MXPA06012216A - Factor de tolerancia celular para virus y uso del mismo. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona metodos y composiciones relacionadas a la generacion de las celulas huesped tolerantes para el crecimiento del virus, particularmente el virus del Sindrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (VSRRP).

Description

SRRP o virus Para ambos SRRP en Norteamérica y la enfermedad se caracteriza por la falla reproductiva en cerdas y cerdas jóvenes de último nacimiento de crías muertas y alta mortalidad entre cerdos para crianza y enfermedad respiratoria en cerdos de todas las La enfermedad se ha sometido a revisiones recientes y Murtaugh et En los la infección SRRP se limita a un subgrupo de células del linaje de Las células de macrófagos alveolares de porcinos completamente diferenciados son las células blanco primarias para la replicación viral et Duan et La inmortalización de las células PAM es un reto técnicamente y cuando es ha resultado en líneas celulares que no son tolerantes para el crecimiento del virus SRRP et Los viriones SRRP se enlazan específicamente mediante los macrófagos y se internan en hoyos cubiertos con clatrina mediante La liberación de vesículas endocitícas requiere pH ácido et El enlace inicial de los viriones se media mediante la interacción de la proteína de matriz viral con glicosaminoglicanos de sulfato heparina et La internalización puede facilitarse por una glicoproteína de membrana de 210 ó 220 como la incubación de las células PAM con anticuerpos monoclonales para esta Infección de bloque de polipéptidos con el virus SRRP et Wissink et La glicoproteína kDa 210 se ha identificado recientemente como un miembro de familia siglec del ácido siálico enlazando las lectinas como inmunoglobulina et La transfección de la línea celular de no tolerante con sialoadhesina de porcino confiere la habilidad de internar las partículas pero ellas permanecen como un bloque aparente en el estado sin a medida que los viriones ingresan en las vesículas celulares pero no padecen desintegración del núcleo cápslde y la fusión de la membrana de Los genes virales no se expresaron y las células transfectadas no se presentaron tolerantes para el virus SRRP et Para nuestro la transfección con sialoadhesina no ha demostrado ser lo suficiente para convertir cualquier línea celular no tolerante VSRRP a un fenotipo tolerante Aparte de las células porcinas primarias del linaje de solamente el otro tipo celular conocido por ser tolerante para el crecimiento de VSRRP en el cultivo celular es la línea celular de riñon de mono inmortalizada et y sus derivados tales como et y Se sabe porque esta línea celular particular es aunque otras líneas celulares de mamíferos no lo El virus SRRP enlaza específicamente a un número de tipos de células pero no inicia la infección Therrien et En las células la internalización del virus mediante la endocitosis y el descubrimiento subsecuente en las vesículas de pH bajo parecen eventos mímicos similares en las células PAM y Sin un número de anticuerpos monoclonales que enlazan a la sialoadhesina de porcino caen para detectar la proteína homóloga en la superficie de las células et Wissink et sugiriendo que las células pueden usar un número divergente de la misma familia de proteína o un receptor diferente Las vacunas VSRRP se propagan en las líneas celulares que es una actividad potencialmente El uso de líneas celulares de simios para la producción de la vacuna tiene el potencial para introducir los virus de primates de significación en las líneas de cerdo intentadas para propósitos de Debido a que los cerdos se han explorado como una fuente de órganos de xenotransplantes para la introducción de las lineas celulares de los primates para las poblaciones de cerdos puede poner últimamente en riesgo a los humanos de recibir órganos sería prudente evitar el uso de líneas celulares de simios en las preparaciones de vacuna de Por lo tanto sería deseable identificar o generar células de no simio o líneas celulares capaces de soportar la replicación Hacia este es esencial identificar los productos genéticos que pueden ser responsables para conferir la tolerancia para la replicación VSRRP como se observa en ciertas líneas celulares de simios así como en las células Una vez que dichos productos de gen se las células no tolerantes pueden volverse tolerantes mediante la transfeccion del gen esencial en las por lo tanto produciendo una serie más amplia de líneas de producción para una Un laboratorio ha reportado que la proteína tetraspanina de las células cuando sé transfectan en las células no confieren tolerancia al virus SRRP y Shanmukhappa y Esta observación no sé confirmó por un laboratorio Cuando se describe un polipéptido no que cuando se transfecta en células confiere tolerancia al virus Referencias Citadas y Method of growning and attenuating a viral agent associated with mystery swine Boehringer Ingelheim Animal 585 Tipo de Patente y Rogan Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome comparison of the North American and European isolates y Pensaert Recubrimiento de la proteína de matriz en la unión del virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino a un receptor como heparin en los macrófagos alveolares de y Efectos de origen y estado de la diferenciación y activación de los en su susceptibilidad para el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino Nau y La cuantificación e identificación de los blancos celulares en los pulmones y los tejidos linfoides de los cerdos en diferentes intervalos de tiempo después de la inoculación con virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino y Identificación de un receptor putativo para el virus del síndrome de la respiración y reproductor porcino en los macrófagos alveolares y un receptor de señal de depuración de complejos de del International Journal of Biochemistry Cell Blology Gronlund Vltved Lausen Skjodt Holmskov Clonación de una membrana transmembrana de tipo I rica en clsteína del receptor depurador novedoso expresado por los macrófagos Journal of Immunology y Factores dé susceptibilidad del huésped para el virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino y usos en la alimentación de como un blanco para compuestos antivirales y el desarrollo de una línea celular recombinante no simiana para la propagación del Ninguna US A1 EUA Tipo de Kwang y Replicación mejorada del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino en una subpoblación homogénea de la línea celular Los factores de membrana celular son los determinantes principales del tropismo de la proteína el virus del síndrome respiratorio y reproductor Virus y El virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino ingresa a las células a través de una ruta endocítica de pH bajo Virus y Una breve revisión de los procedimientos y problemas potenciales asociados con el diagnóstico del síndrome respiratorio y reproductor Veterinary Research el Veterinary Research y Respuestas inmunológicas de credos para la infección del virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino Viral Immunology Van y La entrada del virus del síndrome respiratorio y reproductivo en la endocitosis mediada por el receptor vía los macrófagos alveolares Síndrome Respiratorio y Reproductora Porcino con referencia especial a los aspectos clínicos y diagnósticos Una revisión y Polipéptido de codificación del ácido nucleico involucrado en la entrada celular del virus Akzo Nobel y Universiteit WO Philippidis y El receptor purificador de hemoglobina CD163 media la liberación de y la síntesis de la heme respuestas in vitro del en resolver las ampollas de piel en vivo y después de la cirugía de bypass Circulation Research Virus del Síndrome respiratorio y reproductor Origin Emerging Infectious Diseases y Schmitz Organización genómica y localización cromosomal del gen CD163 un miembro de la superfamilia rica en cisteína del receptor Biochemical Biophysical Research Communications Gómez del y Domínguez Expresión de CD 63 porcino en correlaciona con la tolerancia a la infección de la fiebre del cerdo y Clonación e identificación del enlace de las proteínas celulares al gen de nucleoproteína parcial y del virus del síndrome respiratorio y reproductivo y En Virología en Roizman y Lippincott Williams St y Caracterización preliminar del factor de enlace de proteína para el virus del síndrome respiratorio y reproductor en la superficie de las células no tolerantes y Van van y La complicación de la sialoadhesina en la entrada del virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino en los macrófagos alveolares Van y Babiuk Líneas celulares porcinas continua desarrolladas desde los macrófagos alveolares Caracterización parcial y susceptibilidad de Methods van van y Identificación de las glicoproteínas alveolares porcinas involucradas en la infección del virus del síndrome reproductivo y respiratorio SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención incluye un método para facilitar la infección de una o más células por un virus que se selecciona del grupo que consiste de Arterividae y que comprende la etapa de dirigir la expresión incrementada de un polipéptido CD163 dentro de dicha En una modalidad preferida el CD163 es un enlace de En una el virus se selecciona del grupo que consiste de En una modalidad el virus es En otra modalidad dicho virus es virus de la arteritis viral equina En aún otra modalidad dicho virus es el virus de la fiebre hemorrágica en cerdos africanos La expresión incrementada de un polipéptido CD163 puede llevarse a cabo mediante métodos tales como introducción a los ácidos nucleicos exógenos codificando los polipéptidos tales métodos incluyen pero no se limitan a la electroporación y fusión con un portador de un polipéptido comprendiendo un polinucleótido que codifica un polipéptido La expresión incrementada también puede llevarse a cabo mediante la inducción de la expresión del CD163 endógena CD163 mediante tratamiento El método puede producir previamente células tolerantes no VSRRP y tolerantes El método también puede incluir producir una o más células que previamente no expresan un polipéptido CD163 en las células que se inducen para expresar un polipéptido Las células en una modalidad preferida son células Ellas pueden ser células vertebradas o Las células pueden ser de La línea o las líneas celulares pueden ser una línea celular de Las células pueden ser células Las células pueden derivarse de las células de riñon de Las células o la línea celular puede derivarse de las células de riñon de Las células o la línea celular puede ser pero no limitarse a 21 Vero o células Puede ser el VSRRP o el genotipo norteamericano o Como se anotó la expresión incrementada de un polipéptido CD 63 puede llevarse a cabo mediante métodos que incluyen pero no se limitan electroporación y fusión con un portador de un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido Cualquier polipéptido CD163 se Se prefieren aquellos que contienen una región Los polipéptidos CD163 ejemplarizadores se seleccionan del grupo que consiste de polinucleótidos listados Uno como dichos polinucleótidos comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos identidad con la SEC ID Uno de dicho polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polinucleótido que difiere de la SEC ID 2 por más de 20 substituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polinucleótido que difiere de la SEC ID 2 por más de 10 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polinucleótido que comprende la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido con la secuencia establecida en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos de identidad a un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 14 por no más de 15 sustituciones de aminoácido Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 14 por más de sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido compre de un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido con la secuencia establecida en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polinucleótido que difiere de la SEC ID 24 por no más de 2 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido con la secuencia establecida en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos o de identidad de un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 27 por no más de 20 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 27 por no más de 10 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido con la secuencia establecida en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos de identidad para un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 32 por no más de 15 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 32 por no más de 10 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido con la secuencia establecida en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos de identidad para un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID por no más de 15 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 34 por no más de sustituciones de Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido con la secuencia establecida en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos de identidad para un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 36 por no más de 15 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 36 por no más de 10 sustituciones de Uno de dicho polinucleótidos que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido con la secuencia establecida en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos de identidad para un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 42 por no más de sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 42 por no más de 10 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido con la secuencia establecida en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos de identidad para un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 44 por no más de 15 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 44 por no más de 10 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido con la secuencia establecida en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 9 de identidad para un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 46 por no más de 15 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 46 por no más de 10 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido con la secuencia establecida en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 91 de identidad para un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 48 por no más de sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que difiere de la SEC ID 44 por no más de 10 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la SEC ID Uno de dicho polinucleótido que comprende un polinucleótido con la secuencia establecida en la SEC ID El método para facilitar la infección anteriormente descrita que además puede comprende la etapa de producir un cultivo de Cualquiera de los métodos descritos anteriormente que pueden además comprende la etapa de producir un SRRP u otra vacuna La vacuna puede matar o vivir La invención también comprende una célula o línea celular en donde la habilidad de una o más células puede infectarse mediante un virus seleccionado del grupo que consiste de Arterividae y Asfarviridae que se han modificado mediante dingir la expresión incrementada de un polipéptido dentro de dichas En una modalidad preferida el polipéptido CD163 comprende una región En una modalidad el virus se selecciona del grupo que consiste de En una modalidad preferida el virus es En otra modalidad dicho virus es el virus de arteritis viral equina En otra modalidad dicho virus es el virus de la peste porcina africana La célula o la línea celular de la invención puede haber sido previamente VSRRP no tolerante y se produce el VSRRP tolerante por la expresión incrementada dirigida de un polipéptido CD163 dentro de dicha célula o línea La célula o la línea celular de la invención incluye células o líneas celulares que no expresan un polipéptido CD163 y se induce para expresar un polipéptido CD Las células en una modalidad preferida son células de Ellas pueden ser células vertebradas o no Las células pueden ser de La célula o línea celular puede ser la célula de un insecto o la línea celular de un Las células pueden ser células Las células pueden derivarse de células de riñon La célula o la línea celular puede derivarse de las células de riñon Las células pueden pero no se limitan a NLF Vero o células El VSRRP puede ser norteamericano o La invención incluye un método para medir la propensión de una célula o línea celular de prueba para permitir la infección por un virus seleccionado del grupo que consiste de Arterividae y Asfarviridae proporcionar una muestra que contiene ácidos nucleicos de la célula o línea celular de determinar la cantidad de polinucleótido que codifica un polipéptido CD163 o su complemento en dicha en donde una cantidad incrementada del polinucleótido que codifica un polipéptido CD163 relativo a una muestra de control derivada de una célula de control o la línea celular conocida no soporta el crecimiento de dicho virus que indica una propensión de la línea celular o la célula de prueba para soportar la replicación de dicho En una el virus se selecciona del grupo que consiste de En una modalidad preferida el virus es En otra modalidad dicho virus es virus de arteritis viral equina En otra modalidad dicho virus es virus de la peste porcina africana La cantidad de polinucleótido que codifica un polipéptido CD163 puede determinarse mediante La cantidad de polinucleótido que codifica un polipéptido CD163 puede determinare por La invención también incluye un método para medir la propensión de una célula o línea celular de prueba para permitir la infección por un virus seleccionado del grupo que consiste de Arterividae y Asfarvirídae proporcionar una muestra que contiene polipéptidos de la célula de prueba o la línea determinar la cantidad de polipéptido CD163 en dicha en donde una cantidad incrementada de un polipéptido conocido no soporta el crecimiento d dichos virus indica una propensión de la célula de prueba o la línea celular para soportar la replicación de dicho En una el virus se selecciona del grupo que consiste de En una modalidad el virus es En otra dicho virus es virus de la arteritis equina En otra modalidad dicho virus es el virus de la peste porcina africana En una modalidad la determinación se llevó a cabo mediante contactar un polipéptido CD163 con un anticuerpo específico para el polipéptido CD bajo condiciones en donde el anticuerpo enlaza el polipéptido La invención incluye un método para medir la propensión de un cerdo para ser infectado por un virus seleccionado del grupo que consiste de Arteriviridae y Asfarviridae proporcionar una muestra que contiene ácidos nucleicos del cerdo a determinar la cantidad de polinucleótido que codifica un polipéptido CD163 o sus complementos en dicha en donde una cantidad incrementada de polinucleótido que codifica un polipéptido CD 163 relativo a una muestra de control derivada de un cerdo conocido es resistente a dicha infección de virus indica una propensión del cerdo a probarse de ser infectado por dicho En una modalidad el virus se selecciona del grupo que consiste de En una modalidad preferida el virus es En otra modalidad dicho virus es virus de arteritis viral equina En otra modalidad dicho virus es el virus de fiebre porcina africana En una la determinación se lleva a cabo mediante En otra modalidad la determinación se lleva a cabo mediante La invención también incluye un método para medir la propensión de un cerdo a infectarse por un virus seleccionado del grupo que consiste de Arteriviridae y proporcionar una muestra que contiene polipéptidos de cerdo a determinar la cantidad de polipéptido CD163 en dicha en donde una cantidad incrementada de un polipéptido CD163 relativa a una muestra de control derivada de un cerdo conocido para ser resistente a dicha infección de virus indica una propensión del cerdo a probarse para infectarse por dicho En una modalidad el virus se selecciona del grupo que consiste de En una modalidad preferida el virus es En otra dicho virus es virus de arteritis equina En otra modalidad dicho virus es el virus de la peste porcina africana En una modalidad la determinación se lleva a cabo mediante contactar un polipéptido CD163 con un anticuerpo específico para el polipéptido bajo condiciones en donde el anticuerpo enlaza el polipéptido La invención también incluye un polipéptido aislado en donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de los polipéptidos posteriormente Por lo tanto la invención también incluye un polipéptido aislado que tiene al menos 81 de identidad para la SEC ID Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 2 por no más de 20 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 2 por no más de 10 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido comprende la SEC ID Por lo la invención también incluye un polipéptido aislado que tiene al menos de identidad para un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 14 por no más de sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 14 por no más de sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 14 por no más de sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido comprende la SEC ID Por lo la invención también incluye un polipéptido aislado que difiere de la SEC ID 24 por no más de 2 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido comprende la SEC ID Por lo la invención también incluye un polipéptido aislado que tiene al menos o de identidad para un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 27 por no más de sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 27 por no más de sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que comprende la SEC ID Por lo la invención también incluye un polipéptido aislado que tiene al menos de identidad para un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 32 por no más de 15 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 32 por no más de 10 sustituciones de aminoácido Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que comprende la SEC ID Por lo la invención incluye un polipéptido aislado que tiene al menos de identidad para un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 34 por no más de 5 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 34 por no más de 0 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que comprende la SEC ID Por lo tanto la invención también incluye un polipéptido aislado que tiene al menos de identidad para un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 36 por no más de 5 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho poiipéptido es un poiipéptido que difiere de la SEC ID 36 por no más de 10 sustituciones de aminoácidos La invención también incluye un poiipéptido aislado que tiene al menos de identidad para un poiipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho poiipéptido es un poiipéptido que difiere de la SEC ID 38 por no más de 15 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho poiipéptido es un poiipéptido que difiere de la SEC ID 38 por no más de 10 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho poiipéptido es un poiipéptido que comprende la SEC ID Por lo la invención también incluye un poiipéptido aislado que tiene al menos de identidad para un poiipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho poiipéptido es un poiipéptido que difiere de la SEC ID 40 por no más de 5 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho poiipéptido es un poiipéptido que difiere de la SEC ID 40 por no más de 0 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho poiipéptido es un poiipéptido que comprende la SEC ID Por lo la invención también incluye un poiipéptido aislado que tiene de identidad para un poiipéptido establecido en la SEC ID Un dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 42 por no más de sustituciones de aminoácidos Un dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 42 por no más de 10 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que comprende la SEC ID Por lo la invención también incluye un polipéptido aislado que tiene al menos de identidad para un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 44 por no más de sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 44 por no más de 10 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que comprende la SEC ID Por lo la invención también incluye un polipéptido aislado que tiene al menos de identidad para un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 46 por no más de 15 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 46 por no más de 10 sustituciones de aminoácido Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que comprende la SEC ID Por lo la invención también incluye un polipéptido aislado que tiene al menos de identidad para un polipéptido establecido en la SEC ID Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 48 por no más de 15 sustituciones de aminoácidos Uno de dicho polipéptido es un polipéptido que difiere de la SEC ID 48 por no más de 10 sustituciones de aminoácido Uno de dicho polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la SEC ID La invención también incluye un polinucleótido CD163 aislado en donde dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de los polinucleótidos posteriormente Por lo la invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 1 ó un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos ó de identidad y o similitud a un polipéptido establecido en la SEC ID un polinucleotido que codifica un polipéptido de la SEC ID un polinucleotido que es el complemento de cualquiera de o Por lo la invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 12 ó un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos de identidad y o similitud para un polipéptido establecido en la SEC ID 14 un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o Por lo la invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 22 ó 23 un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o Por lo la invención además incluye un polinucleótido aislada que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 25 ó un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos ó de identidad y o similitud para un polipéptido establecido en la SEC ID un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o Por lo la invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 30 ó 31 un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud a un polipéptido establecido en la SEC ID 32 un polinucleótido que codifica un poiipéptido de SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o Por lo la invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 33 un polinucleótido que codifica un poiipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud a un poiipéptido establecido en la SEC ID 34 un polinucleótido que codifica un poiipéptido de SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o Por lo la invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 35 un polinucleótido que codifica un poiipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud a un poiipéptido establecido en la SEC ID 36 un polinucleótido que codifica un poiipéptido de SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o Por lo la invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 37 un polinucleótido que codifica un poiipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud a un poiipéptido establecido en la SEC ID 38 un polinucleótido que codifica un poiipéptido de SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o Por lo la invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 39 un polinucleótido que codifica un poiipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud a un poiipéptido establecido en la SEC ID 40 un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o Por lo la invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 41 un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud a un polipéptido establecido en la SEC ID 42 un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o Por lo la invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 43 un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud a un polipéptido establecido en la SEC ID 44 un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o Por lo la invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 45 un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud a un polipéptido establecido en la SEC ID 46 un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o La invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 47 un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud a un polipéptido establecido en la SEC ID 48 un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o Por lo la invención también incluye un polipéptido CD163 en el cual la región transmembrana se Por lo tanto la invención también incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido CD163 en el cual la región transmembrana se Además de lo la invención como un aspecto todas las modalidades de la invención más estrechas en alcance en cualquier forma que las variaciones específicamente anteriormente BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS LISTADOS DE SECUENCIA SEC ID 1 secuencia de cADN que codifica susCD163v1 de porcino SEC ID 2 secuencia de aminoácido predicho de susCD163v1 de porcino SEC ID 3 secuencia de número de acceso GenBank AJ311716 SEC ID 4 secuencia de aminoácidos predicha derivada del número de acceso GenBank AJ311716 SEC ID 5 secuencia de cADN de susCD163v1 que contiene secuencia de flanqueo SEC ID secuencias iniciadoras SEC ID 12 secuencia de cADN que codifica susCD163v2 de porcino que contiene la secuencia de flanqueo SEC ID 13 secuencia de cADN que codifica susCD163v2 de porcino SEC ID 14 secuencia de aminoácido predicho de susCD163v2 de porcino SEC ID secuencias iniciadoras SEC ID 17 secuencia de cADN que codifica el CD143v2 de humano que contiene secuencia de flanqueo SEC ID 18 secuencia de cADN que codifica el CD163v2 de humano SEC ID 19 secuencia de aminoácido predicho de CD163v2 de humano SEC ID secuencias iniciadoras SEC ID 22 secuencia de cADN que codifica el CD143v2 murino que contiene secuencia de flanqueo SEC ID 23 secuencia de cADN que codifica el CD163v2 murino SEC ID 24 secuencia de aminoácido predicho de CD163v2 murino SEC ID 25 secuencia de cADN que codifica el CD163v3 murino que contiene secuencia de flanqueo SEC ID 26 secuencia de cADN que codifica CD163v3 murino SEC ID 27 secuencia de aminoácido predicho de CD163v3 murino SEC ID secuencias iniciadoras SEC ID 30 secuencia cADN que codifica CD163v3 que contiene secuencia de flanqueo SEC ID 31 secuencia de cADN que codifica CD163v3 SEC ID 32 secuencia de aminoácido predicho de CD163v3 SEC ID 33 secuencia de cADN que codifica la célula Vero CD163v2 transcript SEC ID 34 secuencia de aminoácido predicho de la célula Vero CD163v2 SEC ID 35 secuencia de cADN que codifica la célula Vero CD163v3 transcript SEC ID 36 secuencia de aminoácido predicho de la célula Varo SEC ID 37 secuencia de cADN que codifica la célula Vero CD 63v4 transcripción SEC ID 38 secuencia de aminoácido predicho de célula Vero CD163v3 SEC ID 39 secuencia de cADN de la célula Vero CD163v5 transcripción SEC ID 40 secuencia de aminoácido predicho de la célula Vero CD163v5 SEC ID 41 secuencia de cADN que codifica la célula Vero CD163v6 transcript SEC ID 42 secuencia de aminoácido predicho de la célula Vero CD163v6 SEC ID 43 secuencia cADN que codifica la célula Vero CD163v7 transcript SEC ID 44 secuencia de aminoácido predicho de la célula Vero CD163v7 SEC ID 45 secuencia cADN que codifica el CD 63v2 transcript de canino SEC ID 46 secuencia de aminoácido predicho de CD163v2 de canino SEC ID 47 secuencia cADN que codifica el CD163v3 transcript de canino SEC ID 48 secuencia de aminoácido predicho de CD163v3 de BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una comparación esquemática de susCD163v1 con en A bp de extensión B 738 bp de omisión C 44 La Figura 2 es una alineación de la secuencia de aminoácidos de susCD163v1 ID con AJ311716 ID La Figura 3 es una alineación de secuencia de nucleótidos de susCD163v1 con La Figura 4 muestra la generación de fragmentos de ADN y la unión para colocar el CD163 directamente atrás del promotor Los plásmidos se digieren con Dralll o seguido por una reacción de despunte con la enzima Después de la los plásmidos se digieren con La purificación de gel produjo fragmentos de ADN que subsecuentemente se unen usando el término Notl Los promotores de RSV y SV40 se indican con en D E Ampicilina F Ligasa La Figura 5 muestra un mapa de Vector de clonación La Figura 6 muestra tres líneas y y la línea celular BHK no tolerante se infectaron con P129 aislado VSRRP y marcado con El panel A muestra un clon de célula BHK21 no El Panel B muestra el clon El panel C muestra el clon El panel D muestra el clon La Figura 7 muestra las tres líneas celulares y se infectaron con el aislado P129 del virus VSRRP y marcado con El panel A muestra el clon 2 El panel B muestra el clon 3 El panel C muestra el clon 4 BH La Figura 8 muestra las líneas celulares de riñon de felino que expresan el que muestra las placas Las líneas celulares G4F y ambas en el pasaje 4 se infectaron con el aislado P129 del VSRRP de Norteamérica y se incubaron por 6 Las monocapas se fijaron con acetona y se marcaron con anticuerpo monoclonal El microscopio de contraste de fases muestra las regiones localizadas de CPE mientras la detección FA muestra el antígeno nucleocápside viral La Figura 9 muestra cuatro líneas celulares y que se infectaron con aislado P129 del VSRPP y se marcaron con anticuerpo monoclonal El panel A muestra el clon celular 1 El panel B muestra el clon El panel C muestra el clon El panel D muestra el La Figura 10 muestra células en el pasaje infectadas con el aislado P129 La monocapa se fija con de acetona y se marcó con el anticuerpo monoclonal FITV conjugado SDOW17 Technologies que es específico para el nucleocápside del El mismo bien bajo la iluminación de campo brillante mostrando la distribución La Figura 11 muestra el en el pasaje 17 infectado con el aislado P 29 La monocapa se fijó con de acetona y se marcó con el anticuerpo SDOW17 conjugado Technologies que es específico para el nucleocápside del La Figura 12 muestra tres ejemplos representativos de las líneas celulares BH Las células se infectaron con el aislado P129 VSRRP y subsecuentemente se marca con El panel A muestra la línea celular el panel B muestra la línea celular 34 y el panel C muestra la línea celular La Figura 13 muestra el en el pasaje 15 infectado con el aislado P129 del La monocapa posteriormente se fijó con de acetona y se marcó con al anticuerpo SDOW17 monoclonal Technologies es específico para el nucleocápside La Figura 14 muestra la cantidad de progenitura de VSRRP producida por cuatro líneas celulares recombinantes establemente expresan las células susCD163v1 y mediante las células se determinó en un experimento de curva de crecimiento usando el aislado NVSL de Las muestras cultivadas en intervalos de 12 horas se suspendieron en las monocapas de las células en G Suspensión del virus H Tiempo de La Figura 15 muestra el análisis de citometría de flujo de la infección VSRRP en la presencia de anticuerpo específico Las células se expresa el CD163 de la transfección transitoria se incubaron con el anticuerpo específico CD 63 o el IgG de cabra normal y se infectó con un VSRRP de expresión Cada punto de datos representa los resultados de los pozos en I de intentado J de La Figura 16 muestra el análisis de citometría de flujo de la infección VSRRP en la presencia del anticuerpo específico Las células NLFK que expresan establemente el CD 63 humano se incubaron con anticuerpo específico o IgG de cabra normal y se infectaron con un VSRRP que expresa En las 24 horas el porcentaje de las células infectadas que expresan GFP se Cada punto de datos representa el resultado de un pozo simple de La Figura 17 muestra la representación gráfica de seis variantes de deslizamiento alternativo de CD163 mARN recubiertas de las células Las seis variantes difieren la presencia o ausencia de tres designados E105 y Los exones E6 y E105 tienen longitudes que son múltiplos de tres y por lo tanto no resulta en un cambio en el recuadro de lectura cuando está En la ausencia de E83 resulta en un recuadro de lectura intercambiado y una secuencia de aminoácidos alterna en el término carboxi de la proteína por un diseño tramado en la La región de transmembrana hidrofóbica se codifica dentro de E La Figura 18 muestra las células infectadas con el aislado El sobrenadante no diluido del aislado P201 VSRRP infectado con PAMs se usó para infectar las células Después de dos días de incubación las células se fijaron y marcaron con anticuerpo monoclonal SDOW17 como se describió en el Ejemplo La Figura 19 muestra las células infectadas con el aislado VSRRP El sobrenadante no diluido del aislado VSRRP infectadas con PAMs se usó para infectar las células Dos días las células se fijaron con acetona y se mancharon con anticuerpo monoclonal SDOW17 como se describió en el Ejemplo La Figura 20 muestra la infección de las células del clon con el aislado P201 El panel A muestra una monocapa de las células infectadas con VSRRP P201 en el pasaje 1 veinticuatro horas El panel B muestras una monocapa de las células en 2 días con el sobrenadante VSRRP libre celular P201 en el pasaje La Figura 21 muestra las células madre NLFK y un sustrato de se examinó por la expresión Las células se fijaron en el de la acetona y se reaccionaron con CD163 anti cabra System a 1 por una hora seguida por el lavado con Para el IgG de burro conjugado con FTTC INC a 1 se No se detectó fluorescencia específica en las células madre NLFK como se muestra en el Panel A La mayoría del subclon mostraron buen marcado fluorescente indicando la presencia de CD163 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Generales Las células y las líneas celulares pueden ser o no Por una célula o línea celular que es virus tolerante es capaz de permitir la infección por el la replicación subsecuente y la producción del Una célula o línea celular que es un virus no tolerante es incapaz de permitir la infección por el la replicación subsecuente y la producción del Una línea celular que es algo tolerante puede producirse más tolerante mediante los métodos de la Artetivirídae se refiere a una familia de virus de ARN de hebras positivas envuelto perteneciente al orden de La familia incluye el virus de elevación lactato dehidrogenasa en el virus de la arteritis equina el virus de la fiebre hemorrágica de los simios y Asfarvlrídae es una familia de virus icosohédricos envueltos cuyos genomas consisten de moléculas simples de ADN de doble hebra lineal cerca de nucleótidos de El nombre de la familia se deriva de los Virus Relacionados y de la Peste Porcina El Virus de la Peste Porcina Africana es el tipo de especies del género Asfivirus y es el único miembro de la El término o virus SRRP se refiere tanto a los genotipos del virus SRRP norteamericano y Dentro de cada los aislados típicamente comparten o mayor identidad de Entre los sin el nivel de identidad de secuencia es solamente aproximadamente El virus SRRP es un miembro de la familia El genoma de los arteriovirus es ARN de hebra simple de polaridad positiva entre 12 y 16 kb en cubiertos en el extremo y poliadenilado en el extremo Sobre dos tercios del genoma se dedican a los recuadros de lectura abierta 1a y que codifican las funciones no estructurales del EL es una extensión de ORF1a y es el resultado de un cambio ribosomal que no es múltiplo de Los ORFs 1a y 1b se trasladan directamente del ARN Estos productos polipéptidos largos se penetran por las proteasas virales para producir 12 ó 13 péptidos más pequeños Los restantes que codifican las proteínas estructurales virales se expresan de una serie de ARNs subgenómico Los sgARNs se producen mediante la transcripción discontinua del ARN de hebras tal como una secuencia líder común que llega a fusionarse a cada Las proteínas estructurales principales son la nucleocápside codificada por la proteína de matriz codificada por y la glicoproteína de sobre principal codificada por Las proteínas GP4 GP3 GP2 y E son componentes estructurales menores del cuyas funciones no se han La biología molecular del VSRRP ha sido el sujeto de recientes artículos de revisión et Meulenberg Snijder y Como se usa en este el término significa una proteína codificada por un gen CD163 de incluyendo las variantes alélicas que contienen cambios no conservadores y Se ha reportado una secuencia de cADN que codifica un polipéptido CD163 de porcino de acceso GenBank También se ha reportado un polipéptido murino CD163 de acceso GenBank así como las variantes múltiples ejemplificadas por los números de acceso GenBank AAH51281 y Se reportan en este documento los polinucleótidos que codifican los polipéptidos CD163 de mono verde murino y canino y que comprenden las secuencias establecidas en la SEC ID 41 45 y Un es un miembro de la familia rica en cisteína del receptor depurador de las glicoproteínas de transmembrana y se piensa que se expresan exclusivamente en los monocitos y Un rol identificado del CD163 es para inhibir el daño al tejido oxidativo siguiendo la hemolisis mediante consumir los complejos de mediante La liberación subsecuente de la y la síntesis de hemo resulta en efectos antiinflamatorios y citoprotectores et Graversen et El gen humano extiende 65 kb en el cromosoma 12 y consiste de 17 exones y Un número de isoformas del polipéptido CD163 incluyendo el enlace de tipos citoplásmico y secretado se conocen por ser generados mediante deslizamiento alterno et Las isoformas que comprenden un dominio de transmembrana son particularmente Un dominio transmembrana se caracteriza por un segmento polipéptido de una secuencia mayor que se expresa en ambos lados de la Los dominios extracelulares y citoplásmicos se separan mediante al menos un segmento de que atraviesa el ambiente hidrofóbico en la doble capa de El segmento de se compone de residuos de aminoácidos con cadenas laterales no usualmente en la forma de una hélice Los segmentos que contienen aproximadamente residuos hidrofóbicos son lo suficientemente largos para extender una membrana como la hélice alfa y pueden comúnmente identificarse por medio de una trama El dominio de la transmembrana predicha de la SEC ID 2 y 14 se indica mediante letras negritas en la Para determinar si otras secuencias CD163 contienen una característica de secuencia similar se determina fácilmente mediante la inspección de la secuencia de las tramas Las SEC ID son representativas de las proteínas CD163 variantes que no contienen un dominio de transmembrana y sus ácidos nucleicos de Como se usa en este generalmente se refiere a cualquier poliribonucleótido o polideoxribonucleótido que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN Los incluyen pero no se limitan a ADN de doble hebra o el ADN que es una mezcla de regiones de doble hebra y ARN doble y el ARN es la mezcla de las regiones de doble hebra y simple y las moléculas híbridas que comprende el ARN y el ADN que puede ser de doble hebra o simple o más típicamente de doble hebra o una mezcla de regiones de doble hebra y el se refiere a las regiones de triple hebra comprendiendo el ARN o ADN o ambos ARN y El término también incluye ADNs o ARNs que contienen una o más bases modificadas y los ADNs o ARNs con columna vertebral modificada para la estabilidad o para otras Las bases incluyen por bases tres veces suspendidas y bases inusuales tales como Puede hacerse una variedad de ADN y además abarca formas enzimáticamente o metabólicamente modificadas de los polinucleótidos tales como los típicamente encontrados en la así como las formas químicas del ADN y ARN características de los virus y las El también abarca los polinucleótidos relativamente comúnmente referidos como Como se usa en este se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende aminoácidos unidos a otro mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos El se refiere a ambas cadenas comúnmente referidas como oligopéptidos u oligómeros y las cadenas más largas generalmente referida como Los polipéptidos pueden contener aminoácidos más que los 20 aminoácidos codificados de 20 Los incluyen las secuencias de aminoácidos modificadas por los procesos naturales tales como procesamiento o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la Dichas modificaciones se describirán en los textos básicos y en monografías más así como en una literatura de búsqueda Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier forma en un incluyendo la columna vertebral del las cadenas laterales del aminoácido y el término carboxilo o Se apreciará que algún tipo de modificación puede estar presente a los mismos o varios grados en varios sitios en un polipéptido un polipéptido dado puede contener muchos tipos de Los polipéptidos pueden ser ramificados como un resultado de ubiquitinación y ellos pueden ser con o sin Los polipéptidos cíclicos ramificados y cíclicos pueden resultar de los procesos naturales o pueden hacerse mediante métodos Las modificaciones o las formas modificadas incluyen ribosilación de unión covalente de unión covalente de una porción unión covalente de un derivado nucleótido o unión covalente de un lípido o un derivado unión covalente de formación de enlace de formación de reticulaciones covalentes formación de formación de formilación carboxilación formación de sujeción procesamiento fenilación adición mediada con transferencia de ARN de los aminoácidos a las proteínas tales como arginilacion y ubiquitinación por Estructura de las Proteínas y Propiedades Freeman y Nueva Modificaciones de Proteínas Perspectivas y páginas en la Modificación Covalente translacional de las Academic Nueva Seifter et for protein modifications and nonprotein 646 y Rattan et Modifications and Ann NY Acad Sci Como se usa en este documento significa alterado por la mano del hombre del estado Si una composición o sustancia ocurre en la se ha cambiado o removido de su ambiente original o Por un polinucleótido o un polipéptido naturalmente presente en un animal vivo no se pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural es como el termino se emplea en este Por lo tanto como se usa en este documento y se entiende en la en donde se refiere a polinucleótidos o polipéptidos se entiende que significa separado del ambiente celular original en el cual el polipéptido o ácido nucleico normalmente se Como se usa en este por lo por medio de ejemplo un animal transgénico o una línea celular recombinante construida con un polinucleótido de la invención hace uso del ácido nucleico Específicamente excluido de la definición de polinucleótidos aislados de la invención son los cromosomas aislados de las células huésped nativas de las cuales el polinucleótido se derivo En la descripción a seguir se hace uso del término o similitud como se aplica a las secuencias de aminoácidos de El porcentaje de de la secuencia de aminoácidos con respecto a los polipéptidos se define en este documento como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidato que son idénticos con los residuos en las secuencias blanco después de la alineación de ambas secuencias y la introducción de si es para lograr el porcentaje máximo de identidad de El porcentaje de identidad de secuencia se determina mediante métodos Por BLASTP TA y TL BLAST 2 una nueva herramienta para comparar las secuencias de nucleótidos y FEMS Microbiol como se anotó dos secuencias de aminoácidos se ligaron para optimizar los mareajes de alineación usando una penalidad de abertura de intervalo de una penalidad de extensión de intervalo de y la matriz de mareaje de Henikoff y Henikoff EUA El porcentaje de identidad posteriormente se calcula Número Total de Igualaciones Idénticas x 100 de la secuencia más larga el número de intervalos introducidos en la secuencia más larga para alinear las dos El porcentaje de de secuencia referida como con respecto a un polipéptido de la invención se define como el porcentaje de los residuos de aminoácido en la secuencia candidato que son idénticos con los residuos en las secuencias blanco después de la alineación de las secuencias y los intervalos de si es para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia se describió y también considerando cualquier sustitución conservadora como parte de la identidad de Número total de igualaciones idénticas y sustituciones conservadoras x 100 de la secuencia más larga el número de intervalos introducidos en la secuencia más larga para alinear las dos Los aminoácidos pueden clasificarse de conformidad con las propiedades físicas y la contribución a la estructura de proteína secundaria y Una sustitución conservadora se reconoce en la técnica como una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades Las sustituciones conservadoras ejemplarizadoras se establecen en la Tabla 1 2 y 3 Tabla 1 Sustituciones Conservadoras I CARACTERÍSTICA DE CADENA AMINOÁCIDOS LATERAL Alifático No polar G A P L V Polar sin carga C S T M N Q Polar cargado D E K Aromático H F W Y Otro N Q D E los aminoácidos conservadores pueden agruparse como se describe en Segunda Worth pp como se establece en la Tabla inmediatamente Tabla 2 Sustituciones Conservadoras II CADENA LATERAL CARACTERISTICAS AMINOACIDOS No polar A L I V P F W Azufre que M En el G Polar sin carga S T Y N Q C En el G Positivamente cargado K R H Negativamente cargado D E Aún como otra las sustituciones conservadoras ejemplarizadoras se establecen bla inmediatamente Tabla 3 Sustituciones Conservadoras III Residuo Original Sustitución Ejemplarizadora Ala lie Arg Asn Asn Arg Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp His Arg lie Phe Leu Phe Lys Asn Met lie Ala Pro Gly Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Ser Val Ala Métodos Dirigidos a la Producción de Virus y Células Huésped de la Invención La invención proporciona un método para modificar la producción de un virus que es un miembro de la familia Arteriviridae y Asfarviridae en una célula que comprende la etapa de dirigir dicha célula para expresar un polipéptido Esto puede incluir producir una célula no tolerante al virus en una célula tolerante al virus o puede involucrar producir una célula más tolerante al En una el virus que es un miembro de la familia Arteriviridae o Asfarviridae se selecciona del grupo que consiste de LDV de virus de la arteritis equina virus de la fiebre hemorrágica de simios VSRRP y VPPA de En una modalidad el virus es La invención además proporciona un método para preparar un cultivo de virus que es un miembro de la familia Arteriviridae o Asfarviridae comprendiendo las etapas proporcionar una línea dirigir dicha línea celular para expresar un polipéptido infectar dicha línea celular con el virus y causar que dicha línea celular produzca la progenitura En una el virus que es un miembro de la familia Arteriviridae se selecciona del grupo que consiste de LDV de virus de la arteritis equina virus de la fiebre hemorrágica de los simios VSRRP de cerdos y VPPA de En una modalidad el virus es Todos los métodos anteriores usan células y líneas celulares que expresan un polipéptido CD163 que puede facilitarse o incrementarse por los métodos que involucran la introducción del ácido nucleico exógeno en la Dicha célula puede comprender un polinucleótido o vector en una manera que permita la expresión de un polipéptido Los polinucleótidos que codifican el CD163 pueden introducirse en la célula huésped como parte de un plásmido circular o como un ADN lineal comprendiendo una región de codificación de proteína aislada o en el vector Los métodos para introducir el ácido nucleico exógeno en la célula huésped bien conocidos y practicados rutinariamente en la técnica incluyen la inyección nuclear o fusión con los portadores tales como células fantasma y Los sistemas celulares del huésped de la invención incluyen los sistemas celulares vertebrados e Los huéspedes pueden pero no se limitan a los células de células del riñón de cerdos células de riñón de felino células testiculares de cerdos células del riñón de monos verdes africanos VERO y células células de ovario de hámster chinos células de riñón de hámster células 293 de humanos y fibroblastos 3T3 de Los sistemas de cultivos celulares huéspedes de insectos también pueden usarse para la expresión de los polipéptidos En otra los polipéptidos CD163 se expresan usando un sistema de expresión La selección del vector de expresión apropiado para la expresión de los polipéptidos CD163 por supuesto dependerá de la célula huésped específica a usarse y que está dentro del alcance de un experto en la Los ejemplos de vectores de expresión apropiados incluyen pSport y pcADN3 y pSVL Los vectores de expresión para usarse en células huéspedes de mamíferos pueden incluir secuencias de control translacional y transcripcional derivadas de los genomas Las secuencias promotoras usadas comúnmente y las secuencias modificadoras que pueden usarse en la presente invención pero no se limitan aquellas derivadas de citomegalovirus humano virus del sarcoma de Rous Adenovirus Polioma y virus de simio 40 Los métodos para construcción de los vectores de expresión de mamíferos se por ejemplo en Okayama y Berg Cosman et Cosman et y WO Porque las secuencias CD163 se conoce que existen en las células de varias el gen endógeno puede modificarse para permitir o incrementar la expresión del polipéptido Las células pueden modificarse mediante recombinación para proporcionar la expresión incrementada mediante el reemplazo en su totalidad o en del promotor CD163 de ocurrencia natural con todo o parte de un promotor heterólogo de manera que las células expresen el polipéptido CD163 a altos El promotor heterólogo se inserta de dicha manera que se una operativamente a las secuencias de codificación por la Publicación Internacional de PCT WO Publicación de PCT Internacional WO y la Publicación Internacional de PCT WO También se contempla que además del ADN promotor el ADN marcador amplificable dhfr y el gen cad que codifica la sintasa fosfata transcarbamilasa aspartato y el ADN del intrón pueden insertarse junto con el ADN del promotor Si se une a la secuencia de codificación la amplificación del ADN marcador mediante los métodos de selección estándar resultan en la de las secuencias de codificación CD163 en las La expresión CD 63 también puede inducirse mediante tratamiento Los ésteres especialmente acetato de miristil forbol una o más activas del receptor de membrana proteína cinasa C y son los medios particularmente preferidos para incrementar la expresión Otros métodos de movilización de calcio intracelular también se Producción de Vacuna Los métodos descritos anteriormente pueden usarse para producir cualquier virus que es un miembro de la familia Arteriviridae o Asfarviridae para el propósito de la producción de vacuna o En una el virus que es un miembro de la familia Arteriviridae se selecciona del grupo que consiste de LDV de virus de la arteritis equina virus de la fiebre hemorrágica en los simios y el VSRRP de En una modalidad el virus es Producción de Vacuna Los métodos descritos anteriormente pueden usarse para producir el virus para los propósitos de la producción de vacuna o Pueden producirse vacunas vivas o Por lo para hacer una vacuna un aislado de virus o una variante mutada o atenuada del crece en el cultivo El virus se cultiva de conformidad con los métodos bien conocidos en la El virus posteriormente puede congelarse y almacenarse a o se congela seco y se almacena a Antes de la el virus se mezclo en una dosis apropiada es desde aproximadamente a de las dosis de las infecciones de cultivo de tejido por con un portador farmacéuticamente aceptable tal como una solución salina y opcionalmente un La vacuna producida deberá también comprende una vacuna muerta o inactiva comprendiendo el virus cultivado por los métodos de la La vacuna inactiva se hace mediante métodos bien conocidos en la Por un virus se propaga para concentraciones deberá ser rápidamente aparente para aquellos expertos en la técnica que la masa antigénica del vires podría obtenerse mediante métodos bien conocidos en la Por la masa antigénica del virus puede obtenerse mediante concentración o Todos de estos métodos se han empleado para obtener la masa antigénica viral apropiada para producir El virus posteriormente se inactiva mediante tratamiento con betapropiolactona etilenoimina binaria u otros métodos conocidos por aquellos expertos en la El virus inactivo posteriormente se mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable tal como solución salina y opcionalmente un Los ejemplos de los adyuvantes incluyen pero no se limitan a hidróxido de aceite en agua y emulsiones de agua en saponinas tales como QuilA y adyuvantes de polipéptido incluyendo interferones y otras La inactivación mediante formalina se realizó mediante mezclar la suspensión viral con de formaldehído para una concentración final de formaldehído de La mezcla de se mezcló mediante agitación constante por aproximadamente 24 horas a temperatura La mezcla de virus inactivo posteriormente se probó para el virus vivo residual mediante probar el crecimiento en una línea celular La inactivación mediante BEI se realizó mediante mezclar la suspensión viral de la presente invención con M de BEI en N de para una concentración BEI final de 1 La mezcla de virus BEI se mezcló mediante agitación constante por aproximadamente 48 horas a temperatura seguido mediante la adición de M de tiosulfato de sodio para una concentración final de La mezcla se continuó por un adicional de dos La mezcla de virus inactivo se probó para el virus vivo residual mediante probar el crecimiento en una línea celular Las células tolerantes al virus que se han dirigido para expresar el CD 63 también pueden usarse para cuantificar el virus Dos métodos que son bien conocidos por aquellos expertos en la son la prueba de placa y la prueba de dilución Las líneas celulares de expresión CD 63 de la presente invención pueden usarse para que crezca el virus para el propósito de producir el antígeno viral para los equipos de Los lisatos del ejemplo de las células infectadas purificación opcional de las partículas virales o extracción de las proteínas virales pueden cubrirse en las placas de ELISA para detectar y cuantificar los anticuerpos para el virus en el suero de El virus inactivado o vivo crecido en las células que expresan el CD163 pueden usarse después de la separación opcional de las proteínas virales para inmunizar los animales para generar anticuerpos monoespecíficos o Estos a su vez pueden usarse como la base de las pruebas de diagnóstico para la detección y cuantificación de los virus en el suero de cerdo y otras muestras Pruebas de la Invención La invención proporciona métodos para determinar la propensión de un animal para infectarse por un virus que es un miembro de la familia Arteriviridae o Asfarvirídae o de una línea celular para soportar la replicación de un virus que es un miembro de la familia Arteriviridae o Las muestras de la fuente se obtienen y prueban para la expresión de El nivel de la expresión del gen CD163 puede compararse con los niveles de control conocidos que no soportan la replicación del En el caso de un las muestras pueden ser cualquier muestra que comprende las moléculas o proteínas del ácido nucleico de muestra y obtenidos desde cualquier tejido corporal que expresa el incluyendo pero no limitados a macrófagos células biopsias u otras preparaciones de El nivel de expresión puede probarse en o ambos del nivel del ARN mensajero o la proteína En una modalidad el miembro del virus de la familia Arteriviridae o Asfariviridae se selecciona del grupo que consiste de LDV de virus de arteritis equina virus de la fiebre hemorrágica de los simios VSRRP de cerdos y VPPA de Pruebas basadas en Ácido Nucleico Los métodos para determinar los niveles de CD163 pueden ser ácido nucleico basado como se anotó Los ácidos nucleicos derivados del CD163 pueden estar en solución o en un soporte En algunas pueden emplearse como elementos de formación en las solas o en combinación con otras moléculas de elementos de Los métodos basados en ácidos nucleicos generalmente requieren el aislamiento de ADN o ARN de la muestra y la hibridación subsecuente o amplificación PCR usando los iniciadores específicos derivados de cualquier secuencia de codificación CD163 en la técnica o aquellas específicamente descritas como la SEC ID 1 31 45 y El ADN y el ARN pueden aislarse de la muestra de conformidad con cualquier número de métodos bien conocidos por aquellos expertos en la Por los métodos de purificación de los ácidos nucleicos se describen en Técnicas de Laboratorio en Bioquímica y Biología Hibridación con Pruebas de Ácido parte Teoría y Preparación del Ácido Nueva En una modalidad el ARN total se aisla usando el reactivo de aislamiento ARN total TRIAZOL Gaithersburg y el mARN se aisla usando la cromatografía de oligo columna o los lechos de Cuando las moléculas de ácido nucleico de muestra se amplifican es deseable amplificar las moléculas de ácido nucleico de muestra y mantener las abundancias relativas de la muestra original incluyendo las transcripciones de baja el ARN puede amplificarse in in situ o in vivo Eberwine Patente Norteamericana También es ventajoso incluir los controles dentro de la muestra para asegurar que la amplificación y los procedimientos de mareaje no cambian la distribución verdadera de las moléculas de ácido nucleico en una Para este una muestra se atraviesa con una cantidad de una molécula de ácido nucleico de control predeterminada para ser detectable mediante hibridación de su molécula de ácido nucleico formada complementaria y la composición de las moléculas de ácido nucleico incluyen las moléculas de ácido nucleico de referencia que se hibridizan específicamente con las moléculas de ácido nucleico formadas de Después de la hibridación y las señales de hibridación obtenidas deberán reflejar las cantidades exactas de la moléculas de ácido nucleico formadas de control agregadas a la Antes de la puede ser deseable fragmentar las moléculas de ácido nucleico de La fragmentación mejora la hibridación mediante minimizar la estructura secundaria y la hibridación cruzada para las otras moléculas de ácido nucleico de muestra en la muestra o las moléculas de ácido nucleico no La fragmentación puede realizarse mediante medios químicos o Etiquetado Las moléculas de ácido nucleico de muestra o sondas pueden etiquetarse con uno o más porciones de etiquetado para permitir la detección de los complejos de molécula de ácido nucleico de Las porciones de etiquetado pueden incluir composiciones que pueden detectarse mediante medios ópticos o Las porciones de etiquetado incluyen radioisótopos tales como o compuestos proteínas de enlace átomos de metal marcadores tales como marcadores y tintes etiquetas enzimas etiquetas de espectrometría de etiquetas de donadores y aceptares de transferencia de electrones y los Los marcadores fluorescentes preferidos incluyen fluoroforas Cy3 y Cy5 Pharmacia Piscataway Hibridación La secuencia de la molécula del ácido nucleico de la SEC ID 1 31 41 45 y 47 u otra secuencia de codificación CD163 en la técnica y los fragmentos de los mismos pueden usarse en varias tecnologías de hibridación para varios Las sondas de hibridación pueden diseñarse o derivarse de cualquier secuencia CD163 de mamíferos pero puede hacer uso de aquellas secuencias descritas en la SEC ID 31 41 45 y Dichas sondas pueden hacerse de una región altamente específica o de una porción conservada y usada en protocolos para cuantificar el mensaje las variantes alélicas o las secuencias Las sondas de hibridación de la invención sujeto puede ser ADN o ARN y puede derivarse de cualquier secuencia CD163 de mamífero conocida en la técnica o de aquellas secuencias descritas en este documento como SEC ID 1 30 o de las secuencias genómicas que incluyen mejoradores e intrones del gen de La hibridación de las sondas PCR pueden producirse usando traducción de marcación de extremo o amplificación PCR en la presencia del nucleótido Un vector que contiene la secuencia de ácido nucleico puede usarse para producir una sonda de mARN in vitro mediante la adición de una polimerasa ARN y las moléculas de ácido nucleico Estos procedimientos pueden llevarse a cabo usando juegos comercialmente disponibles como aquellos proporcionados por Amersham Pharmacia La severidad de la hibridación se determinó por el contenido de de la dicha concentración y En la severidad puede incrementarse mediante reducir la concentración de sal o elevar la temperatura de En soluciones usadas por algunas hibridaciones basadas en la las adiciones de un solvente orgánico tales como la formamida que permite que la reacción ocurra en una temperatura La hibridación puede realizarse a baja severidad con los tales como 5xSSC con de sulfato dodecil de sodio a que permite la formación de un complejo de hibridación entre las secuencias de nucleótidos que contienen algunas Los lavados subsecuentes se realizan a alta severidad con los estabilizadores tales como con de SDS a o En alta los complejos de hibridación permanecerán estables solamente en donde las secuencias de ácido nucleico son casi completamente En algunas hibridaciones basadas en membrana de preferencia o preferiblemente más de la formamida puede agregarse a la solución de hibridación para reducir la temperatura en la cual la hibridación se realiza y la señales de fondo pueden reducirse por el uso de otros detergentes tales como Sakosyl o Tritón y un agente de bloqueo tal como el ADN de esperma de La selección de los componentes y las condiciones de hibridación son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y se revisan en Ausubel y Sambrook et Molecular A Laboratory Cold Spring Harbor Plainview Las condiciones de hibridación altamente severa son como hibridación a en una solución de hibridación que comprende de de 1 de de sulfato de dextrano y se lavó dos veces por 30 minutos a en una solución de lavado que comprende X SSC y de Se entiende en la técnica que las condiciones de la severidad equivalente puede lograrse a través de la variación de la temperatura y el estabilizador o la concentración de sal como se describe en et Protocols in Molecular John Wiley Sons pp a Las modificaciones en las condiciones de hibridación pueden determinarse empíricamente o precisamente calculadas con base en la longitud y el porcentaje del par de base de de la Las condiciones de hibridación pueden calcularse como se describe en Sambrook et Molecular A Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Nueva York a La especificidad de hibridación puede evaluarse mediante comparar la hibridación de moléculas de ácido nucleico de control de especificidad para la especificidad de las moléculas de ácido nucleico de muestra de control que se agregan a una muestra de una cantidad Las moléculas del ácido nucleico formadas de control de especificidad pueden tener una o más desigualdades de secuencia comparadas con las moléculas de ácido nucleico formadas De esta es posible determinar si solamente las moléculas de ácido nucleico formadas complementarias se hibridan a las moléculas de ácido nucleico de muestra o si se determinan las dobles híbridas desiguales que se Las reacciones de hibridación pueden realizarse en formatos de hibridación absolutos o En el formato de hibridación las moléculas de ácido nucleico de una muestra se hibridan a las moléculas en un formato de y las señales se detectan después de la formación del complejo de hibridación que se correlaciona con los niveles de molécula de ácido nucleico en una En el formato de hibridación la expresión diferencial de un juego de genes en dos muestras biológicas se Para la hibridación las moléculas de ácido nucleico de ambas muestras se prepara y se marca con diferentes porciones de Una mezcla de dos moléculas de ácido nucleico marcadas se agrega a una La posteriormente se examina bajo condiciones en las cuales las emisiones de las dos diferentes etiquetas son individualmente Las moléculas en la que se hibridan a números sustancialmente iguales de las moléculas de ácido nucleico derivadas de ambas muestras biológicas dan una fluorescencia combinada distinta et Publicación PCT En una modalidad las etiquetas son marcadores fluorescentes con espectro de emisión tal como fluoroforas Cy3 y Después de la la se lava para remover las moléculas de ácido nucleico no hibridadas y se detecta la formación compleja entre los elementos de formación hibridable y las moléculas de ácido Los métodos para detectar la formación compleja son bien conocidos por aquellos expertos en la En una modalidad las moléculas de ácido nucleico se marcan con una etiqueta fluorescente y la medición de los niveles y los diseños de fluorescencia indicadores de que la formación compleja se llevó a cabo mediante la microscopía de de preferencia microscopía de fluorescencia En un experimento de hibridación las moléculas de ácido nucleico de dos o más muestras biológicas diferentes se marcan con dos o más etiquetas fluorescentes diferentes con longitudes de onda de emisión Las señales fluorescentes se detectan separadamente con fotomultiplicadores diferentes establecidos para detectar las longitudes de onda Los niveles de relativa de las moléculas de ácido nucleico en dos o más muestras se las intensidades de fluorescencia de pueden normalizarse para tomar en cuenta las variaciones en las intensidades de hibridación cuando más de una formación se usa bajo condiciones de prueba En una modalidad las intensidades de hibridación del complejo de molécula de ácido nucleico de muestra formado individual se normalizan usando las intensidades derivadas de los controles de normalización interna contenidos en cada Pruebas Basadas en Polipéptidos La presente invención proporciona métodos y reactivos para detectar y cuantificar los polipéptidos Estos métodos incluyen los métodos bioquímicos analíticos tales como espectrometría de métodos cromatográficos y los similares o varios métodos tales como radioinmunoprueba pruebas de inmunoabsorbencia ligada a enzimas purebas de hibridación espectrometría de masa de captura de actividad biológica y otras posteriormente descritas y aparentes para aquellos expertos en la técnica bajo revisión de esta Inmunopruebas La presente invención también proporciona métodos para la detección de los polipéptidos CD163 que emplean uno o más reactivos de anticuerpo Como se usa en este una inmunoprueba es una prueba que usa un anticuerpo se define ampliamente en este documento y específicamente incluye quimeras y otros agentes de que específicamente unen un polipéptido o epítope Se conoce un número de formatos de prueba de enlace inmunológico bien establecidos apropiados para la práctica de la invención por ejemplo las Patentes Norteamericanas y por ejemplo Methods in Cell Biology Volumen Antibodies in Cell Academic New York Basic and Clinical Immunology Stites Harlow and supra es Capítulo y Ausubel et supra Capítulo las pruebas de unión inmunológica usan un de para unir específicamente a y comúnmente inmovilizar el analito a una fase En una el agente de captura es una porción que se une específicamente a un polipéptido o subsecuencia tal como un anticuerpo el producto de gen siendo probado se dirige directamente o indirectamente usando una etiqueta La etiqueta o grupo detectable usado en la prueba es usualmente un aspecto no crítico de la de manera que no interfiere significantemente con la unión específica del anticuerpo o anticuerpos usados en la La etiqueta puede unirse covaientemente al agente de captura un anticuerpo o puede unirse a una tercera tal como otro anticuerpo que específicamente se une al polipéptido La presente invención proporciona métodos y reactivos para las no competitivas y competitivas para detectar los polipéptidos Las no competitivas son pruebas en las cuales la cantidad del analito capturado este caso es se mide Una dicha prueba es una inmunoprueba basada en monoclonal de dos sitios usando reactivos de anticuerpos monoclonales de dos epítopes de en el polipéptido por ejemplo Maddox et para la información de En una prueba el agente de captura anticuerpo se une directamente a un sustrato sólido en donde se Estos anticuerpos inmovilizados entonces capturan cualquier polipéptido presente en la muestra de El polipéptido CD163 además inmovilizado puede es mediante unirlo a un segundo anticuerpo 63 soportando una el segundo anticuerpo CD163 puede carecer de pero se unirá por medio de un tercer anticuerpo marcado específico a los anticuerpos de las especies de las cuales el segundo anticuerpo se El segundo anticuerpo alternativamente puede modificarse con una porción tal como biotina a la cual una tercer molécula marcada puede unirse tal como estreptavidina marcada con En las pruebas la cantidad del polipéptido CD163 presente en la muestra se midió indirectamente mediante medir la cantidad de un polipéptido agregado desplazado completado de un agente de captura anticuerpo por el polipéptido CD163 presente en Una prueba de inhibición hapten es otro ejemplo de una prueba En esta el polipéptido CD163 se inmoviliza en un sustrato Una cantidad conocida del anticuerpo CD163 se agregó a la y la muestra posteriormente se contactó con el polipéptido CD163 En este la cantidad del anticuerpo CD163 unido al polipéptido CD163 inmovilizado es inversamente proporcional a la cantidad de polipéptido CD163 presente en la La cantidad de anticuerpo inmovilizado puede detectarse mediante detectar la fracción inmovilizada del anticuerpo o la fracción del anticuerpo que continua en la En este la detección puede ser directa en donde el anticuerpo se marca o indirecta en donde la etiqueta se une a una molécula que específicamente se une al anticuerpo descrito Formatos de Prueba Basados en Otros Anticuerpos La invención también proporciona reactivos y métodos para detectar y cuantificar la presencia de un polipéptido CD163 en la muestra mediante una un formato de inmunohibridación La otra inmunoprueba es de esta manera de flujo En una versión no competitiva de la cromatografía de flujo una muestra se mueve a través de un sustrato mediante por la acción capilar y abarca un anticuerpo marcado inmóvil que se une al analito formando un El conjugado entonces se mueve a través del sustrato y abarca un segundo anticuerpo inmovilizado que se une al el analito inmovilizado se detecta mediante detectar el anticuerpo En una versión competitiva de cromatografía de flujo una versión marcada del analito se mueve a través del portador y compete con el analito no marcado para unirse con el anticuerpo La mayor parte de la cantidad del analito en la lo menor del enlace por el analito marcado y por lo tanto la señal más por May et Patente Norteamericana y patente Norteamericana Dependiendo de la varios incluyendo el el anticuerpo blanco o el anticuerpo S pueden unirse a una superficie sólida o soporte un o papel Muchos métodos para inmovilizar las biomoléculas para una variedad de superficies sólidas se conocen en la Por la superficie sólida puede ser una membrana un plato de es decir polipropileno o un tubo de prueba o una varilla graduada látex y los un tubo microcentrifugado o un lecho de plástico o El componente deseado puede unirse covalentemente o unirse no covalentemente a través del enlace no Una amplia variedad de polímeros inorgánicos y ambos naturales y sintéticos pueden emplearse como el material para la superficie Los polímeros ilustrativos incluyen bifluoro polivinilideno acetato de nitrocelulosa y los Otros materiales que pueden incluyen materiales cementos y los pueden usarse las sustancias que forman tales como proteínas agarosa y Los polímeros que forman varias fases tales como polialquilenglicoles o tales como sales de alquilamonio de cadena larga átomos de y los similares también son En donde la superficie sólida es varios tamaños de poro pueden emplearse dependiendo de la naturaleza del Espectrometría de masa La masa de una molécula frecuentemente puede usarse como un identificador de la Por lo los métodos de espectrometría de masa pueden usarse para identificar un analito de Los espectrómetros de masa pueden medir la masa mediante determinar el tiempo requerido para un analito ionizado para correr debajo de un tubo de vuelo y para detectarse mediante un detector de Un método de espectrometría de masa para las proteínas es la espectrometría de masa de ionización de liberación de láser asistido por matriz En la el analito se mezcla con un material de matriz de absorbencia de energía que absorbe la energía de la longitud de onda de un láser y se coloca en la superficie de una Al golpear la matriz con el el analito se libera de la superficie de se ioniza y se detecta por el detector de Ver por Hillenkamp et Patente Norteamericana Otros métodos de espectrometría de masa para las proteínas se describen en Hutchens y Patente Norteamericana En dicho método referido como Superficies Mejoradas para la Captura de Afincada un reactivo de afinidad de fase sólida que une el analito específicamente o no tal como un anticuerpo o ión se usa para separar el analito de otros materiales en una Entonces el analito capturado se libera de la fase mediante por energía de ionizado y detectado por el Ácidos Nucleicos de la Invención Los ejemplos describen el descubrimiento de varios polinucleótidos La invención incluye estos polinucleótidos La presente invención proporciona varios polinucleótidos novedosos aislados secuencias de ADN y transcripciones de ARN y hebras ambas de hebra doble o incluyendo las variantes de las que codifican los polipéptidos CD163 Se reportan en este documento los polinucleótidos novedosos aislados que codifican los polipéptidos CD163 de mono verde africano de de de humano y de canino y que comprenden las secuencias establecidas en la SEC ID 1 45 y Deberá reconocerse que mediante la descripción de la SEC ID 1 41 45 y 47 se proporciona a un experto en la técnica una multitud de métodos para obtener estas Por medio de sería posible generar sondas de la secuencia descrita en las SEC ID 31 45 y 47 y bibliotecas genómicas o de porcino de de de de canino y del cADN del mono verde africano y por lo tanto obtener la SEC ID 1 31 41 45 y 47 completas o sus equivalente Sambrookl et Molecular A Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Nueva York También por medio de un experto en la técnica inmediatamente reconocería que dada la secuencia descrita en SEC ID 45 y 47 es entonces posible de generar los iniciadores apropiados para la amplificación PCR para obtener la secuencia completa representada por estas por ejemplo PCR Stockton Nueva Protocolos Una Guía para los Métodos y David John snisky y Thomas Academic Nueva Los polinucleótidos AND de la invención incluyen cADN y ADN que se ha sintetizado químicamente completamente o en parte y también se intenta que incluya variantes alélicas de los Las variantes alélicas son formas modificadas de una secuencia de gen de tipo sin la modificación resultante de la recombinación durante la segregación cromosomal o la exposición a condiciones que elevan la mutación Las variantes como los genes de tipo sin son secuencias de ocurrencia natural se oponen a las variantes de ocurrencia no natural que se elevan en manipulación in Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos CD163 novedosos se establecen en las SED ID 41 45 y El trabajador experto en la técnica rápidamente apreciará que el ADN de la invención comprende una molécula de doble por ejemplo la molécula que tiene la secuencia establecida en la SEC ID 45 y 47 junto con la molécula complementaria no o teniendo una secuencia deducible de la secuencia de las SEC ID 41 45 y 47 de conformidad con las reglas de paridad de base para el También se contempla mediante la invención otros polinucleótidos que codifican los polipéptidos CD163 de murino y de mono verde africano de las SEC ID 27 y 48 que difieren en la secuencia del polinucleótido de las SEC ID 1 41 45 y 47 en virtud de la degeneración bien conocida del código genético como es bien conocido en la La presente por lo contempla aquellas otras moléculas ARN y ADN que en codifica los polipéptidos de la SEC ID 27 y Teniendo identificada la secuencia del residuo de aminoácido que codificó el polipéptido CD163 porcino y con el conocimiento de todos los codones triples para cada residuo de aminoácido es posible para describir todas las secuencias de ADN y ARN de Las moléculas de ARN y ADN otras diferentes a aquellas descritas específicamente en este documento caracterizadas simplemente por un cambio en un codón para un aminoácido están por lo tanto dentro del alcance de esta Una tabla de aminoácidos y sus abreviaciones símbolos y codones se establece posteriormente en la Tabla 4 Tabla 4 Como es bien conocido en la los codones constituyen secuencias triples de nucleótidos en mARN y sus moléculas cADN Los codones se caracterizan por la base uracil cuando está presente en una molécula pero se caracteriza por la base timina cuando está presente en el Un simple cambio en un codón para el mismo residuo de aminoácido dentro de un polinucleótido no cambiará la secuencia o estructura del polipéptido Es aparente que cuando una frase inicial que una secuencia de nucleótido 3 particular cualquier aminoácido el experto en la técnica reconocerá que la tabla anterior proporciona un medio de identificación para los nucleótidos particulares como se Por medio de si una secuencia de tres nucleótidos particulares codifica la la tabla anterior describe que esas secuencias triples posibles son ACC y ACU si está en La invención incluye por lo un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido susCD163v1 establecida en las SEC ID 1 y 5 un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud para un polipéptido establecido en la SEC ID 2 un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o La invención también incluye un polinucleótido que una secuencia de polinucleótido susCD163v2 establecida en la SEC ID 12 ó 13 un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos de identidad similitud para un polipéptido establecido en la SEC ID 14 un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o La invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido CD63v2 murina establecida en la SEC ID 22 ó 23 un polinucleótido que codifica un poiipéptido establecido en la SEC ID 24 un polinucleótido que codifica un poiipéptido de la SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o La invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido CD163v3 murino establecida en la SEC ID 25 ó 26 un polinucleótido que codifica un poiipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud para un poiipéptido establecido en la SEC ID 27 un polinucleótido que codifica un poiipéptido de la SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o La invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido CD163v2 de mono verde africano establecida en la SEC ID 30 ó 31 un polinucleótido que codifica un poiipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud para un poiipéptido establecido en la SEC ID 32 un polinucleótido que codifica un poiipéptido de la SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o La invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 33 un polinucleótido que codifica un poiipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud para un poiipéptido establecido en la SEC ID 34 un polinucleótido que codifica un poiipéptido de la SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o La invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 35 un polinucleótido que codifica un poiipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud para un poiipéptido establecido en la SEC ID 36 un polinucleótido que codifica un poiipéptido de la SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o La invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 37 un polinucleótido que codifica un poiipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud para un poiipéptido establecido en la SEC ID 38 un polinucleótido que codifica un poiipéptido de la SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o La invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 39 un polinucleótido que codifica un poiipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud para un poiipéptido establecido en la SEC ID 40 un polinucleótido que codifica un poiipéptido de la SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o La invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 41 un polinucleótido que codifica un poiipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud para un poiipéptido establecido en la SEC ID 42 un polinucleótido que codifica un poiipéptido de la SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o La invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 43 un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud para un polipéptido establecido en la SEC ID 44 un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o La invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 45 un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 91 ó de identidad similitud para un polipéptido establecido en la SEC ID 46 un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o La invención también incluye un polinucleótido aislado que una secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID 47 un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud para un polipéptido establecido en la SEC ID 48 un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEC ID un polinucleótido que es el complemento de cualquiera de o La información de la secuencia de polinucleótido proporcionada por la invención hace posible la expresión a gran escala del polipéptido codificado mediante técnicas bien conocidas y rutinariamente practicadas en la Los polinucleótidos de la invención también permiten la identificación y aislamiento de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos CD163v1 de porcino tales como las variantes alélicas humanas y las especies mediante técnicas bien conocidas incluyendo la hibridación Southern Northern y la reacción de cadena de polimerasa Se conoce que la secuencia de cualquier secuencia CD163 descrita en este documento también hace posible a través del uso de la hibridación Southern o la reacción de cadena de polimerasa la identificación de las secuencias de ADN genómicas que codifican las secuencias reguladoras CD163 tales como los represores y los Como se anotó en la sección titulada de la los polinucleótidos de la invención también son útiles en las pruebas de hibridación para detectar la capacidad de las células para expresar el CD163 o medir los niveles de expresión Los polinucleótidos de la invención también pueden ser la base de los métodos de diagnóstico útiles para determinar la susceptibilidad de un animal a la infección por el virus como se describió La descripción en este documento de los polinucleótidos de longitud completa que codifica un polipéptido hace rápidamente disponible al trabajador experto en la técnica los fragmentos del polinucleótido de longitud La invención por lo tanto proporciona fragmentos únicos de los polinucleótidos que codifican el CD163 que comprenden al menos 15 a través de los nucleótidos consecutivos de secuencia de longitud completa entre cada uno y todos los valores de números de un polinucleótido que codifica un CD163 descrito en este Porque los polinucleótidos de la invención los comprenden secuencias únicas para la secuencia de polinucleótido que codifica el CD163 por lo tanto hibridan bajo condiciones moderadamente o altamente severas solamente decir a los polinucleótidos que codifican los varios polipéptidos Las únicas secuencias para los polinucleótidos de la invención son reconocibles a través de la comparación de secuencias para los otros polinucleótidos conocidos y pueden identificarse a través del uso de programas de alineación rutinariamente usadas en la es por aquellas disponibles en las bases de datos de secuencia Dichas secuencias también se reconocen de los análisis de hibridación Southern para determinar el número de fragmentos de ADN genómico al cual un polinucleótido se Los polinucleótidos de la invención pueden etiquetarse en una manera en la cual permita su incluyendo el etiquetado radioactivo y Uno o más polinucleótidos de fragmento único otros polinucleótidos CD163 como se describió pueden incluirse en los equipos que se usan para detectar la presencia de un polinucleótido que codifica el CD163 o se usa para detectar las variaciones en una secuencia de polinucleótido que codifica el También se hacen disponibles mediante la invención los polinucleótidos que reconocen e hibridan a los polinucleótidos que codifican el Se proporcionan los polinucleótidos de fragmento y de longitud Las moléculas de fragmento de la invención incluyen aquellos que reconocen específicamente e hibridan a las variantes descritas en este documento se determinó mediante la secuencia de comparación del ADN que codifica el CD163 para el ADN que codifica las otras moléculas La identificación de las secuencias únicas para los polinucleótidos que codifican el CD163 pueden deducirse a través del uso de cualquier base de datos de secuencia públicamente disponible a través del uso de los programas de comparación de secuencia comercialmente La singularidad de las secuencias seleccionadas en un genoma completo puede además verificarse mediante los análisis de Después de la identificación de las secuencias puede realizarse el aislamiento a través de la digestión de restricción o la amplificación usando cualquiera de las varias técnicas de reacción de cadena de polimerasa bien conocidas en la Los polinucleótidos son particularmente relevantes para regular la expresión de CD 63 mediante aquellas células que expresan el Los ácidos nucleicos de preferencia 10 a 20 pares base de capaces de enlazar específicamente a las secuencias de control de expresión CD163 o ARN CD 63 se introducen en las células mediante el vector viral o el sistema de dispersión coloidal tal como una El ácido nucleico enlaza a la secuencia de nucleótidos blanco CD163 de porcino en la célula y previene la transcripción o traducción de la secuencia Los oligonucleótidos antisentido metilfosfonato y fosforotioato se contemplan específicamente para uso terapéutico mediante la Los oligonucleótidos antisentido además pueden modificarse mediante polilisina transferina o porciones de colesterol en el extremo La supresión de la expresión CD163 de porcino en el nivel translacional o transcripcional es útil para generar los modelos celulares o animales para las enfermedades caracterizadas por la expresión CD163 de porcino aberrante o como una modalidad Como se anotó anteriormente en más los ácidos nucleicos de la invención incluyen los vectores que comprenden un polinucleótido en las células huésped para crear cantidades útiles del En otras el vector es un vector de expresión en donde el polinucleótido de la invención se une operativamente a un polinucleótido que comprende una secuencia de control de Dichos vectores son útiles para la producción recombinante de polipéptidos de la También se anoto anteriormente que la invención proporciona células huésped que se trasforman o transfieren o con los polinucleótidos de la invención o vectores de la Como se estableció dichas células huésped son útiles para la producción de virus y la producción de La invención también proporciona polipéptidos CD163 aislados codificados mediante un polinucleótido novedoso de la Polipéptidos de la Invención Los ejemplos describen el descubrimiento de varios polipéptidos CD163 La invención incluye estos polipéptidos CD163 novedosos que se establecen en las SEC ID 46 y La invención incluye por lo un poiinucleótido aislado que comprende un polipéptido susCD163 con la secuencia establecida en la SEC ID La invención también incluye un polipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud para un polipéptido establecido en la SEC ID La invención incluye por lo un poiinucleótido aislado que comprende un polipéptido susCD163v2 con la secuencia establecida en la SEC ID La invención además incluye un polipéptido que tiene al menos de identidad similitud para el polipéptido susCD163v2 establecido en la SEC ID La invención también incluye un polipéptido CD163v2 murino que tiene la secuencia establecida en la SEC La invención también incluye un polipéptido CD163v3 murino que tiene la secuencia establecida en la SEC La invención además incluye al menos un polipéptido que tiene ó de identidad similitud para un polipéptido establecido en la SEC ID La invención además incluye un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEC La invención además incluye un polipéptido que tiene al menos ó de identidad similitud para un polipéptido establecido en la SEC ID La invención también incluye un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEC La invención también incluye un polipéptido que tiene al menos de identidad similitud a un polipéptido establecido en la SEC ID 34 La invención también incluye un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEC La invención además incluye un polipéptido que tiene al menos de identidad similitud a un polipéptido establecido en la SEC ID La invención además incluye un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEC ID La invención también incluye un polipéptido que tiene al menos de identidad similitud para un polipéptido establecido en la SEC ID La invención también incluye un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEC ID La invención también incluye un polipéptido que tiene al menos de identidad similitud a un polipéptido establecido en la SEC ID La invención también incluye un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEC La invención también incluye un polipéptido que tiene al menos 91 de identidad similitud para un polipéptido establecido en la SEC ID La invención también incluye un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEC ID La invención también incluye un polipéptido que tiene al menos de identidad similitud para un polipéptido establecido en la SEC ID La invención también incluye un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEC La invención también incluye un polipéptido que tiene al menos de identidad similitud para un polipéptido establecido en la SEC ID La invención también incluye un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEC La invención también incluye un polipéptido que tiene al menos de identidad similitud para un polipéptido establecido en la SEC ID Los polipéptidos de la invención pueden aislarse de las fuentes celulares naturales o pueden sintetizarse químicamente pero de preferencia producirse mediante procedimientos recombinantes que involucran las células huéspedes de la El uso de células huésped de mamíferos se espera que proporcionen dichas modificaciones lipidación y como pueda necesitarse para conferir la actividad biológica en los productos de expresión recombinante de la Se abarcan las formas glicosiladas y no glicosiladas de los polipéptidos CD163 La sobreexpresión en los huéspedes eucarióticos y procarióticos como se describieron anteriormente facilitan el aislamiento de los polipéptidos La invención por lo tanto incluye los polipéptidos CD163 aislados establecidos en la SEC ID 48 y las variantes y sustituciones de aminoácidos conservadores en el mismo incluyendo los polipéptidos blanco y La invención incluye polipéptidos CD163 novedosos que son El término como se usa en este documento se refiere al enlace covalente o conjugación de cualquier grupo detectable incluyendo las enzimas peroxidasa de rábano fosfatasa alcalina y etiquetas fluorescentes y radiomarcas 32P y para el compuesto siendo Las técnicas para marcar varios compuestos incluyendo las péptidos y anticuerpos son bien Ver por Methods in Enzymology 103 Syvanen et 3762 Bolton and 529 El término marcado también puede abarcar un polipéptido que se ha unido covalentemente a una etiqueta de aminoácido como se describe los polipéptidos CD163 novedosos de la invención pueden marcarse Esto involucra la adición covalente de una porción para el polipéptido y el acoplamiento subsecuente de la porción agregada para un compuesto marcado o etiqueta que exhibe el enlace específico para la porción Las posibilidades de marcas indirectas incluyen la biotinilación del péptido seguida por la unión a al avidina acoplada a uno de los grupos de etiquetas Otro ejemplo sería incubar un anticuerpo radiomarcado específico para una etiqueta de histidina con un polipéptido CD163s comprendiendo una etiqueta de El efecto neto es unir el anticuerpo radioactivo al polipéptido debido a la afinidad considerable del anticuerpo para la La invención también abarca las variantes de la proteína CD163 En un las variantes de inserción se proporcionan en donde uno o más residuos de aminoácidos suplen una secuencia de aminoácidos CD163 Las inserciones pueden ubicarse en ambos términos de la proteína o pueden colocarse dentro de las regiones integrales de la secuencia de aminoácidos de la proteína Las variantes de inserción con residuos adicionales en o ambos términos incluyen por las proteínas de fusión y las proteínas que incluyen las etiquetas o marcas de Las variantes de inserción incluyen los polipéptidos novedosos CD163 en donde uno o más residuos aminoácidos se agregan a una secuencia de ácido CD163 o a un fragmento biológicamente activo del Las variantes de inserción por lo tanto también pueden incluir las proteínas de fusión en donde el término amino carboxi del polipéptido CD163 novedoso se fusiona a otro Varios polipéptidos de etiqueta y sus anticuerpos respectivos son bien conocidos en la Los ejemplos incluyen las etiquetas o el polipéptido de la etiqueta HA de la influenza y su anticuerpo 12CA5 et la etiqueta y los anticuerpos B7 y 9E10 del mismo et Molecular y Celular y la etiqueta D de la glicoproteína del virus del Herpes Simple et Protein Otros polipéptidos de etiqueta incluyen el péptido Flag et el péptido KT3 epítope et y el péptido epítope et y el gen T7 de la etiqueta del péptido de proteína 10 et 6397 el polipéptido CD163 puede marcarse con proteínas enzimáticas tales como peroxidasa y fosfatasa En otro la invención proporciona variantes de omisión en donde uno o más residuos de aminoácidos en un polipéptido novedosos se Las omisiones pueden efectuarse en uno o ambos términos del polipéptido novedoso o con la remoción de uno o más residuos dentro de la secuencia de aminoácidos CD163 Las variantes de por lo tanto incluyen todos los fragmentos del polipéptido CD163 Los polipéptidos CD163 contienen una transmembrana o membrana de la región de Deberá reconocerse que dichos dominios de transmembrana son útiles cuando se expresan en el contexto de una proteína heterologa para ayudar en el señalamiento de la proteína heterologa para las Deberá también reconocerse que puede ser ventajoso omitir algunos dominios transmembrana para mejorar la purificación o solubilidad de la Las variantes omitidas de la transmembrana de los polinucleótidos y del CD163 que los codifican son de valor potencial como terapéuticos Dichas variantes se describen específicamente en este documento como SEC ID La presente invención también incluye variantes de los polipéptidos anteriormente esto polipéptidos que varían de la secuencia de referencia mediante sustituciones de aminoácidos Las sustituciones conservadoras ejemplarizadoras se establecen en las Tablas 1 2 y 3 en la sección arriba titulada En aquellas situaciones en donde se prefiere aislar completa o parcialmente los polipéptidos novedosos la purificación puede llevarse a cabo usando métodos estándares bien conocidos por aquellos expertos en la Dichos métodos sin la separación mediante electrofóresis seguida por electro varios tipos de cromatografía tamiz molecular intercambio de cromatografía de líquido a alta En algunos puede preferirse usar más de uno de estos métodos para completar la La purificación de los polipéptidos CD163 novedosos puede llevarse a cabo usando una variedad de Si el polipéptido se ha sintetizado de manera que contiene una etiqueta como Hexahistidina u otro péptido pequeño tal como FLAG Kodak New o myc en su término amino o puede purificarse esencialmente en un proceso de un etapa mediante pasar la solución a través de una columna de afinidad en donde la matriz de columna tiene una alta afinidad para la etiqueta o para el polipéptido directamente un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente el Por la polihistidina se une con gran afinidad y especificidad al además una columna de afinidad de níquel como las columnas de níquel Oiagen Registered puede usarse para la purificación de por Ausubel et Current Protocols in Molecular Sección John Wiley New York Incluso si el polipéptido CD163 novedoso se prepara sin una etiqueta o marca para facilitar su el CD163 novedosos de la invención puede purificarse mediante la cromatografía de Para llevar a cabo los anticuerpos específicos para los polipéptidos CD163 deberán prepararse mediante medios conocidos en la Los anticuerpos generados en contra de los polipéptidos novedosos de la invención pueden obtenerse mediante administrar los polipéptidos o fragmentos de soporte análogos o células a un de preferencia un no humano usando protocolos de Para la preparación de anticuerpos puede usarse cualquier técnica conocida en la técnica que proporciona anticuerpos producidos mediante cultivos de líneas celulares Los ejemplos incluyen varias tales como aquellas en y Nature Kozbor et Immunology Today 72 Colé et en Monoclonal Antibodies and Cáncer Alan En donde los polipéptidos CD163 novedosos se preparan sin una etiqueta unida y ningún anticuerpo este otros procedimientos bien conocidos para la purificación pueden Dichos procedimientos sin cromatografía de intercambio de cromatografía de tamiz electrofóresis de gel nativo en combinación con la elución de gel y el enfoque isoeléctrico preparativo Hoefer En algunos dos o más de estas técnicas pueden combinarse para lograr la pureza Deberá entenderse que la definición de los polipéptidos de la invención se intenta que incluya los polipéptidos que soportan las modificaciones diferentes a la omisión o sustitución de residuos de Por medio de las modificaciones pueden ser covalentes en naturaleza e incluyen por ejemplo enlaces químicos con otras porciones inorgánicas y Anticuerpos También se contemplan mediante la presente invención los anticuerpos decir anticuerpos monoclonales y anticuerpos de cadena anticuerpos anticuerpos anticuerpos anticuerpos humanos y anticuerpos injertados con región determinante complementaria incluyendo los compuestos que incluyen las secuencias CDR que reconocen específicamente un polipéptido de la específicos para los fragmentos o CD163 novedosos del El término cuando se usa para describir los anticuerpos de la indica que las reglones variables de los anticuerpos de la invención reconocen y enlazan a los polipéptidos CD163 exclusivamente son capaces de distinguir los polipéptidos CD163 de otros polipéptidos conocidos en virtud de las diferencias medibles en la afinidad de a pesar de la existencia posible de la identidad de secuencia homología o similitud entre los CD163 novedosos y dichos Se entiende que esos anticuerpos específicos también pueden interactuar con otras proteínas proteína aureus A u otros anticuerpos en las técnicas a través de las interacciones con las secuencias fuera de la región variable de los anticuerpos y en particular en la región constante de la Las pruebas de análisis para determinar la especificidad de unión de un anticuerpo de la invención son bien conocidas y se practican rutinariamente en la Para una descripción comprensible de dichas ver Harlow et Antibodies A Laboratory Cold Spring Harbor Cold Spring NY Capítulo Los anticuerpos que reconocen y se unen a los fragmentos de los polipéptidos CD163 de la invención también se con la condición de que los anticuerpos primero son y seguirán siendo polipéptidos CD163 Los anticuerpos de la invención pueden producirse usando cualquier método bien conocido y rutinariamente practicado en la Los anticuerpos no humanos pueden humanizarse mediante cualquier método conocido en la En un los CDRs no humanos se insertan en un anticuerpo humano o secuencia de cuadro de anticuerpo Además los cambios pueden introducirse en el recuadro del anticuerpo para modular la afinidad o Los anticuerpos de la invención son útiles para los propósitos de diagnóstico para detectar o cuantificar los así como la purificación de los Los equipos que comprenden un anticuerpo de la invención para cualquiera de los propósitos descritos en este documento también se En un equipo de la invención también incluye un antígeno de control para el cual el anticuerpo es La presente invención además se pero no se limita por los siguientes Ejemplo 1 Transfección transitoria con el CD163 de porcino que confiere tolerancia a la infección del virus SRRP para una línea celular no El mARN total de las células del macrófago alveolar de porcino primario se usó para construir la biblioteca de cADN en el plásmido con el cADN clonado entre los sitios EcoRV y Un miembro de esta cuando se aisla y se transfectó transitoriamente en la línea celular de hámster confirió un fenotipo tolerante Las células se crecieron en medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con de suero de bovino fetal en una atmósfera de de C02 a Los cultivos celulares se transfectaron transitoriamente usando uL de Lipofectamina 2000 y ug de Una monocapa duplicada se transfectó con pPAMB de plásmido de control Este plásmido es careciendo de una La eficiencia de transfección se monitoreo con una proteína de fluorescencia verde de expresión de plásmido Aproximadamente 24 horas las monocapas se infectaron con genotipos Europeos o Norteamericano del virus Para la detección de la replicación las monocapas se fijaron usando de acetona aproximadamente 24 horas y se incubaron por aproximadamente 1 hora con anticuerpo SDOW17 monoclonal conjugado FITC Technologies Este anticuerpo monoclonal es específico para el nucleocápside viral SRRP expresado desde el recuadro de lectura abierta Un microscopio fluorescente invertido TE 300 Nikon con un objetivo se usó para fotografiar una monocapa que contiene células positivas FITC y una monocapa de control Se confirmó que las células transfectadas tolerantes para ambos genotipos Europeos y Norteamericano del La expresión de los genes virales puede detectarse en muchas células BHK transfectadas y el virus de progenitura se detectó rápidamente en el La transfección de control que usa el vector sin inserción o plásmidos irrelevantes no confirió La secuencia de la inserción en el plásmido usando el equipo de reacción de secuencia de tinte Big Terminator Versión Foster y el Analizador de ADN de Applied Biosystems 3730 reveló ungen que es altamente homólogo para el cADN del gen CD163 de porcino publicado de acceso Genbank El cADN se identificó conteniendo regiones no traducidas y adicionales relativas al AJ311716 y el cuadro de lectura abierta diferido en tres una omisión interna de 378 bp cerca del extremo una extensión del extremo para un codón ATG ascendente y dieciséis cambios de nucleótido predichos para causar 10 cambios de La identidad de secuencia entre las secuencias fue Las alineaciones de la secuencia CD163 de porcino recientemente descubiertas con la secuencia previamente reportada AJ3 son mostradas en las Figuras 1 y La nueva variante de porcino novedosa se designó g 2700 S i l I l t Ejemplo Construcción del plásmido pCMVsusCD163v1 La construcción del plásmido pCMVsusCD 63v1 se realizó como El clon funcional identificado en la biblioteca cADN del macrófago de porcino primario como confiere la tolerancia al VSRRP servido como la plantilla para la amplificación PCR de la inserción incluyendo las regiones y no usando los iniciadores ID Y 3 D163 ID iniciador incorpora un sitio de restricción Sacll en el extremo de la inserción mientras el iniciador incorpora un sitio de restricción ???? en el extremo de la inserción Las reacciones que contienen 190ng de la plantilla de plásmido se amplificaron usando polimerasa del ADN Pfx platino de siguiendo las instrucciones del Las reacciones se calentaron a por 2 minutos entonces se ciclaron 35 veces a través de por 20 por 30 segundos y por minutos seguidos por una extensión terminal en por 7 Los productos PCR resultantes se purificaron usando el equipo de purificación de PCR Qiaquick de digerido con enzimas de restricción Sacll y Xhol y los fragmentos resultantes se purificaron con gel usando el equipo de Extracción de Gel Qiaquick de El fragmento PCR posteriormente se ligo en el plásmido Script de preparado para aceptar el fragmento PCR digerido mediante la digestión con Sacll y Xhol seguido por la purificación de gel descrita El material ligado se transformó en la hebra DH5a y los recombinantes se seleccionaron mediante el crecimiento en 50 de kanamicina y se identificaron mediante análisis de El plásmido contiene la inserción CD163 de porcino internamente omitida descrita en el Ejemplo 1 bajo el control transcripcional del promotor eucariótico y el gen de resistencia de bajo el control de ambos promotores procarióticos y Ejemplo Construcción del vector de expresión y pRSVsusCD163v1 El plásmido se usó como una plantilla para la amplificación PCR del promotor La secuencia del promotor RSV se contuvo dentro de los nucleótidos 209 a través de 604 de El iniciador delantero PCIRSVLTR ID y el iniciador inverso VSRRTLSAC ID se Los sitios de reconocimiento Pci y Sac de la endonucleasa de restricción se incorporaron en los iniciadores y para la clonación El PCR se realizó usando el equipo de Polimerasa de ADN de etiqueta HotMaster siguiendo las instrucciones del Las reacciones contuvieron ng de la plantilla del plásmido y de cada iniciador anteriormente Las reacciones se calentaron a por 2 minutos entonces se ciclaron 30 veces hasta por 20 por 10 segundos y por 1 El fragmento PCR resultante se digirió con las enzimas de restricción Pci y Sac se purificó en gel y se clonó en el plásmido que se había digerido similarmente para remover la secuencia del promotor La construcción final colocó al promotor RSV inmediatamente ascendente del sitio de clonación múltiple y se nombra La inserción susCD163v1 se clonó debajo del promotor RSV como La secuencia susCD163v1 se separó del plásmido pCMVsusCD163v1 mediante digestión de restricción I y Sac y se purificó con Este fragmento se ligó en que también se había digerido con las mismas enzimas y el gel La mezcla de ligación se transformó en DH5a y los transformados seleccionados usando kanamicina a El clon que contuvo la inserción correcta se designó Ejemplo Clonación y caracterización de una variante más grande de cADN CD163 de porcino Basado en la secuencia CD163v1 de un iniciador delantero ID y un iniciador inverso pnl ID se designó usando el programa Lasergene PrimerSelect Madison para la amplificación de un gen CD 63 porcino de amplia Los sitios de restricción endonucleasa de restricción para Notl y Kpn I se incubaron en los iniciadores y respectivamente para permitir la clonación El ARN celular total se preparó de los macrófagos alveolares primarios cultivados de lavados de pulmón de cerdos La preparación se hizo usando el mini equipo RNeasy Las reacciones se prepararon usando una etapa de PCR para el equipo Long Templates y los parámetros se establecieron como por 30 por 2 30 30 seg y 4 por 35 por 10 Los productos PCR se analizaron en de geles de agarosa GTG Los productos de de varios tamaños se cortaron de los geles de agarosa y el ADN se extrajo usando el equipo GeneClean Estos productos PCR se clonaron en el vector de clonación Los clones se analizaron mediante la digestión de la enzima de restricción para la presencia de un Las colonias que contenían las inserciones se secuenciaron usando el equipo de Reacción de Secuencia versión Big Dye Terminator Foster y el analizador de ADN Applied Biosystems 3730 para confirmar la autenticidad de Las secuencias se editaron y ensamblaron usando los programas Lasergene EditSeq y SeqMan Madison Un plásmido con una inserción grande se designó conteniendo la variante 2 de de porcino que se había designado SEC ID La secuencia de codificación contenida dentro de la SEC ID 12 se reprodujo abajo y se designó SEC ID El análisis de secuencia mostró este CD163 de porcino que codifica una secuencia de aminoácido de aminoácidos que se han designado SEC ID Cuando se compara a la secuencia CD163 de porcino en GenBank de Acceso la secuencia CD163v2 es idéntica en el extremo extendiendo el recuadro de lectura abierto a un codón de iniciación ATG ascendente en cuadro en la secuencia CD163v1 de porcino descrita en el ejemplo El CD163 de porcino es idéntico al CD163 de humano de acceso GenBank y idéntico al CD163 de ratón de Acceso GenBank en el nivel de La secuencia de señal predicha y la región transmembrana de la SEC ID 14 se indicaron mediante el subrayado y negritas Para determinar si otras secuencias CD163 contienen características de secuencia similares es fácilmente determinado por la inspección de la El sus CD163 v2 en el pCRsusCD163v2 se liberó del vector después de la digestión y purificación en gel de las enzimas Kpn I y Not El vector de recepción también se cortó con el mismo par de enzima de restricción y se permitió una clonación dirección del susCD163v2 en el Después de la ligación de susCD163v2 con el la mezcla ligada se usó para transformar las células SRBL coli Un transformante se encontró que contenía el gen CD163 mediante el análisis de digestión de enzima de restricción y se designó el clon 3 Ejemplo Preparación de un promotor RSV basado en el sistema de expresión mediante la ligación directa y el método de Un procedimiento basado en no clonación para generar las cantidades de microgramos del ADN lineal apropiado para usarse en la generación de líneas celulares estables expresando CD163 de un promotor RSV se desarrolló El procedimiento involucra el aislamiento y la ligación de las dos piezas del una conteniendo el gen de neomicina y la cinta del promotor RSV derivado del y el otro conteniendo la secuencia de codificación susCD163v2 de El plásmido del vector se linearizó con Dralll ascendente del gen de neomicina y golpeado ligeramente con el fragmento lenow de la polimerasa del ADN Este plásmido posteriormente se digirió con inmediatamente descendente del promotor El clon pC se digirió en la secuencia del vector descendente de la inserción con y se golpeó ligeramente con el fragmento Klenow de la polimerasa de La secuencia de codificación se liberó del vector con un inmediatamente ascendente de la secuencia de codificación Para cada digestión de se purificaron los fragmentos apropiados de los geles de Se realizó como sigue una reacción de ligación a gran Aproximadamente 20 de cada fragmento de ADN se incubó en un volumen de 600 µ? con unidades de ligasa de ADN La reacción se incubó a temperatura ambiente por 20 en cuyo tiempo se removió una alícuota y la reacción se congeló en hielo El análisis de gel de agarosa de la alícuota reveló que una cantidad significante de ADN no ligado de otra manera 15 unidades de ligasa se agregaron y se incubaron por otros 10 minutos a temperatura Siguiendo la una pieza lineal de ADN conteniendo todos los elementos apropiados que se purificaron mediante electrofóresis de gel de La ligación de los dos fragmentos de ADN vía el término Nofí cohesivo resultó en la colocación de las secuencias del gen CD163 descendente del promotor permitiendo la expresión directa de CD163 en las células de Una vez el ADN purificado se usó para transfectar varias líneas celulares de Ejemplo Clonación y caracterización del cADN CD163 humano Basado en una secuencia de cADN humana conocida de Acceso GenBank un iniciador delantero ID y un iniciador inverso ID designaron usando el programa Los sitios de restricción para y se incorporaron en los iniciadores y para facilitar la clonación en los vectores de La secuencia CACC se agregó al extremo del iniciador para permitir la clonación direccional en el vector TOPO de K49001 ver la Figura Los cADNs C163 de humanos se amplificaron del ARN extraído de la línea celular U937 después de la estimulación con el por 3 El ARN celular total se preparo usando el equipo Rneasy Las reacciones y los métodos de secuenciación fueron los mismos como los descritos en el Ejemplo Los productos PCR se separaron en de gel de agarosa SeaKem y se extrajo con el gel usando el equipo Los productos PCR se clonaron direccionalmente en el vector TOPO siguiendo las instrucciones de los Dos clones con grandes insertos se La secuenciación y los métodos de análisis de secuencia se describieron en el Ejemplo Un clon con un inserto correcto se designó y se había designado la secuencia del inserto de la SEC ID El recuadro de lectura abierta CD163 en el es 21 residuos en longitud SEC ID que codifica la SEC ID 9 posteriormente y es idéntica a GenBank Z22968 cADN CD163 humano de la misma La secuencia CD163v2 de humano es también idéntica al GenBank BC051281 y Z22969 deslizantes del CD163 de excepto que 42 residuos no homólogos en las secuencias GenBank reemplazan los siete residuos de nuestra Esta diferencia es debido a la presencia de un exón de 83 nucleótidos en BC051281 y Z22969 y el recuadro resultante cambio en el extremo del y Un Nuevo antígeno de diferenciación de que es un miembro de la superfamilia del receptor European Journal of Immunology 23 SECUENCIA ID NO SBC ID luso Ejemplo Clonación y caracterización del CD163 murino Basado en la secuencia de CD163 murino en GenBank un iniciador delantero ID y un iniciador inverso ID se designaron usando el programa Los sitios de restricción endonucleasas para Notl y Kpnl se incluyeron en los iniciadores y para permitir la clonación futura en otros vectores de Los macrófagos peritoneales de ratón se cultivaron de ratones de 2 días después de la inyección de medio de tiogliocolato en la cavidad El ARN celular total fue preparado de los macrófagos peritoneales usando el equipo Las reacciones y los parámetros fueron los mismos como se describió en el Ejemplo excepto que la temperatura de templado se incremento a y la temperatura de extensión se incremento a El producto PCR se purificó en de de agarosa SeaKem y se clonó direccionalmente en de conformidad con las instrucciones del Varios clones con inserciones largas se identificaron para el análisis Un plásmido que contiene una inserción ID con un CD163 murino que codifica una proteína de la misma longitud como aminoácidos de la SEC ID y difiere de GenBank AF274883 por solamente dos aminoácidos de se designó Otro se el cual contuvo una inserción ID conteniendo una secuencia de codificación CD163 murina ID que codifica una proteína de 1159 aminoácidos en longitud ID Difiere de AF274883 por solamente 3 aminoácidos dentro de los primeros 1107 residuos de pero las secuencias divergen completamente iniciando en el residuo Esto es debido a una inserción de 82 nucleótidos en el cADN y un intercambio concomitante en el recuadro de lectura descendente de la Como un el CD163v3 murino contiene 52 aminoácidos en su término carboxi que no son homólogos a los residuos terminales 14 carboxi de CD163v2 Estas dos versiones alternas de CD163 murino de son más parecidas a la variante deslizante del mismo como se ha descrito para el CD163 de humano Zhang y Masón Un nuevo antígeno de diferenciación del macrófago que es un miembro de la superfamilia del receptor European Journal of Immunology SECUENCIA NO SECI 300 M Mtt uto ano e Ufo USO e 3040 ct g at i 3000 a Ejemplo Clonación y caracterización de CD163 Un iniciador delantero CD163 de simio ID basado en el CD163 de y un iniciador inverso ID se usaron para amplificar el cADN de CD163 de las células del riñon de Mono Verde Africano El ARN celular total se preparó de las células usando el equipo Los parámetros de fueron los mismos como se describió en el Ejemplo Los productos se clonaron direccionalmente en el vector de conformidad con las instrucciones del Varios clones conteniendo los insertos grandes se El clon 25 se designó Este cADN CD163 novedoso de las células es 1116 aminoácidos en Cuando se preparó para las secuencias en la base de datos la secuencia de aminoácidos CD163 es idéntica para el CD163 de humano idéntica al CD163 de cerdo y idéntica al CD163 de ratón SECUENCIA t 60 30 900 1030 1140 ft uto fc 3100 3340 3530 t acto 3700 3040 3300 3434 i V t I5 V 31 y 32 Ejemplo Clonación y caracterización del de simio de las células Vero Un iniciador delantero de CD163 de simio ID basado en el CD163 de y un iniciador inverso ID se usaron para amplificar el cADN de CD163 de las células El ARN celular total se preparó de las células Vero usando el equipo Los parámetros fueron los mimos como se describe en el Ejemplo Los productos se clonaron direccionalmente en el vector de conformidad con las instrucciones del Ocho clones conteniendo las inserciones grandes se secuenciaron y seis diseños de deslizamiento discreto se Estos parámetros se representan gráficamente en la Figura Las seis variantes deslizantes difieren en la presencia o ausencia de tres designándose E105 y Las omisiones de E6 ó E105 no cambian el recuadro de puesto que es la omisión Los diseños similares al v2 v3 también se observan en las células de simios de de murinos y de Los diseños v4 y v5 carecen de exón nucleótido 105 que codifica la región transmembrana Estos cADNs son capaces de producir las células BHK tolerantes para la infección VSRRP en una prueba de transfección probablemente porque la CD163 se secreta más que el enlace de membrana Aunque las moléculas CD163 que carecen de región transmembrana parecen ser no funcionales como factores tolerantes es posible que puedan tener utilidad en la neutralización directa del virus a los anticuerpos de o como un inmunogen para la inducción de los anticuerpos que podría bloquear la infección viral en los animales La variante deslizante más larga contiene todos de los tres exones E105 y Este cADN del CD 63 novedosos de las célula Vero codifica un polipéptido que es 1153 aminoácidos de Cuando se compara a las secuencias en la base de datos la secuencia del aminoácido Vero es idéntica al CD163 humano idéntica al CD163 de cerdo y idéntica al CD163 de ratón Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las seis variantes deslizantes en las células Vero se proporcionan posteriormente ID SECUENCIA V S A D V K SJSC y S 1 T I 1 i S 1 I x c a X T V C V V X C C T X K A I II I II V I C 9 1 S I t ?? 8 I t C S S X X C A V S S 9 D 2 X ß o a ? a o L y g i v ? x g v v c c s y r Í C X V M S C D S D F 5 A A V C 1501 c o v v s x x fl v c X C A 101 C V A e C V A i A S C C C V A V c B s r r x A C x A V V C i 2531 g e v g v T c t X C 0 P S A x X i r e i 1031 C II t I 4 ß c v t v x V C 1301 E C C a t H C P V A v c i c v t fl s G 8 P I X S V A C X S R A V V C ? ? ? ß 6 ? ? ß ? ß ? ß ? i o t ? g g o ír o c S S M C S Q t x x I X f i i t V C 0 1 i 1 t f I ß I i 0 1 I I I ? ? ß r x X V A C C T T A I V A V C T e X X fi V V C 401 s A v v c c A T s y x A M C k A c A í V 5 0 1 fi V V D A X X C X C X 8 C V A e v S I X V X S C X C R V X T i C C E I A V C X v A S a A H I G 3 V C T G X XAH X V i A V 1 i y x x A V Y C O C A A A v C 8 S A V T S i c i 201 C ß A V ß e i fi 321 I I f S C A C C A A V Z C S V ? s t C D D S4i V A C A X V 321 A e o r s V C X B B r C D A s x C V C G A V V C C A o v r s 1331 C Y A I T C A e 1441 V C P S A A V C C ? V V 8 v c sr v v v c s T ? ? t ? ? c i v A ? ? ß ? ? ? 3041 ß ß e a t o ? ß ? ? ? ? ß ? ? E C A V I C r A o v C T I 3 C C P S C S V l 3 Q 6 V t V C fi A i f C T G I X V I C S A A V C T A t T B X ? ? ? ? ß ? ? ? c g I C I s c v c a A V C Q C A f T i T C P T A I T C A C l V C v i I 1 1 E Ir t l C V I X V X C V S T c i t c s 3041 A V R C A V I T S C C I A T S A a f Q I C 8 S C C S 2341 Q C S A V C S C A B I V C f ß e I 1 I 1 X t I fl A 1001 I I I 4 I t S 9 O I V I S C M S S S S 8 A ? X A 2 S S S SEC 121 AOT 2021 Ejemplo Clonación y caracterización del CD163 canino de las células DH82 Un iniciador delantero CD163 de simio ID CACCGGAATG AG CAAACTC AG AATG basado en el y un iniciador inverso ID se usaron para amplificar el cADN de las células El ARN celular total se preparó de las células DH82 usando el equipo Los parámetros fueron los mismos como se describió en el Ejemplo Los productos sé clonaron directamente en el vector de conformidad con las instrucciones del Se analizaron varios clones que contienen grandes Se analizaron varios clones con inserciones grandes y estos caen dentro los diseños de deslizamiento v2 ó v3 observados en otras Al variante v2 le faltó un exón de 81 nucleótidos relativa al variante que resulta en un intercambio de recuadro de lectura y las secuencias de aminoácidos carboxi terminales El cADN CD163 v2 de canino de las células DH82 codifican un polipéptido de 1115 Cuando se compara con las secuencias en la base de datos es idéntico al CD163 de humano idéntico al CD163 de cerdo y idéntico al CD163 de ratón Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de las dos variantes de deslizamiento encontradas en las células DH82 se proporcionan posteriormente ID SECUENCIA ID S V C ID r S A X G C a c A A fi A á a V S C G A C S C A S V T C S S C I V Q S V C P X A fi V V 541 201 C S A V S ? ? IT ß C A t V V X C 261 S ? V D 6 V T I C X S V fi V C C r A V A 901 X W C y C 8 1021 v 1201 I A C s C I i t V I I I V C V 1441 c s i c i S4 A y C S 8 C S V A p D a T C V V V C 6 T ? ? 3 ? ß ? ? C g C V T A Q A C A G V A V I c i 2101 C 74 X C X A V V C 2221 i V C C X S ii C S S 2341 W C V I C S I S i l S I C A V V V C C A I P A s ii c x i i ø T C A c V T V C a ß C I c t t i 3121 1 11 I 9 ß I V 1041 V K A 1101 V a D r V PflAVA SBC ID 121 341 301 461 541 601 841 AA A S V S S S A 0 3X C 8 A Y V V Z ft S41 301 G N A C V 2032 Ejemplo Varias líneas celulares se vuelven tolerantes a la infección Norteamericana del virus VSRRP seguida de la transfección transitoria con Se obtuvieron riñon de porcino de líneas testiculares de cerdo Norden Labs de riñon de perro Norden Labs de Pfizer y se cultivaron a y de C02 en medio de crecimiento consistente de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco número de catálogo suplementado con suero de bovino fetal 1mM de piruvato de 2 de y Las líneas celulares de riñon de hámster bebé riñon de felino Norden Labs y pulmón de conejo se obtuvieron de Pfizer y se cultivaron a y de C02 en medio de crecimiento que consiste de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco número de catálogo suplementado con de suero de bovino fetal 1 mM de piruvato de 2 de glutamina y Las células Vero se obtuvieron de Pfizer y se cultivaron a C y de C02 en medio de crecimiento consistiendo de Alfa Medio Esencial Mínimo suplementado con de suero de bovino fetal 2 de y Gentamicina a 20 microgramos por Los pozos de cultivo celular conteniendo aproximadamente 1x106 células se transfectaron con 2 microgramos por pozo de plásmido en DMEM sin FBS o usando Lipofectamina 2000 de catálogo Invitrogen de conformidad con la instrucciones del La línea celular RL se transfectó con microgramos de plásmido Un miembro de la biblioteca de cADN de célula PAM sin una designada pPAMB y el vector del plásmido pSport se usó como un plásmido de control A las 24 horas los pozos de se aspiraron y se lavaron dos veces con de FBS seguidos por la infección con VSRRO norteamericano aislado El virus se permitió absorber en mi de medio de crecimiento por un mínimo de dos después de las cuales se agregó medio adicional a un volumen final de mi y se incubó durante la El virus entonces se los pozos se lavaron dos veces con medio de crecimiento y el medio de cultivo fresco agregado mi por Una muestra de tiempo cero del fluido de cultivo se tomó inmediatamente para determinar el fondo del virus de infección del En un mínimo de 48 horas los cultivos se analizaron para tolerancia mediante remover los fluidos de cultivo para probar el virus y las células tolerantes en la monocapa se detectaron mediante la prueba de anticuerpo fluorescente La FA se completó mediante fijar la monocapa con de acetona y marcada con anticuerpo monoclonal FITC conjugado SDW017 Technologies que es específico para la proteína del nucleocápside El virus viable se titraron mediante diluciones de inoculación de los fluidos de cultivo en las células La tabla 5 muestra los resultados de la infección de virus por FA y la presencia del virus de progenitura para cada línea celular La falla para detectar el virus de progenitura de algunas líneas celulares puede ser el resultado de la baja suspensión del virus en los fluidos de cultivo abajo del límite de detección de la La tolerancia de las células Vero para la infección VSRRP se aumentó por la expresión de Comparado con la medición cero del virus de existió cercanamente un incremento en las suspensiones del virus en las células Vero transfectadas con si existe menos que un log en el incremento de la suspensión en las células transfectadas con el plásmido pPAMB del plásmido de control Todas las líneas celulares excepto fueron positivas para FA para tolerancia a la infección P129 del aislado VSRRP norteamericano después de la transfección con Tabla 5 Altamente positivo Moderadamente positivo Ligeramente positivo No detectable NT No probado Ejemplo Células BHK21 se volvieron tolerantes a la infección VSRRP europea seguida por infección transitoria con La línea celular de riñon de hámster bebé se obtuvo de Pfizer y se cultivaron a y de C02 en medio de crecimiento consistiendo de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco número de catálogo Invitrogen suplementado con de suero de bovino fetal 1 mM de piruvato de 2 mM de y Los pozos de cultivo celular conteniendo aproximadamente 1x106 células se transfectaron con 2 microgramos por pozo de plásmido en DMEM sin FBS o usando Lipofectamina 2000 de catálogo Invitrogen de conformidad con las instrucciones del En las 24 horas los pozos se aspiraron y se lavaron dos veces con de FBS seguido por la infección de aislado 96V196 VSRRP El virus se permitió absorber por un mínimo de 2 El virus posteriormente se los pozos se lavaron dos veces con medio de crecimiento y el medio de crecimiento fresco agregado mi por Una muestra de tiempo cero del fluido de cultivo se tomó inmediatamente para determinar el novel de fondo del virus infeccioso del En un mínimo de 48 horas los cultivos se analizaron para tolerancia mediante remover los fluidos de cultivo para probar el virus viable y las células tolerantes en la monocapa se detectaron mediante la prueba de anticuerpo fluorescente El FA se completó mediante fijar la monocapa con de acetona y se marcó con anticuerpo monoclonal FITC conjugado SDOW17 Technologies que es específico para la proteína nucleocápside El virus viable se suspendió mediante diluciones de inoculación de los fluidos de cultivo en las células Como un resultado de la transfección transitoria de B H21 con las células se hicieron tolerantes para la infección del aislado 96V198 VSRRP europeo y se produjo el virus de progenitura Ejemplo Genes CD163 de especies animales múltiples produce las células BHK21 tolerantes para la infección de virus SRRP Las células BH 21 crecieron en D EM de catálogo Invitrogen suplementado con de suero fetal de 1 mM de piruvato de sodio y antibióticos se usaron en los experimentos de transfección Antes las células de transfección se lavaron una vez con OtiMEM sin suero u otros Se usó la lipofectamina 2000 en todos los experimentos de transfección de conformidad con el protocolo proporcionado por el La mezcla de transfección consiste de 10 microlitos de Lipofectamina 2000 y microgramos de ADN por pozo de 35 Después de la incubación durante toda la el medio de transfección se removió y las células se infectaron con aislado P129 La infección se permitió progresar por cuando las células se fijaron con de acetona y se marcaron con anticuerpo monoclonal SDOW17 conjugado con FTTC Technology El marcado de la proteína nucleocápside se visualizó bajo microscopio de Tabla Transfección transitoria en las células BHK21 con varios genes CD163 las hace tolerantes a la infección del virus SRRP Tabla 6 Altamente positivo Moderadamente positivo Ligeramente positivo Ejemplo Generación de las líneas celulares estables BHK21 tolerantes VSRRP usando Las células se cultivaron en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con de suero de bovino 1 mM de piruvato de sodio y Para la las células se cultivaron en aproximadamente de confluencia en 6 placas de pozos y se incubaron durante la noche a en de Las células sé transfectaron con ADN usando lipofectamina 2000 de conformidad con instrucciones del Un día después de la transfección las células se trataron con tripsina y se en placas de 96 pozos en una serie de Para seleccionar los transfectantes el medio se suplemento con 1 de Geneticin número de catálogo Invitrogen de este punto El medio se cambió cada Las placas se cultivaron hasta que aquellos pozos con colonias derivados de las células simples alcanzaron la confluencia en el punto en que las placas se trataron con tripsina y se cultivaron en placas de 96 pozos Una de las placas de 96 pozos duplicadas se infectaron con aislado P129 VSRRP y los clones tolerantes a la infección se identificaron mediante marcado con anticuerpo SDOW17 monoclonal conjugado Los clones positivos entonces se expandieron de la segunda placa Para asegurar la los cultivos positivos se clonaron con célula simple mediante dilución En cada los subclones que despliegan crecimiento robusto y alta tolerancia al VSRRP se seleccionan para Tres clones designados BHK 5 y 12 se Estas líneas celulares han mantenido el fenotipo tolerante a través de 20 Ejemplo Generación de líneas celulares estables 21 VSRRP tolerantes usando Las células se cultivaron como se describe en el Ejemplo Las células BH se transfectaron con pRSVsusCD163v1 usando Lipofectamina 2000 como se describe en el Ejemplo La clonación de las células transfectadas y el análisis para los clones tolerantes se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo De la clonación se identificaron 3 clones celulares simples como tolerantes y se reclonaron subsecuentemente dos veces para asegurar la homogeneidad y para intentar aislar los subclones de alta tolerancia la Figura Las líneas celulares resultantes se nombraron y Todos estos clones han mantenido el fenotipo tolerante a través del pasaje más alto probado para el clon pasaje 7 para el clon y pasaje 5 para el clon Ejemplo Generación de líneas celulares estables de riñon de felino tolerantes VSRRP usando Las células de riñon de felino Labs Norden parenterales se cultivaron a y de C02 en medio de Eagle Modificado de Dulbecco de catálogo Invitrogen suplementado con de suero de bovino 1 mM de piruvato de sodio y Varios pozos de 35 mm conteniendo aproximadamente 2x10 células cada uno se transfectó con 4 microgramos por pozo de en OptiME usando Lipofectamina 2000 de catálogo Invitrogen de conformidad con las instrucciones del Después de la incubación durante la las células se removieron del sustrato usando Cautaza Cell número de catálogo diluido en medio y se cultivaron en tres placas de 96 pozos en tres densidades 2 x 2 x 103 y 2 x 104 células por Las células se establecieron durante la noche a antes de iniciar la selección de transformadores A la siguiente el medio se reemplazó con 100 bien fresco conteniendo 500 de Geneticina número de catálogo Invitrogen para seleccionar las células que expresan el gen de resistencia de El medio se cambió cada 2 ó 3 días para mantener la potencia Después de 19 días de la placa de 96 pozos con la densidad celular inicial más baja 200 produjeron 70 pozos vacíos y 26 pozos con una o más colonias de las células resistentes G418 calculado de células es usando la distribución Estos 26 pozos se deslizaron en pozos duplicados y se permitió establecerse durante la Un juego de pozos se infectó con el aislado P129 se incubó por 24 entonces se fijó con de acetona y se marcó con anticuerpo SDOW17 monoclonal FITC conjugado Technologies que es específico para el nucleocápside De los 26 8 contuvieron algunas células que se infectaron por Uno de estos designado fue claramente más tolerante que los otros con cerca de de las células marcando positivas para el antígeno Mediante el número de pasaje celular existió alguna evidencia de heterogeneidad fenotípica en la línea celular Por lo las células se clonaron por célula simple mediante limitar la dilución en el medio conteniendo iniciando con las reservas congeladas de pasaje Doce de dichos clones se expandieron para De los clones y susCD fueron notables por su estabilidad para formar placas discretas localizadas de cuando se infectan con el aislado P129 VSR P la Figura Ejemplo Generación de las líneas celulares estables de riñon de felino tolerante a VSRRP usando Las células de riñon de felino Norden Labs se cultivaron a y de C02 en Medio Alfa Medio Esencial Mínimo de catálogo Invitrogen suplementado con de suero de bovino fetal y Las células NLFK se cultivaron en placas de 6 pozos en aproximadamente de confluencia y se permitió unirse durante la Las células posteriormente se transfectaron con plásmido usando Lipofectamina 2000 siguiendo las instrucciones del Después de 24 las células se clonaron como se describe en el Ejemplo El análisis de los clones de células tolerantes VSRRP se realizó como se describe en el Ejemplo Los cuatro clones se seleccionaron del análisis y fueron clonados con célula simple mediante limitar la dilución dos Cuatro clones nombrados FK 3 y se Las líneas celulares han mantenido el fenotipo tolerante VSRRP a través de al menos 8 pasajes la Figura Ejemplo Generación de líneas celulares estables de riñon de porcino tolerables VSRRP usando Las células de riñon de porcino parenteral se obtuvieron de Pfizer y se cultivaron a 37 grados C y de C02 en medio de crecimiento consistiendo de Medio Eagle Modificado de Dulbecco número de catálogo Invitrogen suplementado con de suero de bovino fetal 1 mM de piruvato de 2 mM de y Los pozos del cultivo del tejido conteniendo aproximadamente 1x106 cada una se transfectó con 2 microgramos por pozo de plásmido en DMEM sin FBS o usando Lipofectamina 2000 de catálogo Invitrogen de conformidad con las instrucciones del Después de la incubación durante la las células se lavaron con PBS removido del sustrato usando Accutasa Cells número de catálogo y se diluyó en medio de crecimiento conteniendo Geneticina número de catálogo Invitrogen a miligramos por mi y cultivados en placas de 96 pozos en varias densidades para asegurar la recuperación de los clones celulares simples después de la selección A través de la selección de el medio se cambió aproximadamente cada 3 a 5 Después de la los pozos conteniendo clones celulares simples se expandieron en las placas de 96 pozos duplicados y se permitió incubarlos hasta que se logró de Un juego de pozos se analizó para la tolerancia al VSRRP mediante la infección con el aislado P129 de VSRRP por un mínimo de 48 Once clones se encontraron para ser tolerantes al Uno de designado claramente retuvo el fenotipo tolerante después de numerosos pasajes la Figura Ejemplo Generación de líneas celulares estables BHK21 tolerantes al VSRRP usando Las células de riñon de hámster bebé parenterales se obtuvieron de Pfizer y se cultivaron a 37 grados C y de C02 en medio de crecimiento que consiste de Medio Eagle Modificado de Dulbecco número de catálogo Invitrogen suplementado con de suero de bovino fetal 1 mM de piruvato de 2mM de y Los pozos de cultivo de tejido conteniendo aproximadamente 1x106 cada uno se transfectó con 2 microgramos por pozo de 63v2 en DMEM sin FBS o usando Lipofectamina 2000 de catálogo Invitrogen de conformidad con las instrucciones del Después de la incubación durante la las células se lavaron con PBS y se removió del sustrato usando Accutasa Cells número de catálogo y se diluyó en medio de crecimiento conteniendo Geneticina número de catálogo Invitrogen a miligramos por mi y se cultivaron en placas de 96 pozos en varias densidades para asegurar la recuperación de los clones celulares simples después de la recuperación de los clones celulares simples después de la selección de A través de la selección de el medio se cambió aproximadamente cada 3 a 5 Después de la los pozos conteniendo clones celulares simples se expandieron en las placas de 96 pozos duplicados y se incubaron hasta que se logró de Un juego de pozos se analizó para la tolerancia al VSRRP mediante la infección con el aislado P129 de VSRRP y se incubó por un mínimo de 48 Tres clones se encontraron para ser tolerantes VSRRP y uno de designado se seleccionó para estudio adicional la Figura Ejemplo Generación de líneas celulares estables tolerantes a VSRRP usando Las células se cultivaron como se describió en el Ejemplo las células se transfectaron con la construcción de ADN descrita en el Ejemplo 5 usando Lipofectamina 2000 siguiendo las instrucciones del La clonación subsecuente y selección de las líneas celulares tolerantes a VSRRP se realizó como se describió en el Ejemplo De 336 clones celulares simples 129 fueron Varias de estos clones celulares se han pasado más de 7 veces y se ha mantenido el fenotipo tolerante VSRRP la Figura Estas líneas celulares se han nombrado seguido por un número de clon Ejemplo Generación de líneas celulares estables de riñon de porcino tolerantes al VSRRP usando Las células de riñon de porcino parenteral se obtuvieron de Pfizer y se cultivaron a y de C02 en medio de crecimiento consistiendo de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco número de catálogo Invitrogen 1 suplementado con de suero de bovino fetal 1 mM de piruvato de 2 de glutamina y Los pozos de cultivo de tejido aproximadamente 1 x células cada una se transfectó con 2 microgramos por pozo de en DMEM sin FBS o usando Lipofectamina 2000 de catálogo Invitrogen de conformidad con las instrucciones del Después de la incubación durante la las células se lavaron con FBS y se removieron del sustrato usando Accutasa Cells número de catálogo y se diluyeron en medio de crecimiento conteniendo Geneticina número de catálogo Invitrogen en miligramos por mi y se cultivaron en placas de 96 pozos en varias densidades para asegurar la recuperación de los clones celulares simples después de la selección de A través de la selección de el medio se cambió aproximadamente cada 3 a 5 Después de la os pozos conteniendo clones celulares simples se expandieron en placas de 96 pozos duplicados y se incubaron hasta que se logró de la Un juego de pozos se analizó para tolerancia mediante la inyección con aislado P129 VSRRP y se incubó por un mínimo de 48 Un clon designado mostró el fenotipo de tolerancia Ejemplo Generación de las líneas celulares estables BHK21 tolerantes al VSRRP usando Las células de riñon de hámster bebé parental se obtuvieron de Pfizer y se cultivaron a y de C02 en medio de cultivo consistiendo de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco número de catálogo Invitrogen suplementado con de suero de bovino fetal 1 de piruvato de 2 mM de glutamina y Los pozos de cultivo de tejido conteniendo aproximadamente 1x106 cada uno se transfectó con 23 microgramos por pozo de en DMEM sin FBS o usando Lipofectamina 2000 de catálogo Invitrogen de conformidad con las instrucciones del Después de la incubación durante la las células se lavaron con PBS y se removieron del sustrato usando Accutasa Cells número de catálogo y se diluyeron en medio de crecimiento conteniendo Geneticina número de catálogo Invitrogen en miligramos por mi y se cultivaron en placas de 96 pozos en varias densidades para asegurar la recuperación de los clones celulares simples después de la selección de A través de la selección de el medio se cambió aproximadamente 3 a 5 Después de la los pozos conteniendo clones celulares simples se expandieron en placas de 96 pozos duplicados y se incubaron hasta que se logró de la Un juego de pozos se analizó para tolerancia mediante infectarse con el aislado P129 se incubó por un mínimo de 48 Siete clones candidatos se encontraron ser tolerantes al Existió alguna evidencia de la heterogeneidad fenotípica en cada uno de los siete clones porque ellos no fueron Por lo los clones candidatos fueron clonados por células simples mediante limitar la dilución en el medio que contenía Un clon de célula simple con tolerancia clara al SRRP se obtuvo y se designó Ejemplo Generación de líneas celulares estables de riñon de felino tolerantes al VSRRP usando Las células del riñon de felino parenterales Norden Labs se cultivaron en y de C02 en medio de crecimiento consistiendo de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco número de catálogo Invitrogen suplementado con de suero de bovino fetal 1 mM de piruvato de 2 mM de glutamina y Los pozos de cultivo de tejido conteniendo aproximadamente 1x106 cada una se transfectó con 2 microgramos por pozo de en DMEM sin FBS o usando Lipofectamina 2000 de catálogo Invitrogen de conformidad con las instrucciones del Después de la incubación durante la las células se lavaron con se removieron del sustrato usando Accutasa Cells número de catálogo se diluyeron en medio de crecimiento conteniendo Geneticina número de catálogo Invitrogen a 500 microgramos por y se cultivaron en placas de 96 pozos en varias densidades para asegurar al recuperación de los clones de células simples después de la selección de A través de la selección de el medio se cambió aproximadamente cada 3 a 5 Después de la los pozos conteniendo clones celulares simples se expandieron en placas de 96 pozos duplicados y se incubaron hasta que se logró de Un juego de pozos se analizó para tolerancia a VSRRP con el aislado P129 VSRRP por un mínimo de 48 Cinco clones se encontraron para ser Uno de estos designado claramente desplegó el fenotipo tolerante la Figura Las células parenterales NLFK y un subclon de se examinaron por la expresión Las células se fijaron en de acetona y se reaccionaron con CD163 de cabra System a 1 por una hora seguido por el lavado con Para se usó el IgG de burro conjugado con FITC Inc en 1 La fluorescencia no específica se detectó en las células parenterales NLFK como se muestra en la Figura 21 La mayoría de los subclones mostraron buena marcación de fluorescencia indicando la presencia de CD163 21 Ejemplo Generación de las líneas celulares estables de riñon de porcino tolerantes usando Las células de riñon de porcino parenterales se obtuvieron de Pfizer y se cultivaron a y de C02 en medio de crecimiento consistiendo de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco número de catálogo Invitrogen suplementado con de suero de bovino fetal 1 de piruvato de 2 mM de y Los pozos de cultivo de tejido contienen aproximadamente 1 x 106 células cada una se transfectó con 2 microgramos por pozo de en DMEM sin FBS o usando Lipofectamina 2000 de catálogo Invitrogen de conformidad con las instrucciones del Después de la incubación durante la las células se lavaron con se removieron del sustrato usando Accutasa Cells número de catálogo se diluyeron en medio de crecimiento conteniendo Geneticina número de catálogo Invitrogen a miligramos por mi y se cultivaron en placas de 96 pozos en varias densidades para asegurar la recuperación de los clones celulares simples después de la selección de A través de la selección de el medio se cambió aproximadamente cada 3 a 5 Después de la los pozos conteniendo clones celulares simples se expandieron en placas de 96 pozos duplicados y se incubaron hasta que se logró de Un juego de pozos se analizó para tolerancia a VSRRP mediante infectarlo con el aislado P129 VSRRP por un mínimo de 48 Dos clones se encontraron para ser Uno de estos designado claramente desplegó el fenotipo tolerante a Ejemplo Generación de la línea celular estable de riñon de felino tolerable VSRRP usando el MARC CD163v2 ligado Un procedimiento basado en la no clonación para generar cantidades de microgramos de ADN lineal apropiados para usarse en la generación de líneas celulares estables que expresan CD163 de un promotor RSV se desarrolló Un proceso similar se adaptó para colocar el CD163v2 de simio de las células obtenidas del promotor El procedimiento involucra el aislamiento y ligación de dos piezas de una conteniendo los genes de neomicina y el cásete del promotor RSV derivado del y el otro conteniendo la secuencia de codificación MARC CD163v2 de MARC El plásmido del vector se linearizó con Hind III y Kpn El plásmido primero se digirió con Kpn I y se golpeo ligeramente con el fragmento Klenow de la polimerasa del ADN del Este plásmido posteriormente se digirió con Hind III inmediatamente descendente del promotor El clon MARC CD163v2 se digirió en la secuencia del vector descendente del inserto CD163 con EcoRV y Hind III ascendente del La secuencia de codificación CD163 se liberó del Para cada digestión de plásmido los fragmentos apropiados se purificaron de los geles de Se realizó una reacción de ligación a gran escala como Aproximadamente 20 de cada fragmento de ADN se incubó en un volumen de 600 con 5 unidades de ligasa de ADN La reacción se incubó a temperatura ambiente por 1 Siguiendo la una pieza lineal de ADN conteniendo todos los elementos apropiados se purificó mediante electrofóresis de gel de El análisis de digestión de enzima de restricción se realizó para confirmar la autenticidad de cada fragmento de La ligación de los dos fragmentos de ADN vía el término Hind III cohesivo resultó en la colocación de las secuencias del gen CD163 MARC descendente del promotor permitiendo la expresión directa del CD163 en las células del Una vez el ADN purificado se usó para transfectar las líneas celulares de mamíferos Las células de riñon de felino Norden Labs se cultivaron a y de C02 en DMEM suplementadas con de suero de bovino fetal y Las células NLFK se cultivaron en placas de 6 pozos en aproximadamente de confluencia y se permitieron unirse durante la Las células entonces se transfirieron con plásmido ligado CD163v2 usando Lipofectamina 2000 siguiendo las instrucciones del Después de 24 las células se clonaron como se describe en el Ejemplo El análisis de los clones celulares tolerantes al VSRRP se realizó como se describe en el Ejemplo Un clon fue positivo para la infección VSRRP y se designó Este clon D4 ha mantenido el fenotipo tolerante a VSRRP a través de 9 Ejemplo Cinéticos de crecimiento del aislado NVSL VSRRP en las células y NLFK recombinantes estables que expresan susCD163v1 del promotor CMV Se cuantificaron las cantidades del virus de progenitura producidas por las células NLFK o infectadas con VSRRP establemente producidas que expresan Cuatro líneas celulares que expresan y G4 se cultivaron en la en placas de 6 pozos después de la incubación durante la se infectaron con el aislado NVSL de Las células 145 se incluyeron en el experimento para Las células se infectaron con el virus en de aproximadamente El virus se absorbió por minutos y se Las células se lavaron tres veces con PBS para remover el virus Una alícuota de mililitros se cosechó de los cultivos en intervalos de 12 horas iniciando inmediatamente después y continuando a través de 96 El medio de cultivo fresco se agregó a las células en varios puntos de tiempo para mantener un volumen dé cultivo suficiente para prevenir que se secara la monocapa Los sobrenadantes de cultivo se almacenaron a hasta que todas las muestras se La cantidad de VSRRP presente en los sobrenadantes de cultivo se determinó por la prueba de placa en las células La Figura 14 muestra todas las líneas celulares recombinantes que expresan CD163 probadas que fueron capaces de producir la progenitura de Ejemplo Bloqueo de la infección VSRRP con el anticuerpo Células transfectadas transitoriamente Las células cultivadas en placas de 24 se transfectaron transitoriamente con el plásmido descrito en el ejemplo usando Lipofectamina 200 como se describió en el Ejemplo Después de la incubación durante la noche para permitir la expresión de una suspensión del anticuerpo policlonal de cabra para el CD163 de humano AF en PBS se agregó a las células en un volumen de Como un se usaron las cantidades equivalentes del IgG de cabra normal cat Siguiendo una incubación de una hora a las monocapas se infectaron con aproximadamente 1 x 107 pfu de una hebra P129 de recombinante de VSRRP que expresa el Las monocapas celulares con el anticuerpo 63 y se incubaron a por una hora en la la mezcla del virus se la monocapa celular se lavó una vez con y 1 mi de medio de crecimiento se agregó a los Las células se incubaron por 24 horas a para permitir la expresión GFP dirigida Para las células se trataron con se suspendieron en 500 µ? de PBS y se analizaron mediante citometría de flujo para innumerar las células infectadas con VSRRP vía la expresión Para la citometría de las células no infectadas se usaron para establece la línea base de la detección de fluorescencia y aproximadamente células se analizaron para cada muestra Los resultados de este mostrados en la Figura muestran que el anticuerpo específico CD163 capaz de reducir significantemente el número de células infectadas cuando se comparan a las células incubadas con IgG de cabra Ejemplo Bloqueo de la infección VSRRP por el anticuerpo células transfectadas establemente Las células NLF que expresan establemente el CD163 de descritas en el Ejemplo se cultivaron en placas de 24 Después de permitir que las células se unieran durante la una suspensión de anticuerpo policlonal de cabra específico para el CD163 de humano en PBS se agregó a las células en un volumen de 100 Como un se usaron las cantidades equivalentes del IgG de cabra normal cat Siguiendo una incubación de una hora a las monocapas se infectaron con aproximadamente 1x107 pfu de una hebra de recombinante P129 de VSRRP que expresa Las monocapas celulares con el anticuerpo y se incubaron a por una hora en cuyo tiempo la mezcla de virus se la monocapa celular se lavó una vez con PBS y 1 mi de medio de crecimiento se agregó a los Las células se incubaron por 24 horas a para permitir la expresión GFP dirigida por el Para las células se trataron con se en 500 µ? de PBS y se analizaron mediante citometría de flujo para ínnumerar las células infectadas con VSRRP vía la expresión Aproximadamente células se analizaron de cada Los resultados de este mostrado en la Figura muestran que el anticuerpo CD163 específico fue capaz de reducir significativamente el número células infectadas cuando se compara con las células incubadas con IgG de cabra Ejemplo Generación de líneas celulares estables de riñon de porcino tolerantes a VSRRP usando Las células de riñon de porcino se cultivaron como se describe en el Ejemplo Para las células se cultivaron en una placa de 24 pozos en de confluencia y se permitió la recuperación durante la La transfección del ADN ligado descrito en el Ejemplo 5 se realizó usando Lipofectamina 2000 siguiendo las instrucciones del La clonación y selección subsecuente de las células tolerantes al VSRRP se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo La clonación inicial mediante la dilución limitante cayó para producir los clones derivados de la célula de manera que los 5 pozos con las células tolerantes al VSRRP se mediante dilución limitada para producir las líneas celulares 10 clones se seleccionaron para estudio adicional y uno de estos mostró la habilidad para soportar el crecimiento foci de VSRRP cercanamente después de la infección la Figura Ejemplo Generación de las líneas celulares estables de riñon de felino tolerantes a VSRRP usando Las células de riñon de felino NLFK se cultivaron como se describe en el Ejemplo Para las células se cultivaron en aproximadamente de la densidad máxima en placas de 24 Después de la incubación durante la las monocapas se transfectaron con ligación derivada de el ejemplo usando Lipofectamina siguiendo las instrucciones del La clonación de las células transfectadas y la selección de los clones celulares tolerantes al VSRRP se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo De los 67 clones celulares probados para la tolerancia al 20 se encontraron Un ejemplo del marcado observado se muestra en la Figura Ejemplo Pasaje del aislado P201 de VSRRP en las células La amplificación de un aislado clínico VSRRP se realizó como Las células de macrófago alveolar periférico se cultivaron a células por 10 cm2 en un plato de 6 pozos usando medio suplementado con de Después de 6 el medio se aspiró y se agregó una alícuota de 2 mi de suero se cosechó de un cerdo infectado con VSRRP a las Siguiendo una absorción de 90 el inoculo del suero se removió y se reemplazó con En aproximadamente 40 el sobrenadante se cosechó y clarificó con una centrifugación de 10 El sobrenadante se usó directamente para infectar las células del clon usando una absorción de 6 Después de la remoción del las células se con El virus P201 se pasó en serie en la línea celular usando la célula alternativamente infectada y pasa libremente el sobrenadante a la Se observó que para extensión suficiente del las células deberán cultivarse a de el día antes de la usando matraces de células que se conservan para Para seguir el progreso de la cada pasaje se replicó en pozos múltiples de células idénticamente infectadas y en cada uno de los pozos se fijó con acetona y se marcó con el anticuerpo monoclonal marcado FITC Si el porcentaje de células infectadas no es mayor que y no se observó el progreso significativo del desarrollo foci sobre los días anteriores de las las células en un pozo equivalente fueron tratados con tripsina y se pasaron a múltiples pozos Estos pasajes celulares infectados estuvieron típicamente en una fisura de y algunas veces incluyeron la adición de un número equivalente de células de un cultivo no si el mareaje SDOW17 reveló que la célula infectada foci tuvo suficiente extensión para contar más de de las células el sobrenadante libre celular se cosecho y se usó para infectar pozos múltiples de células recientemente cultivadas Después de 11 los pasajes de intervención de la célula no fueron necesarios a medida que el virus fue capaz de crecer lo suficiente para suspensión suficiente para permitir el paso consecutivo del sobrenadante libre celular del Ejemplo Análisis de varias líneas celulares CD163 para tolerancia a varios aislados de VSRRP norteamericanos y europeos Varias líneas celulares transgénicas CD 63 se probaron para tolerancia para el paso bajo de los aislados VSRRP norteamericanos y europeos la Tabla Las líneas celulares CD163 transgénicas como se describieron en los ejemplos anteriores incluyeron clon y Cada línea celular CD163 junto con las líneas celulares las líneas celulares de riñon de felino las líneas celulares del riñon de porcino parenterales como se plantearon en placas de cultivo de tejido de 96 El medio de crecimiento se removió de las monocapas y se inoculó con mi por pozo de cada aislado En el día 3 post las placas se fijaron con de acetona y se marcaron con el anticuerpo SDOW17 monoclonal FITC conjugado Technologies que es específico para el Los resultados de la prueba del anticuerpo fluorescente están en la Tabla Tabla 7 a Todos los aislados VSRRP son aislados Norteamericanos excepto el EU98V226 que es un aislado europeo Ejemplo La inducción del forbol de CD163 produce las células U937 de humano tolerantes a la infección VSRRP Las células U937 humanas obtenidas de ATCC se propagaron en el medio RPMI conteniendo suero y aditivos de conformidad con las especificaciones Estas células se conocen por expresar el CD163 cuando se activan por el tratamiento PMA et Las células U937 se cultivaron en duplicado en los pozos de una placa de 6 Un juego de pozos se trató con 100 de PMA y el otro juego se dejó sin Tres días después de la estimulación un pozo de cada juego se infectó con el aislado P129 de El otro pozo de cada juego se fijó y se marcó para la expresión de CD163 en una prueba de anticuerpo inmunofluorescente indirecta usando de cabra e IgG de burro conjugado con FITC Las células U937 no tratadas continuaron la propagación para alta densidad 3 días después del planteamiento Las células U937 PMA tratadas detuvieron la llegaron a ser más largas y se unieron a la superficie de los pozos de Una pequeña fracción de U937 no tratado fue positiva para el marcado mientras que casi todo el U937 PMA tratado fue positivo para el mareaje En el U937 no tratado se observaron células infectadas no Sin cientos de células U937 tratadas con PMA llegaron a infectarse por el Esto demuestra que las células no tolerantes pueden hacerse tolerantes para la infección VSRRP siguiendo la inducción química de la expresión Las características adicionales y variaciones de la invención serán aparentes para aquellos expertos en la técnica de la totalidad de esta aplicación incluyendo la descripción detallada y todas dichas características que se intentan como aspectos de la Así las características de la invención descritas en este documento pueden en las modalidades adicionales que también se intentan como aspectos de la sin pensar en las consecuencias la combinación de características es específicamente mencionada anteriormente como un aspecto o modalidad de la solamente dichas limitaciones que se describen en este documento como críticas a la invención deberán observarse como las variaciones de la invención carecen de limitaciones que no se han descrito en este documento como críticas pero se intentan como aspectos de la Será claro que la invención puede practicarse de otra manera que como se describió particularmente en la descripción precedente y los Numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores y por lo tanto están dentro del alcance de la La descripción completa de todas las publicaciones citadas en este documento se incorporan como referencia a la extensión de que ellas no son consistentes a la descripción en este insufficientOCRQuality

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para facilitar la infección de una célula vertebrado por el VSRRP que comprende la etapa de (a) dirigir la expresión incrementada de un polipéptido CD163 por dicha célula vertebrado.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , que además comprende infectar dicha célula con VSRRP.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 , que además comprende producir un cultivo de VSRRP.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en el cual dicha célula es de mamífero.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido CD163 comprende un dominio de transmembrana.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicha expresión incrementada se lleva a cabo mediante la introducción de ácido nucleico exógeno.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicha expresión incrementada se lleva a cabo mediante tratamiento químico.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicha célula fue VSRRP no tolerante y se vuelve VSRRP tolerante por la etapa (a). s

9. El método de conformidad con la reivindicación 2, en la cual el VSRRP es del genotipo europeo.

10. El método de conformidad con la reivindicación 2, en la cual el VSRRP es del genotipo norteamericano.

11. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2-10 que además comprende la etapa de producir una vacuna VSRRP.

12. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 , en donde la vacuna es muerta.

13. El método de conformidad con la reivindicación 11 , en donde la vacuna es viva atenuada.

14. Un método para medir la propensión de una línea celular de muestra para permitir la infección por el VSRRP comprendiendo: a) proporcionar una muestra que contiene ácidos nucleicos de la línea celular de prueba; b) determinar la cantidad de polinucleótido que codifica un polipéptido CD163 o su complemento en dicha muestra; en donde una cantidad incrementada de polinucleótido que codifica un polipéptido CD163 relativo a una muestra de control derivada de una línea celular de control conocida no soporta el crecimiento de dicho VSRRP indica una propensión de la línea celular de prueba para soportar la replicación de dicho VSRRP.

15. Un método para medir la propensión de una línea celular de prueba para permitir la infección por el VSRRP comprendiendo: (a) proporcionar una muestra que contiene polipéptidos de la línea celular de prueba; (b) determinar la cantidad de un polipéptido CD 63 en dicha muestra; en donde una cantidad incrementada de un polipéptido CD163 relativa a una muestra de control derivada de una línea celular de control conocida no soporta el crecimiento de dicho VSRRP indica una propensión de la línea celular de prueba para soportar la replicación de dicho VSRRP.