JPS5990053A - 抗原−抗体反応 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の対象はレーザー光を用いた抗原−抗体反応の測
定を行なうための装置である。

体液中のたんばく質の定量データは試験された生体の決
定的な特性の一つである。

と特異的な抗体とが化学量論的に沈殿を形成しながら反
応するという性質に基づ（・てし・る。この原理に基づ
いて一連の方法か開発されたが、そのうち１袈なものを
以下に感度の高くなる順に検出限界と共に記載する。

二重拡散　　　　　　４０μｆ／ｍｌ 沈殿分析　　　　１２．５〜２０μ２／−線状免疫拡散
　　　　　　　　１２．５μｆ／ａｔ放射状免疫拡散　
　　　　　　　１０μり／−綿状試験　　　　１．６〜
ろ、０μｆ／葱リング試験　　　　　　　０．２〜０．
４μｆ／ｍＡ補体結合反応り、ｌｌｒ／ｍｌ。

間接血球凝集反応　　　０．０２〜０．０４　ｔｄ／ｍ
ｅ血球凝集阻止試験　　　０．０　［］　６〜Ｏ，［３
１μｔ　／ｍｌｍｌラジオイムノアラ　　　　０．００
　［１０５〜１１．００５μｆｉｔここに記載、したこ
とかられかるように拡散法に対しては充分な感度を有し
ない。しかもこれらの方法はその／ジｆ要拡散８１間の
故に時間がかかる。血球凝集反応など高感夏試験システ
ムは比較的複雑であるが、一方、ラジオイムノアッセイ
は試薬および必要な測定装置が高価なため極めて費用が
かかる。

光散乱測定装置いわゆる比濁計（ｎｅｐｂｅｌ○■・ｅ
ｔ、ｅｒ）の使用によって迅速に完結し肉眼で読み取れ
る沈降反応の感度を篩めるという進歩をもたらした。

比濁法による濃度測定は特異的であり、迅速であり且つ
費用の点でも好ましい。その場合濁液の沈殿粒子から発
する散乱光が測定される。

まず、各種の既知濃度の溶液の散乱光強度を測定して検
量線を作成する。次に同じ実施条件下において未知溶液
の散乱光を測定する。

使用される測定装置は非干渉性光源、光学的スリット装
置、キュベツト（測定容器）および光検出器からなる。

これらの装置の場合、検出感度がしばしば充分でなく、
また測定Ｔ限での再現性に乏しいという欠点がある。

その上、これらの分析装置は極めて高価である。大皿の
試料を分析する大病院ではしばしば自動装置が用いられ
る。他の抗原の測定に切換える場合にはその装置を何回
も洗浄しで、清浄化する必要がある。従って多数の抗原
を測定するためにはいくつかの分析装置を並列的に用い
なければならない。

小病院、医療施設または研究所では取扱いに融通がきき
価格的に手頃な装置が心安である。

したがって、本発明の目的は測定感度およびその再現性
が著しく改良され、そして応用面で融通性のある装置を
見出すことにある。

本発明の対象は、測定すべき抗原を相当する抗体と混合
し２、その混合物を測定システムの光ビーム中に沁きそ
してこの混合物によって前方に散乱された元を光検出器
で測定することからなり、１１１記混合物中にレータ−
光を照射しそし゛〔小立体角で前方に散乱された光を前
記光検出器で測定し次いで定量的に分析することを特徴
とする抗原−抗体反応の測定方法である。

更にまた本発明は上記方法を実ｈｍするための装置に関
するものであって、キュベツトを、レーザー、少なくと
も２個のシャッター（隔板）、レンズシステムおよび光
検出器からなる測定システムの元軸中に、且つ前記シャ
ッターと前記レンズシステムとの間に配置し、そして前
記測定システムがキュベツトとレンズシステムとの間の
光軸に直径がレーザー光線ビーム直径の１．１倍ないし
１．７倍である光トラップを配したことを特徴とする。

光トラップとしては例えば、光吸収または光方向転換装
置、例えば反射鏡、プリズム、光伝導体などが理解され
る。

本装置の効率を改善するため、シャッタ一部分に基因す
る散乱光を遮断するための装置をレンズシステム内に配
置することができる。

前記光トラップが反射鏡の場合には、レーザ一端面に対
して、またはレーザーとキュベツトとの間に配置された
反射鏡に対して適当に調整することにより、散乱光の強
度を増幅することができる。

次に本発明を第１図により説明する。第１図は本装置の
構成を光線進路とともに図示したものである。

レーザー１、例えばＨｅ−Ｎｏレーザーのビーム１１内
にシ・ヤッター２および６を置く。そのシャッターの後
方でレーザー光は例えば深さ１０−５シャッター４１１
１Ｉ１１および高さ２０諭のキュベツト４に貫入する。

一方を閉じた小黒色管５（直径１、５　ｔｔｒｍ　）な
どは直進するレーザー光線に刻する光トラップとして作
用し、また前記キュベツトの直後に配置されるのが好ま
しい。前記キュベツトには０．１　ｙｒ、ｌの抗原、例
えば人血清およびその測定すべき抗原に対する抗体を含
有する０、　１−の抗血清を充てんする。その反応液中
に生ずる沈殿粒子かレーザー光を散乱する。小立体角を
もって前方に散乱された光はレンズシステム９により光
検出器７に集められる。前述のキュベツトを用いる場合
には、比較的大きい角度で散乱された光もキュベツトの
内壁で反射することによりなおレンズシステムに達する
。光検出器７例えばフォトダイオードの信７号は表示装
置８例えば記録器に送られる。小勲色シャッター６（そ
の直径はｔまぼレーザー光線直径である）をレンズシス
テム内で４本の細糸１０に固定する。これによりシャッ
ター２および３において生じた散乱光は遮断することが
できまた妨害原因を減らすことができる。

本方法の感度および再現性を示すために、抗原−抗体反
応としてアルブミン／抗アルブミン系を用いた。そのた
めに抗原としてアルブミン含有人血清を１：５２に希釈
した。抗体とＬ７てはうさぎの抗−ヒトアルブミン−血
清を２棟の希釈度（１：５または１：４０）で用いた、
試薬溶液を膜フイルタ−（孔直径は０．３μｍ以下が有
利である）によりｒ過しそして同調を前記容器に充てん
した。４５分後に容器を激しく振盪し、低濃度（すなわ
ち（１０”−２■／１００ｄ）においてすら生ずる沈殿
物を浮遊させた。その後キュベツトをレーザー光線中に
置きそして散乱光を測定した。抗体濃度が高くても低く
ても両対数図において直線関係が約１０４のアルブミン
濃度まで確認された。

第２図は抗原アルブミンとそれに対応するうさぎ抗血清
の抗原−抗体の三つの異なった反応特性曲線Ａ、Ｂおよ
びＣを示す。散乱光強度Ｕは約１０４まで両対数図にお
いて直線的にアルブミン濃度に依存する。

作図的に測定された関数の測定点の偏差は０．１ｒｑ／
　１　ｏ　ｏ　ｔｎｔ、を越えても約±５％にすぎなか
った。

１ｏ＋ｖ、、’１ｏｏ１ｎｌという比較的高ａ度の標準
人血清では、沈殿粒子が一部再溶解しそして散乱光信号
は減少する。これらの場合には相当する。抗原液の予備
希釈を行なうのがよい。

従来の散乱光測定では±１０％の正確度が得られ、その
際検出下限は最も好ましい場合でも約１０−１〜／１０
０ｓ＋ｊである。ガスレーザー例えば１ｍＷのＨｅ−Ｎ
ｅ−レーザーを用いて前方散乱光を測定することにより
、比濁法分析において感度を約１０ないし１００倍高め
ることができる。１０−２および１Ｏ−３ＷＩＩ／１０
０−へｏｌなイＬ、　０．０１μｆ　／ｍ／の抗原濃度
の定量的検出は注意深く沢過された液を用いた場合に可
能である。検蓋線の再現性は極めてよい。

本装置により抗原−抗体反応を計測することができるの
でこれまで通常行なわれているような標準物質による対
照測定および並行測定を行なう必要はないように思われ
る。

更にまた、光源の出力を約３倍に高めることにより、例
えば１　ｍＷレーザーを３ｍＷレーザーに置きかえるこ
とにより、そして光電受信機に対する散乱光の改善され
た集光により、例えはレンズシステム９として顕微鏡レ
ンズを用いることにより、本装置の感度を本質的に高め
ることができることを見出した。この高感度装置を用い
れば測定範囲限界を０．０１ないしｏ、ｏｏｉμｆ／ｒ
ｎｔの測定範題に高めることかでき、更に痕跡量程度の
抗原さえも測定することができる。

エチレングリコールの添加により抗原−抗体反応の時間
を短縮できることは知られているが。

これは本発明のレーサー散乱光測定にも用いることかで
きる。

更にまた、特に抗原濃度が高い場合には一部の沈殿粒子
が反応時間内にすでに沈降することも確認されている。

したがって反応混合物を反応終了後、激し〜く振盪する
必要１がある。、このようにして得られた測定値は一般
に、振盪しなかった反応混合物の値よりも再現性がよい
。

本Ｗａ明によれば、それに対する特異的抗血清を得るこ
とのできる液中のあらゆる抗原を測定することができる
。本方法の好ましい応用分野は体液、特に血漿の成分、
および抗原性微生物代謝産物または植物含有物質の成分
の定置的測定である。

前述の如く、配置を適当に変えることにより本方法を自
動化することができるが、これは例えば同様な方法で螢
光分光光度計を用いた比濁計において既に知られている
ことである。

次の実施例では血漿からの微量たんばく質の定１．測定
により本発明をより詳細に説明する。

実施例 ２ｒｄの患者血清を膜フイルタ−（孔直径０．０５μｍ
）を通して１遇する。等張食塩溶液により１：５に予希
釈された抗ＩｇＥ＝血清０．２　ｆｆ＋７！を本装置の
容器に入れそして０．２−〇ｆ遇された患者血清と混合
する。その容器を気密に閉鎖しそして室温で１６時間放
置する。次いでその容器を３回手早く振盪する。１０分
間靜買置後り容器をレーザー散乱光測定装置の光線行路
内に置く。第６図は１世界保健機構（ｗＨｏ）において
規定されている標準体の希釈により得られた免疫グロブ
リンＥ　（ＩｇＥ）−微量たんばく質の特性曲線を示す
。読み取られるｍＶ単位のＵはこの特性曲線の値に関連
づけられる。供試血清中には３００単位■ｇＥ／ｍｔが
証明される。

この装置によれば、血清中ＩｇＥ−たんばく買弁を迅速
に、簡単に且つ極めて高感皮に１５０Ｅ／ｍｅまで測定
することが可能であった。放射状免疫拡散法ではこれま
で、８００　Ｅ／−を越える高いＩｇ、Ｅ　−濃度を測
定するのが可能であったにすぎなかった。

以下に本発明により開示された新規な技術的１＃項を歎
約して示す。

１、　測定すべき抗原の溶液を相当する抗体と混合し、
その混合物を光源の光線進路に置きそして前方に散乱さ
れた光を光検出器で測定することからなり、前記混合物
をレーザー光を用いて照射しそして小立体角で前方に散
乱された元を前記光検出器で測定し７次いでその強度を
分析することにより定量的に抗原−抗体反応を測定する
方法。

２、　前記混合物をレーザー光で照射する直前に振盪す
ることを特徴とする、前記第１項の方法。

６、　前記混合物を貫通する散乱されないレーザー光を
消去することを特徴とする、前記第１項の方法。

４、　前記混合物を貫通する散乱されないレーザー光を
光源へ反射することを特徴とする、前記第１項の方法。

５、　測定容器を、レーザー、少なくとも２個のシャッ
ター、レンズシステムおよび光検出器からなる測定シス
テムの光軸中に、前記シャツターとＷｔ＋記レンズシス
テムとの間に配置ｔ１、そして前記測定システムが測定
容器とレンズシステムとの間の光軸に直径がレーザー光
線直径の１１倍ないし１．７倍である元トラップを配し
たことを特徴とする前記第１項の方法を実施するだめの
装飯。

【図面の簡単な説明】

第１図は本装置の構成を図示したものであり、光線進路
も示されている。 第２図および第３図は２釉類の実施例であり、散乱元信
号Ｕが濃度Ｃの関数として示されている。 １・・・レーザー、２．３・・・シャッター、１１・・
・光束、４・・・キュヘット、９・・・レンズシステム
、７・・・光検出器。 ＦＩＧ　　Ｉ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. キュベツトを、レーザー、少なくとも２個のシャッター
   、レンズシステムおよび光検出器からなる測定システム
   の元軸に、前記シャッターと１＋　記レンズシステムと
   の間に配飯し、そして前記測定システムがキュベツトと
   レンズシステムとの間の光軸に直径がレーザー光線直径
   の１．１倍ないし１．７倍である光トラップを配したこ
   とを特徴とする、抗原−抗体反応測定装置。