NO341211B1

NO341211B1 - In vitro fremgangsmåte for å fremme infeksjon i en virveldyrcelle med PRRSV og en fremgangsmåte for å måle tilbøyeligheten en testcellelinje har for å tillate PRRSV-infeksjon

Info

Publication number: NO341211B1
Application number: NO20065115A
Authority: NO
Inventors: Siao-Kun Wan Welch; Jay Gregory Calvert; Shelly Lynn Shields; David Ewell Slade
Original assignee: Zoetis Services Llc
Priority date: 2004-04-23
Filing date: 2006-11-06
Publication date: 2017-09-11
Also published as: US9102912B2; US20140141492A1; ES2570665T3; JP5600340B2; AR049033A1; TWI438278B; MXPA06012216A; AR084530A2; PL1742658T3; TWI354025B; JP2013078324A; TW200604343A; US8486685B2; NO20065115L; CA2564769C; UY28867A1; JP5273642B2; AU2009202410A1; US8058050B2; WO2005107796A2

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer in vitro fremgangsmåter for å fremme PRRS V-infeksjon i en virveldyrcelle og en fremgangsmåte for å måle tilbøyeligheten en testcellelinje har for å tillate PRRS V-infeksjon fra familien Arteriviridae.

Oppfinnelsens bakgrunn

Arteriviridae

Virus av familien Arteriviridae inkluderer arterittvirus fra hest (EAV), laktat dehydrogenaseforhøyende virus (LDV), og ape blødende febervirus (SHFV). Arteriviruset som har den største økonomiske viktighet er svinereproduserende og respiratorisk syndromvirus (PRRSV).

PRRSV

Svinereproduserende og respiratorisk syndrom (PRRS) er en av de økonomisk mest viktige svinesykdommer. Syndromet oppsto nesten samtidig i Nord-Amerika og i vest-Europa på slutten av 1980-årene, og har siden spredt seg til å bli endemisk hos de store, svineproduserende nasjonene i Europa, Asia og Amerika. Det etiologiske middelet til PRRS er et virus som har blitt betegnet PRRS-virus eller PRRSV. For både Europeisk og Nord-Amerikansk PRRS, kjennetegnes sykdommen ved svikt i reproduksjonssvikt hos avlspurker (sene aborter, dødfødsler og innskrumpninger), høy dødelighet blant smågris, og respiratorisk sykdom hos svin i alle aldre. Sykdommen har vært gjenstand for nyere gjennomgåelser (Mengeling og Lager, 2000; Murtaugh et al, 2002; Noedlijk, 2002; Plagemann, 2003).

Hos grisen er PRRSV-infeksjon begrenset til et subset av celler av monocytt/makrofag-linjen. Fullstendig differensierte svinealveolære makrofag (PAM) -celler er de primære målcellene for viral replikasjon (Duan et al., 1997a; Duan et al., 1997b). Immortalisering av PAM-celler er teknisk utfordrende, og når dette er vellykket, har det resultert i cellelinjer som ikke tillater PRRS-virusvekst (Weingartl et al, 2002). PRRS-virioner er spesifikt bundet av makrofager og internalisert i klatrinbelagte groper ved endocytose. Frigivelse fra endocytiske vesikler krever sur pH (Nauwynck et al, 1999). Bindingsstart av virioner formidles ved interaksjon av det virale matriksproteinet med heparinsulfatglykosaminoglykaner (Delputte et al, 2002). Internalisering kan utføres ved et 210 eller 220 kDa membranglykoprotein, ettersom inkubasjon av PAM-celler med monoklonale antistoffer til dette polypeptid blokkerer infeksjon med PRRS-virus

(Duan et al, 1998; Wissink et al, 2003). Glykoproteinet på 210 kDa er nylig identifisert som sialoadhesin, et medlem av siglec-familien av sialsyrebindende immunglobulinliknende lektiner (Pensaert et al, 2003). Transfeksjon av den ikke-permissive PK-15 (svinenyre) cellelinjen med svine-sialoadhesin meddeler evnen til å internalisere PRRSV-partikler, men det gjensto en tydelig blokkering ved beleggfjerningstrinnet da virioner ble tatt inn i cellulære vesikler, men ble ikke underkastet nukleokapsid desintegrasjon og vesikkelmembranfusjon. Virale gener ble ikke uttrykt, og de transfekterte PK-15-cellene ble ikke gjort mottakelige for PRRS-virus (Vanderheijden et al, 2003). Ifølge vår kunnskap er ikke transfeksjon med sialoadhesin vist å være tilstrekkelig til å omdanne noen ikke permissive PRRSV cellelinjer til en permissiv PRRSV fenotype.

Bortsett fra primære svineceller fra monocytt/makrofaglinjen, er den eneste andre celletype som er kjent å tillate vekst av PRRSV i cellekultur den immortaliserte apenyrecellelinjen MA-104 (Chladek et al, 1998), og derivater som MARC-145 (Kim et al, 1993) og CL-2621. Det er ikke kjent hvorfor denne ene spesielle cellelinjen er permissiv, da andre pattedyrcellelinjer er ikke-permissive. PRRS-virus binder spesifikt til en rekke forskjellige celletyper, men starter ikke infeksjon (Kreutz, 1998; Therrien et al, 2000). Internalisering av viruset i MARC-145 celler ved endocytose og påfølgende beleggfjerning i vesikler med lav pH, ser ut til å etterlikne liknende tilfeller i PAM-celler (Kreutz og Ackermann, 1996). En rekke monoklonale antistoffer som binder til svinesialoadhesin, mislykkes imidlertid med å påvise et homologt protein på MARC-145-cellenes overflate (Duan et al, 1998; Wissink et al, 2003), som antyder atMARC-145-celler kan anvende et avvikende medlem med den samme proteinfamilien, eller en annen reseptor sammen.

Nåværende PRRS V-vaksiner dyrkes på apecellelinjer, som er en risikabel og farlig aktivitet. Anvendelsen av apecellelinjer for vaksineproduksjon har muligheten for å introdusere betydelig primatvirus inn i svinelinjer som er ment for xenotransplantasjonsformål. Da svin i økende grad utforskes som en kilde for xenotransplanterte organer for mennesker, kan introduksjon av primatcellelinjer til svinepopulasjoner til slutt skape en risiko for mennesker som mottar xenotransplanterte organer. Det vil således være fornuftig å unngå anvendelse av apecellelinjer i vaksinepreparater fra svin. Det vil derfor være ønskelig å identifisere eller generere ikke-apeceller eller cellelinjer som er i stand til å støtte PRRSV-replikasjon. Mot dette mål er det vesentlig å identifisere genprodukter som kan være ansvarlige for å konferere tillatelse for PRRSV-replikasjon, slik det er sett i enkelte apecellelinjer, så vel som PAM-celler. Straks slike genprodukter er identifiserte, kan ikke-permissive celler gjøres permissive ved transfeksjon av det vesentlige genet inn i dem, som derved gir en utstrakt rekke av produksjonslinjer for en vaksine.

Ett laboratorium har rapportert at tetraspaninproteinet CD151 fra MARC-145-celler konfererer tillatelighet for PRRS-viruset når det transfekteres inn i ikke-permissive BHK-21-celler (Kapil og Shanmukhappa, 2003; Shanmukhappa og Kapil, 2001). Denne observasjonen er ennå ikke bekreftet av et uavhengig laboratorium.

Andre relevante publikaj soner er som beskriver beslektet teknikk er US 2003186236 Al;

Database Unipro (ONLINE) 10 JANUAR 2006 (2006.01.10), " Scavenger receptor cysteine-rich type 1 protein M130 precursor (CD163 antigen)(Contains: soluble CD163 (sCD163)). XP002453672 lastet fra EBI aksesjonsnummer UNIPROT:Q2VL90; Schaer DJ. et al. Molecular cloning and characterization of the mouse CD 163 homologue, a highly glucocorticoid-inducible member of the scavenger receptor cysteine-rich family. Immunogenetics. 2001, vol. 53, nr. 2, side 170-177;

WO 9835023 Al; og

Buechler C. et al. Regulation of scavenger receptor CD 163 expression in human monocytes and macrophages by pro- and antiinflammatory stimuli. J Leukoc Biol. 2000, vol. 67, nr. 1, side 97-103.

Vi beskriver her et polypeptid som ikke er relatert, som når det ble transfektert inn i ikke-permissive celler, konfererer tillatelighet for PRRS-viruset.

Siterte referanser

Chladek, D. W., Harris, L. L., og Gorcyca, D. E.

Method of growing and attenuating a viral agent associated with mystery swine disease. Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. 677,585[US 5,840,563], 1-24. 11-24-1998. USA. 7-9-1996.

Ref Type: Patent

Dea, S., Gagnon,C. A., Mardassi, H., Pirzadeh, B. og Rogan, D. (2000).

Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates [Review]. Arch. Virol. 145, 659-688.

Delputte,P. L., Vanderheijden, N., Nauwynck, H. J. og Pensaert, M. B. (2002). Involvement of the matrix protein in attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on porcine alveolar macrophages. J. Virol. 76, 4312-4320.

Duan, X., Nauwynck, H. J. og Pensaert, M. B. (1997a).

Effects of origin and state of differentiation and activation of monocytes/macrophages on their susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Arch. Virol. 142, 2483-2497.

Duan, X., Nauwynck, H. J. og Pensaert, M. B. (1997b).

Virus quantification and identification of cellular targets in the lungs and lymphoid tissues of pigs at different time intervals after inoculation with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Vet. Microbiol. 56, 9-19.

Duan, X. B., Nauwynck, H. J., Favoreel, H. W. og Pensaert, M. B. (1998). Identification of a putative receptor for porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcine alveolar macrophages. J. Virol. 72, 4520-4523.

Graversen, J. H., Madsen, M., og Moestrup, S. K. (2002).

CD 163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma.

[Review] [19 refs]. International Journal of Biochemistry & Cell Biology 34, 309-314. Gronlund J. Vitved L. Lausen M. Skjodt K. Holmskov U.

Cloning of a novel scavenger receptor cysteine-rich type I transmembrane molecule (Ml60) expressed by human macrophages. Journal of Jmmunology 165(11):6406-6415, 2000.

Kapil, S. og Shanmukhappa, K.

Host susceptibility factor(s) for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and uses in swine breeding, as a target for antiviral compounds, and development of a non-simian recombinant cell line for propagation of the virus. none. US 2003/0186236 Al, 1-45. 10-2-2003. USA. 1-28-2002.

Ref Type: Patent

Kim, H. S., Kwang, J., Yoon, I. J., Joo, H. S. og Frey, M. L. (1993).

Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogenous subpopulation of MA-104 cell line. Arch. Virol. 133, 477-483.

Kreutz, L. C. (1998).

Cellular membrane factors are the major determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus tropism. Virus Res. 53, 121-128.

Kreutz, L. C. og Ackermann,M. R. (1996).

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus enters cells through a low pH-dependent endocytic pathway. Virus Res. 42, 137-147.

Mengeling, W. L. og Lager, K. M. (2000).

A brief review of procedures and potential problems associated with the diagnosis of porcine reproductive and respiratory syndrome. Veterinary Research 31, 61-69.

Meulenberg, J. J. M. (2000).

PRRSV, the virus. Veterinary Research 31,11-21.

Murtaugh, M. P., Xiao, Z. G. og Zuckermann, F. (2002).

Immunological responses of swine to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection [Review]. Viral Immunology 15, 533-547.

Nauwynck, H. J., Duan, X., Favoreel, H. W., Van Oostveldt, P. og Pensaert, M. B.

(1999).

Entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages via receptor-mediated endocytosis. J. Gen. Virol. 80, 297-305.

Nodelijk, G. (2002).

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) with special reference to clinical aspects and diagnosis - A review [Review]. Vet. Quart. 24, 95-100.

Pensaert, M., Nauwynck, H. og Vanderheijden.

N. Nucleic acid encoding polypeptide involved in cellular entrance of the PRRS virus. Akzo Nobel N. V. og Universitet Gent. WO 03/010200 A2, 1-24. 2-6-2003. 7-18-2002. Ref Type: Patent

Philippidis, P., Mason, J. C, Evans, B. J., Nadra, I, Taylor, K. M., Haskard, D. O. og Landis,R.C. (2004).

Hemoglobin scavenger receptor CD 163 mediates interleukin-10 release and heme oxygenase-1 synthesis - Antiinflammatory monocyte-macrophage responses in vitro, in resolving skin blisters in vivo, and after cardiopulmonary bypass surgery. Circulation Research 94, 119-126.

Plagemann, P. G. W. (2003).

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: Origin hypothesis. Emerging Infectious Diseases 9, 903-908.

Ritter, M., Buechler, C, Langmann, T. og Schmitz, G. (1999).

Genomic organization and chromosomal localization of the human CD 163 (Ml 30) gene: a member of the scavenger receptor cysteine-rich superfamily. Biochemical & Biophysical Research Communications 260, 466-474.

Sanchez-Torres, C, Gomez-Puertas, P., Gomez-del-Moral, M., Alonso,F., Escribano, J.

M., Ezquerra, A. og Dominguez, J. (2003).

Expression of porcine CD 163 on monocytes/macrophages correlates with permissiveness to African swine fever infection. Arch. Virol. 148, 2307-2323.

Shanmukhappa, K. og Kapil, S. (2001).

Cloning and identification of MARC-145 cell proteins binding to 3'UTR and partial nucleoprotein gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Adv. Exp. Med. Biol. 494, 641-646.

Snijder, E. J. og Meulenberg, J. J. M. (2001).

Arteriviruses. In Fields Virology, D.M.Knipe, P.M.Howley, D.E.Griffin, M. A.Martin, R.A.Lamb, B.Roizman, and S.E.Straus, eds. (Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins), pp. 1205-1220.

Therrien, D., St Pierre, Y. ogDea, S. (2000).

Preliminary characterization of protein binding factor for porcine reproductive and respiratory syndrome virus on the surface of permissive and non-permissive cells. Arch. Virol. 145, 1099-1116.

Vanderheijden, N., Delputte, P. L., Favoreel, H. W., Vandekerckhove, J., Van Damme, J., van Woensel, P. A. og Nauwynck, H. J. (2003).

Involvement of sialoadhesin in entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages. J. Virol. 77, 8207-8215.

Weingartl, H. M., Sabara, M., Pasick, J., van Moorlehem, E. og Babiuk, L. (2002). Continuous porcine cell lines developed from alveolar macrophages - Partial characterization and virus susceptibility. J. Virol. Methods 104, 203-216.

Wissink, E. H. J., van Wijk, H. A. R., Pol, J. M. A., Godeke, G. J., van Rijn, P. A., Rottier, P. J. M. og Meulenberg, J. J. M. (2003).

Identification of porcine alveolar macrophage glycoproteins involved in infection of porcine respiratory and reproductive syndrome virus. Arch. Virol. 148, 177-187.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen inkluderer en in vitro fremgangsmåte for å fremme infeksjon i en virveldyrcelle med PRRSV, som omfatter trinnet av å styre økt ekspresjon av et CD 163-polypeptid i nevnte virveldyrcelle, der nevnte CD163-polypeptid omfatter et transmembrandoméne og der nevnte økte ekspresjon gjennomføres ved introduksjon av eksogen nukleinsyre.

Øket ekspresjon av et CD163-polypeptid oppnås ved fremgangsmåter som introduserer eksogene nukleinsyrer som koder CD163-polypeptider, slike fremgangsmåter inkluderer, men er ikke begrenset til transfeksjon, elektroporering og fusjon med en bærer av et polynukleotid omfattende et polynukleotid som koder et CD163-polypeptid.

Fremgangsmåten kan gjøre celler som ikke tidligere er permissive for PRRSV permissive for PRRS. Fremgangsmåten kan også inkludere det å gjøre én eller flere celler som tidligere ikke uttrykte et CD163-polypeptid om til celler som er induserte til å uttrykke et CD163-polypeptid.

Cellene er virveldyrceller eller pattedyrceller. Cellene eller cellelinjen kan være BHK-21-celler. Cellene kan være avledet fra svinenyreceller. Cellene eller cellelinjen kan være avledet fra kattenyreceller. Cellene eller cellelinjen kan være, men er ikke begrenset til BHK-21-, NLST-1-, NLFK-1-, Vero- eller RL-celler. PRRSV kan være den europeiske eller nordamerikanske genotypen.

Som bemerket ovenfor, kan økt ekspresjon av et CD163-polypeptid gjennomføres ved fremgangsmåter som inkluderer, men ikke er begrenset til transfeksjon, elektroporering og fusjon med en bærer av et polynukleotid omfattende et polynukleotid som koder er CD163-polypeptid. Ethvert CD163-polypeptid inneholdende et transmembranområde er vurdert. Eksempler på CD163-polypeptider er valgt fra gruppen bestående av polynukleotidene som er opplistet nedenfor der: ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som har minst 70 % 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % identitet med SEQ ID NO: 2; ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 2 med ikke mer enn 20 konservative aminosyresubstitusjoner; ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 2 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusjoner: ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid omfattende

SEQ ID NO: 2;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid med sekvensen som vist i

SEQ ID NO: 1;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid med minst 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 14;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 14 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 14 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid omfattende SEQ ID NO: 14;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid med sekvensen som vist i

SEQ JX> NO: 13;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 24 med ikke mer enn 2 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som omfatter SEQ ID NO: 24;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 23;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid med minst 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 27;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 27 med ikke mer enn 20 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 27 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid omfattende SEQ ID NO: 27;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 26;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid med minst 98 % eller 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 32;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 32 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 32 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid omfattende SEQ ID NO: 32;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 31;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid med minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 34;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 34 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 34 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid omfattende SEQ ID NO: 34;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 33;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid med minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 36;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 36 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 36 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid omfattende SEQ ID NO: 36;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 35;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid med minst 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 42;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 42 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 42 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid omfattende SEQ ID NO: 42;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 41;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid med minst 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 44;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 44 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 44 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid omfattende SEQ ID NO: 44;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 43;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid med minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 46;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 46 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 46 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid omfattende SEQ ID NO: 46;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 45;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid med minst 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 48;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 48 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 48 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusjoner;

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid omfattende SEQ ID NO: 48; og

ett slikt polynukleotid omfatter et polynukleotid med sekvensen presentert i SEQ ID NO: 47;

In vitro femgangsmåten for å forenkle infeksjon beskrevet ovenfor kan ytterligere omfatte trinnet å produsere en viruskultur.

Kulturen kan isoleres ved fremgangsmåten beskrevet ovenfor.

Enhver av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor kan ytterligere omfatte trinnet å produsere en PRRS- vaksine. Vaksinen kan være drept eller levende attenuert.

Det beskrives også en celle eller en cellelinje som kan være nyttige i in vitro fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen der evnen til én eller flere celler som skal infiseres med et PRRS-virus er modifisert vedstyrt økt ekspresjon av et CD163-polypeptid inneholdende et transmembrandomene i nevnte celler.

Cellen eller cellelinjen kan tidligere ha vært ikke-permissive for PRRSV, og gjøres permissive for PRRSV ved styrt økt ekspresjon av et CD 163-polypeptid i nevnte celle eller cellelinje.

Cellen eller cellelinjen inkluderer celler eller cellelinjer som ikke uttrykte et CD 163-polypeptid og er indusert til å uttrykke et CD 163-polypeptid.

Cellene er virveldyrceller eller og kan være pattedyrceller. Cellene kan være BHK-21-celler. Cellene kan være avledet fra svinenyreceller. Cellene eller cellelinjen kan være avledet fra kattenyreceller. Cellene kan være, men er ikke begrenset til BHK-21-, NLST-1-, NLFK-1-, Vero- eller RL-celler. PRRSV kan være europeiske eller nordamerikansk.

Oppfinnelsen inkluderer en fremgangsmåte for å måle tilbøyeligheten til en testcellelinje til å tillate infeksjon med et PRRS-virus omfattende: a) tilveiebringe en prøve inneholdende nukleinsyrer fra testcellelinjen; b) bestemme mengden polynukleotid som koder et CD163-polypeptid eller dets

komplement i nevnte prøve;

hvori en økt mengde polynukleotid som koder et CD 163-polypeptid i forhold til en kontrollprøve avledet fra en kontrollcellelinje kjent for ikke å støtte veksten av nevnte virus, antyder en tilbøyelighet av testcellelinjen til å støtte replikasjonen av nevnte virus.

Mengden polynukleotid som koder et CD 163-polypeptid kan bestemmes ved hybridisering.

Mengden polynukleotid som koder et CD 163-polypeptid kan bestemmes ved PCR.

Oppfinnelsen inkluderer også en fremgangsmåte for å måle tilbøyeligheten til en testcellelinje til å tillate infeksjon med et PRRS-virus omfattende: a) tilveiebringe en prøve inneholdende polypeptider fra testcellelinjen; b) bestemme mengden CD 163-polypeptid i nevnte prøve;

hvori en øket mengde CD163-polypeptid i forhold til en kontrollprøve avledet fra en

kontrollcellelinje kjent for ikke å støtte veksten av nevnte virus, antyder en tilbøyelighet av testcellelinjen til å støtte replikasjonen av nevnte virus.

Bestemmelsen kan utføres ved å bringe et CD 163-polypeptid i kontakt med et antistoff som er spesifikt for CD163-polypeptidet, under betingelser hvori antistoffet binder til CD 163 -polypeptidet.

Oppfinnelsen inkluderer en fremgangsmåte for å måle tilbøyeligheten hos gris for å bli infisert med et PRRS-virus omfattende: a) tilveiebringe en prøve inneholdende nukleinsyrer fra grisen som skal testes; b) bestemme mengden polynukleotid som koder et CD163-polypeptid eller dets

komplement i nevnte prøve;

hvori en øket mengde polynukleotid som koder et CD 163-polypeptid i forhold til en kontrollprøve avledet fra en gris kjent å være resistent mot nevnte virusinfeksjon, antyder en tilbøyelighet hos grisen som skal testes til å bli infisert av nevnte virus.

Bestemmelsen kan utføres ved hybridisering eller PCR.

Oppfinnelsen inkluderer også en fremgangsmåte for å måle tilbøyeligheten hos gris for å bli infisert med et PRRS-virus omfattende: a) tilveiebringe en prøve inneholdende polypeptider fra grisen som skal testes; b) bestemme mengden CD 163-polypeptid i nevnte prøve;

gris kjent å være resistent mot nevnte virusinfeksjon, antyder en tilbøyelighet hos grisen som skal testes til å bli infisert av nevnte virus.

Bestemmelsen kan utføres ved å bringe et CD 163-polypeptid i kontakt med et antistoff som er spesifikt for CD 163-polypeptidet, under betingelser hvori antistoffet binder til CD 163 -polypeptidet.

Det beskrives også et isolert polypeptid som er nyttig i in vitro fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, hvor polypeptidet er valgt fra gruppen bestående av polypeptidene som beskrives nedenfor: et isolert polypeptid som har minst 70 % 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % identitet med SEQ ID NO: 2;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 2 med ikke mer enn 20 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 2 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid omfattende SEQ ID NO: 2;

et isolert polypeptid med minst 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 14;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 14 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 14 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid omfattende SEQ ID NO: 14;

et isolert polypeptid som er ulikt SEQ ID NO: 24 med ikke mer enn 2 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid omfattende SEQ ID NO: 24.

et isolert polypeptid med minst 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 27;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 27 med ikke mer enn 20 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 27 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid omfattende SEQ ID NO: 27;

et isolert polypeptid med minst 98 %, 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 32;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ JD NO: 32 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 32 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som omfatter SEQ ID NO: 32;

et isolert polypeptid med minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 34;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 34 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 34 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som omfatter SEQ ID NO: 34.

et isolert polypeptid med minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 36;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 36 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som omfatter SEQ ID NO: 36.

et isolert polypeptid med minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 38;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 38 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusj oner

et polypeptid som er ulikt fra SEQ JD NO: 38 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusj oner

et polypeptid som omfatter SEQ JD NO: 40;

et isolert polypeptid med minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ JD NO: 40;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ JD NO: 40 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ JD NO: 40 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som omfatter SEQ JD NO: 40;

et isolert polypeptid med minst 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ JD NO: 42;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ JD NO: 42 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ JD NO: 42 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som omfatter SEQ JD NO: 42;

et isolert polypeptid med minst 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ JD NO: 44;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ JD NO: 44 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ JD NO: 44 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som omfatter SEQ JD NO: 44;

et isolert polypeptid med minst 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 46;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 46 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 46 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusjoner;

et polypeptid som omfatter SEQ ID NO: 46;

et isolert polypeptid med minst 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % identitet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 48;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 48 med ikke mer enn 15 konservative aminosyresubstitusj oner;

et polypeptid som er ulikt fra SEQ ID NO: 48 med ikke mer enn 10 konservative aminosyresubstitusjoner; og

et polynukleotid som koder et polypeptid omfattende SEQ ID NO: 48;

Det beskrives også et isolert CD 163-polynukleotid som er nyttig i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen hvor nevnte polynukleotid er valgt fra gruppen bestående av polynukleotidene spesifisert nedenfor:

et isolert polynukleotid omfattende:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 1 eller 5; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som har minst 70 % 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid vist i SEQ ID NO: 2; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID NO: 2; (d) et polynukleotid som er komplementet til en hvilken som helst av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid omfattende:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 12 eller 13; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som har minst 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid vist i SEQ ID NO: 14; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID NO: 14; (d) et polynukleotid som er komplementet til en hvilken som helst av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid omfattende:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 22 eller 23; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID NO: 24; (c) et polynukleotid som er komplementet til en hvilken som helst av (a) eller (b);

et isolert polynukleotid omfattende:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 25 eller 26; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som har minst 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid vist i SEQ ID NO: 27; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID NO: 27; (d) et polynukleotid som er komplementet til en hvilken som helst av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid omfattende:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 30 eller 31; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som har minst 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid vist i SEQ ID NO: 32; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID NO: 32; (d) et polynukleotid som er komplementet til en hvilken som helst av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid omfattende:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 33; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som har minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid vist i SEQ ID NO: 34; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID NO: 34; (d) et polynukleotid som er komplementet til hvilken som helst av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid omfattende:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 35; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som har minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid vist i SEQ ID NO: 36; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID NO: 36; (d) et polynukleotid som er komplementet til hvilken som helst av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid omfattende:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 37; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som har minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid vist i SEQ ID NO: 38; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID NO: 38; (d) et polynukleotid som er komplementet til hvilken som helst av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid omfattende:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 39; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som har minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid vist i SEQ ID NO: 40; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID NO: 40; (d) et polynukleotid som er komplementet til hvilken som helst av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid omfattende:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 41; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som har minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid vist i SEQ ID NO: 42; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID NO: 42; (d) et polynukleotid som er komplementet til hvilken som helst av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid omfattende:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 43; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som har minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid vist i SEQ ID NO: 44; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID NO: 44; (d) et polynukleotid som er komplementet til hvilken som helst av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid omfattende:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 45; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som har minst 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid vist i SEQ ID NO: 46; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID NO: 46; (d) et polynukleotid som er komplementet til hvilken som helst av (a), (b) eller (c); og

et isolert polynukleotid omfattende:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 47; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som har minst 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid vist i SEQ ID NO: 48; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID NO: 49; (d) et polynukleotid som er komplementet til hvilken som helst av (a), (b) eller (c);

I tillegg til det foregående inkluderer oppfinnelsen, som et ytterligere aspekt, alle oppfinnelsens utførelsesformer i et mer begrense omfang enn variasjonene som spesifikt er nevnt ovenfor.

Kort beskrivelse av sekvenslistene

SEQ ID NO: 1 -cDNA-sekvens som koder svine susCD163vl

SEQ ID NO: 2 -antatt aminosyresekvens av svine susCD163vl

SEQ ID NO: 3 -cDNA-sekvens, Genbank adgangsnr. AJ311716

SEQ ID NO: 4 -antatt aminosyresekvens utledet fra Genbank adgangsnr. AJ311716 SEQ ID NO: 5 -cDNA-sekvens av susCD163vl, inneholdende flankerende (ikke-kodende) sekvens.

SEQ ID NO: 6-11 -primersekvenser

SEQ ID NO: 12 -cDNA-sekvens som koder svine susCD163v2 inneholdende

flankerende (ikke-kodende) sekvens.

SEQ ID NO: 13 -cDNA-sekvens som koder svine susCDl63v2

SEQ ID NO: 14 -antatt aminosyresekvens av svine susCD163v2

SEQ ID NO: 15-16 -primersekvenser

SEQ ID NO: 17 -cDNA-sekvens som koder humant CD163v2, inneholdende

flankerende (ikke-kodende) sekvens.

SEQ ID NO: 18 -cDNA-sekvens som koder humant CD 163v2

SEQ ID NO: 19 -antatt aminosyresekvens av humant CD163v2

SEQ ID NO: 20-21 -primersekvenser

SEQ ID NO: 22 -cDNA-sekvens som koder murint CD163v2, inneholdende

flankerende (ikke-kodende) sekvens.

SEQ ID NO: 23 -cDNA-sekvens som koder murint CD 163v2

SEQ ID NO: 24 -antatt aminosyresekvens av murint CD163v2

SEQ ID NO: 25 -cDNA-sekvens som koder murint CD163v3, inneholdende flankerende (ikke-kodende) sekvens.

SEQ ID NO: 26 -cDNA-sekvens som koder murint CD 163v3

SEQ ID NO: 27 -antatt aminosyresekvens av murint CD163v3

SEQ ID NO: 28-29 -primersekvenser

SEQ ID NO: 30 -cDNA-sekvens som koder MARC-145 CD 163v3, inneholdende

flankerende (ikke-kodende) sekvens.

SEQ ID NO: 31 -cDNA-sekvens som koder MARC-145 CD 163v3

SEQ ID NO: 32 -antatt aminosyresekvens av MARC-145 CD 163v3

SEQ ID NO: 33 -cDNA-sekvens som koder Vero-celle CD163v2 transkript SEQ ID NO: 34 -antatt aminosyresekvens av Vero-celle CD163v2

SEQ ID NO: 35 -cDNA-sekvens som koder Vero-celle CD163v3 transkript SEQ ID NO: 36 -antatt aminosyresekvens av Vero-celle CD163v3

SEQ ID NO: 37 -cDNA-sekvens som koder Vero-celle CD163v4 transkript SEQ ID NO: 38 -antatt aminosyresekvens av Vero-celle CD163v4

SEQ ID NO: 39 -cDNA-sekvens som koder Vero-celle CD163v5 transkript SEQ ID NO: 40 -antatt aminosyresekvens av Vero-celle CD163v5

SEQ ID NO: 41 -cDNA-sekvens som koder Vero-celle CD163v6 transkript SEQ ID NO: 42 -antatt aminosyresekvens av Vero-celle CD163v6

SEQ ID NO: 43 -cDNA-sekvens som koder Vero-celle CD163v7 transkript SEQ ID NO: 44 -antatt aminosyresekvens av Vero-celle CD163v7

SEQ ID NO: 45 -cDNA-sekvens som koder hund CD 163v2 transkript

SEQ ID NO: 46 -antatt aminosyresekvens av hund CD163v2

SEQ ID NO: 47 -cDNA-sekvens som koder hund CD 163v3 transkript

SEQ ID NO: 48 -antatt aminosyresekvens av hund CD163v3

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 Skj ematisk sammenlikning av susCD 163v 1 med AJ311716

Figur 2 Aminosyresekvensoppstilling av susCD163vl (SEQ ID NO: 2) med AJ311716(SEQIDNO: 4)

Figur 3 Nukleotid sekvensoppstilling av susCD163vl med AJ311716

Figur 4 Generering av DNA-fragmenter og ligering for plassering av CD 163 direkte bak RSV-promoteren. Plasmider ble fordøyd med enten DrdSL eller Drdl, fulgt av en avrundingsreaksjon med Klenow-enzym. Etter opprensking ble plasmidene fordøyd med Noti. Gel rensing ga DNA-fragmenter som så ble ligert ved anvendelse av den kohesive iVbfl-enden. Promotere fra RSV (pRSV) og SV40 (pSV40) er vist med piler.

Figur 5 Kart av pCDNA3.1 retningsbestemt V5/His/TOPO kloningsvektor

Figur 6 Tre BHK/CMV/vl cellelinjer, nr. 3, nr. 5 og nr. 12 og en ikke-permissive BHK-cellelinje ble infisert med PRRSV isolat P129, og farget med SDOW17-FITC. Panel A viser en ikke-permissiv BHK21 celleklon. Panel B viser BHK/CMV/vl klon nr. 3. Panel C viser BHK/CMV/vl klon nr. 5. Panel D viser BHK/CMV/vl klon nr. 12. Figur 7 Tre BHK/RSV/vl cellelinjer, nr. 2, nr. 3 og nr. 4 ble infisert med PRRSV isolat P129 og farget med SDOW17-FITC. Panel A viser BHK/RSV/vl klon nr. 2. Panel B viser BHK/RSV/vl klon nr. 3. Panel C viser BHK/RSV/vl klon nr. 4. Figur 8 Kattenyrecellelinjer stabilt uttrykkende svine CD163vl, som viser PRRSV-plakk. Cellelinjer NLFK-CMV-susCD163vl-G4F og NLFK-CMV-susCD163vl-G4L, begge ved passasje 4, ble infisert med Pl29 isolat av nordamerikansk PRRSV og inkubert i 6 dager. Monolag ble fiksert med 80 % aceton og farget med monoklonalt antistoff SDOW17-FITC. Fasekontrastmikroskopi (høyre) viser lokaliserte områder av viralt CPE (plakk), mens FA-påvisning (venstre) viser samtidig lokalisert viralt nukleokapsidantigen. Figur 9 Fire FK/RSV/vl cellelinjer, nr. 1, nr. 2, nr. 3 og nr. 4 ble infisert med PRRSV isolat Pl29 og farget med monoklonalt antistoff SDOW17-FITC. Panel A viser FK/RSVvl nr. 1 celleklon. Panel B viser FK/RSV/vl klon nr. 2. Panel C viser FK/RSV/vl klon nr. 3. Panel D viser FK/RSV/vl nr. 4. Figur 10 PK-CMV-susCD163vl-A10 celler ved passasje 19, infisert med PRRSV isolat Pl29. Venstre: Monolaget ble fiksert med 80 % aceton og farget med FITC-konjugert monoklonalt antistoff SDOW17 (Rural Technologies Inc), som er spesifikt for PRRSV nukleokapsid. Høyre: Den samme brønnen under lyst felt, viser celledistribusjon. Figur 11 BHK-CMVScript-susCD163v2-A9 ved passasje 17 infisert med PRRSV isolat Pl29. Monolaget ble fiksert med 80 % aceton og farget med FITC-konjugert monoklonalt antistoff SDOW17 (Rural Technologies Inc), som er spesifikt for PRRSV nukleokapsid. Figur 12 Tre representative eksempler på BHK/RSV/v2 cellelinjene. Cellene ble infisert med PRRSV isolat P129 og så farget med SDOW17-FITC. Panel A viser cellelinje BHK/RSV/v2 nr. 1, panel B viser cellelinje BHK/RSV/v2 nr. 34, og panel C viser cellelinje BHK/RSV/v2 nr. 47. Figur 13 FK-cDNA3.1D-humCD163v2-A6 ved passasje 15 infisert med PRRSV isolat Pl29. Monolaget ble så fiksert med 80 % aceton og farget med FITC-konjugert monoklonalt antistoff SDOW17 (Rural Technologies Inc), som er spesifikt for PRRSV nukleokapsid. Figur 14 Mengden avkom av PRRSV produsert ved fire rekombinante cellelinjer, som stabilt uttrykte susCD163vl, og i MARC-145 celler, ble fastsatt i et vekstkurveeksperiment ved anvendelse av NVSL 94-3 isolatet av PRRSV. Prøver som ble høstet med 12-timers intervaller ble titrert på MARC-145 cellemonolag. Figur 15 Flowcytometrianalyse av PRRSV-infeksjon i nærvær av CD163 spesifikt antistoff. BHK-21 celler uttrykkende MARC-145 CD 163 fra transient transfeksjon, ble inkubert med enten CD 163 spesifikt antistoff eller normalt geite-IgG (NGS), og infisert med GFP-uttrykkende PRRSV. Hvert datapunkt representerer resultatene i triplikatbrønner. Figur 16 Flowcytometrianalyse av PRRSV infeksjon i nærvær av CD 163 spesifikt antistoff. NLFK-celler som stabilt uttrykte humant CD 163, ble inkubert med enten CD 163 spesifikt antistoff eller normalt geite-IgG (NGS), og infisert med et GFP-uttrykkende PRRSV. 24 timer etter infeksjon ble den prosentvise del av GFP-uttrykkende, infiserte celler bestemt. Hvert datapunkt representerer resultatet fra en enkelt cellebrønn. Figur 17 Grafisk avbildning av seks alternative spleisevarianter av CD 163 mRNA, gjenvunnet fra Vero-celler. De seks variantene er ulike i nærvær eller fravær av tre eksoner, betegnet E6, El05 og E83. Eksonene E6 og El05 har lengder som er flere av tre, og resulterer derfor ikke i endringer i leserammen når de er fraværende. I kontrast resulterer fraværet av E83 i en endret leseramme, og i en alternativ aminosyresekvens ved proteinets karboksyende (vist ved skravert mønster i figuren). Det hydrofobe, transmembrane (TM) området er kodet i El05. Figur 18 PK-RSVScript-susCD163v2 nr. 9 celler infisert med PRRSV isolat P129. Ufortynnet supernatant fra PRRSV isolat P201 infiserte PAM'er ble anvendt for å infisere PK-RSVScript-susCD163v2 nr. 9 celler. Etter to dagers inkubasjon ble cellene fiksert og farget med monoklonalt antistoff SDOW17, som beskrevet i eksempel 11. Figur 19 FK-RSVScript-susCD163v2 nr. 51 celler infisert med PRRSV isolat Pl29. Ufortynnet supernatant fra PRRSV isolat P201 infiserte PAM'er ble anvendt for å infisere FK-RSVScript-susCD163v2 nr. 51 celler. To dager etter infeksjon ble cellene fiksert i aceton, og farget med monoklonalt antistoff SDOW17, som beskrevet i eksempel 11. Figur 20 Infeksjon i PK-RSVScript-susCD163v2 klon nr. 9 celler med PRRSV isolat P201. Panel A viser et monolag av celler infisert med PRRSV P201 ved passasje 1, 24 timer etter infeksjon. Panel B viser et monolag av celler to dager etter infeksjon med cellefri supernatant PRRSV P201 ved passasje 10. Figur 21 NLFK moderceller og én subklon av FK-cDNA3.1D-humCD163v2-A6, ble undersøkt for CD 163 ekspresjonen. Celler ble fiksert i 80 % aceton, og så reagert med geit antihumant CD163 (R&D System ved 1:200) i én time, fulgt av vasking med PBS. For visualisering ble det anvendt esel anti-geite-IgG konjugert med FITC (Biodesign Inc ved 1:100). Ingen spesifikk fluorescens ble påvist i NLFK modercellene, som vist i figur 21 A. Hovedandelen av FK.A6.A2 subklonen viste god fluorescensfarging, som viser nærvær av CD 163 (figur 2IB).

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Generelle definisjoner

Celler og cellelinjer kan enten være "virus-permissive" eller "virus ikke-permissive". En celle eller cellelinje som er virus permissive er i stand til å tillate virusinfeksjon, påfølgende replikasjon og virusproduksjon. En celle eller cellelinje som er virus ikke-permissive, er ikke i stand til å tillate virusinfeksjon, påfølgende replikasjon og virusproduksjon. En cellelinje som allerede er noe permissive kan gjøres mer permissive ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen.

Arteriviridae refererer til en familie av innhyllete, positivtrådet RNA-virus som tilhører Mcfov/ra/es-klassen. Familien inkluderer laktatdehydrogenase-forhøyende virus (LDV) fra mus, heste arterittvirus (EAV), ape blødende febervirus (SHFV) og PRRSV. Betegnelsen "PRRSV"- eller "PRRS"-virus viser til både europeiske og nordamerikanske PRRS-virusgenotyper. Innenfor hver genotype deler vanligvis isolater nukleotididentitet med 85 % eller mer. Mellom genotyper er imidlertid nivået av sekvensidentitet bare omkring 60 %.

PRRS-viruset er medlem av familien Arteriviridae. Genomet av arteriviruset er enkeltrådet RNA av positiv polaritet mellom 12 og 16 kb i lengde, kappet ved den 5' ende, og polyadenylert ved den 3'-enden. Mer enn 2/3 deler av genomet er dedikert til åpne leserammer (ORF) la og lb, som koder de ustrukturelle virusfunksjonene. ORFlb er en forlengelse av ORF la, og er resultat av en ribosomal leserammeendring. ORF la og - lb translateres dirkete fra det genomiske RNA. Disse store polypeptidproduktene spaltes ved virale proteaser for å gi 12 eller 13 atskilt mindre peptider. De gjenværende ORF'er som koder viralt strukturelle proteiner uttrykkes fra en serie av 3'-ko-terminale subgenomiske RNA'er (sgRNA'er).

sgRNA'ene produseres ved avbrutt transkripsjon av negativ-trådet RNA, slik at en felles 5-ledersekvens fusjoneres til hvert transkript. De viktigste strukturelle proteiner er nukleokapsidet (N, kodes av ORF7), matriseproteinet (M, kodes av ORF6), og det viktigste hylster-glykoproteinet (GP5, kodes av ORF5). De gjenværende proteinene, GP4 (ORF4), GP3 (ORF3), GP2 (ORF2a) og E (ORF2b) er mindre strukturelle komponenter av virionet, der disses funksjoner ennå ikke er klarlagte. Den molekylære biologien av PRRSV har vært emne for nylig gjennomgående artikler (Dea et al., 2000; Meulenberg, 2000; Snijder og Meulenberg, 2001).

Betegnelsen "CD 163-polypeptid" slik den anvendes her, betyr et proteinsom kodes av et pattedyr CD 163-gen, som inkluderer alleliske varianter som inneholder konservative eller ikke-konservative endringer. En cDNA-sekvens som koder et svine CD 163-polypeptid er rapportert (GenBank adgangsnr. AJ311716). Et murint CD163-polypeptid er også rapportert (GenBank adgangsnr AF274883), så vel som flere humanvarianter, eksemplifisert ved GenBank adgangsnr AAH51281 og CAA80543. Her rapporteres polynukleotider som koder svine-, humane-, murine-, hunde- og afrikansk grønnape-CD163-polypeptider, og som omfatter sekvensene vist i SEQ ID NO: 1, 5, 12, 13, 17, 18, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 42, 43, 45 og 47. Et "CD 163-polypeptid" er et medlem av den utdrivende reseptor cysteinrike (SRCR)-familien av transmembrane glykoproteiner, og er ment å bare uttrykkes på monocytter og makrofager. Én identifisert rolle av CD 163 er å inhibere oksiderende vevsskader etter hemolyse ved å konsumere hemoglobin:haptoglobin-komplekser ved endocytose. Den påfølgende frigjøringen av interleukin-10 og syntese av heme oksygensase-1 resulterer i antiinflammatoriske og cytobeskyttende virkninger (Philippidis et al, 2004; Graversen et al, 2002). Det humane CD163-genet spenner over 35 kb på kromosom 12, og består av 17 exoner og 16 introner. Et antall isoformer av CD 163-polypeptidet, som inkluderer membranbundne, cytoplasmiske og utskilte arter, er kjent for å genereres ved alternativ spleising (Ritter et al, 1999). Isoformer omfattende et transmembrandoméne er spesielt foretrukket.

Et transmembrandoméne karakteriseres ved et polypeptidsegment av en større sekvens som eksponeres på begge sider av en membran. De cytoplasmiske og ekstracellulære doméner separeres med minst ett membranspennende segment som krysser den hydrofobe omgivelsen av det dobbelte lipidlaget. Det membranspenndende segmentet består av aminosyrerester med upolare sidekjeder, vanligvis i form av en a-heliks. Segmenter inneholdende omkring 20-30 hydrofobe rester er lange nok til å spenne over en membran som en a-heliks, og de kan ofte identifiseres med et hydropatiplott. Det antatte transmembrandoménet i SEQ ID NO: 2 og 14 er vist ved utheving i spesifikasjonen. For å fastslå hvorvidt andre CD 163-sekvenser inneholder et liknende sekvenssærtrekk, bestemmes enkelt ved å inspisere sekvensen eller hydropatiplott. SEQ ID NO: 37-40 er representative av ulike CD 163-proteiner som ikke inneholder et transmembrandoméne og deres kodende nukleinsyrer.

Betegnelsen "polynukleotid" slik den anvendes heretter, refererer generelt til ethvert polyribonukleotid eller polydeoksyribonukleotid, som kan være umodifisert eller modifisert RNA eller DNA. "Polynukleotider" inkluderer uten begrensning, enkel- og dobbeltrådet DNA, DNA som er en blanding av enkel- og dobbeltrådete områder, enkel-og dobbeltrådet RNA, RNA som er en blanding av enkel- og dobbeltrådete områder, og hybridmolekyler omfattende DNA og RNA som kan være enkel- eller mer typisk, dobbeltrådet eller blanding av enkel- og dobbeltrådete områder. "Polynukleotid" refererer også til trippeltrådete områder omfattende RNA eller DNA, eller både RNA og DNA. Betegnelsen "polynukleotid" inkluderer også DNA eller RNA inneholdende én eller flere modifiserte baser og DNA eller RNA med modifiserte ryggrader for stabilitet, eller for andre grunner. "Modifiserte" baser inkluderer for eksempel tritylerte baser og uvanlige baser som inosin. Mange modifiseringer kan gjøres med DNA og RNA; og således omslutter "polynukleotid" kjemiske, enzymatiske eller metabolsk modifiserte former av polynukleotider som vanligvis finnes naturlig, så vel som de kjemiske former av DNA- og RNA-karakteristikk av virus og celler. "Polynukleotid" omslutter også relativt korte polynukleotider, som ofte refereres til som oligonukleotider.

Uttrykket "polypeptid" slik det anvendes heretter refererer til ethvert peptid eller protein som omfatter aminosyrer sammenføyd til hverandre med peptidbindinger eller modifiserte peptidbindinger. "Polypeptid" refererer til begge korte kjeder, vanligvis referert til som peptider, oligopeptider eller oligomerer, og til lengre kjeder som vanligvis refereres til som proteiner. Polypeptider kan inneholde andre aminosyrer enn de 20 genkodete aminosyrene. "Polypeptider" inkluderer aminosyresekvenser modifisert med enten naturlige prosesser, slik som posttranslasjonell prosessering, eller med kjemiske teknikker for modifisering, som er velkjent i fagfeltet. Slike modifikasjoner er godt beskrevet i grunntekster og i mer detaljerte monografier, så vel som i omfattende forskningslitteratur. Modifikasjoner kan forekomme hvor som helst i et polypeptid, inkludert peptidryggraden, aminosyresidekj edene og amino- eller karboksylendene. Det vil forstås at den samme type modifisering kan være til stede i den samme eller i varierende grad ved flere seter i et gitt polypeptid. Et gitt polypeptid kan også inneholde mange typer modifikasjoner. Polypeptider kan være forgrenete som et resultat av allestedsnærværende, og de kan være sykliske, med eller uten forgrening. Sykliske, forgrenete og forgrenet sykliske polypeptider kan resultere fra posttranslasjonsnaturlige prosesser, eller kan gjøres ved syntetiske fremgangsmåter. Modifikasjoner eller modifiserte former inkluderer acetylering, acylering, ADP-ribosylering, amidering, kovalent festing av flavin, kovalent festing av en hemehalvdel, kovalent festing av et nukleotid eller nukleotidderivat, kovalent festing av et lipid eller lipidderivat, kovalent festing av fosfotidylinositol, krysskobling, syklisering, dannelse av disulfidbinding, demetylering, dannelse av kovalente kryssbindinger, dannelse av cystein, dannelse av pyroglutamat, formylering, y-karboksylering, glykosylering, GPI ankerdannelse, hydroksylering, jodinering, metylering, myristoylering, oksidasjon, proteolytisk prosessering, fosforyleringsprenylasjon, rasemisering, selenoylering, sulfatering, transfer-RNA formidlet tilføying av aminosyrer til proteiner, slik som arginylering, og ubikitinering (se for eksempel Proteins-Structure and Molecular Properties, 2. utg.,

T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, s. 1-12 in Postranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al, "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182:626-646 og Rattan et al, "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sei (1992) 663:4842).

Slik betegnelsen anvendes heretter, betyr "isolert" endret ved menneskets hånd fra den naturlige tilstanden. Om en "isolert" sammensetning eller substans forekommer naturlig, har den blitt endret eller fjernet fra dens opprinnelige omgivelse eller begge deler. Et polynukleotid eller polypeptid som naturlig er til stede i levende dyr er for eksempel ikke "isolert", men det samme polynukleotid eller polypeptid separert fra de sameksisterende materialer fra sin naturlige tilstand er "isolert", slik betegnelsen anvendes heri. "Isolert" slik betegnelsen anvendes her og forstås i fagfeltet, hvorvidt det refereres til "isolert" polynukleotid eller polypeptid, betyr at det er separert fra sitt opprinnelige cellulære miljø der polypeptidet eller nukleinsyren normalt finnes. Slik det anvendes her, som et eksempel, anvendes uttrykket "isolert" nukleinsyre om et transgent dyr eller en rekombinant cellelinje konstruert med et polynukleotid beskrevet heri. Spesielt ekskludert fra definisjonen av isolerte polynukleotider ifølge oppfinnelsen er fullstendig isolerte kromosomer fra naturlige vertsceller, hvor polynukleotidet opprinnelig var avledet fra.

I den påfølgende beskrivelsen vil betegnelsen "identitet" eller likhet ofte anvendes for polypeptidenes aminosyresekvenser. Prosent aminosyresekvens "identitet", med hensyn til polypeptider, defineres heri som den prosentvise del av aminosyrerester i kandidatsekvensen som er identisk med restene i målsekvensene etter oppstilling av begge sekvensene, og introduksjon av åpninger om nødvendig, for å oppnå den maksimale prosentandel av sekvensidentitet, og hvor ikke konservative substitusjoner betraktes som del av sekvensidentiteten. Prosent sekvensidentitet fastslås ved konvensjonelle fremgangsmåter. For eksempel BLAST 2.2.6 [Tatusova TA and TL Madden, "BLAST 2 sequences- a new tool for comparing protein and nucleotide sequences". (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250.]

I korthet, som bemerket ovenfor, er to aminosyresekvenser oppstilt for optimalisering av poeng ved anvendelse av en kostnad for dannelse av åpning på 10, en kostnad for forlengelse av åpning på 0,1, og "blosum62" poengmatrisen til Henikoff og Henikoff (Proe. Nat. Acad. Sei., USA 89:10915-10919. 1992).

Prosentandelen identitet beregnes deretter som:

Totalt antall identiske treff x 100

(lengde av den lengste sekvensen + antall åpninger

introdusert i den lengste sekvensen for oppstilling

av de to sekvensene)

Prosent sekvens "likhet" (ofte referert til som homologi) med hensyn til et polypeptid beskrevet heri, er definert heri som den prosentvise del av aminosyrerester i kandidatsekvensen som er identisk med restene i målsekvensene etter oppstilling av sekvensene og introduksjon av åpninger om nødvendig, for å oppnå den maksimale prosentandel sekvensidentitet (som beskrevet ovenfor), og også vurdering av enhver konservativ substitusjon som en del av sekvensidentiteten.

Totalt antall identiske treff og konservative substitusjoner x 100

(lengde av den lengste sekvensen + antall åpninger

introdusert i den lengste sekvensen for oppstilling

av de to sekvensene)

Aminosyrer kan klassifiseres i henhold til fysiske egenskaper og bidrag til sekundær og tertiær proteinstruktur. En konservativ substitusjon gjenkjennes i fagfeltet som en substitusjon av en aminosyre med en annen aminosyre med liknende egenskaper.

Eksempler på konservative substitusjoner vises i tabell 1, 2 og 3 nedenfor.

Alternativt kan konservative aminosyrer grupperes som beskrevet i Lehninger, (Biochemistry, 2. utg.; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), s. 71-77), som vist i tabell 2 nedenfor.

Som et ytterligere alternativ, er eksempler på konservative substitusjoner vist i tabell 3 nedenfor.

Fremgangsmåter rettet mot produksjon av virus og vertsceller

Oppfinnelsen tilveiebringer en in vitro fremgangsmåte for å modifisere produksjon av et PRRS- virus i en vertebratcelle omfattende trinnet å målrette nevnte celle til å uttrykke et CD 163-polypeptid som har en transmembrant område. Dette kan inkludere å gjøre en celle som er ikke-permissiv for viruset om til en celle som er permissiv for viruset, eller kan involvere å gjøre en celle mer permissivfor viruset.

En fremgangsmåte for å fremstille en PRRS-viruskultur, omfatter trinnene av:

Å tilveiebringe en cellelinje; styre nevnte cellelinje til å uttrykke et CD 163-polypeptid; infisere nevnte cellelinje med virus; og medføreat nevnte cellelinje produserer virale avkom.

Alle de ovenfor nevnte fremgangsmåter anvender celler og cellelinjer som uttrykker et CD 163-polypeptid. CD 163 kan forenkles eller økes ved in vitro fremgangsmåter som involverer introduksjon av eksogen nukleinsyre i cellen. En slik celle kan omfatte polynukleotid eller vektor på en måte som tillater ekspresjon av et kodet CD163-polypeptid.

Polynukleotider som koder CD 163 kan introduseres i vertscellen som en del av et sirkulært plasmid, eller som et lineært DNA, omfattende et isolert proteinkodende område, eller i en virusvektor. Fremgangsmåter for å introdusere eksogen nukleinsyre i vertscellen er velkjent og praktiseres rutinemessig i fagfeltet, inkludert transformasjon, transfeksjon, elektroporering, nukleær injeksjon, eller fusjon med bærere, slik som liposomer, miceller, skyggeceller og protoplaster. Vertscellesystemer ifølge oppfinnelsen virveldyrcellesystemer . Verter kan inkludere det følgende, men er ikke begrenset til:, svinenyre-(PK) celler, kattenyre- (FK) celler, svinetestikkel- (ST) celler, afrikansk grønnape nyreceller (MA-104, MARC-145, VERO- og COS-celler), kinahamsterovarie (CHO) celler, babyhamster nyreceller, humane 293-celler og murine 3 T3 -fibroblastceller.

Valg av en egnet ekspresjonsvektor for ekspresjon av CD 163-polypeptider vil selvsagt avhenge av den spesifikke vertscellen som skal anvendes, og er innenfor fagområdet til den ordinære fagpersonen. Eksempler på egnete ekspresjonsvektorer inkluderer pSport og pcDNA3 (Invitrogen), pCMV-Script (Stratagene), og pSVL (Pharmacia Biotech). Ekspresjonsvektorer for anvendelse i pattedyrvertsceller kan inkludere transkripsjonelle og translasjonelle kontrollsekvenser avledet fra virale genomer. Vanlig anvendte promotersekvenser og modifiseringssekvenser som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse, inkluderer uten å være begrenset til de som er avledet fra humant cytomegalovirus (CMV), Rous sarkomvirus (RSV), adenovirus 2, polyomavirus og apevirus 40 (SV40). Fremgangsmåter for konstruksjon av pattedyr ekspresjons vektorer er angitt, for eksempel i Okayama og Berg { Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)); Cosman et al { Mol Immunol 23:935 (1986)); Cosman et al { Nature 312:768 (1984)); EP-A-0367566; og WO 91/18982.

Fordi CD163-sekvenser er kjent å eksistere i celler fra ulike arter, kan det endogene genet modifiseres for å tillate eller øke ekspresjonen av CD 163-polypeptidet. Celler kan modifiseres (for eksempel ved homolog rekombinasjon) til å gi øket ekspresjon ved å erstatte alt eller deler av den naturlig forekommende CD163-polypeptidpromoteren med alt eller deler av en heterolog promoter, slik at cellene uttrykker CD163-polypeptid ved høyere nivåer. Den heterologe promoteren innsettes på en slik måte at den er operativt festet til endogene CD 163-kodende sekvenser. (Se for eksempel PCT Internasjonal Publikasjon nr. WO 94/12650, PCT Internasjonal Publikasjon nr. WO 92/20808 og PCT Internasjonal Publikasjon nr. WO 91/09955). Det er også vurdert at i tillegg til heterolog promoter DNA, amplifiserbare markør-DNA (for eksempel ada, dhfr og det flerfunksjonelle cad- genet, som koder for karbamylfosfatsyntase, aspartat transkarbamylase og dihydroorotase) og/eller intron-DNA, kan innsettes sammen med den heterologe promoter-DNA. Dersom koblet til den CD163-kodende sekvensen, resulterer amplifisering av markør-DNA'et ved standard seleksjonsfremgangsmåter i samtidig amplifisering av de CD163-kodende sekvenser i cellene.

Vaksineproduksi on

Fremgangsmåtene beskrevet ovenfor kan anvendes for produksjon av et hvilket som helst PRRS-virus med den hensikt å produsere vaksine eller diagnostiseringsmidler.

Fremgangsmåtene beskrevet ovenfor kan anvendes for å produsere virus for vaksineproduksjon eller diagnostiseringsmidler.

Drepte (inaktiverte) eller levende vaksiner kan produseres. For konstruksjon av levende vaksine dyrkes derfor et viralt isolat eller en attenuert eller mutert variant derav i en cellekultur. Viruset høstes ifølge fremgangsmåter som er velkjente i fagfeltet. Viruset kan så konsentreres, fryses og lagres ved -70 °C, eller frysetørkes og lagres ved 4 °C. Før vaksinering blandes viruset med en hensiktsmessig dosering (fra omkring 10 3 til 108 vevskulturinfiserte doser pr. ml (TdD5o/ml)), med en farmasøytisk akseptabel bærer som for eksempel en saltløsning, og eventuelt en adjuvans.

Den produserte vaksine kan også omfatte en inaktivert eller drept vaksine, inneholdende et virus dyrket ved fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse. Den inaktiverte vaksine konstrueres ved fremgangsmåter som er velkjent i fagfeltet. Som for eksempel når viruset har spredd seg til høyere titere, vil det være tydelig for den dyktige i fagfeltet at virusets antigenmasse kan oppnås ved fremgangsmåter vel kjent i fagfeltet. Virusets antigenmasse kan for eksempel oppnås ved fortynning, konsentrering eller ekstraksjon. Alle disse fremgangsmåtene anvendes for å oppnå hensiktsmessig, viral antigenmasse for vaksineproduksjon. Viruset inaktiveres så med formalinbehandling, betapropriolaceton (BPL), binært etylenimin (BEI), eller andre kjente fremgangsmåter kjent for fagpersoner i fagfeltet. Det inaktiverte virus blandes så med en farmasøytisk akseptabel bærer, som en saltløsning og eventuelt en adjuvans. Eksempler på adjuvanser inkluderer, men er ikke begrenset til aluminiumhydroksid, olje-i-vann og vann-i-olje emulsjoner, AMPHIGEN, saponiner som QuilA, og polypeptidadjuvanser inkludert interleukiner, interferoner og andre cytokiner.

Formalininaktivering gjennomføres ved å blande den virale suspensjonen med 37 % formaldehyd til en sluttkonsentrasjon av formaldehyd på 0,05 %. Virusformaldehydblandingen blandes under konstant røring i omkring 24 timer i romtemperatur. Den inaktiverte virusblandingen testes så for rester av levende virus ved analyse for vekst på en egnet cellelinje.

Inaktivering ved BEI utføres ved å blande den virale suspensjonen ifølge foreliggende oppfinnelse med 0,1 M BEI (2-brom-etylamin i 0,175 N NaOH) til en BEI sluttkonsentrasjon på 1 mM. Virus-BEI-blandingen blandes under konstant omrøring i omkring 48 timer i romtemperatur, etterfulgt av tilsetting av 1,0 M natriumtiosulfat til en sluttkonsentrasjon på 0,1 mM. Blandingen forsetter i ytterligere to timer. Den inaktiverte virusblandingen testes så for rester av levende virus ved analyse for vekst på en egnet cellelinje.

Virus-permissiv celler som målrettes til å uttrykke CD 163 kan også anvendes for å kvantifisere levende virus. To vanlige fremgangsmåter som er velkjent for de dyktige i fagfeltet, er plakkanalysen og den begrensende fortynningsanalysen. CD 163-uttrykkende cellelinjer som er nyttige i fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for virusdyrking med den hensikt å produsere viralt antigen til diagnoseutstyr. Lysater fra infiserte celler (med eventuell rensing av virale partikler eller ekstraksjon av utvalgte virale proteiner), kan for eksempel belegges på ELISA-plater for påvisning og kvantifisering av antistoffer til viruset i svineserum.

Levende eller inaktivert virus dyrket i CD 163-uttrykkende celler kan anvendes etter eventuell separering av de virale proteinene til immuniserte dyr for å generere polyklonale, monospesifikke eller monoklonale antistoffer. Disse kan i sin tur anvendes som basis i diagnoseanalyser for påvisning og kvantifisering av virus i svineserum og andre biologiske prøver.

Analyser

Oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter for å fastslå et dyrs tilbøyelighet til å bli infisert av et PRRS-virus eller av en cellelinje som støtter replikasjon av et PRRS-virus . Prøver tas og analyseres for ekspresjon av CD163. Genekspresjonsnivået til CD163 kan sammenliknes med kontrollnivåer som er kjent for ikke å støtte virusreplikasjon.

I tilfellet av et dyr, kan prøver være enhver prøve som omfatter prøver av nukleinsyremolekyler eller proteiner, og oppnådd fra et legemlig vev som uttrykker CD 163 inkludert, men ikke begrenset til alveolære makrofager, dyrkete celler, biopsier eller andre vevspreparater. Ekspresjonsnivået kan bedømmes ved det ene eller begge nivåene til budbringer-RNA'et eller -proteinet produsert.

Nukleinsvrebasert analyse

Fremgangsmåtene for å bestemme CD 163-nivåer kan være nukleinsyrebasert som bemerket ovenfor. CD 163-avledete nukleinsyrer kan være i løsning eller på en fast støtte. I noen utførelsesformer kan de anvendes som oppstillingselementer i mikromatriser alene eller i kombinasjon med andre oppstillingselementmolekyler. Nukleinsyrebaserte fremgangsmåter krever generelt isolasjon av DNA eller RNA fra prøven, og påfølgende hybridisering eller PCR-amplifisering ved anvendelse av spesifikke primere avledet fra enhver kjent CD 163-kodende sekvens i faget, eller de som spesifikt er angitt som SEQ ID NO: 1, 3, 5, 12, 13, 17, 18, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 og 47. DNA eller RNA kan isoleres fra prøven i henhold til enhver av en rekke fremgangsmåter som er velkjente i fagfeltet. Fremgangsmåter for rensing av nukleinsyrer er beskrevet i Tijssen, P. (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, New York, N. Y. I en foretrukket utførelsesform isoleres total RNA ved anvendelse av TRIZOL total RNA isolasjonsreagens (Life Technologies, Inc., Gaithersburg Md.), og mRNA isoleres ved anvendelse av oligo d(T) kolonnekromatografi eller glasskuler. Når nukleinsyremolekylprøven er forsterket, er det ønskelig å opprettholde overfloden i den originale prøven, inkludert lave overflodstranskripter. RNA kan amplifiseres in vitro, in situ eller in vivo (Se Eberwine, U.S. pat. nr. 5 514 545).

Det er også fordelaktig å inkludere kontroller i prøven for å sikre at amplifikasjon og merkeprosedyrer ikke endrer den korrekte distribusjonen av nukleinsyremolekyler i en prøve. I denne hensikt tilsettes en prøve en mengde kontrollnukleinsyremolekyl, som på forhånd er gjort påvisbar før hybridisering til sitt komplementært oppstilte nukleinsyremolekyl, og sammensetningen av nukleinsyremolekyler inkluderer referansenukleinsyremolekyler som spesifikt hybridiserer med de oppstilte kontrollnukleinsyremolekylene. Etter hybridisering og prosessering bør hybridiseringssignalene som oppnås reflektere den nøyaktige mengden oppstilt kontrollnukleinsyremolekyler som er tilsatt prøven.

Før hybridisering kan det være ønskelig å fragmentere nukleinsyremolekylprøven. Fragmentering forbedrer hybridiseringen ved å minisere sekundærstruktur og krysshybridisering til andre prøvenukleinsyremolekyler i prøven eller ikke-komplementære nukleinsyremolekyler. Fragmentering kan utføres ved mekaniske eller kjemiske midler.

Merking

Nukleinsyremolekylprøven eller prober kan merkes med én eller flere merkingsdeler for å tillate påvisning av hybridiserte, oppstilte/prøve-nukleinsyremolekylkomplekser. Merkingshalvdelene kan inkludere sammensetninger som kan påvises ved spektroskopi, fotokjemiske, biokjemiske, bioelektroniske, immunkjemiske, elektriske, optiske eller ved kjemiske midler. Merkingshalvdelene inkluderer radioisotoper som (32)P, (33)P eller (35)S, kjemiluminiserende forbindelser, merkete bindingsproteiner, tungmetallatomer, spektroskopiske markører som fluoriserende markører og farginger, magnetiske markører, koblete enzymer, massespektrometrimarkører, spinn markører, elektroniske overføringsdonorer og mottakere og liknende. Foretrukne fluoriserende markører inkluderer Cy3 og Cy5 fluoroforer (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway N. J., USA).

Hybridisering

Nukleinsyremolekylsekvensen av SEQ ID NO: 1, 3, 5, 12, 13, 17, 18, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 og 47 eller andre CD163-kodende sekvenser i fagfeltet og fragmenter derav, kan anvendes i forskjellige hybridiseringsteknologier for ulike formål. Hybridiseringsprober kan designes eller avledes fra enhver pattedyr-CD163-sekvens, men kan gjøre bruk av sekvensene i SEQ ID NO: 1, 3, 5, 12, 13, 17, 18, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 og 47. Slike prober kan konstrueres fra en sterkt spesifikk region eller fra et konservert motiv, og anvendes i protokoller for å kvantifisere CD 163-beskjed, alleliske varianter eller relaterte sekvenser. Hybridiseringsprobene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være DNA eller RNA, og kan være avledet fra enhver pattedyr-CD 163-sekvens kjent i fagfeltet, eller fra de her angitte sekvenser som SEQ ID NO: 1, 3, 5, 12, 13, 17,18, 22, 23, 25, 26, 30 eller fra genomiske sekvenser som inkluderer promotere, enhancere og introner av det mammalske genet. Hybridisering eller PCR-prober kan produseres ved anvendelse av oligomerking, nick-translasjon, ende-merking eller PCR-amplifisering i nærvær av det merkete nukleotid. En vektor inneholdende nukleinsyresekvensen kan anvendes for å produsere en mRNA-probe in vitro ved tilsetting av en RNA-polymerase og merkete nukleinsyremolekyler. Disse prosedyrene kan gjennomføres ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige sett, som de som tilveiebringes ved Amersham Pharmacia Biotech.

Hybridiseringsstringensen bestemmes ved G+C innholdet i proben, saltkonsentrasjon og temperatur. Spesielt kan stringensen økes ved å redusere saltkonsentrasjonen eller ved å heve hybridiseringstemperaturen. I løsninger som anvendes for noen membranbaserte hybridiseringer tillater tilsettinger av et organisk løsemiddel som formamid, reaksjonen til å skje ved en lavere temperatur. Hybridisering kan utføres ved lavere stringens med buffere, slik som 5 x SSC med 1 % natriumdodecylsulfat (SDS) ved 60 °C, som tillater dannelse av et hybridiseringskompleks mellom nukleotidsekvenser som inneholder noen feiltilpasninger. Påfølgende vaskinger gjennomføres ved høyere stringens med buffere, slik at 0,2 x SSC med 0,1 % SDS ved enten 45 °C (middels stringens) eller 68 °C (høy stringens). Ved høy stringens vil hybridiseringskompleksene forbli stabile bare der hvor nukleinsyresekvensene nesten er fullstendig komplementære. I noen membranbaserte hybridiseringer kan fortrinnsvis 35 % eller mest foretrukket 50 % formamid tilsettes hybridiseringsløsningen for å redusere temperaturen som hybridiseringen utføres i, og bakgrunnssignaler kan reduseres ved anvendelse av andre rensemidler, slik som Sarkysol eller Triton X-100, og et blokkeringsmiddel som laksesperm-DNA. Valg av komponenter og betingelser for hybridisering er velkjent for de øvete i fagfeltet, og er gjennomgått i Ausubel (supra) og Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview N. Y.

Eksempler på høystringent hybridiseringsbetingelser er som følger: Hybridisering i

42 °C i en hybridiseringsløsning, omfattende 50 % formamid, 1 % SDS, IM NaCl,

10 % dekstransulfat, og vasking 2 x 30 minutter i 60 °C i en vaskeløsning omfattende 0,1 x SSC og 1 % SDS. Det er forstått i fagfeltet at forhold for ekvivalent stringens kan oppnås gjennom variasjon av temperatur og buffer, eller saltkonsentrasjon, som beskrevet av Ausubel et al, (red.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons

(1994), s. 6.0.3 til 6.4.10. Modifikasjoner i hybridiseringsbetingelser kan erfaringsmessig bestemmes eller nøyaktig beregnet, basert på lengden og prosentandelen av guanosin/cytosin (GC) basepar av proben. Hybridiseringsbetingelsene kan beregnes som beskrevet av Sambrook et al, (red.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), s. 9.47 til 9.51.

Hybridiseringsspesifisitet kan vurderes ved å sammenlikne hybridiseringen av spesifisitetskontrollnukleinsyremolekyler mot spesifisitetskontrollprøve av nukleinsyremolekyler som er tilsatt en prøve i en kjent mengde. De spesifisitetskontrolloppstilte nukleinsyremolekylene kan ha én eller flere sekvensfeiltilpasninger sammenliknet med de korresponderende oppstilte nukleinsyremolekylene. På denne måten er det mulig å bestemme hvorvidt bare komplementære oppstilte nukleinsyremolekyler hybridiserer til prøvenukleinsyremolekylene eller hvorvidt feiltilpassete hybridduplekser dannes.

Hybridiseringsreaksjoner kan gjennomføres i absolutte eller ulike hybridiseringsformater. I det absolutte hybridiseringsformatet hybridiseres nukleinsyremolekyler fra en prøve til molekylene i et mikromatriseformat, og signaler påvises etter hybridiseringskompleksdannelse som korrelerer til nukleinsyremolekylnivåer i en prøve. I det differensielle hybridiseringsformatet analyseres den differensielle ekspresjonen av et sett med gener i to biologiske prøver. For differensiell hybridisering fremstilles nukleinsyremolekyler fra begge de biologiske prøvene og merkes med ulike merkingshalvdeler. En blanding av de to merkete nukleinsyremolekylene tilsettes en mikromatrise, som så undersøkes under betingelser hvor emisjon fra de to forskjellige merkingene påvises individuelt. Molekyler i mikromatrisen som er hybridisert til hovedsakelig like antall av nukleinsyremolekyler avledet fra begge de biologiske prøvene, gir en tydelig kombinert fluorescens (Shalon et al; PCT-publikasjon WO95/35505). Fortrinnsvis er merkingene fluoriserende markører med emisjonsspektra som kan skjelnes, slik som Cy3 og Cy5 fluoroforer.

Etter hybridisering ble mikromatrisen vasket for å fjerne ikkehybridiserte nukleinsyremolekyler og kompleksdannelse mellom de hybridiserbare oppstilte elementene og nukleinsyremolekylene påvises. Fremgangsmåter for påvisning av kompleksdannelse er velkjent i fagfeltet. Fortrinnsvis merkes nukleinsyremolekylene med en fluoriserende markør og måling av nivåer og fluorescerende mønstre som viser kompleksdannelse utføres ved fluorescerende mikroskopi, fortrinnsvis konfokal fluorescens mikroskopi.

I et differensiert hybridiseringseksperiment merkes nukleinsyremolekyler fra to eller flere ulike biologiske prøver med to eller flere ulike fluorescensmarkører med ulike emisjonsbølgelengder. Fluorescenssignaler påvises atskilt med ulike fotomultiplikatorer satt til å påvise spesifikke bølgelengder. De relative overflods/ekspresjonsnivåene av nukleinsyremolekylene i to eller flere prøver oppnås.

Mikromatrisefluorescensintensitet kan typisk normaliseres for å ta i betraktning variasjoner i hybridiseringsintensitet når mer enn én mikromatrise anvendes under liknende testbetingelser. I en foretrukket utførelsesform normaliseres individuelt oppstilte prøvenukleinsyremolekylkompleksintensiteter ved anvendelse av intensiteten avledet fra interne normaliseringskontroller inneholdt på hver mikromatrise.

Polvpeptidbaserte analyser

Fremgangsmåter og reagenser for påvisning og kvantifisering av CD 163-polypeptiderinkluderer analytisk biokjemiske fremgangsmåter som elektroforese, massespektroskopi, kromatografiske fremgangsmåter og liknende, eller ulike immunologiske fremgangsmåter som radioimmunanalyse (RIA), enzymkoblete immunsorbentanalyser (ELISA), immunfluorescensanalyser, western blotting, massespektrometri med affinitetsfanging, biologisk aktivitet og annet beskrevet nedenfor, som er tydelig for de med dyktighet i fagfeltet ved gjennomgang av denne angivelsen.

Immunanalyser

Fremgangsmåter for påvisning av CD163-polypeptider som anvender ett eller flere anti-CD163-antistoffreagenser (dvs. immunanalyser)som anvendt heri, inkluderer en immunanalyse en analyse som anvender et antistoff (som bredt definert heri, og som spesifikt inkluderer fragmenter, kimærer og andre bindingsmidler) som spesifikt binder et CD 163-polypeptid eller epitop.

En rekke veletablerte immunologiske bindingsanalyseformater egnet for praktiseringen av foreliggende oppfinnelse er kjent (se for eksempel U.S. patent nr. 4 366 241; 4 376 110; 4 517 288; og 4 837 168). Se for eksempel Methods in Cell Biology, bind 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, red. Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and Clinical Immunology, 7. utg., Stites & Terr, red. (1991); Harlow and Lane, supra [for eksempel kap. 14], og Ausubel et al., supra, [for eksempel kap. 11]. Immunologiske bindingsanalyser (eller immunanalyser) anvender vanligvis et "innfangingsmiddel" som spesifikt binder til, og ofte immobiliserer analytten til en fast fase. I en utførelsesform er innfangingsmiddelet en halvdel som spesifikt binder til et CD 163-polypeptid, eller undersekvens som et anti-CD 163-antistoff.

CD 163-genproduktet som analyseres påvises vanligvis direkte eller indirekte ved anvendelse av en påvisbar markør. Denne markøren eller påvisbare gruppe som anvendes i prøven er vanligvis ikke et kritisk aspekt ifølge oppfinnelsen så lenge den ikke interfererer betydelig med den spesifikke antistoffbindingen som anvendes i prøven. Markøren kan være kovalent festet til innfangingsmiddelet (for eksempel et anti-CD 163-antistoff), eller kan være festet til en tredje halvdel, slik som et annet antistoff som spesifikt binder til CD 163-polypeptidet.

Fremgangsmåter og reagenser for kompetitive og ikke-kompetitive immunanalyser for påvisning av CD 163-polypeptider er også beskrevet. Ikke-kompetitive immunanalyser er analyseprøver der mengden analytt (i dette tilfellet CD 163) måles direkte. En slik prøve er en toseters, monoklonalbasert immunanalyse som anvender monoklonale antistoffer som er reaktive til to ikke-interferende epitoper på CD 163-polypeptidet. Se for eksempel Maddox et al, 1983, J. Exp. Med., 158:1211 for bakgrunnsinformasjon. I en "sandwich"-analyse bindes innfangingsmiddelet (for eksempel et anti-CD163-antistoff) direkte til et fast substrat der det immobiliseres. Disse immobiliserte antistoffene fanger så ethvert CD 163-polypeptid som er til stede i testprøven. CD 163-polypeptidet som således immobiliseres, kan deretter merkes, dvs. ved å binde til et andre anti-CD 163-antistoff som bærer en markør. Det andre CD 163-antistoffet kan alternativt mangle en markør, men bli bundet med et tredje, merket antistoff som er spesifikt til antistoffer av arten, hvorfra det andre antistoff er avledet. Det andre antistoffet kan alternativt modifiseres med en påvisbar halvdel, slik som biotin, som et tredje merket molekyl spesifikt kan binde til, slik som enzymmerket streptavidin.

I kompetitive analyseprøver måles mengden CD 163-polypeptid som er til stede i prøven indirekte ved å måle mengden tilsatt (eksogent) CD 163-polypeptid som er fortrengt (eller utkonkurrert) fra et innfangingsmiddel (for eksempel CD 163-antistoff) av CD 163-polypeptidet som er til stede i prøven. En hapten inhibitoranalyseprøve er et annet eksempel på en kompetitiv analyseprøve. I denne analysen immobiliseres CD 163-polypeptidet på et fast substrat. En kjent mengde CD163-antistoff tilsettes prøven, og prøven settes så i kontakt med det immobiliserte CD 163-polypeptidet. I dette tilfellet er mengden anti-CD 163-antistoff som er bundet til det immobiliserte CD 163-polypeptidet omvendt proporsjonalt til mengden CD 163-polypeptid som er til stede i prøven. Mengden immobilisert antistoff kan påvises ved å påvise enten den immobiliserte antistoff-fraksjonen eller den gjenværende antistoff-fraksjonen i løsningen. I dette aspektet kan påvisningen være direkte der antistoffet er merket, eller indirekte der markøren er bundet til et molekyl som spesifikt binder til antistoffet som beskrevet ovenfor.

Andre antistoffbaserte analyseprøveformater

Fremgangsmåter for påvisning og kvantifisering av nærvær av CD 163-polypeptid i prøven ved anvendelse av et immunblott (western blott) format er beskrevet heri. En annen immunanalyse er den såkalte "laterale strømningskromatografien". I en ikke-kompetitiv versjon av lateral strømningskromatografi beveger en prøve seg over et substrat ved for eksempel kapillærvirkning, og møter et mobilt, merket antistoff som binder til analytten som danner et konjugat. Konjugatet beveger seg så over substratet og møter et immobilisert andre antistoff som binder til analytten. Den immobiliserte analytten påvises således ved påvising av det merkete antistoff. I en kompetitiv versjon av lateral strømningskromatografi beveger en merket versjon seg av analytten over bæreren, og konkurrerer med umerket analytt for binding med det immobiliserte antistoff. Jo større mengde av analytten i prøven, desto mindre binding med merket analytt, og derfor også svakere signal. Se f. eks. May et al, U.S. patent nr. 5 622 871 og Rosenstein, U.S. patent nr. 5 591 645.

Avhengig av analyseprøven, kan ulike komponenter, inkludert antigenet, målantistoff eller antikatepsin-S-antistoff, bindes til en fast overflate eller støtte (dvs. substrat, membran eller filterpapir). Mange fremgangsmåter for immobilisering av biomolekyler til mange faste overflater er kjent i faget. Den faste overflaten kan for eksempel være en membran (f. eks. nitrocellulose), mikrotiterskål (f. eks. PVC, polypropylen eller polystyrén), testrør (glass eller plast), målepinne (f. eks. glass, PVC, polypropylen, polystyrén, lateks og liknende), mikrosentrifugerør eller glass- eller plastkule. Den ønskete komponent kan være kovalent bundet eller ikke-kovalent festet gjennom uspesifikk binding.

Mange organiske og uorganiske polymérer, både naturlige og syntetiske, kan anvendes som materiale for den faste overflaten. Illustrative polymérer inkluderer polyetylen, polypropylen, poly(4-metylbuten), polystyrén, polymetakrylat, poly(etylentereftalat), rayon, nylon, poly(vinylbutyrat), polyvinylidendifluorid (PVDF), silikoner, polyformaldehyd, cellulose, celluloseacetat, nitrocellulose og liknende. Andre materialer som kan anvendes inkluderer papir, glass, keramikk, metaller, metalloider, halvledermaterialer, sementer eller liknende. I tillegg kan det anvendes substanser som danner geléer, som proteiner (f. eks. gelatiner), lipopolysakkarider, silikater, agarose og polyakrylamider. Polymérer som danner flere vandige faser, som dekstraner, polyalkylenglykoler eller overflatemidler som fosfolipider, langkjedete (12-24 karbonatomer) alkylammoniumsalter og liknende er også egnet. Der den faste overflaten er porøs, kan forskjellige porestørrelser anvendes, avhengig av systemets natur.

Massespektrometri

Molekylmassen kan ofte anvendes som molekylidentifikasjon.

Massespektrometrifremgangsmåtene kan derfor anvendes til å identifisere en proteinanalytt. Massespektrometer kan måle masse ved å bestemme tiden som er nødvendig for en ionisert analytt trenger for å vandre ned et fluktrør og påvises av en ionedetektor. Matriseassistert laserutskillings ioniseringsmassespektrometri ("MALDI") er én fremgangsmåte for massespektrometri av proteiner. I MALDI blandes analytten med et energiabsorberende matrisemateriale som absorberer en lasers bølgelengde og plasseres på overflaten av en probe. Når laserstrålen treffer matrisen, utskilles analytten ionisert fra probens overflate, og påvises av ionedetektoren. Se for eksempel Hillenkamp et al, U.S. patent nr. 5 118 937.

Andre fremgangsmåter av massespektrometri for proteiner er beskrevet av Hutchens og Yip, U.S. patent nr. 5 719 060.1 en slik fremgangsmåte, referert til som Surfaces Enhanced for Affinity Capture ("SEAC"), anvendes en fastfasereagens som binder analytten spesifikt eller uspesifikt, slik som et antistoff eller et metallion, for å separere analytten fra andre materialer i prøven. Den innfangete analytten utskilles deretter fra fastfasen ved for eksempel laserenergi, ionisert, og påvises av detektoren.

Nukleinsyrer

Eksemplene angir oppfinnernes oppdagelse av flere nye CD 163-polynukleotider. Oppfinnelsen inkluderer disse nye CD163-polynukleotidene. Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelse benytter flere isolerte, nye polynukleotider (for eksempel DNA-sekvenser og RNA-transkripter, både sens- og komplementære anitisens-trådet, både enkel- og dobbeltrådet, inkludert spleisevarianter derav, som koder nye CD 163-polypeptider. Oppfinnerne rapporterer her også nye polynukleotider som koder svine-, murine-, humane-, hunde- og afrikansk grønnape-CD 163-polypeptider, og som omfatter sekvensene i SEQ ID NO: 1, 5, 12, 13, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 og 47.

Det må forstås at ved angivelse av SEQ ID NO: 1, 5, 12, 13, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 og 47, gir dette en dyktig fagperson i fagfeltet en mangfoldighet av fremgangsmåter for å oppnå disse sekvensene. Ved hjelp av eksempler vil det være mulig å generere prober fra de angitte sekvenser i SEQ ID NO: 1, 5, 12, 13, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 og 47, og screene svine-, murine-, humane-, hunde-og afrikansk grønnape-cDNA eller genomiske biblioteker, og derved oppnå hele SEQ ID NO: 1, 3, 5, 12, 13, 17, 18, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 og 47, eller dens genomiske ekvivalent. Sambrook et al, (red.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989). Også ved eksempler vil en dyktig fagperson straks innse at ved angivelse av sekvensen angitt i SEQ ID NO: 5, 12 13, 22, 23, 25, 26, 30 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 og 47, er det mulig å generere de hensiktsmessige primerne for PCR amplifisering for å oppnå den fullstendige sekvensen som er representert ved disse sekvensene. (Se for eksempel PCR Technology, H. A. Erlich, red., Stockton Press, New York, 1989; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, M. A. Innis, David H. Gelfand, John J. Sninsky, og Thomas J. White, red., Academic Press, Inc., New York, 1990).

DNA-polynukleotider nyttige i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen inkluderer cDNA og DNA som er kjemisk syntetisert fullstendig eller delvis, og er ment også å inkludere alleliske varianter derav. Alleliske varianter er modifiserte former av en villtype gensekvens, der modifiseringen er et resultat av rekombinasjon under kromosomal atskillelse, eller eksponering for forhold som kan gi opphav til genetisk mutering. Alleliske varianter som villtypegener er naturlig forekommende sekvenser (i motsetning til unaturlig forekommende varianter som oppstår fra in vitro manipulering).

DNA-sekvenser som koder de nye CD163-polypeptidene er vist i SEQ ID NO: 5, 12 13, 22, 23, 25, 26, 30 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 og 47. Fagpersonen innen teknikken vil lett forstå at DNA'et omfatter et dobbeltrådet molekyl, for eksempel molekylet som har sekvensen vist i SEQ ID NO: 5, 12 13, 22, 23, 25, 26, 30 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 og 47, sammen med kompiementmolekylet (det "ikke-kodende tråd" eller "komplement") med sekvensen som kan utledes fra sekvensen i SEQ ID NO: 5, 12 13, 22, 23, 25, 26, 30 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 og 47, i henhold til Watson-Crick's regler for DNA baseparing. Andre polynukleotider som koder for svine-, murine- og afrikansk grønnape-CD 163-polypeptider i SEQ ID NO: 2, 14, 24, 27, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 og 48, som avviker i sekvensen fra polynukleotidene i SEQ ID NO: 1, 3, 5, 12, 13, 17, 18, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 og 47 i kraft av den velkjente degenerering av den universelle genetiske kode, er velkjent innen fagfeltet. Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse vurderer derfor anvendelse av de andre DNA- og RNA-molekyler, som ved ekspresjon koder polypeptidene i SEQ ID NO: 2, 14, 24, 27 og 32. Etter å ha identifisert aminosyrerestsekvensen som kodet svine-CD 163-polypeptidet, og med kunnskap om alle triplett-kodoner for hver enkelt aminosyrerest, er det mulig å beskrive alle slike kodende RNA- og DNA-sekvenser. Andre DNA- og RNA-molekyler enn de som spesifikt er angitt heri, karakteriseres enkelt ved en endring i et kodon for en bestemt aminosyre er derfor innenfor rammen av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsensen.

En tabell av aminosyrer og deres representative forkortelser, symboler og kodoner er vist nedenfor i tabell 4.

Som er godt kjent i fagfeltet utgjør kodon triplettsekvenser av nukleotider i mRNA og deres korresponderende cDNA-molekyler. Kodoner karakteriseres med basen uracil (U) når de presenteres i et mRNA-molekyl, men karakteriseres ved basen tymidin (T) nåe de er til stede i RNA. En enkelt endring i et kodon for den samme aminosyreresten i et polynukleotid, endrer ikke sekvensen eller strukturen av det kodete polypeptid. Det er tydelig at når en frase uttrykker at en bestemt 3 nukleotidsekvens "koder" en bestemt aminosyre, vil den ordinært øvete forsker erkjenne at tabellen ovenfor tilveiebringer et middel for å identifisere de bestemte nukleotider. Ved et eksempel, om et tre-nukleotidsekvens koder treonin, angir tabellen at de mulige triplett-sekvensene er ACA, ACG, ACC og ACU (ACT dersom i DNA).

Det beskrives derfor også isolerte polypeptider nyttige i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen som følger:

et isolert polynukleotid som omfatter:

(a) en susCD163vl polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 1 og 5; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som minst har 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % 97 % 98 % eller 99 %, identitet og/eller likhet til et polypeptid vist i SEQ ID NO: 2; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID: 2; (d) et polynukleotid som er komplementet til ethvert av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid som omfatter:

(a) en susCD163v2 polynukleotidsekvens vist i SEQ ID NO: 12 eller 13; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som minst har 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid vist i SEQ ID NO: 14; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID: 14; (d) et polynukleotid som er komplementet til ethvert av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid som omfatter:

(a) en murin CD63v2 polynukleotidsekvens vist i SEQ ID NO: 22 eller 23; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID: 24; (c) et polynukleotid som er komplementet til en av (a) eller (b);

et isolert polynukleotid som omfatter:

(a) en murin CD163v3 polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 25 eller 26; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som minst har 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 27; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID: 27; (d) et polynukleotid som er komplementet til enhver av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid som omfatter:

(a) en afrikansk grønnape-CD163v2-polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 30 eller 31; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som minst har 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 32; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID: 32; (d) et polynukleotid som er komplementet til ethvert av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid som omfatter:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 33; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som minst har 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 34; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID: 34; (d) et polynukleotid som er komplementet til enhver av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid som omfatter:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 35; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som minst har 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 36; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID: 36; (d) et polynukleotid som er komplementet til enhver av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid som omfatter:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 37; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som minst har 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 38; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID: 38; (d) et polynukleotid som er komplementet til enhver av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid som omfatter:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 39; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som minst har 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 38; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID: 40; (d) et polynukleotid som er komplementet til enhver av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid som omfatter:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 41; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som minst har 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 38; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID: 42; (d) et polynukleotid som er komplementet til enhver av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid som omfatter:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 43; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som minst har 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 44; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID: 44; (d) et polynukleotid som er komplementet til enhver av (a), (b) eller (c);

et isolert polynukleotid som omfatter:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 45; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som minst har 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 46; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID: 46;

(d) et polynukleotid som er komplementet til enhver av (a), (b) eller (c); og

et isolert polynukleotid som omfatter:

(a) en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 47; (b) et polynukleotid som koder et polypeptid som minst har 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 48; (c) et polynukleotid som koder et polypeptid i SEQ ID: 49; (d) et polynukleotid som er komplementet til enhver av (a), (b) eller (c);

Polynukleotidsekvensinformasjonen som er tilveiebragt muliggjør storskala ekspresjon av det kodete polypeptid med teknikker som er velkjent og rutinemessig praktiseres i fagfeltet. Slike polynukleotider tillater også identifisering og isolering av polynukleotider som koder relaterte svine-CD163vl-polypeptider, slik som humane, alleliske varianter og arts-homologer, med velkjente teknikker inkludert southern og/eller northern hybridisering, og polymerasekjedereaksjon (PCR).

Kunnskap om sekvensen av en hvilken som helst CD 163-sekvens angitt heri, muliggjør gjennom anvendelse av southern hybridisering eller polymerasekjedereaksjon (PCR) også identifikasjon av genomiske DNA-sekvenser som koder CD163-regulatoriske sekvenser, som promotere, operatorer, enhancere, undertrykkere og liknende.

Som bemerket i avsnittet ovenfor, titulert "Analyser ", er slike polynukleotider også nyttige i hybridiseringstester for å påvise cellenes kapasitet til å uttrykke CD 163, eller for å måle CD163-ekspresjonsnivåer. Slike polynukleotider kan også være basis for diagnostiske fremgangsmåter som er nyttige for å bestemme mottakeligheten i et dyr for virusinfeksjon, som beskrevet ovenfor.

Angivelsen heri av fullengde polynukleotidene som koder et CD 163-polypeptid, gjør fragmenter av fullengde polynukleotidet enkelt tilgjengelig for fagpersonen i fagfeltet. Unike fragmenter av de CD 163-kodende polynukleotidene omfatter minst 15 til lengden av fullengdesekvensen (som inkluderer hvert og alle heltallsverdier mellom) etterfølgende nukleotider av et polynukleotid som koder et CD 163 angitt heri. Da slike polynukleotider (inkludert fragmenter) omfatter unike sekvenser for den bestemte CD163-kodende polynukleotidsekvensen, vil de derfor bare hybridisere under sterkt stringente eller moderate betingelser (dvs. "spesifikt") til polynukleotider som koder de ulike CD163-polypeptidene. Sekvenser som er unike for slike polynukleotider gjenkjennes ved sekvenssammenlikning med andre kjente polynukleotider, og kan identifiseres ved anvendelse av oppstillingsprogrammer som anvendes rutinemessig i fagfeltet, for eksempel de som er tilgjengelige i offentlige sekvensdatabaser. Slike sekvenser er også gjenkjennelige fra southern hybridiseringsanalyser for å bestemme antall fragmenter av genomisk DNA, der et polynukleotid vil hybridisere. Slike polynukleotider kan merkes på en måte som tillater deres påvisning, inkludert radioaktiv, fluoriserende og enzymatisk merking.

Ett eller flere unike fragmentpolynukleotider (eller andre CD 163-polypeptider, som diskutert ovenfor), kan inkluderes i sett som anvendes for påvising av nærværet av et polynukleotid som koder for CD163, eller som anvendes for å påvise variasjoner i en polynukleotidsekvens som koder for CD163. Antisens polynukleotider som gjenkjenner og hybridiserer til polynukleotider som koder CD163, er også gjort tilgjengelig. Fullengde og fragment antisens polynukleotider tilveiebringes. Fragmentantisensmolekyler ifølge oppfinnelsen inkluderer (i) de som spesifikt gjenkjenner og hybridiserer til CD 163-variantene angitt her (som fastsatt ved sekvenssammenlikning av DNA som koder CD163'er til DNA som koder andre kjente molekyler). Identifisering av unike sekvenser for de nye CD163-kodende polynukleotidene kan utledes gjennom anvendelse av enhver offentlig tilgjengelig sekvensdatabase, og/eller gjennom anvendelse av kommersielt tilgjengelige sekvenssammenlikningsprogrammer. Valgte sekvensers unikhet i et fullstendig genom kan ytterligere verifiseres ved hybridiseringsanalyser. Etter identifisering av de ønskete sekvenser, kan isolering ved restriksjonsfordøying eller amplifisering som anvender enhver av de forskjellige polymerasekjedereaksjonsteknikker som er velkjente i fagfeltet anvendes. Antisens polynukleotider er spesielt relevante for å regulere ekspresjon av CD 163 ved de celler som uttrykker CD163-mRNA.

Antisens nukleinsyrer (fortrinnsvis 10 til 20 basepar oligonukleotider) som er i stand til spesifikt å binde til CD163-ekspresjonskontrollsekvenser eller CD163 RNA introduseres i celler (for eksempel ved en viral vektor eller kolloidalt dispersjonssystem, som et liposom). Antisens nukleinsyren binder til svine-CD163-målnukleotidsekvensen i cellen og hindrer transkripsjon eller translasjon av målsekvensen. Fosfortioat og metylfosfonat antisens oligonukleotider vurderes spesifikt for terapeutisk anvendelse ifølge oppfinnelsen. Antisens oligonukleotidene kan modifiseres ytterligere med poly-L-lysin, transferrin polylysin, eller kolesterolhalvdeler ved deres 5' ende. Undertrykking av svine-CD 163-ekspresjon ved enten det transkripsjonelle eller translasjonelle nivået, er nyttig for å generere cellulære modeller eller dyremodeller for sykdommer som karakteriseres ved avvikende svine-CD 163-ekspresjon eller som en terapeutisk modalitet.

Som bemerket ovenfor mer detaljert, inkluderer nukleinsyrene beskrevet heri vektorer omfattende et polynukleotid beskrevet heri. Slike vektorer er nyttige, for eksempel for å amplifisere polynukleotidene i vertsceller for å skape nyttige kvantiteter derav. I andre utførelsesformer er vektoren en ekspresjonsvektor hvori polynukleotidet beskrevet heri er operativt bundet til et polynukleotid som omfatter en ekspresjonskontrollsekvens. Slike vektorer er nyttige for rekombinant produksjon av polypeptider beskrevet heri.

Vertsceller er transformerte eller transfekterte (stabilt eller forbigående) med polynukleotider eller vektorer beskrevet heri. Som bemerket ovenfor er slike vertsceller nyttige for produksjon av virus og vaksiner.

Polypeptider

Eksemplenebeskriver flere nye CD 163-polypeptider som er vist i

SEQ ID NO: 2, 14, 19, 24, 27, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 og 48 som følger: et isolert polynukleotid omfattende et susCD163vl-polypeptid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 2;

et polypeptid som minst har 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 2;

et isolert polynukleotid omfattende et susCD163v2-polypeptid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 14;

et polypeptid som har minst 99 % identitet og/eller likhet til et susCD163v2-polypeptid som vist i SEQ ID NO: 14;

et murint CD163v2-polypeptid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 24;

et murint CD 163v3-polypeptid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 27;

et polypeptid som minst har 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 27;

et polypeptid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 32;

et polypeptid som minst har 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 32;

et polypeptid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 34.

Oppfinnelsen inkluderer også et polypeptid som minst har 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 34;

et polypeptid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 36;

et polypeptid som minst har 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 36;

et polypeptid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 38;

et polypeptid som minst har 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 39;

et polypeptid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 40;

et polypeptid som minst har 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 40;

et polypeptid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 42;

et polypeptid som minst har 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 42;

et polypeptid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 44;

et polypeptid som minst har 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 44;

et polypeptid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 46;

et polypeptid som minst har 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 46;

et polypeptid med sekvensen som vist i SEQ ID NO: 48.

Oppfinnelsen inkluderer også et polypeptid som minst har 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identitet og/eller likhet til et polypeptid som vist i SEQ ID NO: 48;

Polypeptider kan isoleres fra naturlige cellekilder, eller de kan syntetiseres kjemisk, men produseres fortrinnsvis ved rekombinante fremgangsmåter som involverer vertsceller beskrevet heri. Anvendelse av pattedyrvertsceller er antatt å gi slike posttranslasjonelle modifikasjoner (for eksempel glykosylering, avkortning, lipidering og fosforylering) som kan være nødvendige for å konferere optimalbiologisk aktivitet på rekombinante ekspresjonsprodukter ifølge oppfinnelsen. Glykosylerte og ikke-glykosylerte former av de nye CD163-polypeptidene er innbefattet.

Overekspresjon i eukaryote og prokaryote verter, som beskrevet ovenfor fremmer isolering av CD163-polypeptiderinkludert isolerte CD 163-polypeptider som vist i SEQ ID NO: 2, 14, 19, 24, 27, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 og 48, og varianter og konserverte aminosyresubstitusjoner deri, som inkluderer merkete og taggete polypeptider.

Inkludert er også nye CD 163-polypeptider som er "merket". Betegnelsen "merket" anvendes her for å referere til konjugeringen eller den kovalente bindingen av enhver egnet påvisbar gruppe, som inkluderer enzymer (for eksempel pepperrotperoksidase, glukuronidase, alkalisk fosfatase og P-D-galaktosidase), fluoriserende merker (for eksempel fluorescein, luciferase), og radioaktive markører (for eksempel 14C,<125>1,<3>H, 32 P og35S)til forbindelsen som skal merkes. Teknikker for merking av forskjellige forbindelser inkluderer proteiner, peptider og antistoffer, og er velkjent. Se for eksempel Morrison, Methods in Enzymology 32b, 103 (1974); Syvanen et al., J. Biol. Chem. 284, 3762 (1973); Bolton og Hunter, Biochem. J., 133, 529 (1973). Betegnelsen "merket" kan også omslutte et polypeptid som kovalent har festet til en aminosyremarkør, som diskutert nedenfor.

De nye CD163-polypeptidene kan i tillegg merkes indirekte. Dette involverer kovalent festing av en halvdel til polypeptidet og påfølgende kobling av den tilføyde halvdelen til et merke eller en merket forbindelse som viser spesifikk binding til den tilføyde halvdelen. Muligheter for indirekte merking inkluderer biotinylering av peptidet fulgt av binding til avidin, tilkoplet én av merkingsgruppene oppfinnelsen. Et annet eksempel er inkubasjon av et radioaktivt merket antistoff spesifikt for en histidinmarkør med et CD 163-polypeptid som omfatter en polyhistidinmarkør. Nettoeffekten er å binde det radioaktive antistoff til polypeptidet pga. den betydelige affiniteten antistoffet har til markøren.

Oppfinnelsen omslutter også varianter (eller analoger) av det nye CD 163-proteinet.

I et eksempel tilveiebringes addisjons varianter hvori én eller flere aminosyrerester supplerer en ny CD 163-aminosyresekvens. Addisjoner kan lokaliseres på den ene eller begge proteinendene, eller kan ha posisjon innenfor interne områder av den nye CD 163-proteinaminosyresekvensen. Addisjons varianter med ytterligere rester på den ene eller begge endene, kan inkludere for eksempel fusjonsproteiner og proteiner som inkluderer aminosyremarkører eller -markører. Addisjonsvarianter inkluderer nye CD 163-polypeptider der én eller flere aminosyrerester tilføyes en CD163-aminosyresekvens, eller til et biologisk aktivt fragment derav.

Addisjonsvarianter kan derfor også inkludere fusjonsproteiner hvor amino- og/eller karboksyenden av det nye CD 163-polypeptidet fusjoneres til et annet polypeptid. Forskjellige markør-polypeptider og deres respektive antistoffer er godt kjent i fagfeltet. Eksempler inkluderer polyhistidin (poly-his) eller poly-histidin-glysin (poly-his-gly) markører; influenza-HA-polypeptidmarkør og dets antistoff 12CA5 [Field et al, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; c-myc-markøren og 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 og 9E10 antistoffene dertil [Evan et al, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)], og Herpes Simplex virus glykoprotein-D (gD)-markør og dets antistoff [Paborsky et al, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Andre polypeptidmarkører inkluderer Flag-peptidet [Hopp et al, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; KT3-epitop-peptidet [Martin et al, Science, 255:192-194 (1992)];

et a-tubulinepitoppeptid [Skinner et al, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; og T7-gen 10 proteinpeptidmarkør [Lutz-Freyermuth et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:6393-6397(1990)]. I tillegg kan CD 163-polypeptidet merkes med enzymatiske proteiner, som peroksidase og alkalisk fosfatase.

Delesjonsvarianter hvor én eller flere aminosyrerester i et nytt CD 163-polypeptid fjernes er inkludert. Delesjoner kan utføres ved én eller begge endene i det nye CD 163-polypeptidet, eller med fjerning av én eller flere rester i den nye CD 163- aminosyresekvensen. Delesjonsvarianter inkluderer derfor alle fragmenter av det nye CD 163 -polypeptidet.

CD 163-polypeptider inneholder et transmembran- eller membranforankringsområde. Det bør forstås at slike transmembrane doméner er nyttige når de uttrykkes i konteksten i et heterologt protein for å bidra i målsøkingen av det heterologe proteinet til membraner. Det bør også forstås at det kan være fordelaktig å slette noen transmembrane doméner for å styrke proteinets rensing eller oppløselighet. Slettete transmembrane varianter av CD 163 og polynukleotider som koder disse, er av stor verdi som antivirus legemidler. Slike varianter er spesifikt angitt heri som SEQ ID NO: 37-40.

Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer også anvendelse av varianter av de tidligere nevnte polypeptidene, dvs. polypeptider som varierer fra referansesekvensen med konservative aminosyresubstitusjoner.

Eksemplarisk konservative substitusjoner er vist i tabell 1, 2 og 3 i avsnittet ovenfor titulert "Definisjoner".

I situasjoner der det er fordelaktig å delvis eller fullstendig å isolere de nye CD 163-polypeptidene, kan rensing utføres ved anvendelse av standard fremgangsmåter som er godt kjent for fagpersonen. Slike fremgangsmåter inkluderer, men er ikke begrenset til separasjon ved elektroforese, fulgt av elektroeluering, forskjellige typer kromatografi (immunaffinitet, molekylær siling, og/eller ionebytting), og/eller høytrykksvæskekromatografi. I noen tilfeller kan det være fordelaktig å anvende mer enn én av disse fremgangsmåter for å fullføre rensing.

Rensing av nye CD 163-polypeptider kan utføres ved anvendelse av en rekke forskjellige teknikker. Dersom polypeptider er syntetisert slik at det inneholder en markør, slik som heksahistidin (CD163/heksaHis) eller andre små peptider, slik som FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.) eller mye (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved enten dets karboksyl eller aminoende, kan det hovedsakelig renses i en ett-trinns prosess ved å føre løsningen gjennom en affinitetskolonne der kolonnematrisen har høy affinitet for markøren eller for polypeptidet direkte (dvs. et monoklonalt antistoff som spesifikt gjenkjenner CD163). Polyhistidin binder med stor affinitet og spesifisitet til nikkel, således kan en affinitetskolonne av nikkel (slik som Qiagen-registrerte ™ nikkelkolonner) anvendes for rensing av CD163/polyHis. (se for eksempel Ausubel et al, red., Current Protocols in Molecular Biology, avsnitt 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]).

Selv om det nye CD 163-polypeptidet fremstilles uten en merking eller markør for å fremme rensing, kan den nye CD 163 ifølge oppfinnelsen renses ved immunaffinitetskromatografi. For å gjennomføre dette må antistoffer som er spesifikke for CD 163-polypeptider fremstilles ved hjelp av velkjente midler i fagfeltet.

Antistoffer som genereres mot de nye CD163-polypeptidene beskrevet heri kan oppnås ved å tilføre polypeptidene eller epitopbærende fragmenter, analoger eller celler til et dyr, fortrinnsvis et ikke-humant dyr, ved å anvende rutinemessige protokoller. For fremstilling av monoklonale antistoffer kan enhver teknikk kjent i fagfeltet som tilveiebringer antistoffer produsert ved kontinuerlige cellelinjekulturer anvendes. Eksempler inkluderer forskjellige teknikker, som de beskrevet av Kohler, G. og Milstein, C, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al, Immunology Today 4:72

(1983); Cole et al, s. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Andre velkjente fremgangsmåter for rensing kan anvendes om de nye CD 163-polypeptidene fremstilles uten en tilfestet markør, og antistoffer ikke er tilgjengelige. Slike fremgangsmåter inkluderer, men er ikke begrenset til ionebytterkromatografi, molekylær silingskromatografi, HPLC, naturlig gel-elektroforese i kombinasjon med gel-eluering, og forberedende isoelektrisk fokusering ("Isoprime" maskin/teknikk, Hoefer Scientific). I noen tilfeller kan to eller flere av disse teknikkene kombineres for å oppnå øket renhet.

Det bør forstås at definisjonen av polypeptidene som anvendt heri er ment å inkludere polypeptider som bærer andre modifikasjoner enn addisjoner, delesjoner eller substitusjon av aminosyrerester. Eksempelvis kan modifikasjonene være naturlig kovalente og inkludere for eksempel kjemisk binding med polymérer, lipider, andre organiske og uorganiske halvdeler.

Antistoffer

Også innbefattet av den foreliggende beskrivelse er antistoffer (for eksempel mono- og polyklonale antistoffer, enkeltkjede antistoffer, kimære antistoffer, dobbelt-funksjonelle/spesifikke antistoffer, humaniserte antistoffer, humane antistoffer og komplementært bestemmende regioner (CDR)-podete antistoffer, inkludert forbindelser som inkluderer CDR-sekvenser som spesifikt gjenkjenner et polypeptid ifølge oppfinnelsen) som er spesifikke for nye CD 163 eller fragmenter derav.

Betegnelsen "spesifikk for" når den anvendes for å beskrive antistoffer ifølge oppfinnelsen, angir at de variable antistoffregionene gjenkjenner og binder CD 163-polypeptider eksklusivt (dvs. at de er i stand til å skjelne CD 163-polypeptider fra andre kjente polypeptider ved hjelp avmålbare forskjeller i bindingsaffinitet, til tross for mulig eksistens av lokalisert sekvensidentitet, homologi eller likhet mellom de nye CD 163-polypeptidene og slike polypeptider). Det vil forstås at spesifikke antistoffer også kan interagere med andre proteiner (for eksempel S. aureus protein-A eller andre antistoffer i ELISA-teknikker) gjennom interaksjoner med sekvenser utenfor antistoffenes variable regioner, og særlig i den konstante molekylregionen. Screeningsanalyser for å bestemme bindingsspesifisitet til et antistoff ifølge oppfinnelsen, er velkjent og praktiseres rutinemessig i fagfeltet. For en grundig diskusjon vedrørende slike tester, se Harlow et al, (red.), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), kap. 6. Antistoffer som gjenkjenner og binder fragmenter av CD 163-polypeptidene betraktes også, forutsatt at antistoffene først og fremst er spesifikke for nye CD 163-polypeptider. Antistoffer kan fremstilles ved anvendelse av enhver fremgangsmåte som er godt kjent og rutinemessig praktiseres i fagfeltet. Ikke-humane antistoffer kan humaniseres ved enhver fremgangsmåte kjent i fagfeltet. I en utførelsesform innsettes de ikke-humane CDR'ene i et humant antistoff eller konsensus antistoff rammeverksekvens. Ytterligere endringer kan så introduseres i rammeverkets antistoff for å modulere affinitet eller immungenisitet.

Antistoffer beskrevet heri er nyttige for diagnostiske formål for påvisning eller kvantitering av CD 163'er, slik som rensing av CD163'er. Sett omfattende et antistoff for ethvert av formålene beskrevet heri, er også innbefattet. Generelt inkluderer et sett også et kontrollantigen som antistoffet er immunspesifikt for.

Foreliggende oppfinnelse er ytterligere illustrert, men er ikke begrenset til de påfølgende eksemplene.

Eksempel 1: Forbigående transfeksjon med svine-CD163 som konfererer tillatelse til PRRS-virusinfeksjon til en ikke-permissive cellelinje.

Total-mRNA fra primære svinealveolære makrofagceller ble anvendt for konstruksjon av et cDNA-bibliotek i plasmidet pCMV-Sport6.1 (Invitrogen), med cDNA'et klonet mellom EcdSN og iVofl-setene. Et medlem av dette biblioteket, når isolert og forbigående transfektert i BHK-21 (baby hamster nyre)cellelinjen, konfererte en PRRS-permissiv fenotype. Cellene ble dyrket Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), supplert med 5 % føtalt bovint serum (FBS) i en 5 % CC>2-atmosfære ved 37 °C. cellekulturer ble forbigående transfektert med 10,0 ul lipofectamin 2000 (Invitrogen) og 2,0 ug plasmid. Et duplikat monolag ble transfektert med negativt kontrollplasmid pPAMB. Dette plasmidet er pCMV-Sport6.1 som mangler et innskudd. Transfeksjonseffektivitet ble kontrollert med et plasmid som uttrykte grønnfluoriserende protein (GFP). Omkring 24 timer etter transfeksjon ble monolagene infisert med enten nordamerikanske (isolat P129) eller europeiske (isolat 96V198) genotyper av PRRS-virus. For påvisning av PRRS-replikasjon, ble monolagene fiksert med 80 % aceton omtrent 24 timer etter infeksjon og inkubert i omkring 1 time med FITC-konjugert monoklonalt antistoff SDOW17 (Rural Technologies Inc.) Dette monoklonale antistoff er spesifikt for PRRS viralt nukleokapsid som uttrykkes fra åpen leseramme 7. Et Nikon TE300 invertert fluorescensmikroskop med et 10 x objektiv ble anvendt for å fotografere et monolag inneholdende FITC-positive celler, og et negativt kontrollmonolag.

Det ble bekreftet at transfekterte celler ble permissive for både den nordamerikanske (isolat P129) og europeiske (isolat 96V198) genotypene av PRRSV. Ekspresjon av virale gener kunne påvises i mange av de transfekterte BHK-cellene, og virusavkom var enkelt påvisbare i supernatanten. Kontrolltransfeksjoner som anvendte vektor uten innskudd eller irrelevante plasmider konfererte ikke tillatelighet.

Sekvensering av innskuddet i det funksjonelle plasmidet ved anvendelse av Big Dye Terminator versjon 1.0 sekvensreaksjonssett (Applied Biosystems, Foster City, CA) og Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems), avslørte et gen som sterkt homologt med det publiserte svine-CD 163-gen cDNA (Genbank tilgangsnummer AJ311716). De cDNA som oppfinnerne identifiserte inneholdt ytterligere 5' og 3' utranslaterte regioner relativt til AJ311716, og den åpne leserammen var avvikende på tre måter: (1) en 738 bp intern delesjon nær den 5' ende, (2) en 15 bp forlengelse ved den 5' ende for et oppstrøms ATG-kodon, og (3) 16 nukleotidendringer antatt å forårsake 10 aminosyreendringer. Nukleotidsekvensidentitet mellom sekvensene var 99,4 %. Oppstillinger av den nylig oppdagete svine-CD 163-sekvensen med den tidligere rapporterte sekvensen AJ311716 er vist i figur 1 og 2. Den nye svine-CD 163 varianten fikk betegnelsen "susCD163vl".

Eksempel 2: Konstruksjon av plasmid pCMVsusCD163vl

Konstruksjon av plasmidet pCMVsusCD163vl ble utført som følger. Den funksjonelle klon identifisert i det primære svinemakrofag-cDNA-biblioteket, og som konfererte PRRSV tillatelighet tjente som templat for PCR-amplifisering av CD163-innskudd, som inkluderte de 5' og 3' utranslaterte regionene, ved å bruke primerne 5DS-CD163 (SEQ ID NO:6) (5'-cggaattccgcggatgtaataatacaagaaga-3') og 3'CD163 (SEQ ID NO:7)

(5'ccgctcgagtagtccaggtcttcatcaaggtatctt-3'). Primer 5'DS-CD163 inkorporerte etSacIL restriksjonssete på den 5' enden av CD 163-innskuddet, mens primer 3'CD163 inkorporerte et^ol restriksjonssete på den 3' enden av innskuddet (understreket). Reaksjoner inneholdende 190 ng plasmidtemplat ble amplifisert med PlatinumP^c DNA polymerase (Invitrogen kat. nr. 11708-013), ved å følge produsentens instruksjoner. Reaksjoner ble varmet til 94 °C i 2 minutter, så 35 sykluser ved 94 °C i 20 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 68 °C i 3,5 minutter, fulgt av en terminal forlengelse ved 72 °C i 7 minutter. De resulterende PCR-produktene ble renset med Qiaquick PCR rensingssett (Qiagen kat. nr. 28104), fordøyd med restriksjonsenzymene SacH og Xhol, og de resulterende fragmentene ble gel-renset med Qiaquick Gel ekstraksjonssett (Qiagen kat. nr. 28704). CD 163 PCR-fragmentet ble så ligert inn i

plasmidet pCMV-Script (Stratagene kat. nr. 212220), fremstilt for å akseptere det fordøyde PCR-fragment ved fordøying med SacIL og Xhol, fulgt av gel-rensing som beskrevet ovenfor. Det ligerte materialet ble transformert inn i E. cø/z-stammen DH5oc, og rekombinanter ble valgt ved vekst i 50 ug/ml kanamycin og identifisert ved restriksjonsanalyse. Det resulterende plasmid, "pCMVsusCD163vl", inneholdt det internt slettete svine-CD 163 innskuddet, beskrevet i eksempel 1 under transkripsjonal kontroll av den eukaryote CMV-promoteren og det neomycin/kanamycin-resistente gen under kontroll av både eukaryote og prokaryote promotere.

Eksempel 3: Konstruksjon av den pRSV-skriptuttrykkende vektor og pRSVsusCD163vl

Plasmid pRc/RSV (Invitrogen) ble anvendt som templat for PCR-amplifisering av RSV-promoteren. RSV-promotersekvens var lokalisert i nukleotidene 209 til 604 i pRc/RSV. Foroverprimer PCIRSVLTR (SEQ ID NO: 8)

(5'-ACACTCGACATGTCGATGTACGGGCCAGATATACGCGT-3'), og

reversprimer VSRRTLSAC (SEQ ID NO: 9)

(5'TTCCTTAC AGAGCTCGAGGTGCACACCAATGTGGTGAA -3') ble syntetisert. RestriksjonsendonukleasePczl og Sacl gjenkjenningsseter (understreket), ble henholdsvis inkorporert i den 5' og 3' primeren for fremtidig kloning. PCR ble utført ved HotMaster Taq DNA Polymerasesett (Eppendorf), ved å følge produsentens instruksjoner. Reaksjonen inneholdt 0,9 ng pRc/RSV plasmidtemplat og 0,3 uM av hver primer beskrevet ovenfor. Reaksjoner ble varmet til 94 °C i 2 minutter, og så syklisert 30 ganger ved 94 °C i 20 sekunder, 52 °C i 10 sekunder, og 65 °C i 1 minutt. Det resulterende PCR-fragment ble fordøyd med restriksjonsenzymene Peil og Sacl, gel-renset og klonet inn i plasmidet pCMV-Script (Stratagene), som hadde vært fordøyd på liknende måte for å fjerne CMV-promotersekvensen. Det endelige konstruktet plasserte RSV-promoteren øyeblikkelig oppstrøms for flerkloningssetet, og fikk navnet "pRSV-Script".

SusCD163vl-innskuddet ble klonet bak RSV-promoteren som følger. SusCD163vl-sekvensen ble fjernet fra plasmid pCMVsusCD163vl ved restriksjonsfordøying ( Kpnl og SaclT), og gel-renset. Dette fragmentet ble så ligert inn i pRSV-Script, som også hadde vært fordøyd med de samme enzymene og gel-renset. Ligeringsblandingen ble transformert inn i DH5oc E. coli, og transformanter ble valgt ved anvendelse av kanamycin ved 50(xg/ml. Klonen som inneholdt det korrekte innskuddet ble betegnet "pRSVsusCD163vl".

Eksempel 4: Kloning og karakterisering av en lengre variant av svine-CD163-cDNA

Basert på svine-CD 163 vi-sekvensen, ble en foroverprimer 5'CD163NotIlong (SEQ ID NO: 10)

(5'CGGTCCGGAGCGGCCGCGATGTAATAATACAAGAAGATTTAAATGG-3'),

og en reversprimer 3'CD163KpnI (SEQ ID NO: 11)

(5' CGGTT GGT ACCC AGC A AT ATTCTTTTTT ATTT AATGCC-3') konstruert ved bruk av Lasergene PrimerSelect programmet (DNASTAR Inc., Madison WI) for amplifisering av et fullengde svine-CD 163-gen. Restriksjonsendonukleaseseter for Noti ogKpril (understreket) ble henholdsvis inkludert i 5' og 3' primere, for å tillate bekvem kloning. Totalt cellulær RNA ble fremstilt fra primæralveolære makrofager (PAM), høstet fra lungeutskyllinger fra friske svin. RNA-fremstilling ble utført ved bruk av

RNeasy minisett (Qiagen, Valencia, CA). RT-PCR-reaksjoner ble fremstilt ved bruk av SuperScript ett-trinns RT-PCR for Long Templates sett (Invitrogen, Carlsbad, CA), og RT-PCR parametre ble satt som følger: 50 °C i 30 minutter, 94 °C i 2 minutter, (94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 68 °C i 4 minutter) for 35 sykluser, og 72 °C i 10 minutter. PCR-produkter ble analysert på 0,8 % SeaKem GTG agarosegel. RT-PCR-produkter av forskjellige størrelser ble kuttet fra agarosegeler, og DNA ble ekstrahert ved anvendelse av GeneClean sett (QBiogene). Disse RT-PCR-produktene ble klonet inn i pCR2.1-TOPO kloningsvektoren (Invitrogen). Kloner ble analysert ved restriksjonsenzymfordøying i nærvær av et innskudd. Kolonier som inneholdt innskudd ble sekvensert med Big Dye Terminator, versjon 1.0 sekvensreaksjonssett (Applied Biosystems, Foster City, CA) og Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems), for å bekrefte sekvenslikhet. Sekvenser ble redigert og samlet ved bruk av Lasergene EditSeq og SeqMan programmene (DNASTAR Inc., Madison, WI). Ett plasmid med et stort innskudd ble betegnet<M>pCRsusCD163v2" (pCR2.1 inneholdende svine-CD163 variant 2, som oppfinnerne har betegnet SEQ ID NO: 12). Den kodende sekvensen inneholdt i SEQ ID NO: 12 reproduseres nedenfor, og har betegnelsen SEQ ID NO: 13. Sekvensanalyse viste at dette svine-CD 163 koder en aminosyresekvens på 1115 aminosyrer, som oppfinnerne har gitt betegnelsen SEQ ID NO: 14. Når den sammenliknes med svine-CD 163-sekvensen i GenBank (adgangsnr. AJ311716), er oppfinnernes CD163v2-sekvens 98,9 % identisk med aminosyrenivået. CD163v2 har også ytterligere 5 aminosyrerester på den ytterste 5' enden, som forlenger den åpne leserammen til et i-ramme oppstrøms ATG startkodon (som i svine-CD 163vi-sekvensen beskrevet i eksempel 1). Svine-CD163 er 84,3 % identisk til humant CD163

(GenBank adg. nr. Z22968), og 73,7 % identisk til muse-CD163 (GenBank adg. nr. AF274883) ved aminosyrenivået. Den forventete signalsekvensen og den transmembrane region i SEQ ID NO: 14 er henholdsvis vist ved understreking og utheving. For å bestemme om andre CD 163-sekvenser inneholder liknende sekvenssærtrekk bestemmes enkelt ved sekvensinspeksjon.

Sus CD163v2 i pCRsusCD163v2 ble frigjort fra pCR2.1 vektor etter restriksjonsenzymer Kpnl og Noti fordøying og gel-rensing. Mottakervektor pCMV-script ble også kuttet med det samme restriksjonsenzymparet og tillatt for retningsbestemt kloning av susCD163v2 inn i pCMV-script. Etter ligering av susCD163 v2 med pCMV-script, ble den ligerte blandingen anvendt for transformasjon av STBL 2 E. cø/z-celler (Invitrogen). En transformant ble funnet å inneholde CD 163-genet ved restriksjonsenzymfordøyingsanalyse, og ble betegnet pCMV-script susCD163v2 klon nr. 3.

Eksempel 5: Fremstilling av et RSV-promoterbasert ekspresjonssystem ved direkte ligering og transfeksjonsfremgangsmåte

En ikke-kloningsbasert fremgangsmåte for å generere mikrogrammengder av lineært DNA, egnet for anvendelse i å generere stabile cellelinjer som uttrykker CD 163 fra en RSV-promoter, ble utviklet (figur 4). Fremgangsmåten involverer isolering og ligering av to biter av DNA, én inneholdende neomycingenet og RSV-promoterkassetten avledet fra pRSV-script, og den andre inneholdende den susCD163v2-kodende sekvensen fra pCMVsusCD163v2. Vektorplasmid pRSV-Script ble linearisert med DralU oppstrøms for neomycingenet, og gjort butt med Klenow-fragmentet av E. coli DNA-polymerase. Dette plasmid ble så fordøyd med Noti øyeblikkelig nedstrøms for RSV-promoteren. pCMVsusCD163v2 klonen ble fordøyd med vektorsekvensen nedstrøms for CD 163 innskuddet med Drdl, og gjort butt med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase. Den CD 163-kodende sekvensen ble frigjort fra vektoren med et Noti lokalisert øyeblikkelig oppstrøms for den CD163-kodende sekvensen. For hver plasmidfordøying ble de hensiktsmessige fragmenter renset fra agarosegeler. En storskala ligeringsreaksjon ble utført som følger. Omkring 20 ug av hvert DNA-fragment ble inkubert i et volum på 600 ul med 15 enheter T4 DNA-ligase. Reaksjonen ble inkubert i romtemperatur i 20 minutter, hvorved en alikvot ble fjernet og reaksjonen frosset på tørris. Agarosegelanalyse av alikvoten viste at en betydelig mengde av uligert DNA var igjen, slik at nye 15 enheter av ligase ble tilsatt og inkubert i ytterligere 10 minutter i romtemperatur. Etter ligering ble en lineær bit av DNA inneholdende alle de hensiktsmessige elementer renset ved agarosegelelektroforese. Ligering av de to DNA-fragmentene via de kohesive iVbfl-endene resulterte i plasseringen av den 5' sekvensen av CD 163 genet nedstrøms for RSV-promoter, som tillater retningsstyrt ekspresjon av CD 163 i pattedyrceller. Straks isolert ble det rensete DNA anvendt for å transfektere forskjellige cellelinjer.

Eksempel 6: Kloning og karakterisering av humant CD 163 cDNA

Basert på en kjent, human CD 163 cDNA-sekvens (GenBank adgangsnr. BC051281), ble en forover primer Hu5'Not (SEQ ID NO: 15)

(5' C ACCGCGGCCGCGA AGTT AT A A ATCGCC ACC ATGAGC A A ACTC AGAATG

G-3') og en revers primer Hu3'Kpn (SEQ ID NO: 16)

(5'-TGCTCCGGTACCTAGTCCAGGTCTTCATCAAGGTATCTTA-3') konstruert ved anvendelse av PrimerSelect programmet. Restriksjonsseter for Noti og Kpnl (understreket) ble inkorporert ved henholdsvis de 5' og 3' primerne, for å fremme

kloning inn i ekspresjonsvektorer. Sekvensen CACC ble tilføyd den 5' enden av den 5' primeren for å tillate retningsbestemt kloning inn i pCDNA3.1D/V5/His/TOPO vektor (kat. nr. K49001, Invitrogen, se figur 6). Humane CD 163 cDNA'er ble amplifisert fra RNA ekstrahert fra U937-cellelinjen etter stimulering med forbol 12-myristat 13-acetat (100 ng/ml) i 3 dager. Totalt, cellulært RNA ble fremstilt ved anvendelse av RNeasy sett (Qiagen). RT-PCR-reaksjoner og sekvenseringsfremgangsmåter var de samme som beskrevet i eksempel 4. PCR-produkter ble separert på 0,8 % SeaKem agarosegel og ekstarhert fra gelen ved å benytte GeneClean settet. PCR-produkter ble retningsbestemt klonet inn i pCDNA3. lD/V5/His/TOPO vektoren ved å følge produsentens instruksjoner. To kloner med store innskudd ble sekvensert. Sekvensering og sekvensanalysefremgangsmåter ble beskrevet i eksempel 4. En klon med korrekt innskudd ble betegnet "pcDNA3.1D-humCD163v2" og oppfinnerne har betegnet innskuddssekvensen SEQ ID NO: 17.

CD 163 åpen leseramme i pCDNA3.1D-humCD163v2 er 1121 rester i lengde (betegnet SEQ ID NO: 18, som koder SEQ ID NO: 19, angitt nedenfor), og er 100 % identisk til GenBank Z22968 (et humant CD 163 cDNA med samme lengde). Oppfinnernes humane CD163v2 sekvens er også 100 % identisk til GenBank BC051281 og Z22969 (spleisevarianter av humant CD 163) unntatt at 42 ikke-homologe rester i de to GenBank sekvensene erstatter de syv karboksyterminale restene av oppfinnernes sekvens. Denne forskjellen er pga. nærværet av et 83-nukleotid exon i BC051281 og Z22969, og den resulterende leserammeskiftingen ved den 3' ende av exonet. (Law, S. K., Micklem, K. J., Shaw, J. M., Zhang, X. P., Dong, Y., Willis, A. C. og Mason, D. Y. (1993). A new macrophage differentiation antigen which is a member of the scavenger receptor superfamily. European Journal of Immunology 23 (9), 2320-2325).

Eksempel 7: Kloning og karakterisering av murint CD 163

Basert på den murine CD163-sekvensen i GenBank (AF274883), ble en foroverprimer Mus-new5' (SEQ ID NO: 20) (5'-CACCGCGGCCGCCACACGGAGCCATCAAAATCATCAA-3') og en reversprimer Mus-new3' (SEQ ID NO: 21) (5'-GGTACCGCGAACAAGCAAACCAATAGCAATATTGTTTAATTCCCTC-3,) konstruert ved anvendelse av PrimerSelect programmet. Restriksjonsendonukleaseseter f ot Noti og Kpnl ble henholdsvis inkludert i 5' og 3' primere, for å tillate fremtidig kloning inn i andre ekspresjonsvektorer. Muse peritoneale makrofager ble høstet fra mus 2 dager etter injeksjon av tioglykolatmedium inn i det peritoneale hulrom. Totalt cellulært RNA ble fremstilt fra peritoneale makrofager ved anvendelse av RNeasy sett. RT-PCR-reaksjoner og RT-PCR-parametre var de samme som beskrevet i eksempel 4, unntatt at sammensmeltingstemperaturen ble økt til 60 °C og forlengelsestemperaturen økt til 72 °C. PCR-produktet ble renset på 0,8 % SeaKem agarosegel, og retningsbestemt klonet inn i pCDNA3.1D/V5/His/TOPO ifølge produsentens instruksjoner. Flere kloner med store innskudd ble identifisert for ytterligere analyse. Et plasmid inneholdende et innskudd (SEQ ID NO: 22) med en murin CD 163 som koder et protein med den samme lengden som (1121 aminosyrer SEQ ID NO: 24) og avviker fra GenBank AF274883 med bare to aminosyrer (99,8 % identitet) ble betegnet "pCDNA3.1D-murCD163v2".

Et annet plasmid, "pCDNA3.1D-murCD163v3" ble generert, som inneholdt et innskudd (SEQ ID NO: 25) inneholdende en murint CD163-kodende sekvens (SEQ ID NO: 26), som koder et protein på 1159 aminosyrer i lengde (SEQ ID NO: 27). Den avviker fra AF274883 med bare 3 aminosyrer innenfor de første 1107 restene (99,7 % identitet), men sekvensene divergerer fullstendig, og starter med resten 1108. Dette er pga. en addisjon av 82 nukleotider i cDNA'et, og en ledsagende skifting i leserammen nedstrøms for innskuddet. Som et resultat inneholder murint CD163v3 52 aminosyrer på sin karboksyende som ikke er homolog til de 14 karboksyterminale restene av murint CD163v2. Disse to alternative versjoner av "fullengde" murint CD 163 er mest trolig en spleisevariant av det samme genet, som er beskrevet for human CD 163 (Law, S. K., Micklem, K. J., Shaw, J. M., Zhang, X. P., Dong, Y., Willis, A. C. og Mason, D. Y. (1993), A new macrophage differentiation antigen which is a member of the scavenger receptor superfamily. European Journal of Jmmunology 23 (9), 2320-2325).

Eksempel 8: Kloning og karakterisering av MARC-145 CD163

En foroverprimer 5' ape-CD163 (SEQ ID NO: 28) (5'-CACCGGAATGAGCAAACTCAGAATGG-3' basert på human CD163) og en reversprimer HuCD163-3'Kpn (SEQ ID NO: 29) (5'-TGCTCCGGTACCTAGTCCAGGTCTTCATCAAGGTATCTTA-3') ble anvendt for å amplifisere CD 163 cDNA fra MARC-145 afrikansk grønnape nyreceller. Totalt, cellulært RNA ble fremstilt fra MARC-145 celler ved å anvende RNeasy settet. RT-PCR-parametre var de samme som beskrevet i eksempel 4. RT-PCR-produkter ble direkte klonet inn i pCDNA3.1D/V5/His/TOPO vektor ifølge produsentens instruksjoner. Flere kloner inneholdende store addisjoner ble analysert. Klone nr. 25 ble betegnet "pCDNA3.1D-MARC-CD163v2". Dette nye CD163 cDNA fra MARC-145 celler er 1116 aminosyrer i lengde. Når dette sammenliknes med sekvensene i GenBank database, er MARC-145 CD 163 aminosyresekvens 96,3 % identisk til human CD 163 (Genbank Z22968), 84,7 % identisk til svine-CD163 (Genbank AJ311716), og 73,9 % identisk til muse-CD163 (Genbank AF274883).

Eksempel 9. Kloning og karakterisering av ape CD 163 fra Veroceller

En foroverprimer 5' ape-CD163 (SEQ ID NO: 28)

(5'-CACCGGAATGAGCAAACTCAGAATGG-3' basert på humant CD163) og en reversprimer HuCD163-3'Kpn (SEQ ID NO: 29)

(5'-TGCTCCGGTACCTAGTCCAGGTCTTCATCAAGGTATCTTA-3') ble anvendt for å amplifisere CD 163 cDNA fra Veroceller. Total cellular RNA ble fremstilt fra Veroceller ved anvendelse av RNeasy kit. RT-PCR parametrene var de samme som beskrevet i eksempel 4. RT-PCR-produkter ble retningsbestemt klonet inn i pCDNA3.1D/V5/His/TOPO vektoren i henhold til produsentens instruksjoner. Åtte kloner inneholdende store innskudd ble sekvensert, og seks atskilte spleisemønstre ble funnet. Disse mønstrene er avbildet grafisk i figur 17.

De seks spleisevariantene avviker i nærvær eller fravær av tre exoner, betegnet E6, El 05 og E83. Utelatelser av E6 eller El 05 endret ikke leserammen, mens utelatelse av E83 endret denne. Mønstre liknende v2 og/eller v3 ble også sett i svine, murine, humane og MARC-145 apeceller. Mønstrene v4 og v5 mangler 105-nukleotidexonet som koder den hydrofobe transmembrane region. Disse cDNA'er var ikke i stand til å gjøre BHK-celler permissive for PRRSV-infeksjon i en transient transfeksjonsanalyse, trolig pga. at CD 163 heller er utskilt enn at det forblir membranbundet. Selv om CD 163-molekyler mangler en transmembran region synes å være ikke-funksjonelle som cellulære faktorer for tillatelighet, er det mulig at de kan ha anvendelse i direkte virusnøytralisering (liknende nøytraliserende antistoffer), eller som et immunogen for induksjon av anti-CD 163-antistoffer som vil blokkere virusinfeksjon i vertsdyret.

Den lengste spleisevarianten, v7, inneholder alle tre exonene E6, El 05 og E83. Den nye CD 163 cDNA fra Veroceller koder et polypeptid som er 1153 aminosyrer i lengde. Når den sammenliknes med sekvensene i GenBank databasen er Vero CD163v7 aminosyresekvensen 95,4 % identisk til humant CD 163 (GenBank Z22968), 83,7 % identisk til svine-CD163 (GenBank AJ311716), og 72,1 % identisk til muse-CD163 (GenBank AF274883). Nukleotidet og aminosyresekvensene fra de seks spleisevariantene som er funnet i Veroceller tilveiebringes nedenfor (SEQ ID NOS: 33-44).

Eksempel 10: Kloning og karakterisering av hunde-CD163 fra DH82-celler

En foroverprimer 5' ape-CD163 (SEQ ID NO: 28)

(5'-CACCGGAATGAGCAAACTCAGAATGG-3' basert på humant CD163), og en reversprimer HuCD163-3'Kpn (SEQ ID NO: 29)

(S^GCTCCGGTACCTAGTCCAGGTCTTCATCAAGGTATCTTA-S') ble anvendt for å amplifisere CD 163 cDNA fra DH82-celler. Totalcellulært RNA ble fremstilt fra DH82-celler ved anvendelse av RNeasy settet. RT-PCR-parametre var de samme som beskrevet i eksempel 4. RT-PCR-produkter ble retningsbestemt klonet inn i pCDNA3.1D/V5/His/TOPO vektoren i henhold til produsentens instruksjoner. Flere kloner inneholdende store innskudd ble analysert. Flere kloner med store innskudd ble analysert, og disse falt innenfor enten v2- eller v3-spleisemønstrene sett i andre arter. v2-varianten mangler et 81-nukleotidexon (E81) relativt til v3-varianten, som resulterer i et skift i leserammen, og alternative karboksyterminale aminosyresekvenser. Hunde-CD163v2 cDNA fra DH82-celler koder et peptid på 1115 aminosyrer. Når dette sammenliknes med sekvensene i GenBank database er den 83,9 % identisk til humant CD163 (GenBank Z22968), 85,1 % identisk til svine-CD163 (GenBank AJ311716), og 74,3 % identisk til muse-CD163 (GenBank AF274883). Nukleotid- og aminosyresekvensene av de ti spleisevariantene funnet i DH82-celler, tilveiebringes nedenfor (SEQ ID NOS: 45-48).

Eksempel 11. Forskjellige cellelinjer gjøres permissive for nordamerikansk PRRSV-infeksjon etter transient transfeksjon med pCMV-susCD163vl

Svinenyre (PK032495), Norden Labs Svinetestikler (NLST-1), Norden Labs hundenyre (NLDK-1), ble skaffet fra Pfizer Inc. Og dyrket ved 37 °C og 5 % C02i vekstmedium bestående av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Invitrogen katalog nr. 11965) supplert med 5 % føtalt bovinserum (FBS), 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin og antibiotika. Cellelinjer babyhamsternyre (BHK21), Norden Labs kattenyre (NLFK-1), og kaninlunge (RL), ble skaffet fra Pfizer Inc. og ble dyrket ved 37 °C og 5 % CO2i vekstmedium bestående av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Invitrogen katalog nr. 11965) supplert med 10 % føtalt bovinserum (FBS), 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin og antibiotika. Veroceller ble skaffet fra Pfizer Inc. og ble dyrket ved 37 °C og 5 % CO2i vekstmedium bestående av Minimum Essential Medium Alpha (MEM, Pfizer Inc. formulering) supplert med 10 % føtalt bovinserum (FBS), 2 mM L-glutamin og Gentamicin ved 20 mikrogram/ml. Cellekulturbrønner (35 mm) inneholdende omkring 1 x IO<6>celler ble transfektert med 2 mikrogram/brønn av plasmid pCMV-susCD163vl, i DMEM uten FBS eller antibiotika ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (Invitrogen katalog nr. 11668-027) ifølge produsentens instruksjoner. Cellelinje RL ble transfektert med 1,0 mikrogram/brønn av plasmid pCMV-susCD163vl. Et medlem av PAM-celle cDNA-biblioteket uten et innskudd, betegnet pPAMB (hovedsakelig og tom pSport plasmidvektor), ble anvendt som negativt kontrollplasmid. 24 timer etter transfeksjon ble brønner luftet og vasket to ganger med DMEM/5 % FBS, fulgt av infeksjon med nordamerikansk PRRSV-isolat P129. Virus ble tillatt adsorbert i 0,5 ml vekstmedium i minst to timer, og deretter ble ytterligere medium tilsatt til et sluttvolum på 2,0 ml, og så inkubert over natten. Viruset ble så fjernet, brønner vasket to ganger med vekstmedium, og frisk vekstmedium ble tilført (2,0 ml/brønn). En nulltidsprøve av vekstkulturvæske ble øyeblikkelig tatt for å bestemme bakgrunnsnivået av infeksiøst virus fra podestoffet. Ved et minimum på 48 timer etter ble kulturer screenet for tillatelighet ved å fjerne kulturvæsker for å teste levedyktig virus, og permissive celler i monolaget ble påvist med fluoriserende antistoffanalyse (FA). FA ble fullført ved å fiksere monolaget med 80 % aceton og farget med FITC-konjugert, monoklonalt antistoff SDOW17 (Rural Technologies Inc), som er spesifikt for PRRSV-nukleokapsidproteinet. Levedyktige virus ble titrert med inokkulerende fortynninger av dyrkingsvæsker på MARC-145 celler. Tabell 5 viser resultatene av virusinfeksjon med FA og nærværet av virusavkom for hver testet cellelinje.

Svikt i påvisning av virusavkom fra noen cellelinjer kan være resultatet av lav virustiter i cellekulturvæskene, under testens påvisningsgrense. Tillatelighet av Veroceller for PRRSV-infeksjon ble forsterket ved ekspresjonen av susCD163vl. Sammenliknet med nulltidsmålingen av virusbakgrunn, var det nesten en to-log økning i virustitere i Veroceller transfektert med pCMV-susCD163vl, mens det var mindre enn én-log i titer økning i celler transfektert med negativt kontrollplasmid pPAMB. Alle cellelinjer unntatt NLDK-1 var positive ved FA for tillatelighet for nordamerikansk PRRSV-isolat P129 infeksjon etter transfeksjon med pCMV-susCD163vl.

Eksempel 12. BHK21-celler gjøres permissive for europeisk PRRSV-infeksjon etter transient transfeksjon med pCMV-susCD163vl Cellelinje babyhamsternyre (BHK21) ble skaffet fra Pfizer Inc. og dyrket ved 37 °C og 5 % CO2i vekstmedium bestående av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Invitrogen katalog nr. 11965) supplert med 10 % føtalt bovinserum (FBS), supplert med 10 % føtalt bovinserum (FBS), 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin og antibiotika. Cellekulturbrønner (35 mm) inneholdende omkring 1 x IO<6>celler ble transfektert med 2 mikrogram/brønn av plasmid pCMV-susCD163vl, i DMEM uten FBS eller antibiotika ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (Invitrogen katalog nr. 11668-027) ifølge produsentens instruksjoner. 24 timer etter transfeksjon ble brønner luftet og vasket to ganger med DMEM/5 % FBS, fulgt av infeksjon med europeisk PRRSV-isolat 96V198. Virus ble tillatt adsorbert i minimum 2 timer. Viruset ble så fjernet, brønner vasket to ganger med vekstmedium, og frisk vekstmedium ble tilført (2,0 ml/brønn). En nulltidsprøve av vekstkulturvæske ble øyeblikkelig tatt for å bestemme bakgrunnsnivået av infeksiøst virus fra podestoffet. Ved et minimum på 48 timer etter ble kulturer screenet for tillatelighet ved å fjerne kulturvæsker for å teste levedyktig virus, og permissive celler i monolaget ble påvist med fluoriserende antistoffanalyse (FA). FA ble fullført ved å fiksere monolaget med 80 % aceton og farget med FITC-konjugert, monoklonalt antistoff SDOW17 (Rural Technologies Inc), som er spesifikt for PRRSV-nukleokapsidproteinet. Levedyktige virus ble titrert med inokkulerende fortynninger av dyrkingsvæsker på MARC-145 celler. Som et resultat av den transiente transfeksjonen av BKH21 med pCMV-susCD163vl, ble celler gjort permissive for europeisk PRRSV-isolat 96V198 infeksjon og ga virusavkom.

Eksempel 13: CD163 gener fra flere dyrearter gjør BHK21-celler permissive for PRRS-virusinfeksjon

BHK21-celler dyrket i DMEM (Invitrogen, katalog nr. 11965) supplert med 10 % føtalt bovinserum, 1 mM natriumpyruvat og antibiotika, ble anvendt i transiente transfeksjonseksperimenter. Før transfeksjon ble cellene vasket én gang med OptiMEM (Invitrogen) uten serum eller andre tilsettinger. Lipofectamin 2000 (Invitrogen) ble anvendt i alle transfeksjonseksperimenter i henhold til protokollen gitt av produsenten. Transfeksjonsblandingen besto av 10 ul Lipofectamin 2000 og 2-3 ug DNA/35 mm brønn. Etter inkubasjon over natten ble transfeksjonsmediet fjernet og cellene ble infisert med PRRSV-isolat Pl29. Infeksjon ble tillatt å utvikle seg i 24-48 timer, når cellene ble fiksert med 80 % aceton og farget med monoklonalt antistoff SDOW17, konjugert med FITC (Rural Technology Inc., Brookings, SD). Farging av nukleokapsidproteinet ble visualisert under et fluorescens mikroskop.

Eksempel 14. Generering av PRRSV-permissive BHK21-stabile cellelinjer ved anvendelse av pCMV-susCD163vl

BHK-21 celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10 % føtalt bovinserum, 1 mM natriumpyruvat og antibiotika. For transfeksjon ble celler utsådd ved omkring 90 % konfluens i 6 brønns plater og inkubert over natten i 37 °C i 5 % C02. Cellene ble transfektert med pCMV-susCD163vl DNA ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (Invitrogen), ifølge produsentens instruksjoner. En dag etter transfeksjon ble cellene trypsinert og igjen utsådd i 96 brønnsplater i en fortynningsserie. For valg av stabile transfektanter ble mediet supplert med 1 mg/ml Geneticin (G418-sulfat, Invitrogen, katalog nr. 10131-027) fra dette punkt og fremover. Medium ble skiftet hver 3-5 dager. Platene ble dyrket inntil de brønnene med avledete kolonier fra enkelt celler oppnådde konfluens, på hvilket punkt platene ble trypsinert og utsådd i duplikat 96 brønns plater. En av duplikat 96 brønnsplatene ble infisert med PRRSV-isolat Pl29, og kloner som tillater infeksjon ble identifisert ved farging med FITC konjugert monoklonalt antistoff SDOW17. Positive kloner ble så ekspandert fra den andre duplikatplaten. For å sikre homogenisitet ble de positive kulturene enkelt-celle klonet ved begrensende fortynning. Ved hver kloning ble subklonene som viste kraftig vekst og høy PRRSV tillatelighet valgt for ekspansjon. Tre kloner betegnet BHK/CMV/vl nr. 3, BHK/CMV/vl nr. 5, og BHK/CMV/vl nr. 12 (figur 6) ble valgt. Disse cellelinjene har opprettholdt den permissive fenotypen gjennom 20 passasjer.

Eksempel 15. Generering av PRRSV-permissive BHK21 stabile cellelinjer ved anvendelse av pRSV-susCD163vl

BHK-21 celler ble dyrket som beskrevet i eksempel 14. BHK-21 celler ble transfektert med pRSVsusCD163vl ved anvendelse av Lipofectamin 2000, som beskrevet i eksempel 14. Kloning av transfekterte celler og screening for permissive kloner ble utført hovedsakelig som beskrevet i eksempel 14. Fra den opprinnelige kloning ble tre enkle cellekloner identifisert som permissive, og ble så klonet på nytt to ganger for å sikre homogenisitet og for å forsøke å isolere subkloner med større tillatelighet (se figur 7). De resulterende cellelinjene ble betegnet BHK/RSV/vl, nr. 2, nr. 3 og nr. 4. Alle disse klonene har opprettholdt den permissive fenotypen gjennom den høyeste passeringen som ble testet (passering 11 for klon nr. 2, passering 7 for klon nr. 3 og passering 5 for klon nr. 4).

Eksempel 16. Generering av PRRSV-permissive kattenyrestabile cellelinjer ved anvendelse av pRSV-susCD163vl

Parentale Norden Labs kattenyre (NLFK) celler ble dyrket i 37 °C og 5 % C02i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Invitrogen katalog nr. 11965-092), supplert med 10 % føtalt bovinserum, 1 mM natriumpyruvat og antibiotika. Flere 35 mm brønner inneholdende omkring 2 x IO<6>celler hver, ble transfektert med 4 ug/brønn av pCMV-susCD163vl, i OptiMEM ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (Invitrogen katalog nr. 11668-027) ifølge produsentens instruksjoner. Etter inkubasjon over natten ble cellene fjernet fra substratet ved anvendelse av Accutase (Innovative Cell Technologies, katalog nr. AT 104), fortynnet i medium og utsådd i tre 96-brønnsplater med tre tettheter (omkring 2x102 ,2x10 3 og 2x10 4 celler/brønn). Cellene ble tillatt å o sette seg over natten i 37 °C før utvelgelse av stabile transformanter. Neste morgen ble mediet erstattet 100 ul/brønn friskt medium inneholdende 500 ug/ml Geneticin (G418-sulfat, Invitrogen katalog nr. 10131-027) for å velge celler som uttrykker neomycin resistensgenet. Medium ble byttet hver 2. eller 3. dag for å opprettholde virkevnen til Geneticin. Etter 19 dager med utvelgelse, ga 96-brønnsplaten med den lavest startende celletettheten (omkring 200 celler/brønn) 70 tomme brønner og 26 brønner med én eller flere kolonier med G418-resistente celler (beregnet antall resistente celler/brønn er 0,3, ved anvendelse av fordelingsnøkkelen til Poisson). Disse 26 brønnene ble splittet i duplikate brønner og tillatt å sette seg over natten. Ett sett av brønner ble infisert med PRRSV-isolat Pl29, inkubert i 24 timer, og så fiksert med 80 % aceton, og farget med FITC-konjugert monoklonalt antistoff SDOW17 (Rural Technologies Inc), som er spesifikt for PRRSV nukleokapsid. Av de 26 klonene inneholdt 8 noen celler infisert av PRRSV. Én av disse, betegnet "NLFK-CMV-susCD163vl-G4", ble klart mer permissive enn de andre med nær 100 % av cellene farget positive for viralt antigen.

Ved cellepasseringsnummer 5 var det noe bevis for fenotypisk heterogenisitet i NLFK-CMV-susCD163vl-G4 cellelinjen. Cellene ble derfor enkelt-celleklonet ved begrensende fortynning i G418-inneholdende medium, som startet med frosset lager av NLFK-CMV-susCD163vl-G4 passasje 4. Tolv slike kloner ("A"-"L") ble ekspandert for studier. Av disse ble klonene NLFK-CMV-susCD163vl-G4F og NLFK-CMV-susCD163vl-G4L bemerket for sin evne til å danne atskilte plakk (lokaliserte områder av CPE) når de ble infisert PRRSV-isolat Pl29 (se figur 8).

Eksempel 17. Generering av PRRSV-permissive kattenyrestabile cellelinjer ved anvendelse av pRSV-susCD163vl

Norden Labs kattenyre (NLFK) celler ble dyrket i 37 °C og 5 % C02i Minimal Essential Medium Alpha Medium (Invitrogen katalog nr. 12571-071) supplert med 10 % føtalt bovinserum og antibiotika. NLFK-celler ble utsådd i 6-brønnsplater ved omkring 90 % konfluens og tillatt å feste seg over natten. Cellene ble så transfektert med plasmid pRSV-susCD163vl ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (Invitrogen), ved å følge produsentens instruksjoner. Etter 24 timer ble cellene klonet som beskrevet i eksempel 14. Screening for PRRSV- permissive cellekloner ble utført som beskrevet i eksempel 14. Fire kloner ble valgt fra screening, og ble enkeltcelleklonet ved begrensende fortynning to eller flere ganger. Fire kloner betegnet FK/RSV/vl nr. 1, FK/RSV/vl nr. 2, FK/RSV/vl nr. 3 og FK/RSV/vl nr. 4 ble valgt. Disse cellelinjene har opprettholdt den PRRSV-permissive fenotypen gjennom minst åtte passasjer (se figur 9).

Eksempel 18. Generering av PRRSV-permissive svinenyrestabile cellelinjer ved anvendelse av pCMV-susCD163vl

Parenterale svinenyre (PK032495) celler ble skaffet fra Pfizer Inc., og ble dyrket i 37 °C og 5 % C02i vekstmedium bestående av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Invitrogen katalog nr. 11965) supplert med 5 % føtalt bovinserum (FBS), 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin og antibiotika. Vevskulturbrønner (35 mm) inneholdende omkring 1 x IO6 celler hver, ble transfektert med 2 ug/brønn av plasmid pCMV-susCD163vl, i DMEM uten FBS eller antibiotika, ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (Invitrogen katalog nr. 11668-027) ifølge produsentens instruksjoner. Etter inkubasjon over natten ble cellene vasket med PBS og fjernet fra substratet ved anvendelse av Accutase (Innovative Cells Technologies, katalog nr. ATI 04), og fortynnet i vekstmedium inneholdende Geneticin (G418-sulfat, Invitrogen katalog nr. 10131-027) i 1,0 mg/ml og utsådd i 96-brønns plater med varierende tetthet for å sikre gjenvinning av enkeltcellekloner etter Geneticin utvelgelse. Ved Geneticin utvelgelse ble medium byttet omkring hver 3. til 5. dag. Etter utvelgelse ble brønner inneholdende enkeltcellekloner ekspandert til duplikat 96-brønns plater og tillatt inkubert inntil 100 % konfluens var oppnådd. Ett sett brønner ble screenet for PRRSV-tillatelighet ved å infisere med PRRSV-isolat Pl29 i minimum 48 timer. Elleve kloner ble funnet å være permissive for PRRSV. Én av disse, betegnet "PK-CMV- susCD163vl-A10", beholdt tydelig den permissive fenotypen etter mange passasjer (se figur 10).

Eksempel 19. Generering av PRRSV-permissive BHK21 stabile cellelinjer ved anvendelse av pCMVScript-susCD163v2

Parenterale babyhamsternyre (BHK21) celler ble skaffet fra Pfizer Inc., og ble dyrket i 37 °C og 5 % CO2i vekstmedium bestående av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Invitrogen katalog nr. 11965) supplert med 10 % føtalt bovinserum (FBS), 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin og antibiotika. Vevskulturbrønner (35 mm) inneholdende omkring 1 x IO<6>celler hver, ble transfektert med 2 ug/brønn av pCMVScript-susCD163v2, i DMEM uten FBS eller antibiotika, ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (Invitrogen katalog nr. 11668-027) ifølge produsentens instruksjoner. Etter inkubasjon over natten ble cellene vasket med PBS og fjernet fra substratet ved anvendelse av Accutase (Innovative Cells Technologies, katalog nr. ATI 04), og fortynnet i vekstmedium inneholdende Geneticin (G418-sulfat, Invitrogen katalog nr. 10131-027) i 1,0 mg/ml og utsådd i 96-brønns plater med varierende tetthet for å sikre gjenvinning av enkeltcellekloner etter Geneticin utvelgelse. Ved Geneticin utvelgelse ble medium byttet omkring hver 3. til 5. dag. Etter utvelgelse ble brønner inneholdende enkeltcellekloner ekspandert til duplikat 96-brønns plater og tillatt inkubert inntil 100 % konfluens var oppnådd. Ett sett brønner ble screenet for tillatelighet ved å infisere med PRRSV-isolat Pl29, og inkubert i minimum 48 timer. Tre kloner ble funnet å være PRRSV-permissive, og én av disse, betegnet "BHK-CMVScript-susCD163v2-A9", ble valgt for videre studie (se figur 11).

Eksempel 20. Generering av PRRSV-permissive BHK21 stabile cellelinjer ved anvendelse av pRSV-susCD163v2

BHK-21-celler ble dyrket som beskrevet i eksempel 14. BHK-21-celler ble transfektert med den ligerte pRSV-susCD163v2 DNA konstruksjonen, beskrevet i eksempel 5 ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (Invitrogen) ved å følge produsentens instruksjoner. Påfølgende kloning og utvelgelse av PRRSV-permissive cellelinjer ble utført som beskrevet i eksempel 14. Av 336 enkeltcellekloner som ble screenet, var 129 positive. Flere av disse celleklonene har passert opptil 7 ganger, og har opprettholdt den PRRSV-permissive fenotype (se figur 12). Disse cellelinjene har fått betegnelsen BHK/RSV/v2, fulgt av et numerisk klon-nummer.

Eksempel 21. Generering av PRRSV-permissive svinenyrestabile cellelinjer ved anvendelse av pCMVScript-susCD163v2

Parenterale svinenyre (PK032495) celler ble skaffet fra Pfizer Inc., og ble dyrket i 37 °C og 5 % CO2i vekstmedium bestående av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Invitrogen katalog nr. 11965) supplert med 5 % føtalt bovinserum (FBS), 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin og antibiotika. Vevskulturbrønner (35 mm) inneholdende omkring 1 x IO<6>celler hver, ble transfektert med 2 ug/brønn av plasmid pCMVScript-susCD163v2, i DMEM uten FBS eller antibiotika, ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (Invitrogen katalog nr. 11668-027) ifølge produsentens instruksjoner. Etter inkubasjon over natten ble cellene vasket med PBS og fjernet fra substratet ved anvendelse av Accutase (Innovative Cells Technologies, katalog nr. ATI 04), og fortynnet i vekstmedium inneholdende Geneticin (G418-sulfat, Invitrogen katalog nr. 10131-027) i 1,0 mg/ml og utsådd i 96-brønns plater med varierende tetthet for å sikre gjenvinning av enkeltcellekloner etter Geneticin utvelgelse. Ved Geneticin utvelgelse ble medium byttet omkring hver 3. til 5. dag. Etter utvelgelse ble brønner inneholdende enkeltcellekloner ekspandert i duplikat 96-brønns plater og tillatt inkubert inntil 100 % konfluens var oppnådd. Ett sett brønner ble screenet for tillatelighet ved å infisere med PRRSV-isolat Pl29, og inkubert i minimum 48 timer. En klon, betegnet "PK-CMVScript-susCD163v2-Dl", viste den permissive PRRSV-fenotypen.

Eksempel 22. Generering av PRRSV-permissive BHK21 stabile cellelinjer ved anvendelse av pcDNA3.1D-humCD163v2

Parenterale babyhamsternyre (BHK21) celler ble skaffet fra Pfizer Inc., og ble dyrket i 37 °C og 5 % CO2i vekstmedium bestående av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Invitrogen katalog nr. 11965), supplert med 10 % føtalt bovinserum (FBS),

1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin og antibiotika. Vevskulturbrønner (35 mm) inneholdende omkring 1 x IO<6>celler hver, ble transfektert med 2 ug/brønn av pcDNA3.1D-humCD163v2, i DMEM uten FBS eller antibiotika, ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (Invitrogen katalog nr. 11668-027) ifølge produsentens instruksjoner. Etter inkubasjon over natten ble cellene vasket med PBS og fjernet fra substratet ved anvendelse av Accutase (Innovative Cells Technologies, katalog nr. ATI 04), og fortynnet i vekstmedium inneholdende Geneticin (G418-sulfat, Invitrogen katalog nr. 10131-027) i 1,0 mg/ml og utsådd i 96-brønns plater med varierende tetthet for å sikre gjenvinning av enkeltcellekloner etter Geneticin utvelgelse. Ved Geneticin utvelgelse ble medium byttet omkring hver 3. til 5. dag. Etter utvelgelse ble brønner

inneholdende enkeltcellekloner ekspandert til duplikat 96-brønns plater og tillatt inkubert inntil 100 % konfluens var oppnådd. Ett sett brønner ble screenet for tillatelighet ved å infisere med PRRSV-isolat Pl29, og inkubert i minimum 48 timer. Syv kandidatkloner ble funnet å være PRRSV-permissive. Det var noe bevis for fenotypisk heterogenisitet i hver av de syv kandidatklonene, trolig pga. at de ikke var klonale. Derfor ble kandidatklonene enkelcelleklonet med begrensende fortynning i G418-inneholdende medium. En enkel celleklon med PRRSV-tillatelighet ble oppnådd og fikk betegnelsen BHK-cDNA3.1D-humCD163v2-H9". Eksempel 23. Generering av PRRSV-permissive kattenyrestabile cellelinjer ved anvendelse av pcDNA3.1D-humCD163v2 Parenterale Norden Labs kattenyre (NLFK) celler ble dyrket i 37 °C og 5 % C02i vekstmedium bestående av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Invitrogen katalog nr. 11965) supplert med 10 % føtalt bovinserum (FBS), 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin og antibiotika. Vevskulturbrønner (35 mm) inneholdende omkring 1 x IO6 celler hver, ble transfektert med 2 ug/brønn av pcDNA3. lD-humCD163v2 i DMEM uten FBS eller antibiotika, ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (Invitrogen katalog nr. 11668-027) ifølge produsentens instruksjoner. Etter inkubasjon over natten ble cellene vasket med PBS, fjernet fra substratet ved anvendelse av Accutase (Innovative Cells Technologies, katalog nr. AT 104), og fortynnet i vekstmedium inneholdende Geneticin (G418-sulfat, Invitrogen katalog nr. 10131-027) i 500 ug/ml og utsådd i 96-brønns plater med varierende tetthet for å sikre gjenvinning av enkeltcellekloner etter Geneticin utvelgelse. Ved Geneticin utvelgelse ble medium byttet omkring hver 3. til 5. dag. Etter utvelgelse ble brønner inneholdende enkeltcellekloner ekspandert i duplikat 96-brønns plater og tillatt inkubert inntil 100 % konfluens var oppnådd. Ett sett brønner ble screenet for PRRSV-tillatelighet ved å infisere med PRRSV-isolat Pl29 i minimum 48 timer. Fem kloner ble funnet å være permissive. Én av disse, betegnet "FK-cDNA3.1D-humCD163v2-A6", viste tydelig den permissive fenotypen (se figur 13).

NLFK moderceller og én subklon av FK-cDNA3.1D-humCD163v2-A6 ble undersøkt for CD163-ekspresjon. Celler ble fiksert i 80 % aceton og reagert med geite anti-humant CD163 (R & D system i 1:200) i én time, fulgt av vasking med PBS. For visualisering ble det benyttet esel anti-geite-IgG konjugert med FITC (Biodesign, Inc. i 1:100). Ingen spesifikk fluorescens ble påvist i NLFK modercellene, som vist i figur 21S. Hovedandelen av FK.A6.A2 subklonen viste god fluorescensfarging, som indikerer nærvær av CD163 (figur 21B).

Eksempel 24. Generering av PRRSV-permissive svinenyrestabile cellelinjer ved anvendelse av pcDNA3.1D-humCD163v2

Parenterale svinenyre (PK032495) celler ble skaffet fra Pfizer Inc., og ble dyrket i 37 °C og 5 % CO2i vekstmedium bestående av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Invitrogen katalog nr. 11965) supplert med 5 % føtalt bovinserum (FBS), 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin og antibiotika. Vevskulturbrønner (35 mm) inneholdende omkring 1 x IO6 celler hver, ble transfektert med 2 ug/brønn av pcDNA3. lD-humCD163v2 i DMEM uten FBS eller antibiotika, ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (Invitrogen katalog nr. 11668-027) ifølge produsentens instruksjoner. Etter inkubasjon over natten ble cellene vasket med PBS, fjernet fra substratet ved anvendelse av Accutase (Innovative Cells Technologies, katalog nr. ATI 04), og fortynnet i vekstmedium inneholdende Geneticin (G418-sulfat, Invitrogen katalog nr. 10131-027) i 1,0 mg/ml og utsådd i 96-brønns plater med varierende tetthet for å sikre gjenvinning av enkeltcellekloner etter Geneticin utvelgelse. Ved Geneticin utvelgelse ble medium byttet omkring hver 3. til 5. dag. Etter utvelgelse ble brønner inneholdende enkeltcellekloner ekspandert i duplikat 96-brønns plater og tillatt inkubert inntil 100 % konfluens var oppnådd. Ett sett brønner ble screenet for PRRSV-tillatelighet ved å infisere med PRRSV-isolat Pl29, og inkubert i minimum 48 timer. To kloner ble funnet å være permissive. En av disse, betegnet "PK-cDNA3.1D-humCD163v2-Bl 1", viste klart den permissive PRRSV-fenotypen.

Eksempel 25. Generering av PRRSV-permissive kattenyrestabile cellelinjer ved anvendelse av ligert pRSV-Script MARC CD163v2

En ikke-kloningsbasert fremgangsmåte for å generere mikrogrammengder av lineært DNA, egnet for anvendelse i å generere stabile cellelinjer som uttrykker CD 163 fra en RSV-promoter ble utviklet (figur 4). En liknende fremgangsmåte ble tilpasset for å plassere ape CD163v2 fra MARC-145 celler bak RSV-promoteren. Fremgangsmåten involverer isolering og ligering av to biter DNA, én inneholdende neomycingenet og RSV-promoterkassetten avledet fra pRSV-script, og den andre inneholdende den MARC CD163v2-kodende sekvensen fra pCDNA3.1D MARC CD163v2. Vektorplasmid pRSV-Script ble linearisert med HindEI og Kpnl. Plasmid ble først fordøyd med Kpnl og ble gjort butt med Klenow-fragmentet av E. coli DNA- polymerase. Dette plasmidet ble så fordøyd med HindRI øyeblikkelig nedstrøms for RSV-promoteren. pCDNA3.1D MARC CD163v2-klonen ble fordøyd i vektorsekvensen nedstrøms for CD 163 innskuddet med EcoRV, og HindUl oppstrøms for CD 163. Den CD 163-kodende sekvensen ble frigjort fra vektoren. For hver plasmidfordøying ble de hensiktsmessige fragmentene renset fra agarosegeler. En storskala ligeringsreaksjon ble utført som følger. Omkring 20 \ ig av hvert DNA-fragment ble inkubert med et volum på 600 ul med 15 enheter av T4-DNA-ligase. Reaksjonen ble inkubert i romtemperatur i én time. Etter ligering ble en lineær bit av DNA inneholdende alle de hensiktsmessige elementene renset ved agarosegelelektroforese. Restriksjonsenzymfordøyingsanalyse ble utført for å bekrefte påliteligheten av hvert ligert fragment. Ligering av de to DNA-fragmentene via de kohesive HindlR- eridene resulterte i plassering av de 5' sekvensene av MARC CD 163-genet nedstrøms for RSV-promoteren, som tillater styrt ekspresjon av CD 163 i pattedyrceller. Straks isolert ble det rensete DNA anvendt for å transfektere utvalgte pattedyrcellelinjer.

Norden Labs kattenyre (NLFK) celler ble dyrket i 37 °C og 5 % C02i DMEM, supplert med 5 % føtalt bovinserum og antibiotika. NLFK-celler ble utsådd i 6-brønnsplater med omkring 90 % konfluens og tillatt å feste seg over natten. Cellene ble så transfektert med ligert plasmid pRSV-MARC CD163v2 ved anvendelse av Lipofectamin 2000 ved å følge produsentens instruksjoner. Etter 24 timer ble cellene klonet som beskrevet i eksempel 12. Screening av PRRSV-permissive cellekloner ble utført som beskrevet i eksempel 12. En klon var positiv for PRRSV-infeksjon og ble betegnet NLFK-MARC CD163-D4. Denne D4-klonen har opprettholdt den PRRSV-permissive fenotypen gjennom ni passasjer.

Eksempel 26. Dyrkingskinetikker av PRRSV-isolat NVSL 94-3 i rekombinante BHK-21- og NLFK-celler som stabilt uttrykker susCD163vl fra CMV-promoteren

Mengden av virusavkom produsert ved PRRSV-infiserte BHK-21- eller NLFK-celler stabilt konstruert til å uttrykke susCD163vl, ble kvantifisert. Fire cellelinjer som uttrykker susCD163vl, BHK/CMV/susvl nr. 3, BHK/CMV/susvl nr. 5, BHK/CMV/susvl nr. 12 og FK/CMV/susvl G4 ble utsådd ved underkonfluens i 6 brønnsplater, og etter inkubering over natten infisert med NVSL 94-3 isolatet av PRRSV. MARC-145-celler ble inkludert i eksperimentet for sammenlikning. Cellene ble infisert med virus ved en m.o.i. på omkring 0,1. Virus ble adsorbert i 60-90 minutter og ble fjernet. Cellene ble vasket tre ganger med PBS for å fjerne gjenværende virus. En ml alikvoter ble høstet fra kulturene med 12-timers intervall, som startet straks etter infeksjon og fortsatte i 96 timer. Frisk kulturmedium ble tilsatt cellene på forskjellige tidspunkter for å opprettholde et kulturvolum tilstrekkelig for å hindre uttørking av cellemonolaget. Dyrkingssupernatanter ble lagret ved -80 °C inntil alle prøver var samlet. Mengden PRRSV til stede i dyrkingssupernatantene ble bestemt ved plakkanalyse på MARC-145-celler. Figur 14 viser at alle CD 163-uttrykkende, rekombinante cellelinjer som ble testet var i stand til å produsere avkom av PRRSV.

Eksempel 27. Blokkering av PR RS\ -infeksjon med anti-CD 163-an ti stoff: Forbigående transfekterte celler

BHK-21-celler, utsådd i 24-brønns plater, ble forbigående transfektert med plasmid pCDNA3.1D-MARC-CD163v2, beskrevet i eksempel 8, ved anvendelse av Lipofectamin 2000, som beskrevet i eksempel 14. Etter inkubasjon over natten for å tillate ekspresjon av CD 163, ble en titrering av geitepolyklonalt antistoff, spesifikt for human CD163 (R & D Systems, kat. nr. AF1607) i PBS, tilsatt cellene i et volum på 100 ul. Som kontroll ble like mengder av normalt geite-IgG (R & D Systems, kat. nr. AB-108-C) anvendt. Etter inkubasjon i én time ved 37 °C ble monolagene infisert med omkring 1 x IO<7>pfu av en rekombinant P129-stamme av PRRSV som uttrykker GFP. Cellemonolagene med anti-CD 163-antistoff og PRRSV, ble inkubert i 37 °C i én time, og så ble virus podestoff/antistoff-blandingen luftet, cellemonolaget vasket en gang med PBS, og 1 ml dyrkingsmedium ble tilsatt brønnene. Cellene ble inkubert i 24 timer i 37 °C for å tillate PRRSV-styrt GFP-ekspresjon. For analyse ble cellene trypsinert, resuspendert i 500 ul PBS og analysert med flow-cytometri for å tallfeste de PRRSV-infiserte cellene via GFP-ekspresjon. For flow-cytometri ble ikke-infiserte BHK-21-celler anvendt for å sette grunnlinjen for fluorescens påvis ing, og omkring 100000 celler ble analysert fra hver påfølgende prøve. Resultatene fra denne analysen, vist i figur 15, viser at CD 163 spesifikt antistoff var i stand til å betydelig redusere antall infiserte celler ved sammenlikning med celler inkubert med normal geite-IgG.

Eksempel 28: Blokkering av PRRSV infeksjon med anti-CD 163-antistoff:

Stabilt transfekterte celler

NLFK-celler som stabilt uttrykker humant CD 163 (FK-cDNA3.1D-humCD163v2-A6), beskrevet i eksempel 23, ble utsådd i 24-brønners plater. Etter at cellene ble tillatt å feste seg over natten ble en titrering av geitepolyklonalt antistoff spesifikt for humant CD163 (R & D Systems, kat, nr. AF1607) i PBS, tilsatt cellene i et volum på 100 ul. Som kontroll ble like mengder av normalt geite-IgG (R & D Systems, kat. nr. AB-108- C) anvendt. Etter én times inkubasjon i 37 °C ble monolagene infisert med omkring 1 x 10' pfu av en rekombinant P129-stamme av PRRSV som uttrykker GFP. Celle monolag med anti-CD 163-antistoff og PRRSV ble inkubert i 37 °C i en time, og så ble virus podestoff/antistoff-blandingen luftet, cellemonolaget vasket én gang med PBS, og 1 ml vekstmedium ble tilsatt brønnene. Cellene ble inkubert i 24 timer i 37 °C for å tillate PRRSV-styrt GFP-ekspresjon. For analyse ble cellene trypsinert, resuspendert i 500 ul PBS, og analysert med flow-cytometri for å tallfeste de PRRSV-infiserte cellene via GFP-ekspresjon. Omkring 100000 celler ble analysert fra hver prøve. Resultatene fra denne analysen, vist i figur 16, viste at det CD 163 spesifikke antistoff var i stand til å betydelig redusere antall infiserte celler når de ble sammenliknet med celler inkubert med normalt geite-IgG.

Eksempel 29. Generering av PRRSV-permissive svinenyrestabile cellelinjer ved anvendelse av pRSV-susCD163v2

Svinenyreceller (PK032495) ble dyrket som beskrevet i eksempel 21. For transfeksjon ble celler utsådd i en 24-brønns plate med 80 % konfluens, og tillatt å ta seg inn over natten. Transfeksjon av ligert pRSV-susCD163v2 DNA, beskrevet i eksempel 5, ble gjennomført ved anvendelse av Lipofectamin 2000 (Invitrogen) ved å følge produsentens instruksjoner. Påfølgende kloning og utvelgelse av PRRSV-permissive celler ble hovedsakelig utført som beskrevet i eksempel 14. Den innledende kloningen ved begrensende fortynning mislyktes i å gi enkeltcelleavledete kloner, så fem brønner med PRRSV-permissive celler ble klonet pånytt ved begrensende fortynning for å gi klonale cellelinjer. Ti kloner ble utvalgt for videre studier, og én av disse klonene, PK-RSVScript-susCD163v2 nr. 9, viste evne til å støtte foci vekst av PRRSV tidlig etter infeksjon (se figur 18).

Eksempel 30. Generering av PRRSV-permissive kattenyrestabile cellelinjer ved anvendelse av pRSV-susCD163v2

NLFK-kattenyreceller ble dyrket som beskrevet i eksempel 17. For transfeksjon ble celler utsådd med omkring 80 % av maksimal tetthet i 24-brønns plater. Etter inkubasjon over natten ble monolagene transfektert med ligeringsutledet RSV/susCD163v2 (se eksempel 5) ved anvendelse av Lipofectamin ved å følge produsentens instruksjoner. Kloning av de transfekterte cellene og valg av PRRSV-permissive cellekloner ble utført hovedsakelig som beskrevet i eksempel 14. Av de 67 celleklonene som ble testet for PRRSV-tillatelighet, ble 20 funnet å være positive. Et eksempel på den observerte fargingen er vist i figur 19.

Eksempel 31. Passering av PRRSV-isolat P201 i PK-RSVScript-susCD163v2 celler

Amplifisering av et PRRSV klinisk isolat ble utført som følger. Perifere alveolærmakrofag (PAM) celler ble utsådd på 5.4E6-celler pr. 10 cm<2>i en 6-brønns plate ved anvendelse av OptiMEM media, supplert med 2 % FBS. Etter 6 timer ble mediet luftet, og en 2 ml alikvot av serum høstet fra en PRRSV-infisert gris ble tilsatt cellene. Etter 90 minutters adsorpsjon ble serumpodestoffet fjernet og erstattet med OptiMEM. Omkring 40 timer etter infeksjon ble supernatanten høstet og gjort klar med 10 minutters sentrifugering. Supernatanten ble direkte anvendt for å infisere PK-RSVScript-susCD163v2 klon nr. 9 celler, ved anvendelse av 6 timers adsorpsjon. Etter fjerning av podestoffet ble cellene foret med D-MEM. P201-viruset ble passert i serie på PK-RSVScript-susCD163v2 nr. 9 cellelinjen ved anvendelse av alternerende infisert celle og cellefri supernatant passasjer. Oppfinnerne observerte at effektiv spredning av viruset best ble gjort ved utsåing av cellene ved 50-70 % konfluens dagen før infeksjon ved anvendelse av kolber med celler som ble holdt ved underkonfluens. For å følge infeksjonsutviklingen ble hver passering reprodusert i flere brønner av identisk infiserte celler, og hver dag ble en av brønnene acetonfiksert og farget med det FITC-merkete, monoklonale antistoffet SDOW17. Dersom prosentandelen infiserte celler ikke var mer enn 50 %, og det ikke ble observert betydelig utvikling av foci i de foregående dagene, ble cellene i en ekvivalent brønn trypsinert og passert til flere nye brønner. Disse infiserte cellepasseringene var vanligvis på 1:4 splitting, og inkluderte noen ganger tilføying av et ekvivalent antall celler fra en ikke-infisert kultur. Alternativt, om SDOW17-fargingen viste at de infiserte celle foci hadde spredd seg tilstrekkelig for å utgjøre mer enn 50 % av de totale cellene, ble cellefri supernatant høstet og benyttet for å infisere flere brønner av nylig utsådde celler (figur 20). Etter 11 passasjer var de mellomliggende cellepassasjer ikke nødvendige, ettersom viruset var i stand til å vokse til tilstrekkelig titer for å tillate påfølgende cellefri supernatantpassering av viruset.

Eksempel 32. Screening av ulike CD163 cellelinjer for tillatelighet for ulike europeiske og nordamerikanske PRRSV-isolater

Ulike CD 163 transgene cellelinjer ble vurdert for tillatelighet for å tillate passering av europeiske og nordamerikanske PRRSV-isolater (se tabell 7). Transgene CD 163-cellelinjer, som beskrevet i tidligere eksempler inkluderte NLFK-MARC CD 163 D4, PK-RSVScript-susCD163v2clone nr. 9 og PK-CMV-susCD163vl-A10. Hver CD163-cellelinje sammen med MARC-145 cellelinjer, parentale kattenyre-, parentale svinenyrecellelinjer (tjener som kontroller), ble utplatet i 96-brønns vevskulturplater. Vekstmedia ble fjernet fra monolagene og inokkulert med 0,1 ml/brønn av hvert PRRSV-isolat. Tre dager etter infeksjon ble platene fiksert med 80 % aceton og farget med FITC-konjugert, monoklonalt antistoff SDOW17 (Rural Technologies Inc.), som er spesifikt for nukleokapsidet. Resultater av den fluorescerende antistoff (FA) analysen er vist i tabell 7.

Eksempel 33. Forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) induksjon av CD163 gjør humane U937-celler tillatelige for PRRSV-infeksjon

Humane U937-celler skaffet fra ATCC (CRL-1593.2), ble formert i RPMI-mediuminneholdende serum og tilsettinger i henhold til ATCC spesifikasjoner. Disse cellene er kjent for å uttrykke CD 163 når de aktiveres ved PMA behandling (Gronlund et al, 2000). U937-celler ble utsådd i duplikat i brønner i en 6-brønns plate. Ett sett brønner ble behandlet med 100 ng/ml PMA, mens det andre settet var ubehandlet. Tre dager etter PMA-stimulering ble en brønn fra hvert sett infisert med P129-isolatet av PRRSV. Den andre brønnen fra hvert sett ble fiksert og farget for ekspresjon av CD 163 i en indirekte immunfluoriserende antistofftest ved anvendelse av geite-antihumant CD 163 (R & D System), og esel anti-geite-IgG, konjugert med FITC (BioDesign International).

Ubehandlete U937-celler fortsatte formering til høy tetthet tre dager etter innledende utplating. PMA-behandlete U937-celler stoppet formering, ble forstørrete, og festet til dyrkingsbrønnenes overflate. En liten fraksjon av ubehandlete U937-celler var positive for CD 163-farging, mens nesten alle PMA-behandlete U937-celler var positive for CD 163-farging. I ubehandlete U937-celler ble ingen PRRS V-infiserte celler observert. Hundrevis av PMA-behandlete U937-celler ble imidlertid infisert av PRRSV. Dette viser at ikke-permissive celler kan gjøres permissive for PRRSV-infeksjon etter kjemisk induksjon av CD163-ekspresjon.

Ytterligere særtrekk og variasjoner av oppfinnelsen vil være tydelige for den som er øvet i fagfeltet, ifølge helheten av denne søknaden, som inkluderer den detaljerte beskrivelsen, og alle slike særtrekk er ment som aspekter av oppfinnelsen. Særtrekk av oppfinnelsen beskrevet heri, kan likeledes rekombineres til flere utførelsesformer, som også er ment som aspekter ved oppfinnelsen, uten hensyn til hvorvidt kombinasjon av særtrekk er nevnt ovenfor som et aspekt eller en utførelsesform ifølge oppfinnelsen. Bare slike begrensninger som er beskrevet heri som kritiske for oppfinnelsen, bør ses på som slike; variasjoner av oppfinnelsen som mangler begrensninger som ikke er beskrevet heri som kritiske, er ment som aspekter av oppfinnelsen.

Det vil være klart at oppfinnelsen kan praktiseres på annet måte enn som er spesielt beskrevet i den foregående beskrivelsen og eksemplene.

Tallrike modifikasjoner og variasjoner av den foreliggende oppfinnelse er mulig, i lys av de ovenfor beskrevne belæringer, og er derfor innenfor oppfinnelsens rekkevidde.

Den fullstendige angivelse av alle publikasjoner sitert heri, er herved inkorporert ved referanse i den grad at de ikke er inkonsekvente for angivelsen heri.

Claims

1. In vitro fremgangsmåte for å fremme infeksjon i en virveldyrcelle med PRRSV,karakterisert vedat den omfatter trinnet av å (a) styre økt ekspresjon av et CD163-polypeptid i nevnte virveldyrcelle, der nevnte CD 163-polypeptid omfatter et transmembrandoméne og der nevnte økte ekspresjon gjennomføres ved introduksjon av eksogen nukleinsyre.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den ytterligere omfatter å infisere nevnte celle med PRRSV.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den ytterligere omfatter å produsere en kultur av PRRSV.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte celle er pattedyrcelle.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte celle var ikke permissive for PRRSV og er gjort permissive for PRRSV ved trinn (a).

6. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert vedat PRRSV er av den europeiske genotypen.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert vedat PRRSV er av den nordamerikanske genotypen.

8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 2-10,karakterisert vedat den videre omfatter trinnet av å produsere en PRRSV-vaksine.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisert vedat vaksinen er død.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisert vedat vaksinen er levende attenuert.

11. Fremgangsmåte for å måle tilbøyeligheten av at en testcellelinje for å tillate PRRSV-infeksjon,karakterisert vedat den omfatter: a) å tilveiebringe en prøve inneholdende nukleinsyrer fra testcellelinjen; b) å bestemme mengden polynukleotid som koder et CD 163-polypeptid eller dets komplement i nevnte prøve; hvori en økt mengde av polynukleotid som koder et CD 163-polypeptid i forhold til til en kontrollprøve avledet fra en kontrollcellelinje kjent for ikke å støtte veksten av nevnte PRRSV, indikerer en tilbøyelighet av testcellelinjen til å støtte replikasjon av nevnte PRRSV.

12. Fremgangsmåte for å måle tilbøyeligheten av at en testcellelinje for å tillate infeksjon med PRRSV,karakterisert vedat den omfatter: a) å tilveiebringe en prøve inneholdende polypeptider fra testcellelinjen; b) å bestemme mengden av CD 163-polypeptid i nevnte prøve; hvori en økt mengde av et CD 163-polypeptid i forhold til en kontrollprøve avledet fra en kontrollcellelinje kjent for ikke å støtte veksten av nevnte PRRSV, indikerer en tilbøyelighet av testcellelinjen til å støtte replikasjon av nevnte PRRSV.