MXPA04010310A

MXPA04010310A - Composiciones de proteina asociadas con aceite corporal y metodos de uso de las mismas para reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares.

Info

Publication number: MXPA04010310A
Application number: MXPA04010310A
Authority: MX
Inventors: Kanthasamy Karunanandaa
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2002-04-18
Filing date: 2003-04-17
Publication date: 2005-02-17
Also published as: JP5219326B2; KR20050060031A; CA2482464A1; BRPI0309421A8; AU2003221982B2; IL164647A0; CN1662142A; US20050214346A1; IL164647A; EP1494536A1; WO2003088749A1; BRPI0309421B1; CN102240040B; NO20044575L; CN102240040A; JP2005523007A; EP1494536A4; NZ536466A; BR0309421A; US7541329B2

Abstract

Se proporcionan composiciones y metodos para reducir la hipercolesterolemia y, en consecuencia, el riesgo de una enfermedad cardiovascular; tales composiciones pueden comprender proteinas aisladas asociadas con aceite corporal; ademas se proporcionan provisiones a las cuales una o mas proteinas asociadas con el aceite corporal se han anadido; las composiciones empleadas en la invencion pueden comprender tambien compuestos aditivos, por ejemplo una saponina, una isoflavona, un fosfolipido, un carbohidrato sustancialmente resistente a la digestion, o una combinacion de los mismos; los metodos y composiciones de la invencion se pueden usar para disminuir los niveles de colesterol y de otros lipidos en sujetos para lograr una reduccion en el riesgo de una enfermedad cardiovascular.

Description

COMPOSICIONES DE PROTEINA ASOCIADAS CON CUERPO OLEOSO. Y METODOS DE USO DE LAS MISMAS PARA REDUCIR EL RIESGO DE ENFERMEDAD CARDIOVASCULAR Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud de patente provisional de E.U.A. número de serie 60/373,460, presentada en abril 18 de 2002, cuya descripción se incorpora especificamente en la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a composiciones, polipéptidos y métodos novedosos para reducir los niveles de colesterol y disminuir el riesgo de enfermedad cardiovascular. Más particularmente, la invención se refiere a composiciones novedosas que comprenden proteínas asociadas con cuerpo oleoso, y al uso de las mismas para la prevención y el tratamiento de colesterol elevado y enfermedad cardiovascular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La enfermedad cardiovascular es una causa principal de morbilidad y mortalidad dentro de la población humana. Este es particularmente el caso en los Estados Unidos y en los países de Europa Occidental. Numerosos factores causales se han implicado en el desarrollo de enfermedad cardiovascular. Varios de estos factores incluyen predisposición hereditaria a la enfermedad, factores de estilo de vida tales como el fumar y la dieta, y la edad, sexo, hipertensión e hiperlipidemia, incluyendo hipercolesterolemia. Muchos de estos factores, en particular la hiperlipidemia y la hipercolesterolemia, favorecen el desarrollo de aterosclerosis, una causa primaria de enfermedad cardiovascular. La alta concentración de colesterol en sangre, es uno de los factores de riesgo principales para enfermedad cardiovascular en humanos. El colesterol total y el colesterol de lipoproteína de baja densidad ("LDL") elevados, se relacionan directamente con un riesgo incrementado de enfermedad cardiaca coronaria (Anderson et al., 1987). Aunque los altos niveles de colesterol total y LDL son factores de riesgo en el desarrollo de aterosclerosis y enfermedades vasculares, se ha reconocido recientemente una deficiencia de colesterol de lipoproteína de alta densidad ("HDL") como un factor de riesgo adicional para el desarrollo de estas condiciones. Varias pruebas clínicas apoyan la teoría de una función protectora del HDL contra la aterosclerosis. Uno de dichos estudios ha demostrado que, en mujeres, cada incremento de 1 mg/dl en HDL en la sangre disminuye el riesgo de enfermedad vascular coronaria en 3% (Gordon et al., 1989). Los estudios han indicado que los cambios de dieta pueden reducir el colesterol en humanos. De estos, estudios particulares han indicado que la calidad, así como la cantidad de proteína ingerida, afectan ampliamente los niveles de colesterol en suero (Carol y Hamilton, 1975; Nagaoka et al., 1992; Potter, 1995). La ingestión de materiales de proteína vegetal en lugar de proteína animal en la dieta, se asocia con un menor riesgo de enfermedad cardiovascular, que puede reflejar decrementos en los niveles de colesterol en suero. En particular, se ha mostrado que la proteína de soya, una proteína vegetal, reduce los niveles de colesterol en suero respecto a la proteína animal caseína (Nagaoka et al., 1999). Un meta-análisis más reciente de los efectos de la ingestión de proteína de soya sobre los lípidos en suero en humanos, ha mostrado que la proteína de soya de la dieta se relaciona significativamente con la disminución de las concentraciones de colesterol total y LDL en suero en humanos, sin afectar significativamente las concentraciones de HDL-colesterol (Anderson et al., 1995). Uno de los agentes responsables de la capacidad de la proteína de soya para disminuir el colesterol, es la fracción de alto peso molecular (HMF). La HMF constituye la porción no digerible de la proteína de soya que queda intacta después de la digestión proteolítica. Por lo tanto, esta fracción se forma de muchos péptidos diferentes, o fragmentos de los mismos. De hecho, se ha mostrado que la HMF de la proteína de soya disminuye significativamente el colesterol en suero en estudios en animales y humanos. Se piensa que la HMF no digerible previene la captación de colesterol mediante la prevención de la captación pasiva de colesterol por la membrana del borde en cepillo, o mediante la prevención de la captación de colesterol mediadas por proteínas. En contraste, se ha mostrado realmente que la fracción de peso molecular menor, una fracción digerible de la proteína de soya, aumenta el colesterol en suero (Sugano, et al., 1988). A pesar del valor terapéutico potencial de la proteína de soya, y en particular la HMF, como un agente que disminuye los niveles de colesterol, no se ha determinado los constituyentes específicos responsables de su actividad no digestiva e hipocolesterolémica. Por lo tanto, continúa habiendo la necesidad de identificar estos constituyentes activos en un esfuerzo por proveer un agente terapéutico que sea más potente para reducir el colesterol y otros factores de riesgo asociados con enfermedad cardiovascular.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la invención provee un método para preparar un producto alimenticio, el cual comprende los pasos de: (a) obtener un producto alimenticio seleccionado; y (b) añadir proteína asociada con cuerpo oleoso aislada al producto alimenticio, en donde el consumo de una cantidad efectiva del producto alimenticio disminuye el colesterol en suero de un sujeto que necesita del mismo. En ciertas modalidades, el método comprende además añadir por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de una saponina, un fitoestrógeno, un fosfolípido y un carbohidrato sustancialmente resistente a la digestión. La proteína asociada con cuerpo oleoso puede comprender lipoproteínas y/u oleosina. En una modalidad, el producto alimenticio se basa en soya. Las composición puede carecer o comprender proteína asociada con cuerpo oleoso antes del paso de adición. Ejemplos de productos alimenticios incluyen, pero no se limitan específicamente a, harina de soya, grano de soya, harina integral de soya, hojuelas de soya, leche de soya en polvo, concentrado de proteína de soya, aislado de proteína de soya y polipéptido de soya aislado. En ciertas modalidades de la invención, el aislado de proteína de soya es una fracción de alto peso molecular de un material de soya tratado con una proteasa. En otras modalidades, el polipéptido de soya aislado comprende ß-conglicinína, o un fragmento de la misma, y/o es glicinina, o un fragmento de la misma. En otro aspecto, la invención provee una composición para tratar o prevenir hipercolesterolemia, que comprende: (a) glicinina y/o ß-conglicinina, o fragmentos de las mismas; y (b) proteína asociada con cuerpo oleoso, en donde la glicinina y/o la ß-conglicinina y la proteína asociada con cuerpo oleoso están presentes en una cantidad efectiva para proveer un efecto sinergístico para el tratamiento o prevención de hipercolesterolemia, en un sujeto que necesita de la misma. En una modalidad, la glicinina o ß-conglicinina es por lo menos parcialmente hidrolizada por una enzima o una mezcla de enzimas. En otras modalidades, la composición comprende glicinina, o fragmentos de la misma, y proteína asociada con cuerpo oleoso purificada, y en otra modalidad, comprende ß-conglicinina, o fragmentos de la misma, y proteína asociada con cuerpo oleoso purificada. En ciertas modalidades de la invención, la composición puede comprender de alrededor de 1 % a aproximadamente 5%, de alrededor de 5% a aproximadamente 10%, más de alrededor de 10%, o de alrededor de 30% a aproximadamente 50% de proteína asociada con cuerpo oleoso, en peso. Una composición provista por la invención puede comprender además por lo menos un compuesto aditivo, incluyendo una saponina, un fitoestrógeno, un fosfolípido y un carbohidrato sustancialmente resistente a la digestión. Un ejemplo de fitoestrógeno incluye una isoflavona. Ejemplos de isoflavonas incluyen genisteína, daidzeína, equol, bíochanina A, formononetina, y sus glucósidos de ocurrencia natural y conjugados de glucósidos respectivos. Ejemplos de carbohidrato incluyen almidón de alto contenido de amilosa, oligofructosa y fibra de cotiledones de soya. En una modalidad de la invención, el fosfolípido se selecciona del grupo que consiste de lecitina, liso-lecitína y lecitina con una composición de ácido graso modificada. En otras modalidades, la saponina se selecciona del grupo que consiste de saponina A, saponina B, saponina E, sapogenol A, sapogenol B y sapogenol E de soya. La proteína asociada con cuerpo oleoso puede comprender lipoproteína, incluyendo lipoproteína de mamífero, lipoproteína de la yema del huevo o proteína de membrana de glóbulo de grasa. La proteína asociada con cuerpo oleoso puede ser también oleosina, incluyendo la fracción de oleosina de bajo peso molecular. En una modalidad de la invención, la proteína asociada con cuerpo oleoso comprende un fragmento de polipéptido que contiene una secuencia anfipática. En donde la composición comprende glicinina, puede comprender la subunidad básica de glicinina, incluyendo la subunidad B-1 b.

La composición puede comprender también ß-conglicinina, incluyendo la subunidad ce', o un fragmento de la misma. Puede definirse además que la composición comprende más de 40% de ß-conglicinina, o un fragmento de la misma. Puede definirse además que la composición comprende una o más secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 1 1. En otro aspecto, la invención provee un método para el tratamiento o prevención de hipercoiesterolemia, el cual comprende los pasos de: (a) añadir proteína asociada con cuerpo oleoso a un producto alimenticio seleccionado; y (b) proveer el producto alimenticio a un sujeto que necesita del mismo, en una cantidad suficiente para tratar o prevenir hipercoiesterolemia. El método puede comprender además añadir por lo menos un compuesto al producto alimenticio, seleccionado del grupo que consiste de una saponina, un fitoestrógeno, un fosfolípido y un carbohidrato sustancialmente resistente a la digestión. En una modalidad, la proteína asociada con cuerpo oleoso comprende lipoproteínas, por ejemplo, oleosina. En otra modalidad, el producto alimenticio se basa en soya. Ejemplos de productos alimenticios incluyen harina de soya, grano de soya, harina integral de soya, hojuelas de soya, leche de soya en polvo, concentrado de proteína de soya, aislado de proteína de soya y polipéptido de soya aislado. El producto alimenticio puede carecer o comprender proteína asociada con cuerpo oleoso antes del paso de adición. El aislado de proteína de soya puede comprender una fracción de alto peso molecular de un material de soya tratado con una proteasa. En ciertas modalidades de la invención, el polipéptido de soya aislado comprende ß-conglicinina, o un fragmento de la misma, y/o es glicinina, o un fragmento de la misma. En otro aspecto, la invención provee un método para el tratamiento o prevención de hipercolesterolemia, el cual comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de proteína asociada con cuerpo oleoso purificada, a un sujeto que necesita del mismo. La composición farmacéutica puede administrarse en cualquier forma, incluyendo como una pildora o cápsula o como un complemento nutricional. En el método, la enfermedad cardiovascular puede prevenirse disminuyendo la concentración de colesterol total o triglicéridos en suero y/o hígado. La concentración de colesterol en suero puede reducirse disminuyendo la concentración de lipoproteína de baja densidad, y aumentando la concentración de lipoproteína de alta densidad. En otro aspecto, se provee un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 95% de homología de secuencias con la misma, y que tiene la misma actividad biológica de la misma.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención, se entenderán mejor con respecto a la descripción, reivindicaciones anexas y figuras acompañantes siguientes, en donde: La figura 1 describe la secuencia de la proteína oleosina P24, isoforma A de oleosina (P89) de soya, número de acceso P29530, y que corresponde a SEQ ID NO: 12. La figura 2 describe la secuencia de la proteina oleosina P24, isoforma B de oleosina (P91 ) de soya, número de acceso P29531 , y que corresponde a SEQ ID NO: 13. La figura 3 describe la secuencia de aminoácidos de la proteína asociada con cuerpo oleoso, oleosina de 17 kDa (oleo17) del maíz (Zea mays) (número de acceso AAA68066), y que corresponde a SEQ ID NO: 14. La figura 4 describe la secuencia de aminoácidos de la proteína asociada con cuerpo oleoso, oleosina de 16 kDa (oleo16) del maíz (Zea mays) (número de acceso AAA68065), y que corresponde a SEQ ID NO: 15. La figura 5 describe la secuencia de aminoácidos de la oleosina KD18 (KD18; L2) del maíz (Zea mays) (número de acceso AAA67699), y que corresponde a SEQ ID NO: 16. La figura 6 describe la secuencia de aminoácidos de la oleosina de H. annuus (girasol) (número de acceso CAA55348), y que corresponde a SEQ ID NO: 17.

La figura 7 describe cinco bandas que contienen polipéptidos de un gel, las cuales se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de la HMF del aislado de proteína de soya denominado OBAP(+). La figura 8 describe proteínas asociadas con cuerpo oleoso (P34 y oleosinas) purificadas y separadas sobre un gel de poliacrilamida. La figura 9 describe un gel que contiene la HMF del aislado de proteína de soya digerido con pepsina producido a partir de soyas que carecen de glicininas G1. La figura 10 describe una gráfica que ilustra la inhibición de la captación de colesterol dependiente de la dosis por células Caco-2 del aislado de la HMF de OBAP (+) contra el aislado de proteína de soya OBAP(-), Las figuras 11A y 1 B describen gráficas que ilustran la diferencia entre la absorción de colesterol en presencia de sitostanol, contra la absorción de colesterol en presencia de la HMF nula en glicinina y nula en ala ß-conglicinina, demostrando de esta manera la diferencia en los mecanismos. La figura 12 describe un gel que ilustra la presencia de oleosina en cada una de las muestras. La figura 13 describe un gel que ilustra la presencia o ausencia de oleosina en las muestras indicadas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención supera las limitaciones de la técnica anterior, identificando composiciones con beneficios a la salud cardiovascular. En particular, un aspecto de la invención se refiere al descubrimiento de que proteínas asociadas con cuerpo oleoso tienen la capacidad de disminuir los niveles de colesterol. Aunque se sabe que componentes de la planta tales como la proteína de soya tienen actividad hipocolesterolémica, no se han caracterizado previamente los constituyentes particulares responsables de esta actividad. Por lo tanto, la presente invención se refiere al descubrimiento de la capacidad de proteínas asociadas con cuerpo oleoso, incluyendo oleosinas y lipoproteínas de la yema del huevo, para impartir sobre las proteínas de la planta una capacidad característica para disminuir el colesterol. Igualmente, la presente invención reside en la combinación sinergística de estos componentes particulares con materia vegetal tal como productos alimenticios de soya. Sin que sea limitado a alguna teoría en particular, se piensa que las proteínas asociadas con cuerpo oleoso previenen la digestión de péptidos bioactivos presentes en el material de soya, y de esta manera intensifican sinergísticamente la actividad hipocolesterolémica de la composición. Además, la presente invención se refiere a la combinación sinergística de componentes en combinación con material de soya y un componente aditivo seleccionado del grupo que consiste de una saponina, un fitoestrógeno, un fosfolípido y un carbohidrato sustancialmente resistente a la digestión, o cualquier combinación de los mismos, para intensificar además la actividad hipocolesterolémica de la combinación. La presente invención abarca también el uso terapéutico de estos péptidos, solos o en combinación con otros compuestos, para disminuir la concentración de colesterol total en la sangre, y en particular para disminuir la concentración de LDL-colesterol, para inhibir el desarrollo de enfermedad cardiovascular. Los cuerpos oleosos son pequeños organelos subcelulares esféricos que encapsulan triacilglicéridos almacenados, una reserva de energía usada por muchas plantas. Aunque presentes en la mayoría de las plantas y en tejidos diferentes, son particularmente abundantes en las semillas de oleaginosas, en donde van comúnmente en tamaño desde menos de una miera hasta unas cuantas mieras de diámetro. Los cuerpos oleosos comprenden típicamente triacilglicéridos, y están rodeados por lipoproteínas y proteínas. Una "proteína asociada con cuerpo oleoso" incluye todas estas proteínas y lipoproteínas y cualquiera de las mismas que se asocian físicamente con cuerpos oleosos. En plantas, las proteínas asociadas con cuerpo oleoso principales son oleosinas. Se han clonado y secuenciado oleosinas de muchas fuentes de plantas, incluyendo maíz, colza, zanahoria y algodón. Las oleosinas de diferentes especies están típicamente altamente conservadas.

I. Abreviaturas y definiciones Para facilitar el entendimiento de la invención, se definen a continuación muchos términos y abreviaturas como se usan en la presente. HMF = fracción de alto peso molecular. Como se usa en la presente, "fracción de alto peso molecular" se refiere a la fracción del aislado de proteína vegetal que queda después de digestión hidrolítica o química del aislado que puede separarse mediante centrifugación a 4,000 a 10,000 x g por 15 a 20 minutos a pH 6-7. Como se usa en la presente, "compuesto aditivo" se refiere en conjunto a un compuesto individual o un grupo de compuestos añadidos a la composición de la invención. Estos compuestos se seleccionan del grupo que consiste de saponina, fitoestrógeno, fosfolípido y carbohidrato. Como se usa en la presente, el término "aminoácido" se usa en su sentido más amplio, e incluye aminoácidos de ocurrencia natural, así como aminoácidos de ocurrencia no natural, incluyendo análogos y derivados de aminoácidos. Los últimos incluyen moléculas que contienen una porción de aminoácido. El experto en la técnica reconocerá, en vista de su amplia definición, que la referencia en la presente a un aminoácido incluye, por ejemplo, L-aminoácidos proteogénicos de ocurrencia natural; D-aminoácidos; aminoácidos químicamente modificados, tales como análogos y derivados de aminoácidos; aminoácidos no proteogénicos de ocurrencia natural, tales como norleucina, ß-alanina, ornitina, etc.; y compuestos químicamente sintetizados que tienen propiedades conocidas en la técnica por ser características de aminoácidos. Como se usa en la presente, el término "proteogénico" indica que el aminoácido puede incorporarse en un péptido, polipéptido o proteína en una célula a través de una vía metabólica. Como se usa en la presente, el término "sales farmacéuticamente aceptables'' abarca sales que se usan comúnmente para formar sales de metal alcalino y sales de adición de ácidos libres o bases libres. La naturaleza de la sal no es crítica, siempre que sea farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente, "secuencia de secreción" o "péptido de señal" o "secuencia de señal", significa una secuencia que dirige proteínas de membrana o secretorias recién sintetizadas hacia y a través de las membranas del retículo endoplásmico, o desde el citoplasma hacia el periplasma a través de la membrana interna de bacterias, o desde la matriz de las mitocondrias en el espacio interior, o desde el estroma de los cloroplastos en el tilacoide. La fusión de dicha secuencia con un gen que se expresará en un hospedero heterólogo, asegura la secreción de la proteína recombinante a partir de la célula hospedera. Como se usa en la presente, "polipéptido" y "oligopéptido" se usan recíprocamente, y significan un polímero de por lo menos dos aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Como se usa en la presente, "secuencia" significa el orden lineal en el cual ocurren los monómeros en un polímero, por ejemplo, el orden de aminoácidos en un polipéptido, o el orden de nucleótidos en un polinucleótido. Como se usa en la presente, "soyas enteras trituradas" incluyen, por ejemplo, un material de soya que se forma descascarando o moliendo soyas enteras, incluyendo el hollejo y germen de las soyas. Un material de soya entero triturado puede contener grasa inherente en soya, o puede estar desgrasado. Como se usa en la presente, "harina de soya" incluye, por ejemplo, un material de soya que contiene menos de 65% de contenido de proteína de soya en peso sobre una base libre de humedad, que se forma a partir de soyas descascaradas y que tiene un tamaño de partícula promedio de 150 mieras o menos. El término "harina de soya" puede incluir, por ejemplo, leche de soya en polvo. Una harina de soya puede contener grasa inherente en la soya, o puede estar desgrasada. Como se usa en la presente, "grano de soya" incluye, por ejemplo, un material de soya que contiene menos de 65% de contenido de proteína de soya en peso sobre una base libre de humedad, que se forma a partir de soyas descascaradas y que tiene un tamaño de partícula promedio de 150 mieras a 1000 mieras. Un grano de soya puede contener grasa inherente en la soya, o puede estar desgrasado. Como se usa en la presente, "harina integral de soya" incluye, por ejemplo, un material de soya que contiene menos de 65% de contenido de proteína de soya en peso sobre una base libre de humedad, que se forma a partir de soyas descascaradas que no están dentro de la definición de una harina de soya o un grano de soya. Una harina integral de soya puede contener grasa inherente en la soya, o puede estar desgrasada. Como se usa en la presente, "hojuelas de soya" incluyen, por ejemplo, un material de proteína de soya que es un material de soya descascarado que contiene menos de 65% de contenido de proteina de soya en peso sobre una base libre de humedad, que se forma descascarando soyas deshollejadas. Las hojuelas de soya pueden contener grasa inherente en la soya, o pueden estar desgrasadas. Como se usa en la presente, "concentrado de proteína de soya" incluye, por ejemplo, un material de proteína de soya preparado a partir de semillas de soya deshollejadas, limpias y enteras de alta calidad. El concentrado de proteína de soya puede prepararse removiendo la mayor parte del aceite y los constituyentes no de proteína solubles en agua, y contiene típicamente no menos de 65% de proteína sobre una base libre de humedad. En otra modalidad, puede considerarse también que el "concentrado de proteína de soya" comprende además mezclas de proteínas de soya y fosfolípidos, en donde la proteína total sobre una base libre de humedad está entre alrededor de 65 a aproximadamente 90% de proteína. Típicamente, esto se produce a partir de soyas desgrasadas y deshollejadas mediante tres procedimientos básicos: lixiviación en ácido (a aproximadamente pH 4.5), extracción con alcohol (aproximadamente 55-80%), y desnaturalizando la proteína con calor húmedo antes de la extracción con agua. El concentrado de proteína de soya poco soluble en agua (extracción con alcohol acuoso) se somete a calor (inyección de vapor o cocción de chorro) y trabajo mecánico (homogenización), para aumentar la solubilidad y funcionalidad. Cuando se hace referencia a mezclas de proteínas y fosfolípidos de soya, en donde la proteína total sobre una base libre de humedad está entre 65 y 90% de proteína, dicho material puede prepararse combinando aislado de proteína de soya con fosfolípidos, o fraccionando un complejo de fosfolípido: proteína de soyas (es decir, proteínas asociadas con cuerpo oleoso y fosfolípidos asociados). El término "concentrado de proteína de soya" puede incluir, por ejemplo, leche de soya en polvo. Como se usa en la presente, "extracto de proteína de soya" incluye, por ejemplo, concentrado de proteína de soya o aislado enriquecido en ciertas proteínas de soya. Un material de proteína de soya fraccionado a partir del material de proteína de soya entero puede prepararse, por ejemplo, a partir de desperdicios de ingredientes de proteína de soya, o corrientes de suero (pasos de extracción de agua con alcohol o ácidos). Como se usa en la presente, "aislado de proteína de soya" incluye, por ejemplo, un material de proteína de soya que es la fracción proteinácea principal de soyas preparadas a partir de soyas deshollejadas removiendo la mayoría de los compuestos no de proteína, y no contiene de preferencia menos de 90% de proteína sobre una base libre de humedad. En otra modalidad, puede considerarse también que "aislado de proteína de soya" incluye además materiales de proteína de soya enriquecidos en ciertos tipos de proteínas de soya tales como, por ejemplo, ß-conglicininas, glicininas y oleosinas, o en forma alternativa que carecen de ciertos tipos de proteínas de soya, tales como oleosinas. La proteína se extrae típicamente de hojuelas de soya desgrasadas no calentadas con agua o álcali suave en una escala de pH de 8 a 9, seguida de centrifugación para remover el residuo fibroso insoluble; ajustando el extracto resultante a pH a 4.5, en donde la mayor parte de la proteína se precipita como una cuajada; separando la cuajada mediante centrifugación a partir de los oligosacáridos solubles, seguido de lavados múltiples, neutralizada con hidróxido de sodio o potasio (para hacerla más soluble y funcional), tratada con calor (por ejemplo, usando una estufa de chorro) y secada por aspersión. La adición de proteasas antes del paso de tratamiento con calor, puede usarse también para hidrolizar parcialmente las proteínas y mejorar la solubilidad de los aislados de proteína de soya. Como se usa en la presente, "péptido" y "proteína" se usan recíprocamente, y significan un compuesto que consiste de dos o más aminoácidos que se enlazan mediante enlaces peptídicos. Como se usa en la presente "proteína recombinante" significa que la proteína, ya sea que comprenda una secuencia de aminoácidos nativa o primaria mutante, se obtiene por expresión de un gen llevado por una molécula de ADN recombinante en una célula diferente de la célula en la cual ese gen y/o proteína se encuentra en forma natural. En otras palabras, el gen es heterólogo al hospedero en el cual se expresa. Debe observarse que cualquier alteración de un gen, incluyendo la adición de un polinucleótido que codifique para una porción de purificación por afinidad al gen, hace que ese gen sea no natural para los propósitos de esta definición, y de esta manera ese gen no puede encontrarse "en forma natural" en cualquier célula. Como se usa en la presente, "secuencia de elección de objetivo" significa en el contexto de proteínas o péptidos, una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos, cuya presencia resulta en una proteína que es dirigida hacia un destino particular dentro de una célula. La frase "terapéuticamente efectivo" indica la capacidad de un agente para prevenir o mejorar la severidad de la enfermedad, mientras evita efectos secundarios adversos asociados típicamente con terapias alternativas. Se entenderá que la frase "terapéuticamente efectiva" equivale a la frase "efectiva para el tratamiento o prevención", y ambas están destinadas para calificar, por ejemplo, la cantidad de las composiciones usadas en los métodos de la presente invención que lograrán el propósito de disminuir el riesgo de enfermedad cardiovascular o de prevenir dicha enfermedad, mientras evita efectos secundarios adversos asociados típicamente con terapias alternativas.

II. Polipéptidos de la invención Los solicitantes han identificado secuencias de polipéptidos aisladas de material de soya, y más específicamente de la HMF de material de soya, que tienen actividad hipocolesterolémica. Estas secuencias codifican para péptidos de glicinina o ß-conglicinina. Las proteínas glicinina y ß-conglicinina son proteínas de reserva de la semilla. La glicinina tiene un peso molecular aproximado de 320 kilodaltons ("kDa"), y se forma de seis subunidades, cada una de las cuales consiste de una subunidad ácida y una subunidad básica. Además, la ß-conglicinina tiene un peso molecular aproximado de 150 kDa, y se forma de tres tipos diferentes de subunidades (a, a' y ß) en proporciones variables. Las proteínas tipo glicinina y ß-conglicinina están altamente conservadas a través de diferentes especies vegetales. Por lo tanto, un aspecto de la presente invención abarca uno a varios polipéptidos aislados o fragmentos de polipéptidos de una proteína glicinina. En una modalidad, la secuencia del polipéptido aislado se provee en SEQ ID NO: 1 , y corresponde a VFDGELQEGRVLIVPQNFVVAARSQSDNFEYVSFK. En otro aspecto de la presente invención, se proveen uno a varios polipéptidos aislados o fragmentos de polipéptidos de una proteína ß-conglicinina. En una modalidad, la secuencia del polipéptido aislado se provee en SEQ ID NO: 2, y corresponde a LRMITLAIPVNKPGRFESFFL. En otra modalidad, la secuencia del polipéptido aislado se provee en SEQ ID NO: 3, y corresponde a IFVIPAGYPVWNATSHLNFFAIGI. En otra modalidad, la secuencia del polipéptido aislado se provee en SEQ ID NO: 4, y corresponde a LQESVIVEISKK. En otra modalidad, la secuencia del polipéptido aislado se provee en SEQ ID NO: 5, y corresponde a QQQEEQPLEVRK. En otra modalidad, la secuencia del polipéptido aislado se provee en SEQ ID NO: 6, y corresponde a NQYGHVR. En otra modalidad, la secuencia del polipéptido aislado se provee en SEQ ID NO: 7, y corresponde a AIVILVINEGDANIELVGL. En otra modalidad, la secuencia del polipéptido aislado se provee en SEQ ID NO: 8, y corresponde a NILEASYDTKFEEINK. En otra modalidad, la secuencia del polipéptido aislado se provee en SEQ ID NO: 11 , y corresponde a IFVIPAGYPVWNATSDLNFFAFGI. Los solicitantes han identificado también secuencias de oleosinas que demuestran actividad hipocolesterolémica. Las oleosinas se encuentran principalmente en constituyentes de membrana de cuerpos oleosos de plantas. Las proteínas oleosinas comprenden tres dominios; los dos extremos de la proteína, los extremos amino y carboxilo, son principalmente hidrofílicos y residen sobre la superficie del cuerpo oleoso expuesto al citosol, mientras que el núcleo central altamente hidrofóbico de la oleosina está anclado firmemente dentro de la membrana, y triacilglicérido. Las oleosinas contienen también un dominio alfa-helicoidal anfipático en o cerca del extremo carboxilo. Las oleosinas de diferentes especies representan una pequeña familia de proteínas que muestran conservación considerable de secuencias de aminoácidos, en particular en la región central de la proteína. Dentro de una especie individual, puede existir un pequeño número de isoformas diferentes. Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención abarca uno a varios polipéptidos aislados o fragmentos de polipéptidos de una proteína oleosina. En una modalidad, la oleosina es la ¡soforma A P24 (P89) de soya (número de acceso P29530; SEQ ID NO: 12), que corresponde a la figura 1.

En otra modalidad, la oleosina es la isoforma B P24 (P91 ) de soya (número de acceso P29531 ; SEQ ID NO: 13), que corresponde a la figura 2. En otra modalidad, la oleosina es la proteína asociada con cuerpo oleoso oleosina de 17 kDa (oleo17) del maíz (Zea mays) (número de acceso AAA68066; SEQ ID NO: 14), que corresponde a la figura 3. En otra modalidad, la oleosina es la proteína asociada con cuerpo oleoso oleosina de 16 kDa (oleo16) del maíz (Zea mays) (número de acceso AAA68065; SEQ ID NO: 15), que corresponde a la figura 4. En otra modalidad, la oleosina es la oleosina KD18 (KD18; L2) del maíz (Zea mays) (número de acceso AAA67699; SEQ ID NO: 16), que corresponde a la figura 5. En otra modalidad, la oleosina es la oleosina de H. annuus (girasol) (número de acceso CAA55348; SEQ ID NO: 17), que corresponde a la figura 6. En otra modalidad, la secuencia del polipéptido de oleosina aislado se provee en SEQ ID NO: 9, y corresponde a VKFITAATIGITLLLL. En otra modalidad, la secuencia del polipéptido de oleosina aislado se provee en SEQ ID NO: 10, y corresponde a YETNSSLNNPPSR. Incluidos también en la presente invención, son polipéptidos que tienen 90%, de preferencia 95%, más preferiblemente 97%, y aún más preferiblemente 99% de homología de secuencias con la oleosina y las secuencias de SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16 y 17. Otra modalidad de la invención provee polipéptidos que tienen 90%, de preferencia 95%, más preferiblemente 97%, y aún más preferiblemente 99% de homología de secuencias con cualquiera de las secuencias de SEQ ID NOs: 1-1 1.

El término "homología", como es bien entendido en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, que se determina comparando las secuencias. En la técnica, el término "homología" significa también el grado de relación de secuencias entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, que se determina por la correspondencia entre hileras de dichas secuencias. El término "homología" puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos que incluyen, pero no están limitados a, los descritos en Computational Molecular Biology, 1988: Biocomputing: Informatics and Genome Projects, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, parte I, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, 1987; Sequence Analysis Primer, 1991 ; y Carillo y Lipman, 1988. Métodos para determinar la homología están diseñados para dar la correspondencia más grande entre las secuencias puestas a prueba. Además, métodos para determinar la homología están codificados en programas públicamente disponibles. Programas de cómputo que pueden usarse para determinar la identidad/homología entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados a, GCG (Devereux, et al., 1984); serie de los cinco programas BLAST, tres diseñados para consultas de secuencias de nucleótidos (BLASTN, BLASTX y TBLASTX), y dos diseñados para consultas de secuencias de proteína (BLASTP y TBLASTN) (Coulson, 1994; Birren, et al., 1997). El programa BLAST X está disponible públicamente del NCBI y otras fuentes (BLAST Manual; Altschul et al., 1990). El algoritmo bien conocido de Smith y Waterman puede usarse también para determinar la homología. La presente invención se refiere también a las proteínas aisladas. Como se usa en la presente, el término proteína incluye fragmentos, análogos y derivados de la proteína glicinina, ß-conglicinina u oleosina. La proteína de la presente invención puede ser una proteína natural, una proteína recombinante o una proteína sintética, o un polipéptido. Los expertos en la técnica saben que modificaciones en la secuencia de aminoácidos de un péptido, polipéptido o proteína pueden resultar en péptidos de segunda generación equivalentes o posiblemente mejorados, etc., que exhiben características funcionales equivalentes o superiores cuando se comparan con la secuencia de aminoácidos original. Por consiguiente, la presente invención abarca dichas secuencias de aminoácidos modificadas. Las alteraciones pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones, truncamientos, fusiones, entremezclado de secuencias de subunidades de aminoácidos, y similares, siempre que las secuencias peptídicas producidas por dichas modificaciones tengan sustancialmente las mismas propiedades funcionales que la contraparte, secuencias de ocurrencia natural, descritas en la presente. La actividad o función biológica puede determinarse, por ejemplo, por la capacidad de la proteína para reducir el colesterol en suero total en suero, como se describe en los ejemplos más adelante. Un factor que puede considerarse al hacer dichos cambios, es el índice hidropático de aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir función biológica interactiva sobre una proteína, ha sido descrita por Kyte y Doolittie (1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo de los aminoácidos favorece la estructura secundaria de la proteína resultante. Esto, a su vez, afecta la interacción de la proteína con moléculas tales como enzimas, substratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, etc. Con base en su carácter hidrofóbico y características de carga, a cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático de la manera siguiente: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteina/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1 .8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato/glutamina/aspartato/asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5). Como se sabe en la técnica, ciertos aminoácidos en un péptido o proteína pueden sustituir a otros aminoácidos que tienen un índice hidropático o calificación similar, y producen un péptido o proteína resultante que tiene actividad biológica similar, es decir, que retienen aún funcionalidad biológica. Al hacerse dichos cambios, se prefiere que los aminoácidos que tengan índices hidropáticos dentro de +2 sustituyan a algún otro. Sustituciones más preferidas, son aquellas en donde los aminoácidos tienen índices hidropáticos dentro de ±1. Sustituciones muy preferidas, son aquellas en donde los aminoácidos tienen índices hidropáticos dentro de ±0.5. Asimismo, los aminoácidos pueden ser sustituidos también con base en el carácter hidrofílico. La patente de E.U.A. No. 4,554,101 describe que el carácter hidrofílico promedio local más grande de una proteína, determinado por el carácter hidrofílico de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Se han asignado los siguientes valores de carácter hidrofílico a los aminoácidos: arginina/lisina (+3.0); aspartato/glutamato (+3.0 ±1 ); serina (+0.3); asparagina/glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 ±1 ); alanina/histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1 .3); valina (-1.5); leucina/isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); y triptófano (-3.4). De esta manera, un aminoácido en un péptido, polipéptido o proteína puede ser sustituido por otro aminoácido que tenga un valor de carácter hidrofílico similar, y produce aún una proteína resultante que tiene actividad biológica similar, es decir, reteniendo aún función biológica correcta. Al hacer dichos cambios, aminoácidos que tengan índices hidropáticos dentro de ±2 son sustituidos de preferencia por algún otro, aquellos dentro de ±1 son más preferidos, y aquellos dentro de ±0.5 son muy preferidos. Como se describió anteriormente, las sustituciones de aminoácidos en los péptidos de la presente invención pueden basarse en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral del aminoácido, por ejemplo, su carácter hidrofóbico, carácter hidrofílico, carga, tamaño, etc. Ejemplos de sustituciones que toman en consideración varias de las características anteriores para producir cambios conservativos de aminoácidos que resultan en cambios silenciosos dentro de los presentes péptidos, etc., pueden seleccionarse de otros miembros de la clase a la cual el aminoácido de ocurrencia natural pertenece. Los aminoácidos pueden dividirse en los cuatros grupos siguientes: (1 ) aminoácidos ácidos; (2) aminoácidos básicos; (3) aminoácidos polares neutros; y (4) aminoácidos no polares neutros. Aminoácidos representativos dentro de estos varios grupos incluyen, pero no están limitados a, (1 ) aminoácidos ácidos (cargados negativamente), tales como ácido aspártico y ácido glutámico; (2) aminoácidos básicos (cargados positivamente), tales como arginina, histidina y lisina; (3) aminoácidos polares neutros, tales como glicina, serina, treonina, cisteína, cistina, tirosina, asparagina y glutamina; y (4) aminoácidos no polares neutros, tales como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Debe notarse que cambios que no se espera sean ventajosos, pueden usarse también si éstos resultan en la producción de secuencias funcionales. El término proteína incluye también formas de la proteína a la cual se han añadido uno o más grupos sustituyentes. Un sustituyente es un átomo o grupo de átomos que se introduce en una molécula por reemplazo de otro átomo o grupo de átomos. Dichos grupos incluyen, pero no están limitados a, lípidos, grupos fosfato, azúcares y carbohidratos. De esta manera, el término proteína incluye, por ejemplo, lipoproteínas, glucoproteínas, fosfoproteínas y fosfolipoproteínas.

III. Composiciones y métodos de la invención Otro aspecto de la invención, provee composiciones que son útiles para el tratamiento o prevención de enfermedad cardiovascular. La composición en una modalidad abarca un producto alimenticio basado en plantas al cual se ha añadido proteína asociada con cuerpo oleoso aislada. En una modalidad de la invención, el producto alimenticio se basa en soya. En otra modalidad, la composición comprende un material de soya aislado, una proteína asociada con cuerpo oleoso aislada, y por lo menos un compuesto aditivo seleccionado del grupo que consiste de una saponina, un fitoestrógeno, un fosfolípido y un carbohidrato sustancialmente resistente a la digestión. En ciertas modalidades de la invención, una proteína asociada con cuerpo oleoso aislada, puede ser una fracción purificada aislada de proteína vegetal. Por ejemplo, la proteína asociada con cuerpo oleoso aislada puede ser enriquecida 1 , 0, 100, 200, 1000 o más veces respecto a las proteínas vegetales crudas. En ciertas modalidades de la invención, la proteína asociada con cuerpo oleoso aislada puede ser enriquecida para proteina asociada con cuerpo oleoso 1 , 5, 10, 50 o 100 o más veces respecto a, por ejemplo, una fracción purificada tal como la HMF. Un material de soya aislado usado en la presente invención puede prepararse y aislarse de cualquier planta de soya, al grado de que el material de soya aislado contenga los constituyentes necesarios para que el material de soya aislado exhiba la actividad hipocolesterolémica deseada. El material de soya aislado puede comprender, por ejemplo, soyas enteras trituradas, harina de soya, leche de soya en polvo, grano de soya, harina integral de soya, hojuelas de soya, concentrado de soya, aislado de proteína de soya y extractos de proteína de soya. En una modalidad, el material de soya es concentrado de soya. En otra modalidad, el material de soya es un aislado de proteína de soya. En otra modalidad, el material de soya es extracto de proteína de soya. Cualquier método conocido en la técnica, incluyendo los métodos que se detallan en la presente, puede usarse para aislar el material de soya particular. Un aspecto de la presente invención provee material de soya aislado enriquecido con ciertas proteínas o péptidos de soya, tales como ß-conglicininas, glicininas y oleosinas. Estos materiales de soya pueden prepararse a partir de aislados, concentrados, o de corrientes de desperdicios de fabricación de aislados y concentrados. Pueden prepararse también a partir de soyas con una composición de proteína modificada, tales como soyas que tengan el doble de los niveles normales de ß-conglicinina y niveles reducidos de glicinina (como se describe, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 6,171 ,640). La preparación de productos alimenticios es bien conocida por los expertos en la técnica. En el caso de la soya, su uso común en alimentos incluye, pero no está limitado a, productos tales como la semilla, brotes de frijol, soya horneada, harina de soya de grasa total usada en varios productos de cocción, soya tostada usada como confituras, manteca de nuez de soya, café de soya, y otros derivados de soya de alimentos orientales. Los productos de proteína de soya (por ejemplo, harina integral), pueden dividirse en concentrados y aislados de harina de soya que tengan uso industrial y como alimento/forraje. La harina y los granos de soya se usan con frecuencia en la fabricación de diluentes y análogos de carne, alimentos para mascotas, ingredientes de cocción, y otros productos alimenticios. Los productos alimenticios hechos de harina y aislado de soya, incluyen alimentos para bebés, productos de confitura, cereales, bebidas alimenticias, fideos, levadura, cerveza, cerveza de fermentación alta, etc. En ciertos aspectos de la presente invención, un material de soya aislado que carezca, o que contenga bajas cantidades de ciertos tipos de proteínas de soya tales como, por ejemplo, oleosinas, es fortificado con proteínas asociadas con cuerpo oleoso tales como, por ejemplo, oleosinas, mejorando o restaurando de esta manera las propiedades hipocolesterolémicas de la proteína de soya o la composición de proteína de soya. En otras modalidades de la invención, se añaden proteínas asociadas con cuerpo oleoso a una concentración final de aproximadamente 0.5%, 1 %, 3%, 5%, 10%, 20% o más en peso, incluyendo todas las escalas intermedias dentro de estas concentraciones. Dependiendo de la aplicación particular, materiales de soya sin oleosina, o con cantidades disminuidas de oleosina, pueden ser altamente benéficos. Por ejemplo, puede considerarse a las oleosinas como no deseables debido a que se unen a sabores que favorecen la calidad de sabor relativamente reducida de los alimentos de soya. Además, las oleosinas son también poco solubles, y favorecen la gran fracción de partículas cuando se dispersa leche de soya desgrasada en agua. En una modalidad, la oleosina puede removerse permitiendo que la gran fracción de partículas que contienen oleosina se asiente en un depósito, o usando membranas de ultrafiltración. En forma alternativa, las oleosinas pueden precipitarse del aislado de proteína de soya a pH 2.8 en presencia de sulfato de sodio y cloruro de calcio (Samoto et al., 1998). Abarcada también dentro de la presente invención, es una composición que comprende un material de soya aislado y una proteína asociada con cuerpo oleoso aislada, en donde el material de soya aislado es una fracción de alto peso molecular ( "HMF") de un aislado de proteína de soya. La HMF usada en cualquiera de las composiciones de la invención puede prepararse y aislarse de cualquier aislado de proteína vegetal en el cual ocurre en forma natural, al grado de que la fracción posee la actividad hipocolesterolémica deseada. En una modalidad, la HMF se prepara a partir de una fuente de proteína de soya. Materiales de soya típicos de los cuales la HMF puede prepararse, incluyen soyas, soyas deshollejadas, harina de soya, harina integral de soya, granos de soya, leche de soya en polvo, hojuelas de soya (llenas de grasa y desgrasadas), melazas de soya, concentrado de proteína de soya, suero de soya, proteína de suero de soya, y aislado de proteína de soya. En una modalidad preferida, la HMF se prepara a partir de un aislado de proteína de soya. Para preparar la HMF, el aislado de proteína vegetal seleccionado se somete a digestión hidrolítica o química. Agentes típicos usados para este proceso de digestión incluyen pepsina o proteasas microbianas. Típicamente, por ejemplo, la proteína de soya se incuba con la enzima pepsina durante 13 a 17 horas (NaCI a 0.2% en fase acuosa, 38°C, pH 1.1), siendo la enzima pepsina 0.5 a 5% del aislado de proteína de soya, se trata con calor durante 20 minutos a 90°C para inactivar la pepsina, se enfría sobre hielo, se ajusta a un pH de 6 a 7 con Na2C03, y se centrifuga a 4,500 g durante 20 minutos. Esta pella puede lavarse entonces tres veces con agua, y puede identificarse. Otros métodos de uso de la enzima pepsina son bien conocidos en la técnica. Proteasas microbianas pueden ser, por ejemplo, Sumizyme FP (proteasa de Aspergillus niger, actividad enzimática de 48800 U/gm, Shin Nippon Kagaku Kabushiki Kaisha), incubada con la proteína de soya a 60°C durante cinco horas. Cuando se usa dicha solución, más que ajusfando el pH, la solución se diluye con agua. Puede llevarse a cabo entonces centrifugación a 10,000 x g durante 10 minutos. El precipitado puede entonces colectarse e identificarse. Otros métodos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Hori et al. (1999). La HMF se aisla entonces del aislado de proteína vegetal digerido, mediante cualquier medio conocido generalmente en la técnica. En una modalidad, la HMF se aisla mediante centrifugación. Típicamente, el procedimiento de aislamiento puede llevarse a cabo, por ejemplo, desecando (por ejemplo, deshidratando por congelación) la fracción después de centrifugar una suspensión acuosa del aislado de proteína de soya que se trató con una proteasa o pepsina microbiana (la proteasa es 0.5-6% de la proteína total), e incubando a 30-70°C durante 1-20 horas. Otros métodos son bien conocidos en la técnica. Véase, Nagoako et al. ( 999). Además, cualquier péptido aislado de la H F puede usarse en la composición de la invención, al grado de que el péptido posea la actividad hipocolesterolémica deseada. Sin embargo, típicamente, el péptido usado en la composición tiene por lo menos 10 residuos de aminoácido de longitud, más típicamente de alrededor de 10 a aproximadamente 100 residuos de aminoácido de longitud, y muy típicamente tiene de alrededor de 30 a aproximadamente 80 residuos de aminoácido de longitud. Asimismo, hablando en términos generales, el péptido es de naturaleza sustancialmente hidrofóbica, teniendo aproximadamente más de 30 por ciento en peso a preferiblemente alrededor de más de 35 por ciento en peso de composición de aminoácidos hidrofóbicos. Además, el péptido usado puede tener 0, 1 ó más regiones anfipáticas. Además, el péptido usado puede tener una superficie hidrofóbica o región hidrofóbica que sea el resultado no de una hilera de aminoácidos hidrofóbicos, sino la estructura alfa-helicoidal del péptido. Otra modalidad de ia presente invención provee una composición que comprende polipéptidos de soya aislados, aislados del material de soya en donde los polipéptidos de soya comprenden ß-conglicinina y glicinina. La estructura de la ß-conglicinina y la glicinina se detalló anteriormente, y una revisión detallada de sus estructuras se provee en Utsumi et al. (1997). Sin que se limite a los solicitantes a una sola teoría, se piensa que estos péptidos imparten su actividad hipocolesterolémica debido a que son capaces de sobrevivir a la digestión y de ser absorbidos en la corriente sanguínea, o de unirse a los ácidos biliares. También benéfica, aunque no requerida, es la presencia de una región alfa-helicoidal anfipática dentro de la ß-conglicinina. Sin que se limite a los solicitantes a alguna teoría individual, se piensa que la presencia de una región alfa-helicoidal anfipática es benéfica debido a que forma una superficie hidrofóbica que facilita la interacción con varios sitios de receptor importantes para impartir actividad hipocolesterolémica. Además y sin que se limite a los solicitantes a alguna teoría individual, los polipéptidos identificados de la invención pueden servir también como una fuente de nitrógeno a bacterias benéficas en el colon. Estas bacterias pueden producir entonces ácidos grasos de cadena corta tales como ácido propiónico, que afectan positivamente el metabolismo de lípidos. Los ácidos grasos de cadena corta inhiben la síntesis de ácidos grasos en el hígado, disminuyendo los regímenes de secreción de triglicéridos, y reducen también la síntesis de colesterol hepático. Un aspecto de la invención es el uso de polipéptidos de proteína de soya para promover la producción de ácidos grasos de cadena corta en el colon, y reducir el colesterol y los triglicéridos en suero. La eficacia de los polipéptidos de soya no digeridos para promover el crecimiento de bacterias colónicas benéficas, será más significativa en presencia de carbohidratos no digeridos tales como almidón de maíz de alto contenido de amilosa que son un combustible importante para la microflora colónica humana. Por lo tanto, otra modalidad de la invención es la combinación de ingredientes de polipéptidos de soya con fuentes de carbohidratos no digeridos para optimizar los efectos benéficos de los polipéptidos sobre el colesterol y los triglicéridos en suero. Un aspecto de la invención provee, por lo tanto, composiciones que tienen polipéptidos específicos aislados de ß-conglicinina. Hablando en términos generales, estas secuencias de polipéptidos corresponden a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 11. Estas secuencias pueden aislarse de ß-conglicinina mediante un método, por ejemplo, que incluye (1 ) hidrólisis enzimática de material de soya, seguida de aislamiento de la fracción de alto peso molecular, por ejemplo, mediante centrifugación, o (2) enzimólisis de material de soya, seguida de purificación adicional mediante una membrana de ultrafiltración, columna de resina de intercambio iónico y cromatografía de columna de filtración en gel que da péptidos de una escala de peso molecular de alrededor de 200 a aproximadamente 5,000 daltons (véase, por ejemplo, el método detallado en Yamauchi y Suetsuna (1993)). Los péptidos pueden fraccionarse además usando cromatografía de intercambio iónico (Chen et al., 1995). En forma alternativa, más que aislar las secuencias individuales de las subunidades de ß-conglicinina particulares, también es posible usar soyas que tengan dos veces los niveles normales de ß-conglicinina, y aislar solamente la ß-conglicinina de las soyas. En forma similar, también es posible usar el mismo germoplasma, en donde sólo una subunidad de ß-conglicinina particular sea expresada para obtener preparaciones crudas de esta subunidad. Los péptidos activos se producen entonces después del consumo de las preparaciones crudas como resultado de hidrolización en el intestino por pepsina y pancreatinina, o se obtienen durante la fabricación de ingredientes usando enzimas microbianas. Por lo tanto, en otra modalidad de la invención, se provee una composición que comprende una preparación cruda de una subunidad particular de ß-conglicinina combinada con una preparación de oleosina. Otro aspecto de la invención provee composiciones que tienen polipéptidos específicos aislados de glicinina. En una modalidad, la composición contiene un polipéptido aislado de la subunidad básica de glicinina. En otra modalidad, la composición comprende un polipéptido aislado de la subunidad B-1b de glicinina. En una modalidad preferida, la composición comprende un péptido aislado de glicinina que corresponde a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Típicamente, la glicinina se aisla de fuentes de proteína usando procedimientos de aislamiento que son bien conocidos en la técnica. Un ejemplo de estos procedimientos de aislamiento, es el que se usa para aislar otros aislados de proteína, como se describió anteriormente. Las composiciones de la invención contienen también típicamente una proteína asociada con cuerpo oleoso. Como se usa en la presente, el término "proteína asociada con cuerpo oleoso" incluye cualquier proteína, lipoproteína o péptido asociado físicamente con una estructura de cuerpo oleoso o partícula de lípido intracelular. Hablando en términos generales, la mayoría de las células eucarióticas de especies tales como plantas, mamíferos, células no de mamífero, algas y levaduras, contienen partículas de lípidos intracelulares. Estas partículas se conocen como cuerpos lipidíeos, gotas lipídicas o, especialmente en plantas, cuerpos oleosos, oleosomas o esferosomas, dependiendo de la especie. Las partículas lipídicas de células eucarióticas consisten de un núcleo altamente hidrofobia) de lípidos neutros, principalmente triacilgliceroles y/o ésteres de esterilo, rodeados por una monocapa de fosfolípidos con una pequeña cantidad de proteínas incluidas. Una composición típica de cuerpos oleosos aislados del maíz, consiste en triacilgliceroles (95%), diacilgliceroles (4%), fosfolípidos (0.9%) y proteína (1.4%). Proteínas asociadas con cuerpo oleoso típicas útiles en las composiciones de la invención, incluyen proteínas de cuerpo oleoso tales como oleosinas en forma de apoproteínas o como lipoproteínas y una proteína de 34 kD de las vacuolas de almacenamiento de semillas de soya que se asocia con los cuerpos oleosos. Un aspecto de la invención provee, por lo tanto, una composición que comprende un material de soya aislado y un péptido aislado de una proteína asociada con cuerpo oleoso, en donde el péptido es una oleosina o un fragmento peptídico de una oleosina. La oleosina puede estar representada por las secuencias de la isoforma A de oleosina P24 (P89), número de acceso P29530, como se provee en SEQ ID NO: 12 y que corresponde a la figura 1 , isoforma B de oleosina P24 (P91 ), número de acceso P29531 , como se provee en SEQ ID NO: 13 y que corresponde a la figura 2, la proteína asociada con cuerpo oleoso oleosina de 17 kDa (oleo17), número de acceso AAA68066, como se provee en SEQ ID NO: 14 y que corresponde a la figura 3, la proteína asociada con cuerpo oleoso oleosina de 16 kDa (oleo 16), número de acceso AAA68065, como se provee en SEQ ID NO: 15 y que corresponde a la figura 4, la oleosina KD18 (KD18; L2), número de acceso AAA67699, como se provee en SEQ ID NO: 16 y que corresponde a la figura 5, y la oleosina de H. annuus, número de acceso CAA55348, como se provee en SEQ ID NO: 17 y que corresponde a la figura 6. Más típicamente, el péptido usado en la composición es de una oleosina de bajo peso molecular con un peso molecular aproximado de 17 kilodaltons. En ciertas modalidades, el péptido es de una oleosina, y corresponderá a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. El péptido de oleosina usado en la composición de la invención puede aislarse de cuerpos oleosos intactos. Hacia ese fin, pueden aislarse cuerpos oleosos intactos de semillas como una fuente de proteínas asociadas con cuerpo oleoso. Métodos y listas de tipos de semilla que pueden usarse se proveen, por ejemplo, en el documento WO 00/30602. Métodos para preparar cuerpos oleosos se describen también en la publicación de la solicitud de patente japonesa No. 2002-101820. El aceite puede extraerse de los cuerpos oleosos con éter dietílico, dejando los materiales interfaciales (oleosinas y fosfolípidos) en la fracción acuosa. Los fosfolípidos pueden extraerse usando cloroformo/metanol (2:1 , vol/vol) u otros solventes orgánicos adecuados. En particular, las oleosinas se aislan como la fracción agregada (Tzen y Huang, 1992). Además, puede usarse extracción a pH alto para remover la proteína P34, si está presente. La proteína P34 tiene un pH isoeléctrico menor de 6.5 y, por lo tanto, será soluble a pH alto, en donde las oleosinas tienen su pH isoeléctrico y se precipitan. Pueden aislarse también oleosinas de soyas enteras remojadas en agua, o de harina de soya desgrasada. La oleosina puede aislarse de fuentes de proteína usando procedimientos de aislamiento que son bien conocidos en la técnica. Un ejemplo de estos procedimientos de aislamiento es el que se usa para aislar oleosinas de harina de soya desgrasada, como se describió anteriormente. Otro ejemplo es el aislamiento de oleosinas de soyas enteras (véase documento JP 2002-101820). Otras fuentes de oleosinas incluyen células vegetales, células de hongos, células de levaduras (Leber et al., 1994), células bacterianas (Pieper-Fürst et al., 1994) y células de algas (Roessler, 1988). En modalidades preferidas de la invención, las oleosinas se obtienen de una célula vegetal que incluye células de polen, esporas, semillas y órganos vegetativos en los cuales oleosinas u organelos tipo cuerpo oleoso están presentes (Huang, 1992). Más preferiblemente, las oleosinas de la presente invención se obtienen de una semilla de la planta, y más preferiblemente del grupo de especies de plantas que comprenden: colza (Brassica spp.), soya (Glycine max), girasol (Helianthus annuus), palma de aceite (Elaeis guiñeéis), semilla de algodón (Gossypium spp.), cacahuate (Arachis hypogaeá), coco (Cocus nucífera), ricino (Ricinus communis), cártamo (Carthamus tinctorius), mostaza (Brassica spp. y Sinapis alba), coriandro {Coriandrum sativum), calabaza (Cucúrbita máxima), semilla de linaza/lino {Linum usitatissumum), nuez del Brasil (Bertholletia excelsa), jojoba (Simmondsia chinensis), maíz (Zea mays), crambe (Crambe abyssinica) y eruca (Eruca sativa). Otro aspecto de la invención, abarca una composición que comprende un material de soya aislado y un péptido aislado de una proteína asociada con cuerpo oleoso, en donde el péptido, es una lipoproteína. Las lipoproteínas son complejos no covalentes, no estequiométricos y en partículas de lípido neutro, fosfolípido y proteína presentes en células vegetales y animales. En una modalidad, la lipoproteína es una lipoproteína de mamífero. En otra modalidad, la lipoproteína es lipoproteína de la yema del huevo (para una revisión de la estructura de la yema del huevo véase, por ejemplo, Bringe (1997), cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia). En otra modalidad, la lipoproteína comprende una proteína de membrana de glóbulo de grasa. Las lipoproteínas pueden aislarse de fuentes de proteína asociadas con cuerpo oleoso, usando procedimientos que son bien conocidos en la técnica. Un ejemplo de estos procedimientos de aislamiento, es el que se usa para aislar proteínas de cuerpo oleoso u oleosinas de harina de soya desgrasada, como se describió anteriormente. Además, pueden aislarse lipoproteínas de la yema del huevo de fuentes de proteína asociadas con cuerpo oleoso, usando procedimientos de aislamiento que son bien conocidos 4 en la técnica. Como un ejemplo de estos procedimientos de aislamiento, pueden aislarse lipoproteínas de la yema del huevo extrayendo los triglicéridos y el colesterol usando dióxido de carbono supercrítico (véase, por ejemplo, Bringe y Cheng, 1995). Otro aspecto de la invención provee una composición que comprende un material de soya en combinación con una proteina asociada con cuerpo oleoso y un compuesto aditivo. El compuesto aditivo puede incluir cualquier compuesto que intensifique terapéuticamente la composición. Sin embargo, típicamente, el compuesto aditivo se selecciona del grupo que consiste de una saponina, un fitoestrógeno, un fosfolípido y un carbohidrato sustancialmente resistente a la digestión. Hablando en términos generales, sin que sea limitado a alguna teoría en particular, se piensa que estos compuestos aditivos intensifican la actividad hipocolesterolémica de la composición, previniendo sustancialmente la digestión de polipéptidos que disminuyen los niveles de colesterol en el material de soya aislado. Debido a estas propiedades, los compuestos aditivos de la invención incrementan la capacidad terapéutica de la composición. En una modalidad preferida, por consiguiente, las composiciones de la invención pueden tener cualquier combinación de los componentes aditivos específicos identificados anteriormente, en combinación con un material de soya aislado y una proteína asociada con cuerpo oleoso aislada. En una modalidad, por lo tanto, una composición de la presente invención puede incluir una a varias saponinas como un compuesto aditivo. La saponina puede aislarse de una fuente vegetal en la cual ocurre en forma natural mediante cualquier método conocido, tal como el método de Gurfinkel et al. (2002), o puede prepararse sintéticamente mediante cualquier método conocido. Cualquier saponina es adecuada para su uso en la presente invención al grado de que el compuesto seleccionado intensifica las propiedades de la composición para su uso como un agente hipocolesterolémico. Sin embargo, típicamente, la saponina usada se aisla de una leguminosa, tal como plantas de alfalfa o soya, o de avenas u otras semillas. Más típicamente, la saponina se aisla de semillas de soya, y más específicamente puede aislarse de germen de soya. Fuentes de saponinas incluyen, por ejemplo, soyas, quillaja, alfalfa y hierba jabonera. Saponinas de soya incluyen, por ejemplo, saponina A, B, E y sapogenol A, B y E. Además, una composición de la invención puede incluir uno a varios fitoestrógenos como un compuesto aditivo. El fitoestrógeno puede aislarse de una fuente vegetal en la cual ocurre en forma natural mediante cualquier método conocido, tal como el método que se detalla en la patente de E.U.A. No. 5,855,892 o en el documento WO 00/30663, o puede prepararse en forma sintética mediante cualquier método conocido. Cualquier fitoestrógeno es adecuado para su uso en la presente invención, al grado de que el compuesto seleccionado intensifica las propiedades de la composición para su uso como un agente hipocolesterolémico. Típicamente, el fitoestrógeno usado en la composición es una isoflavona. Más típicamente, la isoflavona es genisteína, daidzeína (incluyendo sus metabolitos o- desmetilangolensina, dihidroclaidzeína y equol), biochanina A, formononetina, y sus glucósidos y conjugados de glucósidos de ocurrencia natural respectivos presentes en soyas o trébol. Una composición de la invención puede incluir también uno a varios fosfolípidos como un compuesto aditivo. Los fosfolípidos pueden ser de varias fuentes, pero se aislan típicamente, por ejemplo, de semillas, y más típicamente de las semillas oleaginosas de plantas de soya. Estos incluyen lecitina y liso-lecitina. Además, pueden usarse fosfolípidos con una composición de ácidos grasos modificada. Dichos fosfolípidos pueden ser fosfolípidos de soya modificados con enzimas. Fosfolípidos modificados con enzimas pueden prepararse, por ejemplo, de fosfolípidos de soya (SLP; True Lecithin, Mié, Japón) mediante tratamiento con fosfolipasa A2 (Novo Industry, Bagsvaerd, Dinamarca) (Nagaoka, et al., 1999). Además, pueden obtenerse fosfolípidos con una composición de ácidos grasos modificada de plantas o semillas de plantas que hayan sido modificadas genéticamente para producir fosfolípidos con composiciones de ácidos grasos modificadas. Un ejemplo de un fosfolípido con una composición de ácido graso modificada, es lecitina con una composición de ácido graso modificada. Otros métodos que son bien conocidos en la técnica pueden usarse también para modificar las composiciones de ácidos grasos de los fosfolípidos. Además, una composición de la invención puede incluir también uno a varios carbohidratos. Cualquier carbohidrato puede usarse en una composición de la invención al grado de que el compuesto seleccionado intensifica las propiedades de la composición para su uso como un agente hipocolesterolémico. Sin embargo, típicamente, los carbohidratos usados son carbohidratos que son sustancialmente resistentes a la digestión. Como se usa en la presente, "sustancialmente resistente a la digestión", cuando se usa para describir un carbohidrato se define en la técnica, para indicar típicamente, por ejemplo, carbohidratos que son más de aproximadamente 70% resistentes a la digestión, de preferencia más de aproximadamente 80% resistentes a la digestión, y más preferiblemente más de alrededor de 90% resistentes a la digestión. Hablando en términos generales, carbohidratos ricos en almidón de amilosa o fibra, son particularmente adecuados para su uso en una composición. En una modalidad, por ejemplo, el carbohidrato usado en la composición es almidón de alto contenido de amilosa, oligofructosa o fibra de cotiledones de soya. Además, modalidades son, por ejemplo, almidones que son físicamente inaccesibles (granos y semillas parcialmente molidos), gránulos resistentes (papa cruda, plátano verde, algunas leguminosas y almidones de alto contenido de amilosa), almidones degenerados (papa cocida y enfriada, pan y hojuelas de maíz), y almidones químicamente modificados (almidones eterizados, esterificados o entrelazados (usados en alimentos procesados)) (Topping y Clifton, 2001 ). Cualquier combinación de un material de soya aislado y una proteína asociada con cuerpo oleoso aislada, en presencia o ausencia de por lo menos un compuesto aditivo, puede combinarse para formar una composición de la invención. El cuadro 1 siguiente ilustra, por ejemplo, muchas formulaciones típicas para diferentes modalidades de composiciones de la presente invención.

CUADRO 1 Formulaciones de la composición Material de soya Proteína asociada con Compuesto aditivo aislado cuerpo oleoso aislada Harina de soya Oleosina Sin compuesto aditivo Por lo menos un Harina de soya Oleosina compuesto aditivo 90%, 95%, 97% o 99% de Harina de soya identidad de secuencias Sin compuesto aditivo con la oleosina 90%, 95%, 97% o 99% de Por lo menos un Harina de soya identidad de secuencias compuesto aditivo con la oleosina Fracción de oleosina de Harina de soya Sin compuesto aditivo bajo peso molecular CUADRO 1 (CONTINUACION) Fracción de oleosina de Por lo menos un Harina de soya bajo peso molecular compuesto aditivo Harina de soya Fracción de 7 kDa Sin compuesto aditivo Por lo menos un Harina de soya Fracción de 17 kDa compuesto aditivo Harina de soya SEQ ID NOs: 12 ó 14 Sin compuesto aditivo Por lo menos un Harina de soya SEQ ID NOs: 12 ó 14 compuesto aditivo Harina de soya Lipoproteína Sin compuesto aditivo Por lo menos un Harina de soya Lipoproteína compuesto aditivo Harina de soya Lipoproteína de mamífero Sin compuesto aditivo Por lo menos un Harina de soya Lipoproteína de mamífero compuesto aditivo Lipoproteína de la yema Harina de soya Sin compuesto aditivo del huevo Lipoproteína de la yema Por lo menos un Harina de soya del huevo compuesto aditivo Proteína de membrana de Harina de soya Sin compuesto aditivo glóbulo de grasa Proteína de membrana de Por lo menos un Harina de soya glóbulo de grasa compuesto aditivo Leche de soya en Oleosina Sin compuesto aditivo polvo Leche de soya en Por lo menos un Oleosina polvo compuesto aditivo 90%, 95%, 97% o 99% de Leche de soya en identidad de secuencias Sin compuesto aditivo polvo con la oleosina 90%, 95%, 97% o 99% de Leche de soya en Por lo menos un identidad de secuencias polvo compuesto aditivo con la oleosina Leche de soya en Fracción de oleosina de Sin compuesto aditivo polvo bajo peso molecular Leche de soya en Fracción de oleosina de Por lo menos un polvo bajo peso molecular compuesto aditivo Leche de soya en Fracción de 17 kDa Sin compuesto aditivo polvo Leche de soya en Por lo menos un Fracción de 17 kDa polvo compuesto aditivo Leche de soya en SEQ ID NOs: 12 ó 14 Sin compuesto aditivo polvo CUADRO 1 (CONTINUACION) Leche de soya en Por lo menos un SEQ ID NOs: 12 ó 14 polvo compuesto aditivo Leche de soya en Lipoproteína Sin compuesto aditivo polvo Leche de soya en Por lo menos un Lipoproteína polvo compuesto aditivo Leche de soya en Lipoproteína de mamífero Sin compuesto aditivo polvo Leche de soya en Por lo menos un Lipoproteína de mamífero polvo compuesto aditivo Leche de soya en Lipoproteína de la yema Sin compuesto aditivo polvo del huevo Leche de soya en Lipoproteína de la yema Por lo menos un polvo del huevo compuesto aditivo Leche de soya en Proteína de membrana de Sin compuesto aditivo polvo glóbulo de grasa Leche de soya en Proteína de membrana de Por lo menos un polvo glóbulo de grasa compuesto aditivo Concentrado de Oleosina Sin compuesto aditivo proteína de soya Concentrado de Por lo menos un Oleosina proteína de soya compuesto aditivo 90%, 95%, 97% o 99% de Concentrado de identidad de secuencias Sin compuesto aditivo proteína de soya con la oleosina 90%, 95%, 97% o 99% de Concentrado de Por lo menos un identidad de secuencias proteína de soya compuesto aditivo con la oleosina Concentrado de Fracción de oleosina de Sin compuesto aditivo proteína de soya bajo peso molecular Concentrado de Fracción de oleosina de Por lo menos un proteína de soya bajo peso molecular compuesto aditivo Concentrado de Fracción de 17 kDa Sin compuesto aditivo proteína de soya Concentrado de Por lo menos un Fracción de 17 kDa proteína de soya compuesto aditivo Concentrado de SEQ ID NOs: 12 ó 14 Sin compuesto aditivo proteína de soya Concentrado de Por lo menos un SEQ ID NOs: 12 ó 14 proteína de soya compuesto aditivo Concentrado de Lipoproteína Sin compuesto aditivo proteína de soya CUADRO 1 (CONTINUACION) CUADRO 1 (CONTINUACION) Aislado de proteína Por lo menos un Lipoproteina de mamífero de soya compuesto aditivo Aislado de proteína Lipoproteína de la yema Sin compuesto aditivo de soya del huevo Aislado de proteína Lipoproteína de la yema Por lo menos un de soya del huevo compuesto aditivo Aislado de proteína Proteína de membrana de Sin compuesto aditivo de soya glóbulo de grasa Aislado de proteína Proteína de membrana de Por lo menos un de soya glóbulo de grasa compuesto aditivo Fracción de alto peso Oleosína Sin compuesto aditivo molecular Fracción de alto peso Por lo menos un Oleosina molecular compuesto aditivo 90%, 95%, 97% o 99% de Fracción de alto peso identidad de secuencias Sin compuesto aditivo molecular con la oleosina 90%, 95%, 97% o 99% de Fracción de alto peso Por lo menos un identidad de secuencias molecular compuesto aditivo con la oleosina Fracción de alto peso Fracción de oleosina de Sin compuesto aditivo molecular bajo peso molecular Fracción de alto peso Fracción de oleosina de Por lo menos un molecular bajo peso molecular compuesto aditivo Fracción de alto peso Fracción de 17 kDa Sin compuesto aditivo molecular Fracción de alto peso Por lo menos un Fracción de 17 kDa molecular compuesto aditivo Fracción de alto peso SEQ ID NOs: 12 ó 14 Sin compuesto aditivo molecular Fracción de alto peso Por lo menos un SEQ ID NOs: 12 ó 14 molecular compuesto aditivo Fracción de alto peso Lipoproteína Sin compuesto aditivo molecular Fracción de alto peso Por lo menos un Lipoproteína molecular compuesto aditivo Fracción de alto peso Lipoproteína de mamífero Sin compuesto aditivo molecular Fracción de alto peso Por lo menos un Lipoproteína de mamífero molecular compuesto aditivo Fracción de alto peso Lipoproteína de la yema Sin compuesto aditivo molecular del huevo CUADRO 1 (CONTINUACION) Fracción de alto peso Lipoproteína de la yema Por lo menos un molecular del huevo compuesto aditivo Fracción de alto peso Proteína de membrana de Sin compuesto aditivo molecular glóbulo de grasa Fracción de alto peso Proteína de membrana de Por lo menos un molecular glóbulo de grasa compuesto aditivo Polipéptido de soya Oleosina Sin compuesto aditivo aislado Polipéptido de soya Por lo menos un Oleosina aislado compuesto aditivo 90%, 95%, 97% o 99% de Polipéptido de soya identidad de secuencias Sin compuesto aditivo aislado con la oleosina 90%, 95%, 97% o 99% de Polipéptido de soya Por lo menos un identidad de secuencias aislado compuesto aditivo con la oleosina Polipéptido de soya Fracción de oleosina de Sin compuesto aditivo aislado bajo peso molecular Polipéptido de soya Fracción de oleosina de Por lo menos un aislado bajo peso molecular compuesto aditivo Polipéptido de soya Fracción de 17 kDa Sin compuesto aditivo aislado Polipéptido de soya Por lo menos un Fracción de 17 kDa aislado compuesto aditivo Polipéptido de soya SEQ ID NOs: 12 ó 14 Sin compuesto aditivo aislado Polipéptido de soya Por lo menos un SEQ ID NOs: 12 ó 14 aislado compuesto aditivo Polipéptido de soya Lipoproteína Sin compuesto aditivo aislado Polipéptido de soya Por lo menos un Lipoproteína aislado compuesto aditivo Polipéptido de soya Lipoproteína de mamífero Sin compuesto aditivo aislado Polipéptido de soya Por lo menos un Lipoproteína de mamífero aislado compuesto aditivo Polipéptido de soya Lipoproteína de la yema Sin compuesto aditivo aislado del huevo Polipéptido de soya Lipoproteína de la yema Por lo menos un aislado del huevo compuesto aditivo Polipéptido de soya Proteína de membrana de Sin compuesto aditivo aislado glóbulo de grasa CUADRO 1 (CONTINUACION) Polipéptido de soya Proteína de membrana de Por lo menos un aislado glóbulo de grasa compuesto aditivo Glicinina o una subunidad de la Oleosina Sin compuesto aditivo misma Glicinina o una Por lo menos un subunidad de la Oleosina compuesto aditivo misma Glicinina o una 90%, 95%, 97% o 99% de subunidad de la identidad de secuencias Sin compuesto aditivo misma con la oleosina Glicinina o una 90%, 95%, 97% o 99% de Por lo menos un subunidad de la identidad de secuencias compuesto aditivo misma con la oleosina Glicinina o una Fracción de oleosina de subunidad de la Sin compuesto aditivo bajo peso molecular misma Glicinina o una Fracción de oleosina de Por lo menos un subunidad de la bajo peso molecular compuesto aditivo misma Glicinina o una subunidad de la Fracción de 17 kDa Sin compuesto aditivo misma Glicinina o una Por lo menos un subunidad de la Fracción de 17 kDa compuesto aditivo misma Glicinina o una subunidad de la SEQ ID NOs: 12 ó 14 Sin compuesto aditivo misma Glicinina o una Por lo menos un subunidad de la SEQ ID NOs: 12 ó 14 compuesto aditivo misma Glicinina o una subunidad de la Lipoproteína Sin compuesto aditivo misma Glicinina o una Por lo menos un subunidad de la Lipoproteína compuesto aditivo misma Glicinina o una subunidad de la Lipoproteína de mamífero Sin compuesto aditivo misma CUADRO 1 (CONTINUACION) Glicinina o una Por lo menos un subunidad de la Lipoproteína de mamífero compuesto aditivo misma Glicinina o una Lipoproteína de la yema subunidad de la Sin compuesto aditivo del huevo misma Glicinina o una Lipoproteína de la yema Por lo menos un subunidad de la del huevo compuesto aditivo misma Glicinina o una Proteína de membrana de subunidad de la Sin compuesto aditivo glóbulo de grasa misma Glicinina o una Proteína de membrana de Por lo menos un subunidad de la glóbulo de grasa compuesto aditivo misma ß-conglicinina o una subunidad de la Oleosina Sin compuesto aditivo misma ß-conglicinina o una Por lo menos un subunidad de la Oleosina compuesto aditivo misma ß-conglicinina o una 90%, 95%, 97% o 99% de subunidad de la identidad de secuencias Sin compuesto aditivo misma con la oleosina ß-conglicinina o una 90%, 95%, 97% o 99% de Por lo menos un subunidad de la identidad de secuencias compuesto aditivo misma con la oleosina ß-conglicinina o una Fracción de oleosina de subunidad de la Sin compuesto aditivo bajo peso molecular misma ß-conglicinina o una Fracción de oleosina de Por lo menos un subunidad de la bajo peso molecular compuesto aditivo misma ß-conglicinina o una subunidad de la Fracción de 17 kDa Sin compuesto aditivo misma ß-conglicinina o una Por lo menos un subunidad de la Fracción de 17 kDa compuesto aditivo misma ß-conglicinina o una subunidad de la SEQ ID NOs: 12 ó 14 Sin compuesto aditivo misma CUADRO 1 (CONTINUACION) ß-conglicinina o una Por lo menos un subunidad de la SEQ ID NOs: 12 ó 14 compuesto aditivo misma ß-conglicinina o una subunidad de la Lipoproteína Sin compuesto aditivo misma ß-conglicinina o una Por lo menos un subunidad de la Lipoproteína compuesto aditivo misma ß-conglicinina o una subunidad de la Lipoproteína de mamífero Sin compuesto aditivo misma ß-conglicinina o una Por lo menos un subunidad de la Lipoproteína de mamífero compuesto aditivo misma ß-conglicinina o una Lipoproteína de la yema subunidad de la Sin compuesto aditivo del huevo misma ß-conglicinina o una Lipoproteína de la yema Por lo menos un subunidad de la del huevo compuesto aditivo misma ß-conglicinina o una Proteína de membrana de subunidad de la Sin compuesto aditivo glóbulo de grasa misma ß-conglicinina o una Proteína de membrana de Por lo menos un subunidad de la glóbulo de grasa compuesto aditivo misma Por lo menos uno de SEQ ID NOs: 2, 3, 4, Oleosina Sin compuesto aditivo 5 Ó 6 Por lo menos uno de Por lo menos un SEQ ID NOs: 2, 3, 4, Oleosina compuesto aditivo 5 Ó 6 Por lo menos uno de 90%, 95%, 97% o 99% de SEQ ID NOs: 2, 3, 4, identidad de secuencias Sin compuesto aditivo 5 Ó 6 con la oleosina Por lo menos uno de 90%, 95%, 97% o 99% de Por lo menos un SEQ ID NOs: 2, 3, 4, identidad de secuencias compuesto aditivo 5 6 6 con la oleosina Por lo menos uno de Fracción de oleosina de SEQ ID NOs: 2, 3, 4, Sin compuesto aditivo bajo peso molecular 5 ó 6 CUADRO 1 (CONTINUACION) Por lo menos uno de Fracción de oleosina de Por lo menos un SEQ ID NOs: 2, 3, 4, bajo peso molecular compuesto aditivo 5 Ó 6 Por lo menos uno de SEQ ID NOs: 2, 3, 4, Fracción de 17 kDa Sin compuesto aditivo 5 Ó 6 Por lo menos uno de Por lo menos un SEQ ID NOs: 2, 3, 4, Fracción de 17 kDa compuesto aditivo 5 ó 6 Por lo menos uno de SEQ ID NOs: 2, 3, 4, SEQ ID NOs: 12 ó 14 Sin compuesto aditivo 5 Ó 6 Por lo menos uno de Por lo menos un SEQ ID NOs: 2, 3, 4, SEQ ID NOs: 12 ó 14 compuesto aditivo 5 Ó 6 Por lo menos uno de SEQ ID NOs: 2, 3, 4, Lipoproteína Sin compuesto aditivo 5 Ó 6 Por lo menos uno de Por lo menos un SEQ ID NOs: 2, 3, 4, Lipoproteína compuesto aditivo 5 Ó 6 Por lo menos uno de SEQ ID NOs: 2, 3, 4, Lipoproteína de mamífero Sin compuesto aditivo 5 Ó 6 Por lo menos uno de Por lo menos un SEQ ID NOs: 2, 3, 4, Lipoproteína de mamífero compuesto aditivo 5 Ó 6 Por lo menos uno de Lipoproteína de la yema SEQ ID NOs: 2, 3, 4, Sin compuesto aditivo del huevo 5 Ó 6 Por lo menos uno de Lipoproteína de la yema Por lo menos un SEQ ID NOs: 2, 3, 4, del huevo compuesto aditivo 5 ó 6 Por lo menos uno de Proteína de membrana de SEQ ID NOs: 2, 3, 4, Sin compuesto aditivo glóbulo de grasa 5 Ó 6 Por lo menos uno de Proteína de membrana de Por lo menos un SEQ ID NOs: 2, 3, 4, glóbulo de grasa compuesto aditivo 5 Ó 6 En una modalidad de la invención, la composición tiene un contenido de material de soya aislado de no menos de 50% en peso de la composición, y un contenido de proteína asociada con cuerpo oleoso de no menos de 0.5% en peso de la composición. Sin embargo, más preferiblemente, la composición tiene un contenido de material de soya aislado de no menos de alrededor de 70 a aproximadamente 90 por ciento en peso de la composición, y un contenido de proteína asociada con cuerpo oleoso entre alrededor de 1 a aproximadamente 5 por ciento en peso de la composición. Cuando están presentes, los compuestos aditivos tales como compuestos de isoflavona o saponina comprenden típicamente no menos de 10 mg/100 g de la composición, y pueden comprender además entre alrededor de 30 a 300 mg/100 g de la composición. Además, cuando están presentes, los compuestos aditivos tales como fosfolípídos o un carbohidrato sustancialmente resistente a la digestión, comprenden típicamente no menos de 2 por ciento en peso, y pueden comprender además entre aproximadamente 10 a 50% en peso de la composición. Las composiciones de la invención pueden administrarse a un mamífero como agentes para prevenir o tratar el desarrollo de aterosclerosis y enfermedad vascular. Más específicamente, las composiciones de la invención pueden administrarse a un mamífero, de preferencia un humano, para disminuir la concentración de colesterol total en suero, para disminuir la concentración de lipoproteína de baja densidad, para aumentar la concentración de lipoproteína de alta densidad, para disminuir la concentración de colesterol en el hígado, y para disminuir la concentración de triglicéridos en suero. Hablando en términos generales, sin que sea limitado por alguna teoría en particular, se piensa que las composiciones de la invención ejercen su actividad hipocolesterolémica previniendo la absorción de colesterol, inhibiendo sustancialmente la reabsorción de ácidos biliares, y/o pueden ser usadas como una fuente de nitrógeno por bacterias en el colon del mamífero.

IV. Composiciones farmacéuticas y administración de las mismas Cualquiera de las composiciones de la presente invención puede formularse como composiciones farmacéuticas o nutricionales. Dichas composiciones pueden administrarse oralmente, parenteralmente, mediante pulverización, inhalación, rectalmente, intradérmicamente, transdérmicamente o tópicamente en formulaciones de unidad de dosificación que contengan portadores, adyuvantes y vehículos no tóxicos farmacéuticamente aceptables convencionales, según se desee. La administración tópica puede incluir también el uso de administración transdérmica, tal como parches transdérmicos o dispositivos de iontoforesis. El término parenteral como se usa en la presente, incluye inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular o intraesternal, o técnicas de infusión. La formulación de fármacos se describe, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (1975), y en Lieberman y Lachman (1980). Preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones oleaginosas o acuosas inyectables estériles, pueden formularse de acuerdo a la técnica conocida usando agentes de suspensión y agentes mojantes o de dispersión adecuados. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1 ,3-butanodio!. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden usarse están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, aceites fijados estériles se usan convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito, puede usarse cualquier aceite fijado suave, incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, ácidos grasos tales como ácido oleico, son útiles en la preparación de inyectables. Pueden usarse dimetilacetamida, agentes tensioactivos que incluyan detergentes iónicos y no iónicos, y polietilenglicoles. Son también útiles mezclas de solventes y agentes mojantes tales como los que se describieron anteriormente. Supositorios para administración rectal de los compuestos descritos en la presente, pueden prepararse mezclando el agente activo con un excipiente no irritante adecuado tal como manteca de cacao, monoglicéridos, diglicéridos o triglicéridos sintéticos, ácidos grasos, o polietilenglicoles que sean sólidos a temperaturas ordinarias, pero líquidos a la temperatura rectal, y los cuales se fundirán por lo tanto en el recto y liberarán el fármaco. Las formas de dosificación sólidas para administración oral pueden incluir cápsulas, tabletas, pildoras, polvos y gránulos. En dichas formas de dosificación sólidas, los compuestos de esta invención se combinan a menudo con uno o más adyuvantes adecuados para la vía de administración indicada. Si se administran per os, los compuestos pueden mezclarse con lactosa, sacarosa, almidón en polvo, ésteres de celulosa de ácidos alcanoicos, ésteres alquílicos de celulosa, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, óxido de magnesio, sales de sodio y de calcio de ácidos fosfórico y sulfúrico, gelatina, goma de acacia, alginato de sodio, polivinilpirrolidona y/o alcohol polivinílico, y entonces pueden tabletearse o encapsularse para administración conveniente. Dichas cápsulas o tabletas pueden contener una formulación de liberación controlada como puede proveerse en una dispersión de compuesto activo en hidroxipropilmetilcelulosa. En el caso de cápsulas, tabletas y pildoras, las formas de dosificación pueden comprender también agentes reguladores de pH tales como citrato de sodio o carbonato o bicarbonato de magnesio o calcio. Las tabletas y pildoras pueden prepararse adicionalmente con recubrimientos entéricos. Para propósitos terapéuticos, las formulaciones para administración parenteral pueden estar en forma de soluciones o suspensiones para inyección estériles isotónicas acuosas o no acuosas. Estas soluciones y suspensiones pueden prepararse a partir de polvos o gránulos estériles que tengan uno o más de los portadores o diluyentes mencionados para su uso en las formulaciones para administración oral. Los compuestos pueden disolverse en agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuate, aceite de ajonjolí, alcohol bencílico, cloruro de sodio y/o varios reguladores de pH. Otros adyuvantes y modos de administración se conocen bien y ampliamente en la técnica farmacéutica. Las formas de dosificación líquidas para administración oral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elíxires farmacéuticamente aceptables que contengan diluyentes inertes que se usan comúnmente en la técnica, tal como agua. Dichas composiciones pueden comprender también adyuvantes, tales como agentes mojantes, agentes emulsionantes y de suspensión, y agentes edulcorantes, saborizantes y de perfume. La cantidad de compuestos terapéuticamente activos que se administran, y el régimen de dosificación para tratar una condición de enfermedad cardiovascular con los compuestos y/o las composiciones de esta invención dependen de varios factores, que incluyen la edad, peso, sexo y condición médica del sujeto, la severidad de la enfermedad, la vía y frecuencia de administración y el compuesto particular usado, y de esta manera pueden variar ampliamente. Dosis diarias generalmente aceptables y efectivas pueden ser de alrededor de 0.1 a aproximadamente 6000 mg/kg de peso corporal por día, más típicamente de alrededor de 100 a aproximadamente 2500 mg/kg por día, y muy preferiblemente de alrededor de 200 a aproximadamente 1200 mg/kg por día. La descripción detallada expuesta anteriormente se provee para ayudar a los expertos en la técnica a poner en práctica la presente invención. Aun así, no debe considerarse que esta descripción detallada limita indebidamente la presente invención, ya que los expertos en la técnica pueden hacer modificaciones y variaciones en las modalidades descritas en la presente sin apartarse del espíritu o alcance del descubrimiento de la presente invención. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y otras referencias citadas en esta solicitud, se incorporan en su totalidad en la presente como referencia, como si se indicara específicamente e individualmente que cada publicación, patente, solicitud de patente u otra referencia individual, se incorpora en la presente como referencia. Sin más elaboración, se piensa que los expertos en la técnica pueden, usando la descripción anterior, usar la presente invención hasta su mayor alcance. Por lo tanto, las siguientes modalidades específicas preferidas deberán considerarse solamente como ilustrativas, y de ninguna manera como limitativas del resto de la descripción.

V. Ejemplos EJEMPL0 1 Identificación de la HMF de la proteína de soya Los polipéptidos presentes en la HMF de la proteína de soya, tienen propiedades activas que disminuyen los niveles de colesterol (véase el ejemplo 2). Se realizaron estudios para identificar el origen y las secuencias parciales de estos polipéptidos. Los métodos usados fueron los siguientes: A. Electroforesis en qel de poliacrilamida Se llevaron a cabo métodos de electroforesis en gel de poliacrilamida de acuerdo con métodos conocidos en la técnica Se usaron varios métodos diferentes en la presente invención, y son los siguientes: B. Electroforesis en qel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) de tris-glicina Preparar muestras de proteína de soya para análisis congelando soyas intactas o molidas y pulverizándolas en un mortero de percusión (la pulverización no es necesaria para aislados de proteína de soya), y extrayendo las proteínas durante 1 hora a temperatura ambiente usando Tris a 0.03M, 2-mercaptoetanol a 0.01 M a pH = 8.0. Preparar una solución de 4 mg/ml de estas proteínas en solución de solubílización de SDS (Tris a 0.0625M, SDS a 2.3%, ß-mercaptoetanol a 5%, glicerol a 10%, pH 6.8, rastro de azul de bromofenol como un colorante de rastreo). Calentar las muestras durante 10 minutos a 70°C, enfriar durante 5 minutos, y centrifugar entonces para transformar a pellas los materiales insolubles. Cargar 5 µ?_ (20 µg) de cada sobrenadante de las muestras sobre un gel de acrilamida total a 10-20% (como es descrito por Laemmli (1970), y separar mediante electroforesis a 15-30 mA por gel (corriente constante) o 60-100 voltios (voltaje constante). Terminar la electroforesis cuando el colorante de rastreo esté dentro de 2 mm del fondo del gel. El anaranjado SYPRO puede sustituir al azul de Coomassie siguiendo el método número 2 en Malone et al (2001 ).

C. Análisis de SDS-PAGE mediante electroforesis en gel de NuPAGE Preparar muestras como se detalla en la sección de SDS-PAGE de Tris-glicina, usando 4x de regulador de pH de muestras LDS de NuPAGE (NOVEX, número de catálogo NP0003 como 1/4 del volumen de muestra, y ditiotreitol a 500 mM como 1/10 del volumen de muestra. Cargar 4 µ?_ (16 µg) de cada sobrenadante de muestra sobre un gel de Bis-Tris de acrilamida a 4-12% de Novex. Llenar el depósito de minigel Xcell de Novex con regulador de pH corriente MES de NuPAGE (MES a 50 mM, Tris a 50 mM, SDS a 3.5 mM, EDTA a 1.025 mM, pH = 7.7), y separar las proteínas mediante electroforesis a 200 voltios (voltaje constante), hasta que el colorante de rastreo alcance la ranura en el fondo del gel. Teñir el gel como se detalla en el protocolo de SDS-PAGE de Tris-glicina.

D. SDS-PAGE de proteínas de soya Extraer proteínas de soya como se detalla en la sección de SDS-PAGE de Tris-glicina. Complementar las muestras para que contengan urea a 8M, CHAPS a 2%, ditiotreitol a 0.35%, anfolito a 0.2% e isopropanol a 15%, hasta un volumen final de 450 ? conteniendo 0.6 a 1 .05 mg de proteína total. Usar 430 µ!_ de esta solución para volver a expandir una tira secante de gradiente de pH inmovilizado (IPG) de 18 cm, pH 3-10, durante 24-30 horas (cubrir las tiras con aceite mineral mientras se vuelven a expandir). Mediante el uso de tiras de electrodos remojadas en agua, enfocar las tiras de IPG (cubiertas con aceite mineral) durante 50,000-70,000 voltios-horas, usando el siguiente procedimiento de aumento de voltaje. Empezar con 1 hora a 100 voltios (v), entonces 1 hora a 200 v, 2 horas a 400 v, 14 horas en una pendiente lineal de 400 a 10000 voltios, entonces hasta 48 horas a 10000 voltios hasta alcanzar el total de voltios-horas final. Remojar cada tira de IPG en 1.5 ml_ de solución de equilibrio de muestras (Tris a 65.2 mM, SDS a 2.3%, 2-mercaptoetanol a 5%, pH 6.8, y un rastro de azul de bromofenol como un colorante de rastreo), durante 3.5 minutos. Drenar las tiras, colocar entonces cada una sobre un gel de Tris-glicina de acrilamida a 10-20%, sellándolas en su lugar usando agarosa a 1 % caliente en solución de equilibrio. Hacer correr los geles bidimensionales, y teñirlos como se detalla en la sección de SDS-PAGE de Tris-glicina.

E. Tripsinización in situ de proteínas en geles de acrilamida Recortar bandas o manchas de gel, colocándolas en tubos de microcentrífuga siliconizados de 1500 µ?. Lavar dos veces con metanol a 50% (30 minutos por lavado) para remover el colorante. Equilibrar las piezas de gel en acetonitrilo a 50% (en acetato de amonio a 200 mM, pH = 8.0) durante 15 minutos. Repetir los lavados dos veces. Lavar 15 minutos en acetonitrilo a 100%, y evaporar entonces hasta sequedad en un Speedvac. Tripsinizar durante 16-20 horas a 37°C usando 20 µg/mL de tripsina modificada de grado de secuenciación (Promega, número de catálogo V51 11 ) en acetonitrilo a 10% en acetato de amonio a 200 mM, pH 8.0. Extraer los péptidos con acetonitrilo a 50% y ácido trifluoroacético (TFA) a 0.1 % durante 20 minutos, agitando con un Nutator. Repetir la extracción usando acetonitrilo a 80% y TFA a 0.1 % en acetato de amonio durante 20 minutos. Repetir la última extracción durante 30 minutos. Combinar todos los sobrenadantes, y secar los extractos en Speedvac.

F. Tripsinización de las bandas para proveer polipéptidos trípticos de los polipéptidos presentes en una banda determinada Se realizó digestión de las bandas con tripsina en gel, para proveer polipéptidos trípticos de los polipéptidos presentes en una banda determinada, de acuerdo al siguiente protocolo: 1 ) Recortar manchas de gel, haciendo la dimensión más grande de cualquier pieza menor de 1 mm. Colocar las piezas de gel en tubos de microcentrífuga siliconizados de 1500 µ?. 2) Lavar las piezas de gel con dos o más lavados (200 µ? por tubo) de metanol a 50% (30 minutos por lavado) para remover el colorante. Los geles teñidos con Coomassie pueden lavarse otras veces para remover el colorante. Las piezas de gel pueden almacenarse en esta solución. Agitar los tubos usando Nutator. 3) Lavar las piezas de gel dos veces en 200 µ? de acetonitrilo a 50% (en acetato de amonio a 200 mM, pH = 8.0 - ajustado con NH4OH) durante 15 minutos por lavado, y entonces un lavado adicional durante 30 minutos. Agitar usando Nutator. 4) Lavar 15 minutos con acetonitrilo a 100%. 5) Separar la solución de las piezas de gel, y evaporar hasta sequedad en Speedvac (15 minutos). 6) Preparar material de abastecimiento de tripsina, añadiendo 1 mi de acetonitrilo a 10% (en NH4OAc a 200 mM, pH 7.8-8.3 - ajustado con NH4OH) a un frasco de tripsina de 200 µg (se usa tripsina modificada de grado de secuenciación de Promega - número de catálogo V51 1 1 ). 7) Digerir la proteína añadiendo bastante solución de tripsina para cubrir piezas de gel en cada tubo. Típicamente, son suficientes 200 µ?. 8) Incubar las piezas a 37°C durante 16-20 horas. 9) Enfriar los tubos a temperatura ambiente y los tubos de microcentrífuga para llevar la humedad al fondo. 10) Extraer los péptidos con 200 µ? de acetonitrilo a 50% y ácido trifluoroacético (TFA) a 0.1 % durante 20 minutos agitando con un Nutator. 11) Guardar los sobrenadantes individualmente para cada tubo, y volver a extraer entonces usando 200 µ? de acetonitrilo a 80% y TFA a 0.1 % durante 15 minutos, agitando con un Nutator. 12) Guardar los sobrenadantes añadiéndolos a los sobrenadantes guardados previamente para cada tubo, y extraer entonces una vez final usando 200 µ? de acetonitrilo a 80% y TFA a 0.1 % durante 30 minutos, con agitación sobre un Nutator. 13) Guardar los sobrenadantes y añadir a los sobrenadantes guardados previamente para cada tubo. Secar los extractos en Speedvac.

G. Análisis de MALDI-TOF Se ionizaron polipéptidos trípticos de una banda usando desorción con láser (para MALDI) o electroaspersión (para LC/MS y LC/MS/MS), para crear un espectro de masa. Las masas de los péptidos se miden como una mezcla usando MALDI; no existe separación de los péptidos trípticos. Se prepararon muestras para análisis de MALDI usando un procedimiento publicado ligeramente modificado (Shevchenko et al., 1996). Se reconstituyeron las muestras añadiendo 10 µ? de TFA a 0.1 % a cada tubo conteniendo los péptidos desecados. Se preparó la matriz disolviendo 10 mg/mL de nitrocelulosa y 20 mg/mL de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico de una mezcla 1 :1 (v:v) de acetona y alcohol isopropílico. Se manchó la matriz suministrando 0.5 µ? de solución de matriz sobre la placa de MALDI. En forma similar, se depositó 1 µL· de la muestra de cada muestra sobre la matriz manchada. Se dejó que la muestra se secara sobre la matriz durante aproximadamente 10 minutos, para asegurar que los péptidos se unieran a la nitrocelulosa. Por último, se realizaron tres lavados acuosos depositando 5 µ?. de ácido fórmico a 5% sobre cada mancha, y aspirando de inmediato esta solución usando una línea de vacío. La placa de muestras de ALDI se movió entonces hacia el espectrómetro de masas para análisis de espectrometría de masas de MALDI. Se colectaron los datos usando el Voyager DE-STR (Perceptive Biosystems, Framingham, MA) en el modo de reflectrón. Se calibraron internamente los espectros usando valores máximos conocidos de autólisis con tripsina. Se generaron listas de valores máximos de las masas de péptidos trípticos, y éstas se examinaron contra la base de datos de secuencias de proteína no redundantes del NCBI usando la herramienta de búsqueda MS-Fit para identificar las proteínas (Clauser et al. (1999)). A veces, la correspondencia es "dudosa" y requiere confirmación, o los datos son débiles o simplemente no existe correspondencia significativa. En estos casos, se usa nano LC/MS/MS. En este método, la mezcla de la digesta se inyecta sobre una columna de fase invertida, de modo que los péptidos se separan y se introducen en el espectrómetro de masas (en este caso un espectrómetro de masas en tándem de electroaspersión), uno a la vez (o por lo menos un par a la vez). El espectrómetro de masas mide la masa de los péptidos, aisla los más abundantes filtrando todo también, y envía un péptido en una celda de colisión, en donde el péptido choca con gas argón. Los péptidos tienden a fragmentarse alrededor de los enlaces de amida, de modo que los fragmentos pueden ser indicativos de la secuencia de aminoácidos. Los datos de fragmentación pueden someterse a una herramienta de búsqueda de base de datos, la cual compara los datos con la base de datos de secuencia de proteína. Usa la secuencia parcial y la masa original del péptido tríptico para lograr una correspondencia. Puede identificarse una proteína usando los datos de MS/ S de un péptido tríptico individual con alta confianza.

H. Nano CLAR Se usa nano CLAR para separar los fragmentos trípticos de una proteína purificada (purificada mediante electroforesis), de modo que sólo un péptido, o unos cuantos péptidos, se introducen en el espectrómetro de masas en tándem de electroaspersión a la vez. Se inyectaron muestras en un sistema CapLC (Waters, Milford, MA) equipado con un muestreador automático, gradiente y bomba auxiliar. Se inyectaron cinco microlitros mediante el modo de "recolección de microlitros", y se desalaron en línea a través de un cartucho de captura Cía de 300 µ?p ? d mm (LC Packings, San Francisco, CA). Las muestras se desalaron a alto flujo (30 µ?/?t??????) durante 3 minutos. Los péptidos se separaron sobre una columna C-is Magic de 100 µ?? x 150 mm (Michrom BioResources, Auburn, CA) antes de la introducción en el espectrómetro de masas. Se usó un gradiente típico de fase invertida de bajo nivel a alto nivel de materia orgánica durante aproximadamente 30 minutos. La fase móvil A era ácido fórmico a 0.1 %, y la fase móvil B era acetonitrilo a 100% y ácido fórmico a 0.1%. La velocidad de flujo se aumentó también linealmente con la fase móvil orgánica. El sistema usó un pequeño flujo de separación, resultando en una velocidad de flujo en la columna de aproximadamente 300-700 nL/min.

I. Análisis de MS/MS v procesamiento de datos Para LC/MS/MS, existe un paso de separación (LC de fase invertida), de modo que los péptidos trípticos se introducen en el espectrómetro de masas (idealmente) uno a la vez. Se denomina MS/MS, o MS en tándem, debido a que primero se mide la masa de un péptido, y entonces se mide la masa de los fragmentos de este péptido. Se fragmenta un péptido tríptico mediante colisiones con un gas estacionario (Ar), y se miden las masas de los fragmentos. Esto dará con frecuencia la secuencia de por lo menos parte del péptido. Se realizaron estudios de MS/MS dependientes de datos sobre un espectrómetro de masas Q-Tof (Micromass, Beverly, MA). La entrada es una fuente de nanoaspersión modificada diseñada para sostener una punta pequeña (New Objective, Cambridge, MA). Se determinó la energía de colisión usada para CAD con base en el estado de carga y masa del péptido. Los datos se procesaron usando ProteínLynx versión 3.4 (Micromass, Beverly, MA) para generar archivos de listas de valores máximos. Los datos se examinaron contra la base de datos de secuencia de proteína no redundante del NCBI usando el motor de búsqueda MASCOT (Matrix Science, Londres, Reino Unido). El motor de búsqueda reportó los veinte impactos superiores. Los datos de secuencia que no compararon entrada alguna en esta base de datos, se examinaron contra la base de datos dbEST del NCBI, así como bases de datos de secuencia generadas internamente.

J. Estudio 1 Se separó la HMF del aislado de proteína de soya denominado OBAP usando electroforesis en gel de poliacrilamida. Cinco polipéptidos que contenían bandas o áreas del gel, fueron tripsinizados y analizados para secuencia de aminoácidos usando espectroscopia de masas (figura 7). Se identificaron los orígenes de las bandas como en el cuadro 2: CUADRO 2 *Secuencias de glicinina alineadas para obtener los residuos 401-435 de la subunidad básica de glicininas G1 (72296, precursor de AlaBx) (SEQ ID NO: 1 ). (VFDGELQEGRVLIVPQNFWAARSQSDNFEYVSFK) (SEQ ID NO: 1 ): A VFDGELQEGR y SQSDNFEYVSFK B Mismos dos como en A, más: VLIVPQNFWAAR K. Estudio 2 La secuencia de oleosina putativa anterior no correspondió con las secuencias de oleosina conocidas. No se conocía la secuencia de la oleosina de soya de peso molecular menor (-18 kDa). El propósito del siguiente estudio, fue determinar si la secuencia de "oleosina putativa" anterior era de la oleosina de soya de 18 kDa. Se purificaron proteínas asociadas con cuerpo oleoso (proteína p34 y oleosinas), y se separaron sobre un gel de poliacrilamida (figura 8). Las bandas fueron tripsinizadas y analizadas mediante MS. La presencia de un péptido tríptico, liberado de la región N-terminal anfipática de oleosina justo después del dominio hidrofobico, se confirmó en una banda de 12 kDa aislada de la HMF. La masa promedio por aminoácido es de 11 1.1 Daltons. De esta manera, el número de aminoácidos en un péptido de 12 kDa es de aproximadamente 108 aminoácidos. Por lo tanto, el péptido presente en la HMF debe contener también una porción del dominio hidrofobico de oleosina. La secuencia YETNNSSLNNPPSR (SEQ ID NO: 10) representa los residuos 33-45 de la oleosina putativa que está poco antes del inicio de la región del núcleo hidrofobico de la proteína. Resultados: confirmaron que la secuencia YETNSSLNNPPSR (SEQ ID NO: 10), se encuentra en la oleosina de soya de bajo peso molecular.

CUADRO 3 L. Estudio 3 La HMF caracterizada en el estudio 1 se obtuvo de una fracción de proteína de soya que tenía poca beta-conglicinina. Esta ayudó a identificar las subunidades de glicinina que están presentes en la HMF. Se llevó a cabo el siguiente estudio para determinar qué secuencias de beta-conglicinina, si es que alguna, puede identificarse en la MHF. Se usaron soyas que carecían de glicininas G1 para obtener aislados de proteína de soya, y el aislado fue digerido con pepsina para obtener la HMF. La HMF se separó usando electroforesis en gel de poliacrilamida (figura 9), y las bandas fueron tripsinizadas y caracterizadas usando MS. Resultados: se identificaron secuencias de polipéptidos de beta-conglicininas.

CUADRO 4 *Precursor alfa-prima beta-conglicinina (121286): QNPSHNKCLR (SEQ ID NO: 18) y secuencias en 4191814 citadas más adelante. *Subunidad alfa-prima de beta-conglicinina (4191814): NQYGHVR (SEQ ID NO: 6), y secuencias en 7442025 citadas más adelante. *Subunidad alfa de beta-conglicinina (7442025): NILEASYDTKFEEINK (SEQ ID NO: 8), LQESVIVEISKK (SEQ ID NO: 4), QQQEEQPLEVRK (SEQ ID NO: 5).

EJEMPLO 2 Efecto de la HMF sobre la captación de colesterol La línea de células Caco-2 se deriva de un carcinoma colorrectal humano, y se usa comúnmente para estudiar la fisiología de las células epiteliales intestinales. Estas células se han usado para estudiar procesos de transporte de colesterol, glucosa, aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos, ácidos biliares y fármacos (Hidalgo et al., 1989; Artursson, 1990; Homan y Hamelehle, 1998). Estas células expresan enzimas que metabolizan lípidos y esterol, y proteínas de transporte que son reguladas en forma similar a las de los enterocitos (Levy et al., 1995). Asimismo, se sabe que expresan SR-B1 , una proteína identificada recientemente que puede desempeñar una función en la absorción de colesterol (Werder et al., 2001 ), así como varias proteínas en la familia de transportadores del cassette de unión a ATP, que pueden desempeñar también una función en mediar la captación neta de colesterol por células epiteliales intestinales (Taipalensuu et al., 200 ). La proteína de soya es la fuente de la HMF. En resumen, se incubaron proteínas de soya con pepsina durante 17 horas (NaCI a 0.2% en fase acuosa, 38°C, pH 1.1 , la pepsina era 5% del aislado de proteína de soya), se trataron con calor durante 20 minutos a 90°C para inactivar la pepsina, se enfriaron sobre hielo, el pH se ajustó a 6.21 con Na2C03 a 0.2 M, y se centrifugaron a 4,500 g durante 20 minutos. Esta pella se lavó tres veces con agua y se identificó como la HMF.

A. Cultivo de células Caco-2 para pruebas de absorción de colesterol 1. Recubrir previamente placas tratadas para cultivo de tejidos blancas sólidas Costar de 96 cavidades (Costar #3917) con colágena de cola de rata, de la manera siguiente: a) Preparar 20 µg/ml de solución de colágena de cola de rata (Becton Dickinson/Collaborative Biomedical Products, número de catálogo 40236) en ácido acético a 0.02N: añadir 11.5 mi de ácido acético a 17.4 N/ 0 mi de agua estéril; añadir 60 µ? de colágena (3.32 mg/ml) por 10 mi de ácido acético a 0.02 N. b) Añadir 250 µ? de solución de colágena/cavidad para una placa de 96 cavidades, y dejar que permanezca a temperatura ambiente durante la noche en una campana laminar. c) Enjuagar cada cavidad 1 x 250 µ? de DMEM, seguida de un enjuague con 100 mi de DME . 2. Enjuagar 2 matraces T-150 (Costar #430825) de células Caco-2 a 70-80% de confluencia (usando células con un número de pasos entre 41 y 60) con 10 mi de solución salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco sin Ca2+ ni Mgt2+. 3. Añadir 6 mi de solución de EDTA/tripsina a 0.25% a cada matraz, e incubar durante 5-10 minutos a 37°C. 4. Usar pipeta de 10 mi para lavar las células del matraz T-150, y disgregar los montones de células. Transferir la suspensión de células a un tubo de 50 mi. 5. Añadir 12 mi de medio completo DMEM con suero de bovino fetal a 10%, 1X de aminoácidos no esenciales, 50 mg/ml de gentamicina a la suspensión de células, mezclar y transformar a pellas las células mediante centrifugación durante 5 minutos a 2000 rpm (Sorvall RT7). 6. Remover los medios y reemplazar con 20 mi de medios completos. Usar pipeta de 10 mi para dispersar las células. [2 x matraces T-150 aproximadamente 80% confluentes, generan -10 x 106 células]. 7. Sembrar las células en las placas de microtítulo recubiertas de colágena de 96 cavidades, a una densidad de 3200 células/100 µ? por cavidad. 8. Alimentar las células en días alternos con medio completo. Las células expresarán los receptores de superficie necesarios para la absorción del colesterol 13 días después de la siembra.

B. Prueba de absorción de colesterol Se llevó a cabo captación de colesterol micelar por células Caco-2 mediante una modificación del método reportado por Field et al. (1991 ). El método de los presentes inventores, se describe a continuación: 1. Se disuelven los compuestos/péptidos que se van a poner a prueba para su capacidad para inhibir la absorción de colesterol en células Caco-2 como soluciones de abastecimiento en DMSO. Se obtienen diluciones de los compuestos de prueba a partir de soluciones de abastecimiento en pentanol. Las diluciones de los compuestos que se van a usar en la prueba de inhibición de la absorción de colesterol por células Caco-2, deben ser 10X mayores que la dilución final deseada que se va a poner a prueba, es decir, pipetear una solución a 2M en la cavidad para obtener una solución final a 200 µ? en la prueba. Se usa sitostanol como el inhibidor de la absorción de colesterol control con inhibición máxima a 200 mM (control de absorción de colesterol a 0%). Se usa sólo solvente como el 100% de absorción de colesterol (alto valor de dpm). 2. Se pipetean diluciones de los compuestos/péptidos control y de paieba en placas de microtítulo de polipropileno de cavidad somera (Sigma M-4029) por triplicado. 3. Las placas se secan en un instrumento GeneVac durante la noche a una temperatura de 35°C-45°C. Se verifican las placas para sequedad completa antes del siguiente paso. 4. Se prepara la mezcla de micelas de 3H-colesterol de la manera siguiente en frascos ámbar Trace-Clean con tapas de forro con septos (VWR, número de catálogo 15900-036): A 1.0 mi de 10X solución de micelas de abastecimiento (10X de solución de micelas de abastecimiento = taurocolato a 50 mM, ácido oleico a 1 mM, colesterol a 1 mM), añadir 37.5 µ? de 3H-colesterol (NEN, número de catálogo NET-725) (0.75 nmoles de colesterol) = 37.5 µ? de 3H-colesterol (la solución contiene colesterol a 0.075% como marca radiactiva = traza). Preparar 1 .8 mi por placa de prueba de microtítulo para permitir sobrante. 5. Pipetear 15 µ?/cavidad de diluyente de CH3CI:MeOH (1 :1 ) en todas las cavidades de las placas desecadas para solvatar el residuo desecado. Usar los depósitos de polipropileno para esto, y conservar los depósitos sobre hielo para reducir al mínimo la evaporación del solvente. 6. A las mismas placas, añadir 15 µ? de la mezcla de 3H-colesterol a cada cavidad usando un depósito de polipropileno sobre hielo que contenga la solución marcada radiactivamente. 7. Secar las placas en una cámara de evaporación precalentada a 37°C (VWR) baldeando con nitrógeno gaseoso durante aproximadamente 20 a 30 minutos. 8. Enjuagar las cavidades desecadas con 50 µ?/cavidad de éter etílico, y volver a secar en la cámara de evaporación. Repetir el enjuague con éter un vez más y secar. 9. Poner las placas en el desecador de vacío durante la noche. 10. Pipetear 150 µ? de solución salina balanceada de Hank (HBSS) (Sigma H-8264) a temperatura ambiente en cada cavidad desecada usando una estación de trabajo Quadra 96. La concentración final de los lípidos micelares es la siguiente: taurocolato a 5 mM, ácido oleico a 100 µ?, colesterol a 100 µ? y 3.75 µ??/??? de 3H-colesteral (o aproximadamente 5 µ?). 1 1. Sellar las placas con cinta de sellado adhesiva (cinta de sellado adhesiva Packard TopSeal-A o cinta de sellado Sigma Mylar T-2 62), y agitar sobre el agitador de placas Labline, modelo 4625 (ajuste = 6) durante por lo menos 30 minutos a temperatura ambiente para solubilizar las micelas. 12. Lavar las células Caco-2 depositadas sobre las placas de 96 cavidades (descritas anteriormente) 5 veces con HBSS usando lavador automatizado de células. Hacer esto POCO ANTES del paso 13. Remover todo exceso de líquido dando una palmada fuerte a la placa sobre toallas de papel antes de añadir las micelas en el siguiente paso. 13. Transferir 100 µ? de las micelas solubilizadas en la placa de células Caco-2 marcada adecuadamente, usando la estación de trabajo Quadra 96. Poner la placa de nuevo en la incubadora a 37°C durante 4 horas. 14. Lavar las células 5 veces con taurocolato a 1 mM frío en HBSS (TC a 1 mM), usando lavador automatizado de células. 15. Pipetear 200 µ?/cavidad del coctel de escintilación (Packard MicroScint 40, número de catálogo 6013641 ) en placas de células usando la estación de trabajo Quadra 96. 16. Sellar las placas con cinta de termosellado (película de termosellado Packard TopSeal-S), y agitar las placas (ajuste = 6 por lo menos) durante por lo menos 20 minutos para mezclar la fluorita con las muestras de células. 17. Mantener las placas en la oscuridad durante la noche. 18. Contar el valor de dpm usando un instrumento Packard TopCount NXT. 19. Los resultados se calculan como % del control (sin inhibidor), de la manera siguiente: % del control = dpm del compuesto de prueba/péptido - dpm de sitostanol a 200 µ? . luu dpm del control (sin compuesto)- dpm de sitostanol a 200 µ? La HMF de la soya de varias fuentes, ilustró una inhibición de la captación de colesterol dependiente de la dosis por células Caco-2 (por ejemplo, véase la figura 10). Las concentraciones de la HMF requeridas para reducir la captación de colesterol en 50% estuvieron entre 1.2 y 2.9 mg/mL, salvo la prueba de beta-conglicinina (4.7 mg/mL).

EJEMPLO 3 Caracterización farmacológica molecular del mecanismo de acción de la HMF Para determinar si los compuestos/péptidos de prueba afectaban la solubilidad del 3H-colesterol en las soluciones micelares preparadas para la prueba de absorción de colesterol (véase los métodos para el ejemplo 2), se llevó a cabo la siguiente prueba: 1. Se preparan micelas como se describe en los métodos del ejemplo 2, hasta e incluyendo el paso #1 1. 2. Transferir 20 µ? de micelas solubilizadas en placas Costar opacas (Costar #3917), usando la estación de trabajo Quadra 96. 3. Pipetear 200 µ?/cavidad del coctel de escintilación (Packard MicroScint 40, número de catálogo 6013641 ) en las cavidades de la placa de microtítulo usando la estación de trabajo Quadra 96. 4. Sellar las placas con cinta de termosellado (película de termosellado Packard TopSeal-S), y agitar las placas (ajuste = 6 por lo menos) durante por lo menos 20 minutos para mezclar la fluorita con las muestras de micelas. 5. Mantener las placas en la oscuridad durante la noche. 6. Contar el valor de dpm usando un instrumento Packard TopCount NXT. 7. Los resultados se calculan como % del control (sin inhibidor), de la manera siguiente: % del control = dpm del compuesto de prueba/péptido - dpm de sitostanol a 200 µ? X 100 dpm del control (sin compuesto) - dpm de sitostanol a 200 µ? 8. Si un compuesto de prueba/péptido desplaza el 3H-colesterol de las miceias, se observará una disminución en el valor de dpm del péptido/compuesto de prueba con concentraciones mayores de compuesto de prueba/péptido. Si no es así, los valores de dpm en las miceias solubilizadas continuarán siendo bastante constantes sobre la escala de diluciones del compuesto de prueba/péptido puestas a prueba. Las figuras 1 1A y 1 1 B ilustra que esto contrasta con el mecanismo primario de inhibición del colesterol por sitostanol.

EJEMPLO 4 Caracterización de la HMF de proteína de soya Se hicieron comparaciones del rendimiento de la HMF de fracciones del aislado de proteína de soya que tienen cantidades reducidas de proteína asociada con cuerpo oleoso (OBAP(-)), una fracción rica en proteína asociada con cuerpo oleoso (OBAP)(+)) y un control. Todas se hicieron de las mismas soyas (variedad A2247). En resumen, se incubaron fracciones de proteínas de soya con pepsina durante 17 horas (NaCI a 0.2% en fase acuosa, 38°C, pH 1 .4, la pepsina era 5% del aislado de proteina de soya), se trataron con calor durante 20 minutos a 90°C para inactivar la pepsina, se enfriaron sobre hielo, el pH se ajustó a 6.21 con Na2C03 a 0.2 M, y se centrifugaron a 4,500 g durante 20 minutos. La pella se lavó dos veces con agua y se deshidrató por congelación. Se comparó el peso de la pella seca con el peso de la cantidad original del aislado de proteína de soya usado en la prueba, para determinar el rendimiento de la HMF [(peso final/peso inicial) x 100]. Las muestras de proteína de soya OBAP(+) y control, produjeron la HMF. Sin embargo, la fracción OBAP(-) no dio HMF alguna, indicando que la oleosina y/o los componentes asociados con la oleosina (por ejemplo, saponinas, fosfolípidos), controlan la digestibilidad de las proteínas de soya. Los siguientes son los procedimientos usados para fraccionar proteínas de soya en aislados de proteína de soya (SPI): A. Procedimiento 1 : OBAP(-) 1. Añadir 1 kg de hojuelas de soya desgrasadas (de Cargill) en 15 kg de agua desionizada. Ajustar el pH a 7.5 con NaOH a 1 . Mezclar a temperatura ambiente durante 1 hora. 2. Centrifugar la mezcla a 10,000 g durante 10 minutos, y colectar el sobrenadante. 3. Añadir Na2S04 y CaCI2 en el sobrenadante a una concentración de 30 mM, respectivamente. 4. Ajustar el pH del sobrenadante del paso 3 a pH 2.8 con HCI a 2N. Centrifugar la mezcla a 10,000 g durante 10 minutos. Colectar el sobrenadante. 5. Diluir el sobrenadante (del paso 4) con agua desionizada 4 veces (por ejemplo, de 1 L a 4 L). Ajustar el pH a 4.5 con NaOH a 2N. Centrifugar a 10,000 g durante 10 minutos. Colectar el precipitado. 6. Volver a disolver el precipitado del paso 5 en agua desionizada, y ajustar el pH a 7.5 con NaOH a 2N. 7. Secar por aspersión la mezcla de proteínas neutralizadas a temperatura de entrada = 200°C y temperatura de salida = 90-95°C.

B. Procedimiento 2: OBAP(+) 1. Añadir 1 kg de hojuelas de soya desgrasadas (de Cargill) en 15 kg de agua desionizada. Ajustar el pH a 7.5 con NaOH a 1 N. Mezclar a temperatura ambiente durante 1 hora. 2. Centrifugar la mezcla a 10,000 g durante 10 minutos, y colectar el sobrenadante. 3. Añadir Na2S04 y CaCI2 en el sobrenadante a una concentración de 30 mM, respectivamente. 4. Ajustar el pH del sobrenadante del paso 3 a pH 2.8 con HCI a 2N. Centrifugar la mezcla a 10,000 g durante 10 minutos. Colectar el precipitado. 5. Volver a disolver el precipitado del paso 4 en agua desionizada, y ajustar el pH a 7.5 con NaOH a 2N. 6. Secar por aspersión la mezcla de proteínas neutralizadas a temperatura de entrada = 200°C y temperatura de salida = 90-95°C.

C. Procedimiento 3: control 1. Añadir 1 kg de hojuelas de soya desgrasadas (de Cargill) en 15 g de agua desionizada. Ajustar el pH a 7.5 con NaOH a 1 N. Mezclar a temperatura ambiente durante una hora. 2. Centrifugar la mezcla a 10,000 g durante 10 minutos, y colectar el sobrenadante. 3. Diluir el sobrenadante (del paso 2) con agua desionizada 4 veces (por ejemplo, de 1 L a 4 L). Ajustar el pH a 4.5 con HCI a 2N. Centrifugar a 10,000 g durante 10 minutos. Colectar el precipitado. 4. Volver a disolver el precipitado del paso 5 en agua desionizada, y ajustar el pH a 7.5 con NaOH a 2N. 5. Secar por aspersión la mezcla de proteína neutralizada a una temperatura de entrada = 200°C y temperatura de salida = 90-95°C. En un estudio, los contenidos de proteína total de las muestras fueron OBAP(-) (94.8%), OBAP(+) (91.8%) y control (68%) (métodos de análisis oficiales de la AOAC, decimosexta edición, 1995, 990.02, localizador #4.2.08). Se determinó el rendimiento de la HMF de cada fracción. Los resultados demostraron que no se produjo HMF alguna a partir de la muestra de OBAP(-) (véase el cuadro 5). Este estudio indicó la importancia de la OBAP y/o la importancia de los fosfolípidos, isoflavonas y saponinas asociados con esta fracción para obtener la HMF, aún cuando las proteínas asociadas con cuerpo oleoso no constituyen una gran porción de la HMF. En el mismo estudio, las actividades del inhibidor de tripsina de los aislados de proteína de soya OBAP(-), OBAP)(+) y control fueron 24, 31.5 y 47.5 U de inhibidor de tripsina/mg, respectivamente (usando un método estándar de AACC, 1995, 9a. edición, método 71-10). Estas actividades no se correlacionan con el rendimiento de la HMF de las muestras; de esta manera, se elimina la probabilidad de que la falta de actividad del inhibidor de tripsina en aislados de OBAP(-), cause la falta de formación de la HMF. Las actividades del inhibidor de quimiotripsina de muestras de proteína de soya, tampoco se correlacionaron con el rendimiento de la HMF de las muestras (cuadro 5) (AACC, 10a. edición, método 22-40).

CUADRO 5 Unidades de inhibición de quimiotripsina por mq de muestra y rendimiento de la HMF Se obtuvieron también otras fracciones de soya (glicinina, beta- conglicinina, intermediario) preparadas en la planta piloto de la Universidad del Estado de lowa (15 kg, procedimiento número 2 de la planta piloto; Wu et al., 1999). Se determinó también la cantidad de oleosina en estas muestras mediante Western blotting usando un anticuerpo de oleosina (véase la figura 12). De nuevo, se demostró que las muestras con mayores cantidades de oleosina tuvieron rendimientos mucho mayores de la HMF (cuadro 6). Muestras de SPI digeridas con pepsina (OBAP y control), muestras de SPI no digeridas (control, OBAP(-), OBAP(+)), la preparación de proteína asociada con cuerpo oleoso, y una muestra de soya molida de la soya control IA-2032, se resolvieron sobre geles de glicina/Tris a 18%, y se transfirieron a membranas de PVDF. Estos blots se sondearon con antisueros para oleosina (figura 13). Estos antisueros se desarrollaron en conejos usando proteína oleosina de longitud completa que fue sobreexpresada en E. coli y purificada de la misma como se describe en QIAexpressionist (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Estos blots ilustraron que las muestras con cantidades mayores de oleosina dieron rendimientos mucho mayores de la HMF (cuadro 6).

EJEMPLO 5 Efecto de la extracción con etanol sobre el rendimiento de la HMF Para ver hasta qué grado el alto rendimiento de la fracción de intermediarios proviene de fosfolípidos, saponinas e isoflavonas, éstos componentes fueron extraídos de la fracción usando etanol a 70%, y la fracción se volvió a poner a prueba para rendimiento de la HMF. El resultado fue un rendimiento 50% menor. La adición de la fracción extraída a una fracción de bajo rendimiento (glicinina), ayudó a mejorar el rendimiento de la HMF de esa fracción (80%). Estos resultados (véase el cuadro 6) sugieren que la capacidad de los polipéptidos de la HMF para resistir a la digestión por proteasas, puede depender en parte de la presencia de componentes extraíbles con alcohol, tales como saponinas, ¡soflavonas y fosfolípidos. El resultado de ejemplos previos se incluye también en el cuadro 6, junto con un resumen de las explicaciones. La conclusión de este resumen, fue que las oleosinas, beta-conglicininas, extraíbles con alcohol (fosfolípidos, saponinas, isoflavonas) y las subunidades de glicinina básicas, favorecen un alto rendimiento de la HMF que puede funcionar como un material que reduce los niveles de colesterol. El componente más importante es la lipoproteína (oleosina y fosfolípido asociado). Se concibe que las propiedades que disminuyen los niveles de colesterol de un ingrediente de proteína de soya que contiene beta-conglicininas y glicininas, pueden intensificarse añadiendo lipoproteínas de plantas (por ejemplo, oleosinas con fosfolípidos asociados) u otras fuentes (por ejemplo, lipoproteínas de la yema del huevo).

CUADRO 6 Comparación del material de origen y el rendimiento de la HMF Todas las composiciones y métodos descritos y reclamados en la presente, pueden obtenerse y ejecutarse sin experimentación Indebida, a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y los métodos de esta invención se han descrito en términos de modalidades preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que pueden hacerse variaciones a las composiciones y los métodos, así como en los pasos o en la secuencia de pasos de los métodos descritos en la presente, sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están químicamente y fisiológicamente relacionados, pueden sustituir a los agentes descritos en la presente, aunque se obtendrían los mismos resultados o resultados similares. Se considera que dichos sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención, según se define mediante las reivindicaciones.

REFERENCIAS Las siguientes referencias, al grado de que proveen ejemplos de procedimientos u otros detalles complementarios a los que se describen en la presente, se incorporan específicamente en la presente como referencia: Patente de E.U.A. No. 4,554,101 Patente de E.U.A. No. 5,855,892 Patente de E.U.A. No. 6,171 ,640 Patente de E.U.A. No. 6,509,453 Altschul et al., J. Mol. Biol., 215-403-410, 1990. Anderson et al., JAMA, 257: 2176-2180, 1987. Anderson et al., N. Engl. Med., 333(5): 276-282, 1995. Artursson, J. Pharm Sci., 79: 476-482, 990. Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith (ed.), Academic Press, NY, 1993. Birren et al., Genome Analysis, 1 : 543-559, 1997. BLAST Manual, Altschul et al. (eds.), NCBI NLM NIH, Bethesda, MD 20894. Bringe y Cheng, Food Tech., 49(5): 94-106, 1995. Bringe, Adv. Exp. Med. Biol., 415: 161-181 , 1997. Carillo y Lipman, J. Applied Math., 48: 073, 1988. Carol y Hamilton, J. Food Sci., 40: 18-23, 1975. Chen et al., Nutr. Biochem., 6: 310-313, 1995.

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LISTADO DE SECUENCIAS <110> BRINGE, NEAL A. KARUNA ANDAA, KANTHASAMY <120> Composiciones de proteína asociadas con cuerpo oleoso, y métodos de uso de las mismas para reducir el riesgo de enfermedad cardiovascular <130> MONS:017WO <140> DESCONOCIDO <141> 2003-04-17 <150> 60/373,460 <151> 2002-04-18 <160> 18 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 35 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 1 Val Phe Asp Gly Glu Leu Gln Glu Gly Arg Val Leu lie Val Pro Gln 1 5 10 15 Asn Phe Val Val Ala Ala Arg Ser Gln Ser Asp Asn Phe Glu Tyr Val 20 25 30 Ser Phe Lys 35 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 2 Leu Arg Met lie Thr Leu Ala lie Pro Val Asn Lys Pro Gly Arg Phe 1 5 10 15 Glu Ser Phe Phe Leu 20 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 3 lie Phe Val lie Pro Ala Gly Tyr Pro Val Val Val Asn Ala 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170 175 <210> 15 <211> 156 < 12> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 15 Met Ala Asp His His Arg Gly Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly 1 5 10 15 Asp Leu Gln Arg Gly Gly Gly Met His Gly Glu Ala Gln Gln Gln Gln 20 25 30 Lys Gln Gly Ala Met Met Thr Ala Leu Lys Ala Ala Thr Ala Ala Thr 35 40 45 Phe Gly Gly Ser Met Leu Val Leu Ser Gly Leu lie Leu Ala Gly Thr 50 55 60 Val lie Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Val Leu Val lie Phe Ser Pro 65 70 75 80 Val Leu Val Pro Ala Ala lie Ala Leu Ala Leu Met Ala Ala Gly Phe 85 90 95 Val Thr Ser Gly Gly Leu Gly Val Ala Ala Leu Ser Val Phe Ser Trp 100 105 110 Met Tyr Lys Tyr Leu Thr Gly Lys His Pro Pro Ala Ala Asp Gln Leu 115 120 125 Asp His Ala Lys Ala Arg Leu Ala Ser Lys Ala Arg Asp Val Lys Asp 130 135 140 Ala Ala Gln His Arg lie Asp Gln Ala Gln Gly Ser 145 150 155 <210> 16 <211> 187 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 16 Met Ala Asp Arg Asp Arg Ser Gly lie Tyr Gly Gly Ala His Ala Thr 1 5 10 15 Tyr Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gly Gly Gly Gly Arg Pro Met Gly Glu 20 25 30 Gln Val Lys Lys Gly Met Leu His Asp Lys Gly Pro Thr Ala Ser Gln 35 40 45 Ala Leu Thr Val Ala Thr Leu Phe Pro Leu Gly Gly Leu Leu Leu Val 50 55 60 Leu Ser Gly Leu Ala Leu Thr Ala Ser Val Val Gly Leu Ala Val Ala 65 70 75 80 Thr Pro Val Phe Leu lie Phe Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Ala Leu 85 90 95 Leu lie Gly Thr Ala Val Met Gly Phe Leu Thr Ser Gly Ala Leu Gly 100 105 110 Leu Gly Gly Leu Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Asn Thr Ala Arg Gln 115 120 125 Ala Phe Gln Arg Thr Pro Asp Tyr Val Glu Glu Ala Arg Arg Arg Met 130 135 140 Ala Glu Ala Ala Ala Gln Ala Gly His Lys Thr Ala Gln Ala Gly Gln 145 150 155 160 Ala lie Gln Gly Arg Ala Gln Glu Ala Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly 165 170 175 Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Arg Ala Ser Ser 180 185 <210> 17 <211> 183 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 17 Met Ala Thr Thr Thr Tyr Asp Arg His His Val Thr Thr Thr Gln Pro 1 5 10 15 Gln Tyr Arg His Asp Gln His Thr Gly Asp Arg Leu Thr His Pro Gln 20 25 30 Arg His Glu Gln Gly Pro Ser Thr Gly Lys lie Met Val lie Met Ala 35 40 45 Leu Leu Pro lie Thr Gly lie Leu Phe Gly Leu Ala Gly lie Thr Ser 50 55 60 Ser Asp Gly Tyr Arg Ala Ser Leu Ala Thr Pro Leu Phe Val lie Phe 65 70 75 80 Ser Pro Val lie Val Pro Ala Met lie Ala lie Gly Leu Ala Val Thr 85 90 95 Gly Phe Leu Thr Ser Gly Thr Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Leu 100 105 110 Ser Tyr Leu Phe Asn Met Val Arg Arg Ser Thr Met Ser Val Pro Asp 115 120 125 Gln Met Asp Tyr Val Lys Gly Lys Leu Gln Asp Val Gly Glu Tyr Thr 130 135 140 Gly Gln Lys Thr Lys Asp Leu Gly Gln Lys lie Gln His Thr Ala His 145 150 155 160 Glu Met Gly Asp Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gly Gly Lys Glu 165 170 175 Gly Arg Lys Glu Gly Gly Lys 180 FIG. 13

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1. - Un método para preparar un producto alimenticio, que comprende los pasos de: (a) obtener un producto alimenticio seleccionado; y (b) añadir proteína asociada con cuerpo oleoso aislada al producto alimenticio, en donde el consumo de una cantidad efectiva del producto alimenticio disminuye el colesterol en suero de un sujeto que necesita del mismo. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende añadir por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de una saponina, un fitoestrógeno, un fosfolípido y un carbohidrato sustancialmente resistente a la digestión. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la proteína asociada con cuerpo oleoso comprende lipoproteínas. 4 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la proteína asociada con cuerpo oleoso comprende oleosina. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el producto alimenticio se basa en soya. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el producto alimenticio carece de proteína asociada con cuerpo oleoso antes del paso de adición. 7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el producto alimenticio comprende proteína asociada con cuerpo oleoso antes del paso de adición. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el producto alimenticio se selecciona del grupo que consiste de harina de soya, grano de soya, harina integral de soya, hojuelas de soya, leche de soya en polvo, concentrado de proteína de soya, aislado de proteína de soya y polipéptido de soya aislado. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el aislado de proteína de soya es una fracción de alto peso molecular de un material de soya tratado con una proteasa. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el polipéptido de soya aislado comprende ß-conglicinina, o un fragmento de la misma. 11. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el polipéptido de soya aislado es glicinina, o un fragmento de la misma. 12. - Una composición para tratar o prevenir hipercolesterolemia, que comprende: (a) glicinina y/o ß-conglicinina, o fragmentos de las mismas; y (b) proteína asociada con cuerpo oleoso, en donde la glicinina y/o ß-conglicinina y la proteína asociada con cuerpo oleoso están presentes en una cantidad efectiva para proveer un efecto sinergístico para el tratamiento o prevención de hipercolesterolemia en un sujeto que necesita de la misma. 13.- La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque la glicinina o ß-conglicinina es hidrolizada por lo menos parcialmente por una enzima o una mezcla de enzimas. 14.- La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque comprende glicinina, o fragmentos de la misma, y proteína asociada con cuerpo oleoso purificada. 15. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque comprende ß-conglicinina, o fragmentos de la misma, y proteína asociada con cuerpo oleoso purificada. 16. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque la composición comprende de alrededor de 1 % a aproximadamente 5% de proteína asociada con cuerpo oleoso. 17. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque la composición comprende de alrededor de 5% a aproximadamente 10% de proteína asociada con cuerpo oleoso. 18. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque la composición comprende más de aproximadamente 10% de proteína asociada con cuerpo oleoso. 19.- La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque la composición comprende de alrededor de 30% a aproximadamente 50% de proteína asociada con cuerpo oleoso. 20.- La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque comprende por lo menos un compuesto aditivo, en donde el compuesto aditivo se selecciona del grupo que consiste de una saponina, un fitoestrógeno, un fosfolípido y un carbohidrato sustancialmente resistente a la digestión. 21.- La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque el fitoestrógeno comprende una isoflavona. 22. - La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque la isoflavona se selecciona del grupo que consiste de genisteina, daidzeína, equol, biochanina A, formononetina, y sus glucósidos y conjugados de glucósidos de ocurrencia natural respectivos. 23. - La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque el carbohidrato se selecciona del grupo que consiste de almidón de alto contenido de amilosa, oligofructosa y fibra de cotiledones de soya. 24.- La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque el fosfolípido se selecciona del grupo que consiste de lecitína, liso-lecitina y lecitina con una composición de ácido graso modificada. 25. - La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la saponina se selecciona del grupo que consiste de saponina A, saponina B, saponina E, sapogenol A, sapogenol B y sapogenol E de soya. 26. - La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la proteína asociada con cuerpo oleoso comprende lipoproteína. 27. - La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque la lipoproteína es una lipoproteína de mamífero, lipoproteína de la yema del huevo o proteína de membrana de glóbulo de grasa. 28. - La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la proteína asociada con cuerpo oleoso aislada es oleosina. 29.- La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la proteína asociada con cuerpo oleoso aislada es la fracción de oleosina de bajo peso molecular. 30. - La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la proteína asociada con cuerpo oleoso comprende un fragmento de polipéptído que contiene una secuencia anfipática. 31 . - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque la glicinina es la subunidad básica de glicinina. 32. - La composición de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque la subunidad básica de glicinina es la subunidad B-1 b. 33. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque la ß-conglícinina es la subunidad a', o un fragmento de la misma. 34. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque se define que comprende más de 40% de ß-conglicinina, o un fragmento de la misma. 35. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque se define que comprende una o más secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 1 1. 36. - El uso de una proteína asociada con cuerpo oleoso para preparar una composición para el tratamiento o prevención de hipercolesterolemia, en donde dicha composición se añade a un producto alimenticio. 37. - El uso como se reclama en la reivindicación 36, en donde comprende añadir por lo menos un compuesto al producto alimenticio seleccionado del grupo que consiste de una saponina, un fitoestrógeno, un fosfolípido y un carbohidrato sustancialmente resistente a la digestión. 38. - El uso como se reclama en la reivindicación 36, en donde la proteína asociada con cuerpo oleoso comprende lipoproteínas. 39. - El uso como se reclama en la reivindicación 36, en donde la proteina asociada con cuerpo oleoso comprende oleosina. 40. - El uso como se reclama en la reivindicación 36, en donde el producto alimenticio se basa en soya. 41. - El uso como se reclama en la reivindicación 36, en donde el producto alimenticio carece de proteína asociada con cuerpo oleoso antes del paso de adición. 42. - El uso como se reclama en la reivindicación 36, en donde el producto alimenticio comprende proteína asociada con cuerpo oleoso antes del paso de adición. 43. - El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el producto alimenticio se selecciona del grupo que consiste de harina de soya, grano de soya, harina integral de soya, hojuelas de soya, leche de soya en polvo, concentrado de proteína de soya, aislado de proteína de soya y polipéptido de soya aislado. 44. - El uso como se reclama en la reivindicación 43, en donde el aislado de proteína de soya es una fracción de alto peso molecular de un material de soya tratado con una proteasa. 45. - El uso como se reclama en la reivindicación 43, en donde el polipéptido de soya aislado comprende ß-conglicinina, o un fragmento de la misma. 46. - El uso como se reclama en la reivindicación 43, en donde el polipéptido de soya aislado es glicinina, o un fragmento de la misma. 47. - El uso de proteína asociada con cuerpo oleoso purificada para prepaar una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de hipercolesterolemia en un sujeto. 48. - El uso como se reclama en la reivindicación 47, en donde la composición farmacéutica es administrable como una pildora o cápsula. 49. - El uso como se reclama en la reivindicación 47, en donde la composición farmacéutica es administrable como un complemento nutricional. 50. - El uso como se reclama en la reivindicación 47, en donde la enfermedad cardiovascular se previene disminuyendo la concentración de colesterol total en suero. 51. - El uso como se reclama en la reivindicación 50, en donde la concentración de colesterol en suero se reduce disminuyendo la concentración de lipoproteína de baja densidad. 52.- El uso como se reclama en la reivindicación 50, en donde la concentración de colesterol en suero se reduce aumentando la concentración de lipoproteína de alta densidad. 53. - El uso como se reclama en la reivindicación 47, en donde la enfermedad cardiovascular se previene disminuyendo la concentración de triglicéridos en suero. 54. - El uso como se reclama en la reivindicación 47, en donde la enfermedad cardiovascular se trata disminuyendo la concentración de colesterol en hígado. 55. - Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 95% de homología de secuencias con la misma y que tiene la misma actividad biológica de la misma.