NO337126B1

NO337126B1 - Kinolinon-karboksamidforbindelser som 5-HT4 receptoragonister

Info

Publication number: NO337126B1
Application number: NO20065112A
Authority: NO
Inventors: Paul Ross Fatheree; Daniel Marquess; Seok-Ki Choi; Adam A Goldblum; Derek S Turner; Daniel D Long; Daniel Genov
Original assignee: Theravance Biopharma R&D Ip Llc
Priority date: 2004-04-07
Filing date: 2006-11-06
Publication date: 2016-01-25
Also published as: US20160376264A1; BRPI0509761B1; RU2394033C2; US20120264779A1; TWI351282B; US9873692B2; CY1108908T1; US20070270457A1; US8575192B2; US20050228014A1; US9353106B2; CA2561558C; ES2320907T3; ZA200608363B; IL178086A; EP1735304A1; CN100569771C; JP2007532546A; US9630960B2; CN1946719A

Description

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot kinolinonkarboksamidforbindelser som er brukbare som 5-HT4receptoragonister. Oppfinnelsen er også rettet mot farmasøytiske preparater omfattende slike forbindelser, slike forbindelser for anvendelse i terapi, anvendelse av slike forbindelser for fremstilling av et medikament for behandling av medisinske tilstander mediert av 5-HT4receptoraktivitet, og prosesser og mellomprodukter som er brukbare for fremstilling av slike forbindelser.

Kjent teknikk

Serotonin (5-hydroksytryptamin, 5-HT) er en neurotransmitter som er utstrakt fordelt i kroppen, både i sentralnervesystemet og i perifere systemer. Minst syv subtyper av serotoninreceptorer er identifisert og interaksjonen av serotonin med disse forskjellige receptorer er linket til et vidt spektrum av fysiologiske funksjoner. Det har derfor vært en vesentlig interesse i utvikling av terapeutiske midler som sikter på spesifikke 5-HT receptorsubtyper.

Spesielt har karakterisering av 5-HT4receptorer og identifisering av farmasøytiske midler som interagerer med disse, vært fokus for signifikant nyere aktivitet. (Se for eksempel the review by Langlois and Fischmeister, J. Med. Chem. 2003, 46, 319-344). 5-HT4receptoragonister er brukbare for behandling av forstyrrelser ved redusert motilitet i gastrointestinalkanalen. Slike forstyrrelser inkluderer irritabelt tarmsyndrom (IBS), kronisk konstipasjon, funksjonell dyspepsi, forsinket gastrisk tømming, gastroøsofageal reflukssykdom (GERD), gastroparese, postoperativ ileus, intestinal pseudoobstruksjon, og medikamentindusert forsinket transitt. I tillegg har det vært foreslått at noen 5-HT4receptoragonistforbindelser kan benyttes ved behandling av sentralnervesystemforstyrrelser inkludert kognitive forstyrrelser, oppførselsforstyrrelser, stemningsforstyrrelser og forstyrrelser med kontroll av autonomfunksjonen.

På tross av den brede anvendelighet av farmasøytiske midler som modulerer 5-HT4receptoraktiviteten er få 5-HT4receptoragonistforbindelser i klinisk bruk i dag. Et middel, cisaprid, som ble benyttet utstrakt for behandling av motilitetsforstyrrelser i fordøyelseskanalen, ble trukket fra markedet, angivelig på grunn av kardialbivirkninger. Senere kliniske forsøk av et annet middel, prukaloprid, er suspendert.

I henhold til dette er det et behov for nye 5-HT4receptoragonister som oppnår sine ønskede effekter med minimale bivirkninger. Foretrukne midler kan ha, blant andre egenskaper, forbedret selektivitet, potens, farmakokinetiske egenskaper og/eller virkningsvarighet.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye forbindelser som har 5-HT4receptor-agonistaktivitet. Blant disse egenskaper er forbindelser ifølge oppfinnelsen funnet å være potente og selektive 5-HT4receptoragonister. I tillegg er forbindelser ifølge oppfinnelsen funnet å vise gunstige, farmakokinetiske egenskaper som er prediktive for god biotilgjengelighet ved oral administrering.

I henhold til dette tilveiebringer oppfinnelsen en forbindelse med formel (I):

der:

R1 er hydrogen, halo, hydroksy, Ci.4alkyl eller Ci-^lkoksy; R er C3-4alkyl eller C3-6cykloalkyl; R er hydrogen eller Ci^alkyl; R<4>er —S(0)2R6 eller —C(0)R<7>; R<5>er hydrogen, Ci-3alkyl, C2-3alkyl substituert med -OH eller Ci-3alkoksy, eller —CH2—pyridyl;

R<6>er Ci.3alkyl;

eller R<5>og R<6>sammen danner C3.4alkylenyl; og

R er hydrogen, Ci-3alkyl eller pyridyl;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller et solvat eller en stereoisomer derav.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et farmasøytisk preparat omfattende en forbindelse ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer.

I separate og distinkte aspekter tilveiebringer oppfinnelsen også fremgangsmåter for fremstilling av forbindelser ifølge oppfinnelsen samt produkt fremstilt ved fremgangsmåtene.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en forbindelse ifølge oppfinnelsen som beskrevet her for anvendelse i terapi, så vel som anvendelse av en forbindelse ifølge oppfinnelsen ved fremstilling av et medikament for behandling av en medisinsk tilstand i et pattedyr assosiert med 5-HT4receptoraktivitet, for eksempel en forstyrrelse med redusert motilitet i gastrointestinalkanalen.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye kinolinonkarboksamid-5-HT4receptoragonister med formel (I), eller farmasøytisk akseptable salter eller solvater eller stereoisomerer derav. De følgende substituenter og verdier er ment for å gi representative eksempler på forskjellige aspekter ved oppfinnelsen. Disse representative verdier er ment ytterligere å definere aspektene og er ikke ment å utelukke andre verdier eller betydninger eller begrense rammen av oppfinnelsen.

I et spesifikt aspekt ved oppfinnelsen er R<1>hydrogen, halo, Ci-4alkyl eller Ci-4alkoksy.

I andre spesifikke aspekter er R<1>hydrogen, halo eller Ci-4alkyl; eller R<1>er hydrogen eller halo; eller R1 er fluor; eller R1 er brom.

I nok et spesifikt aspekt er R<1>hydrogen.

I et spesifikt aspekt er R C3.4alkyl eller C3-6cykloalkyl.

I et annet spesifikt aspekt er R 2 C3-4alkyl. Representative R 2 grupper inkluderer w-propyl, isopropyl, w-butyl, sec-butyl og tert- butyl.

I nok et spesifikt aspekt er R<2>isopropyl.

I nok et spesifikt aspekt er R 2 C3-4alkyl eller C4-scykloalkyl; eller R 2 er isopropyl eller C4-5cykloalkyl.

I et spesifikt aspekt er R hydrogen eller Ci-3alkyl.

I et annet spesifikt aspekt er R 3 hydrogen, eller R 3 er metyl.

I et spesifikt aspekt er R<4>—S(0)2R<6>der R<6>er Ci.3alkyl.

I nok et spesifikt aspekt er R<4>—S(0)2CH3.

I et spesifikt aspekt er R<4>—C(0)R<7>der R<7>er hydrogen, Ci^alkyl eller pyridyl.

I et annet spesifikt aspekt er R<4>—C(0)R<7>der R<7>er hydrogen eller Ci^alkyl; eller R<4>er —C(0)R<7>der R<7>er hydrogen eller metyl; eller R<4>er —C(0)R<7>der R<7>er hydrogen; eller R<4>er —C(0)R<7>der R<7>er metyl.

I nok et spesifikt aspekt er R<4>—C(0)R<7>der R<7>er 3-pyridyl eller 4-pyridyl.

I et spesifikt aspekt er R<5>hydrogen; Ci^alkyl; C2.3alkyl substituert med -OH eller Ci.3alkoxy; eller —CH2—pyridyl.

I et annet spesifikt aspekt er R5 hydrogen, Ci^alkyl, eller —CH2—pyridyl; eller R<5>er hydrogen eller Ci-3alkyl.

I nok et spesifikt aspekt er R<5>—CH2—3-pyridyl; eller R<5>er hydrogen eller metyl; eller R5 er hydrogen; eller R<5>er metyl.

I nok andre spesifikke aspekter er R<5>og R<6>sammen —(CH2)3— eller —(CH2)4; eller R5 og R<6>sammen er —(CH2)3—.

I et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en forbindelse med formel (I) der R<3>er hydrogen.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en forbindelse med formel (I) der R<4>er —S(0)2R<6>.

I nok et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en forbindelse med formel (I) der

R<4>er— C(0)R7.

Oppfinnelsen angår videre en forbindelse med formel (I) der R<1>er hydrogen eller halo; R 2 er isopropyl eller C^scykloalkyl; og R 3 , R 4 , R 5 , R 6 og R 7 er som angitt under formel

CO-

I nok et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en forbindelse med formel (I) der:

R<1>er hydrogen;

R er C3-4alkyl eller C4-scykloalkyl;

R er hydrogen;

R<4>er —S(0)2R6 eller —C(0)R<7>;

R<5>er hydrogen eller Ci^alkyl;

R<6>er Ci.3alkyl; og

R er hydrogen eller Ci^alkyl.

I nok et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en gruppe av forbindelser med formel (II):

der R<1>er hydrogen, R2 er isopropyl ogR<3>, R<4>, R<5>og R<6>, eller R<3>, R<4>, R<5>og R7 har de verdier som er vist i tabell I henholdsvis H

De kjemiske navngivningskonvensjoner som benyttes her illustreres for forbindelser ifølge eksempel 1:

som er angitt som l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(l^S^Si?)-8-[2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-aza-bicyklo[3.2.1]okt-3-yl}-amid, i henhold til AutoNom programmet, tilveiebrakt fra MDL Information Systems, GmbH (Frankfurt, Tyskland). Angivelsen ( 1S, 3R, 5R) beskriver den relative orientering av bindingene assosiert med det bicykliske ringsystem som er angitt som faste og stiplede kiler. Forbindelsen er alternativt angitt som iV-[(3-endo)-8-[2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1 ] okt-3-yl]-1 -(1 -metyletyl)-2-okso-l,2-dihydro-3-kinolinkarboksamid. I alle forbindelser ifølge oppfinnelsen som angitt ovenfor er kinolinonkarboksamidet endo til azabicyklooktangruppen.

Spesielt skal nevnes de følgende forbindelser: l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3^,5i?)-8-[2-hydroksy-3-(metansulfonylamino)propyl] - 8-azabicyklo [3.2.1] okt-3 -yl} amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(lS^i^Si^-S-IXÆ^-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3^,5i?)-8-[(5)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[3-(acetyl-metyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1 ] okt-3 -yl} amid;

l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3^,5i?)-8-[3-(formyl-metyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(l«£,3i?,5i?)-8-[(i?)-3-(acetyl-metyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3^,5i?)-8-[(i?)-3-(formyl-metyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; og l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(l£,3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3 -(metansulfonylamino)propyl] -8-azabicyklo[3.2.1 ] okt-3 -yl} amid.

Som eksemplifisert ved spesielle forbindelser som angitt ovenfor kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen inneholde et kiralt senter og spesifikt på karbonatomet i formlene (I) eller (II) som bærer substituenten —OR . I henhold til dette inkluderer oppfinnelsen rasemiske blandinger, rene stereoisomerer og stereoisomeranrikede blandinger av slike isomerer, hvis ikke annet er sagt. Når en spesiell stereoisomer er vist skal det være klart for fagmannen at mindre mengder av andre stereoisomerer kan være til stede i blandinger eller preparater ifølge oppfinnelsen hvis ikke annet er sagt, forutsatt at en eventuell nytte av forbindelsen som helhet ikke elimineres på grunn av nærværet av slike andre isomerer.

Definisjoner

Ved beskrivelse av forbindelsene, preparatene og fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, har de følgende uttrykk de følgende betydninger, hvis ikke annet er sagt.

Uttrykket "alkyl" betyr en enverdig, mettet hydrokarbongruppe som kan være rett eller forgrenet, eller kombinasjoner derav. Hvis ikke annet er sagt inneholder slike alkylgrupper typisk 1 til 10 karbonatomer. Representative alkylgrupper inkluderer, som eksempel, metyl, etyl, w-propyl («-Pr), isopropyl (/-Pr), w-butyl (w-Bu), sec-butyl, isobutyl, tert-butyl, w-pentyl, w-heksyl, w-heptyl, w-oktyl, w-nonyl, w-decyl og liknende.

Uttrykket "alkylenyl" betyr en toverdig, mettet hydrokarbongruppe som kan være rett eller forgrenet eller en kombinasjon derav. Hvis ikke annet er sagt inneholder slike alkylenylgrupper typisk fra 1 til 10 karbonatomer. Representative alkylenylkgrupper inkluderer, som eksempel, metylen, etylen, «-propylen, w-butylen, propan-1,2-diyl (metyletylen), 2-metylpropan-1,2-diyl (1,1-dimetyletylen) og liknende.

Uttrykket "alkoksy" betyr en monovalent gruppe -O-alkyl der alkyl er som angitt ovenfor. Representative alkoksygrupper inkluderer, som eksempel, metoksy, etoksy, propoksy, butoksy og liknende.

Uttrykket "cykloalkyl" betyr en monovalent, mettet karbocyklisk gruppe som kan være monocyklisk eller multicyklisk. Hvis ikke annet er sagt inneholder slike cykloalkylgrupper typisk fra 3 til 10 karbonatomer. Representative cykloalkylgrupper inkluderer, som eksempel, cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cykloheksyl, cykloheptyl, cyklo-oktyl og liknende.

Uttrykket "halo" betyr fluor, klor, brom eller jod.

Uttrykket "forbindelse" betyr en forbindelse som ble fremstilt syntetisk eller fremstilt på en hvilken som helst annen måte, for eksempel ved metabolisme.

Uttrykket "terapeutsk effektiv mengde" betyr en mengde som er tilstrekkelig til å bevirke behandling ved administrering til en pasient som trenger behandling.

Uttrykket "behandling" eller tilsvarende uttrykk som benyttes her betyr behandling av en sykdom, forstyrrelse eller medisinsk tilstand hos en pasient, for eksempel et pattedyr (og særlig et menneske) som inkluderer: (a) forhindring av sykdommen, forstyrrelsen eller den medisinske tilstand fra å opptre, for eksempel profylaktisk behandling av en pasient; (b) forbedring av sykdommen, forstyrrelsen eller den medisinske tilstand, for eksempel ved å eliminere eller forårsake regresjon av sykdommen, forstyrrelsen eller den medisinske tilstand hos en pasient; (c) å undertrykke sykdommen, forstyrrelsen eller den medisinske tilstand, for eksempel ved å redusere eller stanse utviklingen av sykdommen, forstyrrelsen eller den medisinske tilstand hos pasienten; eller (d) å lindre symptomene ved sykdommen, forstyrrelsen eller den medisinske tilstand hos en pasient.

Uttrykket "farmasøytisk akseptabelt salt" betyr et salt som er fremstilt fra en syre eller en base som er aksepterbar for administrering til en pasient som et pattedyr. Slike salter kan avledes fra farmasøytisk akseptable uorganiske eller organiske syrer og fra farmasøytisk akseptable baser. Typisk blir farmasøytisk akseptable salter av forbindelser ifølge oppfinnelsen fremstilt fra syrer.

Salter som er avledet fra farmasøytisk akseptable syrer inkluderer, men er ikke begrenset til eddik-, adipin-, benzensulfon-, benzo-, kamforsulfon-, sitron-, etansulfon-, fumar-, glukon-, glutamin-, hydrobrom-, salt-, melke-., malein-, eple-, mandel-, metan-sulfon-, musin-, salpeter-, pantoten-, fosfor-, rav-, svovel-, vin-, p-toluensulfon-, xinafon-(l-hydroksy-2-nafto-), naftalen-1,5-disulfonsyre og liknende.

Uttrykket "solvat" betyr et kompleks eller et aggregat som er dannet av ett eller flere molekyler av et oppløst middel eller en solutt, det vil si en forbindelse ifølge oppfinnelsen eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og ett eller flere molekyler av en solvent. Slike solvater er typisk krystallinske faststoffer med et i det vesentlige fast molforhold mellom solutt og solvent. Representative solventer er som eksempler vann, metanol, etanol, isopropanol, eddiksyre og liknende. Når solventen er vann er det dannede solvat er hydrat.

Det skal være klart at utrykket "eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat eller stereoisomer derav" er ment å inkludere alle permutasjoner av salter, solvater og stereoisomerer som et solvat av et farmasøytisk akseptabelt salt av en stereoisomer av en forbindelse med formel (I).

Uttrykket "aminobeskyttende gruppe" betyr en beskyttende gruppe som er egnet for å forhindre uønskede reaksjoner på et aminonitrogen. Representative aminobeskyttende grupper inkluderer, men er ikke begrenset til: formyl; acylgrupper som alkanoylgrupper, for eksempel acetyl; alkoksykarbonylgrupper somferf-butoksykarbonyl (Boe); arylmetoksykarbonylgrupper som benzyloksykarbonyl (Cbz) og 9-fluorenylmetoksy-karbonyl (Fmoc); arylmetylgrupper som benzyl (Bn), trityl (Tr) og l,l-di-(4'-metoksy- fenyl)metyl; silylgrupper som trimetylsilyl (TMS) og fert-butyldimetylsilyl (TBDMS); og liknende.

Generelle, syntetiske prosedyrer

Forbindelser ifølge oppfinnelsen kan fremstilles fra lett tilgjengelige utgangsstoffer ved å benytte de følgende generelle metoder og prosedyrer. Selv om et spesielt aspekt ved oppfinnelsen er illustrert i skjemaene nedenfor vil fagmannen erkjenne at alle aspekter av oppfinnelsen kan fremstilles ved anvendelse av metodene som er beskrevet her eller ved å benytte andre metoder, reagenser og utgangsmaterialer som er velkjente for fagfolk. Det vil også være klart at der typiske eller foretrukne prosessbetingelser (for eksempel reaksjonstemperaturer, tider, molforhold for reaktanter, solventer, trykk og så videre) er gitt, kan andre prosessbetingelser også benyttes hvis ikke annet er sagt. Optimale reaksjonsbetingelser kan variere med de spesielle reaktanter eller solventer som benyttes men slike betingelser kan bestemmes av fagmannen ved optimaliserende rutineforsøk.

I tillegg og slik det vil fremgå for fagmannen, kan konvensjonelle beskyttende grupper være nødvendig for å forhindre visse funksjonelle grupper fra å undergå uønskede reaksjoner. Valget av en egnet, beskyttende gruppe for en spesiell funksjonell gruppe, så vel som egnede betingelser for beskyttelse og debeskyttelse, er velkjent på området. For eksempel er tallrike beskyttende grupper, deres innføring og fjerning, beskrevet i T. W. Greene and G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, 3. utg., Wiley, New York, 1999.

I en syntesemetode blir forbindelser med formel (I) fremstilt som illustrert i skjema A.

(Substituentene og variablene som vist i det følgende skjema har de definisjoner som er gitt ovenfor hvis ikke annet er sagt).

I skjema A betyr L en avspaltbar gruppe som klor, brom, jod eller etoksy, eller reagensen L—R<4>er karboksylsyren HO-C(0)R<7>, det vil si at L formelt betyr hydroksy.

Optimale reaksjonsbetingelser for omsetningen i skjema A kan variere avhengig av de kjemiske egenskaper for reagensen L—R<4>, slik dette vil være velkjent for fagmannen.

Når for eksempel L er en haloavspaltbar gruppe som klor blir reaksjonen typisk gjennomført ved å bringe mellomproduktet (III) i kontakt med mellom rundt 1 og rundt 4 ekvivalenter av en forbindelse med formel L—R<4>i en inert diluent, som diklormetan, i nærvær av et overskudd av en base, for eksempel mellom rundt 3 og rundt 6 ekvivalenter base som iV,iV-diisopropyletylamin eller l,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-ene (DBU). Egnede, inerte diluenter inkluderer også A^A^-dimetylformamid, triklormetan, 1,1,2,2-tetrakloretan, tetrahydrofuran og liknende. Omsetningen gjennomføres typisk ved en temperatur i området rundt -100 °C til rundt 30 °C i rundt et kvarter til rundt 2 timer, eller til reaksjonen i det vesentlige er ferdig. Eksempler på reagenser L—R<4>der L er klor, inkluderer metansulfonylklorid og acetylklorid.

Når reagensen L-R<4>er en karboksylsyre representerer skjema A en amidkoblings-reaksjon som typisk gjennomføres ved å bringe mellomproduktet (HI) i kontakt med mellom rundt 1 og rundt 4 ekvivalenter av en forbindelse av en karboksylsyre L—R<4>i en inert diluent, for eksempel iV,iV-dimetylformamid, i nærvær av et koblingsmiddel som benzotriazol-1 -yloksytripyrrolidino-fosfoniumheksafluorfosfat (PyBop). Reaksjonen gjennomføres typisk ved omgivelsestemperatur, for eksempel i et kvarter til rundt 2 timer, eller inntil reaksjonen i det vesentlige er ferdig. Egnede alternative koblingsmidler inkluderer 1,3 dicykloheksylkarbodiimid (DCC), l-(3-dimetylamino-propyl)-3-etylkarbodiimid (EDC) og PyBop kombinert med l-hydroksy-7-azabenzo-triazol (HOAt).

Amidkoblingen av mellomproduktet (HI) med karboksylsyren L—R<4>kan alternativt gjennomføres ved å konvertere L—R<4>til en aktivert ester, for eksempel en N-hydroksy-suksinimid (NHS) ester eller en p-nitrofenylester, eller et syreimidazol, som så omsettes med mellomproduktet (m).

Når alternativt reagensen L-R<4>er en væske, for eksempel etylformat, kan reaksjonen gjennomføres ved å oppløse (III) i et stort overskudd av reagensen L—R<4>og så å varme det hele opp til en temperatur mellom rundt 50 °C og rundt 100 °C i rundt 12 til rundt 24 timer.

Produktet med formel (I) isoleres og renses ved konvensjonelle prosedyrer. For eksempel kan produktet konsentreres til tørr tilstand under redusert trykk, tas opp i en vandig, svak sur oppløsning og renses ved HPLC kromatografi.

Alternativt kan forbindelsene med formel (I) fremstilles ved en alkylering av en forbindelse med formel (I) der R er hydrogen, som kan fremstilles i henhold til skjema A. N-alkyleringsreaksjonen gjennomføres typisk ved å bringe en forbindelse med formel (I) der R er hydrogen, i kontakt med mellom rundt 1 og rundt 4 ekvivalenter av en forbindelse med formel L'—R der L' er en avspaltbar gruppe som jod eller brom. Denne reaksjon gjennomføres typisk i et polart, aprotisk oppløsningsmiddel som dimetylformamid i nærvær av mellom rundt 2 og rundt 4 ekvivalenter sterk base som kaliumfe/Ybutoksid. Typisk blir reaksjonsblandingen gjennomført ved en temperatur mellom rundt 60 og rundt 100 °C i mellom rundt 6 og rundt 24 timer, eller inntil reaksjonen i det vesentlige er ferdig.

I nok et alternativ fremstilles forbindelser med formel (I) der R<1>er forskjellig fra hydrogen, ved konvensjonelle prosesser fra forbindelser med formel (I) der R<1>er hydrogen.

Mellomprodukter med formel (III) fremstilles fra lett tilgjengelige utgangsmaterialer. Når for eksempel karbonet som bærer substituenten —OR<3>ikke er kiralt, fremstilles et mellomprodukt med formel (HI) ved den prosedyre som er illustrert i skjema B.

der L' uavhengig betyr en haloavspaltbar gruppe som klor, brom eller jod. Et negativt ladet motion er også til stede, assosiert med det positivt ladede mellomprodukt (V) eller

(V).

Først blir et mellomprodukt med formel (IV) omsatt med en oksiranforbindelse, for eksempel 2-brommetyloksiran (generelt epibromhydrin) for å gi et azetidinsalt med formel (V). Denne reaksjon gjennomføres typisk ved å bringe (IV) i kontakt med rundt 2 til rundt 4 ekvivalenter 2-brommetyloksiran i en polar diluent som etanol. Reaksjonen gjennomføres typisk ved omgivelsestemperatur i rundt 24 til rundt 48 timer eller inntil reaksjonen er i det vesentlige ferdig.

Det skal være klart at i prosessene ifølge skjema B og i andre prosesser som beskrevet nedenfor ved bruk av mellomproduktet (TV) kan dette avgis i form av fri base eller i saltform, med egnet justering av reaksjonsbetingelser etter behov, som velkjent for fagmannen.

Et mellomprodukt med formel (V) der R<3>er Ci^alkyl kan fremstilles ved å bringe mellomproduktet (V) i kontakt med fra mindre enn en ekvivalent til rundt en ekvivalent av en forbindelse med formel L'—R 3 der R 3 er Ci^alkyl, i en inert diluent i nærvær av mellom rundt 1 til rundt 3 ekvivalenter av en sterk base, som kaliumtertbutoksid eller natriumhydrid. Reaksjonen gjennomføres typisk ved omgivelsestemperatur i rundt et kvarter til rundt en time, eller til reaksjonen i det vesentlige er ferdig. Egnede, inerte diluenter inkluderer diklormetan, triklormetan, 1,1,2,2-tetraklormetan og liknende.

Deretter blir azetidinmellomproduktet (V) eller (V) omsatt med et amin med formel H2NR<5>for å gi mellomproduktet (III). Typisk blir azetidinmellomproduktet oppløst i en inert diluent som etanol og brakt i kontakt med rundt 1 til rundt 8 ekvivalenter av aminet H2NR<5>. Når for eksempel aminet H2NR<5>er en flyktig reagens som metylamin benyttes det fortrinnsvis mellom rundt 5 og rundt 7 ekvivalenter av aminet. Reaksjonen gjennomføres typisk ved en temperatur mellom rundt 50 og rundt 100 °C i rundt 12 til rundt 24 timer, eller til reaksjonen er i det vesentlige ferdig.

Et mellomprodukt med formel (III) der R5 er hydrogen, kan fremstilles fra azetidinmellomproduktet (V) eller (V) ved bruk av ammoniumformat i stedet for ammoniakk, det vil si i stedet for reagensen H2NR<5>som antydet i skjema B. Alternativt og for å fremstille mellomproduktet (HI) der R<5>er hydrogen kan azetidinringen av (V) eller (V) åpnes ved omsetning med et azid som natriumazid som så følges av en reduksjons-reaksjon for å gi mellomproduktet (III), eller ringen kan åpnes ved omsetning med ammoniumhydroksid.

Som beskrevet i detalj i eksempel 4a og når R<3>og R5 er hydrogen og karbonet som bærer substituenten —OR ikke er kiralt, kan et mellomprodukt med formel (HI) fremstilles med omsetning av mellomproduktet (IV) med en oksiranylmetylforbindelse med et beskyttet nitrogenatom med etterfølgende debeskyttelse. En brukbar reagens er 2-oksiranylmetylisoindol-l,3-dion, generelt epoksypropylftalimid, som omsettes med mellomprodukt (IV) for å danne et mellomprodukt der en ftalimidylsubstituert 2-hydroksypropylgruppe:

er forenet med nitrogenatomet i azabicyklooktanringen av formel (IV). Ftalimidyl-gruppen fjernes så ved tilbakeløpskoking i hydrazin for å danne et mellomprodukt med formel (HI) der R 3 og R 5 er hydrogen.

Et mellomprodukt med formel (III) der R<3>og R<5>er hydrogen kan også fremstilles ved omsetning av azetidinet (V) med anionet av ftalimid og etterfølgende behandling med hydrazin.

I en alternativ metode for syntese kan et mellomprodukt med formel (III) der R<3>er hydrogen, fremstilles ved omsetning av mellomproduktet (IV) med et beskyttet mellom<p>rodukt (VIV

fulgt av et debeskyttelsestrinn. I formel (VI) er P<1>en aminobeskyttende gruppe, L' er en halogenavspaltbar gruppe, og asterisken angir et kiralt senter. Prosessene benytter et mellomprodukt med formel (VI) som er nyttig for fremstilling av former av mellomproduktet (DI) der stereokjemien ved senteret som er merket med asterisken spesifikt er (R) eller (S), så vel som fremstilling av ikke-kirale former av mellomproduktet (111).

Typisk blir mellomprodukt (TV) brakt i kontakt med mellom rundt 1 og rundt 2 ekvivalenter av mellomprodukt (VI) i en polar diluent som metanol, i nærvær av mer enn en ekvivalent av en base som iV,iV-diisopropyletylamin. Reaksjonen gjennomføres typisk ved en temperatur mellom rundt 60 og rundt 100 °C i mellom rundt 12 og rundt 24 timer, eller inntil reaksjonen i det vesentlige er ferdig. Den beskyttende gruppe P<1>fjernes ved standardprosedyrer for å gi et mellomprodukt med formel (III). En brukbar, beskyttende gruppe P<1>er Boe som typisk fjernes ved behandling med en syre som trifluoreddiksyre.

I nok en alternativ prosess for fremstilling av mellomproduktet (HI) kan mellomprodukt (VI) først konverteres til en ringsluttet form (VII):

før omsetning med mellomprodukt (IV) for å gi mellomprodukt (III). Mellomprodukt (VE) fremstilles typisk ved oppløsning av mellomprodukt (VI) i en inert diluent, for eksempel tetrahydrofuran, i nærvær av base, for eksempel natriumhydroksid. Omsetningen mellom (VU) og (IV) for å gi mellomprodukt (III) gjennomføres typisk ved å bringe mellomprodukt (IV) i kontakt med mellom rundt 1 og rundt 4 ekvivalenter av mellomprodukt (VII) i en polar diluent som metanol. Reaksjonen gjennomføres typisk ved en temperatur mellom rundt 60 og rundt 100 °C i mellom rundt 1 og rundt 4 timer, eller inntil reaksjonen i det vesentlige er ferdig. Den beskyttende gruppe P<1>fjernes ved standar dprosedyrer for å gi et mellomprodukt med formel (III).

Det beskyttede mellomprodukt (VI) kan fremstilles fra en oksiran som vist i skjema C for det spesielle eksempel der det dannes et Boc-beskyttet, kiralt intermediat (VT) ved bruk av et kiralt oksiran. Reaksjonen er likeledes brukbar for fremstilling av ikke-kirale forbindelser med formel (VI).

Som vist i skjema C blir et benzylamin 2 brakt i kontakt med minst en ekvivalent av et kiralt oksiran 1 i en ikke-polar diluent som heksan eller toluen for å gi 2-hydroksy- propylaminet 3. Denne reaksjon gjennomføres typisk ved romtemperatur i mellom rundt 12 og 24 timer eller inntil reaksjonen i det vesentlige er ferdig. Mellomproduktet 3 blir typisk omsatt med et lett overskudd av di-ferf-butyldikarbonat (generelt (Boc^O), for eksempel rundt 1,1 ekvivalenter, under en hydrogenatmosfære i nærvær av en overgangsmetallkatalysator for å gi det Boe beskyttede mellomprodukt (VI'). Reaksjonen gjennomføres typisk ved omgivelsestemperatur i rundt 8 til rundt 24 timer.

En prosess for å fremstille mellomprodukter med formel (IV) er vist i skjema D.

Det beskyttede aminoazabicyklooktan, eller generelt aminotropan 5, omsettes først med den substituerte kinolinonkarboksylsyre (Vffl). Typisk gjennomføres denne reaksjon ved først å konvertere (VUT) til et syreklorid ved å bringe (VIII) i kontakt med minst en ekvivalent og særlig mellom rundt 1 og rundt 2 ekvivalenter, av en aktiverende syre som tionylklorid eller oksalylklorid, i en aromatisk diluent som toluen, benzen, xylen eller liknende. Reaksjonen gjennomføres typisk ved en temperatur i området rundt 80 til rundt 120 °C i rundt 15 min. til rundt 4 timer, eller inntil reaksjonen i det vesentlige er ferdig.

Syrekloridoppløsningen settes typisk til en tofaseblanding av rundt 1 ekvivalent av aminotropan 5 for å danne et beskyttet mellomprodukt som ekstraheres ved standardprosedyrer. Tofaseblandingen av 5 fremstilles generelt ved å oppløse 5 i en aromatisk diluent som benyttet ovenfor, og å tilsette en vandig oppløsning inneholdende et overskudd av base som natriumhydroksid eller kaliumhydroksid, fortrinnsvis rundt 2 til 5 ekvivalenter base.

Alternativt kan amidkoblingen av mellomproduktet 5 med karboksylsyre (VIII) gjennomføres i nærvær av et koblingsmiddel som 1,3 dicykloheksylkarbodiimid (DCC), l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid (EDC), eller benzotriazol-l-yloksytripyrrolidino-fosfoniumheksafluorfosfat (PyBop), eventuelt kombinert med 1-hydroksy-7-azabenzotriazol (HOAt), som beskrevet ovenfor, for amidkobling av mellomproduktet (EI) med en karboksylsyre. I nok et alternativ kan amidkoblingen av mellomprodukt 5 med karboksylsyren (VIII) gjennomføres ved å konvertere (VEI) til en aktivert ester som beskrevet ovenfor.

Den beskyttende gruppe P<1>fjernes ved standardprosedyrer for å gi et mellomprodukt med formel (IV). Når for eksempel den beskyttende gruppe er Boe skjer fjerningen typisk ved behandling med en syre som trifluoreddiksyre, noe som gir syresaltet av mellomproduktet. Syresaltet av mellomproduktet (IV) kan konverteres til den frie base hvis ønskelig ved konvensjonell behandling med base. Den beskyttende gruppe Cbz blir, som et annet eksempel, hensiktsmessig fjernet ved hydrogenolyse over en egnet metallkatalysator som palladium på karbon.

Det beskyttede aminotropan 5 som benyttet i reaksjonen som beskrevet her fremstilles fra lett tilgjengelige utgangsstoffer. Når for eksempel den beskyttende gruppe P<1>er Boe, blir det beskyttede aminotropan 5' fremstilt ved prosedyren som illustrert i skjema E.

Som beskrevet i detalj i eksempel la nedenfor blir, for å fremstille det beskyttede mellomprodukt 5', først 2,5-dimetoksytetrahydrofuran 6 brakt i kontakt med mellom rundt 1 og 2 ekvivalenter og særlig rundt 1,5 ekvivalenter benzylamin og et lett overskudd, for eksempel rundt 1,1 ekvivalenter 1,3-acetondikarboksylsyre 7 i en sur, vandig oppløsning i nærvær av et buffermiddel som natriumhydrogenfosfat. Reaksjonsblandingen varmes opp til mellom rundt 60 og rundt 100 °C for å sikre dekarboksylering av eventuelle karboksylerte mellomprodukter i produktet, 8-benzyl-8-azabicyklo-[3.2.1]oktan-3-one 8, vanligvis iV-benzyltropanon.

Mellomproduktet 8 blir typisk omsatt med et lett overskudd av di-ferf-butyldikarbonat (generelt (Boc^O), for eksempel rundt 1,1 ekvivalenter, under en hydrogenatmosfære i nærvær av en overgangsmetallkatalysator for å gi det Boe beskyttede mellomprodukt 9, 3-okso-8-azabicyklo[3.2.l]oktan-8-karboksylsyre ferf-butylester. Reaksjonen gjennomføres typisk ved omgivelsestemperatur i rundt 12 til rundt 72 timer. Til slutt blir mellomproduktet 9 brakt i kontakt med et stort overskudd, for eksempel minst rundt 25 ekvivalenter ammoniumformat i en inert diluent som metanol, i nærvær av en overgangsmetallkatalysator, for å gi produktet 5' i endokonfigurasjon med høy stereo-spesifisitet, for eksempel et endo:exoforhold >99:1. Reaksjonen gjennomføres typisk ved omgivelsestemperatur i rundt 12 til rundt 72 timer eller inntil reaksjonen i det vesentlige er ferdig. Det er fordelaktig å tilsette ammoniumformatreagens i andeler. For eksempel blir mellomprodukt 9 brakt i kontakt med en initial del av ammoniumformat på rundt 15 til rundt 25 ekvivalenter. Etter et intervall på rundt 12 til rundt 36 timer blir en ytterligere andel av rundt 5 til rundt 10 ekvivalenter ammoniumformat tilsatt. Den etterfølgende tilsetning kan repeteres etter et tilsvarende intervall. Produktet 5' kan renses ved konvensjonelle prosedyrer, for eksempel alkalisk ekstrahering.

I en alternativ syntesemodell kan forbindelser med formel CL) fremstilles ved å koble den substituerte kinolinonkarboksylsyre (VIII) med et mellomprodukt med formel (DC) som vist i skjema F.

Reaksjonen i skjema F gjennomføres typisk under amidkoblingsbetingelser som beskrevet ovenfor for omsetning av karboksylsyre (VIII) med mellomproduktet 5.

Mellomprodukter med formel (IX) kan fremstilles ved debeskyttelse av et mellomprodukt med formel CX) :

der P 2 betyr en aminobeskyttende gruppe.

Mellomprodukter med formel (X) kan fremstilles fra lett tilgjengelige utgangsstoffer ved bruk av prosedyrer som er analoge alkyleringen og andre reaksjoner som er beskrevet ovenfor og/eller ved å benytte alternative reaksjoner som er velkjente for fagmannen. For eksempel kan mellomproduktet (X) fremstilles ved bruk av et mellomprodukt 10:

som kan dannes ved å beskytte aminonitrogenet av aminoazobicyklooktanet 5 med aminobeskyttende gruppe P<2>og så å fjerne P<1>fra nitrogenet på azabicyklooktangruppen. Beskyttende grupper P 1 og P 2 velges slik at de fjernes under forskjellige betingelser. Når for eksempel P<1>velges som Boe kan Cbz benyttes som P<2>. Erstatning av beskyttet aminotropan 10 med mellomprodukt (IV) i reaksjonene som beskrevet ovenfor for fremstilling av mellomproduktet (III) gir mellomprodukter med formel (X).

I nok en syntesemetode kan forbindelser med formel (I) der R<3>er hydrogen, representert nedenfor som formel (T), fremstilles som vist i skjema G.

Mellomprodukt (XI) kan inneholde et kiralt senter som vist eksplisitt for det beskyttede oksiranmellomprodukt (VII).

Typisk blir mellomprodukt (TV) brakt i kontakt med mellom rundt 1 og rundt 2 ekvivalenter av oksiranmellomproduktet (XI) i en polar diluent som etanol for å gi produktet (<V>). Mellomproduktet (IV) kan leveres i saltform i hvilket tilfelle et lett molart overskudd av alkalisk base inkluderes i reaksjonsblandingen før tilsetning av oksiranet. Reaksjonen gjennomføres typisk ved en temperatur rundt 60 til rundt 100 °C i mellom rundt 1 og rundt 3 timer, eller inntil reaksjonen i det vesentlige er ferdig. Produktet kan isoleres ved krystallisering fra en inert diluent som fri base eller som syresalt. Mellomprodukter med formel (XI) kan fremstilles ved omsetning av oksiranmellomproduktet 1 som vist i skjema C med det sekundære amin HNR<4>!*<5>. Typisk blir en vandig oppløsning av aminet HNR<4>!*<5>inneholdende rundt 1 ekvivalent av en base som natrium-, litium-, cesium- eller kaliumhydroksid, brakt i kontakt med mellom rundt 1,5 og rundt 2,5 ekvivalenter av oksiranmellomproduktet 1. Reaksjonen gjennomføres typisk ved en temperatur mellom rundt 0 og rundt 10 °C i rundt 1 til rundt 30 timer, eller inntil reaksjonen i det vesentlige er ferdig.

Kinolinonkarboksylsyren (VIII) fremstilles lett ved prosedyrer tilsvarende det som er angitt i litteraturen, for eksempel Suzuki et al, Heterocycles, 2000, 53, 2471-2485 og som beskrevet i eksemplene nedenfor.

Reagensene L'—R<2>, L'—R<3>, L—R<4>, H2NR<5>og HNRV er tilgjengelige kommersielt eller kan lett fremstilles ved standardprosedyrer fra vanlige utgangsstoffer.

Ytterligere detaljer hva angår spesifikke reaksjonsbetingelser og andre prosedyrer for fremstilling av representative forbindelser ifølge oppfinnelsen eller mellomprodukter for disse, er beskrevet i eksemplene nedenfor.

I henhold til dette, og i et fremgangsmåteaspekt, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel (I), eller et salt eller en stereoisomer derav, der prosessen omfatter:

(a) å omsette en forbindelse med formel (HI):

med en forbindelse med formel L—R<4>der L er en avspaltbar gruppe, eller L—R<4>betyr HO-C(0)R<7>; eller

(b) å omsette en forbindelse med formel (VIE):

med en forbindelse med formel (IX):

for å gi en forbindelse med formel (I), eller et salt eller en stereoisomer derav.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en forbindelse med formel (m), eller et salt eller en stereoisomer eller et beskyttet derivat derav, der R 1, R 2 , R 3 og R 5 er som angitt i formel

CO-

I et ytterligere fremgangsmåteaspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel (T) der R1, R2, R<4>og R<5>er som angitt i formel (I), eller et salt eller en stereoisomer derav, der prosessen omfatter å omsette en forbindelse med formel (IV): eller et salt derav med en forbindelse av formel (XI):

for å tilveiebringe en forbindelse av formel (I<1>) eller et salt eller en stereoisomer derav.

Farmasøytiske preparater

Kinolinonkarboksamidforbindelsene ifølge oppfinnelsen administreres typisk til en pasient i form av et farmasøytisk preparat. Slike farmasøytiske preparater kan administreres til pasienten på en hvilken som helst aksepterbar administreringsmåte inkludert, men ikke begrenset til oral, rektal, vaginal, nasal, inhalerings-, topisk (inkludert transdermal) og parenterale administreringsmåter.

I henhold til et av sine preparataspekter er oppfinnelsen rettet mot et farmasøytisk preparat omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient og en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse med formel (I) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav. Eventuelt kan slike farmasøytiske preparater inneholde andre terapeutiske og/eller formulerende midler hvis ønskelig.

De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen inneholder typisk en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav. Typisk vil slike farmasøytiske preparater inneholde fra rundt 0,1 til rundt 95 vekt-% av det aktive middel; fortrinnsvis fra rundt 5 til rundt 70 vekt-% og helst fra rundt 10 til rundt 60 vekt-% av det aktive middel.

En hvilken som helst konvensjonell bærer eller eksipient kan benyttes i det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen. Valget av en spesiell bærer eller eksipient, eller kombinasjoner av bærere eller eksipienter, vil avhenge av den administreringsmåte som benyttes for å behandle en spesiell pasient eller en type medisinsk tilstand eller sykdomstilstand. I denne forbindelse ligger fremstillingen av et egnet, farmasøytisk preparat for en spesiell administreringsmodus vel innenfor kunnskapsområdet for fagmannen. I tillegg er bestanddelene for slike preparater kommersielt tilgjengelige, for eksempel fra Sigma, postboks 14508, St. Louis, MO 63178. Som ytterligere illustrasjon er konvensjonelle formuleringsteknikker beskrevet i Remington: The Science and Practice ofPharmacy, 20. utg., Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland

(2000); og H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7. utg., Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).

Representative eksempler på materialer som kan tjene som farmasøytisk akseptable bærere inkluderer, men er ikke begrenset til de følgende: (1) sukre som laktose, glukose og sukrose; (2) stivelser som mais- og potetstivelse; (3) cellulose som mikrokrystallinsk cellulose og derivater derav som natriumkarboksymetylcellulose, etylcellulose og celluloseacetat; (4) pulverformig tragakant; (5) malt; (6) gelatin; (7) talkum; (8) eksipienter som kakaosmør og suppositorievoks; (9) oljer som jordnøtt-, bomulls-frø-, safran-, sesam-, oliven-, mais- og soyabønneolje; (10) glykoler som propylenglykol; (11) polyoler som glycerin, sorbitol, mannitol og polyetylenglykol;(12) estere som etyloleat og etyllaurat; (13) agar; (14) buffermidler som magnesiumhydroksid og aluminiumhydroksid; (15) alginsyre; (16) pyrogenfritt vann; (17) isotonisk salt-oppløsning; (18) Ringers oppløsning; (19) etylalkohol; (20) fosfatbufferoppløsninger; og (21) andre ikke-toksiske, kompatible substanser som benyttes i farmasøytiske preparater.

De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen fremstilles typisk ved grundig og intim blanding eller miksing av en forbindelse ifølge oppfinnelsen med en farmasøytisk akseptabel bærer og en eller flere eventuelle bestanddeler. Hvis nødvendig eller ønskelig kan den resulterende, enhetlig blandede blanding så formes eller lastes i

tabletter, kapsler, piller og liknende ved bruk av konvensjonelle prosedyrer og utstyr.

De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis pakket i en enhetsdoseform. Uttrykket "enhetsdoseform" henviser til en fysikalsk diskret enhet egnet for dosering til en pasient, for eksempel der hver enhet inneholder en på forhånd bestemt mengde aktiv bestanddel, beregnet for å gi den ønskede, terapeutiske effekt enten alene eller i kombinasjon med en eller flere ytterligere enheter. For eksempel kan slike enhetsdoseformer være kapsler, tabletter, piller og liknende.

I en foretrukket form er det farmasøytiske preparat egnet for oral administrering. Egnede farmasøytiske preparater for oral administrering kan være i form av kapsler,

tabletter, piller, lozenger, cachets, drageer, pulvere, granuler; eller som en oppløsning eller en suspensjon i en vandig eller ikke-vandig væske; eller som en olje-i-vann- eller vann-i-olje emulsjon; eller som en eliksir eller sirup; og likende hver inneholdende en på forhånd bestemt mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen som aktiv bestanddel.

Ved tilsiktet oral administrering i en fast doseringsform (det vil si som kapsler, tabletter, piller og liknende) vil det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen typisk omfatte en forbindelse ifølge oppfinnelsen som aktiv bestanddel og en eller flere farmasøytisk akseptable bærere som natriumcitrat eller dikalsiumfosfat. Eventuelt eller alternativt kan slike faste doseringsformer også omfatte: (1) fyllstoffer eller drøyemidler som stivelser, mikrokrystallinsk cellulose, laktose, sukrose, glukose, mannitol og/eller silitiumsyre; (2) bindemidler som karboksymetylcellulose, alginater, gelatin, polyvinylpyrrolidon, sukrose og/eller akasia; (3) fuktemidler som glycerol; (4) disintegratorer som agar-agar, kalsiumkarbonat, potet- eller tapiokkastivelse, alginsyre, visse silikater, og/eller natriumkarbonat;(5) oppløsningsforsinkende midler som parafin; (6) absorpsjons-akseleratorer som kvaternære ammoniumforbindelser; (7) fuktemidler som cetylalkohol og/eller glycerolmonostearat; (8) absorbenter som kaolin og/eller bentonittleire; (9) lubrikanter som talkum, kalsiumstearat, magnesiumstearat, faste polyetylenglykoler, natriumlaurylsulfat og/eller blandinger derav; (10) fargestoffer; og (11) buffermidler.

Slippmidler, fuktemidler, beleggsmidler, søtnere, smaksstoffer og luktestoffer, preserveringsmidler og antioksidanter kan også være til stede i oppfinnelsens farmasøytiske preparater. Eksempler på farmasøytisk akseptable antioksidanter inkluderer: (1) vannoppløselige antioksidanter som askorbinsyre, cysteinhydroklorid, natriumbisulfat, natriummetabisulfat, natriumsulfitt og liknende; (2) oljeoppløselige antioksidanter som askorbylpalmitat, butylert hydroksyanisol (BHA), butylert hydroksytoluen (BHT), lecitin, propylgallat, a-tokoferol og liknende; og (3) metall-gelaterende midler som sitronsyre, etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), sorbitol, vinsyre, fosforsyre og liknede. Beleggsmidler for tabletter, kapsler, piller og liknende inkluderer de som benyttes for enteriske belegg som celluloseacetatftalat (CAP), polyvinylacetatftalat (PVAP), hydroksypropylmetylcelluloseftalat, metakrylsyre-meta-krylsyreesterkopolymerer, celluloseacetattimelliat (CAT), karboksymetyletylcellulose (CMEC), hydroksypropylmetylcelluloseacetatsuksinat (HPMCAS) og liknende.

Hvis ønskelig kan de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen formuleres for å vise langsom eller kontrollert frigivning av den aktive bestanddel ved, som eksempel, å benytte hydroksypropylmetylcellulose i varierende andeler; eller andre polymer-matrikser, liposomer og/eller mikrosfærer.

I tillegg kan de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen eventuelt inneholde opacifiserende midler og kan formuleres slik at de frigir den aktive bestanddel kun, eller preferensielt, i en viss del av fordøyelseskanalen, eventuelt på forsinket måte. Eksempler på innleiring av preparater som kan benyttes inkluderer polymerstoffer og voks. Den aktive bestanddel kan også være i mikroinnkapslet form hvis dette er hensiktsmessig, med en eller flere av de ovenfor beskrevne eksipienter.

Egnede flytende doseringsformer for oral administrering inkluderer, som illustrasjon, farmasøytisk akseptable emulsjoner, mikroemulsjoner, oppløsninger, suspensjoner, siruper og eliksirer. Slike flytende doseringsformer omfatter typisk den aktive bestanddel og en inert diluent som for eksempel vann eller andre oppløsningsmidler, oppløseliggj ørende midler og emulgatorer som etylalkohol, isopropylalkohol, etyl-karbonat, etylacetat, benzylalkohol, benzylbenzoat, propylenglykol, 1,3-butylenglykol, oljer (særlig bomullsfrø-, jordnøtt-, mais-, germ-, oliven-, ricinus- og sesamoljer), glycerol, tetrahydrofurylalkohol, polyetylenglykoler og fettsyreestere av sorbitan og blandinger derav. Suspensjoner kan, i tillegg til den aktive bestanddel, inneholde suspenderende midler som for eksempel etoksylerte isostearylalkoholer, polyoksy-etylensorbitol og sorbitanestere, mikrokrystallinsk cellulose, aluminiummetahydroksid, bentonitt, agar-agar og tragakant, og blandinger derav.

Alternativt er de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen formulert for administrering ved inhalering. Egnede farmasøytiske preparater for administrering ved inhalering vil typisk være i form av en aerosol eller et pulver. Slike preparater administreres generelt ved bruk av velkjente avleveringsinnretninger som en inhalator med tilmålt dose, en tørrpulverinhalator, en forstøver eller en tilsvarende avleverings-innretning.

Ved administrering ved inhalering ved bruk av en trykksatt beholder vil det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen typisk omfatte den aktive bestanddel og et egnet drivmiddel som diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluoretan, karbondioksid eller annen egnet gass.

I tillegg kan det farmasøytiske preparat foreligge i form av en kapsel eller en patron (fremstilt for eksempel av gelatin) omfattende en forbindelse ifølge oppfinnelsen og et pulver egnet for bruk i en pulverinhalator. Egnede pulverbaser inkluderer, som eksempel, laktose eller stivelse.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også administreres transdermalt ved bruk av kjente transdermalavleveringssystemer eller eksipienter. For eksempel kan en forbindelse ifølge oppfinnelsen administreres med permeasjonsforsterkere som propylenglykol, polyetylenglykolmonolaurat, azacykloalkan-2-oner og liknende, og innarbeides i en pute eller et tilsvarende avleveringssystem. Ytterligere eksipienter som inkluderer geldannende midler, emulgatorer og buffere, kan benyttes i slike transdermale preparater hvis ønskelig.

De følgende formuleringer illustrerer representative, farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen:

Formuleringseksempel A

Harde gelatinkapsler for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ prosedyre: Bestanddelene blandes grundig og lastes så i en hard gelatinkapsel (260 mg preparat per kapsel).

Formuleringseksempel B

Harde gelatinkapsler for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ prosedyre: Bestanddelene blandes grundig og føres så gjennom en U.S. sikt nr. 45 og fylles i harde gelatinkapsler (200 mg preparat per kapsel).

Formuleringseksempel C

Kapsler for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ prosedyre: Bestanddelene blandes grundig og fylles så i gelatinkapsler (310 mg preparat per kapsel).

Formuleringseksempel D

Tabletter for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ prosedyre: Den aktive bestanddel, stivelse og cellulose føres gjennom en U-S. sikt nr. 45 og blandes grundig. Oppløsningen av polyvinylpyrrolidon blandes med de resulterende pulver og denne blanding føres så gjennom en U.S. sikt nr. 14. De således fremstilte granuler tørkes ved 50-60 °C og føres gjennom en U.S. sikt nr. 18. Natriumkarboksymetylstivelse, magnesiumstearat og talkum (i forkant ført gjennom en U.S. sikt nr. 60) settes så til granulene. Etter blanding komprimeres blandingen på en

tablettmaskin for å gi en tablett med vekt 100 mg.

Formuleringseksempel E

Tabletter for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ prosedyre: Bestanddelene blandes grundig og presses så til tabletter

(440 mg preparat per tablett).

Formuleringseksempel F

Enkeltspalttabletter for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ prosedyre: Bestanddelene blandes grundig og presses til enkeltspalttabletter (215 mg preparat per tablett).

Formuleringseksempel G

En suspensjon for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ prosedyre: Bestanddelene blandes for å danne en suspensjon inneholdende 10 mg aktiv bestanddel per 10 ml suspensjon.

Formuleringseksempel H

Et tørrpulver for administrering ved inhalering fremstilles som følger:

Representativ prosedyre: Den aktive bestanddel mikroniseres og blandes deretter med laktose. Denne blandede blanding lastes så i en gelatininhaleringspatron. Innholdet av patronen administreres ved bruk av en pulverinhalator.

Formuleringseksempel I

Et tørrpulver for administrering ved inhalering i en inhalator for tilmålt dose, fremstilles som følger: Representativ prosedyre: En suspensjon inneholdende 5 vekt-% av en forbindelse ifølge oppfinnelsen og 0,1 vekt-% lecitin fremstilles ved å dispergere 10 g aktiv forbindelse som mikroniserte partikler med midlere størrelse mindre enn 10 um i en oppløsning dannet av 0,2 g lecitin oppløst i 200 ml demineralisert vann. Suspensjonen spraytørkes og det resulterende materialet mikroniseres til partikler med en midlere diameter mindre enn 1,5 um. Partiklene fylles i patroner som trykksettes med 1,1,1,2-tetrafluoretan.

Formuleringseksempel J

En injiserbar formulering fremstilles som følger:

Representativ prosedyre: Bestanddelene ovenfor blandes og pH-verdien justeres til 4 ± 0,5 ved bruk av 0,5 N HC1 eller 0,5 N NaOH.

Formuleringseksempel K

Kapsler for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ prosedyre: Bestanddelene blandes grundig og fylles så i en gelatinkapsel (størrelse # 1, hvit, opaque) (264 mg preparat per kapsel).

Formuleringseksempel L

Kapsler for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ prosedyre: Bestanddelene blandes grundig og fylles så i en gelatinkapsel (størrelse # 1, hvit, opaque) (148 mg preparat per kapsel).

Det skal være klart at en hvilken som helst form av forbindelsene ifølge oppfinnelsen (det vil si fri base, farmasøytisk salt eller solvat) som er egnet for den spesielle administreringsmodus, kan benyttes i de farmasøytiske preparater som beskrevet ovenfor.

Anvendelighet

Kinolinonkarboksamidforbindelsene ifølge oppfinnelsen er 5-HT4receptoragonister og er derfor ventet å være nyttige ved behandling av medisinske tilstander som medieres av 5-HT4receptorer eller er forbundet med 5-HT4receptoraktivitet, det vil si medisinske tilstander som forbedres ved behandling med en 5-HT4receptoragonist. Slike medisinske tilstander inkluderer, men er ikke begrenset til, irriterbart tarmsyndrom (IBS), kronisk konstipasjon, funksjonell dyspepsi, forsinket gastrisk tømming, gastro-øsofageal reflukssykdom (GERD), gastroparese, postoperativ ileus, intestinal pseudoobstruksjon og medikamentindusert, forsinket transitt. I tillegg er det foreslått at noen 5-HT4receptoragonistforbindelser kan benyttes ved behandling av sentralnervesystem - forstyrrelser inkludert kognitive forstyrrelser, oppførselsforstyrrelser, stemningsforstyrrelser og forstyrrelser ved kontroll av autonom funksjon.

Særlig øker forbindelsene ifølge oppfinnelsen motiliteten i den gastrointestinale (GI) kanal og er således ventet å være nyttige for behandling av forstyrrelser i GI- eller fordøyelseskanalen forsaket av redusert motilitet hos pattedyr og særlig mennesker. Slike GI motilitetsforstyrrelser inkluderer, som illustrasjon, kronisk konstipasjon, konstipasjonspredominant irritabel tarmsyndrom (C-IBS), diabetisk og idiopatisk gastroparese, og funksjonell dyspepsi.

Det kan derfor beskrives en fremgangsmåte for å øke motiliteten i fordøyelseskanalen hos et pattedyr der metoden omfatter administrering til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av et farmasøytisk preparat omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer og en forbindelse ifølge oppfinnelsen.

Anvendt for å behandle forstyrrelser med redusert motilitet i GI kanalen eller andre tilstander mediert av 5-HT4receptorer vil forbindelsene ifølge oppfinnelsen typisk administreres oralt i en enkelt dose eller i flere doser per dag selv om andre administreringsformer kan benyttes, mengden aktiv bestanddel som administreres per dose eller den totalt administrerte mengde per dag vil typisk bestemmes av legen i lys av relevante omstendigheter inkludert tilstanden som behandles, den valgte administreringsvei, den reelle forbindelse som administreres og dens relative aktivitet, den individuelle pasients alder, vekt og respons samt alvoret av pasientens symptomer, og liknende.

Egnede doser for behandling av forstyrrelser med redusert motilitet i GI kanalen eller andre forstyrrelser som medieres av 5-HT4receptorer vil ligge fra rundt 0,0007 til rundt 20 mg/kg/dag aktiv bestanddel inkludert fra rundt 0,0007 til rundt 1 mg/kg/dag. For et midlere menneske med 70 kg kroppsvekt vil dette utgjøre rundt 0,05 til rundt 70 mg/dag aktiv bestanddel.

I et aspekt ved oppfinnelsen benyttes forbindelsene ifølge oppfinnelsen for å behandle kronisk konstipasjon. Ved anvendelse for å behandle kronisk konstipasjon vil forbindelsene ifølge oppfinnelsen typisk administreres oralt i en enkelt, daglig dose eller i flere doser per dag. Fortrinnsvis vil dosen for behandling av kronisk konstipasjon ligge fra rundt 0,05 til rundt 70 mg per dag.

I et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen benyttes forbindelsene ifølge oppfinnelsen for å behandle irritabelt tarmsyndrom. Ved anvendelse for å behandle konstipasjonspredominant, irritabelt tarmsyndrom, vil forbindelsene ifølge oppfinnelsen typisk administreres oralt i en enkelt, daglig dose eller i flere doser per dag. Fortrinnsvis vil dosen for behandling av konstipasjonspredominant, irritabelt tarmsyndrom ligge fra rundt 0,05 til rundt 70 mg per dag.

I et annet aspekt ved oppfinnelsen benyttes forbindelsene ifølge oppfinnelsen for å behandle diabetisk gastroparese. Ved anvendelse for å behandle diabetisk gastroparese vil forbindelsene ifølge oppfinnelsen typisk administreres oralt i en enkelt, daglig dose eller i flere doser per dag. Fortrinnsvis vil dosen for behandling av diabetisk gastroparese ligge fra rundt 0,05 til rundt 70 mg per dag.

I nok et aspekt ved oppfinnelsen benyttes forbindelsene ifølge oppfinnelsen til å behandle funksjonell dyspepsi. Ved anvendelse for å behandle funksjonell dyspepsi vil forbindelsene ifølge oppfinnelsen typisk administreres oralt i en enkelt, daglig dose eller i flere doser per dag. Fortrinnsvis vil dosen for behandling av funksjonell dyspepsi ligge fra rundt 0,05 til rundt 70 mg per dag.

Som beskrevet ovenfor er forbindelser ifølge oppfinnelsen 5-HT4receptoragonister. Det kan derfor også beskrives en fremgangsmåte for å agonisere en 5-HT4receptor i et pattedyr der metoden omfatter administrering av en forbindelse ifølge oppfinnelsen til pattedyret. I tillegg kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen være nyttige som forskningsverktøy for å undersøke eller studere biologiske systemer eller prøver med 5-HT4receptorer, eller for å finne nye 5-HT4receptoragonister. Fordi videre forbindelser ifølge oppfinnelsen viser bindingsselektivitet for 5-HT4receptorer sammenliknet med binding til receptorer av andre 5-HT subtyper og særlig 5-HT3receptorer, er slike forbindelser spesielt nyttige for å studere effektene av selektiv agonisme av 5-HT4receptorer i et biologisk system eller en prøve. Et hvert egnet, biologisk system eller en prøve som har 5-HT4receptorer kan benyttes i slike studier som kan gjennomføres enten in vitro eller in vivo. Representative, biologiske systemer eller prøver som er egnet for slike studier inkluderer, men er ikke begrenset til celler, celleekstrakter, plasmamembraner, vevprøver, pattedyr (som mus, rotter, marsvin, kaniner, hunder, svin, et cetera) og liknende.

Et biologisk system eller en prøve omfattende en 5-HT4receptor kan bringes i kontakt med en 5-HT4receptoragoniserende mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen. Effektene av å agonisere 5-HT4receptoren blir så bestemt ved bruk av konvensjonelle prosedyrer og utstyr som radioligandbindings-analyser og funksjonelle analyser. Slike funksjonelle analyser inkluderer ligandmedierte forandringer i intracellulær cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP), ligandmedierte forandringer i aktiviteten av enzymadenylylcyklase (som syntetiseres cAMP), ligand-medierte forandringer i innarbeidning av analoger av guanosintrifosfat (GTP) som [ 35S]GTPyS (guanosin 5'-0-(y-tio)trifosfat) eller GTP-Eu, inn i isolerte membraner via receptorkatalysert utbytting av GTP analoger mot GDP analoger, ligandmedierte forandringer i frie intracellulære kalsiumioner (målt for eksempel med en fluorescens-linket billedplateleser eller FLIPR<®>fra Molecular Devices, Inc.) og måling av mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) aktivering. En forbindelse ifølge oppfinnelsen kan agonisere eller øke aktiveringen av 5-HT4receptorer i en hvilken som helst av de funksjonelle analyser som er angitt ovenfor, eller analyser av tilsvarende art. En 5-HT4receptoragoniserende mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen vil typisk ligge fra rundt 1 nanomolar til rundt 500 nanomolar.

I tillegg kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen benyttes som forskningsverktøy for å finne nye 5-HT4receptoragonister. 5-HT4receptorbinding eller funksjonelle data for en testforbindelse eller en gruppe av slike kan sammenlignes med 5-HT4receptorbindingen eller funksjonelle data for en forbindelse ifølge oppfinnelsen for å identifisere testforbindelser som har overlegen binding eller funksjonell aktivitet, hvis til stede. Det kan genereres sammenlikningsdata (ved bruk av de egnede analyser) og testdata kan analyseres for å identifisere testforbindelsene av interesse.

Blant andre egenskaper er forbindelsene ifølge oppfinnelsen funnet å være potente agonister av 5-HT4receptoren og å vise vesentlig selektivitet for 5-HT4receptorsubtypen i forhold til 5-HT3receptorsubtypen i radioligandbindingsanalyser. Videre har forbindelser ifølge oppfinnelsen vist overlegne farmakokinetiske egenskaper i en rottemodell. Forbindelser ifølge oppfinnelsen er således ventet å være meget biotilgjengelige ved oral administrering. I tillegg er disse forbindelser påvist ikke å vise noe ikke-akseptabelt nivå av inhibering av kaliumionestrømmen i en in vitro spennings-klemmemodell som benyttet isolerte helceller som uttrykte hERG kardialkaliumkanalen. Spenningsklemmeanalysen er en akseptert, preklinisk metode for å bedømme potensialet for farmasøytiske midler når det gjelder å forandre mønsteret av kardial repolarisering, særlig å forårsake såkalt QT forlengelse som er forbundet med kardial arytmi, (Cavero et al, Opinion on Pharmacotherapy, 2000, 1, 947-73, Fermini et al, Nature Reviews Drug Discovery, 2003, 2, 439-447). I henhold til dette er farmasøytiske preparater omfattende forbindelser ifølge oppfinnelsen forventet å ha en akseptabel kardial profil.

Disse egenskaper så vel som anvendelsen for forbindelsene ifølge oppfinnelsen, kan vises ved forskjellige in vitro- og in vivo analyser som er velkjente for fagfolk på området. Representative analyser er beskrevet i større detalj i de følgende eksempler.

EKSEMPLER

De følgende syntese- og biologiske eksempler gis for å illustrere oppfinnelsen og skal ikke konstrueres på noen måte som begrensende for rammen av oppfinnelsen. I eksemplene nedenfor har de følgende forkortelser de følgende betydninger hvis ikke annet er sagt. Forkortelser som ikke er definert nedenfor har den generelt aksepterte betydning.

Reagenser (inkludert sekundære aminer) og oppløsningsmidler ble ervervet fra kommersielle leverandører (Aldrich, Fluka, Sigma, etc.) og benyttet uten ytterligere rensing. Forløpet i reaksjonsblandingene ble forfulgt ved tynnsjiktkromatografi (TLC), analytisk HPLC og massespektrometri der detaljene er gitt nedenfor og separat i spesifikke reaksjonseksempler. Reaksjonsblandinger ble opparbeidet som beskrevet spesifikt ved hver reaksjon; vanligvis ble de renset ved ekstrahering eller andre rensemetoder som temperatur- og/eller oppløsningsavhengig krystallisering, og precipitering. I tillegg ble reaksjonsblandinger rutinemessig renset ved preparativ HPLC: en generell protokoll er beskrevet nedenfor. Karakterisering av reaksjons-produktene ble rutinemessig gjennomført ved masse- og<*>H NMR spektrometri. For NMR måling ble prøvene oppløst i deuterert oppløsningsmiddel (CD3OD, CDCI3eller DMSO-d6) og 'H-NMR spektra ble oppnådd ved hjelp av et Varian Gemini 2000 instrument (300 MHz) under standardbetingelser. Massespektrometrisk identifisering av forbindelsene ble gjennomført ved en elektrosprayioniseringsmetode (ESMS) med et Applied Biosystems (Foster City, CA) modell API 150 EX instrument eller et Agilent (Palo Alto, CA) modell 1100 LC/MSD instrument. Vanninnholdet bestemmes ved Karl Fischer titrering ved bruk av et Brinkmann (Westbury, NY) Metrohm Karl Fischer Modell 813 kulometer.

Eksempel 1: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(l^,3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo-[3.2.1]okt-3-yl}amid

a. Fremstilling av 8- benzvl- 8- azabicvklo[ 3. 2. 11oktan- 3- one

30 ml konsentrert hydroklorsyre ble satt til en heterogen oppløsning av 2,5-dimetoksytetrahydrofuran (82,2 g, 0,622 mol) i 170 ml vann under omrøring. I en separat kolbe ble 92 ml konsentrert saltsyre, avkjølt til 0 °C ved hjelp av et isbad, langsomt satt til en oppløsning av benzylamin (100 g, 0,933 mol) i 350 ml vann. 2,5-dimetoksytetrahydro- furanoppløsningen ble omrørt i rundt 20 min., fortynnet med 250 ml vann og deretter ble benzylaminoppløsningen tilsatt fulgt av tilsetning av en oppløsning av 1,3-acetondikarboksylsyre (100 g, 0,684 mol) i 400 ml vann og deretter tilsetning av natriumhydrogenfosfat (44 g, 0,31 mol) i 200 ml vann. pH verdien ble justert fra pH 1 til pH~4,5 ved bruk av 40 % NaOH. Den resulterende uklare og blekgule oppløsning ble omrørt over natten. Oppløsningen ble så surgjort til pH 3 fra pH 7,5 ved bruk av 50 % saltsyre, varmet opp til 85 °C og omrørt i 2 timer. Oppløsningen ble avkjølt til romtemperatur, gjort basisk til pH 12 ved bruk av 40 % NaOH og ekstrahert med 3 x 500 ml DCM. De kombinerte, organiske sjikt ble vasket med brine, tørket over MgS04, filtrert og så konsentrert under redusert trykk for å gi det urene tittelmellomprodukt som 52 g viskøs, brun olje.

Til en oppløsning av det urene mellomprodukt i 1 000 ml metanol ble det satt åi- tert-butyldikarbonat (74,6 g, 0,342 mol) ved 0 °C. Oppløsningen ble tillatt oppvarming til romtemperatur og omrørt over natten. Metanolen ble fjernet under redusert trykk og den resulterende olje ble oppløst i 1 000 ml diklormetan. Mellomproduktet ble ekstrahert til 1 000 ml IM H3PO4og vasket med 3 x 250 ml diklormetan. Det vandige sjikt ble gjort basisk til pH 12 ved bruk av vandig NaOH og ekstrahert med 3 x 500 ml diklormetan. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert under redusert trykk for å gi tittelmellomproduktet som en viskøs, lysebrun olje.

'H-NMR (CDCI3) 6 (ppm) 7,5-7,2 (m, 5H, C6H5), 3,7 (s, 2H, CH2Ph), 3,45 (bred s, 2H, CH-NBn), 2,7-2,6 (dd, 2H, CH2CO), 2,2-2,1 (dd, 2H, CH2CO), 2,1-2,0 (m, 2H, CH2CH2), 1,6 (m, 2H, CH2CH2).

im/ z) : [M+H]<+>kalk. for C14H17NO 216,14; funnet, 216,0.

b. Fremstilling av 3- okso- 8- azabicyklo[ 3. 2. lloktan- 8- karboksvlsvrefert- butvlester

Til en oppløsning av 8-benzyl-8-azabicyklo[3.2.1]oktan-3-one (75 g, 0,348 mol) i 300 ml EtOAc ble det satt en oppløsning av di-ferf-butyldikarbonat (83,6 g, 0,383 mol,

1,1 ekv.) i 300 ml EtOAc. Den resulterende oppløsning (...) og skyllet med 100 ml EtOAc ble satt til en 1 liter Parr hydrogeneringsbeholder inneholdende 23 g palladium-hydroksid (20 vekt-% Pd, tørr basis, på karbon,~50 % våt med vann; for eksempel Pearlmans katalysator) under en strøm av nitrogen. Reaksjonsbeholderen ble avgasset (alternerende vakuum og N2, fem ganger) og satt under trykk til 60 psi H2gass. Reaksjonsoppløsningen ble omrørt i 2 dager og fylt igjen med H2etter behov for å holde

H2trykket ved 60 psi inntil reaksjonen var ferdig, overvåket ved silikatynnsjikts-kromatografi. Den sorte oppløsning ble så filtrert gjennom en pute av Celite<®>og konsentrert under redusert trykk for å gi tittelmellomproduktet kvantitativt som en viskøs, gul til oransjefarget olje. Det hele ble benyttet i det neste trinn uten ytterligere behandling.

<*>H NMR (CDCI3) 6 (ppm) 4,5 (bred, 2H, CH-NBoc), 2,7 (bred, 2H, CH2CO), 2,4-2,3 (dd, 2H, CH2CH2), 2,1 (bred m, 2H, CH2CO), 1,7-1,6 (dd, 2H, CH2CH2), 1,5 (s, 9H, (CH3)3COCON)).

c. Fremstilling av ( lÅS^ S^- S- amino- S- azabicvklorS^. lloktan- S- karboksvlsyre tert - but<y>lester

Til en oppløsning av produktet fra det foregående trinn (75,4 g, 0,335 mol) i 1 liter metanol ble det satt ammoniumformat (422,5 g, 6,7 mol), 115 ml vann og 65 g av palladium på aktivert karbon (10 % på tørr basis,~50 % våt med vann, Degussa type El 01 NE/W) under en strøm av N2under omrøring med et mekanisk røreverk. Etter 24, henholdsvis 48 timer ble ytterligere andeler av ammoniumformat (132 g, 2,1 mol) tilsatt hver gang. Etter at reaksjonsprogresjonen var ferdig, overvåket ved analytisk HPLC, ble Celite (>500 g) tilsatt og den resulterende, tykke suspensjon filtrert og det samlede faststoff så vasket med rundt 500 ml metanol. Filtratet ble kombinert og konsentrert under redusert trykk inntil all metanol var fjernet. Den resulterende uklare, tofase-oppløsning ble så fortynnet med IM fosforsyre til et sluttvolum på rundt 1,5 til 2,0 liter ved pH 2 og vasket med 3 x 700 ml diklormetan. Det vandige sjikt ble gjort basisk til pH 12 ved bruk av 40 % vandig NaOH og ekstrahert med 3 x 700 ml diklormetan. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert ved rotasjons-fordampning og så høyvakuum, noe som ga 52 g (70 %) av tittelmellomproduktet, vanlig N-Boc-endo-3-aminotropan, som et hvitt til blekt gult faststoff. Isomerforholdet endo:exoamin for produktet var > 99:1 basert på<*>H NMR analyse (> 96 % renhet ved analytisk HPLC).

<*>H NMR (CDCI3) 6 (ppm) 4,2-4,0 (bred d, 2H, CHNBoc), 3,25 (t, 1H, CHNH2), 2,1-2,05 (m, 4H), 1,9 (m, 2H), 1,4 (s, 9H, (CH3)3OCON), 1,2-1,1 (bred, 2H).

im/ z) : [M+H]<+>kalk. for Ci2H22N202) 227,18; funnet, 227,2.

Analytisk HPLC (isokratisk metode; 2:98 (A:B) til 90:10 (A:B) over 5 min.): retensjonstid = 3,68 min.

d. Fremstilling av l- isopropyl- 2- okso- l, 2- dihvdrokinolin- 3- karboksvlsvre

Først ble aceton (228,2 ml, 3,11 mol) satt til en omrørt oppløsning av 2-aminofenyl-metanol (255,2 g, 2,07 mol) og eddiksyre (3,56 ml, 62 mmol) i 2 liter vann ved romtemperatur. Etter 4 timer ble suspensjonen avkjølt til 0 °C og omrørt i ytterligere 2,5 timer og så filtrert. Faststoffet ble samlet og vasket med vann og det våte faststoff avkjølt og tørket ved lyofilisering for å gi 2,2,-dimetyl-l,4-dihydro-2i/-benzo[l,3]-oksazin (332,2 g, 98 %) som et hvitaktig faststoff.

<*>H NMR (CDC13; 300MHz): 1,48 (s, 6H, C(CH3)2), 4,00 (bs, 1H, NH), 4,86 (s, 2H, CH2), 6,66 (d, 1H, ArH), 6,81 (t, 1H, ArH), 6,96 (d, 1H, Arg), 7,10 (t, 1H, ArH).

En oppløsning av 2,2,-dimetyl-l,4-dihydro-2//-benzo[l,3]oksazin (125 g, 0,77 mol) i

1 liter THF ble filtrert gjennom en scintillasjonstrakt og så dråpevis satt, via en tilsetningstrakt, i løpet av 2,5 timer, til en omrørt oppløsning av 800 ml 1,0 M LiAlH4i THF, ved 0 °C. Reaksjonsblandingen ble quenchet ved langsom, porsjonsvis tilsetning av 110 g Na2SC>4- 10H2O i løpet av 1,5 timer ved 0 °C. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten, filtrert og de faste salter vasket grundig med THF. Filtratet ble konsentrert under redusert trykk og man oppnådde 2-isopropylaminofenylmetanol (120 g, 95 %) som en gul olje.

<*>H NMR (CDCI3; 300MHz): 1,24 (d, 6H, CH(CH3)2), 3,15 (bs, 1H, OH), 3,61 (sept, 1H, CH(CH3)2), 4,57 (s, 2H, CHz), 6,59 (t, 1H, ArH), 6,65 (d, 1H, ArH), 6,99 (d, 1H, ArH), 7,15 (t, 1H, ArH).

Mangandioksid (85 % 182,6 g, 1,79 mol) ble satt til en omrørt oppløsning av 2-isopropylaminofenylmetanol (118 g, 0,71 mol) i 800 ml toluen og reaksjonsblandingen varmet opp til 117 °C i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble tillatt avkjøling til romtemperatur over natten og så filtrert gjennom en pute av Celite som så ble eluert med toluen. Filtratet ble konsentrert under redusert trykk og man oppnådde 2-isopropylaminobenzaldehyd (105 g, 90 %) som en oransjefarget olje.

<1>HNMR(CDC13; 300MHz): 1,28 (d, 6H, CH(CH3)2), 3,76 (sept, 1H, CH(CH3)2), 6,65 (t, 1H, ArH), 6,69 (d, 1H, ArH), 7,37 (d, 1H, ArH), 7,44 (t, 1H, ArH), 9,79 (s, 1H,

CHO).

2,2-dimetyl-[l,3]dioksan-4,6-dion, vanligvis kalt Meldrums syre (166,9 g, 1,16 mol) ble satt til en omrørt oppløsning av 2-isopropylaminobenzaldehyd (105 g, 0,64 mol), eddiksyre (73,6 ml, 1,29 mol) og etylendiamin (43,0 ml, 0,64 mol) i 1 liter metanol ved 0 °C. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time ved 0 °C og deretter ved romtemperatur over natten. Den resulterende suspensjon ble filtrert og faststoffet vasket med metanol og samlet for å gi tittelmellomproduktet, l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre (146 g, 98 %) som et hvitaktig faststoff.

<*>H NMR (CDC13; 300MHz): 1,72 (d, 6H, CH(CH3)2), 5,50 (bs, 1H, CH(CH3)2), 7,44 (t, 1H, ArH), 7,75-7,77 (m, 2H, ArH), 7,82 (d, 1H, ArH), 8,89 (s, 1H, CH).

e. Fremstilling av ( IS . 3R . 5R )- 3 -\ 1 - isopropyl- 2- okso- 1. 2- dihydrokinolin- 3- karbonvD-aminol- 8- azabicvklor3. 2. 11oktan- 8- karboksvlsvrefert- butvlester

Tionylklorid (36,6 ml, 0,52 mol) ble satt til en omrørt suspensjon av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre (80 g, 0,35 mol) i 600 ml toluen ved 85 °C hvoretter reaksjonsblandingen ble varmet opp til 95 °C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og så i løpet av 25 min. satt til en heftig omrørt bifase-oppløsning av (l^Si^S^-S-amino-S-azabicyklotS^.^oktan-S-karboksylsyre tert-butylester (78,2 g, 0,35 mol) og natriumhydroksid (69,2 g, 1,73 mol) i 1 liter toluen/vann (1:1) ved °C. Etter 1 time ble sjiktene tillatt separering og den organiske fase konsentrert under redusert trykk. Den vandige fase ble vasket med 1 liter og så med 500 ml EtOAc og de kombinerte, organiske ekstrakter ble benyttet for å oppløse den konsentrerte, organiske rest. Oppløsningen ble vasket med 500 ml IM H3PO4, 500 ml mettet vandig NaHC03og 500 ml brine, og så tørket over MgS04, filtrert og konsentrert under redusert trykk for å gi tittelmellomproduktet (127,9 g, ca. 84 %) som et gult faststoff.

^NMRtCDCls): 1,47 (s, 9H), 1,67 (d, 6H), 1,78-1,84 (m, 2H), 2,04-2,18 (m, 6H), 4,20-4,39 (m, 3H), 5,65 (bs, 1H), 7,26 (dd, 1H), 7,63 (m, 2H), 7,75 (dd, 1H), 8,83 (s, 1H), 10,63 (d, 1H).

f. Fremstilling av l- isopropvl- 2- okso- 1. 2- dihvdrokinolin- 3- karboksylsyre {( IS3R . 5R )-8- azabicyklo [ 3. 2. 11 okt- 3 - yl} amid

300 ml TF A ble satt til en omrørt oppløsning av 127,9 g av produktet fra det foregående trinn i 600 ml CH2C12ved 0 °C. Reaksjonsblandingen ble varmet opp til romtemperatur

og omrørt i 1 time og så konsentrert under redusert trykk. Den oljeaktige, brune rest ble så helt i en heftig omrørt oppløsning av 3 liter eter og det dannet seg umiddelbart et fast precipitat. Suspensjonen ble omrørt over natten og deretter ble faststoffet samlet ved filtrering og vasket med eter for å gi tittelmellomproduktet som trifluoreddiksyresalt (131,7 g, 86 % i to trinn) som et lysegult faststoff.

<*>H NMR (CDC13): 1,68 (d, 6H), 2,10 (d, 2H), 2,33-2,39 (m, 4H), 2,44-2,61 (m, 2H), 4,08 (bs, 2H), 4,41 (m, 1H), 5,57 (bs, 1H), 7,31 (m, 1H), 7,66 (m, 2H), 7,77 (d, 1H), 8,83 (s, 1H), 9,38 (bd, 2H), 10,78 (d, 1H).

g. Fremstilling av 3- hydroksy- 3'- {[ 1 - isopropyl- 2- okso- 1, 2- dihydrokinolin- 3- yl)-karbonyll- aminolspirorazetidin- 1. 8'- n5'. 3-/ ?. 5./ ?V8- azabicvklor3. 2. 11oktan ( mellomprodukt ( V) medR<1>=H. R<2>= isopropyl)

2-brommetyloksiran (10,72 ml, 129,5 mmol) ble satt til en omrørt oppløsning av 1-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(l^i^Si^-S-aza-bicyklol^^.l]-okt-3-yl}amidtrifluoreddiksyresalt (14,65 g, 43,2 mmol) i 150 ml etanol ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble omrøt i 63 timer på hvilket tidspunkt det dannet seg et fast precipitat. Faststoffet ble samlet ved filtrering og vasket med 70 ml etanol for å gi mellomproduktet som brom 8,4 g bromidsalt.

( m/ z) : [M]<+>kalk. for C23H30N3O3396,23; funnet, 396,5. Retensjonstid (anal. HPLC: 2-50 % MeCN/H20 over 5 min.) = 4,13 min.

h. Fremstilling av 1 - isopropyl- 2- okso- 1. 2- dihvdrokinolinon- 3- karboksvlsvre l( 15', 3i?, 5i?)- 8-[ 2- hvdroksv- 3- metvlaminopropvll- 8- azabicvklo[ 3. 2. 11okt- 3- vl} amid 3 -hydroksy-3'- {[ 1 -isopropyl-2-okso-1,2-dihydrokinolin-3-yl)karbonyl]amino } spiro-[azetidin-l,8'-(15',3i?,5i?)-8-aza-bicyklo[3.2.1]oktanbromid (678 mg, 1,4 mmol) ble oppløst i 10 ml etanol og deretter ble en 41 % oppløsning i vann av metylamin (510 8,0 mmol) tilsatt. Blandingen ble varmet opp til 80 °C i 16 timer og så konsentrert under redusert trykk for å gi mellomproduktet som en uren olje som ble benyttet direkte i det følgende trinn.

i. Syntese av l- isopropvl- 2- okso- l, 2- dihydrokinolinon- 3- karboksvlsvre {( l<S', 3i?, 5i?)- 8-[ 2- hydroksy- 3 -( metansulfonyl- metvl- amino) propvll - 8- azabicyklo[ 3. 2. 11 okt- 3 - yl} amid

Produktet fra det foregående trinn ble oppløst i 10 ml diklormetan og deretter ble l,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-ene (763 ul, 5,1 mmol) tilsatt og blandingen omrørt under nitrogen og avkjølt til 0 °C. Metansulfonylklorid (132 ul, 1,7 mmol) ble tilsatt og blandingen omrørt ved 0 °C i 30 min. Reaksjonsblandingen ble quenchet ved tilsetning av vann og konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 10 ml eddiksyre:vann (1:1) og renset ved HPLC kromatografi. De rensede fraksjoner ble lyofilisert ved bruk av tittelforbindelsen som trifluoreddiksyresalt (340 mg).

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C25H36N4O5S, 505,25; funnet, 505,4. Retensjonstid (anal. HPLC: 2-50% MeCN/H20 over 5 min.) = 4,17 min.

Eksempel 2: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)- 8- [2-metoksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo-[3.2.1]okt-3-yl}amid

a. Fremstilling av 3 - metoksy- 3'- {[ 1 - isopropyl- 2- okso- 1, 2- dihydrokinolin- 3 - vnkarbonyll- aminolspirorazetidin- 1. 8'-( l5'. 3-/ ?. 5./ ?)- 8- aza- bicvklor3. 2. 11oktan ( mellomprodukt (<V>) medR<1>=H. R<2>= isopropyl. R<3>- metyl)

Kalium-ferf-butoksid (1,63 g, 14,5 mmol) ble satt til en omrørt suspensjon av 3-hydroksy-3'- {[ 1 -isopropyl-2-okso-1,2-dihydrokinolin-3 -yl)karbonyl]amino} spiro-[azetidin-l,8'-(15',3i?,5i?)-8-azabicyklo[3.2.1]oktanbromid (3,45 g, 7,25 mmol) i 100 ml diklormetan ved romtemperatur. Etter 2 min. ble metyljodid (0,477 ml, 7,61 mmol) satt til reaksjonsblandingen. Etter 30 min. ble 2 ml vann satt til for å quenche reaksjonen og reaksjonsblandingen ble konsentrert under redusert trykk. Resten ble oppløst i et minimalt volum av eddiksyre:vann (1:1) og renset ved preparativ HPLC for å gi tittelmellomproduktet som 2,1 g trifluoreddiksyresalt.

( m/ z) : [M]<+>kalk. for C24H32N3O3, 410,24; funnet 410.5. Retensjonstid (anal. HPLC: 2-50 % MeCN/H20 over 5 min.) = 4,36 min.

b. Fremstilling av 1 - isopropyl- 2- okso- 1, 2- dihydrokinolinon- 3- karboksvlsvre {( 15,, 3i?, 5i?)- 8-[ 2- metoksv- 3- metvlaminopropvll- 8- azabicvklo[ 3. 2. 11okt- 3- yl} amid 3 -metoksy-3'- {[ 1 -isopropyl-2-okso-1,2-dihydrokinolin-3 -yl)karbonyl]amino} spiro-[azetidin-l,8'-(15',3i?,5i?)-8-aza-bicyklo[3.2.1]oktantrifluoreddiksyresalt(410mg,

0,84 mmol) ble oppløst i 10 ml etanol og deretter ble 41 % metylaminoppløsning i vann (320 ul, 5 mmol) tilsatt. Blandingen ble varmet opp til 80 °C i 16 timer og så konsentrert under redusert trykk for å gi produktet som en uren olje som ble benyttet direkte i det følgende trinn.

c. Syntese av l- isopropvl- 2- okso- l, 2- dihvdrokinolinon- 3- karboksvlsvre |(! S, 3R, 5R)- 8-r2- metoksv- 3-( metansulfonvl- metvl- amino) propyll- 8- azabicvklor3. 2. 11okt- 3- vl| amid

Produktet fra det foregående trinn (53,6 mg, 0,12 mmol) ble oppløst i 1,0 ml diklormetan og deretter ble l,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-ene (89,7 ul, 0,6 mmol) tilsatt hvoretter blandingen ble omrørt under nitrogen og avkjølt til 0 °C. Metansulfonylklorid (18,6 ul, 0,24 mmol) ble tilsatt og blandingen omrørt ved 0 °C i 30 min. Blandingen ble quenchet ved tilsetning av vann og konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 1,5 ml eddiksyre:vann (1:1) og renset ved HPLC kromatografi. De rensede fraksjoner ble lyofilisert for å gi tittelforbindelsen som trifluoreddiksyresalt i en mengde av 45,8 mg.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C26H38N4O5S, 519,27; funnet 519,2. Retensjonstid (anal. HPLC: 5-40 % MeCN/H20 over 4 min.) = 2,72 min.

Eksempel 3: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(l^,3i?,5i?)-8-[3-(metansulfonyl-pyridin-3-ylmetyl-amino)-2-metoksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

a. Fremstilling av l- isopropvl- 2- okso- l, 2- dihvdrokinolin- 3- karboksylsyre (( l^ J^ Si?)-8-{ 2- metoksv- 3- r( pvridin- 3- vlmetvl) aminolpropyl}- 8- azabicvklo[ 3. 2. 11okt- 3- vl} amid 3 -metoksy-3'- {[ 1 -isopropyl-2-okso-1,2-dihydrokinolin-3 -yl)karbonyl]amino} spiro-[azetidin-l,8'-(15',3i?,5i?)-8-aza-bicyklo[3.2.1]oktan (410 mg, 0,84 mmol) ble oppløst i 10 ml etanol hvoretter 3-aminometylpyridin (153 ul, 1,5 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble varmet opp til 60 °C i 16 timer og så konsentrert under redusert trykk for å gi tittelmellomproduktet som en uren olje som ble benyttet direkte i det neste trinn.

b. Syntese av l- isopropvl- 2- okso- l, 2- dihvdrokinolin- 3- karboksylsyre j ( lS , 3R , 5R )- S -\ 3 -

( metansulfonyl- pyridin- 3 - vlmetvl- amino)- 2- metoksvpropyll - 8 - azabicyklo [ 3. 2. 11 okt- 3 - yl} amid

Produktet fra det foregående trinn (102,6 mg, 0,2 mmol) ble oppløst i 1,0 ml diklormetan hvoretter l,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-ene (119,6 ul, 0,8 mmol) ble tilsatt og blandingen så omrørt under nitrogen og avkjølt til 0 °C. Metansulfonylklorid (30,1 ul, 0,4 mmol) ble tilsatt og blandingen omrørt ved 0 °C i 30 min. Reaksjonen ble quenchet ved tilsetning av vann og blandingen ble konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 1,5 ml eddiksyre:vann (1:1) og renset ved HPLC kromatografi. De rensede fraksjoner ble lyofilisert for å gi tittelforbindelsen som 63,5 mg trifluoreddiksyresalt.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C31H41N5O5S, 596,29; funnet 596,2. Retensjonstid (anal. HPLC: 5-40 % MeCN/H20 over 4 min.) = 2,35 min.

Eksempel 4: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(l^,3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-metansulfonylamino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

a. Fremstilling av l- isopropyl- 2- okso- l, 2- dihvdrokinolin- 3- karboksylsyre UIS , 3R , 5R )-8-[ 3 -( 1, 3 - diokso- 1, 3- dihvdroisoindol- 2- vl)- 2- hydroksvpropvl - 8- azabicyklo[ 3. 2. 11 okt- 3 - yll amid

l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(lÆ^i^Si^-S-aza-bicyklo-[3.2.1]okt-3-yl}amid (3,39 g, 10 mmol) oppløses i 40 ml etanol og deretter tilsettes 2-oksiranylmetylisoindol-l,3-dion, generelt kalt epoksypropylftalimid, (3,05 g, 15 mmol). Blandingen varmes opp til 80 °C i 36 timer, avkjøles og konsentreres under redusert trykk. Den resulterende olje flashkromatograferes over Si02med diklormetan:metanol 9:1 for å gi tittelmellomproduktet i en mengde av 4,95 g som et hvitt faststoff som ble benyttet direkte i det neste trinn.

b. Fremstilling av 1 - isopropyl- 2- okso- 1, 2- dihydrokinolinon- 3- karboksvlsyre K15'. 3Æ5i?)- 8- r2- hvdroksv- 3- aminopropvll- 8- azabicvklor3. 2. 11okt- 3- vl} amid

Produktet fra det foregående trinn (4,95 g, 9,13 mmol) ble oppløst i 40 ml etanol og deretter ble hydrazin (860 ul, 27,4 mmol) tilsatt. Blandingen ble brakt til tilbakeløp i 16 timer og så avkjølt til romtemperatur. Blandingen ble filtrert og filtratet konsentrert for å gi tittelmellomproduktet som en uren olje som ble benyttet direkte uten ytterligere rensing.

c. Syntese av l- isopropvl- 2- okso- l, 2- dihvdrokinolinon- 3- karboksvlsvre ( OS, 3R, 5R)- 8-[ 2- hydroksy- 3 - metansulfonylamino) propvll - 8- azabicyklo[ 3. 2. 11 okt- 3 - yl} amid

Produktet fra det foregående trinn (82 mg, 0,2 mmol) ble oppløst i 1,0 ml diklormetan hvoretter l,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-ene (60 ul, 0,4 mmol) ble tilsatt og blandingen omrørt under nitrogen og avkjølt til -78 °C. Metansulfonylklorid (15,5 ul, 0,2 mmol) ble tilsatt og blandingen omrørt og tillatt oppvarming til romtemperatur i 30 min. Reaksjonen ble quenchet ved tilsetning av vann og blandingen konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 1,5 ml eddiksyre:vann 1:1 og renset ved HPLC kromatografi. De rensende fraksjoner ble lyofilisert for å gi tittel - forbindelsen som 70,7 mg trifluoreddiksyresalt.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C24H34N4O5S, 491,23; funnet 491,2. Retensjonstid (anal. HPLC: 5-40 % MeCN/H20 over 4 min.) = 2,43 min.

Eksempel 5: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)- 8- [3-(metansulfonyl-pyridin-3-ylmetyl-amino)-2-hy droksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

a. Fremstilling av l- isopropvl- 2- okso- l, 2- dihvdrokinolin- 3- karboksylsyre UIS , 3R , 5R ) 8-{ 2- hvdroksv- 3-[( pvridin- 3- vlmetvl) aminolpropvl}- 8- azabicvklo[ 3. 2. 11okt- 3- yl} amid 3 -hydroksy-3'- {[ 1 -isopropyl-2-okso-1,2-dihydrokinolin-3-yl)karbonyl]amino} spiro-[azetidin-l,8'-(15',3i?,5i?)-8-aza-bicyklo[3.2.1]oktanbromid (505 mg, 1,27 mmol) ble oppløst i 10 ml etanol og deretter ble 3-(aminometyl)-pyridin (193 ul, 1,9 mmol) tilsatt. Blandingen ble varmet opp til 80 °C i 16 timer og så konsentrert under redusert trykk for å gi tittelmellomproduktet som en uren olje som ble benyttet direkte i det følgende trinn.

( metansulfonyl- pyridin- 3 - vlmetvl- amino)- 2- hvdroksvpropyll - 8- azabicyklo[ 3. 2. 11 okt- 3 - yl} amid

Produktet fra det foregående trinn (42,5 mg, 0,08 mmol) ble oppløst i 1,0 ml diklormetan, l,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-ene (74,8 ul, 0,5 mmol) ble tilsatt, og

blandingen omrørt under nitrogen og avkjølt til 0 °C. Metansulfonylklorid (6,1 ul, 0,08 mmol) ble tilsatt og blandingen omrørt ved 0 °C i 30 min. Reaksjonen ble quenchet ved tilsetning av vann og konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 1,5 ml eddiksyre:vann 1:1 og renset ved HPLC kromatografi. De rensende fraksjoner ble lyofilisert for å gi tittelforbindelsen som 22,8 mg trifluoreddiksyresalt.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C30H39N5O5S, 582,28; funnet 582,2. Retensjonstid (anal. HPLC: 5-40 % MeCN/H20 over 4 min.) = 2,78 min.

Eksempel 6: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)- 8- [(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

a. Fremstilling av ( £M-( benzvl- metyl- aminoV3- klorpropan- 2- og lignende

N-benzylmetylamin (13,95 ml, 108,1 mmol) og (5)-2-klormetyloksiran, generelt kalt (5)-epiklorhydrin (8,48 ml, 108,1 mmol) ble oppløst i 40 ml heksan og omrørt i 16 timer. Oppløsningen ble så flashkromatografert over Si02og eluert med 10 % metanol: 90 % diklormetan). Fraksjoner inneholdende produktet ble konsentrert og man oppnådde 19,7 g av tittelmellomproduktet som en olje.

'H-NMR (DMSO d6, 299,96 MHz): 5 (ppm) 2,01 (s, 3H), 2,2-2,4 (m, 2H), 3,21-3,5 (m, 3H), 3,53-3,6 (m, 1H), 3,65-3,75 (m, 1H), 4,95 (d, 1H), 7,0-7,25 (m, 5H).

im/ z) : [M+H]<+>kalk. for CnHi6ClNO, 214,10; funnet 214,1.

b. Fremstilling av (( 5V3- klor- 2- hvdroksvpropvl) metvlkarbaminsvreefrt- butylester

($-l-(benzyl-metyl-amino)-3-klorpropan-2-ol (8,4 g, 39,3 mmol) ble oppløst i 75 ml etylacetat og deretter ble di-ferf-butyldikarbonat (9,3 g, 43,23 mmol) og 2,6 g palladiumhydroklorid, tilsatt. Blandingen ble ristet i 12 timer under 60 atmosfærer hydrogen. Blandingen ble filtrert gjennom et sjikt av Celite® og konsentrert til tørr

tilstand under redusert trykk. Den resulterende olje ble filtrert gjennom silika, eluert med heksan, fulgt av diklormetan, fulgt av dietyleter. Etersjiktet ble konsentrert og man oppnådde mellomproduktet som 7,1 g olje.

^-NMR (DMSO d6, 299,96 MHz): 5 (ppm) 1,35-1,46 (s, 9H), 2,81-2,85 (s, 3H), 2,95-3,1 (m, 1H), 3,3-3,6 (m, 3H), 3,67-3,85 (m, 1H), 5,25-5,4 (m, 1H).

im/ z) : [M+H-Boc]<+>kalk. for C9Hi8ClN03, 123,10; funnet 123,1.

c. Fremstilling av (( i?)- 2- hvdroksv- 3-( 3-[( l- isopropvl- 2- okso- 1. 2- dihvdrokinolin- 3-karbonyl) aminol -( 1 S , 3R , 5i?)- 8- azabicyklo[ 3. 2. 11 okt- 8- vl} propvDmetvlkarbaminsvre-fert- butylester ((5)-3-klor-2-hydroksypropyl)metylkarbaminsyretert-butylester (335 mg, 1,5 mmol) og 1- isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(l^T^ST^-S-aza-bicyklo-[3.2.1]okt-3-yl}amid (339 mg, 1,0 mmol) ble oppløst i 5 ml metanol hvoretter N, N-diisopropyletylamin (523 ul, 3,0 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble varmet opp til 80 °C i 16 timer og så konsentrert under redusert trykk. Den resulterende olje ble flashkromatografert over SiC>2og eluert med 10 % metanol:90 % diklormetan. Fraksjoner inneholdende produktet ble konsentrert for å gi tittelmellomproduktet som et hvitt faststoff i en mengde av 0,5 g. im/ z) : [M+H]<+>kalk. for C29H42N4O5, 527,33; funnet 527,6. Retensjonstid (anal. HPLC: 2- 50 % MeCN/H20 over 5 min.) = 4,75 min. d. Fremstilling av l- isopropyl- 2- okso- 1. 2- dihvdrokinolin- 3- karboksvlsvre 1( 15. 37^. 57?)-8-[( 5)- 2- hvdroksv- 3- metvlaminopropvll- 8- azabicvklo[ 3. 2. 11okt- 3- yl} amid ((7?)-2-hydroksy-3 - {3 -[(1 -isopropyl-2-okso-1,2-dihydrokinolin-3 -karbonyl)amino] - (l^ST^S^-S-azabicyklotS^.^okt-S-ylJpropyOmetylkarbaminsyreterNbutylester (575 mg, 1,09 mmol) ble oppløst i 5 ml diklormetan og deretter ble 5 ml trifluoreddiksyre langsomt tilsatt. Blandingen ble omrørt i 30 min. og deretter konsentrert under redusert trykk. Den resulterende olje ble triturert med dietyleter og så filtrert. Precipitatet ble tørket under vakuum for å gi tittelmellomproduktet som 0,68 g trifluoreddiksyresalt. im/ z) : [M+H]<+>kalk. for C24H34N4O3, 427,27; funnet 427,2. Retensjonstid (anal. HPLC: 2-50 % MeCN/H20 over 5 min.) = 3,40 min.

e. Syntese av 1 - isopropyl- 2- okso- l, 2- dihydrokinolin- 3- karboksylsyre {( l^ S^ S^- S-[( i?)- 2- hvdroksv- 3-( metansulfonvl- metvl- amino) propyll- 8- aza- bicvklo[ 3. 2. 11okt- 3-yllamid

l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[(5)-2-hydroksy-3-metylaminopropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (1,03 g, 1,57 mmol) ble oppløst i 6,0 ml diklormetan, l,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-ene (747 ul, 5,0 mmol) ble tilsatt og blandingen omrørt under nitrogen og avkjølt til 0 °C. Metansulfonylklorid (124,4 ul, 1,6 mmol) ble tilsatt og blandingen omrørt ved 0 °C i 30 min. Reaksjonen ble quenchet ved tilsetning av vann og blandingen konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 5 ml eddiksyre: vann 1:1 og renset ved HPLC kromatografi. De rensende fraksjoner ble lyofilisert for å gi tittelforbindelsen som 0,38 g trifluoreddiksyre.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C25H36N4O5S, 505,25; funnet 505,4. Retensjonstid (anal. HPLC: 2-50 % MeCN/H20 over 5 min.) = 4,17 min.

Fri base: ^-NMR (DMSO d6, 299,96 MHz): 6 (ppm) 1,40-1,68 (d, 6H), 1,81-2,02 (br s, 4H), 2,02-2,18 (br m, 2H), 2,22-2,36 (d, 2H), 2,78-2,90 (2 s, 6H), 2,91-3,04 (m, 1H), 3,10-3,30 (m, 4H), 3,61-3,78 (br s, 1H), 4,02-4,17 (m, 1H), 4,71-4,79 (br s, 1H), 5,2-5,8 (br s, 1H), 7,3-7,4 (t, 1H), 7,67-7,78 (t, 1H), 7-82-7,94 (d, 1H), 7,98-8,02 (d, 1H), 8,80 (s, 1H), 10,37-10,40 (d,NH).

Eksempel 7: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15,3i?,5i?)-8-[(5)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

Ved å følge prosedyren i eksempel 6 men ved å benytte (i?)-2-klormetyloksiran i stedet for (5)-2-klormetyloksiran i trinn a fremstilles de følgende mellomprodukter og tittel-forbindelser:

(i?>l-(benzyl-metyl-amino)-3-klorpropan-2-ol:<X>H-NMR (DMSO d6, 299,96 MHz):

8 (ppm) 2,01 (s, 3H), 2,2-2,4 (m, 2H), 3,21-3,5 (m, 3H), 3,53-3,6 (m, 1H), 3,65-3,75 (m, 1H), 4,95 (d, 1H), 7,0-7,25 (m, 5H).

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for CnHi6ClNO, 214,10; funnet 214,1.

((i?)-3-klor-2-hydroksy-propyl)metylkarbaminsyretert-butylester:

'H-NMR (DMSO de, 299,96 MHz): 6 (ppm) 1,35-1,46 (s, 9H), 2,81-2,85 (s, 3H), 2,95-3,1 (m, 1H), 3,3-3,6 (m, 3H), 3,67-3,85 (m, 1H), 5,25-5,4 (m, 1H).

( m/ z) : [M+H-Boc]<+>kalk. for C9Hi8ClN03, 123,10; funnet 123,1.

((S)-2-hydroksy-3- {3 - [(1 -isopropyl-2-okso-1,2-dihydrokinolin-3 -karbonyl)amino] -

(1 S, 3R, 5i?)-8-azabicyklo[3,2,1 ] okt-8-yl} propyl)mety lkarbaminsyretert-butyl ester:

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C29H42N4O5, 527,33; funnet 527,6. Retensjonstid (anal. HPLC: 2-50 % MeCN/H20 over 5 min.) = 4,75 min. 1- isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3./?,5./?)-8-[(/?)-2-hydroksy-3 -metylaminopropyl] -8-azabicyklo[3,2,1 ] okt-3-yl} amid: ( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C24H34N4O3, 427,27; funnet 427,2. Retensjonstid (anal. HPLC: 2- 50 % MeCN/H20 over 5 min.) = 3,40 min. l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(l5',3i?,5i?)-8-[(5)-2-hydroksy-3 -(metansulfonyl-metyl-amino)propy 1] - 8-aza-bicyklo [3,2,1 ] okt-3 -yl} amid: ( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C25H36N405S, 505,25; funnet 505,4. Retensjonstid (anal. HPLC: 2-50 % MeCN/H20 over 5 min.) = 4,17 min.

Eksempel 8: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)- 8- [2-hydroksy-3- [metyl-(py ridin-4-karbonyl)amino] propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3- metylaminopropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (71 mg, 0,17 mmol) ble oppløst i 0,5 ml DMF og deretter ble iV,iV-diisopropyletylamin (88,9 ul, 0,51 mmol) tilsatt. Deretter ble en oppløsning av isonikotinsyre (41,8 mg, 0,34 mmol) og PyBOP (177 mg, 0,34 mmol) i DMF, tilsatt. Den resulterende blanding ble ristet ved romtemperatur i 30 min. og så konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 1,5 ml eddiksyre:vann 1:1 og renset ved HPLC kromatografi. De rene fraksjoner ble lyofilisert for å gi tittelforbindelsen som 30,8 g trifluoreddiksyresalt.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C30H37N5O4, 532,29; funnet 532,7. Retensjonstid (anal. HPLC: 5-40 % MeCN/H20 over 4 min.) = 2,11 min.

Eksempel 9: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)- 8- [2-hydroksy-3- [(pyridin-4-karbonyl)amino] propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-aminopropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (82,4 mg, 0,2 mmol) ble oppløst i 0,5 ml DMF hvoretter iV-diisopropyletylamin (69,7 ul, 0,4 mmol) ble tilsatt. Deretter ble en oppløsning av isonikotinsyre (49,2 mg, 0,4 mmol) og PyBOP (208,2 mg,

0,4 mmol) i DMF, tilsatt. Den resulterende blanding ble ristet ved romtemperatur i 30 min. og så konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 1,5 ml eddiksyre:vann 1:1 og renset ved HPLC kromatografi. De rensede fraksjoner ble lyofilisert for å gi tittelforbindelsen som 82,1 mg trifluoreddiksyresalt.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C29H35N5O4, 518,28; funnet 518,2. Retensjonstid (anal. HPLC: 5-40 % MeCN/H20 over 4 min.) = 2,20 min.

Eksempel 10: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)- 8- [3-(acetyl-metyl-amino)-2-metoksy propyl]-8-azabicyklo [3.2.1] okt-3-yljamid

l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(l^i^Si^-S-^-metoksy-S-metylaminopropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (53,6 mg, 0,12 mmol) ble oppløst i 1,0 ml DMF hvoretter iV,iV-diisopropyletylamin (104 ul, 0,6 mmol), ble tilsatt. Blandingen ble omrørt under nitrogen og avkjølt til 0 °C. Acetylklorid (17,1 ul,

0,24 mmol) ble tilsatt og blandingen omrørt ved 0 °C i 30 min. og så konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 1,5 ml eddiksyre:vann 1:1 og renset ved HPLC. De rensede fraksjoner ble lyofilisert og man oppnådde tittelforbindelsen som trifluoreddiksyresalt i en mengde av 40,4 mg.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C27H38N4O4, 483,30; funnet 483,2. Retensjonstid (anal. HPLC: 5-40 % MeCN/H20 over 4 min.) = 2,54 min.

Eksempel 11. Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(15,3i?,5i?)-8-[2-metoksy-3-[metyl-(pyridin-4-karbonyl)amino]propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(lÆ^i^Si^-S-^-metoksy-S-metylaminopropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (53,6 mg, 0,12 mmol) ble oppløst i 1,0 ml DMF og deretter ble iV,iV-diisopropyletylamin (104,5 ul, 0,6 mmol) tilsatt. Blandingen ble omrørt under nitrogen og avkjølt til 0 °C. Isonikotinylklorid (42,7 mg, 0,24 mmol) ble tilsatt og blandingen omrørt ved 0 °C i 30 min. og så konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 1,5 ml eddiksyre:vann 1:1 og renset ved HPLC kromatografi. De rensede fraksjoner ble lyofilisert og man oppnådde tittelforbindelsen som trifluoreddiksyresalt i en mengde av 54,4 mg.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C31H39N5O4, 546,31; funnet 546,2. Retensjonstid (anal. HPLC: 5-40 % MeCN/H20 over 4 min.) = 2,29 min.

Eksempel 12. Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydro-kinolin-3-karboksylsyre {(15,3i?,5i?)-8-[3-(acetyl-pyridin-3-ylmetyl-amino)-2-metoksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre (8-{2-metoksy-3-[(pyridin-3-ylmetyl)amino]propyl}-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl)amid (102,6 mg, 0,2 mmol) ble oppløst i 1,0 ml DMF hvoretter iV,iV-diisopropyletylamin (139,4 ul, 0,8 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt under nitrogen og avkjølt til 0 °C. Acetylklorid (28,5 ul, 0,4 mmol) ble tilsatt og blandingen omrørt ved 0 °C i 30 min. og så konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 1,5 ml eddiksyre:vann 1:1 og renset ved HPLC kromatografi. De rensede fraksjoner ble lyofilisert og man oppnådde tittelforbindelsen som 33,2 mg trifluoreddiksyresalt.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C32H41N5O4, 560,33; funnet 560,4. Retensjonstid (anal. HPLC: 5-40 % MeCN/H20 over 4 min.) = 2,27 min.

Eksempel 13. Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydro-kinolin-3-karboksylsyre {(15,3i?,5i?)-8-[3-acetylamino-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-aminopropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (82,4 mg, 0,2 mmol) ble oppløst i

0,5 ml DMF hvoretter AfiV-diisopropyletylamin (69,7 ul, 0,4 mmol) ble tilsatt. Deretter ble en oppløsning av eddiksyre (22,7 ul, 0,4 mmol) og PyBOP (208,2 mg, 0,4 mmol) i DMF, tilsatt. Den resulterende blanding ble ristet ved romtemperatur i 30 min. og så konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 1,5 ml eddiksyre:vann 1:1 og renset ved HPLC kromatografi. De rensede fraksjoner ble lyofilisert for å gi tittelforbindelsen som trifluoreddiksyresalt i en mengde av 79,2 mg.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C25H34N4O4, 455,27; funnet 455,2. Retensjonstid (anal. HPLC: 5-40 % MeCN/H20 over 4 min.) = 2,33 min.

Eksempel 14. Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydro-kinolin-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)- 8- [3-(acetyl-metyl-amino)-2-hydroksy propyl]-8-azabicyklo [3.2.1] okt-3-yl}amid

l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-metylaminopropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (43 mg, 0,1 mmol) ble oppløst i 1,0 ml DMF og deretter ble iV,iV-diisopropyletylamin (87,1 ul, 0,5 mmol), tilsatt. Blandingen ble omrørt under nitrogen og avkjølt til 0 °C. Acetylklorid (17,8 ul,

0,25 mmol) ble tilsatt og blandingen omrørt ved 0 °C i 30 min. Blandingen ble konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 1,5 ml eddik-yre:vann 1:1 og renset ved HPLC kromatografi. De rensede fraksjoner ble lyofilisert for å gi tittelmellomproduktet som trifluoreddiksyresalt i en mengde av 17,1 mg.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C26H36N4O4, 469,28; funnet 469,2. Retensjonstid (anal. HPLC: 5-40 % MeCN/H20 over 4 min.) = 2,49 min.

Eksempel 15. Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydro-kinolin-3-karboksylsyre {(15,3i?,5i?)-8-[3-(formyl-metyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-metylaminopropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (43 mg, 0,1 mmol) ble oppløst i 1,0 ml etylformat. Blandingen ble varmet opp til 65 °C i 16 timer og så konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 1,5 ml eddiksyre: vann 1:1 og renset ved HPLC kromatografi. De rensede fraksjoner ble lyofilisert for å gi tittelmellomproduktet som trifluoreddiksyresalt i en mengde av 22,7 mg.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C25H34N4O4, 455,27; funnet 455,2. Retensjonstid (anal. HPLC: 5-40 % MeCN/H20 over 4 min.) = 2,37 min.

Eksempel 16. Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydro-kinolin-3-karboksylsyre {( 1S, 3R, 5R)- S- [3-formylamino-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo [3.2.1] okt-3-yl}-amid

l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(l5',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-aminopropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (41,2 mg, 0,1 mmol) ble oppløst i 1,0 ml etylformat. Blandingen ble varmet opp til 65 °C i 16 timer og så konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 1,5 ml eddiksyre: vann 1:1 og renset ved HPLC kromatografi. De rensede fraksjoner ble lyofilisert for å gi tittelforbindelsen som 37,5 mg trifluoreddiksyresalt.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C24H32N4O4, 441,25; funnet 441,2. Retensjonstid (anal. HPLC: 5-40 % MeCN/H20 over 4 min.) = 2,89 min.

Eksempel 17. Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydro-kinolin-3-karboksylsyre {( 1S, 3R, 5R)- S- [(Æ)-3-(acetyl-metyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo [3.2.1] - okt-3-yl}amid

1- isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[(5)-2-hydroksy-3-metylaminopropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (200 mg, 0,3 mmol) ble oppløst i 1,0 ml DMF hvoretter N,iV-diisopropyletylamin (160,3 ul, 0,92 mmol) ble tilsatt. Deretter ble en oppløsning av eddiksyre (17,3 ul, 0,3 mmol) og PyBOP (159 mg,

0,3 mmol), i DMF, tilsatt. Den resulterende blanding ble ristet ved romtemperatur i 30 min. og så konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 1,5 ml eddiksyre:vann 1:1 og renset ved HPLC kromatografi. De rensede fraksjoner ble lyofilisert for å gi tittelmellomproduktet som 130 mg trifluoreddiksyresalt.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C26H36N4O4, 469,28; funnet 469,5. Retensjonstid (anal. HPLC: 2- 50 % MeCN/H20 over 5 min.) = 3,94 min.

Eksempel 18. Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydro-kinolin-3-karboksylsyre {(15,3i?,5i?)-8-[(i?)-3-(formyl-metyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

1- isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[(5)-2-hydroksy-3-metylaminopropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (235 mg, 0,36 mmol) ble oppløst i 5,0 ml etylformat. Blandingen ble varmet opp til 65 °C i 16 timer og så konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Produktet ble tatt opp i 1,5 ml eddiksyre:vann 1:1 og renset ved HPLC kromatografi. De rensede fraksjoner ble lyofilisert for å gi tittelmellomproduktet som trifluoreddiksyresalt i en mengde av 97,5 mg.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C25H34N4O4, 455,27; funnet 455,2. Retensjonstid (anal. HPLC: 2- 50 % MeCN/H20 over 5 min.) = 3,87 min.

Eksempel 19: Syntese av 5-brom-l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(lÆ,3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl] -8-azabicyklo [3.2.1] okt-3-yl} amid

Til en oppløsning av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo-[3.2.1]okt-3-yl}amid (500 mg, 0,99 mmol), oppløst i en mengde av 5 ml acetonitril og 10 ml eddiksyre, ble det satt brom (0,30 ml, 5,9 mmol). Blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 12 timer og konsentrert under redusert trykk og ga en blek gul, oljeaktig rest. Resten ble oppløst i 5 ml 20 % acetonitril i vann med 0,5 % TF A og renset ved HPLC. Tittelforbindelsen ble oppnådd som et hovedprodukt og isolert som et 200 mg trifluoreddiksyresalt.

<X>H-NMR (CD3OD): 5 (ppm) 8,64 (s, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,72-7,70 (m, 2H), 4,18 (br m, 2H), 4,0 (br s, 1H), 3,2-3,0 (m), 2,88 (s, 3H), 2,79 (s, 3H), 2,5-2,2 (m, 2H), 1,56 (d, 6H).

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C25H35BrN405S, 583,16; funnet 583,4. Retensjonstid (anal, HPLC: 10-50 % MeCN/H20 over 6 min.) = 3,90 min.

Eksempel 20: Alternativ syntase av ((i?)-2-hydroksy-3-{3-[(l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karbonyl)amino]-(15,3i?,5i?)-8-azabicyklo [3.2.1] okt-8-yl}propyl)metylkarbaminsyretert-butylester

a. Fremstilling av metvl-( 5)- l- oksiranylmetvlkarbaminsvreefrt- butvlester

((5)-3-klor-2-hydroksypropyl)-metylkarbaminsyreet/1;-butylester (2,23 g, 10 mmol) ble oppløst i 30 ml THF og deretter ble det tilsatt en 0,48 g vandig natriumhydroksid-oppløsning i 10 ml vann. Blandingen ble omrørt i 2 timer. Blandingen ble så konsentrert under redusert trykk for å fjerne mesteparten av THF og den gjenværende, vandige oppløsning ble ekstrahert til etylacetat og vasket med vann. Produktet ble tørket over natriumsulfat, filtrert og konsentrert under redusert trykk og man oppnådde 1,6 g av tittelmellomproduktet som en olje.

im/ z) : [M+Na]<+>kalk. for C9H17NO3, 210,10; funnet 210,1.

^-NMR (DMSO d6, 299,96 MHz): 5 (ppm) 1,32-1,42 (s, 9H), 2,69-2,73 (m, 1H), 2,75-2,85 (s, 3H), 2,95-3,05 (br s, 1H), 3,10-3,15 (dm, 1H), 3,16-3,21 (d, 1H), 3,37-3,51 (m, 2H).

b. Syntese av (( i?)- 2- hvdroksv- 3-( 3-[( l- isopropyl- 2- okso- 1. 2- dihvdrokinolin- 3-karbonyl) aminol -( 1 S , 3R , 5i?)- 8- azabicyklo[ 3. 2. 11 okt- 8- vl} propvDmetvlkarbaminsvre-tert- butylester

Metyl-(5)-l-oksiranylmetylkarbaminsyretert-butylester (9,53 g, 51,1 mmol) og 1-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15,3i?,5i?)-8-aza-bicyklo-[3.2.1]okt-3-yl}amid (8,7 g, 25,6 mmol) ble oppløst i 100 ml metanol. Blandingen ble varmet opp til 80 °C i 2 timer og så konsentrert under redusert trykk. Den resulterende olje ble tatt opp i etylacetat og vasket med mettet, vandig natriumbikarbonat fulgt av mettet vandig natriumklorid. De organiske væsker ble tørket over natriumsulfat, filtrert og konsentrert under redusert trykk. Den resulterende olje ble flashkromatografert over Si02og eluert med 10 % metanol:90 % diklormetan. Fraksjoner inneholdende produktet ble konsentrert og man oppnådde mellomproduktet som et hvitt faststoff i en mengde av 13,5 g.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C29H42N4O5, 527,33; funnet 527,6. Retensjonstid (anal. HPLC: 2-50 % MeCN/H20 over 5 min.) = 4,75 min.

Eksempel 21: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(15,3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-(metansulfonyl-etylamino)propyl]-8-azabicyklo-[3.2.1]okt-3-yl}amid

Ved å følge prosedyren i eksempel 1 men ved å erstatte metylamin med etylamin i trinn h ble tittelforbindelsen fremstilt.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C26H38N4O5S, 519,28; funnet 519,2. Retensjonstid (anal. HPLC: 10-70 % MeCN/H20 over 6 min.) = 2,91 min.

Eksempel 22: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)- 8- [(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonylamino)-propyl] -8-azabicy klo-[3.2.1]okt-3-yl}amid

al. Fremstilling av ( 5V2- oksiranvlmetvlisoindol- 1. 3- dion

Til en kald oppløsning av (S)-l-oksiranylmetanol (5 g, 67,5 mmol) og ftalimid (9,9 g, 67,3 mmol) i tetrahydrofuran (200 ml) ble det i et isbad satt trifenylfosfin (17,9 g, 68,2 mmol) og dietylazodikarboksylat (12,3 g, 70,6 mmol). Blandingen ble omrørt ved 0 °C i 2 timer og ved omgivelsestemperatur i 48 timer. Blandingen ble konsentrert under vakuum og den oljeaktige rest renset ved flashsilikakolonnekromatografi og man oppnådde 10,1 g ønsket produkt som et blekgult faststoff.

Rf=0,51 i 1:1 EtOAc/heksan, ^-NMR (CDCI3, 300MHz): 5 (ppm) 7,76-7,64 (m, 2H), 7,63-7,60 (m, 2H), 3,9-3,8 (dd, 1H), 3,70-3,65 (dd, 1H), 3,15 (m, 1H), 2,70-2,67 (dd, 1H), 2,58-2,55 (dd, 1H).

bl. Syntese av 1 - isopropyl- 2- okso- 1. 2- dihvdrokinolinon- 3- karboksvlsvre ( OS. 3R. 5R)-8- r( i?)- 2- hydroks v- 3 - metansulfonylamino) prop yll - 8- azabicyklo [ 3. 2. 11 okt- 3 - yl} amid

Ved å følge prosedyren i Eksempel 4 men ved å erstatte rasemisk 2-oksiranylmetyl-isoindol-l,3-dion med det kirale mellomprodukt fra det foregående trinn ble trifluoracetatsaltet av tittelforbindelsen fremstilt.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C24H34N4O5S, 491,24; funnet 491,4. Retensjonstid (anal. HPLC: 10-50 % MeCN/H20 over 6 min.) = 3,69 min.

^-NMR (CD3OD, 300MHz): 8 (ppm) 8,67 (s, 1H), 7,74-7,73 (m, 3H), 7,7-7,6 (dt, 1H), 7,3-7,2 (t, 1H), 4,2 (br s, 2H), 4,0 (br m, 2H), 3,2-2,9 (m, 4H), 2,8 (s, 3H), 2,6-2,3 (br m, 6H), 2,2-2,1 (br m, 2H), 1,57-1,55 (d, 6H).

Tittelforbindelsen ble også fremstilt ved den følgende prosedyre.

a2. Fremstilling av A^-(( 5)- oksiranylmetvl) metansulfonamid

Til en kald oppløsning av metansulfonamid (10 g, 0,105 mol) i 100 ml vann i et isbad settes natriumhydroksid som pellets (8,4 g, 0,21 mol) og deretter tilsettes (5)-2-klor-metyloksiran (12,4 g, 0,158 mol). Blandingen omrøres ved denne temperatur i 2 timer og ved romtemperatur i 12 timer og deretter tilsettes 18 ml konsentrert saltsyre. Produktet isoleres ved ekstrahering av det vandige sjikt med 2 x 300 ml diklormetan. Det organiske sjikt tørkes over MgSC>4 og fordampes så til tørr tilstand og man oppnår 2,5 g fargeløs væske som benyttes direkte i det neste trinn.

b2. Syntese av 1 - isopropyl- 2- okso- l, 2- dihvdrokinolinon- 3- karboksvlsvre (( 1S , 3R , 5i?)-8-[( i?)- 2- hvdroksv- 3-( metansulfonvlamino) propvll- 8- azabicvklo[ 3. 2. 11okt- 3- yl} amid

Til en oppløsning av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(l£3i?,5i?)-8-aza-bicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (TFA salt; 4 g, 8,8 mmol) i 150 ml metanol settes iV,iV-diisopropyletylamin (1,7 ml, 9,5 mmol) og produktet fra det foregående trinn (2,5 g, 18,2 mmol). Blandingen omrøres ved 80 °C i 2 dager. Etter konsentrering under vakuum renses resten ved preparativ HPLC og man oppnår trifluoracetatsaltet av tittelforbindelsen i en mengde av 1,3 g.

Eksempel 23: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(15,3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-(l,l-diokso-2-isotiazolidinyl)propyl]-8-azabicyklo-[3.2.1]okt-3-yl}amid

a. Fremstilling av 1 - isopropyl- 2- okso- 1, 2- dihydrokinolinon- 3- karboksvlsyre l( 15', 3i?, 5i?)- 8-[ 2- hvdroksv- 3-( 3- klorpropansulfonvlamino) propvll- 8- azabicvklor3. 2. 11okt- 3- vliamid

Til en kald oppløsning av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-aminopropyl]-8-azabicyklo[3.2.1] okt-3-yl} amid TFA salt (0,125 g, 0,195 mmol) i 2 ml diklormetan settes i et isbad iV,iV-diisopropyletylamin (0,119 ml, 0,683 mmol) og 3-klorpropansulfonylklorid (0,025 ml, 0,205 mmol). Etter omrøring ved 0 °C i 2 timer omrøres blandingen ved romtemperatur over natten. Det hele fortynnes med 50 ml diklormetan og vaskes med brine og mettet NaHCC>3 oppløsning. Etter tørking over MgSC>4 fordampes den organiske oppløsning til tørr tilstand og man oppnår en oljeaktig rest. Råproduktet benyttes direkte i det neste trinn.

b. l- isopropvl- 2- okso- l, 2- dihvdrokinolinon- 3- karboksylsyre {( 15', 3i?, 5i?)- 8-[ 2-hvdroksv- 3-( l. l- diokso- 2- isotiazolidinvl) propyll- 8- azabicvklor3. 2. 11okt- 3- vl| amid

Til en oppløsning av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-(3-klorpropansulfonylamino)propyl]-8-azabicyklo-[3.2.1]okt-3-yl}amid (100 mg, 0,18 mmol) i 3 ml vannfri DMF settes kaliumkarbonat (75 mg, 0,56 mmol). Reaksjonsblandingen ristes ved 85 °C i 12 timer og konsentreres så under vakuum. Resten oppløses i 50 ml diklormetan og vaskes med mettet NaHCC>3. Etter tørking over MgSC>4 fordampes filtratet til tørr tilstand og resten renses ved preparativ HPLC for å gi tittelforbindelsen.

( m/ z) : [M+H]<+>kalk. for C26H36N4O5S, 517,26; funnet 517,3.

Eksempel 24: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {( 1S, 3R, 5R)- S- [(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

a. Fremstilling av ( lÅSÆS^- S- ri- isopropyl^- okso- l^- dihydrokinolin- S-karbonvDaminol - 8- azabicvklo[ 3. 2. 11 oktan- 8- karboksvlsvre fert- butvlester

I en 3 liters kolbe suspenderes l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre (112,4 g, 0,486 mol, 1,1 ekv.) i 1 liter toluen. Blandingen varmes opp til 85 °C hvoretter tionylklorid (86,74 g, 0,729 mol) dråpevis tilsettes i løpet av 70 min. Blandingen varmes opp til 95 °C i 1,5 timer under omrøring og tillates så avkjøling til romtemperatur.

I en separat 12 liters kolbe suspenderes (15,3i?,5i?)-3-amino-8-azabicyklo[3.2.1]oktan-8-karboksylsyreefrt-butylester (100,0 g, 0,442 mol, 1 ekv.) i 1 liter toluen hvoretter 4 ekv. 3 M NaOH tilsettes. Blandingen omrøres ved romtemperatur i 10 min. og avkjøles så til 5 °C. Den sure kloridoppløsning settes langsomt til under omrøring i løpet av 40 min. mens den indre temperatur holdes under 10 °C. Blandingen omrøres ved 3 til 5 °C i 30 min. og sjiktene tillates separering over natten. De rundt 2,5 liter toluensjikt samles, konsentreres til det rundt halve (-1,2 1) ved rotasjonsfordamping og benyttes direkte i det neste trinn.

b. Fremstilling av l- isopropyl- 2- okso- l, 2- dihvdrokinolin- 3- karboksvlsvre UlS , 3R , 5R )-8- azabicvklo [ 3. 2. 11 okt- 3 - yl} amid

Til toluenoppløsningen som fremstilles i det foregående trinn (-1,2 1) ble det satt 200 ml trifluoreddiksyre i løpet av 20 min. ved 20 °C under omrøring. Blandingen ble omrørt ved 20 °C i 2 timer. 1,55 liter vann ble tilsatt og blandingen omrørt i 30 min. ved 20 °C. Etter 30 min. ble blandingen separert i tre sjikt. Bunnsjiktet (-350 ml), en viskøs, brun olje, inneholdt det urene mellomprodukt.

Til en 12 liters kolbe fylt med 2,8 liter MTBE ble den urene, brune olje tilsatt i løpet av 1 time ved 1-2 °C under omrøring. Suspensjonen ble omrørt ved denne temperatur i 1 time og så filtrert. Filtratet ble vasket med 2 x 300 ml MTBE og tørket under vakuum ved romtemperatur i 4 dager for å gi trifluoracetatsaltet av tittelmellomproduktet

(163,3 g) som et blekt gult pulver.

c. Fremstilling av A^- metyl- A^(. SV2- oksiran- 2- vlmetvllmetansulfonamid

En 12 liters kolbe ble fylt med Hiter vann fulgt av tilsetning av 50 % NaOH i vann (146,81 g, 1,835 mol). Begerglasset inneholdende NaOH ble vasket med 2 x 500 ml vann og vaskevæskene satt til kolben. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 10 min. og avkjølt til - 8 °C. (iV-metyl)metansulfonamid (200,2 g, 1,835 mol) i 500 ml vann ble tilsatt over 5 min. Blandingen ble omrørt i 1 time ved rundt 4 °C hvoretter (5)-2-klormetyloksiran (339,6 g, 3,67 mol) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 20 timer ved 3-4 °C. 2 liter diklormetan ble tilsatt og blandingen omrørt i 30 min. ved 5-10 °C. De to sjikt ble tillatt separering i løpet av 10 min. og samlet. Det organiske sjikt på rundt 2,5 liter ble brakt tilbake til 12 liters kolben og vasket med 800 ml 1 M H3P04og 800 ml brine. Diklormetan ble fjernet ved rotasjonsfordamping. Til det urene produkt ble det satt 400 ml toluen og det hele fjernet ved rotasjonsfordamping. Etter tre ytterligere cykler av toluenprosessen ble tittelmellomproduktet i en mengde av 228,2 g oppnådd og dette ble benyttet uten ytterligere rensing i det neste trinn.

d. Syntese av l- isopropvl- 2- okso- l, 2- dihvdrokinolin- 3- karboksylsyre {( l^ S^ S^- S-[( i?)- 2- hvdroksv- 3-( metansulfonvl- metvl- amino) propyll- 8- aza- bicvklo[ 3. 2. 11okt- 3-yllamid

I en 3 liters kolbe ble l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(l^S^S^-S-azabicyklotS^.llokt-S-yllamidtrifluoracetat (105,0 g, 0,232 mol) suspendert i 400 ml absolutt etanol. Til denne suspensjon ble det satt 50 %

NaOH i vann (0,243 mol. 1,05 ekv.), oppløst i 100 ml absolutt etanol, ved romtemperatur. Begeret inneholdende NaOH ble vasket med 2 x 50 ml etanol og vaskevæskene satt til reaksjonsblandingen. Etter 30 min. omrøring ble en oppløsning av iV-metyl-Af-[(S)-2-oksiran-2-ylmetyl]metansulfonamid (62,0 g, 1,5 ekv.) i 100 ml absolutt etanol, tilsatt. Blandingen ble brakt til tilbakeløp i 2 timer, avkjølt til romtemperatur og ympekrystaller av tittelforbindelsen tilsatt. Etter rundt 2 min. omrøring ble det dannet et hvitt faststoff. Blandingen ble avkjølt til 3 til 5 °C og omrørt i 2 timer. Det hvite faststoff ble filtrert og den våte filterkake vasket med 3 x 50 ml kald absolutt etanol. Faststoffet ble tørket under vakuum ved 30 °C i 60 timer for å gi tittelforbindelsen i en mengde av 93,8 g der vanninnholdet, bestemt ved Karl Fischer, var 2,03 %.

<*>H NMR (CDC13) 6 ppm 10,52 (d, 1H), 8,83 (s, 1H), 7,75 (d, 2H), 7,64-7,60 (m, 2H), 7,28-7,26 m, 1H), 4,33-4,26 (m, 2H), 3,78-3,75 (m, 1H), 3,27-3,20 (m, 4H), 3,01 (s, 3H), 2,88 (s, 3H), 2,58-2,53 (m, 1H), 2,30-l,81(m, 11H), 1,68 (d, 6H).

Ympekrystallene ble oppnådd fra et tidligere preparat av tittelforbindelsen ved metoden ifølge dette eksempel i en mindre målestokk der krystallisering inntrådte spontant.

Eksempel 25: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)- 8- [(if)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo [3.2.1] okt-3-yl} amidhydroklorid

I en 1 liters kolbe ble l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (34,7 g, 0,069 mol) suspendert i 210 ml absolutt etanol. 1,1 ekv. konsentrert HC1 ble tilsatt ved romtemperatur under omrøring. Blandingen ble brakt til tilbakeløp i 30 min. og så avkjølt til romtemperatur og omrørt i 2 timer. Faststoffet ble filtrert og den våte kake vasket med 3 x 50 ml absolutt etanol. Faststoffet ble tørket under vakuum ved 30 °C i 48 timer for å gi tittelforbindelsen (34,5 g, 93,7 % utbytte, vanninnhold ved Karl Fischer metoden 0,13 %).

Eksempel 26: Syntese av sitronsyresalt l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15,3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)-propyl]-8-aza-bicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(l£,3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-aza-bicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (0,1 g,

0,2 mmol) ble suspendert i 1 ml etanol. Til denne suspensjon ble det satt en IM oppløsning av sitronsyre i etanol (0,072 ml, 0,072 mmol, 0,33 ekv.). Blandingen ble sonikert kort inntil den var klar, lukket og så satt hen over natten. Lokket ble så fjernet og blandingen tillatt fordamping under omgivelsesbetingelser inntil det ble observert faststoffer. Blandingen ble så lukket igjen og satt hen i 72 timer. Det resulterende faststoff ble filtrert og vasket med kald etanol for å gi tittelforbindelsen som 74,3 mg.

Eksempel 27: Syntese av syresalter av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15,3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-aza-bicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

Ved å følge prosedyren i eksempel 26 ble syresaltene av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15,3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-aza-bicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid som angitt nedenfor i tabell HI, fremstilt i fast form ved bruk av de antydede ekvivalenter av syre.

Eksempel 28: Syntese av metansulfonsyresalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(lÆ,3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-aza-bicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

Til en oppløsning av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15,3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-aza-bicyklo-[3.2.1]okt-3-yl}amid (0,1 g, 0,2 mmol) i 1 ml 50 % acetonitril/vann ble det satt en IM oppløsning av metansulfonsyre i etanol (0,2 ml, 0,2 mmol, lekv.). Blandingen ble så frosset og lyofilisert til tørr tilstand over natten. Det resulterende faststoff ble oppløst i lml isopropanol under forsiktig oppvarming og så tillatt avkjøling. Det resulterende faststoff ble samlet ved filtrering og vasket med kald isopropanol for å gi tittelforbindelsen som 90 mg faststoff.

Eksempel 29: Syntese av syresalter av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15,3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)-propyl]-8-aza-bicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

Ved å følge prosedyren i eksempel 28 ble syresaltene av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15,3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-aza-bicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid som angitt nedenfor i tabell IV, fremstilt i fast form ved å bruke de antydede ekvivalenter syre.

Analyse 1: Radioligandbindingsanalyse på 5-HT4(c) humanreceptorer

a. Membranfremstilling 5- HT4fC>

HEK-293 (human embryonisk nyre) celler som stabilt er transfektert med human 5-HT4(C) receptor cDNA (Bmax =~6,0 pmol/mg protein, bestemt ved [ H]-GR113808 membranradioligandbindingsanalyse) ble dyrket i T-225 kolber i Dulbeccos modifiserte eagles medium (DMEM) inneholdende 4 500 mg/l D-glukose og pyridoksinhydro- klorid (GIBCO-Invitrogen Corp., Carlsbad CA: kat #11965), supplert med 10 % føtal bovinserum (FBS) (GIBCO-Invitrogen Corp.: kat #10437), 2 mM L-glutamin og (100 enheter) penicillin-(100 ug) streptomycin/ml (GIBCO-Invitrogen Corp.: kat. #15140) i en 5 % C02, fuktet inkubator ved 37 °C. Celler ble dyrket under kontinuerlig seleksjonstrykk ved tilsetning av 800 ug/ml geneticin (GIBCO-Invitrogen Corp.: kat. #10131) til mediet.

Celler ble dyrket til grovt 60-80 % konfluens (< 35 subkulturpassasjer). 20-22 timer før høstning ble cellene vasket to ganger og matet med serumfri DMEM. Alle trinn i membranfremstillingen ble gjennomført på is. Cellemonosjiktet ble løftet ved forsiktig mekanisk agitering og triturering med en 25 ml pipett. Celler ble samlet ved sentrifugering ved 1 000 omdreininger per min. i 5 min.

For membranpreparering ble cellepellets resuspendert i iskald 50 mM 4-(2-hydroksy-etyl)-l-piperazinetansulfonsyre (HEPES), pH 7,4 (membranfremstillingsbuffer)

(40 ml/totalt celleutbytte fra 30-40 T225 kolber) og homogenisert ved bruk av en polytron disrupter (med innstillingen 19, 2 x 10 s.) på is. De resulterende homogenater ble sentrifugert ved 1 200 g i 5 min. ved 4 °C. Pelleten ble kassert og supernatanten sentrifugert i 20 min. ved 40 000 g. Pelleten ble vasket en gang ved resuspendering med membranprepareringsbuffer og sentrifugert i 20 min. ved 40 000 g. Sluttpelleten ble resuspendert i 50 mM HEPES, pH 7,4 (analysebuffer) (ekvivalent 1 T225 kolbe/l ml). Proteinkonsentrasjonen for membransuspensjonen ble bestemt ved metoden i henhold til Bradford (Bradford, 1976). Membraner ble lagret frosset i alikvoter ved -80 °C.

b. Radioligandbindingsanalvser

Radioligandbindingsanalyser ble gjennomført i 1,1 ml 96-dypbrønn polypropylenanalyseplater (Axygen) i et totalt analysevolum på 400 ul inneholdende 2 ug membranprotein i 50 mM HEPES pH 7,4, inneholdende 0,025 % bovinserumalbumin (BSA). Metningsbindingsstudier for bestemmelse av Ka verdiene for radioliganden ble gjennomført ved bruk av [<3>H]-GR113808 (Amersham Inc., Bucks, UK: kat. #TRK944; spesifikk aktivitet~82 Ci/mmol) ved 8-12 forskjellige konsentrasjoner i området 0,001 nM - 5,0 nM. Fortrengningsanalyser for bestemmelse av pK; verdier for forbindelser ble gjennomført med [ H]-GR113808 ved 0,15 nM og elleve forskjellige konsentrasjoner av forbindelser i området fra 10 pM - 100 uM.

Testforbindelser ble mottatt som 10 mM forrådsoppløsninger i DMSO og fortynnet til 400 uM i 50 mM HEPES, pH 7,4 ved 25 °C inneholdende 0,1 % BSA, og seriefortynninger (1:5) ble så foretatt i samme buffer. Ikke-spesifikk binding ble bestemt i nærvær av 1 uM ikke-merket GR113808. Analyser ble inkubert i 60 min. ved romtemperatur og deretter ble bindingsreaksjonene avsluttet ved hurtig filtrering over 96-brønner GF/B glass fiberfilterplater (Packard BioScience Co., Meriden, CT) som på forhånd var bløtgjort i 0,3 % polyetylenimin. Filterplatene ble vasket tre ganger med filtreringsbuffer (iskald 50 mM HEPES, pH 7,4) for å fjerne ikke-bundet radioaktivitet. Platene ble tørket, 35 ul Microscint-20 væskescintillasjonsfluid (Packard BioScience Co., Meriden, CT) ble satt til hver brønn og platene talt i en Packard Topcount væskescintillasjonsteller (Packard BioScience Co., Meriden, CT).

Bindingsdata ble analysert ved ikke-lineære regresjonsanalyser med GraphPad Prism Software pakken (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) ved bruk av 3-parameter modellen for en-sete konkurranse. BUNNEN (kurveminimum) ble fiksert til verdien for ikke-spesifikk binding, bestemt i nærvær av 1 uM GR113808. K; verdier for testforbindelsene ble beregnet, i Prism, fra de best tilpassede IC50verdier, og K4verdien av radioliganden, ved bruk av Cheng-Prusoff likningen (Cheng and Prusoff, Biochemical Pharmacology, 1973, 22, 3099-108): K; = IC50/ (1 + [L]/Ka ) der [L] = konsentrasjonen [ H]-GR113808. Resultatene er uttrykkt som den negative, dekadiske logaritme av K; verdienes pK;.

Testforbindelser med høyere pK; verdi i denne analyse har en høyere bindingsaffinitet for 5-HT4receptoren. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen som ble testet i denne analyse hadde en pK; verdi i området rundt 6,3 til rundt 9,0 og karakteristisk i området 6,5 til rundt 8,5.

Analyse 2: Radioligandbindingsanalyse på 5-HT3Ahumanreceptorer: bestemmelse av receptorsubtypeselektivitet

a. Membranfremstilling 5- HT^ a

HEK-293 (human embryonisk nyre) celler som stabilt er transfektert med human 5-HTjareceptor cDNA ble oppnådd fra Dr. Michael Bruess (University of Bonn, GDR)

(Bmax =~9,0 pmol/mg protein, som bestemt ved [ H]-GR65630 membranradioligandbindingsanalyse). Celler ble dyrket i T-225 kolber eller cellefabrikker i 50 % Dulbeccos modifiserte eagles medium (DMEM) (GIBCO-Invitrogen Corp., Carlsbad,

CA: kat. #11965) og 50 % Ham<*>s F12 (GIBCO-Invitrogen Corp.: kat. #11765) supplert med 10% varmeinaktivert føtalbovinserum (FBS) (Hyclone, Logan, UT: kat. #SH30070.03) og (50 enheter) penicillin-(50 ug) streptomycin/ml (GIBCO-Invitrogen Corp.: kat. #15140) i en 5 % C02, fuktet inkubator ved 37 °C.

Celler ble dyrket til grovt 70-80 % konfluens (< 35 subkultupassasjer). Alle trinn i membranfremstillingen ble gjennomført på is. For å høste cellene ble media aspirert og cellene skylt med Ca , Mg -fritt Dulbeccos fosfatbuffrede saltoppløsning (dPBS). Cellemonosjikt ble løftet ved forsiktig mekanisk agitering. Cellene ble samlet ved sentrifugering ved 1 000 omdreininger per min. i 5 min. Etterfølgende trinn av membranfremstillingen fulgte protokollen som beskrevet ovenfor for membraner som uttrykker 5-HT4(c) receptorer.

b. Radioligandbindingsanalyser

Radioligandbindingsanalyser ble gjennomført i 96-brønners polypropylenanalyseplater i et totalt analysevolum på 200 ul inneholdende 1,5-2 ug membranprotein i 50 mM HEPES pH 7,4, inneholdende 0,025 % BSA analysebuffer. Metningsbindingsstudier for bestemmelse av Ka verdier av radioliganden ble gjennomført ved bruk av [<3>H]-GR65630 (PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA: kat. #NET1011, spesifikk aktivitet -85 Ci/mmol) ved tolv forskjellige konsentrasjoner i området 0,005 nM til 20 nM. Fortrengningsanalyser for bestemmelse av pK; verdiene av forbindelser ble gjennomført med [ HJ-GR65630 ved 0,50 nM og elleve forskjellige konsentrasjoner av forbindelser i området 10 pM til 100 uM. Forbindelser ble mottatt som 10 mM forråds-oppløsninger i DMSO (se del 3.1), fortynnet til 400 uM i 50 mM HEPES pH 7,4 ved 25 °C, inneholdende 0,1 % BSA hvoretter serie (1:5) fortynninger ble foretatt i den samme buffer. Ikke-spesifikk binding ble bestemt i nærvær av 10 uM ikke-merket MDL72222. Analyser ble inkubert i 60 min. ved romtemperatur hvoretter bindings-reaksj onene ble avsluttet ved hurtig filtrering over 96-brønners GF/B glassfiberfilter-plater (Packard BioScience Co., Meriden, CT) som på forhånd var bløtgjort i 0,3 % polyetylenimin. Filterplatene ble vasket tre ganger med filtreringsbuffer (iskald 50 mM HEPES, pH 7,4) for å fjerne ikke-bundet radioaktivitet. Platene ble tørket, 35 ul Microscint-20 væskescintillasjonsfluid (Packard BioScience Co., Meriden, CT) ble satt til hver brønn og platene talt i en Packard Topcount væskescintillasjonsteller (Packard BioScience Co., Meriden, CT).

Bindingsdata ble analysert ved bruk av den ikke-lineære regresjonsprosedyre som er beskrevet ovenfor for å bestemme K; verdier. BUNN (kurveminimum) ble fiksert til verdien for ikke-spesifikk binding som bestemt ved nærværet av 10 uM MDL72222. Mengden [L] i Cheng-Prusoff likningen ble definert som konsentrasjonen [<3>H]-GR65630.

Selektivitet for 5-HT4receptorsubtypen med henblikk på 5-HT3receptorsubtypen ble beregnet som forholdet Ki(5-HT3A):Ki(5-HT4(C)). Forbindelsene ifølge oppfinnelsen som ble testet i denne analyse hadde en 5-HT4:5-HT3receptorsubtypeselektivitet fra rundt 50 til rundt 8 000 og typisk i området rundt 100 til rundt 4 000.

Analyse 3: Helcelle cAMP akkumuleringsflashplateanalyse med HEK-293 celler som uttrykker humane 5-HT4(C) receptorer

I denne analyse ble den funksjonelle potens for en testforbindelse bestemt ved å måle mengden cyklisk AMP som fremstilles når HEK-293 celler som uttrykker 5-HT4receptorer ble brakt i kontakt med forskjellige konsentrasjoner testforbindelse.

a. Cellekultur

HEK-293 (human embryonisk nyre) celler som stabilt er transfektert med klonet human 5-HT4(C) receptor cDNA ble preparert ved å uttrykke receptoren ved to forskjellige densiteter: (1) ved en densitet på rundt 0,5-0,6 pmol/mg protein som bestemt ved å benytte en [ H]-GR113808 membranradioligandbindingsanalyse, og (2) ved en densitet på rundt 6,0 pmol/mg protein. Cellene bel dyrket i T-225 kolber i Dulbeccos modifiserte eagles medium (DMEM) inneholdende 4 500 mg/L D-glukose (GIBCO-Invitrogen Corp.: kat. #11965) supplert med 10 % føtalbovinserum (FBS) (GIBCO-Invitrogen Corp.: kat. #10437) og (100 enheter) penicillin-(100 ug) streptomycin/ml (GIBCO-Invitrogen Corp.: kat. #15140) i en 5 % C02, fuktet inkubator ved 37 °C. Cellene ble dyrket under kontinuerlig seleksjonstrykk ved tilsetning av geneticin (800 ug/ml: GIBCO-Invitrogen Corp.: kat. #10131) til mediet.

b. Cellepreparering

Celler ble dyrket til grovt 60-80 % konfluens. 20-22 timer før analysen ble cellene vasket to ganger og matet med serumfri DMEM inneholdende 4 500 mg/L D-glukose (GIBCO-Invitrogen Corp.: kat. #11965). For å høste cellene ble media aspirert og 10 ml Versene (GIBCO-Invitrogen Corp.: kat. #15040) satt til hver T-225 flaske. Cellene ble inkubert i 5 min. ved romtemperatur og deretter frigjort fra kolben ved mekanisk agitering. Cellesuspensjonen ble overført til et sentrifugerar inneholdende et likt volum forvarmet (37 °C) dPBS og sentrifugert i 5 min. ved 1 000 omdreininger per min. Supernatanten ble kassert og pelleten resuspendert i forvarmet (37 °C) stimuleringsbuffer (10 ml ekvivalent per 2-3 T-225 kolber). Dette tidsrom ble notert og angitt som tid null. Cellene ble talt i en Coulterteller (telling over 8 um, kolbeutbytte var 1-2 x IO<7>celler/kolbe). Celler ble suspendert ved en konsentrasjon på 5 x 105 celler/ml i forvarmet (37 °C) stimuleringsbuffer (tilveiebrakt i flashplatesettet) og preinkubert ved 37 °C i 10 min.

cAMP analyser ble gjennomført i et radioimmunoanalyseformat ved bruk av Flashplate Adenylyl Cyclase Activation Assay System med<125>I-cAMP (SMP004B, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), i henhold til produsentens instruksjoner.

Celler ble dyrket og preparert som beskrevet ovenfor. Sluttcellekonsentrasj onene i analysen var 25 x 10 celler/brønn og sluttanalysevolumet var 100 ul. Testforbindelser ble mottatt som 10 mM forrådsoppløsninger i DMSO, fortynnet til 400 uM i 50 mM HEPES pH 7,4 ved 25 °C, inneholdende 0,1 % BSA, og (1:5) seriefortynninger ble så foretatt i samme buffer. Cykliske AMP akkumuleringsanalyser ble gjennomført med 11 forskjellige konsentrasjoner av forbindelse i området 10 pM til 100 uM (slutt-analysekonsentrasjoner). En 5-HT konsentrasjonsresponskurve (10 pMtil 100 uM) ble inkludert på hver plate. Cellene ble inkubert, under risting, ved 37 °C i 15 min. og reaksjonen avsluttet ved tilsetning av 100 ul iskald detekteringsbuffer (som tilveiebrakt i flashplatesettet) til hver brønn. Platene ble forseglet og inkubert ved 4 °C over natten. Bundet radioaktivitet ble kvantitert ved scintillasjonsproksimitetsspektroskopi ved bruk av Topcount (Packard BioScience Co., Meriden, CT).

Mengden cAMP som ble produsert per ml reaksjon ble ekstrapolert fra cAMP standard-kurven i henhold til instruksjonene i produsentens brukermanual. Data ble analysert ved ikke-lineær regresjonsanalyse med GraphPad Prism Software pakken ved bruk av 3-parametersigmodial dose-responsmodellen (helling avgrenset til enhet). Potensdata er angitt som pECsoverdier, den negative, dekadiske logaritme av EC50verdien, der EC50er den effektive konsentrasjon for en 50 % maksimal respons.

Testforbindelser som viser en høyere pECsoverdi i denne analyse har en høyere potens for agonisering av 5-HT4receptoren. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen som ble testet i denne analyse har for eksempel, i cellelinje (1) en densitet rundt 0,5-0,6 pmol/mg protein, en pECsoverdi fra rundt 7,0 til rundt 9,0 og typisk fra rundt 7,5 til rundt 8,5.

Analyse 4: In vitro spenningsklemmeanalyse for inhibering av kaliumionestrøm i hele celler som uttrykker hERG kardialkaliumkanalen

CHO-K1 celler som stabilt er transfektert med hERG cDNA ble oppnådd fra Gail Robertson ved universitet i Wisconsin. Cellene ble holdt under kryogen lagring inntil bruk. Cellene ble ekspandert og ført I Dulbeccos modifiserte eagles medium/F 12 supplert med 10 % føtalbovinserum og 200 ug/ml geneticin. Cellene ble sådd på poly-D-lysin (100 ug/ml) belagte glassdekkplater i 35 mm2 plater (inneholdende 2 ml medium) ved en densitet som muliggjorde at isolerte celler kunne velges for helcelle-spenningsklemmestudier. Platene ble holdt i en fuktet 5 % CO2omgivelse ved 37 °C.

Ekstracellulær oppløsning ble preparert minst hver 7. dag og lagret ved 4 °C hvis ikke i bruk. Den ekstracellulære oppløsning inneholdt (mM): NaCl (137), KC1 (4), CaCl2(1.8), MgCl2(1), glukose (10), 4-(2-hydroksyetyl)-l-piperazinetansulfonsyre (HEPES) (10), pH 7,4 med NaOH. Den ekstracellulære oppløsning ble, i fravær eller nærvær av testforbindelse, holdt i reservoarer hvorfra den strømmet inn i registreringskammeret i en mengde på rundt 0,5 ml/min. Den intracellulære oppløsning ble preparert, alikvotert og lagret ved -20 °C inntil bruksdagen. Den intracellulære oppløsning inneholdt (mM): KC1 (130), MgCl2(1), etylenglykol-bis(p-aminoetyleter) ATATA^jV-tetraeddiksyresalt (EGTA) (5), MgATP (5), 4-(2-hydroksyetyl)-l-piperazinetansulfonsyre (HEPES) (10), pH 7,2 med KOH. Alle forsøk ble gjennomført ved romtemperatur (20-22 °C).

Dekkplatene på hvilke celler var sådd ble overført til et noteringskammer og perfusert kontinuerlig. Gigaohmforseglinger ble dannet mellom cellen og puteelektroden. Når først en stabil pute var oppnådd begynte noteringen i spenningsklemmemodus med initialholdespenningen ved -80 mV. Etter at en stabil helcellestrøm var oppnådd ble cellene eksponert til testforbindelse. Standardspenningsprotokollene var: trinn fra holdepotensialet på -80 mV til -20 mV i 4,8 s., repolarisering til -50 mV i 5 s. og så retur til opprinnelig holdepotensiale (- 80 mV). Denne spenningsprotokoll ble gjennomført en gang hver 15 s. (0,067 Hz). Toppstrømamplituder under repolariseringsfasen ble bestemt ved bruk av pClamp program. Testforbindelsene i en konsentrasjon på 3 uM ble perfusert over cellene i 5 min. fulgt av en 5 min. vaskeperiode i fravær av forbindelse. Til slutt ble en positiv kontroll (cisaprid, 20 nM) satt til perfusatet for å teste cellefunksjonen. Trinnet fra -80 mV til +20 mV aktiverer hERG kanalen og resulterer i en utoverstrøm. Trinnet tilbake til -50 mV resulterer i en utadrettet halestrøm når kanalen henter seg igjen fra inaktivering og deaktiveres.

Toppstrømamplituder under repolariseringsfasen ble bestemt ved bruk av pCLAMP program. Kontrollen og testartikkeldata ble eksportert til Origin® (OriginLab Corp., Northampton MA) der de individuelle strømamplituder ble normalisert til initialstrøm-amplituden i fravær av forbindelse. Det normaliserte strømmiddel og standardfeil for hver betingelse ble beregnet og plottet versus tidsforløpet for forsøket.

Sammenlikninger ble foretatt mellom observert K<+>strøminhibering etter 5 min. eksponering til enten testgjenstanden eller vehikkelkontroll (vanligvis 0,3 % DMSO). Statistiske sammenlikninger mellom forsøksgrupper ble gjennomført ved bruk av en to-populajsonsuavhengig t-test (Microcal Origin v. 6.0). Differanser ble ansett signifikante ved p < 0,05.

Desto mindre prosentandel inhibering av kaliumionestrømmen er i denne analyse, desto mindre er potensialet for testforbindelsene til å forandre mønsteret for kardial repolarisering ved anvendelse som terapeutiske midler. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen som ble testet i denne analyse viste ved en konsentrasjon på 3 uM en inhibering av kaliumionestrømmen på mindre enn rundt 20 % og karakteristisk mindre enn rundt 15%.

Analyse 5: In vitro modell av oral biotilgjengelighet: Caco-2 permeasjonsanalyse

Caco-2 permeasjonsanalysen ble gjennomført for å modellere evnen hos testforbindelsene til å passere gjennom tarmen og gå inn i blodstrømmen etter oral administrering. Hastigheten ved hvilke testforbindelsene i oppløsning permeerer et cellemonosjikt designert for å minimalisere den tette forbindelsen av human tynntarm-monosjikt, ble bestemt.

Caco-2 (kolon, adenokarsinom; human) celler ble oppnådd fra ATCC (American Type Culture Collection; Rockville, MD). For permeasjonsstudiene ble cellene sådd ut i en densitet på 63 000 celler/cm<2>på forfuktede transbrønnpolykarbonatfiltre (Costar; Cambridge, MA). Et cellemonosjikt ble dannet etter 21 dager i kultur. Etter celle-kulturen i transbrønnplaten ble membranen inneholdende cellemonosjiktet løsgjort fra transbrønnplaten og innført i diffusjonskammeret (Costar; Cambridge, MA). Diffusjonskammeret ble innført i varmeblokken som var utstyrt med sirkulerende eksternt, 37 °C termostatisk regulert vann, for temperaturkontroll. Luftmanifolden avga 95 % 02:5 % CO2til hver halvpart av et diffusjonskammer og dannet et laminert strømningsmønster over cellemonosjiktet som var effektivt med henblikk på å redusere det ikke-berørte grensesjikt.

Permeasjonsstudien ble gjennomført med testforbindelseskonsentrasjoner på 100 uM og med<14>C-mannitol for å følge integriteten av monosjiktet. Alle forsøk ble gjennomført ved 37 °C i 60 min. Prøver ble tatt ved 0, 30, henholdsvis 60 min. både fra donor- og recipientsiden av kammeret. Prøvene ble analysert ved HPLC eller væskescintillasjons-telling for testforbindelser og mannitolkonsentrasjoner. Permeasjonskoeffisienten (Kp) i cm/s., ble beregnet.

I denne analyse anses en Kp verdi større enn rundt 10 x IO"<6>cm/s. som en indikasjon på gunstig biotilgjengelighet. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen som ble testet i denne analyse viste Kp verdier mellom rundt 10 x IO"<6>cm/s. og rundt 50 x IO"<6>cm/s., typisk mellom rundt 20 x IO"<6>cm/s. og rundt 40 x IO"<6>cm/s.

Analyse 6: Farmakokinetisk stadium i rotter

Vandige oppløsningsformuleringer av testforbindelser ble fremstilt i 0,1 % melkesyre ved en pH verdi mellom rundt 5 og rundt 6. Sprague-Dawley hannrotter (stamme CD, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) ble dosert med testforbindelser via intravenøs administrering (IV) i en dose på 2,5 mg/kg eller ved oral tvangsforing (PO) i en dose på 5 mg/kg. Doseringsvolumet var 1 ml/kg for IV- og 2 ml/kg for PO administrering. Serieblodprøver ble samlet fra dyr før dose og ved 2 (kun IV), 5,15, og 30 min. samt 1, 2, 4, 8 og 24 timer etter dosering. Konsentrasjoner av testforbindelser i blodplasma ble bestemt ved væskekromatografi-massespektrometrianalyse (LC-MS/MS) (MDS SCIEX, API 4000, Applied Biosystems, Foster City, CA) med en nedre kvantiteringsgrense på 1 ng/ml.

Standard farmakokinetiske parametere ble bedømt ved ikke-kompartmental analyse (modell 201 for IV og modell 200 for PO) ved bruk av WinNonlin (versjon 4.0.1, Pharsight, Mountain View, CA). Maksimum i kurven av testforbindelses-konsentrasjonen i blodplasma versus tid angis som Cmax. Arealet under konsentrasjon versus tidkurven fra doseringstidspunktet til den sist målbare konsentrasjon (AUC(O-t)) ble beregnet ved den lineære trapezoidregel. Oral biotilgjengelighet (F(%)), det vil si forholdet mellom dose-normalisert forhold av AUC(O-t) for PO administrering til AUC(O-t) for IV administrering, ble beregnet som:

Testforbindelser som viser store verdier for parametrene Cmax, AUC(O-t) og F (%) i denne analyse er ventet å ha stor biotilgjengelighet ved administrering oralt. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen som ble testet ved denne analyse hadde Cmaxverdier som typisk lå fra rundt 0,1 til rundt 0,25 ug/ml og AUC(O-t) verdier som typisk lå fra rundt 0,4 til rundt 0,9 ug-hr/ml. Som eksempel hadde forbindelsen ifølge eksempel 1 en Cmaxverdi på 0,17 ug/ml, en AUC(O-t) verdi på 0,66 ughr/ml og en oral biotilgjengelighet (F(%)) i rottemodellen på rundt 35 %.

Claims

1. Forbindelse,karakterisert vedformel (I):

der: R1 er hydrogen, halo, hydroksy, Ci-4alkyl eller Ci-4alkoksy; R<2>er C3_4alkyl eller C3.6cykloalkyl; R er hydrogen eller Ci^alkyl; R<4>er —S(0)2R<6>eller —C(0)R<7>; R5 er hydrogen, Ci^alkyl, C2-3alkyl substituert med -OH eller Ci^alkoksy, eller —CH2—pyridyl; R<6>er Ci.3alkyl; eller R<5>og R<6>sammen danner C3-4alkylenyl; og R er hydrogen, Ci^alkyl eller pyridyl; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller et solvat eller en stereoisomer derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat R5 er hydrogen, Ci^alkyl, C2-3alkyl substituert med -OH eller Ci^alkoksy, eller CH2—pyridyl; og R<6>er Ci_3alkyl.

3. Forbindelse ifølge krav 2,karakterisert vedat R1 er hydrogen eller halogen.

4. Forbindelse ifølge krav 2,karakterisert vedat R er C3.4alkyl.

5. Forbindelse ifølge krav 2,karakterisert vedat R<4>er —S(0)2R6

6. Forbindelse ifølge krav 5,karakterisert vedat R<4>er —S(0)2CH3.

7. Forbindelse ifølge krav 2,karakterisert vedat R<4>er —C(0)R7

8. Forbindelse ifølge krav 7,karakterisert vedat R er hydrogen eller metyl.

9. Forbindelse ifølge krav 2,karakterisert vedat R5 er hydrogen eller metyl.

10. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat: R<1>er hydrogen; R er C3-4alkyl eller C4-5cykloalkyl; R er hydrogen; R<4>er —S(0)2R<6>eller —C(0)R<7>; R<5>er hydrogen eller Ci^alkyl; R<6>er Cualkyl; og R er hydrogen eller Ci^alkyl.

11. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat den er valgt blant: l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(l^i^Si^-S-^-metoksy-S-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(l^Si^SiJJ-S-tS^metan-sulfonyl-pyridin-3-ylmetyl-amino)-2-metoksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}-amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(l5',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3 -metansulfonylamino)propyl] -8-azabicyklo[3.2.1 ] okt-3 -yl} amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(liS!,3-K,5i2)-8-[3-(nietan-sulfonyl-pyridin-3-ylmetyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}-amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(l^i^Si^-S-^Æ^-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3^,5i?)-8-[(5)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3 -[metyl-(pyridin-4-karbonyl)amino] propyl] -8-azabicyklo[3.2.1 ] okt-3 -yl} amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-[(pyridin-4-karbonyl)amino]propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[3-(acetyl-metyl-amino)-2-metoksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(l^i^Si^-S-^-metoksy-S-[metyl-(pyridin-4-karbonyl)amino]propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid;

1- isopropyl-2-okso-l,2-dihydro-kinolin-3-karboksylsyre {(l«£,3i?,5i?)-8-[3-(acetyl-pyridin-3 -ylmety l-amino)-2-metoksypropyl] - 8-azabicyklo [3.2.1] okt-3 -yl} amid;

1 -isopropyl-2-okso-1,2-dihydro-kinolin-3-karboksylsyre {( IS, 3R, 5R)- S-[3-acetylamino-2- hydroksypropyl] -8-azabicyklo[3.2.1 ] okt-3 -yl} amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydro-kinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[3-(acetyl-metyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid;

1 -isopropyl-2-okso-1,2-dihydro-kinolin-3 -karboksylsyre {(1S,3R,5R)-8-[3-(formyl-metyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid;

1 -isopropyl-2-okso-1,2-dihydro-kinolin-3-karboksylsyre {( IS, 3R, 5R)- S-[3-formyl-amino-2-hydroksypropyl] - 8-azabicyklo [3.2.1] okt-3 -yl} amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydro-kinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[(i?)-3-(acetyl-metyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydro-kinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[(i?)-3-(formyl-metyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; 5-brom-l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)- S-[( R)- 2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-(metansulfonyl-etylamino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1 ]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)-&-[( R)- 2-hydroksy-3-(metansulfonylamino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; og l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3 -(1,1 -diokso-2-isotiazolidinyl)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1 ] okt-3 -yl} amid; og farmasøytisk akseptable salter og solvater og stereoisomerer derav.

12. Forbindelse ifølge krav 2,karakterisert vedat forbindelsen er valgt blant: l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3^,5i?)-8-[2-hydroksy-3-(metansulfonylamino)propyl]-8-aza-bicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(lÆ^i^Si^-S-IXÆ^-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3^,5i?)-8-[(5)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[3-(acetyl-metyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1 ] okt-3 -yl} amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3^,5i?)-8-[3-(formyl-metyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(l«£,3i?,5i?)-8-[(i?)-3-(acetyl-metyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3^,5i?)-8-[(i?)-3-(formyl-metyl-amino)-2-hydroksypropyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolinon-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)- S-[( R)- 2-hydroksy-3-(metansulfonylamino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; og farmasøytisk akseptable salter og solvater og stereoisomerer derav.

13. Forbindelse ifølge krav 12,karakterisert vedat den er valgt blant: l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)- S-[( R)- 2- hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[(5)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid; l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydrokinolin-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)- S-[( R)- 2- hydroksy-3 -(metansulfonylamino)propyl] -8-azabicyklo[3.2.1 ] okt-3 -yl} amid; og farmasøytisk akseptable salter og solvater og stereoisomerer derav.

14. Farmasøytisk preprat,karakterisert vedat det omfatter en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

15. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13 for anvendelse i terapi.

16. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13 for fremstilling av et medikament.

17. Anvendelse ifølge krav 16 der medikamentet er for behandling av en medisinsk tilstand i et pattedyr assosiert med 5-HT4receptoraktivitet.

18. Anvendelse ifølge krav 17 der sykdommen eller tilstanden er en forstyrrelse med redusert motilitet i gastrointestinalkanalen.

19. Anvendelse ifølge krav 18 der forstyrrelsen med redusert motilitet er valgt blant konisk konstipasjon, konstipasjonspredominant irritabelt tarmsyndrom, diabetisk og idiopatisk gastroparese og funksjonell dyspepsi.

20. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13,karakterisert vedat den omfatter: (a) å omsette en forbindelse med formel ( HL) :

med en forbindelse med formel L—R<4>der L er en avspaltbar gruppe, eller L—R<4>betyr HO-C(0)R<7>; eller (b) å omsette en forbindelse med formel (Vni):

med en forbindelse med formel (LX):

for å gi en forbindelse med formel ( I), eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller et solvat eller en stereoisomer derav.

21. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel (!')

der R<1>, R<2>, R<4>og R<5>er som angitt i krav 1, eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat eller en stereoisomer derav,karakterisert vedat den omfatter: å omsette en forbindelse med formel (IV):

eller et salt derav, med en forbindelse med formel (XI):

for å gi en forbindelse med formel (F) eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat eller en stereoisomer derav.

22. Produkt,karakterisert vedat det er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 20 eller 21.

23. Forbindelse,karakterisert vedformel (III):

der: R<1>er hydrogen, halo, hydroksy, Ci^alkyl eller Ci.4alkoksy; R er C3-4alkyl eller C3-6cykloalkyl; R er hydrogen eller Cualkyl; R<4>er —S(0)2R6 eller —C(0)R<7>;og R<5>er hydrogen, Ci^alkyl, C2-3alkyl substituert med -OH eller Ci^alkoksy, eller —CH2—pyridyl; eller et salt eller en stereoisomer eller et beskyttet derivat derav.