NO750639L - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte og innretning til måling

av antigen-antilegeme-reaksj oner.

Oppfinnelsens gjenstand er en fremgangsmåte til måling av antigen-antilegeme-reaksjoner med laserlys samt' en innretning til gjennomføring av fremgangsmåten.

Kvantitative angivelser over proteiner i legemsvæsker karakteriserer de undersøkte organismer i avgjørende punkter.

Immunologiske bestemmelsesmetoder av antigener beror på antigenenes egenskap og reagerer med spesifikt mot dem rettede antilegemer støkiometrisk under dannelse av presipitater, Byggende på dette prinsipp ble det utviklet en rekke fremgangsmåter, hvorav de viktigste nedenfor er anført i rekkefølge med stigende følsomhet ved siden av deres påvisningsgrenser:

Som det fremgår av denne oppstilling er diffusjonsme-toden ofte ikke følsom nok for et antall antigener i kroppsvæskene eller kulturfiltratet av mikroorganismer. På grunn av den nødvendige diffusjonstid er disse metoder dessuten langvarige. Mens ved de mere følsomme prøvesystemer som hemaglutinasjon er relativt omstende-lige er radioimmunologiske fremgangsmåter meget kostbare på grunn av den høye pris av reagensene og de nødvendige måleapparater. ,

Et fremskritt i økningen av følsomheten ved hurtig-forløpende og med det blotte øye avlesbare fnokningsreaksjoner bragte anvendelsen av optiske uklarhetsmåleapparater, såkalte nefelometere.

Nefelometriske konsentrasjonsbestemmelser er spesifikke, hurtige og prisgunstige. Herved måles spredningslyset, som går ut fra presipitatpartiklene i en uklar oppløsning. Det måles i første rekke sprednings lysintensiteten av oppløsninger av forskjellige, men kjente konsentrasjoner og oppstilles en målekurve. Under samme for-søksbetingelser foregår deretter spredningslysmålingen av ukjente oppløsninger.

De anvendte måleapparater består av en inkoherent lyskilde, en optisk spaltesystemanordning, en kuvette og en fotodetektor. Uheldig ved disse apparater er den til kravene ofte ikke til-fredsstillende påvisningsfølsomhet, samt den manglende reproduserbarhet ved de nedre påvisningsgrenser.

Disse analyseapparater er dessuten meget kostbare. Automatiske apparater anvendes forenklet i storklinikker, hvor

store prøvemengder analyseres. Ved veksling til bestemmelse av et annet antigen må anlegget renses i flere spyleproesser. Det anvendes derfor for flere gangs bestemmelser dyre, parallelt løpende analyse-veier.

I mindre klinikker, i legepraksis eller i vitenskapelige laboratorier krever man i betjeningen mere fleksible og billigere apparater.

Det fremstår derfor den oppgave å finne en innretning hvormed påvisningsfølsomheten og dens reproduserbarhet betraktelig forbedres og er mere fleksibel anvendbar.

Oppfinnelsens gjenstand er en fremgangsmåte til måling

av antigen-antilegeme-reaksjoner, hvor oppløsningen og det antigen som skal bestemmes sammenblandes med de tilsvarende antilegemer, blandingen stilles i en lyskilde strålegang og det forover spredte lys måles med en fotodetektor, idet fremgangsmåten erkarakterisertved at man gjennomstråler blandingen med laserlys og utelukkende måler det under liten romvinkel forover spredte lys med fotodetektoren og deretter analyserer kvantitativt.

Dessuten er det funnet en innretning til gjennomføring

av overnevnte fremgangsmåte, idet denne innretning erkarakterisertved at en målekuvette er anordnet i den optiske akse av et målesystem bestående av en laser, minst to blendere, et linsesystem og en foto-

detektor mellom blende- og linsesystemet og at målesystemet mellom målekuvette og linsesystem i den optiske akse har en lysfelle hvis diameter utgjør 1,1- til 1,7 ganger laserstrålediameteren.

Med lysfelle forstås f,eks. innretninger til absorbering av lyset eller omstyring av lyset som speil, prismer, lysledere og lignende.

Innretningen kan forbedres ved at man innenfor linsesystemet anordner en innretning til utblending av det fra blendene stammende sprederlys.

Består lys-fellen av et speil, så kan det ved tilsvarende justering til laserendeflåtene eller til et mellom laser'og målekuvette anordnet speil oppnås en intensitetsøkning.

Tegningsfigurene viser en eksempelvis utførelse av oppfinnelsen. Figur 1 viser en skjematisk oppbygning av innretningen med en anordning av strålegangen.

Figurene 2 og 3 viser to utførelseseksempler. Det er oppført spredningslyssignalet U som funksjon av konsentrasjonen C.

I lysbunten 11, av en laser 1, eksempelvis en Hé-Ne-laser bringes de to blendere 2 og 3• Bak blendene gjennomtrenger laserlyset en eksempelvis 10 mm dyp, 4 mm bred og 20 mm høy kuvette 4. Et ensidig lukket svertet lite rør 5 (diameter 1,5 mm) eller lignende tjener som lysfelle for den direkte laserstråle og er fortrinnsvis anordnet direkte bak kuvetten. I kuvetten fylles 0,1 ml antigen, eksempelvis menneskelig serum og 0,1 ml antiserum, som inneholder antilegemet mot antigenet som skal bestemmes. De i reaksjonsoppløs-ningen dannede utfellingspartikler sprer laserlyset. Det under liten romvinkel i fremadretningen spredte lys samles ved hjelp av et linsesystem 9 på en fotodetektor 7. Ved anvendelse av overnevnte kuvette kommer også under større vinkel spredt lys ved refleksjon på kuvettens indre vegger, dessuten i linsesystemet. Signalene av fotodetektoren 7, f.eks. en fotodiode tilføres et påvisningsinstrument 8, f.eks.

en skriver. En liten sort blender 6 (diameter er ca. laserstrålediameteren) fastgjøres inne i linsesystemet 9 på fire tynne tråder 10. Herved kan det ved blendene 2 og 3 dannede spredningslys ut-blendes og forstyrrelsesbakgrunnsn minskes.

I forsøk til påvisning av følsomhet og reproduserbarhet av fremgangsmåten ble det som antigen-antilegeme-reaksjon anvendt systemet albumin/antialbumin. Hertil ble det som antigen fortynnet et albuminholdig menneskelig blodserum 1:52. Som antilegeme ble det anvendt et anti-humanalbumin-serum fra kaniner i to fortynninger

(1:5 resp. 1:40). Reaksjonsoppløsningen ble filtrert gjennom et membranfilterjav porediameter fortrinnsvis mindre enn 0,3/Um og samme volum fylt i kuvetten. Etter 45 minutter ble kuvetten rystet kraftig for å oppvirvle den selv ved lave konsentrasjoner, dvs. lavere enn 10 -2 mg/100 ml, opptredende bunnavsetning. Kuvetten ble bragt i laserstrålen og spredningslyset målt. Ved høyere som også ved lavere antilegemekonsentrasjon ble det fastslått en lineær sammenheng i dobbelt logaritmisk gjengivelse over tilnærmet 4 tipotenser av albuminkonsentrasjonen.

Figur 2 viser antigen-antilegeme-reaksjonskarakteristiske linjer A, B og C av tre forskjellige mot antigenalbumin rettet kanin-antisera. Spredningslysintensitet U er over tilnærmet fire tipotenser i dobbeltlogaritmisk gjengivelse lineært avhengig av albuminkonsentrasjonen.

Avvikelsen av målepunktene fra den tegnerisk fastslåtte funksjon utgjorde over 0,1 mg/100 ml bare ca. ± 5%• Ved relativt høye konsentrasjoner av standard-human-serum på 10 mg/100 ml oppløste utfellingspartiklene seg igjen delvis og spredningslyssignalet avtok. I dette tilfellet lønnet det seg med en tilsvarende forfortynning av antigenoppløsningen.

Ved vanlige spredningslysmålinger oppnår man nøyaktig-heter på ± 10%, idet den nedre påvisningsgrense i det gunstigste tilfellet ligger ved ca. 10 ^ mg/100 ml. Ved anvendelse av en gasslaser, som en He-Ne-laser av 1 mW og ved måling av det i fremadgående ret-ning spredte lys kan det ved neflometriske undersøkelser oppnås en følsomhetsøkning med en faktor mellom 10 og 100. Den kvantitative påvisning av antigenkonsentrasjoner mellom 10 og 10 ^ mg/100 ml 0,1 til 0,01^ug/ml muliggjøres ved anvendelse av omhyggelige filtrerte oppløsninger. Reproduserbarheten av målepunktene av målekurven er meget god.

Antigenkonsentrasjonens avhengighet som skal fastslås en gang av den tilsvarende signalintensitet av laserspredningslyset muliggjør gjentatt tilordning av det målte signal til den søkte kon-sentrasjon av antigen. Derved synes det ikke nødvendig å gjennomføre hittil vanlige kontroll- og parallellmålinger med målestoffer.

Det ble videre funnet at ved økning av ytelsen av lyskilden med tre ganger, eksempelvis ved erstatning av emul mWrilaser med en 3 mW-laser, og ved en forbedret fokusering av spredningslyset på den fotoelektriske mottager, f.eks. ved anvendelse av en mikroskop-

linse som linsesystem 9, kan apparatets følsomhet vesentlig økes.

Med dette følsomme apparat lykkes det å gå frem med en ytterligere tierpotens til et måleområde fra 0,01 til 0, OO.l^ug/ml og påvise sporeantigener.

Som kjent lar ved tilsetning av etylenglykol tiden for antigen-antilegeme-reaksjonen seg forkorte, som også kan nyttes ved laserspredningslysmålinger.

Det er videre blitt fastslått at spesielt ved høye anti-genkonsentras j oner sedimenterer en del av utfellingspartiklene ennu i løpet av reaksjonstiden. Det er derfor nødvendig kraftig å ryste reaksjonsblandingen etter reaksjonsavslutningen. Måleverdier oppnådd på denne måte er vanligvis bedre å reprodusere enn verdier av reaksj onsb landinger som ikke blir rystet.

Ifølge oppfinnelsen lar det seg bestemme alle antigener

i oppløsninger, mot hvilke kan fåes de spesifikke antisera. Et fore-trukket anvendelsesområde for metoden ligger i den kvantitative bestemmelse av bestanddeler av legemsvæsken, spesielt blodplasma og av antigene mikrobielle stoffvekslingsprodukter eller planteinne-holdte stoffer,

Ved egnet modifikasjon av anordningen slik den ble be-skrevet ovenfor lar fremgangsmåten' seg også automatisere, som dette på tilsvarende måte allerede er kjent ved neflometere ved hjelp av fluoressens-spektral-fotometere. 1 det følgende eksempel skal oppfinnelsen forklares nærmere i forbindelse med den kvantitative bestemmelse av et spore-protein fra plasma.

Eksempel.

2 ml av et pasientserum filtreres gjennom et membran-filter (porediameter 0,05/Um). 0,2 ml av et IgE-antiserum, som ble forfortynnet,'1:5 med isotonisk kokesaltoppløsning, haes i apparatets målekuvette og blandes med 0,2 ml av det filtrerte pasientserum. Kuvetten lukkes lufttett og hensettes ved værelsestemperatur i 16 timer. Deretter rystes kuvetten kort tre ganger. Etter 10 minutters henstand i ro stilles kuvetten i strålegangen av et laser-spredningslys-måleapparat. Figur 3 viser de karakteristiske linjer av immun-globulin E (IgE)-sporeprotein, som ble fremstillet ved fortynning av den ved Verdens Helseorganisasjon (WHO) til disposisjon stående standard. Det avleste signal U i mV settes i forbindelse med verdien av denne kjennelinje. Det fremkom 300 enheter IgE/ml i det undersøkte

serum.

Med innretningen er det for første gang mulig, hurtig, enkelt og meget følsomt å bestemme IgE-proteininnholdet i serum inntil 150 E/ml. Med den radiale immundiffusjon var det hittil bare mulig å måle forhøyede IgE-konsentrasjoner over 800 E/ml.

Claims (4)

1. Fremgangsmåter til måling av antigen-antilegeme-reaksjoner hvor oppløsningen av antigenet som skal bestemmes^ blandes med det tilsvarende antilegeme, blandingen plasseres i strålegangen av en lyskilde og det fremadspredte lys måles med en fotodetektor, karakterisert ved at man gjennomstråler blandingen med laserlys og utelukkende måler det under liten romvinkel fremadspredte lys med fotodetektoren og deretter analyserer kvantitativt.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at blandingen rystes umiddelbart før gjennomstråling med laserlys.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det ikke spredte laserlys som passerer blandingen fjernes.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det ikke spredte laserlys som passerer blandingen reflek-teres i lyskilden.

5- Innretning til gjennomføring av fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert ved at én målekuvette er anordnet i den optiske akse av et målesystem, bestående av en laser^ minst to blendere, 'et linsesystem og en fotodetektor mellom blendene og linsesystemet og at målesystemet mellom målekuvette og linsesystem i den optiske akse har en lysfelle, hvis diameter ugjør 1,1- til 1,7 ganger laserstrålediameteren.