tarkkaan määritelty osa lipideistä, kun taas muut lipidit toimivat oleellisina kantajina, jotka helpottavat kuljetusta ja absorptiota membraaneihin.

(2) Aktiivisten komponenttien ja kantajakomponenttien yhdistelmällä on määrätyt fysikokemialliset ominaisuudet, kuten pintatiheys ja varausjakauma.

(3) Nämä ominaisuudet voisivat olla optimaalisia solun pintoihin liittyvän hyvän kuljetuksen, hajoamisen, purkamisen tai 6 75270 vaihtumisen kannalta, vuorovaikutuskohdasta riippuen.

(4) Eri lipidikomponentit voisivat toimia synergistisesti edellä kuvattujen aktiivisuuksien aikaansaamiseksi.

(5) Tyydyttymättömyysaste on optimaalinen, so. silla on tarvittavat fluiditeettiominaisuudet (muuttuminen täydellisestä tyydyttyneisyydestä monotyydyttymättömyyteen on mitä kriittisintä fluidisointikyvyn kannalta, kun taas muuttuminen rnonotyydyttymättömyydestä moni-tyydyttymättömyyteen ei merkittävästi muuta fluidisointikykyä (Hubbell ja McConnell, J.Am.Chem.Soc. 93, 314 (1971); Stubbs et ai., Biochemistry 20, 4257 (1981)), mutta se ei kuitenkaan ole liian tyydyttymätön, jolloin se kestää paremmin hapettumista.

Oheisen keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että käsitellään tuore tai kuivattu munankeltuainen, soija-papuja tai näiden puhdistamatonta lipidiuutetta asetonilla ei-toivottujen lipidien poistamiseksi, otetaan sakka talteen ja uutetaan sakka uudelleen asetonilla, poistetaan supernatantti ja otetaan haluttu jae (AL) talteen supernatantista seostamalla alle 0°C:ssa, tai haihduttamalla asetoni.

Keksinnön mukaan valmistettua lipidiä ja sitä sisältäviä seoksia voidaan käyttää nisäkkäiden ja ihmisten erilaisten tautien ja anomaliatilojen hoidossa, kuten 1. Ikääntymisen ja vanhenemisen erilaiset oireet (esimerkiksi henkisten toimintojen ja lipidon häviäminen, lisääntynyt herkkyys bakteerikontaminaatioille jne.); 2. Immuunijärjestelmän häiriöt; 3. Allergiat; 4. Mielitaudit, kuten maanis-depressio ja skitsofrenia ja vastaavat; it 7 75270 5. Henkinen jälkeenjääneisyys; 6. Neurologiset häiriöt, kuten Alzheimer·in tauti, Parkin-sonismi, hidas liikuntahäiriö, Huntington'in tanssitauti, vapina, ataksia, epilepsia ja vastaavat; 7. Hyperlipidemiatilat, kuten hypertensio, ateroskleroosi, sappikivet, kirroosi ja liikalihavuus ja vastaavat; 8. Alkoholin ja muiden lääkkeiden vieroitusoireet; 9. Lääkkeiden sietokyvyn estäminen.

Esillä olevia aktiivisia lipidejä voidaan myös käyttää (in vitro tai in vivo) hedelmättömyyteen, virus- ja mikrobi-kontaminaatioiden hoidossa ja pienennettäessä kudoksen anti-geenisyyttä, mikä saattaa pienentää kudoshyljintää ja auttaa transplantaatioita jne.

Fraktiointi suoritetaan siten, että biologisesta lähteestä (esimerkiksi munankeltuaisesta, soijapavusta) saatu lipidiuute liuotetaan sopivaan liuottimeen, haihdutetaan liuotin lähes täysin kuiviin ja saostetaan liuenneista lipideistä jae lisäämällä orgaanista liuotinta ja otetaan talteen haluttu jae supernatantista haihduttamalla liuotin. Tähän jakeeseen lisätään 0,5 % paino/paino toko£erolia tai mitä muuta tahansa sopivaa antioksidanttia. Vaihtoehtoisesti fraktiointi suoritetaan siten, että lipidilähde (esimerkiksi munankeltuainen, soijapapu) käsitellään sopivalla liuottimena, poistetaan sakka ja sen jälkeen liuotetaan se uudelleen sopivaan liuottimeen ja otetaan supernatantti talteen. Haluttu jae otetaan sen jälkeen supernatantista joko haihduttamalla liuotin tai saostamalla kylmässä ja sen jälkeen haihduttamalla liuotin-jäämät. Myös tähän jakeeseen lisätään 0,5 % (paino/paino) tokoferolia tai mitä tahansa muuta sopivaa antioksidanttia.

Tämän keksinnön kolme parhaana pidettyä suoritusmuotoa ovat seuraavat.

8 75270 (1) Munankeltuaisesta saatu lipidiuute (esimerkiksi raakalesi-tiini) liuotetaan kloroformiin, haihdutetaan lähes kuiviin, asetonilisäyksellä saostetaan tietty osa lipidistä ja superna-tantti poistetaan, haihdutetaan ja liuotin poistetaan täysin kuiviin, jolloin jäljelle jää jae, joka sisältää noin 5 painoprosenttia käsittelemättömän munankeltuaisen alkumäärästä. Tämä jae on haluttu AL-jae. Lisätään antioksidanttia, kuten tokoferolia loppukonsentraatioon noin 0,5 % (paino/paino).

Tämän jakeen (valmiste 1) lipidikoostumuksen analyysi on annettu taulukossa 1.

(2) Luonnon lipidilähde (esimerkiksi munankeltuainen, soijapapu) sekoitetaan ensin asetonin kanssa ylimääräisten ei-toivottujen lipidien poistamiseksi. Sen jälkeen sakka käsitellään uudelleen asetonilla ja supernatantti otetaan talteen. Haihdutetaan täysin kuiviin, jolloin jäljelle jää jae, jonka määrä on noin 10 - 15 painoprosenttia käsittelemättömän munankeltuaisen alkumäärästä. Tämä on haluttu AL-jae. Lisätään antioksidanttia, kuten tokoferolia loppukonsentraatioon noin 0,5 % (paino/paino). Taulukossa 1 on esitetty myös tämän jakeen (valmiste 2) lipidikoostumuksen analyysi. Muista tässä yhteydessä käyttökelpoisista liuottimista mainittakoon: Kloroformi-metanoli 1:1 (tilavuus/tilavuus), heksaani, tetrahydrofuraani, aseto-nitriili, etanoli, metanoli, dietyylieetteri ja dietyyliketoni.

(3) Luonnon lipidilähde (esimerkiksi munankeltuainen, soijapapu) sekoitetaan ensin asetonin kanssa ylimääräisten ei-toivottujen lipidien poistamiseksi. Sen jälkeen sakka käsitellään uudelleen asetonilla ja supernatantti otetaan talteen ja jäähdytetään alle 0°C. Tällöin saostuu ja otetaan talteen haluttu jae (AL), jonka määrä on noin 10 - 15 painoprosenttia käsittelemättömän munankeltuaisen alkumäärästä. Lisätään antioksidanttia, kuten tokoferolia loppukonsentraatioon noin 0,5 % (paino/paino). Tämän jakeen (valmiste 3) lipidikoostumuksen analyysi on annettu taulukoissa 1 ja 2. Muista tässä yhteydessä käyttökelpoisista liuottimista mainittakoon: Kloroformi-metanoli 1:1 (ti lavuus/tilavuus), heksaani, tetrahydrofuraani, asetonit-riili, etanoli, metanoli, dietyylieetteri ja dietyyliketoni.

Il 9 75270

Parhaana pidetyn suoritusmuodon kuvaus 10 g:sta kuivattua munankeltuaista uutetaan lipidit sekoittamalla ensin 50 ml kanssa asetonia. Sakka poistetaan ja käsitellään sen jälkeen 50 ml:lla kloroformia. Otetaan talteen lipidiuutteen sisältävä liuos. Tämän jälkeen kloroformi poistetaan alipaineessa lähes kuiviin. Lisätään 50 ml kylmää (5 - 10°C) asetonia, jolloin suurin osa lipideistä saostuu 1-3 tunnin aikana. Tämä sakka heitetään pois, supernatantti otetaan talteen ja asetoni haihdutetaan kokonaan pois. Jäljelle jää haluttu aktiivisten lipidien jae (AL), jonka paino on 0,8 - 1,2 g. Tähän jakeeseen lisätään 0,5 % (paino/paino) tokoferolia. Tämän valmisteen (n:o 1) koostumus on annettu taulukossa 1.

Seuraavassa on kuvattu muunneltu menetelmä (n:o 2), jolla saadaan samanlaiset tulokset: 10 ml kanssa tuoretta munankeltuaista sekoitetaan 30 - 40 ml asetonia ja sekoitetaan 5 minuuttia huoneen lämpötilassa.

Sakka otetaan talteen ja uutetaan 30 - 40 ml:lla uutta asetonia 40 - 45°C:ssa 30 - 60 minuutin ajan. Supernatantti otetaan talteen ja haihdutetaan täysin kuiviin. Jäljelle jää haluttu jae aktiivisia lipidejä (AL), 1,0 - 1,5 g. Tähän jakeeseen lisätään 0,5 % tokoferolia. Myös tämän valmisteen (n:o 2) koostumus on annettu taulukossa 1. '

Valmiste n:o 3 valmistetaan seuraavasti:

Huoneen lämpötilrssa sekoitetaan 5 minuuttia keskenään 1 tilavuus tuoretta munankeltuaista ja 2 - 3 tilavuutta asetonia, joka sisältää 1 mg/ml vitamiinia E (α-tokoferoliasetaatti).

Kiinteä aine erotetaan ja käsitellään yhden tunnin ajan 2 tilavuudella uutta asetonia 40 - 45°C:ssa. Asetoniuute erotetaan kiinteästä jäännöksestä suodattamalla nopeasti ja jäähdytetään -20°C:een 16 tunniksi, jolloin aktiivinen lipidi (AL) saostuu. Aktiivinen lipidi erotetaan suodattamalla nopeasti, pestään etanolilla ja kuivataan hyvin (tyhjiössä).

10 75270

Tuotteeseen lisätään 0,5 % vitamiinia E. Saanto on 10 -15 g 100 g:sta kuivaamatonta munankeltuaista.

Taulukko 1: Aktiivisen lipidin koostumus

Valmiste Valmiste Valmiste n:ol n:o2 n:o3 paino -% paino-% paino-%

Neutraalit lipidit 50-70 70-80 65-75 (yhteensä) (a) glyseridit 40-60 60-70 60-70 (b) kolesteroli 3-5 3-5 3-5 (c) muut alle 5 alle 5 alle 5

Lesitiini (fosfati- dyylikoliini) 20-50 10-20 15-25

Fosfatidyyli- etanoliamiini 10-15 5-10 5-10

Negat iivisesti vapautuneet fosfo- lipidit 2-5 2-5 2-3

Tyydyttämättömät/ tyydytetyt rasvahapot yli 2 yli 2 yli 2 li 11 75270

Taulukko 2? Valmisteen n; o 13 rasyahappokoostumus (Tyypillinen esimerkki)

Rasvahappo AL Diqlyseridit NL Triglyseridit PC_PE

16:0 39,8 42,5 27,6 42,8 33,3 16:1 2,5 5,0 14,5 ......

18:0 6,6 5,8 12,3 13,5 15,1 18:1 42,5 40,0 26,3 34,8 42,7 18:2 8,2 6,6 19,3 8,9 8,9 20:4 0,4 --- --- --- ~-u

Aktiivisen lipidin aktiivisuus lipidin fluidisaattorina on osoitettu seuraavissa kokeissa. Hiiren aivomembraaneja (puhdistamaton mitokondriajae - , valmistettu hiiren etuaivoista) inkuboitiin lipididispersion kanssa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa koko ajan ravistellen 50 mM Tris- HC1-puskurissa, pH 7,4, joka sisälsi 3,5 % polyvinyylipyrrolido-nia (PVP) (0,2 mg/ml) (Heron, et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 22* 7463 (1980). Lipidien loppukonsentraatio oli 0,04 mg lipidejä per 1 mg P2m-membraaneja. Sen jälkeen membraanit pestiin hyvin ja määritettiin lipidin mikrovisko-siteetti (η) Shinitzky'n ja Barenholz'in menetelmillä,

Biochim. Biophys. Acta 515, 367 (1978). Kolesteroli-ja fosfolipidipitoisuudet määritettiin seuraavilla menetelmillä Bartlett, J. Biol. Chem. 234, 466 (1959), ja Brown et ai., Anal. Chem. 2£, 367 (1954). Taulukosta 3 käy selvästi ilmi, että aktiivisen lipidin fluidisointiteho on paljon parempi kuin kaikkien muiden testattujen lipidien. Taulukosta 3 voidaan myös havaita, että fluidisaation saa aikaan sekä kolesterolin uuttuminen että fosfolipidien nettoliittyminen. Hiiren pernasoluilla suoritettiin samanlaisia kokeita. Soluja (10^/ml) inkuboitiin lipididispersion (0,3 mg/ml) kanssa 2 tuntia 37°C:ssa fosfaatti-puskuroitu suolaliuos (PBS) puskurissa, joka sisälsi 3,5 % polyvinyyli-pyrrolidonia, ja pestiin hyvin (Shinitzky et ai. Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 7_6, 5313 (1979). Tulokset on koottu 75270 taulukkoon 4. Jälleen voidaan selvästi havaita, että aktiivisen lipidin fluidisointiteho on paljon tehokkaampi kuin PC: n.

Taulukko 3

Eri lipidien vaikutukset hiiren membraanien (P2m) mikroviskosi-teettiin (η) ja niiden kolesteroli (C) ja fosfolipidi (PL) pitoisuuteen

Käsittely η C-proteiini PL/proteiini C/PL

( 25°C, (paino/paino) (paino/paino) (M/M) poisi

Kontrolli ^,7+0,2 4,1+0,3 1,0+0,2- 0,33j+0,4 (käsitelty väli-teaineella) AL 2,8+0,3 2,3+0,3 1,8+0,3 0,11+0,2 (valmiste n:o 3) ”

Puhdistamaton muna- 4,0+0,1 3,6+0,2 1,1+0,2 0,27+0,4 lesitiini ("Sigma",

Grade II)

Puhdas munalesi- 4,1+0,2 3,3+0,4 1,5+0,3 0,18+0,3 tiini (PC) ("Lipid-Products",

Nutfield, Englanti)

Dipalmitoyyli- 6,4+0,2 lesitiini (OPL) (Koch-Light Labs,

Colribrook, Englanti)

Tulokset ovat vähintään 10 kokeen, joissa kussakin eri AI-erä, keskiarvoja standardipoikkeamineen.

11 13 75270

Taulukko 4

Eri lipidien vaikutus hiiren pernasolujen mikroviskositeettiin (n) Käsittely Π (25°C, poisi)

Kontrolli 3,5+0,2 käsitelty väliteaineella AL 2,3+0,3 (valmiste n:o 3) PC 3,3+0,2 ("Lipid products"

Nuffield, Englanti)

Tulokset ovat vähintään 5 kokeen, joissa kussakin eri AL-erä, keskiarvoja standardipoikkeamineen.

Sen lisäksi, että edelliset AL-jakeet ovat hyödyllisiä in vitro manipulaatioissa, kuten edellä on kuvattu, niitä voidaan käyttää aktiivisena ainesosana lämminverisille nisäkkäille annetuissa lääkkeissä hoidettaessa tiloja, joissa membraanilipidien rakenne ja dynamiikka on huonontunut.

Jakeen tehokkaat määrät riippuvat hoidetusta tilasta ja potilaan tarpeista, mutta lämminverisillä nisäkkäillä tehokkaat määrät ovat suuruusluokkaa 1 - 20 g potilasta ja päivää kohti. Uusi jae annetaan edullisesti laskimonsisäisesti lipidisuspensiona suolaliuoksessa (10 - 100 mg/ml).

In vitro manipulaatioissa tehokkaat määrät ovat suuruusluokkaa 50 - 200 mg/10^ solua 1 ml:ssa mediumia. Tällaisia in vitro manipulaatioita voidaan käyttää hoitamaan sperman f ~ _ 14 75270 hedelmättömyyttä, helpottamaan kudossiirrostuksia tai säätämään virusten infektoivuutta rokotteissa käyttöä varten.

Tukitulokset (1) Vieroitusoireiden pienentäminen morfiinille addiktoitu-neilla hiirillä

Neljä ryhmää Balb/C koirashiiriä injisoitiin subkutaanisti morfiinilla (40 - 200 mg/kg kaksi kertaa päivässä kahdeksan päivän ajan). 9. päivänä kumpikin ryhmä injisoitiin intraperi-toneaalisesti (a) suolaliuoksella (0,3 ml), (b) dipalmitoyyli-lesitiinillä (synteettinen, täysin tyydytetty membraaneja jäykistävä aine),(c) aktiivisella lipidillä i.p. injektiolla tai (d) aktiivinen lipidi annettiin ruoan mukana. Kaikki neljä ryhmää injisoitiin tämän jälkeen 2,5 mg/kg naloksonilla, joka cm morfiinin antagonisti ja jonka tiedetään käynnistävän vieroitusoireet. Näille oireille annettiin pisteluvut havaintokammiossa. Tulokset on esitetty taulukosa 5.

Aivojen eri alueilta saatujen synaptisten membraanien mikroviskositeetti mitattiin Shinitzky1 n .ja Barenholz'in menetelmällä, Biochim. Biophs.Acta 515, 367 (1978), fluore-senssipolarisaation avulla käyttämällä mittana difenyyliheksa-trieeniä (DPH). Myös nämä tulokset on annettu taulukossa 5. Tulokset sopivat yhteen ajatuksen kanssa, että membraanin mikroviskositeetti (η) kasvaa kroonisen morfiinin käytön aikana. Tämä luultavasti johtuu C/PL-suhteen kasvusta lääkkeen fluidisointivaikutusten kompensoimiseksi. Eräät muut tutkijat ovat ilmoittaneet samanlaisia tuloksia alkoholi-addiktion suhteen (Johnson et ai., Mol. Pharmacol ._15, 739 (1979); Chin ja Goldstein, Science 196, 684 (1977)).

Taulukosta 5 voidaan havaita, että dipalmitoyylilesitiini (joka lisää membraanin mikroviskositeettia) vaikeutti vieroitusoireita ja että aktiivinen lipidi pienensi niitä tai poisti ne lähes kokonaan sekä injisoitaessa että ruoan is 75270 mukana annettaessa, jolloin samanaikaisesti membraanin mikroviskositeetti laski.

Kuten edellä mainittiin, liittyy krooniseen alkoholismiin myös suurempi kolesterolipitoisuus synaptisissa membraaneissa, mikä kompensoi alkoholin fluidisoivia vaikutuksia. Alkoholin vieroitusoireita voidaan sen vuoksi myös hoitaa AL-käsitte-ly1lä.

Koska sopeutumistapahtumaan (so. toleranssiin) morfiinille ja muille lääkkeille liittyy C/PL-moolisuhteen kasvu membraaneissa, lääkkeiden, kuten morfiinin jne. yhteydessä annettu aktiivinen lipidi saattaa estää sietokyvyn kehittymisen ja siten tällaisten lääkkeiden tehon pienenemisen. Tämä lähestymistapa saattaa olla äärimmäisen tärkeää, esimerkiksi terminaalisissa syöpätapauksissa, joissa annetaan morfiinia kivun lievittämiseksi.

16 75270

Taulukko 5

Lipidien vaikutus naloksoonilla käynnistettyihin vieroitusoireisiin ja aivomembraanien lipidifluiditeettiin morfiinista riippuvilla hiirillä.

AL Suolaliuos Dipalmitoyy- Al-ravinto n=32 (kontrolli) lilesitiini n=10 n=2B n=16

Hypyt 3+0,7(*) 21+4 35+8(+) 11+4,4(f)

Kehon vapina 4+,9(*) 17+2,5 19+2,3(n.s) 4+1,6( )

Etukäpälien vapina1 40 % 80 % 90 % 60 %

Ripuli2 50 % 90 % 90 % 75 %

Kieriskely3 50 % 75 % 90 % 50 S

Siemensyöksyt 75 S 50 % 50 % 75 % η, 25°C (poisi)

Aivoturso 5,95+0,03(*) 6,41+0,04 6,58+0,07(r) 6,10+0,7(*) Häntätumake 6,41+0,06(*) 6,75+0,05 6,75+0,08(n.s) 6,58+0,09(f)

Luvut tarkoittavat neljän erillisen kokeen keskiarvoja keskivirheineen. "n" on testattujen eläinten kokonaismäärä. Käsittelemättömien hiirien (n=20) aivoturson ja häntätumakkeen mikroviskositeetit (η) olivat vastaavasti 5,80+0,03 ja 6,10+0,05.

1. Niiden eläinten prosenttimäärä, joilla esiintyi jatkuvaa ja voimakasta etukäpälien vapinaa (yli 70 kertaa).

2- Niiden eläinten prosenttimäärä, joilla esiintyi voimakasta ripulia pehmeine nestemäisine ulosteineen.

3. Niiden eläinten prosenttimäärä, joilla kertoja oli yli 10.

4. Niiden eläinten prosenttimäärä, joilla kertoja oli yli 5.

17 75270

Muut oireet, kuten pystyyn kohoaminen, siistiytyminen, nuuhkiminen, pureminen jne. olivat myös lievempiä AL-ryhmissä kuin suolaliuos- tai dipalmitoyyli-lesitiini-ryhmissä. Yleisesti ottaen AL-ryhmät olivat hyvin rauhallisia suurimman osan aikaa ja niillä oli heikompia oireita, kun taas dipalmi-toyyli-lesitiini-ryhmät käyttäytyivät oudosti ja agressii-visesti jopa ennen naloksoni-injektioita ja jälkikäteen niillä esiintyi kaikista ryhmistä voimakkaimpia oireita.

t-testin merkitsevyydet: (*) - p <0,001, ( ) - p < 0,025, (1) - Ρ < 0,05, (#) - p <0,1, (n.s.) - ei merkittävä 2. Vanhojen eläinten aivomembraanien mikroviskositeetin muuttuminen AL-ruokavalioilla Tässä kokeessa käytettiin neljää hiiriryhmää klassisena T-neliönä. Kaksi ryhmää muodostui nuorista (2-3 kuukautta) ja kaksi ryhmää vanhoista hiiristä (24 - 27 kuukautta).

Ryhmät käsiteltiin ruoan mukana annetulla aktiivisella lipidillä (sekoitettuna Purina Chow-rehuun) 10 - 20 päivän ajan. Tulokset on esitetty taulukossa 6.

18 75270

Taulukko 6

Nuorten (2-3 kuukautta) ja vanhojen ja (24 - 28 kuukautta) Eb/Bl-hiirten aivojen eri osista saatujen erilaisten aivoval-misteiden membraanilipidin mikroviskositeetti (fi) ennen AL-käsittelyä ja sen jälkeen

Valmiste Aivojen n, 25°C (poisi) alue Vanha (AL) Vanha Nuori NuorA1 2 (kontrolli) (kontrolli) (AL) SPM etuaivo 5.4+0.4(20)t 6.4+0.8(20)1 5.0+0.2(20) 4.9+0.2(6)n.s.

Mitokondria " 3.4+0.3(14)t 4.0+0.2(14)1 3.4+0.2(14) -

Mikrosomit " 4.9+0.3(12)n.e. 5.1+0.2(12)n.e. 5.0+0.1(12)

Puhdistamaton " 7.5+0.4(12)t 7.9^0.4(12)1 7.5+0.2(12) tumajae

Myeliini " 9.3+0.6(12)n.e. 9.3+0.4(12)n.e. 9.1+0.4(12)

Puhdistamaton » 5.8+0.1(14)t 6.1+0.2(14)« 5.5+0.2(20) 5.4+0.2(12)n.e.

homogenaatti

Dissoidut aivoturso 6.0+0.2(20)t 6.4+0.2(20)1 5.4+0.2(24) 5.4+0.2(12)n.s.

solut " häntätumoke 6.2+0.2(20)n.t. 6.4+0.2(20)1 5.5+0.2(24) 5.5+0.3(12)n.e.

Arvot ovat 4-3 edellisen kokeen keskiarvoja standardipoik-keamineen. Jokaisessa ryhmässä oli 4-6 eläintä. Suluissa olevat luvut tarkoittavat määrityskertojen määrää. Määritykset tehtiin kahdesti näytteistä, jotka oli valmistettu kahden eläimen yhdistetyistä aivoista.

Il - p <10,01 vanha (kontrolli) verattuna nuoreen (kontrolli) f - p ,0,01 vanha (AL) verrattuna vanhaan (kontrolli) n.s. - ei merkittävä 2 - nuori (AL) verrattuna nuoreen (kontrolli).

19 752 7 0

Voidaan selvästi havaita, että aktiivinen lipidi palautti takaisin vanhoista eläimistä saatujen eri aivovalmisteiden, erityisesti synaptisten plasmamembraanien (SPM) ja mitokondrioiden hyperviskositeetin, kun taas AL-käsittely ei lainkaan vaikuttanut nuorista eläimistä otettuihin valmisteisiin. Samanlaisia "nuorentavia" vaikutuksia havaittiin myös resepto-reiden, kuten serotiniinireseptoreiden sitomisominaisuuksissa ja proteiinien fosforylaatiossa (Hershkou/itz et ai., Progress in Brain Research, Elsevier-North Holland, in press) vanhojen eläinten aivoissa, kun taas nuorilla eläimillä ei AL-käsitte-lyllä havaittu mitään vaikutuksia. Tämä viittaa siihen, että nuorissa eläimissä, joilla membraanin mikroviskositeetti on normaali, lipideillä kuormittamisella (esimerkiksi AL-käsittely) ei ole mitään vaikutusta tehokkaista säätelyprosesseista johtuen. Vanhoilla eläimillä "homeoviskoosinen adaptaatio" on kuitenkin huonontunut (Sinensky, J. Cell.Biol., 85, 166 (1980)). Tämä merkitsee, että ei ole olemassa mitään vaaraa aktiivisen lipidin yliannostuksesta, koska ylimääräinen aktiivinen lipidi joko poistetaan tai muiden lipidien muutokset kompensoivat sen. Näiden kokeiden kliiniset merkitykset ovat ilmeisiä.

Maininnanarvoista on, että mitään havaittavia toksisia vaikutuksia tai sivuvaikutuksia ei esiintynyt missään eläinten hoitotapauksessa (ruokavalion avulla).

Lopuksi mainittakoon, että membraaniin sitoutuneiden ribosomien proteiinisynteesin havaittiin oleellisesti pienentyneen vanhojen eläinten pikkuaivoissa. Nämä muutokset johtuvat luultavasti membraanin koostumuksen ja rakenteen muutoksista.

Alustavat tulokset osoittavat, että vanhojen eläinten hoidot aktiivisella lipidillä (ruokavaliossa) lisäsi yleisesti ja epäspesifisesti proteiinisynteesiä näiden eläinten pikkuaivoissa .

3. Aktiivisen lipidin vaikutus immuunifunktioon 20 75270 Pääasiallinen bakteeri-infektioita vastaan toimiva immuunime-kanismi on se, että makrofaagit tuhoavat bakteerit. Olemme seuranneet tätä tapahtumaa in vitro AL-käsittelyn jälkeen.

Taulukossa 7 on esitetty tulokset tyypillisestä kokeesta.

Taulukko 7: Stafylococcus Aureus-pesäkkeiden määrä 0 tunti 1 tunti 2 tuntia

Nuori verenluovuttaja *- l 380 50 20

Nuori verenluovuttaja *> 1 + AL 375 55 18

Nuori verenluovuttaja p 2 385 62 17

Nuori verenluovuttaja *2 + AL 380 61 31

Vanha verenluovuttaja #-1 390 372 352

Vanha verenluovuttaja *1 + AL 375 150 92

Vanha verenluovuttaja ψ2 383 361 348

Vanha verenluovuttaja *2 + AL 381 180 70

Vanhojen tai nuorten verenluovuttajien kokovereen (heparinisoi-tu) lisättiin aktiivista lipidiä loppukonsentraatioon 400 Ug/ml. Sen jälkeen verta inkuboitiin 2 tuntia 37°C:ssa.

Verenluovuttajien joko käsiteltyä tai käsittelemätöntä kokoverta lisättiin sen jälkeen 0,9 ml 0,1 ml:aan Staphylococcus aureus'n suspension (optinen tiheys 0,6, 620 nm) 1:1000 i PBS-laimennukseen. Taulukossa ilmoitettuina aikoina tätä veriseosta lisättiin 10 U1 60C:ssa pidettyyn 5.5.3 agariin.

Agarin ja veren seosta pyörresekoitettiin suurella nopeudella ja kaadettiin petrimaljaan ja annettiin jäähtyä. Maljoja inkuboitiin yön yli 35°C:ssa ja pesäkkeet laskettiin seuraavana aamuna (Kensel et ai., J. Infect.Dis. 131, 584 (1975)).

Pesäkkeiden lukumäärä tarkoittaa eloonjääneiden bakteereiden lukumäärää. Selvästi voidaan havaita, että eloonjääneiden pesäkkeiden lukumäärä oli hyvin paljon pienempi, kun oli kysymys nuorilta verenluovuttajilta saadusta verestä, mikä merkitsee tehokasta immuunireaktiota. Näissä tapauksissa 11 75270 aktiivisella lipidillä ei ollut mitään vaikutusta. Kun veri oli peräisin vanhoilta verenluovuttajilta, eloonjääneiden pesäkkeiden määrä oli vain hieman pienempi, mikä merkitsee huonontunutta immuunireaktiota. Aktiivisella lipidillä oli "nuorentavia" vaikutuksia immuunisysteemiin, jonka toiminta näytti palautuneen. Kliiniset implikaatiot ovat ilmeisiä.

4. Aktiivisen lipidin vaikutus ihmisen lymfosyyttien aktiivisuuteen in vitro

Vanhojen miesten (70 - 75 vuotta) periferiaveren lymfosyyttejä sekoitettiin nuorten (30 - 40 vuotta) säteilytettyjen lymfosyyttien kanssa klassisessa MLC-määrityksessä (mixed lymphocytes assay). Lymfosyyttien herkistyminen määritettiin ^H-tymidiini-oton avulla. Kun mukana oli aktiivista lipidiä 0,2 mg/ml vanhojen miesten lymfosyytit ottivat tymidiiniä 70 - 300 % enemmän, mikä on osoitus selvästä immunologisen reaktiivisuuden kasvusta.

5. Aktiivisen lipidin vaikutukset hypertensiivisiin rottiin

Charles Rivers (N.Y.)-yhtiöltä ostettiin spontaanisti hyperten-siivisiä naarasrottia (SHR) ja ne kasvatettiin 5 kuukauden ikäisiksi. Yhdelle 10 rotan ryhmälle annettiin 3 viikon ajan ravintoa, jota oli täydennetty 5 % (paino/paino) aktii- .

vista lipidiä. Vertailuryhmää (9 rottaa) ravittiin samalla tavoin mutta ilman AL-lisäystä. Sen jälkeen mitattiin keskimääräinen valtimoverenpaine (M.A.B.P.). Vertailuryhmässä M.A.B.P. oli 125_^16 (mmHg), kun taas aktiivisella lipidillä käsitellyillä eläimillä se oli 110+12. Aktiivinen lipidi alensi merkittävästi (p 0,05) hypertensiivisten rottien MABP-painetta. Samanaikaisesti se myös alensi striatumista otettujen P2m-membraanien mikroviskositeetin 6,5+0$2 poisista (25°c) 5,5+0,2 poisiin. Näiden kahden ryhmän sydämen lyönti-nopeudessa tai painossa ei ollut mitään merkittävää eroa.

75270 22 6. Muut aktiivisen lipidin vaikutukset:

Alustavat tulokset osoittavat, että aktiivinen lipidi helpotti tai lähes kokonaan poisti rotilla amfetamiinilla indusoidun psykoosin eri oireet (tehty yhteistyössä G. Ellison.in kanssa, Brain Research Ins., UCLA).

7. Aktiivisen lipidin valmistaminen A. Materiaalit: Isoja tuoreita kananmunia, tislattu asetoni; 0,1 g/ml tokoferoliasetaatti (vitamiini E)etanolissa, 0,1 m MgC^, 0,1 m CaC^ vedessä (suolaliuos).

B. Menetelmä: (1) Sekoitetaan 1 litra munankeltuaisia (noin 60 munaa), 2 litraan tislattua asetonia ja 5 ml vitamiinia E huoneen lämpötilassa 5 minuutin ajan. Sakka otetaan talteen lasi-sintterisuppilolla.

(2) Sakka siirretään 2 litraan asetonia, joka on jo lämmitetty 45-asteiseksi termostoidussa hauteessa. Lisätään 60 ml suolaliuosta ja sekoitetaan hyvin 1 tunti 45°C:ssa. Suodatetaan nopeasti lasisintterin läpi ja neste otetaan talteen.

(3) Neste siirretään jäähdytyshauteeseen (asetoni-hiilihappo-jää, lämpötila välillä -60 ja -70°C), jolloin muodostuu sakka. Pidetään 3 tuntia kylmässä, minkä jälkeen sakka otetaan talteen suodattamalla nopeasti. Fosfolipidien paino-suhde glyserideihin tulisi olla noin 1:3. Tämä määritetään fosfaattianalyysin avulla ja se tulisi tarkistaa jokaisessa tuotantomitassa (kts. kommentit). 1 li

Sakka sulatetaan lämmittämällä ja siirretään haihduttimeen ja lisätään 5 ml vitamiinia E. Liete haihdutetaan tyhjiössä täysin kuiviin, kunnes asetonia ei ole lainkaan jäljellä.

Tuote siirretään ruskeisiin astioihin. Saanto on noin 1 g munaa kohti.

(5) Analysoidaan fosfaatin määrä (kts. jäljempänä), kerrotaan 26:11a, jolloin saadaan arvio fosfolipidien painosta. Tämän tulisi olla 25 - 50 % kokonaispainosta.

23 75270 C. Kommentit: Kuvattu menetelmä koskee laboratoriomittaa. Suuremmissa mitoissa tulisi ottaa huomioon eräitä muutoksia. Tärkeimmät muuttujat ovat asetonin (2) tilavuus, lisätyn suolaliuoksen tilavuus (2) ja jäähdytys ja sen pituus (3). Havaintojemme perusteella 20 - 30 % fosfolipidiä on edelleen optimaalinen määrä, vaikkakin erityistarkoituksissa fosfolipi-dien määrän on ehkä oltava erilainen. Meillä on tällä hetkellä teknillistä tietoa siitä, kuinka lopullinen fosfolipidipitoi-suus saadaan välille 5 - 75 %. Periaatteessa on mahdollista valmistaa mikä tahansa välikonsentraatio sekoittamalla eriä, joissa fosfolipidin määrä on alhainen tai korkea.

D. Analyysit: (1) Fosfolipidit. Tämä määritetään Bartlett'in, J. Biol.

Chem. 234 466 (1959), fosforimenetelmällä käyttäen Bottcher'in et ai. muunnelmaa, Anal Chim. Acta 2j4 203 (1961). Mooli fosforia vastaa moolia fosfolipidiä. Fosfolipidien keskimääräiseksi molekyylipainoksi otetaan 800, jolloin fosfolipidien painomäärä on 26 kertaa analyysissä saadun fosforin painomäärä.

(2) Glyseridit. Tämä analyysi ei ole helppo eikä se itse asiassa ole oleellinen, koska aktiivisesta lipidistä muodostuu yli 90 % fosfolipidiglyserideistä ja jälkimmäinen voidaan määrittää fosfolipidipitoisuuden avulla. Tämä menetelmä on annettu julkaisussa Kates, Techniques of Lipidoloqy P 373-374.

(3) Dispergoitavuus. Aktiivisen lipidin pääasiallinen fysikaalinen ominaisuus on sen kyky muodostaa homogeeninen dispersio vedessä. Sekoitetaan 500 mg aktiivista lipidiä 5 ml:aan vettä ja seos laitetaan ultraäänihauteeseen ja käsitellään 3 minuuttia. Muodostuu maitomainen suspensio, joka on stabiili vähintään muutaman päivän. Tällaista dispersiota on mahdollista käyttää intravenöösin injisoinnin perusmateriaalina.

24 75270 (4) Biologinen teho. Aktiivinen lipidi lisää leukosyyttien reaktiivisuutta mitogeeneille (esimerkiksi Con A). Tämä voidaan määrittää joko in vivo tai in vitro. Tällä hetkellä paras on seuraava in vivo-koe. 5-8 kuukauden vanhasta naaraskaniinista valutetaan verta ja käytetään välittömästi ms-määritykseen (mitogenic stimulation assay). Välittömästi veren valuttamisen jälkeen samaan kaniiniin injisoidaan intravenöösisti 200 mg ultraäänikäsiteltyä aktiivista lipidiä 2 ml:ssa suolaliuosta. 24 tuntia myöhemmin valutetaan lisää verta ja määritetään jälleen mitogeeninen reaktio. Yli 2-kertainen mitogeenisen reaktion kasvu on osoitus tehokkaasta AL-erästä.

li

Claims

75270

1. Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen lipidijakeen (AL) valmistamiseksi, joka lipidijae sisältää 40 - 80 paino-% glyseridejä, 3-5 paino-% kolesterolia, 10 - 30 paino-% lesitiiniä (fosfatidyylikoliini), 5-15 paino-% fosfatidyyli-etanoliamiinia ja 2 - 5 paino-% negatiivisesti varautuneita fosfolipidejä, jolloin tyydyttämättömien rasvahappojen suhde tyydytettyihin rasvahappoihin on vähintään 1:1, tunnet-t u siitä, että käsitellään tuore tai kuivattu munankeltuainen, soijapapuja tai näiden puhdistamatonta lipidiuutetta asetonilla ei-toivottujen lipidien poistamiseksi, otetaan sakka talteen ja uutetaan sakka uudelleen asetonilla, poistetaan supernatantti ja otetaan haluttu jae (AL) talteen supernatantista seostamalla alle 0°C:ssa, tai haihduttamalla asetoni.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että AL-jakeeseen lisätään antioksidanttia.