NO333937B1

NO333937B1 - Metode for fremstilling av et næringsmiddel, sammensetning og næringsmiddel for behandling eller forebygging av hyperkolesterolemi, samt anvendelse derav.

Info

Publication number: NO333937B1
Application number: NO20044575A
Authority: NO
Inventors: Neal A Bringe; Kanthasamy Karunanandaa
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2002-04-18
Filing date: 2004-10-25
Publication date: 2013-10-28
Also published as: BR0309421A; MXPA04010310A; BRPI0309421B8; US7541329B2; EP1494536A1; NO20044575L; CN102240040B; WO2003088749A1; EP1494536A4; CA2482464A1; BRPI0309421B1; JP5219326B2; CN102240040A; AU2003221982A1; JP2005523007A; BRPI0309421A8; CN1662142A; KR101238752B1; AU2003221982B2; EP1494536B1

Abstract

Preparater og metoder for reduksjon av hyperkolesterolemi og følgelig, risiko for kardiovaskulær sykdom, er tilveiebragt. Slike preparater kan omfatte isolerte oljelegeme- assosierte proteiner. I tillegg tilveiebringes matvarer til hvilke ett eller flere oljelegemeassosierte proteiner er tilsatt. Preparatene anvendt i oppfinnelsen kan videre omfatte additivforbindelser, for eksempel et saponin, et isoflavon, et fosfolipid, et karbohydrat i det vesentlige resistent mot fordøyelse eller en kombinasjon derav. Metodene og preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å senke kolesterol- og andre lipid-nivåer hos individer for å oppnå en reduksjon av risiko for kardiovaskulær sykdom.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår metode for fremstilling av et næringsmiddel, sammensetning og næringsmiddel for behandling eller forebygging av hyperkolesterolemi, samt anvendelse derav. Sammensetningen kan anvendes for reduksjon av kolesterolnivåer og reduksjon av risiko for kardiovaskulær sykdom

Bakgrunn for oppfinnelsen

Kardiovaskulær sykdom er en ledende årsak til sykdom og dødelighet i den humane populasjon. Dette gjelder spesielt USA og vesteuropeiske land. En rekke forårsakende faktorer er implisert i utvikling av kardiovaskulær sykdom. Mange av disse faktorer omfatter arvelig predisponering for sykdommen, livsstilfaktorer så som røking og diett, alder, kjønn, hypertensjon og hyperlipidemi, omfattende hyperkolesterolemi. Flere av disse faktorer, spesielt hyperlipidemi og hyperkolesteremi, bidrar til utvikling av aterosklerose, en primær årsak til kardiovaskulær sykdom.

Høy blodkolesterol-konsentrasjon er én av de vesentlige risikofaktorer for kardiovaskulær sykdom hos mennesker. Forhøyet lav-densitet lipoprotein-kolesterol ("LDL") og total kolesterol er direkte relatert til en øket risiko for koronar hjertesykdom. (Anderson et al, 1987). Selv om høye nivåer av total kolesterol og LDL er risikofaktorer for utvikling av aterosklerose og vaskulære sykdommer, er mangel på høy-densitet lipoprotein-kolesterol ("HDL") nylig erkjent som en ytterligere risikofaktor for å utvikle disse lidelser. Mange kliniske forsøk støtter teorien av en beskyttende rolle for HDL mot aterosklerose. Én slik undersøkelse har demonstrert at hos kvinner reduserer hver 1 mg/dl økning i HDL i blodet, risikoen for koronar vaskulær sykdom med 3% (Gordon et al, 1989).

Undersøkelser har vist at diettære endringer kan redusere kolesterol hos mennesker. Av disse har spesielle undersøkelser vist at kvaliteten, så vel som mengden, av protein inntatt sterkt påvirker serum-kolesterolnivåer. (Carol og Hamilton, 1975; Nagaoka et al, 1992; Potter, 1995). Inntak av vegetabilske proteinmaterialer istedenfor animalsk protein i dietten er forbundet med en lavere risiko for kardiovaskulær sykdom, som kan reflektere reduksjon av serum-kolesterolnivåer. Spesielt soyaprotein, et vegetabilsk protein, er vist å redusere serum-kolesterolnivåer i forhold til det animalske protein kasein (Nagaoka et al, 1999). En nyere meta-analyse av virkningene av soyaprotein-inntak på serum-lipider hos mennesker har vist at diettært soyaprotein er sterkt relatert til nedsettelse av serumkonsentrasjoner av total kolesterol og LDL hos mennesker uten betydelig å påvirke HDL-kolesterol-konsentrasjoner (Anderson et al, 1995).

Ett av agensene ansvarlig for evnen til soyaprotein til å redusere kolesterol er den høymolekylære fraksjon (HMF). HMF utgjør den ufordøyelige del av soyaprotein som forblir intakt etter proteolytisk fordøyelse. Denne fraksjonen er derfor sammensatt av flere forskjellige peptider eller peptidfragmenter. HMF i soyaprotein er faktisk vist tydelig å redusere serum- kolesterol ved både dyre- og menneske-undersøkelser. Det er antatt at den ikke-fordøyelige HMF forhindrer opptaket av kolesterol enten ved å forhindre passivt opptak av kolesterol av "brush border" membran eller ved å forhindre protein-mediert opptak av kolesterol. I motsetning har den lavmolekylære fraksjon, en fordøyelig fraksjon av soyaprotein, faktisk vært vist å øke serum-kolesterol (Sugano, et al, 1988).

WO 01/22830 Al beskriver en metode for å fremstille et næringsmiddel ved å blande et isolert oljelegeme-assosiert protein med melk.

WO 00/19839 A2 beskriver en soyasammensetning omfattende beta-conglycinin og glycinin.

WO 00/30663 Al beskriver en sammensetning omfattende en soyaproteinkilde, valgt fra isolert soyaprotein, minst et fytoøstrogen og diettfiber.

JP 516828 A beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av vermicelli-liknende mat.

EP 1046396 A2 beskriver en sammensetning omfattende et soyaproteinmateriale og en plante sterol.

GB 1533084 A beskriver en eggeplommeerstatning omfattende soyaprotein, soyabønneolje, et lecitinkonsentrat og et løselig karbohydrat og fremstilling derav.

Til tross for den potensielle terapeutiske verdi av soyaprotein og spesielt HMF, som et kolesterol-nedsettende middel, er de spesifikke bestanddeler ansvarlige for dens ikke-fordøyelsesfremmende og hypokolesterolemiske aktivitet ikke bestemt. Det er derfor et behov å identifisere disse aktive bestanddeler i en anstrengelse for å tilveiebringe et terapeutisk middel som er kraftigere for reduksjon av kolesterol og andre risikofaktorer forbundet med kardiovaskulær sykdom.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen metode for fremstilling av et næringsmiddel,karakterisert vedat den omfatter trinnene:

(a) å oppnå et valgt næringsmiddel; og

(b) tilsette oleosin og fosfolipid til næringsmiddelet, hvori oleosinet blir tilsatt til en sluttkonsentrasjon på omtrent 5% eller mer i vekt, og hvor fosfolipidet omfatter en mengde ikke mindre enn 2 vekt-%; og hvor konsumet av en effektiv mengde av næringsmiddelet reduserer serum-kolesterolet til et individ med behov for dette. I visse utførelsesformer omfatter metoden videre tilsetning av minst én forbindelse valgt fra gruppen bestående av et saponin, et fytoøstrogen, et fosfolipid og et karbohydrat hovedsakelig resistent mot fordøyelse. Det oljelegeme-assosierte protein kan omfatte lipoproteiner og/eller oleosin. I én utførelsesform er næringsmidlet soya-basert. Preparatet kan mangle eller omfatte oljelegeme- assosiert protein før tilsetningstrinnet. Eksempler på matvarer omfatter soyamel, soyakorn, grovt soyamel, soyaflak, soyamelkepulver, soyaprotein-konsentrat, soyaprotein-isolat og isolert soya-polypeptid. I visse utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse omfatter metoden at (i) soyaprotein-isolatet er en høymolekylvektfraksjon av et soyamateriale behandlet med en protease; eller (ii) det isolerte soyapolypeptidet omfatter P-konglycinin, eller et fragment derav;

eller

(iii) det isolerte soyapolypeptidet er glycinin, eller et fragment derav.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen sammensetning for behandling eller forebygging av hyperkolesterolemi,

kjennetegnet ved at den omfatter:

(a) glycinin og/eller P-konglycinin, eller fragmenter derav;

(b) oleosin; og

(c) fosfolipid,

hvor oleosin er tilstede i en mengde på omtrent 5% eller mer i vekt, idet fosfolipidet er tilstede i en mengde som ikke er mindre enn 2 vekt-% og hvor glycinin og/eller P-konglycinin er tilstede i en mengde som er effektiv for å tilveiebringe en

synergistisk effekt for behandling eller forebygging av hyperkolesterolemi i et individ som trenger dette.

I én utførelsesform er sammensetningen kjennetegnet ved at

(i) glycinin eller P-konglycinin er minst delvis hydrolysert ved et enzym eller en blanding av enzymer; eller (ii) definert å omfatte glycinin, eller fragmenter derav, og renset oleosin; eller (iii) definert å omfatte P-konglycinin, eller fragmenter derav og renset oleosin; eller

(iv) hvor sammensetningen omfatter mer enn omtrent 10% oleosin; eller

(v) hvor sammensetningen omfatter omtrent 30% til omtrent 50% oleosin.

En sammensetning tilveiebragt ved oppfinnelsen kan videre omfatte minst én additiv forbindelse, omfattende et saponin, et fytoøstrogen, et fosfolipid og et karbohydrat hovedsakelig resistent mot fordøyelse. Et eksempel på fytoøstrogen omfatter isoflavon. Eksempler på isoflavoner omfatter genistein, diadzein, equol, biochanin A, formononetin og deres respektive naturlig forekommende glukosider og glukosid-konjugater. Eksempler på karbohydrat omfatter høy-amylose stivelse, oligofruktose og soya-kimblad-fiber. Fosfolipidet kan velges fra gruppen bestående av lecitin, lyso-lecitin og lecitin med en modifisert fettsyre-sammensetning. I ytterligere utførelsesformer er sammensetningen kjennetegnet ved at

(i) karbohydratet er valgt fra høy amylasestivelse, oligofruktose og soyakotyledonfiber; eller (ii) fosfolipidene er valgt fra lecitin, lyso-lecitin og lecitin med en modifisert fettsyresammensetning; eller (iii) saponin er valgt fra et soyasaponin A, saponin B, saponin E, sapogenol A, sapogenol B og sapogenol E.

I ytterligere utførelsesformer er sammensetningen kjennetegnet ved at oleosinet omfatter lipoprotein, fortrinnsvis er lipoproteinet et pattedyrlipoprotein, eggeplommelipoprotein eller fettglobulmembran protein.

I ytterligere utførelsesformer er sammensetningen kjennetegnet ved at

oleosinet er lav-molekylvektfraksjonen av oleosin.

I ytterligere utførelsesformer er sammensetningen kjennetegnet ved at glycinin er den basiske subenheten av glycinin, fortrinnsvis er den basiske subenheten av glycinin B-lb subenheten.

I ytterligere utførelsesformer er sammensetningen kjennetegnet ved at P-conglycininet er a' subenheten eller et fragment derav.

I ytterligere utførelsesformer er sammensetningen kjennetegnet ved at den er videre definert

(i) å omfatte mer enn 40% p-konglycinin eller et fragment derav; eller

(ii) å omfatte en eller flere polypeptidsekvenser valgt fra gruppen bestående av

SEKV ID NR:1, SEKV ID NR: 2, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 4, SEKV ID NR: 5,

SEKV ID NR: 6, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 10 og SEKV ID NR: 11.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen næringsmiddel egnet for behandling eller forebygging av hyperkolesterolemi, og kan oppnås ved tilsetning av oleosin og et fosfolipid til et valgt næringsmiddel, idet oleosinet blir tilsatt til en endelig konsentrasjon på omtrent 5% eller mer i vekt, og hvor fosfolipidet er omfattet i en mengde ikke mindre enn 2 vekt-%.

I ytterligere utførelsesformer er næringsmidlet kjennetegnet ved at minst en ytterligere forbindelse er valgt fra et saponin, et fytoøstrogen og et karbohydrat vesentlig resistent overfor fordøying blir tilsatt.

I ytterligere utførelsesformer er næringsmidlet kjennetegnet ved at

(i) næringsmiddelet er soya-basert; eller

(ii) næringsmiddelet mangler oleosin før tilsetningstrinnet.

I ytterligere utførelsesformer er næringsmidlet kjennetegnet ved at det omfatter oleosin før trinnet med tilsetning, fortrinnsvis er næringsmiddelet valgt fra soyamel, soyakorn, grovt soyamel, soyaflak, soyamelkepulver, soyaprotein-konsentrat, soyaprotein-isolat og isolert soyapeptid.

I ytterligere utførelsesformer er næringsmidlet kjennetegnet ved at

(i) soyaproteinisolatet er høymolekylvekt fraksjonen av et soyamateriale behandlet med en protease; eller (ii) det isolerte soyapolypeptidet omfatter P-konglycinin, eller fragment derav; eller (iii) det isolerte soyapolypeptidet er glycinin, eller et fragment derav.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse av en sammensetning som omfatter oleosin og fosfolipid i en mengde på omtrent 5% eller mer i vekt og ikke mer enn 2 vekt-% for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av hyperkolesterolemi eller en kardiovaskulær sykdom.

I ytterligere utførelsesformer omfatter anvendelsen at medikamentet er i form av en pille eller kapsel, eller er et næringsmiddelsupplement.

I ytterligere utførelsesformer omfatter anvendelsen at den kardiovaskulære sykdommen blir forebygget ved redusering av konsentrasjonen av totalt serumkolesterol, fortrinnsvis blir serumkolesterolkonsentrasjonen redusert ved redusering av konsentrasjonen av lav tetthet lipoprotein, eller ved å øke konsentrasjonen av høy tetthet lipoprotein.

I ytterligere utførelsesformer omfatter anvendelsen at den kardiovaskulære sykdommen (i) blir forebygget ved redusering av konsentrasjonen av serum triglycerider; eller (ii) blir behandlet ved redusering av konsentrasjonen av leverkolesterol.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan anvendes for behandling eller forebygging av hyperkolesterolemi ved administrering av et farmasøytisk preparat omfattende en terapeutisk effektiv mengde av renset oljelegeme-assosiert protein til et individ med behov for dette. Det farmasøytiske preparatet kan administreres på hvilken som helst måte, omfattende som pille eller kapsel eller som et ernærings-supplement. Den kardiovaskulære sykdom kan forhindres ved å redusere konsentrasjonen av total serum- og/eller lever-kolesterol eller triglycerider. Serum-kolesterolkonsentrasjonen kan nedsettes ved å redusere konsentrasjonen av lav-densitet lipoprotein og øke konsentrasjonen av høy densitet-lipoprotein og .

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Disse og andre trekk, aspekter og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil bli bedre forstått i lys av den følgende beskrivelse, de følgende krav og ledsagende figurer hvor:

FIG. 1 viser sekvensen av oleosin-protein P24 Oleosin Isoform A (P89) fra soya, Aksesjonsnummer P29530 og svarer til SEKV ID NR: 12. FIG. 2 viser sekvensen av oleosin-protein P24 Oleosin Isoform B (P91) fra soya, Aksesjonsnummer P29531 og svarer til SEKV ID NR: 13. FIG. 3 viser aminosyresekvensen av det oljelegeme-assosierte protein 17 kDa oleosin (oleol7) fra mais { Zea mays) (Aksesjonsnummer AAA68066) og svarer til SEKV ID NR: 14. FIG. 4 viser aminosyresekvensen av det oljelegeme-assosierte protein 16 kDa oleosin (oleol6) fra mais { Zea mays) (Aksesjonsnummer AAA68065 og svarer til SEKV ID NR: 15. FIG. 5 viser aminosyresekvensen av oleosin KD18 (KD18; L2) fra mais { Zea mays) (Aksesjonsnummer AAA67699) og svarer til SEKV ID NR: 16. FIG. 6 viser aminosyresekvensen av H. annuus (solsikke) oleosin (Aksesjonsnummer CAA55348) og svarer til SEKV ID NR: 17. FIG. 7 viser fem polypeptid-inneholdende bånd i en gel som ble separert ved polyakrylimid-gelelektroforese av HMF fra soyaprotein-isolatet betegnet OBAP(+). FIG. 8 viser oljelegeme-assosierte proteiner (P34 og oleosiner) renset og separert på en polyakrylimidgel. FIG. 9 viser en gel inneholdende HMF fra pepsin-fordøyet soyaprotein-isolat produsert fra soyabønner som mangler Gl glycininer. FIG. 10 viser en kurve som illustrerer doseavhengig hemning av kolesterol-opptak av Caco-2 celler av isolert HMF fra OBAP(+) versus OBAP(-) soyaprotein-isolat. FIG. 11 viser kurver som illustrerer forskjellen mellom kolesterolabsorpsjonen i nærvær av sitostanol versus kolesterolabsorpsjon i nærvær av glycinin-null og a/a' P-conglycinin-null HMF, som derved demonstrerer forskjellen i mekanismer. FIG. 12 viser en gel som illustrerer tilstedeværelse av oleosin i hver av prøvene. FIG. 13 viser en gel som illustrerer nærvær eller fravær av oleosin i de angitte prøver.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen overkommer begrensningene ved tidligere teknikk ved å identifisere sammensetninger med kardiovaskulære helsegevinster. Spesielt angår ett aspekt av foreliggende oppfinnelse oppdagelsen at oljelegeme-assosierte proteiner har evnen til å nedsette kolesterolnivåer. Mens plantekomponenter, så som soyaprotein, er kjent å ha hypokolesterolemisk aktivitet, er de spesielle bestanddeler ansvarlige for denne aktivitet ikke tidligerekarakterisert. Foreliggende oppfinnelse angår derfor oppdagelsen av evnen til oljelegeme-assosierte proteiner, omfattende oleosiner og eggeplomme- lipoproteiner, til å gi planteproteiner en karakteristisk evne til å redusere kolesterol. Likeledes omfatter foreliggende oppfinnelse den synergistiske kombinasjon av disse spesielle komponenter med plantemateriale så som soya-matvarer. Uten å være bundet til noen spesiell teori er det antatt at de oljelegeme-assosierte proteiner forhindrer fordøyelse av bioaktive peptider til stede i soyamateriale og derved synergistisk forsterker den hypokolesterolemiske aktivitet til preparatet. I tillegg angår foreliggende oppfinnelse den synergistiske kombinasjon av komponenter i kombinasjon med soya-materiale og en additiv komponent valgt fra gruppen bestående av et saponin, et fytoøstrogen, et fosfolipid og et karbohydrat hovedsakelig resistent mot fordøyelse eller hvilken som helst kombinasjon derav, for ytterligere å forbedre den hypokolesterolemiske aktivitet til kombinasjonen. Det er videre beskrevet den terapeutiske anvendelsen av disse peptider, enten alene eller i kombinasjon med andre forbindelser, for å senke total kolesterol-konsentrasjon i blodet og spesielt for å redusere LDL-kolesterol-konsentrasjon, for å hemme utvikling av kardiovaskulær sykdom.

Oljelegemer er små, sfæriske, subcellulære organeller som innkapsler lagrede triacylglycerider, en energireserve anvendt av mange planter. Selv om funnet i de fleste planter og i forskjellige vev, er de spesielt rikelige i frøene til oljefrø, hvor de vanligvis har en størrelse fra under én mikron til noen få mikron i diameter. Oljelegemer omfatter typisk triacylglycerider og er omgitt av lipoproteiner og proteiner. Et "oljelegeme-assosiert protein" omfatter hvilke som helst og alle disse proteiner og lipoproteiner som er fysisk forbundet med oljelegemer. I planter er de viktigste oljelegeme-assosierte proteiner oleosiner. Oleosiner er klonet og sekvensert fra mange plantekilder omfattende mais, rapsfrø, gulrot og bomull. Oleosiner fra forskjellige arter er typisk meget konserverte.

I. Forkortelser og definisjoner

For å lette forståelse av foreliggende oppfinnelse er flere betegnelser og forkortelser som anvendt her, definert nedenfor:

HMF=høymolekylær fraksjon

Som anvendt her angir "høymolekylær fraksjon" fraksjonen av planteprotein-isolat som blir igjen etter hydrolytisk eller kjemisk fordøyelse av isolatet som kan separeres ved sentrifugering ved 4,000 til 10,000 x g i 15 til 20 min ved pH 6-7.

Som anvendt her refererer "additiv forbindelse" kollektivt til en enkel forbindelse eller en gruppe forbindelser satt til preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse forbindelser er valgt fra gruppen bestående av saponin, fytoøstrogen, fosfolipid og karbohydrat.

Som anvendt her blir betegnelsen "aminosyre" anvendt i dens bredeste forstand og omfatter naturlig forekommende aminosyrer så vel som ikke-naturlig forekommende aminosyrer, omfattende aminosyre-analoger og -derivater. De sistnevnte omfatter molekyler inneholdende en aminosyregruppe. Fagfolk på området vil forstå, i betraktning av denne brede definisjon, at referanse her til en aminosyre omfatter for eksempel naturlig forekommende proteogene L-aminosyrer; D-aminosyrer; kjemisk modifiserte aminosyrer så som aminosyre-analoger og -derivater; naturlig forekommende ikke-proteogene aminosyrer så som norleucin, (P-alanin, ornitin, etc.; og kjemisk syntetiserte forbindelser som har egenskaper kjent på området å være karakteristiske for aminosyrer.

Som anvendt her angir betegnelsen "proteogen" at aminosyren kan innføres i et peptid, polypeptid eller protein i en celle gjennom en metabolsk bane.

Som anvendt her omfatter betegnelsen "farmasøytisk akseptable salter" salter vanlig anvendt for å danne alkalimetallsalter og addisjonssalter av frie syrer eller frie baser. Typen av saltet er ikke kritisk, forutsatt at det er farmasøytisk akseptabelt.

Som anvendt her betyr "sekresjonssekvens" eller "signalpeptid" eller "signalsekvens" en sekvens som styrer nysyntetiserte sekretoriske eller membran-proteiner til og gjennom membraner i endoplasmatisk reticulum eller fra cytoplasmaet til periplasma gjennom den indre membran til bakterier eller fra matriksen av mitokondrier til det indre rom eller fra stroma av kloroplaster til thylakoid. Fusjon av en slik sekvens til et gen som skal uttrykkes i en heterolog vert sikrer sekresjon av det rekombinante proteinet fra vertscellen.

Som anvendt her blir "polypeptid" og "oligopeptid" anvendt om hverandre og betyr en polymer av minst 2 aminosyrer bundet sammen av peptidbindinger.

Som anvendt her betyr "sekvens" den lineære rekken hvor monomerer forekommer i en polymer, for eksempel rekkefølgen av aminosyrer i et polypeptid eller rekkefølgen av nukleotider i et polynukleotid.

Som anvendt her omfatter "pulveriserte hele soyabønner" for eksempel et soyamateriale dannet ved flaking eller maling av hele soyabønner, omfattende belg og kim av soyabønner. Et pulverisert helt soyabønne-materiale kan inneholde fett naturlig i soya eller kan være avfettet.

Som anvendt her omfatter "soyamel" for eksempel et soyamateriale inneholdende mindre enn 65% soyaprotein-innhold etter vekt på en fuktighetsfri basis som er dannet fra soyabønner uten belg og som har en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på 150 mikron eller mindre. Betegnelsen "soyamel" kan for eksempel omfatte soyamelkepulver. Et soyamel kan inneholde fett naturlig i soya eller være avfettet.

Som anvendt her omfatter "soyakorn" for eksempel et soyamateriale inneholdende mindre enn 65% soyaprotein-innhold etter vekt på en fuktighetsfri basis som er dannet fra soyabønner uten belg og som har en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på fra 150 mikron til 1000 mikron. Soya-korn kan inneholde fett naturlig i soya eller kan være avfettet.

Som anvendt her omfatter "grovt soyamel" for eksempel et soyamateriale inneholdende mindre enn 65% soyaprotein-innhold etter vekt på en fuktighetsfri basis som er dannet fra soyabønner uten belg som ikke faller innenfor definisjonen av soyamel eller soyakorn. Et grovt soyamel kan inneholde fett naturlig i soya eller kan være avfettet.

Som anvendt her omfatter "soyaflak" for eksempel et soyaprotein-materiale som er et flaket soyamateriale inneholdende mindre enn 65% soyaprotein-innhold etter vekt på en fuktighetsfri basis dannet ved flaking av soyabønner uten belg. Soyaflak kan inneholde fett naturlig i soya eller kan være avfettet.

Som anvendt her omfatter "soyaprotein-konsentrat" for eksempel et soyaprotein-materiale fremstilt fra høykvalitet friske, rene, soyabønnefrø uten belg. Soyaprotein-konsentrat kan fremstilles ved å fjerne mesteparten av oljen og vannoppløselige ikke-protein-bestanddeler og inneholder typisk ikke mindre enn 65% protein på en fuktighetsfri basis. I en annen utførelsesform kan "soyaprotein-konsentrat" også tolkes til i tillegg å omfatte blandinger av soyaproteiner og fosfolipider hvor det totale protein på en fuktighetsfri basis er mellom ca. 65 til ca. 90% protein. Typisk blir dette produsert fra avfettede soyabønner uten belg ved tre basiske prosesser: syreutvasking (ved ca. pH 4,5), ekstraksjon med alkohol (ca. 55-80%) og denaturering av proteinet med fuktig varme før ekstraksjon med vann. Lite vannoppløselig (vandig alkohol-ekstraksjon) soyaprotein-konsentrat blir underkastet varme (dampinjeksjon eller jet koking) og mekanisk opparbeidelse (homogenisering) for å øke oppløselighet og funksjonalitet. Når det refereres til blandinger av soyaproteiner og fosfolipider hvor det totale protein på en fuktighetsfri basis er mellom 65 og 90% protein, kan slikt materiale fremstilles ved å kombinere soyaprotein-isolat med fosfolipider eller ved fraksjonering av et fosfolipid:protein-kompleks fra soyabønner (dvs. oljelegeme-proteiner og assosierte fosfolipider). Betegnelsen "soyaprotein-konsentrat" kan for eksempel omfatte soyamelkepulver.

Som anvendt her omfatter "soyaprotein-ekstrakt" for eksempel soyaprotein-konsentrat eller isolat anriket med visse soyaproteiner. Et soyaprotein-materiale fraksjonert fra helt soyaprotein-materiale kan fremstilles fra for eksempel soyaprotein-ingrediens-avfall- eller whey-strømmer (alkohol eller sure vann ekstraksjonstrinn).

Som anvendt her omfatter "soyaprotein-isolat" for eksempel et soyaprotein-materiale som er den betydelige proteinholdige fraksjon av soyabønner fremstilt fra soyabønner uten belg ved å fjerne majoriteten av ikke-protein-forbindelser og som fortrinnsvis ikke inneholder mindre enn 90% protein på en fuktighetsfri basis. I enda en annen utførelsesform kan "soyaprotein-isolat" også forstås i tillegg å omfatte soyaprotein-materialer anriket på visse typer av soyaproteiner så som for eksempel P-conglycininer, glycininer og oleosiner eller alternativt å mangle visse typer av soyaproteiner, så som oleosiner. Proteinet blir typisk ekstrahert fra uoppvarmede avfettede soyabønneflak med vann eller mild alkali i et pH-område på 8-9, fulgt av sentrifugering for å fjerne uoppløselig fibrøst residuum; regulering av resulterende ekstrakt til pH 4,5 hvor mesteparten av proteinet utfelles som masse; separering av masse ved sentrifugering fra de oppløselige oligosakkarider, fulgt av multiple vaskinger, nøytralisering med natrium- eller kaliumhydroksyd (for å gjøre det mer oppløselig og funksjonelt), varme-behandling (f.eks. ved anvendelse av jet-koker) og spray-tørking. Tilsetning av proteaser før varme-behandlingstrinnet kan også anvendes for delvis å hydrolysere proteinene og forbedre oppløseligheten av soyaprotein-isolater.

Som anvendt her blir "peptid" og "protein" anvendt om hverandre og betyr en forbindelse som består av to eller flere aminosyrer som er bundet ved hjelp av peptidbindinger.

Som anvendt her betyr "rekombinant protein" at proteinet, enten det omfatter en nativ eller mutant primær aminosyresekvens, blir oppnådd ved ekspresjon av et gen båret av et rekombinant DNA-molekyl i en celle forskjellig fra cellen hvor det gen og/eller protein naturlig finnes. Med andre ord er genet heterologt til verten hvor det er uttrykt. Det skal bemerkes at hvilken som helst endring av et gen, omfattende tilsetning av et polynukleotid som koder for en affinitets-rensegruppe til genet, gjør det gen unaturlig for formålene ved denne definisjonen og det gen kan således ikke være "naturlig" funnet i noen celle.

Som anvendt her angir "målrettings-sekvens" i sammenheng med proteiner eller peptider, en nukleotidsekvens som koder for en aminosyresekvens hvor tilstedeværelsen av denne resulterer i at et protein blir styrt til en spesiell destinasjon innen en celle.

Uttrykket "terapeutisk effektiv" indikerer evnen til et middel til å forhindre eller forbedre alvorlighetsgraden av sykdommen, mens ugunstige bivirkninger typisk forbundet med alternative terapier unngås. Uttrykket "terapeutisk effektiv" skal forstås å være ekvivalent med uttrykket "effektiv for behandling eller forebygging" og begge skal kvalifisere, f.eks. mengden av preparatene anvendt ved metodene ifølge foreliggende oppfinnelse som vil oppnå målet å redusere risiko for kardiovaskulær sykdom eller forhindre nevnte sykdom mens ugunstige bivirkninger typisk forbundet med alternative terapier unngås.

II. Polypeptider beskrevet heri

Søkerne har identifisert sekvenser av polypeptider isolert fra soyamateriale og mer spesifikt fra HMF i soyamateriale, som har hypokolesterolemisk aktivitet. Disse sekvenser koder for peptider fra glycinin eller (3-conglycinin. Proteinene glycinin og P-conglycinin er frølagrings-proteiner. Glycinin har en omtrentlig molekylvekt på 320 kilodalton ("kDa") og er sammensatt av seks subenheter som hver består av en sur og en basisk subenhet. Videre har P-conglycinin en omtrentlig molekylvekt på 150 kDa og er sammensatt av tre forskjellige typer av subenheter (a, a' og P) i varierende forhold. Glycinin- og P-conglycinin-type proteiner er meget konservert på tvers av forskjellige plantearter.

Det er beskrevet ett til flere isolerte polypeptider eller polypeptid-fragmenter fra et glycinin-protein. I én utførelsesform er sekvensen av det isolerte polypeptid gitt i SEKV ID NR:1 og svarer til VFDGELQEGRVLIVPQNFVVAARSQSDNFEYVSFK.

I enda et ytterligere aspekt tilveiebringes ett til flere isolerte polypeptider eller polypeptid-fragmenter fra et P-conglycinin-protein. I én utførelsesform er sekvensen av det isolerte polypeptid gitt i SEKV ID NR:2 og svarer til LRMITLAIPVNKPGRFESFFL. I en annen utførelsesform er sekvensen av det isolerte polypeptid gitt i SEKV ID NR:3 og svarer til IFVIPAGYPVVVNATSHLNFFAIGI. I enda en annen utførelsesform er sekvensen av det isolerte polypeptid gitt i SEKV ID NR:4 og svarer til LQESVIVEISKK. I enda en annen utførelsesform er sekvensen av det isolerte polypeptid gitt i SEKV ID NR:5 og svarer til QQQEEQPLEVRK. I enda en annen utførelsesform er sekvensen av det isolerte polypeptid gitt i SEKV ID NR:6 og svarer til NQYGHVR. Sekvensen av det isolerte polypeptid kan være gitt i SEKV ID NR:7 og svarer til AIVILVINEGDANIELVGL. Sekvensen av det isolerte polypeptid kan være gitt i SEKV ID NR: 8 og svarer til NILEASYDTKFEEINK. I enda en annen utførelsesform er sekvensen av det isolerte polypeptid gitt i SEKV ID NR: 11 og svarer

til IFVIPAGYPVVVNATSDLNFFAFGI.

Søkeren har også identifisert sekvenser av oleosiner som demonstrerer hypokolesterolemisk aktivitet. Oleosiner er primært funnet i membran-bestanddeler av planteolje-legemer. Oleosin proteiner er omfattet av tre domener; de to ender av proteinet, N- og C-termini, er i stor grad hydrofile og ligger på overflaten av oljelegemet eksponert for cytosolen mens den meget hydrofobe sentrale kjerne av oleosinet er fast forankret innen membranen og triacylglyceridet. Oleosiner inneholder også et amfipatisk alfa-heliks domene ved eller nær C-terminus. Oleosiner fra forskjellige arter representerer en liten familie av proteiner som viser betraktelig aminosyresekvens-konservering, spesielt i den sentrale region av proteinet. Innen en individuell art kan et lite antall forskjellige isoformer eksistere.

Ett til flere isolerte polypeptider eller polypeptid-fragmenter fra et oleosin-protein er beskrevet. Oleosinet kan være P24 isoform A (P89) fra soya (aksesjonsnummer P29530; SEKV ID NR: 12), som svarer til FIG. 1. Oleosinet kan være P24 isoform B (P91) fra soya (aksesjonsnummer P29531; SEKV ID NR: 13), som svarer til FIG. 2. Oeosinet kan være det oljelegeme-assosierte protein 17 kDa oleosin (oleol7) fra mais { Zea mays) (aksesjonsnummer AAA68066; SEKV ID NR: 14), som svarer til FIG. 3. Oleosinet kan være oljelegeme protein 16 kDa oleosin (oleol6) fra mais { Zea mays) (aksesjonsnummer AAA68065; SEKV ID NR: 15), som svarer til FIG.

4. Oleosinet kan være oleosin KD 18 (KD 18; L2) fra mais { Zea mays)

(aksesjonsnummer AAA67699; SEKV ID NR 16), som svarer til FIG. 5. Oleosinet kan være H. annuus oleosin (solsikke) (aksesjonsnummer CAA55348; SEKV ID NR: 17), som svarer til FIG. 6. Sekvensen av det isolerte oleosin-polypeptid er gitt i SEKV ID NR:9 og svarer til VKFITAATIGITLLLL. Sekvensen av det isolerte oleosin-polypeptid er gitt i SEKV ID NR: 10 og svarer til YETNSSLNNPPSR.

"Homologi", som er godt forstått på området, er en relasjon mellom to eller flere polypeptidsekvenser eller to eller flere polynukleotidsekvenser, som bestemt ved å sammenligne sekvensene. På området betyr "homologi" også graden av sekvens-relasjon mellom polypeptid- eller polynukleotidsekvenser, som bestemt ved overensstemmelse mellom strenger av slike sekvenser. "Homologi" kan lett beregnes ved kjente metoder omfattende, men ikke begrenset til, de beskrevet i Computational Molecular Biology, 1988; Biocomputing: Informatics and Genom Projects, 1993; Data Analysis of Sequence Data, Part I, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, 1987; Sequence Analysis Primer, 1991; og Carillo og Lipman, 1988. Metoder for å bestemme homologi er utformet for å gi den største overensstemmelse mellom sekvensene testet. Videre er metoder for å bestemme homologi kodifisert i offentlig tilgjengelige programmer. Datamaskinprogrammer som kan anvendes for å bestemme identitet/homologi mellom to sekvenser omfatter, men er ikke begrenset til, GCG (Devereux et al, 1984); gruppe på fem BLAST-programmer, tre utformet for nukleotidsekvens-søk (BLASTN, BLASTX og TBLASTX) og to utformet for proteinsekvens-søk (BLASTP og TBLASTN) (Coulson, 1994; Birren, et al, 1997). BLAST X-programmet er offentlig tilgjengelig fra NCBI og andre kilder ( BLAST Manual; Altschul et al, 1990). Den velkjente Smith Waterman algoritme kan også anvendes for å bestemme homologi.

De isolerte proteiner er beskrevet. Som anvendt her omfatter betegnelsen protein-fragmenter, analoger og derivater av glycinin-, P-conglycinin- eller oleosin-protein. Proteinet heri kan være et naturlig protein, et rekombinant protein eller et syntetisk protein eller et polypeptid.

Fagfolk på området vil vite at modifikasjoner i aminosyresekvensen av et peptid, polypeptid eller protein kan resultere i ekvivalent eller muligens forbedret, andre generasjon peptider, etc, som oppviser ekvivalente eller overlegne funksjonelle karakteristika sammenlignet med den opprinnelige aminosyresekvens. Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig slike modifiserte aminosyresekvenser. Endringer kan omfatte aminosyre-insersjoner, delesjoner, substitusjoner, trunkasjoner, fusjoner, "shuffling" av subenhet-sekvenser og lignende, forutsatt at peptidsekvensene produsert ved slike modifikasjoner har hovedsakelig samme funksjonelle egenskaper som de naturlig forekommende motstykke-sekvenser beskrevet her. Biologisk aktivitet eller funksjon kan bestemmes ved for eksempel evnen til proteinet til å nedsette totalt serum-kolesterol som vist i eksemplene nedenfor.

Én faktor som kan tas i betraktning ved slike endringer er den hydropatiske indeks til aminosyrer. Betydningen av den hydropatiske aminosyre-indeks for å gi interaktiv biologisk funksjon til et protein er beskrevet av Kyte og Doolittle (1982). Det er akseptert at den relative hydropatiske karakter av aminosyrer bidrar til den sekundære struktur av det resulterende protein. Dette påvirker igjen interaksjonen av proteinet med molekyler så som enzymer, substrater, reseptorer, DNA, antistoffer, antigener, etc.

Basert på dens hydrofobisitet og ladningskarakteristika er hver aminosyre gitt en hydropatisk indeks som følger: isoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenylalanin (+2,8); cystein/cystin (+2,5); metionin (+1,9); alanin (+1,8); glycin (-0,4); treonin (-0,7); serin (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrosin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamat/glutamin/aspartat/asparagin (-3,5); lysin (-3,9); og arginin (-4,5).

Som det er kjent på området kan visse aminosyrer i et peptid eller protein erstattes med andre aminosyrer som har en lignende hydropatisk indeks eller score og gi et resulterende peptid eller protein som har lignende biologisk aktivitet, dvs. som fortsatt beholder biologisk funksjonalitet. Ved slike endringer er det foretrukket at aminosyrer som har hydropatiske indekser innen ±2 blir erstattet med hverandre. Mer foretrukne substitusjoner er de hvor aminosyrene har hydropatiske indekser innen ±1. Mest foretrukne substitusjoner er de hvor aminosyrene har hydropatiske indekser innen ±0,5.

Like aminosyrer kan også erstattes på basis av hydrofilitet. U.S. Patent

nr. 4,554,101 beskriver at den største lokale gjennomsnittlige hydrofilitet til et protein, som styrt av hydrofiliteten av de tilstøtende aminosyrer, korrelerer med en biologisk egenskap til proteinet. De følgende hydrofilitetsverdier er gitt til aminosyrer: arginin/lysin (+3,0); aspartat/glutamat (+3,0 ±1); serin (+0,3); asparagin/glutamin (+0,2); glycin (0); treonin (-0,4); prolin (-0,5 ±1); alanin/histidin (-0,5); cystein (-1,0); metionin (-1,3); valin (-1,5); leucin/isoleucin (-1,8); tyrosin (-2,3); fenylalanin (-2,5); og tryptofan (-3,4). Således kan én aminosyre i et peptid, polypeptid eller protein erstattes med en annen aminosyre som har en lignende hydrofilitet-score og fortsatt gi et resulterende protein som har lignende biologisk aktivitet, dvs. beholder fortsatt korrekt biologisk funksjon. Ved slike endringer blir aminosyrer som har hydropatiske indekser innen ±2 fortrinnsvis erstattet med hverandre, de innen ±1 er mer foretrukket og de innen ±0,5 er mest foretrukket.

Som beskrevet ovenfor kan aminosyre-substitusjoner i peptidene heri være basert på den relative similaritet av aminosyre-sidekjede-substituenter, for eksempel deres hydrofobisitet, hydrofilisitet, ladning, størrelse, etc. Eksempler på substitusjoner som tar de forskjellige foregående karakteristika i betraktning for å produsere konservative aminosyre-endringer som resulterer i "silent" endringer i foreliggende peptider, etc, kan velges fra andre medlemmer av klassen til hvilken den naturlig forekommende aminosyre tilhører. Aminosyrer kan deles opp i de følgende fire grupper: (1) sure aminosyrer; (2) basiske aminosyrer; (3) nøytrale polare aminosyrer; og (4) nøytrale ikke-polare aminosyrer. Representative aminosyrer innen disse forskjellige grupper omfatter, men er ikke begrenset til: (1) sure (negativt ladede) aminosyrer så som asparaginsyre og glutaminsyre; (2) basiske (positivt ladede) aminosyrer så som arginin, histidin og lysin; (3) nøytrale polare aminosyrer så som glycin, serin, treonin, cystein, cystin, tyrosin, asparagin og glutamin; og (4) nøytrale ikke-polare aminosyrer så som alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan og metionin. Det skal bemerkes at endringer som ikke er forventet å være fordelaktige også kan være anvendelige hvis disse resulterer i produksjon av funksjonelle sekvenser.

Betegnelsen protein omfatter også former av proteinet til hvilket én eller flere substituent-grupper er tilsatt. En substituent er et atom eller en gruppe av atomer som blir innført i et molekyl ved erstatning av et annet atom eller gruppe av atomer. Slike grupper omfatter, men er ikke begrenset til lipider, fosfatgrupper, sukkere og karbohydrater. Således omfatter betegnelsen protein for eksempel lipoproteiner, glykoproteiner, fosfoproteiner og fosfolipoproteiner.

III. Preparater og metoder ifølge foreliggende oppfinnelse

Et annet aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringer preparater som er anvendelige for behandling eller forebygging av kardiovaskulær sykdom. Preparatet i én utførelsesform omfatter et plantebasert næringsmiddel til hvilket isolert oljelegeme-assosiert protein er tilsatt. I én utførelsesform av oppfinnelsen er næringsmidlet soya-basert. I enda en annen utførelsesform omfatter preparatet et isolert soyamateriale, et isolert oljelegeme-assosiert protein og minst én additiv forbindelse valgt fra gruppen bestående av et saponin, fytoøstrogen, et fosfolipid og et karbohydrat hovedsakelig resistent mot fordøyelse. I visse utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse kan et isolert oljelegeme-assosiert protein være en renset fraksjon isolert fra planteprotein. For eksempel kan isolert oljelegeme-assosiert protein være anriket 1,10, 100, 200, 1000 eller flere ganger i forhold til rå planteproteiner. I visse utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse kan det isolerte oljelegeme-assosierte protein være anriket med oljelegeme-assosiert protein 1, 5,10, 50 eller 100 eller flere ganger i forhold til for eksempel en renset fraksjon så som HMF.

Et isolert soyamateriale anvendt ved foreliggende oppfinnelse kan fremstilles og isoleres fra hvilken som helst soyaplante, i den grad det isolerte soyamateriale inneholder bestanddelene nødvendig for det isolerte soyamateriale for å vise den ønskede hypokolesterolemiske aktivitet. Isolert soyamateriale kan for eksempel omfatte pulveriserte hele soyabønner, soyamel, soyamelkepulver, soyakorn, grovt soyamel, soyaflak, soyakonsentrat, soyaprotein-isolat og soyaprotein-ekstrakt. I én utførelsesform er soyamaterialet soya-konsentrat. I enda en annen utførelsesform er soyamaterialet soyaprotein-isolat. I enda en ytterligere utførelsesform er soyamaterialet soyaprotein-ekstrakt. Hvilken som helst metode kjent på området, omfattende de metoder angitt detaljert her, kan anvendes for å isolere det spesielle soyamaterialet.

Ett aspekt ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolert soyamateriale anriket med visse soyaproteiner eller -peptider, så som B-conglycininer, glycininer og oleosiner. Disse soyamaterialer kan fremstilles fra isolater, konsentrater eller fra avfallsstrømmer fra isolat- og konsentrat-fremstilling. De kan også fremstilles fra soyabønner med en modifisert protein-sammensetning, så som soyabønner som har to ganger de normale nivåer av B-conglycinin og lave nivåer av glycinin (som beskrevet i for eksempel U.S. Patent nr. 6,171,640).

Fremstilling av matvarer er velkjent for fagfolk på området. I tilfellet av soya, omfatter vanlig matanvendelse, men er ikke begrenset til, produkter så som frø, bønneskudd, bakt soyabønne, helfett soyamel anvendt i forskjellige produkter for baking, ristet soyabønne anvendt som konfekt, soyanøttsmør, soyakaffe og andre soya-derivater av orientalske matvarer. Soyaprotein-produkter ( f. eks. mel), kan deles opp i soyamel-konsentrater og isolater som har både mat/for og industriell anvendelse. Soyamel og -korn blir ofte anvendt ved fremstilling av kjøtt-fyllmidler og analoger, matvarer for kjeledyr, bakebestanddeler og andre matprodukter. Matprodukter fremstilt fra soyamel og isolat omfatter babymat, godteriprodukter, kornblandinger, matdrikker, nudler, gjær, øl, overgjæret øl, etc.

I visse aspekter ved foreliggende oppfinnelse blir isolert soyamateriale som mangler eller inneholder lave mengder av visse typer av soyaproteiner, så som for eksempel oleosiner, forsterket med oljelegeme-assosierte proteiner, så som for eksempel oleosiner, for derved å forbedre eller gjenopprette de hypokolesterolemiske egenskaper til soyaproteinet eller soyaprotein-preparatet. I ytterligere utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse blir oljelegeme-assosierte proteiner tilsatt til en endelig konsentrasjon på ca. 0,5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 20% eller mer etter vekt, omfattende alle mellomområder innen disse konsentrasjoner. Avhengig av den spesielle anvendelse, kan soyamaterialer uten oleosin eller med reduserte mengder av oleosin, være meget fordelaktig. For eksempel kan oleosiner betraktes uønskede fordi de binder smaksmidler som bidrar til den relativt dårlige smakskvalitet av soyamatvarer. Videre er oleosiner også lite oppløselige og bidrar til stor-partikkel-fraksjon når avfettet soyamelk blir dispergert i vann. I én utførelsesform kan oleosinet fjernes ved å la stor-partikkel-fraksjonen inneholdende oleosin bunnfelles i en tank eller ved anvendelse av ultrafiltreringsmembraner. Alternativt kan oleosiner utfelles fra soyaprotein-isolat ved pH 2,8 i nærvær av natriumsulfat og kalsiumklorid (Samoto et al, 1998).

Det er beskrevet preparat omfattende et isolert soyamateriale og et isolert oljelegeme-assosiert protein hvor det isolerte soyamateriale er en høymolekylær fraksjon ("HMF") av et soyaprotein-isolat. HMF anvendt i hvilket som helst av preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles og isoleres fra hvilket som helst planteprotein-isolat hvor det naturlig forekommer, i den grad fraksjonen har den ønskede hypokolesterolemiske aktivitet. I én utførelsesform blir HMF fremstilt fra en soyaprotein-kilde. Typisk soyamateriale fra hvilket HMF kan fremstilles omfatter soyabønner, soyabønner uten belg, grovt soyamel, soyamel, soyakorn, soyamelkepulver, soyaflak (helfett og avfettet), soya-melasser, soyaprotein-konsentrat, soyamyse, soyamyseprotein og soyaprotein-isolat. I en foretrukket utførelsesform blir HMF fremstilt fra et soyaprotein-isolat.

For å fremstille HMF, blir det valgte planteprotein-isolat underkastet hydrolytisk eller kjemisk fordøyelse. Typiske midler anvendt for denne fordøyelsesprosess omfatter pepsin eller mikrobielle proteaser. Typisk blir for eksempel soyaproteinet inkubert med pepsinenzymet i 13 til 17 timer, (0,2% NaCl i vandig fase, 38°C, pH 1,1) idet pepsinenzymet er 0,5 til 5% av soyaprotein-isolat), varme-behandlet i 20 min ved 90°C for å inaktivere pepsinet, avkjølt på is, regulert til en pH på 6 til 7 med Na2CC>3og sentrifugert ved 4.500 g i 20 min. Denne pellet kan deretter vaskes 3 ganger med vann og identifiseres. Andre metoder for anvendelse av pepsinenzym er velkjente på området.

Mikrobielle proteaser kan for eksempel være Sumizyme FP ( Aspergillus niger protease, enzymaktivitet 48800 U/g, Shin Nippon Kagaku Kabushiki Kaisha) og inkuberes med soyaproteinet ved 60°C i fem timer. Ved anvendelse av en slik løsning, istedenfor regulering av pH, blir løsningen fortynnet med vann. Sentrifugering ved 10.000 x g kan deretter utføres i 10 min. Fellingen kan deretter oppsamles og identifiseres. Ytterligere metoder er kjent på området. Se for eksempel Hori et al.

(1999).

HMF blir deretter isolert fra det fordøyede planteprotein-isolat ved hvilken som helst metode generelt kjent på området. I én utførelsesform blir HMF isolert ved sentrifugering. Typisk kan isoleringsprosessen utføres ved for eksempel tørking (f.eks. frysetørking) av fraksjonen etter sentrifugering av en vandig suspensjon av soyaprotein-isolat som er behandlet med en mikrobiell protease eller pepsin (protease er 0,5-6% av totalt protein) og inkubering ved 30-70°C i 1-20 timer. Ytterligere metoder er velkjente på området. Se Nagoako et al, (1999).

Videre kan hvilket som helst peptid isolert fra HMF anvendes i preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse i den grad peptidet har den ønskede hypokolesterolemiske aktivitet. Typisk er imidlertid peptidet anvendt i preparatet minst 10 aminosyrerester i lengde, mer typisk fra ca. 10 til ca. 100 aminosyrerester i lengde og mest typisk ca. 30 til ca. 80 aminosyrerester i lengde. Generelt er peptidet også hovedsakelig hydrofobt av natur idet det har fra over ca. 30 vektprosent til fortrinnsvis over ca. 35 vektprosent av hydrofob aminosyre-sammensetning. I tillegg kan det anvendte peptidet ha 0,1 eller flere amfipatiske regioner. I tillegg kan det anvendte peptidet ha en hydrofob overflate eller hydrofob region som ikke er et resultat av en streng av hydrofobe aminosyrer, men av den a-heliske struktur til peptidet.

Det er beskrevet et preparat som omfatter isolerte soya-polypeptider isolert fra soyamateriale hvor soya-polypeptidene omfatter P-conglycinin og glycinin. Strukturen av både P-conglycinin og glycinin er detaljert angitt ovenfor og en detaljert oversikt over deres strukturer er gitt i Utsumi et al. (1997). Uten å begrense søkerne til en enkel teori er det antatt at disse peptider gir deres hypokolesterolemiske aktivitet fordi de kan overleve fordøyelse og blir absorbert inn i blodstrømmen eller binder til gallesyrer. Også fordelaktig, men ikke nødvendig, er tilstedeværelse av en amfipatisk a-helisk region i p-conglycininet. Uten å begrense søkerne til noen enkel teori, er det antatt at tilstedeværelsen av en amfipatisk a-helisk region er fordelaktig fordi den danner en hydrofob overflate som letter interaksjon med forskjellige reseptorseter viktige for å gi hypokolesterolemisk aktivitet.

I tillegg og uten å begrense søkerne til noen enkel teori, kan de identifiserte polypeptider også tjene som en kilde for nitrogen for fordelaktige bakterier i kolon. Disse bakteriene kan deretter produsere kortkjedede fettsyrer så som propionatsyre som positivt påvirker lipid-metabolisme. Kortkjedede fettsyrer hemmer syntese av fettsyrer i leveren, nedsetter hastigheten av triglycerid-sekresjon og reduserer også hepatisk kolesterol-syntese. Soyaprotein-polypeptider kan anvendes for å fremme produksjon av kortkjedede fettsyrer i kolon og redusere serum-kolesterol og -triglycerider. Effektiviteten av ufordøyede soya-polypeptider til å fremme veksten av fordelaktige kolon-bakterier vil være mest betydelig i nærvær av ufordøyede karbohydrater så som høyamylose maisstivelse som er viktig næring for human kolon-mikroflora. Soya-polypeptid- bestanddeler kan kombineres med kilder for ufordøyede karbohydrater for å optimalisere de fordelaktige effektene av polypeptider på serum-kolesterol og - triglycerider.

Et aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor preparater som har spesifikke polypeptider isolert fra P-conglycinin. Generelt svarer disse polypeptidsekvenser til hvilken som helst av aminosyresekvensene i SEKV ID NR:2, SEKV ID NR:3, SEKV ID NR:4, SEKV ID NR:5, SEKV ID NR:6 og SEKV ID NR: 11. Disse sekvenser kan isoleres fra p-conglycinin ved en metode som for eksempel involverer (1) enzymatisk hydrolyse av soyamateriale fulgt av isolering av den høymolekylære fraksjon, f.eks. ved sentrifugering eller (2) enzymolyse av soyamateriale fulgt av ytterligere rensning med en ultrafiltreringsmembran, ionebytterharpiks-kolonne og gelfiltrerings-kolonnekromatografi for å gi peptider med et molekylvektområde på omtrent 200 til ca. 5.000 kilodalton (se for eksempel metoden detaljert angitt i Yamauchi og Suetsuna (1993). Peptidene kan fraksjoneres ytterligere ved anvendelse av ionebyttingskromatografi (Chen et al, 1995). Alternativt, istedenfor å isolere de individuelle sekvenser fra de spesielle P-conglycinin-subenheter, er det også mulig å anvende soyabønner som har to ganger de normale nivåer av P-conglycinin og bare isolere p-conglycinin fra soyabønnene. Likeledes er det også mulig å anvende samme kimplasma hvor bare en spesiell p-conglycinin-subenhet er uttrykt for å oppnå rå preparater av denne subenhet. De aktive peptider blir deretter produsert etter konsum av de rå preparater som et resultat av hydrolysering i tarmen av pepsin og pankreatin eller blir oppnådd under ingrediens-fremstilling ved anvendelse av mikrobielle enzymer. I en annen utførelsesform av oppfinnelsen er derfor tilveiebragt et preparat omfattende et rått preparat av en spesiell subenhet av P-conglycinin kombinert med et oleosin-preparat.

Enda et annet aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringer preparater som har spesifikke polypeptider isolert fra glycinin. I én utførelsesform inneholder preparatet et polypeptid isolert fra den basiske subenhet av glycinin. I enda en annen utførelsesform omfatter preparatet et polypeptid isolert fra B-lb subenhet av glycinin. I en foretrukket utførelsesform omfatter preparatet et peptid isolert fra glycinin som svarer til aminosyresekvensen i SEKV ID NR: 1. Typisk blir glycinin isolert fra proteinkilder ved anvendelse av isoleringsprosedyrer som er velkjente på området. Et eksempel på disse isoleringsprosedyrer er de anvendt for å isolere andre protein-isolater, som beskrevet ovenfor.

Preparatene heri inneholder typisk også et oljelegeme-assosiert protein. Som anvendt her omfatter betegnelsen "oljelegeme-assosiert protein" hvilket som helst protein, lipoprotein eller peptid fysisk forbundet med en oljelegeme-struktur eller intracellulær lipid-partikkel. Generelt inneholder de fleste eukaryote celler fra arter så som planter, pattedyr, ikke-pattedyrceller, alger og gjær intracellulære lipid-partikler. Disse partikler er kjent som lipid-legemer, lipide små dråper eller, spesielt i planter, oljelegemer, oleosomer eller sfærosomer, avhengig av artene. De lipide partikler i eukaryote celler består av en meget hydrofob kjerne av nøytrale lipider, hovedsakelig triacylglyceroler og/eller sterylestere, omgitt av et fosfolipid monolag med en liten mengde av proteiner innleiret. En typisk sammensetning av oljelegemer isolert fra mais er triacylglyceroler (95%), diacylglyceroler (4%), fosfolipider (0,9%) og protein (1,4%).

Typiske oljelegeme-assosierte proteiner anvendelige i preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter oljelegeme-proteiner så som oleosiner i form av apoproteiner eller som lipoproteiner og et 34-kD soyabønnefrø lagrings-vakuole-protein som assosierer med oljelegemene. Preparatet kan omfatte et isolert soyamateriale og et peptid isolert fra et oljelegeme-assosiert protein hvor peptidet er et oleosin eller et peptidfragment fra et oleosin. Oleosinet kan representeres ved sekvensene av P24 Oleosin Isoform A (P89) Aksesjonsnummer P29530, som er gitt i SEKV ID NR: 12 og svarer til FIG. 1, P24 Oleosin Isoform B (P91) Aksesjonsnummer P29531, som er gitt i SEKV ID NR: 13 og svarer til FIG. 2, det oljelegeme-assosierte protein 17 kDa oleosin (oleol7) Aksesjonsnummer AAA68066, som gitt i SEKV ID NR: 14 og svarende til

FIG. 3, oljelegeme protein 16 kDa oleosin (oleol6) Aksesjonsnummer AAA68065, som gitt i SEKV ID NR:15 og svarende til FIG. 4, oleosin KD18 (KD18; L2)

Aksesjonsnummer AAA67699, som gitt i SEKV ID NR 16 og svarende til FIG. 5 og H. annuus oleosin Aksesjonsnummer CAA55348, som gitt i SEKV ID NR: 17 og svarende til FIG. 6. Mer typisk er peptidet anvendt i preparatet er lavmolekylært oleosin med en omtrentlig molekylvekt på 17 kilodalton. I visse utførelsesformer er peptidet fra et oleosin og vil svare til aminosyresekvensen i SEKV ID NR:9 eller SEKV ID NR: 10.

Oleosinpeptidet anvendt i preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse kan isoleres fra intakte oljelegemer. For dette formål kan intakte oljelegemer isoleres fra frø som en kilde for oljelegeme-assosierte proteiner. Metoder og lister av frøtyper som kan anvendes er gitt i for eksempel WO 00/30602. Metoder for fremstilling av oljelegemer er også beskrevet i Japansk patentsøkn. Pub. nr. 2002-101820. Oljen kan ekstraheres fra oljelegemene med dietyleter og etterlate grenseflatematerialer (oleosiner og fosfolipider) i den vandige fraksjon. Fosfolipider kan ekstraheres ved anvendelse av kloroform/metanol (2:1, vol/vol) eller andre egnede organiske løsningsmidler. Spesielt blir oleosiner isolert som aggregert fraksjon (Tzen og Huang 1992). I tillegg kan høy pH ekstraksjon anvendes for å fjerne P34 protein, hvis til stede. P34 proteinet har en isoelektrisk pH under 6,5 og vil derfor være oppløselig ved høy pH hvor oleosiner har deres isoelektriske pH og presipiteres.

Oleosiner kan også isoleres fra hele soyabønner oppbløtt i vann eller fra avfettet soyamel. Oleosin kan isoleres fra proteinkilder ved anvendelse av isoleringsprosedyrer som er velkjente på området. Et eksempel på disse isoleringsprosedyrer er de anvendt for å isolere oleosiner fra avfettet soyamel, som beskrevet ovenfor. Et annet eksempel er isolering av oleosiner fra hele soyabønner (JP 2002-101820). Ytterligere kilder for oleosiner omfatter planteceller, fungale celler, gjærceller, (Leber et al, 1994), bakterieceller, (Pieper-Furst et al, 1994) og algeceller (Roessler, 1988). I foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse blir oleosiner oppnådd fra en plantecelle som omfatter celler fra pollen, sporer, frø og vegetative planteorganer hvor oleosiner eller oljelegeme-lignende organeller er til stede (Huang, 1992). Mer foretrukket blir oleosiner ifølge foreliggende oppfinnelse oppnådd fra plantefrø og mest foretrukket fra gruppen plantearter omfattende: rapsfrø ( Brassica spp.), soyabønne ( Glyeine max), solsikke ( Helianthus annuus), oljepalme ( Elaeis guineeis), bomullsfrø ( Gossypium spp.), jordnøtt ( Arachis hypogaea), kokosnøtt ( Cocus nucifera), ricinus ( Ricinus cummunis), fargetistel ( Carthamus tinctorius), sennep ( Brassica spp. og sinapis alba), koriander ( Coriandrum sativum), squach ( Cucurbita maxima), linfrø/lin ( Linum usitatissumum), Brazil-nøtt ( Bertholletia excelsa), jojoba ( Simmondsia chinensis), mais ( Zea mays), crambe ( Crambe abyssinica) og ruccola ( Eruca sativa) .

Preparatet kan omfatte et isolert soyamateriale og et peptid isolert fra et oljelegeme-assosiert protein hvor peptidet er et lipoprotein. Lipoproteiner er ikke-kovalente, ikke-støkiometriske, partikkelformige komplekser av nøytralt lipid, fosfolipid og protein funnet i både dyre- og planteceller. I én utførelsesform er lipoproteinet et pattedyr-lipoprotein. I enda en annen utførelsesform er lipoproteinet eggeplomme lipoprotein (for en oversikt over eggeplomme-struktur, se for eksempel Bringe (1997), idet innholdet i denne herved inntas her ved referanse). I enda en annen utførelsesform omfatter lipoproteinet et fettkulemembran-protein.

Lipoproteiner kan isoleres fra oljelegeme-assosierte proteinkilder ved anvendelse av prosedyrer som er velkjent på området. Et eksempel på disse isoleringsprosedyrer er de anvendt for å isolere oljelegeme-proteiner eller oleosiner fra avfettet soyamel, som beskrevet ovenfor. Videre kan eggeplomme-lipoproteiner isoleres fra oljelegeme-assosierte proteinkilder ved anvendelse av isoleringsprosedyrer som er velkjent på området.

Som et eksempel på disse isoleringsprosedyrer kan eggeplomme-lipoproteiner isoleres ved ekstrahering av triglyceridene og kolesterol ved anvendelse av superkritisk karbondioksyd (se for eksempel Bringe og Cheng, 1995). Preparatet kan omfatte et soyamateriale i kombinasjon med et oljelegeme-assosiert protein og en additiv forbindelse. Additiv-forbindelsen kan omfatte hvilken som helst forbindelse som terapeutisk forbedrer preparatet. Typisk er imidlertid additiv-forbindelsene valgt fra gruppen bestående av et saponin, et fytoøstrogen, et fosfolipid og et karbohydrat hovedsakelig resistent mot fordøyelse. Generelt, uten å være bundet av noen spesiell teori, er det antatt at disse additiv-forbindelser forbedrer den hypokolesterolemiske aktivitet til preparatet ved hovedsakelig å forhindre fordøyelse av kolesterol-nedsettende polypeptider i det isolerte soyamateriale. På grunn av disse egenskaper øker additiv-forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse den terapeutiske kapasitet til preparatet. I en foretrukket utførelsesform kan preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse følgelig ha hvilken som helst kombinasjon av de spesifikke additiv-komponenter identifisert ovenfor i kombinasjon med et isolert soyamateriale og et isolert oljelegeme-assosiert protein.

I én utførelsesform kan et preparat ifølge foreliggende oppfinnelse derfor omfatte ett til flere saponiner som additiv-forbindelse. Saponinet kan isoleres fra en plantekilde hvor det naturlig forekommer ved hvilken som helst kjent metode, så som metoden ifølge Gurfinkel et al, (2002) eller det kan fremstilles syntetisk ved hvilken som helst kjent metode. Hvilket som helst saponin er egnet for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse i den utstrekning at den valgte forbindelse forbedrer egenskapene til preparatet for anvendelse som et hypokolesterolemisk middel. Typisk blir imidlertid saponinet anvendt isolert fra en belgplante, så som alfalfa- eller soyabønne-planter eller fra havre eller andre plantefrø. Mer typisk blir saponinet isolert fra soyabønnefrø og kan mer spesifikt isoleres fra soyabønnekim. Kilder for saponiner omfatter for eksempel soyabønner, quillaja, alfalfa og såpeurt. Soya-saponiner omfatter for eksempel saponin A, B, E og sapogenol A, B og E.

Videre kan et preparat ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte ett til flere fytoøstrogener som en additiv forbindelse. Fytoøstrogenet kan isoleres fra en plantekilde hvor det naturlig forekommer ved hvilken som helst kjent metode, så som metoden angitt detaljert i U.S. Patent nr. 5,855,892 eller WO 00/30663 eller det kan fremstilles syntetisk ved hvilken som helst kjent metode. Hvilket som helst fytoøstrogen er egnet for anvendelse i foreliggende oppfinnelse i den utstrekning at den valgte forbindelsen forbedrer egenskapene til preparatet for anvendelse som et hypokolesterolemisk middel. Typisk er fytoøstrogenet anvendt i preparatet et isoflavon. Mer typisk er isoflavonet genistein, daidzein (omfattende dens metabolitter o-desmetylangolensin, dihydroclaidzein og equol), biochanin A, formononetin og deres respektive naturlig forekommende glukosider og glukosid-konjugater til stede i soyabønner eller kløver.

Preparatet kan også omfatte ett til flere fosfolipider som en additiv forbindelse.

Fosfolipider kan være fra forskjellige kilder, men blir typisk isolert for eksempel fra frø og mer typisk fra oljefrø av soyaplanter. Disse omfatter lecitin og lyso-lecitin. I tillegg kan fosfolipider med en modifisert fettsyre-sammensetning anvendes. Slike fosfolipider kan være enzym-modifiserte soyafosfolipider. Enzym-modifiserte fosfolipider kan fremstilles fra for eksempel soya- fosfolipider (SLP; True Lecithin, Mie, Japan) ved behandling med fosfolipase A2(Novo Industrier, Bagsværd, Danmark) (Nagaoka, et al, 1999). I tillegg kan fosfolipider med en modifisert fettsyre-sammensetning oppnås fra planter eller plantefrø som er genetisk modifisert for å produsere fosfolipider med modifisert fettsyre-sammensetning. Et eksempel på et fosfolipid med modifisert fettsyre-sammensetning er lecitin med modifisert fettsyre-sammensetning. Andre metoder som er velkjente på området kan også anvendes for å modifisere fettsyre-sammensetningen i fosfolipider.

I tillegg kan et preparat ifølge foreliggende oppfinnelse også omfatte ett til flere karbohydrater. Hvilket som helst karbohydrat kan anvendes i et preparat ifølge foreliggende oppfinnelse i den utstrekning at den valgte forbindelsen forbedrer egenskapene til preparatet for anvendelse som et hypokolesterolemisk middel. Typisk er imidlertid de anvendte karbohydrater, karbohydrater som er hovedsakelig resistente mot fordøyelse. Som anvendt her er "hovedsakelig resistent mot fordøyelse" når anvendt for å beskrive et karbohydrat, på området typisk definert å bety for eksempel karbohydrater som er mer enn ca. 70% resistente mot fordøyelse, fortrinnsvis mer enn ca. 80% resistente mot fordøyelse og mer foretrukket mer enn ca. 90% resistente mot fordøyelse. Generelt er karbohydrater rike på amylose stivelse eller fiber spesielt egnet for anvendelse i et preparat. I én utførelsesform er for eksempel karbohydratet anvendt i preparatet høy-amylose stivelse, oligofruktose eller soya-kimbladfiber. I tillegg omfatter utførelsesformer for eksempel stivelser som er fysisk utilgjengelige (delvis malt korn og frø), resistente granuler (rå potet, grønn banan, noen belgplanter og høy-amylose stivelser), retrograde stivelser (kokt og avkjølt potet, brød og maisflak) og kjemisk modifiserte stivelser (foretrede, forestrede eller kryssbundede stivelser (anvendt i prosesserte matvarer)) (Topping og Clifton, 2001).

Hvilken som helst kombinasjon av et isolert soyamateriale og et isolert oljelegeme-assosiert protein, i nærvær eller fravær av minst én additiv forbindelse, kan kombineres for å danne et preparat ifølge foreliggende oppfinnelse. Tabell 1 nedenfor illustrerer for eksempel flere typiske formuleringer for forskjellige utførelsesformer av preparater ifølge foreliggende oppfinnelse.

I én utførelsesform har preparatet et isolert soyamateriale-innhold på ikke mindre enn 50 vektprosent av preparatet og et oljelegeme-assosiert protein-innhold på ikke mindre enn 0,5 vektprosent av preparatet. Mer foretrukket har imidlertid preparatet et isolert soyamateriale-innhold på ikke mindre enn ca. 70 til ca. 90 vektprosent av preparatet og et oljelegeme-assosiert protein-innhold på mellom ca. 1 til ca. 5 vektprosent av preparatet. Når til stede utgjør additiv-forbindelser så som isoflavon- eller saponin-forbindelser typisk ikke mindre enn 10 mg/100 g av preparatet og kan videre utgjøre mellom ca. 30 til 300 mg/100 g av preparatet. Videre, når til stede, utgjør additiv-forbindelser så som fosfolipider eller et karbohydrat hovedsakelig resistent mot fordøyelse, typisk ikke mindre enn 2 vektprosent og kan videre utgjøre mellom ca. 10 til 50 vektprosent av preparatet.

Preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres til et pattedyr som midler for å forhindre eller behandle utvikling av aterosklerose og vaskulær sykdom. Mer spesifikt kan preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse administreres til et pattedyr, fortrinnsvis et menneske, for å redusere den totale serum-kolesterol-konsentrasjon, for å redusere lavdensitet lipoprotein-konsentrasjon, for å øke høydensitet lipoprotein-konsentrasjon, for å redusere konsentrasjonen av kolesterol i leveren og for å redusere konsentrasjonen av serum-triglycerider. Generelt, uten å være bundet av noen spesiell teori, er det antatt at preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse utøver deres hypokolesterolemiske aktivitet ved å forhindre kolesterol-absorpsjon, hovedsakelig hemme gallesyre-reabsorpsjon og/eller kan anvendes som en nitrogenkilde for bakterier i kolon til pattedyret.

IV. Farmasøytiske preparater og administrering

Hvilket som helst av preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres som farmasøytiske eller næringsmiddel-preparater. Slike preparater kan administreres oralt, parenteralt, ved inhaleringsspray, rektalt, intradermalt, transdermalt eller topisk i doseenhetspreparater inneholdende konvensjonelle ikke-toksiske, farmasøytisk akseptable bærere, adjuvantia og konstituenter som ønsket. Topisk administrering kan også involvere anvendelse av transdermal administrering så som transdermale plastere eller iontoforese-anordninger. Betegnelsen parenteral som anvendt her omfatter subkutane, intravenøse, intramuskulære eller intrasternale injeksjons- eller infusjons-teknikker. Formulering av medikamenter er beskrevet i for eksempel Remington' s Pharmaceutical Sciences, (1975) og Liberman og Lachman (1980).

Injiserbare preparater, for eksempel sterile injiserbare vandige eller oljeaktige suspensjoner, kan formuleres i henhold til kjent teknikk ved anvendelse av egnede dispergerings- eller fuktemidler og suspenderingsmidler. Det sterile, injiserbare preparat kan også være en steril injiserbar løsning eller suspensjon i et ikke-toksisk parenteralt akseptabelt fortynningsmiddel eller løsningsmiddel, for eksempel som en løsning i 1,3-butandiol. Blant de akseptable konstituenter og løsningsmidler som kan anvendes er vann, Ringer's løsning og isotonisk natriumklorid-løsning. I tillegg er sterile, fikserte oljer konvensjonelt anvendt som et løsningsmiddel eller suspenderingsmedium. For dette formål kan hvilken som helst blanding av fiksert olje anvendes, omfattende syntetiske mono- eller diglycerider. I tillegg er fettsyrer så som oleinsyre anvendelige ved fremstilling av injiserbare preparater. Dimetylacetamid, overflateaktive midler omfattende ioniske og ikke-ioniske rensemidler og polyetylenglykoler kan anvendes. Blandinger av løsningsmidler og fuktemidler så som de beskrevet ovenfor er også anvendelige.

Suppositorier for rektal administrering av forbindelsene beskrevet her kan fremstilles ved blanding av det aktive midlet med et egnet ikke-irriterende tilsetningsmiddel så som kakaosmør, syntetiske mono-, di- eller triglycerider, fettsyrer eller polyetylenglykoler som er faste ved normale temperaturer men flytende ved rektal temperatur og som derfor vil smelte i rektum og frigjøre medikamentet.

Faste doseformer for oral administrering kan omfatte kapsler, tabletter, piller, pulvere og granuler. I slike faste doseformer er forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse vanligvis kombinert med ett eller flere adjuvantia som passer for den indikerte administreringsvei. Hvis administrert pr. os, kan forbindelsene blandes med laktose, sukrose, stivelsepulver, celluloseestere av alkansyrer, cellulose-alkylestere, talk, stearinsyre, magnesiumstearat, magnesiumoksyd, natrium- og kalsiumsalter av fosforsyre og svovelsyre, gelatin, akasiegummi, natriumalginat, polyvinylpyrrolidon og/eller polyvinylalkohol og deretter tabletteres eller innkapsles for hensiktsmessig administrering. Slike kapsler eller tabletter kan inneholde et preparat med kontrollert frigjøring som kan gis i en dispersjon av aktiv forbindelse i hydroksypropylmetylcellulose. I tilfellet av kapsler, tabletter og piller kan doseformene også omfatte buffermidler så som natriumcitrat eller magnesium- eller kalsiumkarbonat eller bikarbonat. Tabletter og piller kan i tillegg fremstilles med enterisk belegg.

For terapeutiske formål kan preparater for parenteral administrering være i form av vandige eller ikke-vandige isotoniske sterile injeksjonsløsninger eller -suspensjoner. Disse løsninger og suspensjoner kan fremstilles fra sterile pulvere eller granuler som har én eller flere av bærerene eller fortynningsmidlene nevnt for anvendelse i preparatene for oral administrering. Forbindelsene kan oppløses i vann, polyetylenglykol, propylenglykol, etanol, maisolje, bomullsfrøolje, jordnøttolje, sesamolje, benzylalkohol, natriumklorid og/eller forskjellige buffere. Andre adjuvantia og administreringsmetoder er godt og bredt kjent på det farmasøytiske området.

Flytende doseformer for oral administrering kan omfatte farmasøytisk akseptable emulsjoner, løsninger, suspensjoner, siruper og eliksirer inneholdende inerte fortynningsmidler vanlig anvendt på området, så som vann. Slike preparater kan også omfatte adjuvantia, så som fuktemidler, emulgerings- og suspenderingsmidler og søtende, smaksgivende og parfymerende midler.

Mengden av terapeutisk aktive forbindelser som blir administrert og doseregimet for behandling av en kardiovaskulær sykdomstilstand med forbindelsene og/eller preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse avhenger av en rekke faktorer, omfattende alder, vekt, kjønn og medisinsk tilstand til individet, alvorlighetsgraden av sykdommen, ruten og administreringshyppigheten og den spesielle forbindelsen som anvendes og kan således variere sterkt. Generelt akseptable og effektive daglige doser kan være fra ca. 0,1 til ca. 6000 mg/kg kroppsvekt pr. dag, mer typisk fra ca. 100 til ca. 2500 mg/kg pr. dag og mest foretrukket fra ca. 200 til ca. 1200 mg/kg pr. dag.

Den detaljerte beskrivelsen angitt ovenfor er gitt for å hjelpe fagfolk på området med å praktisere foreliggende oppfinnelse. Uten ytterligere utdypning er det antatt at fagfolk på området kan, ved anvendelse av den foregående beskrivelse, anvende foreliggende oppfinnelse i dens fulle utstrekning. De følgende foretrukne spesifikke utførelsesformer skal derfor betraktes bare som illustrative.

V. Eksempler

Eksempel 1

Identifikasjon av HMF fra soyaprotein

Polypeptidene til stede i HMF fra soyaprotein har aktive kolesterol-nedsettende egenskaper (Se Eksempel 2). Undersøkelser ble utført for å identifisere opprinnelsen og partielle sekvenser av disse polypeptider. Metodene anvendt var som følger: A. Polyakrylamid-gelelektroforese.

Polyakrylimid-gelelektroforesemetoder ble utført i henhold til metoder kjent på området. Mange forskjellige metoder ble anvendt ved foreliggende oppfinnelse og er som følger: B. Tris-glycin-natrium-dodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektroforese

(SDS-PAGE)

Fremstill soyaprotein-prøver for analyse ved frysing av intakte eller malte soyabønner og pulveriser dem i en støtmorter (pulverisering ikke nødvendig for soyaprotein-isolater) og ekstraher proteiner i 1 time ved romtemperatur ved anvendelse av 0,03M Tris, 0,01M 2-merkaptoetanol ved pH=8,0. Fremstill en 4 mg/ml løsning av disse proteiner i SDS solubiliseringsløsning (0,0625 M Tris, 2,3 % SDS, 5 % P-merkaptoetanol, 10% glycerol, pH 6,8, spor av bromfenolblått som et sporfargestoff). Oppvarm prøver i 10 min ved 70°C, avkjøl 5 min, sentrifuger deretter for å pelletere uoppløselige materialer. Tilsett 5^1 (20^g) av hver prøve-supernatant på en 10-20% total akrylamidgel (som beskrevet av Laemmli (1970) og separer ved elektroforese ved 15-30 mA pr. gel (konstant strøm) eller 60-100 volt (konstant spenning). Avslutt elektroforesen når sporfargestoffet er innen 2 mm fra bunnen av gelen. SYPRO Orange kan anvendes istedenfor Coomassie ved å følge metode nummer 2 i Malon et al, (2001).

C. SDS-PAGE analyse ved NuPAGE gel-elektroforese

Fremstill prøver som detaljert angitt i Tris Glycine SDS-PAGE avsnittet, ved anvendelse av 4x NuPAGE LDS Prøvebuffer (NOVEX katalog # NP0003 som 1/4 av prøvevolumet og 500 mM ditiotreitol som 1/10 av prøvevolumet. Tilsett 4^1 (16^g) av hver prøvesupernatant til en Novex 4-12% akrylamid Bis-Tris gel. Fyll Novex Xcell 2 mini-gel tank med NuPAGE MES Running Buffer (50 mM MES, 50 mM Tris, 3,5 mM SDS, 1,025 mM EDTA, pH=7,7) og separer proteiner ved elektroforese ved 200 volt (konstant spenning) inntil fargestoffet når spalten ved bunnen av gelen. Merk gelen som detaljert angitt i Tris-Glycine SDS-PAGE protokoll.

D. 2-D PAGE av soyaproteiner

Ekstraher soyaproteiner som detaljert angitt i Tris-Glycine SDS-PAGE avsnittet. Suppler prøver til å inneholde 8M urinstoff, 2% CHAPS, 0,35% ditiotreitol, 0,2% amfolytt og 15% isopropanol til et endelig volum på 450^1 inneholdende 0,6 til 1,05 mg totalt protein. Anvend 430^1 av denne løsningen til å svelle opp igjen en 18cm pH 3-10 immobilisert pH Gradient (IPG) tørrstrimmel i 24-30 timer (dekk strimmelen med mineralolje mens den svelles). Ved anvendelse av vann-bløtede elektrode-strimler, fokuser IPG-strimlene (dekket med mineralolje) i 50,000-70,000 volt-timer ved anvendelse av den følgende spenningsøkende metoden. Begynn med 1 time ved 100 volt (v), deretter 1 time ved 200 v, 2 timer ved 400 v, 14 timer med en lineær stigning fra 400 til 10000 volt, deretter opptil 48 timer ved 10000 volt for å nå den endelige volt-tid-total. Bløt hver IPG-strimmel i 1,5 ml prøve-ekvilibreringsløsning (62,5 mM Tris, 2,3% SDS, 5% 2-merkaptoetanol, pH 6,8 og spor av bromfenolblått som et sporfargestoff) i 3,5 min. Avrenn strimlene, plasser deretter hver på en 10-20% akrylamid Tris Glycine gel, ved å forsegle det på plass ved anvendelse av varm 1% agarose i ekvilibreringsløsning. Kjør den andre dimensjon geler og merk dem som detaljert angitt i Tris-Glycine SDS-PAGE avsnittet.

E. In situ trypsinisering av proteiner i akrylamidgeler

Kutt ut gelbånd eller flekker, plasser dem i 1500^1 silikonisert mikrosentrifugerør. Vask to ganger med 50% metanol (30 min pr. vask) for å fjerne flekker. Ekvlibrer gelstykker i 50% acetonitril (i 200 mM ammoniumacetat pH = 8,0) i 15 min. Gjenta vasking to ganger. Vask 15 min 100% acetonitril, inndamp deretter til tørrhet i en Speedvac. Trypsiniser i 16-20 timer ved 37°C ved anvendelse av 20^g/ml sekvenserings-kvalitet modifisert trypsin (Promega kat # V5111) i 10% acetonitril i 200 mM ammoniumacetat pH-8,0. Ekstraher peptider med 50% acetonitril, 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) i 20 min under agitering med Nutator. Gjenta ekstraksjon ved anvendelse av 80% acetonitril, 0,1% TFA i ammoniumacetat i 20 min. Gjenta siste ekstraksjon i 30 min. Kombiner alle supernatanter og tørk ekstrakter i Speed-vac.

F. Trypsinisering av båndene for å gi tryptiske polypeptider av

polypeptidene til stede i et gitt bånd.

I gel ble trypsinfordøyelse av båndene for å gi tryptiske polypeptider av polypeptidene til stede i et gitt bånd, utført i henhold til den følgende protokoll: 1) Kutt ut gel-flekker, ved å gjøre den største dimensjon av hvilket som helst stykke mindre enn 1 mm. Plasser gelstykker i 1500^1 silikoniserte mikrosentrifuge-rør. 2) Vask gelstykker med 2 eller flere vaskinger (200^1 pr. rør) med 50% metanol (30 min pr. vask) for å fjerne flekker. Coomassie-merkede geler kan vaskes ytterligere ganger for å fjerne flekker. Gelstykker kan lagres i denne løsningen. Agiter rør ved anvendelse av Nutator. 3) Vask gelstykker to ganger i 200 ^1 50% acetonitril (i 200 mM ammoniumacetat pH = 8,0 - regulert med NH4OH) i 15 min pr. vask, deretter én ytterligere vask i 30 min. Agiter ved anvendelse av Nutator.

4) Vask 15 min i 100% acetonitril.

5) Fjern løsning fra gelstykker og inndamp til tørrhet i Speedvac (15 min).

6) Lag Trypsin-lager ved tilsetning av 1 ml 10% acetonitril (i 200 mM NH4OAC, pH 7,8-8,3 - regulert med NH4OH) til et 20^g medisinglass med trypsin. (Promega Sequencing Grade Modified Trypsin - kat# V5111 anvendt). 7) Fordøy protein ved tilsetning av akkurat nok trypsinløsning til å dekke gelstykker i hvert rør. Typisk er 20^1 tilstrekkelig.

8) Inkuber stykker ved 37°C i 16-20 timer.

9) Avkjøl rør til romtemperatur og mikrosentrifuger rør for å bringe fuktighet til bunnen. 10) Ekstraher peptider med 200^150% acetonitril, 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) i

20 min under agitering med Nutator.

11) Bevar supernatantene individuelt for hvert rør, reekstraher deretter ved anvendelse av 200^180% acetonitril, 0,1% TFA i 15 min under agitering med Nutator. 12) Bevar supernatantene ved tilsetning til de bevart tidligere for hvert rør, ekstraher deretter én endelig gang ved anvendelse av 200^1 80% acetonitril, 0,1% TFA i 30 min med agitering på Nutator. 13) Bevar supernatant og tilsett til den tidligere bevarte for hvert rør. Tørr ekstrakter i Speed-vac.

G. MALDI-TOF analyse

Tryptiske polypeptider fra et bånd ble ionisert ved anvendelse av laser desorpsjon (for MALDI) eller elektrospray (for LC/MS og LC/MS/MS) for å skape et massespektrum. Massene til peptidene blir målt som en blanding ved anvendelse av MALDI; det er ingen separering av de tryptiske peptider. Prøver ble fremstilt for MALDI-analyse ved anvendelse av en lett modifisert publisert prosedyre (Shevchenko et al, 1996). Prøvene ble rekonstituert ved tilsetning av 10^L 0,1% TFA til hvert rør inneholdende de tørkede peptider. Matriks ble fremstilt ved oppløsning av 10 mg/ml nitrocellulose og 20 mg/ml a-cyano-4-hydroksykanelsyre i en 1:1 (vol:vol) blanding av aceton og isopropylalkohol. Matriks ble flekket ved levering av 0,5^1 av matriksløsning på MALDI-platen. Tilsvarende ble 1 ^1 av prøve fra hver prøve avsatt på den flekkede matriks. Prøven fikk tørke på matriksen i omtrent 10 min for å sikre at peptider bandt til nitrocellulosen. Til slutt ble tre vandige vaskinger utført ved å avsette 5^1 av 5% maursyre på hver flekk og umiddelbart aspirere denne løsningen av ved anvendelse av en vakuumledning. MALDI-prøveplaten ble deretter flyttet til massespektrometeret for MALDI massespektrometri-analyse. Dataene ble oppsamlet ved anvendelse av Voyager DE-STR (Perseptive Biosystems, Framingham, MA) i reflektron-modus. Spektra ble internt kalibrert ved anvendelse av kjente trypsin autolyse-topper. Topp-lister av de tryptiske peptidmasser ble dannet og disse ble undersøkt mot NCBI ikke-redundant proteinsekvens database ved anvendelse av MS-Fit søkeverktøy for å identifisere proteinene (Clauser et al, (1999).

Noen ganger er overensstemmelsen "grensetilfelle" og krever bekreftelse eller dataene er svake eller det er ganske enkelt ingen betydelig overensstemmelse. I disse tilfeller blir nano LC/MS/MS anvendt. Ved denne metoden blir den fordøyede blanding injisert på en reversert-fase kolonne slik at peptidene blir separert og innført i massespektrometeret (i dette tilfellet en elektrospray, tandem massespektrometer), én om gangen (eller minst et par om gangen). Massespektrometeret måler massen til peptidene, isolerer de rikeligste ved utfiltering av alt annet og sender et peptid til en kollisjonscelle hvor peptidet kolliderer med Ar-gass. Peptider har tendens til å fragmentere omkring amidbindingener, så fragmentene kan være indikative for aminosyresekvensen. Fragmenteringsdata kan underkastes et database-søkeverktøy, som matcher dataene til proteinsekvens-database. Den anvender den partielle sekvens og den opprinnelige masse av det tryptiske peptid for å få en match. Et protein kan identifiseres ved anvendelse av MS/MS data fra et enkelt tryptisk peptid med høy sannsynlighet.

H. Nano HPLC

Nano HPLC blir anvendt for å separere de tryptiske fragmenter fra et renset protein (renset ved elektroforese) slik at bare ett (eller noen få) peptider blir innført i elektrospray, tandem massespektrometer på en gang. Prøver ble injisert i et CapLC (Waters, Milford, MA) system utstyrt med en autosampler, gradient og hjelpepumpe. Fem mikroliter ble injisert via "mikroliter pickup" modus og avsaltet on-line gjennom en 300 x 5 mm Cigoppfangingspatron (LC Packings, San Francisco, CA). Prøvene ble avsaltet med høy strømningshastighet (30^L/min) i 3 min. Peptidene ble separert på en 100 x 150 mm Magic Ciskolonne (Michrom BioResources, Auburn, CA) før innføring i massespektrometeret. En typisk revers fase gradient ble anvendt fra lav til høy organisk over ca. 30 min. Mobil fase A var 0,1% maursyre og B var 100% acetonitril, 0,1% maursyre. Strømningshastigheten ble også øket lineært med organisk mobil fase. Systemet anvendte en liten delt krets ("split flow") hvilket resulterte i en kolonne-strømningshastighet på omtrent 300-700 nL/min.

I. MS/MS analyse og data-prosessering

For LC/MS/MS anvendes det et separeringstrinn (reversert-fase LC), slik at de tryptiske peptider blir innført i massespektrometeret (ideelt) ett om gangen. Det er betegnet MS/MS eller tandem MS, fordi først blir massen til et peptid målt og deretter blir massen til fragmentene fra dette peptid målt. Et tryptisk peptid blir fragmentert ved kollisjoner med en stasjonær gass (Ar) og massene til fragmentene blir målt. Dette vil ofte gi sekvensen av i det minste en del av peptidet. Data-avhengig MS/MS undersøkelser ble utført på et Q-Tof massespektrometer (Micromass, Beverly, MA). Innløpet er en modifisert nanospray-kilde utformet for å holde en pikotupp (New Objective, Cambridge, MA). Kollisjonsenergien anvendt for CAD ble bestemt basert på masse- og ladningstilstanden til peptidet. Dataene ble prosessert med ProteinLynx versjon 3.4 (Micromass, Beverly, MA) for å danne toppliste-filer. Dataene ble søkt mot NCBI ikke-redundant proteinsekvens database ved anvendelse av søkemotoren MASCOT (Matrix Science, London, UK). Søkemotoren anga topp tyve treff. Sekvensdata som ikke matchet noen innføringer i denne database ble søkt mot dbEST database fra NCBI så vel som internt dannede sekvens-databaser.

J. Studie 1

HMF fra soyaprotein-isolatet betegnet OBAP-rik ble separert ved anvendelse av polyakrylimid-gelelektroforese. Fem polypeptid-inneholdende bånd eller områder av gelen ble trypsinisert og analysert for aminosyresekvens ved anvendelse av massespektroskopi (FIG. 7). Opprinnelsen til båndene ble identifisert som i Tabell 2:

Tabell 2.

Bånd Protein-identifikasjon Kommentar

A Glycinin AlaBx (72296) Automatisert match, to

sekvenser<*>

B Glycinin Gl (99907) Automatisert match, tre

sekvenser<*>

C dbEst annotert som antatt Sekvens: YETNSSLNNPPSR

oleosin (SEKV ID NR: 10)

D Alfa subenhet beta-conglycinin Mange peptider

( 72289)

E Alfa subenhet beta-conglycinin Mange peptider - mange

(72289) felles med andre subenheter av beta-conglycinin.

<*>Glycinin-sekvenser oppstilles sammen for å danne rester 401-435 av den basiske subenhet av Gl glycininer (72296, AlaBx forløper) (SEKV ID NR:1)

(VFDGELQEGRVLIVPQNFVVAARSQSDNFEYVSFK) (SEKV ID NR:1):

A VFDGELQEGR og SQSDNFEYVSFK

B Samme to som i A pluss: VLIVPQNFVVAAR

K. Studie 2

Den antatte oleosin-sekvens ovenfor matchet ikke kjente oleosinsekvenser. Sekvensen av soyaoleosin med lavere molekylvekt (~18 kDa) var ikke kjent. Formålet med den følgende studie var å bestemme om den ovenfor "antatte oleosin" sekvens var fra 18 kDa soyabønne-oleosin. Olje-legeme-assosierte proteiner (p34 protein og oleosiner) ble renset og separert på en polyakrylimidgel (FIG. 8). Båndene ble trypsinisert og analysert ved MS.

Tilstedeværelsen av et tryptisk peptid, frigjort fra den amfipatiske N-terminale region av oleosin rett ved siden av det hydrofobe domene, ble bekreftet i et 12 kDa bånd isolert fra HMF. Den gjennomsnittlige masse pr. aminosyre er 111,1 Dalton. Således er antallet aminosyrer i et 12 kDa peptid omtrent 108 aminosyrer. Derfor må peptidet funnet i HMF også inneholde en del av det hydrofobe domene i oleosin. Sekvensen YETNNSSLNNPPSR (SEKV ID NR: 10) representerer rester 33-45 av det antatte oleosin som ligger rett foran begynnelsen av den hydrofobe kjerneregion av proteinet.

Resultater: Bekreftet at sekvens, YETNSSLNNPPSR (SEKV ID NR: 10), er funnet i lavmolekylært soyaoleosin.

L. Studie 3

HMFkarakteriserti studie 1 ble utført fra en soyaprotein-fraksjon som hadde lite beta-conglycinin. Dette hjalp til å identifisere glycinin-subenheter som er til stede i HMF. Den følgende studie ble utført for å bestemme hvilke, om noen, beta-conglycinin-sekvenser som kan identifiseres i HMF. Soyabønner som mangler Gl glycininer ble anvendt for å fremstille soyaprotein-isolat og isolatet ble fordøyet med pepsin for å fremstille HMF. HMF ble separert ved anvendelse av polyakrylimid-gelelektroforese (FIG. 9) og båndene ble trypsinisert ogkarakterisert vedanvendelse av

MS.

Resultater: Polypeptidsekvenser fra beta-conglycininer ble identifisert.

Eksempel 2

Effekt av HMF på kolesterol-opptak

Caco-2 cellelinje er avledet fra humant kolorektalt karsinom og blir vanlig anvendt for å undersøke intestinal epitelcelle-fysiologi. Disse celler har vært anvendt for å undersøke kolesterol-, glukose-, aminosyre-, vitamin-, fettsyre-, gallesyre- og medikament-transportprosesser (Hidalgo et al, 1989); Artursson, 1990; Homan og Hamelehle, 1998). Disse celler uttrykker lipid og sterol metabolisering av enzymer og transportproteiner som blir regulert tilsvarende til de i enterocytter (Levy et al, 1995). De er også kjent for å uttrykke SR-B1, et nylig identifisert protein som kan spille en rolle ved kolesterolabsorpsjon (Werder et al, 2001) så vel som forskjellige proteiner i ATP-binding kasett transportør-familie som også kan spille en rolle i mediering av netto kolesterolopptak av intestinale epitelceller (Taipalensuu et al, 2001).

Soyaprotein er kilden for HMF. Kort angitt ble soyaproteiner inkubert med pepsin i 17 timer (0,2% NaCl i vandig fase, 38°C, pH 1,1, pepsin var 5% av soyaprotein-isolat), varme-behandlet i 20 min ved 90 C for å inaktivere pepsinet, avkjølt på is, regulert til pH 6,21 med 0,2 M Na2C03og sentrifugert ved 4.500 g i 20 min. Denne pellet blir vasket 3 ganger med vann og identifisert som HMF.

A. Kultur av Caco-2 celler for kolesterolabsorpsjonsforsøk

1. Forhåndsbelegg 96-brønn Costar faste hvite vev-kultur behandlede plater (Costar #3917) med rottehale kollagen som følger: a) Fremstill 20^g/ml rottehale-kollagen-løsning (Becton Dickinson/Collaborative Biomedical Products kat. # 40236) i 0,02 N eddiksyre:

0,02 N eddiksyre: Tilsett 11,5 ml 17,4 N Eddiksyre/10 m sterilt H20

Tilsett 60 ul kollagen (3,32 mg/ml) pr. 10 ml 0,02 N eddiksyre

b) Tilsett 250^1 kollagen-løsning/brønn til en 96-brønn plate og la stå ved romtemperatur natten over under laminær hette "laminar hood". c) Skyll hver brønn med lx 250^1 av DMEM fulgt av en skylling med 100 ml

DMEM

2. Skyll 2 T-150 kolber (Costart #430825) med Caco-2 celler ved 70-80% sammenflyting (anvend celler med et passasjenummer mellom 41 og 60) med 10 ml Dulbeco's fosfatbufret saltvann uten Ca<2+>og Mgt<2+>. 3. Tilsett 6 ml 0,25% Trypsin/EDTA-løsning til hver kolbe og inkuber i 5-10 min ved 37°C. 4. Anvend 10 ml pipette for å vaske celler fra T-150 kolben og bryte opp celleklumper. Overfør cellesuspensjon til et 50 ml rør. 5. Tilsett 12 ml fullstendig medium DMEM med 10% føtalt bovint serum, IX ikke-essensielle aminosyrer, 50 mg/ml gentamicin til cellesuspensjonen, bland og pelleter celler ved sentrifugering i 5 min ved 2000 rpm (Sorvall RT7). 6. Fjern medier og erstatt med 20 ml fullstendige medier. Anvend 10 ml pipette for å dispergere celler.[2 x T150 kolber~80% sammenflyting genererer~10 x IO6 celler]. 7. Plat ut cellene i de 96-brønn kollagen-belagte mikrotiter plater med en densitet på 3200 celler/100^1 pr. brønn. 8. Mat celler på vekselvise dager med fullstendig medium. Celler vil uttrykke overflatereseptorer nødvendig for kolesterolabsorpsjon 13 dager etter utplating.

B. Kolesterolabsorpsjonsforsøk

Opptak av micellær kolesterol av Caco-2 celler ble utført ved en modifikasjon av metoden angitt av Field et al. (1991). Vår metode er beskrevet som følger: 1. Forbindelser/peptider som skal testes for deres evne til å hemme kolesterol-absorpsjon i Caco-2 celler oppløses som lagerløsninger i DMSO. Fortynninger av testforbindelser fra lagerløsninger blir utført i pentanol. Fortynninger av forbindelser som skal anvendes i Caco-2 kolesterolabsorpsjon hemningsforsøk bør være 10X høyere enn den ønskede endelige fortynning som skal undersøkes, dvs. pipetter 2 mM løsning i brønnen for å få 200^M endelig i forsøk. Sitostanol blir anvendt som kontrollkolesterol-absorpsjons-inhibitor med maksimal hemning ved 200 mM (0% kolesterolabsorpsjon kontroll). Løsningsmiddel blir bare anvendt som 100% kolesterol-absorpsjon (høy dpm). 2. Fortynninger av kontroll og testforbindelser/peptider blir pipettert inn i polypropylen grunne brønn-mikrotiterplater (Sigma M-4029) in triplo. 3. Platene blir tørket i et GeneVac instrument natten over ved en temperatur på 35°C - 45°C. Plater blir kontrollert for fullstendig tørrhet før neste trinn. 4.<3>H-kolesterol micelle-blanding blir fremstilt som følger i Trace-Clean ravgule medisinglass med septa liner lokk (VWR Kat. nr. 15900-036): Til 1,0 ml 10X STOCK micelleløsning (10X Stock Micelle Løsning = 50 mM Taurocholat, 1 mM Oleinsyre, 1 mM Kolesterol) tilsett 37,5^1<3>H-Kolesterol (NEN Kat. nr. NET-725) (0,75 nmol chol) = 37,5^Ci<3>H-kolesterol (Løsningen inneholder 0,075% chol som radiomerke = spor). Fremstill 1,8 ml pr. mikrotiter forsøksplate i tilfelle av overalder. 5. Pipetter 15^l/brønn av fortynningsmiddel CH3Cl:MeOH (1:1) i alle brønner av de tørkede plater for å solvatere det tørkede residuet. Anvend polypropylen-kar for dette og hold karene på is for å minimalisere avdampning av løsningsmidlet. 6. Til samme plater, tilsett 15^1 av 3H-kolesterol-blanding til hver brønn ved anvendelse av et polypropylen-kar på is for å inneholde radiomerke-løsningen. 7. Tørk platene i et forhåndsoppvarmet 37°C inndampningskammer (VWR) med spyling med nitrogengass i ca. 20-30 minutter. 8. Skyll tørkede brønner med 50^l/brønn etyleter og tørk påny i inndampningskammer. Gjenta eterskylling 1 gang til og tørk.

9. Plasser platene i vakuum-eksikator natten over.

10. Pipetter 150^1 romtemperatur Hank's Balanserte saltløsning (HBSS) (Sigma H-8264) inn i hver tørket brønn ved anvendelse av en Quadra 96 arbeidsstasjon. Den endelige konsentrasjon av micellære lipider er som følger: 5 mM taurocholat, 100^M oleinsyre, 100^M kolesterol og 3,75^Ci/ml<3>H-kolesterol (eller ca. 5^M). 11. Lukk platene med klebende forseglingstape (Packard TopSeal-A Adhesive Sealing Tape eller Sigma Mylar Sealing Tape T-2162) og rist på Labline plate-shaker, Modell 4625, (innstilling=6) i minst 30 minutter ved romtemperatur for å solubilisere miceller. 12. Vask Caco-2 celler platet ut på 96 brønn plater (beskrevet ovenfor) 5 ganger med HBSS ved anvendelse av automatisert cellevasker. Gjør dette like før trinn 13. Fjern eventuelt overskudd av væske ved å klappe platene med papirhåndkle før tilsetning av micellene i neste trinn. 13. Overfør 100^1 av solubiliserte miceller i passende merket Caco-2 celleplate ved anvendelse av Quadra 96 arbeidsstasjon. Plasser platen tilbake i 37°C inkubatoren i

4 timer.

14. Vask celler 5 ganger med kald 1 mM Taurocholat i HBSS (1 mM TC) ved anvendelse av automatisert cellevasker. 15. Pipetter 200^l/brønn av scintillationscocktail (Packard MicroScint 40, Kat. nr. 6013641) inn i celleplater ved anvendelse av Quadra 96 arbeidsstasjon. 16. Lukk platene med varmeforseglingstape (Packard TopSeal-S Heat Sealing Film) og rist platene (innstilling=6 minst) i minst 20 minutter for å blande fluor med celleprøvene.

17. Hold platene i mørke natten over.

18. Tell dpm ved anvendelse av et Packard TopCount NXT instrument.

19. Resultater blir beregnet som % av kontroll (ingen inhibitor) som følger:

% av Kontroll = Testforbindelse/ peptid dpm - 200 uM sitostanol dpm X 100

Kontroll (ingen forbindelse) dpm - 200 uM sitostanol dpm

Soya HMF fra forskjellige kilder illustrerte en dose-avhengig hemning av kolesterol-opptak av Caco-2 celler (Se for eksempel FIG. 10). Konsentrasjonene av HMF nødvendig for å redusere kolesterol-opptak med 50% var mellom 1,2 og 2,9 mg/ml, med unntak av beta-conglycinin-test (4,7 mg/ml).

Eksempel 3

Molekylær farmakologisk karakterisering av HMFs virkningsmekanisme.

For å bestemme hvorvidt testforbindelser/peptider påvirket oppløseligheten av<3>H-kolesterol i de micellære løsninger fremstilt for kolesterolabsorpsjonsforsøket (se Metoder for Eksempel 2), ble det følgende forsøk utført: 1. Miceller blir fremstilt som beskrevet ved metoder for Eksempel 2, opptil og omfattende trinn #11. 2. Overfør 20^1 av solubiliserte miceller til opake Costar-plater (Costar #3917) ved anvendelse av Quadra 96 arbeidsstasjon. 3. Pipetter 200^l/brønn av scintillasjonscocktail (Packard MicroScint 40, kat. nr. 6013641) til mikrotiterplate-brønner ved anvendelse av Quadra 96 arbeidsstasjon. 4. Lukk platene med varmeforseglingstape (Packard TopSeal-S Heat Sealing Film) og rist platene (innstilling=6 minst) i minst 20 minutter for å blande fluor med micelleprøver.

5. Hold platene i mørke natten over.

6. Tell dpm ved anvendelse av et Packard TopCount NXT instrument.

7. Resultater blir beregnet som % av kontroll (ingen inhibitor) som følger:

% av kontroll = Testforbindelse/ peptid dpm - 200 uM sitostanol dpm X 100

Kontroll (ingen forbindelse) dpm - 200 uM sitostanol dpm

8. Hvis en testforbindelse/peptid fortrenger<3>H-kolesterol fra micellene, vil en reduksjon i testforbindelse/peptid dpm sees med høyere konsentrasjoner av testforbindelse/peptid. Hvis ikke vil dpm i de solubiliserte miceller være omtrent konstant over området av fortynninger av testforbindelse/peptid testet.

FIG. 11 illustrerer at dette er i motsetning til den primære mekanisme av kolesterol-hemning av sitostanol.

Eksempel 4

Karakterisering av soyaprotein HMF

Sammenligninger ble utført av utbyttet av HMF fra soyaproteinisolat-fraksjoner som har lave mengder av oljelegeme-assosiert protein (OBAP(-)), en fraksjon rik på oljelegeme-assosiert protein (OBAP(+)) og en kontroll. Alle ble utført fra samme soyabønner (variant A2247).

Kort angitt ble fraksjoner av soyaproteiner inkubert med pepsin i 17 timer (0,2% NaCl i vandig fase, 38°C, pH 1,4, pepsin var 5% av soyaprotein-isolat) varme-behandlet i 20 min ved 90°C for å inaktivere pepsin, avkjølt på is, pH regulert til 6,21 med 0,2M Na2CC>3 og sentrifugert ved 4,500 g i 20 min. Pelleten ble vasket 2 ganger med vann og frysetørket. Vekten til den tørre pellet ble sammenlignet med vekten til den opprinnelige mengde av soyaprotein-isolat anvendt i forsøket for å bestemme utbytte av HMF [(endelig vekt/innledende vekt) x 100]. OBAP(+) og kontroll soyaprotein-prøver produserte begge HMF. Imidlertid ga ikke OBAP(-) fraksjon noe HMF, hvilket indikerer at oleosin og eller komponenter assosiert med oleosin (f.eks. saponiner, fosfolipider) kontrollerer fordøybarheten av soyaproteiner.

De følgende er metodene anvendt for å fraksjonere soyaproteiner til soyaprotein-isolater (SPI):

A. Prosedyre 1: OBAP(-)

1. Tilsett 1 kg avfettet soyaflak (fra Cargill) til 15 kg av DI vann. Reguler pH til 7,5 med IN NaOH. Bland ved romtemperatur i én time.

2. Sentrifuger blandingen ved 10.000 g i 10 min og oppsamle supernatanten.

3. Tilsett Na2SC«4 og CaCl2til supernatanten i en konsentrasjon på henholdsvis 30 mM. 4. Reguler pH i supernatanten fra trinn 3 til pH 2,8 med 2N HC1. Sentrifuger blandingen ved 10.000 g i 10 min. Oppsamle supernatanten. 5. Fortynn supernatanten (fra trinn 4) med DI vann 4 ganger (f.eks. fra 1 L til 4 L). Reguler pH til 4,5 med 2N NaOH. Sentrifuger ved 10.000 g i 10 min. Oppsamle fellingen. 6. Oppløs igjen fellingen fra trinn 5 i DI vann og reguler pH til 7,5 med 2N NaOH. 7. Spraytørk den nøytraliserte proteinblanding ved innløpstemperatur = 200°C, utløpstemperatur = 90-95°C.

B. Prosedyre 2: OBAP(+)

2. Sentrifuger blandingen ved 10.0008 i 10 min og oppsamle supernatanten.

3. Tilsett Na2S04og CaCb til supernatanten i en konsentrasjon på henholdsvis

30 mM.

4. Reguler pH i supernatanten fra trinn 3 til pH 2,8 med 2N HC1. Sentrifuger blandingen ved 10.0008 i 10 min. Oppsamle fellingen. 5. Oppløs igjen fellingen fra trinn 4 i DI vann og reguler pH til 7,5 med 2N NaOH. 6. Spraytørk den nøytraliserte proteinblanding ved innløpstemperatur = 200°C, utløpstemperatur = 90-95°C.

C. Prosedyre 3: Kontroll

2. Sentrifuger blandingen ved 10.000 g i 10 min og oppsamle supernatanten.

3. Fortynn supernatanten (fra trinn 2) med DI vann 4 ganger (f.eks. fra 1 L til 4 L). Reguler pH til 4,5 med 2N HC1. Sentrifuger ved 10.000 g i 10 min. Oppsamle fellingen. 4. Oppløs igjen fellingen fra trinn 5 i DI vann og reguler pH til 7,5 med 2N NaOH. 5. Spraytørk den nøytraliserte proteinblanding ved innløpstemperatur = 200°C, utløpstemperatur = 90-95°C.

I én undersøkelse var det totale proteininnhold i prøvene, OBAP(-) (94,8%), OBAP(+) (91,8%) og kontroll (68%) (Official Methods of Analysis of the AOAC, 16. Ed., 1995, 990,02, Locator #4.2.08). Utbyttet av HMF fra hver fraksjon ble bestemt. Resultater demonstrerte at intet HMF ble tilveiebragt fra OBAP(-) prøve (se Tabell 5). Denne undersøkelsen viste betydningen av OBAP og/eller betydningen av fosfolipider, isoflavoner og saponiner assosiert med denne fraksjonen for å oppnå HMF, selv om oljelegeme-assosierte proteiner ikke utgjør en stor del av HMF.

I samme undersøkelse var trypsin-inhibitor-aktiviteter til OBAP(-), OBAP(+) og kontroll soyaprotein-isolater henholdsvis 24,31,5 og 47,5 TIU/mg (ved anvendelse av en standard AACC metode, 1995, 9. utgave, metode 71-10). Disse aktiviteter korrelerer ikke med utbyttet av HMF fra prøvene; hvilket således eliminerer sannsynligheten for at mangelen på trypsin-inhibitor-aktivitet i OBAP(-) isolater forårsaket mangelen på HMF-dannelse.

Chymotrypsin-inhibitor-aktiviteter til soyaprotein-prøver korrelerer heller ikke med utbyttet av HMF fra prøvene (Tabell 5) (AACC, 10. utgave, metode 22-40).

Andre soyabønne-fraksjoner ble også oppnådd (glycinin, beta-conglycinin, mellomprodukt) fremstilt ved Iowa State University's pilotanlegg (15 kg pilotanlegg prosess #2; Wu et al, 1999). Mengden av oleosin i disse prøver ble også bestemt ved Western blotting ved anvendelse av et oleosin antistoff (Se FIG. 12). Igjen ble det demonstrert at prøvene med høyere mengder av oleosin produserte meget høyere utbytter av HMF (Tabell 6).

Prøver av pepsinfordøyet SPI (OBAP og kontroll), ufordøyede SPI-prøver (kontroll, OBAP(-), OBAP(+)), oljelegeme proteinpreparat og en malt soyaprøve av kontroll soyabønne IA-2032 ble spaltet på 18% Tris/glycin geler og overført til PVDF membraner. Disse blot ble probet med antisera til oleosin (FIG. 13). Dette antisera ble utviklet i kanin ved anvendelse av full-lengde oleosin-protein som ble overuttrykt i og renset fra E. coli som beskrevet i QIAexpressionist (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Disse blot illustrerte at prøvene med høyere mengder av oleosin produserte meget høyere utbytter av HMF (Tabell 6).

Eksempel 5

Effekt av ekstraksjon med etanol på HMF-utbytte

For å se i hvilken grad det høye utbyttet av mellomprodukt-fraksjonen kom fra fosfolipider, saponiner og isoflavoner, ble disse komponenter ekstrahert fra fraksjonen ved anvendelse av 70% etanol og fraksjonen ble igjen testet for HMF-utbytte. Resultatet var 50% lavere utbytte. Tilsetning av den ekstraherte fraksjon til en fraksjon som gir lavt utbytte (glycinin) hjalp til å forbedre utbyttet av HMF for den fraksjon (80%). Disse resultater (se Tabell 6) indikerer at evnen til HMF polypeptider til å motstå fordøyelse av proteaser kan til dels kan avhenge av tilstedeværelsen av alkohol-ekstraherbare komponenter så som saponiner, isoflavoner og fosfolipider. Resultater fra tidligere eksempler er også omfattet i Tabell 6 sammen med oppsummerende forklaringer. Konklusjonen fra denne oppsummering var at oleosiner, beta-conglycininer, alkohol-ekstraherbare forbindelser (fosfolipider, saponiner, isoflavoner) og basiske glycinin-subenheter bidrar til et høyt utbytte av HMF som kan fungere som et kolesterol-nedsettende materiale. Den viktigste komponent er lipoprotein (oleosin og assosiert fosfolipid). Det er antatt at de kolesterol-nedsettende egenskaper til en soyaprotein-bestanddel inneholdende beta-conglycininer og glycininer kan forbedres ved tilsetning av lipoproteiner fra planter (f.eks. oleosiner med assosierte fosfolipider) eller andre kilder (f.eks. eggeplomme-lipoproteiner).

Alle preparatene og metodene beskrevet og krevet her kan fremstilles og utføres uten unødvendig eksperimentering i lys av foreliggende beskrivelse. Mer spesifikt vil det være klart at visse midler som er både kjemisk og fysiologisk relatert kan anvendes istedenfor midlene beskrevet her, mens samme eller lignende resultater ville oppnås.

REFERANSER

De følgende referanser, i den grad de gir eksempler på prosedyrer eller andre detaljer som supplement til de angitt her, er spesifikt inntatt her ved referanse:

U.S. Patent 4,554,101

U.S. Patent 5,855,892

U.S. Patent 6,171,640

U.S. Patent 6,509,453

Altschul et al, J. Mol. Biol, 215:403-410,1990.

Anderson et al, JAMA, 257:2176-2180,1987.

Anderson et al, N. Engl. J. Med., 333(5):276-282, 1995.

Artursson,./. Pharm Sel, 79:476-482,1990.

Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith (Ed.), Academic Press, NY,

1993.

Birren et al, Genome Analysis, 1:543-559, 1997.

BLAST Manual, Altschul et al, (Eds.), NCBI NLM NIH, Bethesda, MD 20894.

Bringe and Cheng, Food Tech., 49(5):94-106,1995.

Bringe, Adv. Exp. Med. Biol, 415:161-181, 1997.

Carillo and Lipman, J. AppliedMath., 48:1073,1988.

Carol and Hamilton, J. Food Sei., 40:18-23, 1975.

Chen et al, Nutr. Biochem., 6:310-313, 1995.

Clauser et al, Analytical Chemistry, 71:2871,1999.

Computational Molecular Biology, Lesk (Ed.), Oxford University Press, NY, 1988. Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin and Griffin (Eds.), Humana Press,

NJ, 1994.

Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76-80, 1994.

Devereux et al, Nucleic Acids Res., 12(1):387, 1984.

Field et al, J. Lipid Research, 32:1811-1821, 1991.

Gordon et al, Circulation, 79:8-15,1989.

Gurfinkel et al. J. Agric. Food Chem., 50(3):426-430,2002.

Hidalgo et al, Gasteroenterology, 96:736-740, 1989.

Homan and Hamelehle,./. Lipid Res., 39:1197-1209, 1998.

Hori etal., J. Jpn. Soc. Nutr. Food Sel, 52:135-145, 1999.

Uuang, Ann. Rev. Plant Physiol, 43:177-200,1992.

Kyte andDoolittle,7. Mol. Biol, 157:105-132, 1982.

Laemmli, Nature, 227:680-685, 1970.

Lebere/a/., Yeast, 10:1421-1428, 1994.

Levy et al., FASEB J., 9:626-635,1995.

Malone et al, Electrophoresis, 22(5):919-932, 2001.

Nagaoka et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 56:1484-1485,1992.

Nagaoka et al, J. Nutr., 129:1725-1730,1999.

Nagaoka et al, J. Nutr., 9:725-730,1999.

Nagoako et al, J. Nutr., 129:1725-1730, 1999.

PCTAppl. WO 00/30602

PCTAppl. WO 00/30663

Pharmaceutical Dosage Forms, Leiberman and Lachman (Eds.), Marcel Decker, NY,

1980.

Pieper-Furst et al, J. Bacteriol, 176:4328-4337,1994.

Potter, J. Nutr., 125:606S-611S, 1995.

Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania

1975

Roessler,J. Phycol. (London), 24:394-400, 1988.

Samoto et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 62:935-940, 1998.

Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, Academic Press, 1987.

Sequence Analysis Primer, Gribskov and Devereux (Eds.), Stockton Press, NY, 1991. Shevchenko et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 93:14440-14445,1996.

Sugano, et al, Atherosclerosis, 72:115-122, 1988.

Taipalensuu et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 299:164-170, 2001.

Topping and Clifton, Physiol. Rev., 81(3): 1031-1064, 2001.

TzenandHuang,J. Cell Biol, 117:327-335, 1992.

Utsumi et al, In: Food Proteins and Their Applications, Damodaran and Paraf (Eds.),

Marcel Dekker, Inc., NY, 1997.

Werder et al, Biochemistry, 40:11643-11650,2001.

Wu et al, JAOCS, 76:285-293, 1999.

Yamauchi and Suetsuna, Nutr. Biochem., 4:450-457, 1993.

Claims

1. Metode for fremstilling av et næringsmiddel,karakterisert vedat den omfatter trinnene: (a) å oppnå et valgt næringsmiddel; og (b) tilsette oleosin og fosfolipid til næringsmiddelet, hvori oleosinet blir tilsatt til en sluttkonsentrasjon på omtrent 5% eller mer i vekt, og hvor fosfolipidet omfatter en mengde ikke mindre enn 2 vekt-%; og hvor konsumet av en effektiv mengde av næringsmiddelet reduserer serum-kolesterolet til et individ med behov for dette.

2. Metode ifølge krav 1,karakterisert vedat den videre omfatter tilsetning av minst en forbindelse valgt fra et saponin, et fytoøstrogen og et karbohydrat vesentlig resistent mot fordøyelse.

3. Metode ifølge krav 1,karakterisert vedat næringsmiddelet er soyabasert, er fortrinnsvis valgt fra soyamel, soyakorn, grovt soyamel, soyaflak, soya melkepulver, soyaprotein konsentrat, soyaprotein-isolat og isolert soyapolypeptid.

4. Metode ifølge krav 1,karakterisert vedat næringsmiddelet (i) mangler oleosin før tilsetningstrinnet; eller (ii) omfatter oleosin før tilsetningstrinnet.

5. Metode ifølge krav 3,karakterisert vedat (i) soyaprotein-isolatet er en høymolekylvektfraksjon av et soyamateriale behandlet med en protease; eller (ii) det isolerte soyapolypeptidet omfatter p-konglycinin, eller et fragment derav; eller (iii) det isolerte soyapolypeptidet er glycinin, eller et fragment derav.

6. Sammensetning for behandling eller forebygging av hyperkolesterolemi,karakterisert vedat den omfatter: (a) glycinin og/eller P-konglycinin, eller fragmenter derav; (b) oleosin; og (c) fosfolipid, hvor oleosin er tilstede i en mengde på omtrent 5% eller mer i vekt, idet fosfolipidet er tilstede i en mengde som ikke er mindre enn 2 vekt-% og hvor glycinin og/eller p-konglycinin er tilstede i en mengde som er effektiv for å tilveiebringe en synergistisk effekt for behandling eller forebygging av hyperkolesterolemi i et individ som trenger dette.

7. Sammensetning ifølge krav 6,karakterisert vedat (i) glycinin eller P-konglycinin er minst delvis hydrolysert ved et enzym eller en blanding av enzymer; eller (ii) definert å omfatte glycinin, eller fragmenter derav, og renset oleosin; eller (iii) definert å omfatte P-konglycinin, eller fragmenter derav og renset oleosin; eller (iv) hvor sammensetningen omfatter mer enn omtrent 10% oleosin; eller (v) hvor sammensetningen omfatter omtrent 30% til omtrent 50% oleosin.

8. Sammensetning ifølge krav 6,karakterisert vedat den videre omfatter minst en additivforbindelse, hvor den additive forbindelsen er valgt fra et saponin, et fytoøstrogen og et karbohydrat vesentlig resistent overfor fordøying.

9. Sammensetning ifølge krav 8,karakterisert vedat fytoøstrogenet omfatter et isoflavon, fortrinnsvis er isoflavonet valgt fra genistein, diadzein, equol, biochanin A, formononetin og deres respektive naturlige forekommende glukosider og glukosidkonjugater.

10. Sammensetning ifølge krav 8,karakterisert vedat (i) karbohydratet er valgt fra høy amylasestivelse, oligofruktose og soyakotyledonfiber; eller (ii) fosfolipidene er valgt fra lecitin, lyso-lecitin og lecitin med en modifisert fettsyresammensetning; eller (iii) saponin er valgt fra et soyasaponin A, saponin B, saponin E, sapogenol A, sapogenol B og sapogenol E.

11. Sammensetning ifølge krav 8,karakterisert vedat oleosinet omfatter lipoprotein, fortrinnsvis er lipoproteinet et pattedyrlipoprotein, eggeplommelipoprotein eller fettglobulmembran protein.

12. Sammensetning ifølge krav 8,karakterisert vedat oleosinet er lav-molekylvektfraksjonen av oleosin.

13. Sammensetning ifølge krav 6,karakterisert vedat glycinin er den basiske subenheten av glycinin, fortrinnsvis er den basiske subenheten av glycinin B-1b subenheten.

14. Sammensetning ifølge krav 6,karakterisert vedat P-conglycininet er a' subenheten eller et fragment derav.

15. Sammensetning ifølge krav 6,karakterisert vedat den er videre definert (i) å omfatte mer enn 40% p-konglycinin eller et fragment derav; eller (ii) å omfatte en eller flere polypeptidsekvenser valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:1, SEKV ID NR: 2, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 4, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 6, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 10 og SEKV ID NR: 11.

16. Næringsmiddel egnet for behandling eller forebygging av hyperkolesterolemi, og kan oppnås ved tilsetning av oleosin og et fosfolipid til et valgt næringsmiddel, idet oleosinet blir tilsatt til en endelig konsentrasjon på omtrent 5% eller mer i vekt, og hvor fosfolipidet er omfattet i en mengde ikke mindre enn 2 vekt-%.

17. Næringsmiddel ifølge krav 16,karakterisert vedat minst en ytterligere forbindelse valgt fra et saponin, et fytoøstrogen og et karbohydrat vesentlig resistent overfor fordøying blir tilsatt.

18. Næringsmiddel ifølge krav 16,karakterisert vedat (i) næringsmiddelet er soya-basert; eller (ii) næringsmiddelet mangler oleosin før tilsetningstrinnet.

19. Næringsmiddel ifølge krav 16,karakterisert vedat det omfatter oleosin før trinnet med tilsetning, fortrinnsvis er næringsmiddelet valgt fra soyamel, soyakorn, grovt soyamel, soyaflak, soyamelkepulver, soyaprotein-konsentrat, soyaprotein-isolat og isolert soyapeptid.

20. Næringsmiddel ifølge krav 19,karakterisert vedat (i) soyaproteinisolatet er høymolekylvekt fraksjonen av et soyamateriale behandlet med en protease; eller (ii) det isolerte soyapolypeptidet omfatter p-konglycinin, eller fragment derav; eller (iii) det isolerte soyapolypeptidet er glycinin, eller et fragment derav.

21. Anvendelse av en sammensetning som omfatter oleosin og fosfolipid i en mengde på omtrent 5% eller mer i vekt og ikke mer enn 2 vekt-% for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av hyperkolesterolemi eller en kardiovaskulær sykdom.

22. Anvendelse ifølge krav 21, hvor medikamentet er i form av en pille eller kapsel, eller er et næringsmiddelsupplement.

23. Anvendelse ifølge krav 21, idet den kardiovaskulære sykdommen blir forebygget ved redusering av konsentrasjonen av totalt serumkolesterol, fortrinnsvis blir serumkolesterolkonsentrasjonen redusert ved redusering av konsentrasjonen av lav tetthet lipoprotein, eller ved å øke konsentrasjonen av høy tetthet lipoprotein.

24. Anvendelse ifølge krav 21, idet den kardiovaskulære sykdommen (i) blir forebygget ved redusering av konsentrasjonen av serum triglycerider; eller (ii) blir behandlet ved redusering av konsentrasjonen av leverkolesterol.