KR101238752B1 - 심혈관 질환의 위험성을 감소시키기 위한 오일 바디 결합 단백질 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

심혈관 질환의 위험성을 감소시키기 위한 오일 바디 결합 단백질 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101238752B1
KR101238752B1 KR1020047016758A KR20047016758A KR101238752B1 KR 101238752 B1 KR101238752 B1 KR 101238752B1 KR 1020047016758 A KR1020047016758 A KR 1020047016758A KR 20047016758 A KR20047016758 A KR 20047016758A KR 101238752 B1 KR101238752 B1 KR 101238752B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ala
protein
gly
leu
thr
Prior art date
Application number
KR1020047016758A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20050060031A (ko
Inventor
브린지닐에이
카루나난다칸타사미
Original Assignee
몬산토 테크놀로지 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 filed Critical 몬산토 테크놀로지 엘엘씨
Publication of KR20050060031A publication Critical patent/KR20050060031A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101238752B1 publication Critical patent/KR101238752B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/168—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/14—Vegetable proteins
    • A23J3/16—Vegetable proteins from soybean
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
    • A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
    • A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
    • A23J3/347—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of proteins from microorganisms or unicellular algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A23L33/11—Plant sterols or derivatives thereof, e.g. phytosterols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/185—Vegetable proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)

Abstract

본 발명은 고콜레스테롤혈증을 감소시킴에 따라서 심혈관 질환의 위험성을 감소시키기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다. 당해 조성물은 분리된 오일 바디 결합 단백질을 포함할 수 있다. 추가로 하나 이상의 오일 바디 결합 단백질이 첨가된 식료품을 제공하는 것이다. 본 발명에 사용된 조성물은 추가로 부가 화합물, 예를 들어, 사포닌, 이소플라본, 인지질, 실질적으로 분해에 내성인 탄수화물 또는 이의 배합물을 포함한다. 본 발명은 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 대상체내 콜레스테롤 및 기타 지질 수준을 저하시켜 심혈관 질환의 위험성을 감소시키는 것에 관한 것이다.
고콜레스테롤혈증, 대두, 오일 바디 결합 단백질, 사포닌, 이소플라본, 심혈관질환

Description

심혈관 질환의 위험성을 감소시키기 위한 오일 바디 결합 단백질 조성물 및 이의 사용 방법{Oil body associated protein compositions and methods of use thereof for reducing the risk of cardiovascular disease}
본 출원은 전반적인 내용이 본원에 참조로서 구체적으로 인용된, 2002년 4월 18일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 제60/373,460호의 우선권을 주장한다.
본 발명은 콜레스테롤 수준을 감소시켜 심혈관 질환의 위험성을 감소시키기 위한 신규 조성물, 폴리펩타이드 및 이의 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 오일 바디 결합 단백질을 포함하는 신규 조성물 및 상승된 콜레스테롤 및 심혈관 질환의 예방 및 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다.
심혈관 질환은 사람 집단내에서 이환율 및 사망율의 주요 원인이다. 이것은 특히, 미국과 서유럽 국가에서 나타난다. 많은 원인 제공 인자는 심혈관 질환의 발병과 관련되어 있다. 이들 인자중 몇몇은 당해 질환에 대한 유전적 성향 및 생활양식 인자 (예를 들어, 흡연 및 일상적인 음식 섭취, 연령, 성별, 고혈압 및 고콜레스테롤혈증을 포함하는 고지혈증)를 포함한다. 이들 인자중 다수, 특히, 고지혈증 및 고콜레스테롤혈증이, 심혈관 질환의 주요 원인인 죽상동맥경화증의 발병에 기여한다.
높은 혈중 콜레스테롤 농도는 사람의 심혈관 질환에 대한 주요 위험 인자중 하나이다. 저밀도 지단백질 콜레스테롤 ("LDL") 및 전체 콜레스테롤의 상승은 관상동맥 심장 질환의 위험성이 증가된 것과 직접 연관이 있다[문헌참조: Anderson et al., 1987]. 전체 콜레스테롤 및 LDL의 고수준이 죽상동맥경화증 및 혈관 질환을 발병시키는데 있어 위험 인자이긴 하지만 최근에, 고밀도 지단백질 콜레스테롤 ("HDL")의 결핍은 당해 증상들을 발병시키는 추가의 위험 인자인 것으로 인식되었다. 여러 임상 시험은 죽상동맥경화증에 대한 HDL의 보호 역할에 대한 이론을 뒷받침한다. 그러한 한 연구는 여성에서 혈중 HDL이 dl당 1-mg이 증가할때 마다 관상 혈관 질환을 3% 씩 감소시킴을 입증하였다[문헌참조: Gordon et al., 1989]
당해 연구는 사람의 식료품 섭취를 변화시켜 콜레스테롤을 감소시킬 수 있음을 지적했다. 무엇보다, 특정 연구는 섭취된 단백질의 질 뿐만 아니라 양이 혈청 콜레스테롤의 수준에 크게 영향을 준다고 지적했다[문헌참조: Carol and Hamilton, 1975; Nagaoka et al., 1992; Potter, 1995]. 식료품중에 동물성 단백질 대신 식물성 단백질을 섭취하는 것은 심혈관 질환의 위험을 감소시키는 것과 관련이 있고 이것은 혈청 콜레스테롤 수준의 감소를 반영하는 것일 수 있다. 특히, 식물성 단백질인 대두 단백질은 동물성 단백질 카제인과 비교하여 혈청 콜레스테롤 수준을 감소시키는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Nagaoka et al., 1999]. 보다 최근에, 사람에서 혈청 지질에 대한 대두 단백질 섭취의 효과에 관한 메타 (meta) 분석은 식료품 대두 단백질이 사람에서 전체 콜레스테롤 및 LDL의 혈청 농도를 저하시키는 것과 크게 관련이 있으나 HDL 콜레스테롤 농도에는 크게 영향을 미치지 않음을 밝혔다[문헌참조: Anderson et al., 1995].
콜레스테롤을 저하시키는 대두 단백질의 능력에 관여하는 제제중 하나는 고분자량의 분획물 (HMF)이다. HMF는 단백질 분해후 온전하게 잔류하는 대두 단백질의 비분해성 부분을 구성한다. 따라서, 당해 분획물은 다수의 상이한 펩타이드 또는 펩타이드 단편들로 이루어진다. 사실, 대두 단백질의 HMF는 동물 및 사람 둘다의 연구에서 혈청 콜레스테롤을 크게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 비분해성 HMF는 미소융모막에 의한 콜레스테롤의 수동적 흡수를 차단하거나 콜레스테롤의 단백질 매개 흡수를 차단함에 의해 콜레스테롤의 흡수를 방해하는 것으로 사료된다. 대조적으로, 저분자량의 분획물인 대두 단백질의 분해성 분획물은 실질적으로 혈청 콜레스테롤을 증가시키는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Sugano, et al., 1988].
콜레스테롤 저하제로서 대두 단백질 및 특히, HMF의 잠재적인 치료학적 가치에도 불구하고, 비분해성 및 혈중 콜레스테롤 저하 활성에 관여하는 특정 성분들이 밝혀지지 않았다. 따라서, 심혈관 질환과 관련된 콜레스테롤 및 기타 위험 인자들을 감소시키는데 보다 강력한 치료제를 제공하고자 하는 노력의 일환으로 이들 활성 성분들을 동정할 필요가 있다.
발명의 요약
한 측면에서, 본 발명은, (a) 선택된 식료품을 수득하는 단계 및 (b) 분리된 오일 바디 결합 단백질을 당해 식료품에 첨가하는 단계를 포함하는 식료품을 제조하는 방법에 관한 것이고, 여기서, 유효량의 식료품의 소비는 이를 필요로 하는 대상체의 혈청 콜레스테롤을 감소시킨다. 특정 양태에서, 당해 방법은 사포닌, 피토에스트로겐, 인지질 및 실질적으로 분해에 내성인 탄수화물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 오일 바디 결합 단백질은 지단백질 및/또는 올레오신을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 식료품은 대두가 주요 성분이다. 당해 조성물에는 첨가하는 단계 이전에 오일 바디 결합 단백질이 결여되어 있거나 존재할 수 있다. 식료품의 예는 대두 가루, 대두 알갱이, 대두 굵은 가루, 대두 조각, 두유 분말, 대두 단백질 농축물, 대두 단백질 분리물 및 분리된 대두 폴리펩타이드를 포함하지만 특별히 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 특정 양태에서, 대두 단백질 분리물은 프로테아제로 처리된 대두 물질의 고분자량의 분획물이다. 추가의 양태에서, 분리된 대두 폴리펩타이드는 β-콘글리시닌 또는 이의 단편 및/또는 글리시닌 또는 이의 단편이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 글리시닌 및/또는 β-콘글리시닌 또는 이의 단편 및 (b) 오일 바디 결합 단백질을 포함하는 고콜레스테롤혈증을 치료하거나 예방하기 위한 조성물을 제공하고, 여기서, 글리시닌 및/또는 β-콘글리시닌 및 오일 바디 결합 단백질은 유효량으로 존재하여 이를 필요로 하는 대상체에서 고콜레스테롤혈증의 치료 또는 예방을 위한 공동상승 작용 효과를 제공한다. 한 양태에서, 글리시닌 또는 β-콘글리시닌은 효소 또는 효소의 혼합물에 의해 적어도 부분적으로 가수분해된다. 추가의 양태에서, 조성물은, 글리시닌 또는 이의 단편 및 정제된 오일 바디 결합 단백질을 포함하고, 또 다른 양태에서는 β-콘글리시닌 또는 이의 단편 및 정제된 오일 바디 결합 단백질을 포함한다. 본 발명의 특정 양태에서, 당해 조성물은 약 1중량% 내지 약 5중량%, 약 5중량% 내지 약 10중량%, 약 10중량% 초과 또는 약 30중량% 내지 약 50중량%의 오일 바디 결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 조성물은, 사포닌, 피토에스트로겐, 인지질 및 실질적으로 분해에 내성인 탄수화물을 포함하는 하나 이상의 부가 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 피토에스트로겐의 예는 이소플라본을 포함한다. 이소플라본의 예는 게니스테인, 디아드제인, 에쿠올, 바이오카닌 A, 포르모노네틴 및 이의 각각의 천연 글루코사이드 및 글루코사이드 접합체를 포함한다. 탄수화물의 예는 고 아밀로스 전분, 올리고프럭토스 및 대두 자엽 섬유를 포함한다. 본 발명의 한 양태에서, 인지질은 레시틴, 리소-레시틴, 및 변형된 지방산 조성을 갖는 레시틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 양태에서, 사포닌은 대두 사포닌 A, 사포닌 B, 사포닌 E, 사포게놀 A, 사포게놀 B 및 사포게놀 E로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 오일 바디 결합 단백질은 포유동물 지단백질, 난황 지단백질 또는 지방 소구체 막 단백질을 포함할 수 있다. 오일 바디 결합 단백질은 또한 올레오신일 수 있고 저분자량의 올레오신 분획물을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 오일 바디 결합 단백질은 양쪽성 서열을 포함하는 폴리펩타이드 단편을 포함한다. 조성물이 글리시닌을 포함하는 경우, B-1b 서브유니트를 포함하는 글리시닌의 염기성 서브유니트를 포함할 수 있다. 당해 조성물은 또한 α' 서브유니트 또는 이의 단편을 포함하는 β-콘글리시닌을 포함할 수 있다. 당해 조성물은 40% 초과의 β-콘글리시닌 또는 이의 단편을 포함하는 것으로서 추가로 정의될 수 있다. 당해 조성물은 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 9, 서열 10 및 서열 11로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 것으로서 추가로 정의될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 오일 바디 결합 단백질을 선택된 식료품에 첨가하는 단계 및 (b) 당해 식료품을 고콜레스테롤혈증을 치료하거나 예방하는데 충분한 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 단계를 포함하는, 고콜레스테롤혈증을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다. 당해 방법은 사포닌, 피토에스트로겐, 인지질 및 실질적으로 분해에 내성인 탄수화물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식료품에 하나 이상의 화합물을 첨가하는 추가의 단계를 포함한다. 한 양태에서, 오일 바디 결합 단백질은 지단백질, 예를 들어, 올레오신을 포함한다. 또 다른 양태에서, 식료품은 대두가 주요 성분이다. 식료품의 예는 대두 가루, 대두 알갱이, 대두 굵은 가루, 대두 조각, 두유 분말, 대두 단백질 농축물, 대두 단백질 분리물 및 분리된 대두 폴리펩타이드를 포함한다. 식료품에는 첨가 단계 이전에 오일 바디 결합 단백질이 부재이거나 존재할 수 있다. 대두 단백질 분리물은 프로테아제로 처리된 대두 물질의 고분자량 분획물을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 분리된 대두 폴리펩타이드는 β-콘글리시닌 또는 이의 단편 및/또는 글리시닌 또는 이의 단편을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 정제된 오일 바디 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는, 고콜레스테롤혈증을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다. 당해 약제학적 조성물은 환제, 캅셀제 또는 영양 보충물을 포함하여 어떠한 방식으로도 투여될 수 있다. 당해 방법에서, 심혈관 질환은 총 혈청 및/또는 간 콜레스테롤 또는 트리글리세라이드의 농도를 감소시킴으로써 예방될 수 있다. 혈청 콜레스테롤 농도는 저밀도 지단백질의 농도를 감소시키고 고밀도 지단백질의 농도를 증가시킴으로써 저하될 수 있다.
여전히, 또 다른 측면에서, 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이것과 95% 이상의 서열 상동성을 갖고 동일한 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩타이드가 제공된다.
본 발명의 또 다른 특징, 측면 및 잇점은 하기에 기재된 내용, 첨부된 청구항 및 도면과 함께 보다 잘 이해될 것이다.
도 1은 대두 기원의 올레오신 단백질 P24 올레오신 이소형 (isoform) A(P89)의 서열 (승인 번호 제P29530호 및 서열 12에 상응함)을 도시한다.
도 2는 대두 기원의 올레오신 단백질 P24 올레오신 이소형 B(P91)의 서열 (승인 번호 제P29531호 및 서열 13에 상응함)을 도시한다.
도 3은 옥수수 (제아 메이스: Zea mays)) 기원의 오일 바디 결합 단백질 17kDa 올레오신 (oleo17)의 아미노산 서열 (승인 번호 제AAA68066호 및 서열 14에 상응함)을 도시한다.
도 4는 옥수수 (제아 메이스) 기원의 오일 바디 결합 단백질 16kDa 올레오신 (oleo16)의 아미노산 서열 (승인 번호 제AAA68065호 및 서열 15에 상응함)을 도시한다.
도 5는 옥수수 (제아 메이스) 기원의 올레오신 KD18(KD18; L2)의 아미노산 서열 (승인 번호 제AAA67699호 및 서열 16에 상응함)을 도시한다.
도 6은 에이취 안누스 (H. annuus) (해바라기) 올레오신의 아미노산 서열 (승인 번호 제CAA55348호 및 서열 17에 상응함)을 도시한다.
도 7은 OBAP(+)로 불리는 대두 단백질 분리물 기원의 HMF의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리된 겔의, 폴리펩타이드 함유 밴드 5개를 도시한다.
도 8은 폴리아크릴이미드 겔상에서 정제되고 분리된 오일 바디 결합 단백질(P34 및 올레오신)을 도시한다.
도 9는 G1 글리시닌 부재의 대두로부터 제조된, 펩신 분해된 대두 단백질 분리물로부터의 HMF를 함유하는 겔을 도시한다.
도 10은 OBAP(+) 대 OBAP(-) 대두 단백질 분리물로부터의 분리물 HMF의 Caco-2 세포에 의한 콜레스테롤 흡수에 대한 용량 의존성 억제를 도해하는 그래프를 도시한다.
도 11은 시토스탄올의 존재하의 콜레스테롤 흡수 대 글리시닌-부재 HMF 및 α/α' β-콘글리시닌-부재 HMF의 존재하의 콜레스테롤 흡수 간의 차이를 도해하는 그래프를 도시함으로써 기작의 차이를 입증한다.
도 12는 샘플 각각에서 올레오신의 존재를 도시하는 겔을 도시한다.
도 13은 지적된 샘플중의 올레오신의 존재 또는 부재를 도시하는 겔을 도시한다.
본 발명은 심혈관의 건강에 이득이 되는 조성물을 동정함으로써 선행 기술 분야의 한계를 극복한다. 특히, 본 발명의 한 측면은 오일 바디 결합 단백질이 콜레스테롤 수준을 저하시키는 능력을 갖고 있음을 밝힌 것이다. 대두 단백질과 같은 식물 성분이 혈중 콜레스테롤 저하 활성을 갖는 것으로 공지되어 있지만 당해 활성에 관여하는 특정 성분의 특징이 이전에 밝혀진 바 없다. 따라서, 본 발명은, 식물 단백질에 콜레스테롤을 저하시키는 특징적인 능력을 부여하는 오일 바디 결합 단백질 (올레오신 및 난황 지단백질 포함)의 능력의 발견에 관한 것이다. 동등하게, 본 발명은 대두 식료품과 같은 식물체와 당해 특정 성분의 공동상승 작용 배합물에 관한 것이다. 어떠한 특정 이론에 구애받지 않으면서, 오일 바디 결합 단백질이 대두 물질에 존재하는 생물활성 펩타이드의 분해를 차단함으로써 조성물의 혈중 콜레스테롤 저하 활성을 증진시키는 것으로 사료된다. 추가로, 본 발명은 혈중 콜레스테롤 저하 활성을 추가로 증진시키는, 대두 물질과, 사포닌, 피토에스트로겐, 인지질, 실질적으로 분해에 내성인 탄수화물 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 부가 성분과의 공동 상승 작용적인 배합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단독으로 또는 기타 화합물과 배합되어 혈중 전체 콜레스테롤 농도를 저하시키고 특히, LDL-콜레스테롤 농도를 감소시켜 심혈관 질환의 발병을 억제하는 당해 펩타이드의 치료학적 용도를 포함한다.
오일 바디는 많은 식물에 의해 에너지원으로서 사용되는 트리글리세라이드를 포집하여 저장하고 있는 소형의 구형 아세포 소기관이다. 대부분의 식물 및 상이한 조직에서 발견되지만 이들은 특히, 평지씨의 종자에 풍부하고 여기서, 이들은 공통적으로 직경크기의 범위가 1㎛에서 수 ㎛ 이다. 오일 바디는 전형적으로 트리아실글리세라이드로 구성되고 지단백질 및 단백질에 의해 둘려싸여져 있다. "오일 바디 결합 단백질"은 오일 바디와 물리적으로 결합된 당해 단백질 및 지단백질중 어느 하나 및 이 모두를 포함한다. 식물에서, 주요 오일 바디 결합 단백질은 올레오신이다. 올레오신은 클로닝되었고 옥수수, 평지, 당근 및 목화를 포함하는 많은 식물원으로부터 서열 분석되었다. 상이한 종 기원의 올레오신은 전형적으로 고도로 보존되어 있다.
I. 약어 및 정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 본원에 사용된 바와 같은 다수의 용어 및 약어는 하기에서 정의한 바와 같다:
HMF는 고분자량의 분획물
본원에 사용된 바와 같이, "고분자량의 분획물"은 pH 6 내지 7에서 15분 내지 20분 동안 4,000 내지 10,000 x g에서 원심분리에 의해 분리될 수 있는 분리물의 가수분해 또는 화학적 분해후에 잔류하는 식물 단백질 분리물의 분획물을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같이, "부가 화합물"은 본 발명의 조성물에 첨가되는 단일 화합물 또는 그룹 화합물을 총칭한다. 이들 화합물은 사포닌, 피토에스트로겐, 인지질 및 탄수화물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산"은 이의 가장 광의적 의미로 사용되고 아미노산 유사체 및 유도체를 포함하는 비천연적으로 존재하는 아미노산 뿐만 아니라 천연적으로 존재하는 아미노산을 포함한다. 후자는 아미노산 잔기를 함유하는 분자를 포함한다. 당업자는 이의 광범위한 의미에서, 본원에 언급된 아미노산이 예를 들어, 천연적으로 존재하는 단백질성 L-아미노산; D-아미노산; 화학적으로 변형된 아미노산 (예를 들어, 아미노산 유사체 및 유도체); 천연적으로 존재하는 비단백질성 아미노산 (예를 들어, 노르류신 (β-알라닌, 오르니틴등)); 및 당해 기술 분야에 공지된 아미노산 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물을 포함하는 것으로 인지할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질발생성 (proteogenic)"은 아미노산이 대사 경로를 통해 세포내 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 혼입될 수 있음을 지적한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 유리산 또는 유리 염기의 알칼리 금속 염 및 부가염을 형성하는데 일반적으로 사용되는 염을 포함한다. 염의 특성은 중요하지 않고 단, 약제학적으로 허용가능해야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "분비 서열" 또는 "시그날 펩타이드" 또는 "시그날 서열"은 새롭게 합성된 분비성 단백질 또는 막 단백질을 소포체로 이동시키고 이를 통과하도록 하거나 세균의 세포질로부터 내부막을 거쳐 막주변세포질 (periplasm)로 이동시키거나 미토콘드리아의 매트릭스로부터 내부 공간으로 이동시키거나 엽록체의 스트로마 (stroma)로부터 틸라코이드 (thylakoid)로 이동시키는 서열을 의미한다. 당해 서열과 이종성 숙주에서 발현될 유전자와의 융합은 숙주 세포로부터 재조합 단백질이 확실히 분비될 수 있도록 한다.
본원에 사용된 바와 같은 "폴리펩타이드" 및 "올리고펩타이드"는 상호교환적으로 사용되고 펩타이드 결합에 의해 2개 이상의 아미노산이 함께 연결된 중합체를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "서열"은 단량체가 중합체에 존재하는 선형 배열, 예를 들어, 폴리펩타이드내 아미노산의 배열 또는 폴리뉴클레오타이드내에서 뉴클레오타이드의 배열을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "분쇄된 전두"는 예를 들어, 대두의 껍질 및 씨를 포함하는, 전체 대두를 박리시키거나 갈아서 형성된 대두 물질을 포함한다. 분쇄된 전체 대두 물질은 대두내에 본래 존재하는 지방을 포함할 수 있거나 탈지시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "대두 가루"는 예를 들어, 껍질 제거한 대두로부터 형성되고 평균 입자 크기가 150㎛ 이하인, 무수 상태를 기준으로 65중량% 미만의 단백질 함량을 갖는 대두 물질을 포함한다. 용어 "대두 가루"는 예를 들어, 두유 분말을 포함할 수 있다. 대두 가루는 대두에 본래 존재하는 지방을 함유할 수 있거나 탈지시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "대두 알갱이"는 예를 들어, 껍질 제거한 대두로부터 형성되고 평균 입자 크기가 150㎛ 내지 1000㎛인 무수 상태를 기준으로 65중량% 미만의 대두 단백질 함량을 갖는 대두 물질을 포함한다. 대두 알갱이는 대두내에 본래 존재하는 지방을 함유할 수 있거나 탈지시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "대두 굵은 가루"는 예를 들어, 껍질 제거한 대두로부터 형성되고 대두 가루 또는 대두 알갱이의 정의내에 포함되지 않는 무수 상태를 기준으로 65중량% 미만의 단백질 함량을 갖는 대두 물질을 포함한다. 대두 굵은 가루는 대두내에 본래 존재하는 지방을 함유할 수 있거나 탈지시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "대두 조각"은 예를 들어, 껍질 제거된 대두에 의해 형성되는 무수 상태를 기준으로 65중량% 미만의 대두 단백질 함량을 갖는 조각난 대두 물질인 대두 단백질 물질을 포함한다. 대두 조각은 대두에 본래 존재하는 지방을 함유할 수 있거나 탈지시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "대두 단백질 농축물"은 예를 들어, 고품질의 완전하고 세정된 껍질 제거된 대두 종자로부터 제조된 대두 단백질 물질을 포함한다. 대두 단백질 농축물은 지용성 및 수용성 비단백질 성분 대부분을 제거함에 의해 제조될 수 있고 전형적으로 무수 상태를 기준으로 65중량% 미만의 단백질을 함유한다. 또 다른 양태에서, "대두 단백질 농축물"은 또한 추가로 대두 단백질 및 인지질의 혼합물을 포함하는 것으로 해석될 수 있고 이때, 무수 상태를 기준으로 총 단백질은 약 65 내지 약 90중량의 단백질이다. 전형적으로, 이것은 3개의 기본 공정에 의해 껍질제거되고 탈지된 대두로부터 제조된다. 산 삼출 (약 pH 4.5에서), 알콜로의 추출 (약 55 내지 80%) 및 물로의 추출 전에 습열로 단백질을 변성시키는 공정. 낮은 수용성 (수성 알콜 추출) 대두 단백질 농축물을 가열시키고 (스팀 분사 또는 제트 쿠킹) 및 기계적 작업 (파쇄)을 수행하여 용해도 및 기능성을 증가시킨다. 무수 상태를 기준으로 총 단백질이 65 내지 90%의 단백질인 대두 단백질 및 인지질의 혼합물을 언급할때 당해 물질은 대두 단백질 분리물을 인지질과 배합하거나 인지질:단백질 복합체 (즉, 오일 바디 단백질 및 관련 인지질)를 대두로부터 분획시킴에 의해 제조될 수 있다. 용어 "대두 단백질 농축물"은 예를 들어, 두유 분말을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, "대두 단백질 추출물"은 예를 들면, 특정의 대두 단백질중에 풍부한 대두 단백질 농축물 또는 분리물을 포함한다. 전체 대두 단백질 물질로부터 분획화된 대두 단백질 물질은 예를 들면, 대두 단백질 성분 폐기물 또는 유장 스트림 (알콜 또는 산성 수 추출 단계)으로부터 제조할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, "대두 단백질 분리물"은 예를 들면, 대부분의 비-단백질 화합물을 제거함에 의해 껍질 제거된 대두로부터 제조된 대두의 주요 단백질성 분획물이고 바람직하게는 무수 상태를 기준으로 하여 90% 이상의 단백질을 함유하는 대두 단백질 물질을 포함한다. 다른 양태에서, "대두 단백질 분리물"은 또한 예를 들면 β-콘글리시닌, 글리시닌 및 올레오신과 같은 특정 유형의 대두 단백질에 풍부한 대두 단백질 물질을 추가로 포함하거나, 달리는 올레오신과 같은 특정 유형의 대두 단백질이 결여된 것으로서 해석될 수 있다. 단백질은 물 또는 pH 8 내지 9 범위의 약 알칼리를 사용하여 가열시키지 않은 탈지방 대두 조각으로부터 통상적으로 추출한 후 원심분리하여 불용성인 섬유성 잔사를 제거하고; 수득되는 추출물을 pH 4.5로 조정하고 (여기서, 대부분의 단백질이 응유로서 침전된다); 수득되는 응유를 가용성 올리고사카라이드로부터 원심분리한 후 다중 세척에 의해 분리하고; 수산화나트륨 또는 수산화칼륨으로 중화시켜 이를 더욱 가용성이고 기능성이 되도록 하고; 열처리[예를 들어, 제트 쿠커 (jet-cooker) 사용]하며 분무 건조시킨다. 열 처리 단계전 프로테아제를 또한 첨가하여 단백질을 부분적으로 가수분해시키고 대두 단백질 분리물의 용해도를 향상시킬 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, "펩타이드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 화합물을 의미한다.
본원에 사용된 것으로서, "재조합 단백질"은 천연 또는 돌연변이 1차 아미노산 서열을 포함하는 단백질이, 유전자 및/또는 단백질이 천연적으로 발견된 세포이외의 세포내에서 재조합 DNA 분자가 지니는 유전자의 발현에 의해 수득됨을 의미한다. 다시 말해서, 유전자는 발현되는 숙주에 대해 이종이다. 유전자에 대한 친화성 정제 잔기를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 첨가를 포함하는, 유전자의 어떠한 변형이라도, 유전자가 본 정의의 목적에 있어 비천연적이 되도록 함으로써 유전자가 어떠한 세포내에서 "천연적"으로 발견될 수 없도록 함을 주목하여야 한다.
본원에 사용된 것으로서, "표적화 서열"은 단백질 또는 펩타이드의 측면에서 의미하며, "표적화 서열"은 이의 존재가, 단백질이 세포내 특정 위치로 지시되도록 하는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다.
어구 "치료학적으로 효과적인"은 질환의 중증도를 예방하거나 개선시키는 한편, 변형 치료요법과 통상적으로 관련된 부작용 효과를 피하는 제제의 능력을 나타낸다. 어구 "치료학적으로 효과적인"은 어구 "치료 또는 예방에 효과적인"과 동일한 것으로 이해되어야 하며, 이들 둘다는 예를 들면, 심혈관 질환의 위험성을 감소시키거나 당해 질환을 예방하는 한편 변형 치료요법과 통상적으로 관련된 부작용 효과를 피하는 목표를 달성시킬 본 발명의 방법에 사용된 조성물의 질을 규정하는 것으로 의도된다.
II. 본 발명의 폴리펩타이드
출원인은 대두 물질로부터 분리된 폴리펩타이드 서열, 더욱 특히 혈중 콜레스테롤 저하 활성을 갖는 대두 물질의 HMF로부터 분리된 폴리펩타이드의 서열을 동정하였다. 이들 서열은 글리시닌 또는 β-콘글리시닌 기원의 펩타이드를 암호화한다. 단백질 글리시닌 및 β-콘글리시닌은 종자 저장 단백질이다. 글리시닌은 대략 분자량이 320 킬로달톤 ("kDa")이고 각각 산성 및 염기성 서브유니트로 이루어진 6개의 서브유니트로 구성된다. 더우기, β-콘글리시닌은 대략의 분자량이 150 kDa이고 다양한 비율의 상이한 종류의 서브유니트 (α,α' 및 β)로 구성된다. 글리시닌 및 β-글리시닌 유형의 단백질은 상이한 식물종에 걸쳐 고도로 보존되어 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 측면은 글리시닌 단백질로부터의 1개 내지 수개의 분리된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편을 포함한다. 하나의 양태에서, 분리된 폴리펩타이드의 서열은 서열 1로 제공되며, VFDGELQEGRVLIVPQNFVVAARSQSDNFEYVSFK에 상응한다.
본 발명의 추가의 측면은 β-콘글리시닌 단백질로부터의 1개 내지 수개의 분리된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편을 제공하는 것이다. 하나의 양태에서, 분리된 폴리펩타이드의 서열은 서열 2로 제공되며 LRMITLAIPVNKPGRFESFFL에 상응한다. 다른 양태에서, 분리된 폴리펩타이드의 서열은 서열 3으로 제공되며 IFVIPAGYPVVVNATSHLNFFAIGI에 상응한다. 다른 양태에서, 분리된 폴리펩타이드의 서열은 서열 4로 제공되며 LQESVIVEISKK에 상응한다. 다른 양태에서, 분리된 폴리펩타이드의 서열은 서열 5로 제공되며 QQQEEQPLEVRK에 상응한다. 여전히 다른 양태에서, 분리된 폴리펩타이드의 서열은 서열 6으로 제공되며 NQYGHVR에 상응한다. 여전히 다른 양태에서, 분리된 폴리펩타이드의 서열은 서열 7로 제공되며 AIVILVINEGDANIELVGL에 상응한다. 다른 양태에서, 분리된 폴리펩타이드의 서열을 서열 8로 제공되며 NILEASYDTKFEEINK에 상응한다. 여전히 다른 양태에서, 분리된 폴리펩타이드의 서열은 서열 11로 제공되며 IFVIPAGYPVVVNATSDLNFFAFGI에 상응한다.
출원인은 또한 혈중 콜레스테롤 저하 활성을 나타내는 올레오신의 서열을 동정하였다. 올레오신은 식물 오일 바디의 막 성분에서 주로 발견된다. 올레오신 단백질은 3개의 도메인으로 이루어진다; 단백질의 2개의 말단, N- 및 C-말단은 대부분 친수성이고 세포질에 노출된 오일 바디의 표면상에 위치하는 반면, 올레오신의 고 소수성 중심 코어는 막 및 트리아실글리세라이드내에 견고하게 고정되어 있다. 올레오신은 또한 C-말단에 또는 근처에 양쪽성 알파-나선형 도메인을 함유한다. 상이한 종으로부터의 올레오신은 특히 단백질의 중심 영역에 상당한 아미노산 서열 보존을 나타내는 단백질 소 부류를 나타낸다. 개개의 종내에서, 적은 수의 상이한 이소형이 존재할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 올레오신 단백질로부터 1개 내지 수개의 분리된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편을 포함한다. 하나의 양태에서, 올레오신은 도 1에 상응하는, 대두로부터의 P24 이소형 A(P89) (승인 번호 제P29530호; 서열 12)이다. 다른 양태에서 올레오신은 도 2에 상응하는, 대두로부터의 P24 이소형 B(P91) (승인 번호 제 P29531호; 서열 13)이다. 다른 양태에서, 올레오신은 도 3에 상응하는, 옥수수 (제아 메이스)로부터의 오일 바디 결합 단백질 17kDa 올레오신 (oleo17) (승인 번호 제AAA68006호; 서열 14)이다. 다른 양태에서, 올레오신은 도 4에 상응하는, 옥수수 (제아 메이스)로부터 오일 바디 결합 단백질 16kDa 올레오신 (oleo16) (승인 번호 제AAA68065호; 서열 15)이다. 다른 양태에서, 올레오신은 도 5에 상응하는, 옥수수 (제아 메이스)로부터의 올레오신 KD18(KD18; L2) (승인 번호 제AAA67699호; 서열 16)이다. 다른 양태에서, 올레오신은 도 6에 상응하는, 에이치. 안누스 (H. annuus) 올레오신 (해바라기) (승인 번호 제CAA55348호; 서열 17)이다. 추가의 양태에서, 분리된 올레오신 폴리펩타이드의 서열은 서열 9로 제공되며 VKFITAATIGITLLLL에 상응한다. 다른 양태에서, 불리된 올레오신 폴리펩타이드의 서열은 서열 10으로 제공되며 YETNSSLNNPPSR에 상응한다.
또한, 본 발명은 올레오신과 90%, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 97% 및 더욱 바람직하게는 99%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발 명의 추가의 양태는 서열 1 내지 11의 어떠한 서열과도 90%, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 97%, 및 더욱 바람직하게는 99%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.
당해 분야에 잘 이해되어 있는 "상동성"은 서열을 비교하여 측정한, 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 관계이다. 당해 분야에서, "상동성"은 또한 이러한 서열의 각각 사이의 매치 (match)에 의해 측정된 것으로서 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열사이의 서열 관련 정도를 의미한다. "상동성"은 문헌 (참조: Computational molecular Biology, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, 1987; Sequence Analysis Primer, 1991; 및 Carillo and Lipman, 1988)에 기술된 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는 공지된 방법으로 용이하게 산정할 수 있다. 상동성을 측정하는 방법은 시험한 서열간의 최대 매치를 제공하는 것으로 설계된다. 더우기, 상동성을 측정하는 방법은 널리 이용되는 프로그램에서 코드화되어 있다. 2개의 서열간의 동일성/상동성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램은 GCG (참조: Devereux et al., 1984); 5개의 BLAST 프로그램[이중 3개는 뉴클레오타이드 서열 질의에 대해 설게되어 있고 (BLASTP, BLASTX, 및 TBLASTX), 2개는 단백질 서열 질의에 대해 설계되어 있다 (BLASTP 및 TBLASTN); Coulson, 1994; Birren, et al., 1997 참조]를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. BLAST X 프로그램은 업자 (NCBI) 및 기타 공급원 (참조: BLAST Manual; Altschul et al., 1990)로부터 시판된다. 잘 알려진 스미쓰 워터만 알고리듬을 또한 사용하여 상동성을 측정할 수 있다.
본 발명은 또한 분리된 단백질에 관한 것이다. 본원에 사용된 것으로서 용어 단백질은 글리시닌, β-콘글리시닌 또는 올레오신 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함한다. 본 발명의 단백질은 천연 단백질, 재조합 단백질 또는 합성 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다.
당해 분야의 숙련가들은, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열내 변형이 본래의 아미노산 서열과 비교시 동등하거나 우월한 작용 특성을 나타내는 동등한, 또는 가능하게는 개선된 제2의 펩타이드 생성 등을 초래할 수 있음을 잘 인지하고 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 변형은 아미노산 삽입, 결실, 치환, 절단, 융합, 서브유니트 서열의 이동 등을 포함하며, 단, 이러한 변형에 의해 제조된 펩타이드 서열은 실질적으로 본원에 기술된 천연적으로 존재하는 대응하는 서열과 동일한 작용 특성을 실질적으로 갖는다. 생물학적 활성 또는 작용은 예를 들면, 하기 실시예에 묘사한 바와 같이 총 혈청 콜레스테롤을 저하시키기 위한 단백질의 능력에 의해 측정할 수 있다.
이러한 변화를 유발하기 위해 고려될 수 있는 하나의 인자는 아미노산의 하이드로패틱 지수 (hydropathic index)이다. 단백질상의 상호활성 생물학적 작용을 부여하는 하이드로패틱 아미노산 지수의 중요성은 카이트 및 둘리틀 (Kyte and Doolittle, (1982))에 의해 논의되어 왔다. 아미노산의 상대적인 하이드로패틱 특성은 수득되는 단백질의 2차 구조에 기여하는 것으로 받아들여지고 있다. 즉, 이는 단백질과, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과 같은 분자의 상호작용에 영향을 미친다.
소수성 및 전하 특성에 기초하여, 각각의 아미노산은 다음과 같은 하이드로패틱 지수를 갖는다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트/글루타민/아스파르테이트/아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 펩타이드 또는 단백질내 특정의 아미노산은 유사한 하이드로패틱 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환시켜 유사한 생물학적 활성을 갖는, 즉, 여전히 생물학적 기능을 지니는 단백질 또는 펩타이드를 제조할 수 있다. 이러한 변화를 유발하는데 있어서, 하이드로패틱 지수가 ±2이내인 아미노산을 다른 아미노산으로 치환되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 치환은, 아미노산의 하이드로패틱 지수가 ±1인 것이다. 가장 바람직한 치환은, 아미노산의 하이드로패틱 지수가 ±0.5인 것이다.
유사한 아미노산은 또한 친수성을 기준으로 치환시킬 수 있다. 미국 특허 제4,554,101호는, 인접한 아미노산의 소수성에 의해 지배되는 것으로서, 단백질의 최대 국부적인 평균 소수성이 단백질의 생물학적 특성과 관련됨을 기술하고 있다. 다음 친수성 지수가 아미노산에 부여되어 있다: 아르기닌/라이신(+3.0); 아스파르테이트/글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴/글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌/히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신/이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 및 트립토판(-3.4). 따라서, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질내 하나의 아미노산은 유사한 친수성 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환시킬 수 있으며 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는, 즉, 여전히 정확한 생물학적 작용을 보유하는 단백질을 제조할 수 있다. 이러한 변화를 유발시키기 위해서는, 하이드로패틱 지수가 ±2이내인 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 것이 바람직하며, 하이드로패틱 지수가 ±1이내인 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 것이 더욱 바람직하고, 하이드로패틱 지수가 ±0.5이내인 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 것이 가장 바람직하다.
위에서 요약한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드내 아미노산 치환은 아미노산 측쇄 치환의 상대적인 유사성, 예를 들면, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기초로할 수 있다. 본 발명의 펩타이드내 사일런스 변화 (silent change)를 유도하는 보존성 아미노산 변화를 유도하기 위해 고려되는 전술된 각종 특성을 취한 예시적인 치환은 천연적으로 존재하는 아미노산이 속하는 부류의 다른 구성원으로부터 선택할 수 있다. 아미노산은 다음 4개의 그룹으로 분류시킬 수 있다: (1) 산성 아미노산; (2) 염기성 아미노산; (3) 중성의 극성 아미노산; 및 (4) 중성의 비극성 아미노산. 이들 각종 그룹내의 대표적인 아미노산은 (1) 산성(음 하전된) 아미노산(예: 아스파르트산 및 글루탐산); (2) 염기성(양 하전된) 아미노산(예: 아르기닌, 히스티딘 및 라이신); (3) 중성의 극성 아미노산(예: 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 시스틴, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민); 및 (4) 중성의 비극성 아미노산(예: 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유리한 것으로 예측되지 않는 변화가, 작용성 서열을 생성하는 경우, 또한 유용할 수 있음을 주목하여야 한다.
용어 단백질은 또한 하나 이상의 치환 그룹이 가해진 단백질의 형태를 포함한다. 치환은 다른 원자 또는 원자의 그룹의 치환에 의해 단백질내로 도입된 원자 또는 원자의 그룹이다. 이러한 그룹은 지질, 포스페이트 그룹, 당 및 탄수화물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 용어, 단백질은 예를 들어, 지단백질, 당단백질, 인단백질 및 인지질단백질을 포함한다.
III. 본 발명의 조성물 및 방법
본 발명의 다른 측면은 심혈관 질환을 치료 또는 예방하는데 유용한 조성물을 제공한다. 하나의 양태에서 조성물은 분리된 오일 바디 결합 단백질이 첨가된 식물계 식료품을 포함하다. 본 발명의 하나의 양태에서, 식료품은 대두를 주요 성분으로 한다. 다른 양태에서, 당해 조성물은 분리된 대두 물질, 분리된 오일 바디 결합 단백질, 및 사포닌, 피토에스트로겐, 인지질 및 실질적으로 분해 내성인 탄수화물로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 부가 화합물을 포함한다. 본 발명의 특정 양태에서, 분리된 오일 바디 결합 단백질은 식물 단백질로부터 분리된 정제된 분획물일 수 있다. 예를 들어, 분리된 오일 바디 결합 단백질은 조 식물 단백질에 대해 1, 10, 100, 200 또는 1000배 이상 농축될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 분리된 오일 바디 결합 단백질은 오일 바디 결합 단백질에 대해 예를 들면, HMF와 같은 정제된 분획물에 대해 1, 5, 10, 50 또는 100배 이상 농축될 수 있다.
본 발명에 사용된 분리된 대두 물질은, 당해 분리된 대두 물질이 목적하는 혈중 콜레스테롤 저하 활성을 나타내는데 필요한 성분을 함유하는 정도로 모든 대두 식물로부터 제조하거나 분리할 수 있다. 분리된 대두 물질은 예를 들면, 분쇄된 전두, 대두 가루, 두유 분말, 대두 알갱이, 대두 굵은 가루, 대두 조각, 대두 농축물, 대두 단백질 분리물, 및 대두 단백질 추출물을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 대두 물질은 대두 단백질 분리물이다. 추가의 양태에서, 대두 물질은 대두 단백질 추출물이다. 본원에 상세히 기술된 방법을 포함하는 당해 분야에 공지된 어떠한 방법이라도 특정의 대두 물질을 분리하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 한 측면은 특정의 대두 단백질 또는 펩타이드, 즉, β-콘글리시닌, 글리시닌 및 올레오신이 풍부한 분리된 대두 물질을 제공한다. 이들 대두 물질은 분리물, 농축물, 또는 분리물과 농축물 제조시의 폐류로부터 제조할 수 있다. 이들은 또한 정상 농도보다 두배의 β-콘글리시닌 및 저농도 글리시닌을 갖는 대두와 같은 변형된 단백질 조성을 갖는 대두로부터 제조될 수 있다 (미국 특허 제6,171,640호에 기재된 바와 같은).
식료품의 제조는 당업계의 통상의 숙련인들에게 널리 공지되어 있다. 대두의 경우, 통상의 식품 활용은 종자, 콩 싹, 구운 콩, 다양한 베이킹 제품에 사용되는 전지 콩가루, 과자류로 사용되는 볶은 콩, 콩의 너트 버터, 커피콩, 및 동양 음식의 기타 콩 유도체와 같은 식품을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 대두 단백질 생성물 (예: 굵은 가루)은 식품/사료 및 산업적 용도 모두를 갖는 대두 가루 농축물 및 분리물로 분류될 수 있다. 대두 가루 및 대두 알갱이는 종종 고기 증량제 및 유사체, 애완동물용 사료, 베이킹 성분 및 기타 식품의 제조에 사용된다. 대두 가루 및 분리물로부터 제조된 식품은 유아용 식품, 캔디 제품, 씨리얼, 음료, 국수류, 효모, 맥주, 맥주, 에일 등을 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 예를 들면 올레오신과 같은 특정 유형의 대두 단백질이 결여되거나 이를 저함량으로 함유하는 분리된 대두 물질은, 예를 들면 올레오신과 같은 오일 바디 결합 단백질을 강화시켜 대두 단백질 또는 대두 단백질 조성물의 혈중 콜레스테롤 저하 특성을 개선시키거나 복구시킨다. 본 발명의 추가의 양태에서, 오일 바디 결합 단백질을 중량당 약 0.5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 20% 이상의 최종 농도로 가하며, 이때 이들 농도내의 모든 중간 범위도 역시 포함된다. 특정 적용에 따라, 올레오신 부재이거나 이를 감소된 양으로 함유하는 대두 물질이 매우 이로울 수 있다. 예를 들면, 올레오신은 대두 식품의 비교적 불량한 향미 특성의 원인이 되는 향미와 결부되어 있으므로, 바람직하지 않은 것으로 간주될 수 있다. 더구나, 올레오신은 난용성으로, 탈지 두유를 물에 분산시키는 경우 커다란 입자 분획의 원인이 될 수 있다. 한가지 양태에서 올레오신은, 올레오신을 함유하는 커다란 입자 분획을 탱크내에서 침강시키거나 한외여과막을 사용함으로써 제거될 수 있다. 대안적으로, 올레오신은 황산나트륨 및 염화칼슘의 존재하에 pH 2.8에서 대두 단백질 분리물로부터 침전될 수 있다[참조: Samoto et al., 1998].
또한, 본원 발명에는 분리된 대두 물질 및 분리된 오일 바디 결합 단백질을 포함하는 조성물이 포함되는데, 여기서 분리된 대두 물질은 대두 단백질 분리물중 고분자량 분획 ("HMF")이다. 본 발명의 임의의 조성물중 사용되는 HMF는, 분획이 목적하는 혈중 콜레스테롤 저하 활성을 갖는 정도로 천연적으로 존재하는 임의의 식물 단백질 분리물로부터 제조 및 분리될 수 있다. 한가지 양태에서, HMF는 대두 단백질 공급원으로부터 제조된다. HMF가 제조될 수 있는 전형적인 대두 물질은 대두, 껍질 제거된 대두, 두유, 대두 가루, 대두 알갱이, 두유 분말, 대두 조각 (전지 및 탈지), 대두 당밀, 대두 단백질 농축물, 유장, 유장 단백질 및 대두 단백질 분리물을 포함한다. 바람직한 양태에서, HMF는 대두 단백질 가수분해물로부터 제조된다.
HMF를 제조하기 위하여, 선택된 식물 단백질 분해물을 가수분해 또는 화학적 분해시킨다. 이러한 분해 과정에 사용되는 전형적인 제제는 펩신 또는 미생물 프로테아제를 포함한다. 일반적으로, 예를 들면, 대두 단백질을 펩신 효소 (0.5 내지 5% 대두 단백질 분리물임)와 함께 13 내지 17시간 항온처리하고 (수성상중 0.2% NaCl, 38℃, pH 1.1), 20분간 90℃에서 가열처리하여 펩신을 불활성화시키고, 빙상에서 냉각시키고 Na2CO3 으로 pH 6-7로 조정하고 4,500g에서 20분간 원심분리한다. 이후 이러한 펠렛을 물로 3회 세척하고 확인할 수 있다. 펩신 효소 사용의 또다른 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
미생물 프로테아제는, 예를 들면, 써미자임 (Sumizyme) FP (아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) 프로테아제, 효소 활성 48800 U/gm, Shin Nippon Kagaku Kabushiki Kaisha)일 수 있고 60℃에서 5시간 동안 대두 단백질과 함께 항온처리 할 수 있다. pH wh정 대신 이러한 용액을 사용하는 경우, 용액을 물로 희석한다. 이후 10,000xg 에서 10분간 원심분리할 수 있다. 이후 침전물을 수거하고 확인할 수 있다. 추가의 방법이 당업계에 공지되어 있다[참조: Hori et al. (1999)].
이후, HMF를 분해된 식물 단백질 분리물로부터 당업계에 일반적으로 공지된 임의의 수단에 의해 분리한다. 하나의 양태에서, HMF를 원심분리로 분리한다. 전형적으로, 분리 공정은, 예를 들면, 미생물 프로테아제 또는 펩신 (프로테아제는 총 단백질의 0.5-6% 이다)으로 처리한 대두 단백질 분리물의 수성 현탁액을 원심분리한 후 분획을 건조 (예, 동결건조)하고 30-70℃에서 1-20 시간동안 항온처리함으로써 수행할 수 있다. 추가의 방법이 당업계에 널리 공지되어 있다[참고: Nagoako et al., (1999)].
또한, HMF로부터 분리된 임의의 펩타이드는 당해 펩타이드가 목적하는 혈중 콜레스테롤 저하 활성을 갖는 정도로 본 발명의 조성물중에 사용될 수 있다. 하지만, 일반적으로, 당해 조성물중에 사용된 펩타이드는 10개 이상의 아미노산 잔기 길이, 보다 전형적으로는 약 10 내지 약 100개 아미노산 잔기 길이, 가장 전형적으로는 약 30 내지 약 80개 아미노산 잔기 길이를 갖는다. 또한, 일반적으로, 펩타이드는 소수성 아미노산 조성이 약 30 중량% 이상 내지 바람직하게는 약 35 중량% 이상인, 실질적으로 소수성 특성을 갖는다. 추가로, 사용되는 펩타이드는 0, 1, 또는 그 이상의 양쪽성 영역을 가질 수 있다. 부가적으로, 사용되는 펩타이드는 일단의 소수성 아미노산에 의해서라기 보단 펩타이드의 α-나선 구조로 인해 소수성 표면 또는 소수성 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 또다른 양태는 대두 폴리펩타이드가 β-콘글리시닌 및 글리시닌을 포함하는, 대두 물질로부터 분리된 대두 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. β-콘글리시닌 및 글리시닌 모두의 구조는 위에서 상세히 설명되었고, 이들의 구조에 대한 개관은 문헌[참조: Utsumi et al. (1997)]에 제공된다. 하나의 이론에 국한됨 없이, 본 출원인에게는, 이들 펩타이드가 분해되지 않고 유지되어 혈류로 흡수되거나 담즙산에 결합될 수 있기 때문에, 이들의 혈중 콜레스테롤 저하 활성을 부여하는 것으로 간주된다. 반드시 필요치는 않으나, β-콘글리시닌 내의 양쪽성 α-나선 영역의 존재는 유익하다. 임의의 하나의 이론에 국한됨 없이, 양쪽성 α-나선 영역의 존재로 소수성 표면이 형성되어 혈중 콜레스테롤 저하 활성을 부여하는데 중요한 다양한 수용체 부위와의 상호작용이 촉진되므로, 이의 존재는 이로운 것으로 출원인에게 간주된다.
또한, 임의의 하나의 이론에 국함됨 없이, 본 발명에서 확인된 폴리펩타이드는 또한 결장내의 이로운 세균에 대한 질소 공급원으로서 작용할 수 있다. 이들 세균은 이후 지질 대사에 양성 효과를 나타내는 프로피오네이트산과 같은 단쇄 지방산을 생산할 수 있다. 단쇄 지방산은 간에서의 지방산 합성을 억제하고, 트리글리세라이드 분비율을 저하시키며 또한 간의 콜레스테롤 합성을 감소시킨다. 본 발명의 하나의 측면은 결장내에서 단쇄 지방산의 생산을 촉진하고 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세라이드를 감소시키기 위한 대두 단백질 폴리펩타이드의 용도이다. 유익한 결장 세균의 성장을 촉진하는데 있어 비분해성 대두 폴리펩타이드의 효과는, 사람 결장내 세균집단에 대한 중요한 연료인 고 아밀로스 옥수수 전분과 같은 비분해성 탄수화물의 존재하에 가장 의의가 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 또다른 양태는 대두 폴리펩타이드 성분과 비분해성 탄수화물을 배합하여 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세라이드의 유익한 효과를 최적화하는 것이다.
따라서, 본 발명의 하나의 측면은, β-콘글리시닌으로부터 분리된 특정 폴리펩타이드를 갖는 조성물을 제공하는 것이다. 일반적으로, 이들 폴리펩타이드 서열은 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6 및 서열 11의 아미노산 서열중 어느 하나에 상응한다. 이들 서열은, 예를 들면, (1) 대두 물질의 효소적 가수분해 후 고분자량의 분획물을 예를 들면 원심분리에 의해 분리하거나, (2) 대두 물질의 효소분해 후 한외여과막, 이온교환 수지 컬럼 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하여 약 200 내지 약 5,000 킬로달톤의 분자량 범위의 펩타이드를 수득함을 포함하는 방법[참고:예를 들면,Yamauchi and Suetsuna (1993)에 기술된 방법]에 의해, β-콘글리시닌으로부터 분리될 수 있다. 펩타이드는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분획화될 수 있다[참조: Chen et al., 1995]. 대안적으로, 특정의 β-콘글리시닌 서브유니트로부터 개개의 서열을 분리하는 것보다, β-콘글리시닌을 정상 농도보다 2배 더 갖는 대두를 사용하여 대두로부터 β-콘글리시닌을 단순히 분리할 수도 있다. 마찬가지로, 단지 특정의 β-콘글리시닌 서브유니트만이 발현되는 동일한 배원질을 사용하여 이러한 서브유니트의 조악한 제제를 수득할 수도 있다. 이후 활성 펩타이드는, 장내에서 펩신 및 판크레아틴에 의한 가수분해의 결과로서 조악한 제제가 소비된 후 제조될 수 있거나, 미생물 효소를 사용하는 성분 제조시 수득된다. 따라서, 본 발명의 또다른 양태에서, 올레오신 제제와 배합된 β-콘글리시닌의 특정 서브유니트의 조악한 제제를 포함하는 조성물이 제공된다.
또다른 본 발명의 측면은 글리시닌으로부터 분리된 특정 폴리펩타이드를 갖는 조성물이다. 하나의 양태에서, 당해 조성물은 글리시닌의 염기성 서브유니트로부터 분리된 폴리펩타이드를 함유한다. 또다른 양태에서, 당해 조성물은 글리시닌의 B-1b 서브유니트로부터 분리된 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직한 양태에서, 당해 조성물은 서열 1의 아미노산 서열에 상응하는 글리시닌으로부터 분리된 펩타이드를 포함한다. 일반적으로 글리시닌은 당업계에 널리 공지된 분리 방법을 사용하여 단백질 공급원으로부터 분리된다. 이들 분리 과정의 예는 상기에서 기술한 바와 같이 기타 단백질 분리물을 분리하는데 사용된 것들이다.
본 발명의 조성물은 일반적으로 또한 오일 바디 결합 단백질을 함유한다. 본원에서, 용어 "오일 바디 결합 단백질"이란, 오일 바디 구조 또는 세포내 지질 입자가 물리적으로 결합되어 있는 임의의 단백질, 지단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 식물, 포유동물, 비-포유동물 세포, 조류 및 효모와 같은 종으로부터의 대부분의 진핵세포는 세포내 지질 입자를 함유한다. 이들 입자는 종에 따라, 지질 바디, 지질 소적, 또는 특히 식물에서의 지질 바디, 오일 바디, 올레오좀 또는 스페로솜으로서 공지되어 있다. 진핵세포의 지질 입자는, 소량의 단백질이 삽입된 인지질 단층에 의해 둘러싸여진, 중성 지질, 주로 트리아실글리세롤 및/또는 스테릴 에스테르의 고도로 소수성인 코어로 이루어진다. 옥수수에서 분리된 오일 바디의 일반적 조성은 트리아실글리세롤 (95%), 디아실글리세롤 (4%), 인지질 (0.9%) 및 단백질 (1.4%)이다.
본 발명의 조성물에 유용한 전형적인 오일 바디 결합 단백질은 아포단백질의 형태내의 올레오신 또는 지단백질과 같은 오일 바디 단백질 및 오일 바디 결합된 34kD 대두 종자 저장 액포 단백질을 포함한다. 그러므로, 본 발명의 한 측면은 분리된 대두 물질, 및 펩타이드가 올레오신 또는 올레오신의 펩타이드 단편인 오일 바디 결합 단백질로부터 분리된 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 올레오신은 서열 12로 제공되고 도 1에 상응하는 P24 올레오신 이소형 A (P89) 승인 번호 제P29530호, 서열 13으로 제공되고 도 2에 상응하는 P24 올레오신 이소형 B (P91) 승인 번호 제P29531호, 서열 14로 제공되고 도 3에 상응하는 오일 바디 결합 단백질 17kDa 올레오신 (oleo17) 승인 번호 제AAA68066호, 서열 15로 제공되고 도 4에 상응하는 오일 바디 단백질 16kDa 올레오신 (oleo16) 승인 번호 제AAA68065호, 서열 16으로 제공되고 도 5에 상응하는 올레오신 KD18 (KD18; L2) 승인 번호 제AAA67699호 및 서열 17로 제공되고 도 6에 상응하는 에이치. 안누스 (H. annuus) 올레오신 승인 번호 제CAA55348호의 서열로 제시될 수 있다. 보다 전형적으로, 조성물에 사용되는 펩타이드는 약 17 kDa 분자량을 갖는 저분자량의 올레오신에서 유래한다. 특정 양태에서, 상기 펩타이드는 올레오신에서 유래하고 서열 9 또는 서열 10의 아미노산 서열에 상응할 것이다.
본 발명의 조성물에서 사용되는 올레오신 펩타이드는 완전한 오일 바디로부터 분리될 수 있다. 결론적으로, 완전한 오일 바디는 오일 바디 결합 단백질의 공급원로서 종자로부터 분리될 수 있다. 사용될 수 있는 종자 형태의 방법 및 목록은, 예를 들면 WO 00/30602에서 제공된다. 또한 오일 바디를 제조하는 방법은 일본 특허출원 공보 제2002-101820호에 기술되어 있다. 오일은 수성 분획물중에 계면 물질 (올레오신 및 인지질)을 방치하고, 디에틸 에테르를 사용하여 오일 바디로부터 추출될 수 있다. 인지질은 클로로포름/메탄올 (2:1, 용적/용적) 또는 기타 적합한 유기 용매를 사용하여 추출될 수 있다. 특히, 올레오신은 응집된 분획물로서 분리된다 (Tzen and Huang 1992). 또한 높은 pH 추출은 P34 단백질이 존재하는 경우 이를 제거하는데 사용될 수 있다. P34 단백질은 6.5 이하에서 등전점 pH를 가지므로, 올레오신의 등전점 pH 보다 높은 pH에서 가용성이고 침전된다.
또한 올레오신은 물에 침지된 전두 또는 탈지 대두 가루로부터 분리될 수 있다. 올레오신은 당업계에 익히 공지된 분리 방법을 사용하여 단백질 공급원으로부터 분리될 수 있다. 상기 분리 방법의 예는 상기 개요된 바와 같이 탈지 대두 가루로부터 올레오신을 분리하는데 사용된 방법이다. 또다른 예는 전체 대두로부터 올레오신의 분리이다 (JP 2002-101820). 올레오신의 공급원은 식물 세포, 진균 세포, 효모 세포 (Leber et al., 1994), 세균 세포 (Pieper-Furst et al., 1994) 및 조류 세포 (Roessler, 1998)를 포함한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 올레오신은 화분, 포자, 종자 및 올레오신 또는 오일 바디 세포기관이 존재하는 무성 식물 기관으로부터의 세포를 포함하는 식물 세포로부터 수득된다 (Huang, 1992). 더욱 바람직하게, 본 발명의 올레오신은 식물 종자로부터 수득되고, 가장 바람직하게 평지씨 (브라지카 종; Brassica spp.), 대두 (글리신 맥스; Glycine max), 해바라기 (헬리안투스 안누스; Helianthus annuus), 오일 야자 (엘래이스 구이니스; Elaeis guineeis), 목화씨 (고지피움 종; Gossypium spp.), 땅콩 (아라키스 히포가애; Arachis hypogaea), 코코넛 (코쿠스 누시페라; Cocus nucifera), 캐스터 (리시누스 쿰무니스; Ricinus cummunis), 잇꽃 (카타무스 틴토리우스; Carthamus tinctorius), 머스타드 (브라지카 종 및 시나피스 알바; sinapis alba), 코리안더 (코리안드럼 사티붐; Coriandrum sativum), 스쿼치 (쿠커비타 맥시마; Cucurbita maxima), 라인시드/플랙스 (리움 우시타티주뭄; Linum usitatissumum), 브라질 넛트 (베톨레티아 엑셀사; Bertholletia excelsa), 호호바 (시몬드지아 키넨시스; Simmondsia chinensis), 옥수수 (제아 메이스), 크램브 (크램브 아비지니카; Crambe abyssinica) 및 에루카 (에루카 사티바; Eruca sativa)를 포함하는 식물종의 그룹으로부터 수득된다.
본 발명의 또다른 측면은 분리된 대두 물질 및 펩타이드가 지단백질인 오일 바디 결합 단백질로부터 분리된 펩타이드를 포함하는 조성물을 포괄한다. 지단백질은 중성 지질, 인지질 및 동물 및 식물 세포 모두에서 발견되는 단백질의 비공유, 비화학양론, 미립자적 복합체이다. 한 양태에서, 지단백질은 포유동물의 지단백질이다. 또다른 양태에서, 지단백질은 난황 지단백질 (예를 들면, Bringe (1997)에서 난황 구조의 검토, 상기 문헌이 본원에서 참고로 인용)이다. 또한 또다른 양태에서, 지단백질은 지방 소구체 막 단백질을 포함한다.
지단백질은 당업계에 익히 공지된 방법을 사용하여 오일 바디 결합 단백질 공급원으로부터 분리될 수 있다. 상기 분리 방법의 예는 상기 개요된 바와 같이 오일 바디 단백질 또는 탈지 대두 가루로부터 올레오신을 분리하는데 사용된 방법이다. 더우기, 난황 지단백질은 당업계에 익히 공지된 분리 방법을 사용하여 오일 바디 결합 단백질 공급원으로부터 분리될 수 있다.
상기 분리 방법의 예로서, 난황 지단백질은 초임계 이산화탄소 (참고, Bringe and Cheng, 1995)를 이용한 트리글리세라이드 및 콜레스테롤을 추출함으로써 분리될 수 있다. 본 발명의 추가 측면은 오일 바디 결합 단밸질 및 부가 화합물과 배합한 대두 물질을 포함하는 조성물을 제공한다. 부가 화합물은 조성물을 치료학적으로 증진시키는 임의의 화합물을 포함할 수 있다. 그러나, 전형적으로 부가 화합물은 사포닌, 피토에스트로겐, 인지질 및 실질적으로 분해 내성인 탄수화물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일반적으로, 임의의 특정 이론에 구속되지 않고 상기 부가 화합물이 실질적으로 분리된 대두 물질중의 콜레스테롤-저하 폴리펩타이드의 분해를 억제함으로써 상기 조성물의 혈중 콜레스테롤 저하 활성을 증진시킨다고 여겨진다. 상기 특성 때문에, 본 발명의 부가 화합물은 조성물의 치료 능력을 증가시킨다. 따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물은 분리된 대두 물질 및 분리된 오일 바디 결합 단백질과 배합하는 상기 동정된 특정 부가 성분의 임의 배합물을 가질 수 있다.
그러므로, 한 양태에서, 본 발명의 조성물은 부가 화합물로서 1 내지 몇몇 사포닌을 함유할 수 있다. 사포닌은 문헌[참고: Gurfinkel et al., 2002]의 방법과 같은 임의의 공지된 방법으로 천연적으로 발생하거나 임의의 공지된 방법으로 합성 제조될 수 있는 식물 공급원으로부터 분리될 수 있다. 임의의 사포닌은 선택된 화합물이 혈중 콜레스테롤 저하제로서 사용되는 조성물의 특성을 증진시키는 정도까지 현재 발명의 용도에 적합하다. 그러나, 전형적으로, 사용되는 사포닌은 알파파 또는 대두 식물과 같은 콩과 식물 또는 귀리 또는 기타 식물 종자로부터 분리된다. 보다 전형적으로, 사포닌은 대두 종자로부터 분리되고, 더욱 특별히 대두 배아로부터 분리될 수 있다. 사포닌의 공급원은, 예를 들면, 대두, 퀼라자 (quillaja), 알파파 및 소프워트 (Soapwort)를 포함한다. 대두 사포닌은, 예를 들면, 사포닌 A, B, E 및 사포게놀 A, B 및 E를 포함한다.
더우기 본 발명의 조성물은 부가 화합물로서 1종 내지 몇가지 종의 피토에스트로겐을 포함할 수 있다. 피토에스트로겐은 임의의 공지 방법에 의해 천연적으로 발생하거나 미국 특허 제5,855,892호 또는 WO 00/30663에 상세하게 설명된 방법과 같은 임의의 공지된 방법으로 합성 제조될 수 있는 식물 공급원으로부터 분리될 수 있다. 임의의 피토에스트로겐은 선택된 화합물이 혈중 콜레스테롤 저하제로서 사용되는 조성물의 특성을 증진시키는 정도까지 현재 발명의 용도에 적합하다. 전형적으로, 조성물에 사용된 피토에스트로겐은 이소플라본이다. 보다 전형적으로, 이소플라본은 게니스테인, 다이드제인 (대사산물인 o-데스메틸란골렌신, 디하이드로클레이드자인 및 에쿠올을 포함), 바이오카닌 A, 포르모노네틴 및 이들 각각의 천연 발생 글루코사이드 및 대두 또는 클로버에 존재하는 글루코사이드 접합체이다.
본 발명의 조성물은 또한 부가 화합물로서 1종 내지 몇가지 종의 인지질을 포함할 수 있다. 인지질은 각종 공급원에서 유래할 수 있으나, 전형적으로 예를 들면 종자로부터 분리되고, 보다 전형적으로 대두 식물의 오일 종자로부터 분리된다. 이는 레시틴 및 리소-레시틴을 포함한다. 또한, 변형된 지방산 조성물과 함께 인지질이 사용될 수 있다. 상기 인지질은 효소 변형된 대두 인지질일 수 있다. 효소 변형된 인지질은, 예를 들면, 대두 인지질 (SLP; True Lecitin, Mie, 일본)로부터 포스포리파제 A2 (Novo Industry, Bagsvaerd, Denmark)로 처리함으로써 제조될 수 있다[참고: Nagaoka et al., 1999]. 또한, 변형된 지방산 조성을 갖는 인지질은 식물 또는 변형된 지방산 조성을 갖는 인지질을 생성하기 위해 유전적으로 변형되는 식물 종자로부터 수득될 수 있다. 변형된 지방산 조성물을 갖는 인지질의 예는 변형된 지방산 조성물을 가진 레시틴이다. 당업계에 익히 공지된 기타 방법은 또한 인지질의 지방산 조성물을 변형시키는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 또한 1종 내지 몇가지 종의 탄수화물을 포함할 수 있다. 임의의 탄수화물이, 선택된 화합물이 혈중 콜레스테롤 저하제로서 사용되는 조성물의 특성을 증진시키는 정도까지 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 그러나, 전형적으로, 사용되는 탄수화물은 실질적으로 분해 내성인 탄수화물이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 탄수화물을 기술하는데 사용되는 경우 "실질적으로 분해 내성"은 당업계에서, 예를 들면 약 70% 초과로 분해에 내성인 탄수화물, 바람직하게 약 80% 초과로 분해에 내성인 탄수화물, 및 더욱 바람직하게 약 90% 초과로 분해에 내성인 탄수화물을 의미하는 것으로 정의된다. 일반적으로, 아밀로스 전분 또는 섬유소가 풍부한 탄수화물은 특히 당해 조성물에 사용되기에 적합하다. 일 양태에서, 예를 들면, 조성물에 사용되는 탄수화물은 고 아밀로스 전분, 올리고프럭토스 또는 대두 자엽 섬유이다. 또한 양태는, 예를 들면, 물리적으로 받아들여지지 않는 (phisically inaccessible) 전분 (부분적으로 갈린 곡물 및 종자), 난소화성 과립 (날 감자, 녹색 바나나, 일부 콩과식물 및 고 아밀로스 전분), 노화 전분 (요리된 감자 및 냉동된 감자, 빵 및 콘플레이크) 및 화학 변형된 전분 (에테르화, 에스테르화 또는 가교 결합된 전분 (처리된 식물중에 사용))[참고: Topping and Clifton, 2001]이다.
하나 이상의 부가 화합물의 존재 또는 부재에서, 분리된 대두 물질 및 분리된 오일 바디 결합 단백질의 임의 배합물은 본 발명의 조성물을 형성하기 위해 배합될 수 있다. 하기 표 1은, 예를 들면, 본 발명의 조성물의 상이한 양태에 대한 다수의 전형적 제형을 예시한다.
Figure 112008027501872-pct00022
Figure 112008027501872-pct00023
Figure 112008027501872-pct00024
Figure 112008027501872-pct00025
Figure 112008027501872-pct00026
Figure 112008027501872-pct00027
Figure 112008027501872-pct00028
본 발명의 한 양태에서, 상기 조성물은 조성물의 50 중량% 이상의 분리된 대두 물질 함량 및 조성물의 0.5 중량% 이상의 오일 바디 결합 단백질 함량을 가진다. 그러나, 더욱 바람직하게, 상기 조성물은 조성물의 약 70 이상 90 중량%의 분리된 대두 물질 함량 및 조성물의 약 1 내지 5 중량%의 오일 바디 결합 단백질 함량을 가진다. 이소플라본 또는 사포닌 화합물 같은 부가 화합물이 존재하는 경우, 상기 부가 화합물은 전형적으로 조성물의 10 ㎎/100g 이상을 포함하고 조성물의 약 30 내지 300 ㎎/100g을 추가로 포함할 수 있다. 더우기, 인지질 또는 실질적으로 분해 내성인 탄수화물과 같은 부가 화합물이 존재하는 경우, 상기 부가 화합물은 전형적으로 조성물의 2중량% 이상을 포함하고 조성물의 약 10 내지 50중량%를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 죽상동맥경화 및 혈관 질환의 발병을 예방하거나 치료하는 제제로서 포유동물에 투여될 수 있다. 더욱 특별히, 본 발명의 조성물은 포유동물에, 바람직하게 사람에게, 총 혈청 콜레스테롤 농도를 저하시키고, 고밀도 지단백질 농도를 증가시키며, 간에서 콜레스테롤의 농도를 감소시키고, 혈청 트리글리세라이드의 농도를 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 일반적으로, 임의의 특정 이론에 구애받지 않으면서, 본 발명의 조성물은 콜레스테롤 흡수를 예방하고, 실질적으로 담즙산 재흡수를 억제함으로써 혈중 콜레스테롤 저하 활성을 발휘하고/하거나 포유동물의 결장내 세균에 의한 질소원으로서 사용될 수 있다.
Ⅳ. 약제학적 조성물 및 투여
본 발명의 임의의 조성물은 약제학적 또는 영양학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 경구적으로, 비경구적으로, 흡입 분무에 의해, 직장으로, 피내로, 경피적으로 또는 국소적으로 통상적인 비독성 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 및 목적하는 비히클을 함유하는 투여량 단위 제형으로 투여될 수 있다. 국소적 투여는 또한 경피 패치 또는 전리 요법 기구와 같은 경피 투여의 용도를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 비경구는 피하, 정맥내, 근육내 또는 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 약물의 제형은, 예를 들면, 문헌[참고: Remington's Pharmaceutical Sciences, (1975) 및 Liberman and Lachman (1980)]에서 논의된다.
주사용 제제, 예를 들면, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 비독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매, 예를 들면, 1,3-부탄디올중의 용액으로서 멸균 주사용 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정유는 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 상기 목적으로, 임의의 블렌드 고정유 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 포함하여 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사용 제제에 유용하다. 디메틸 아세트아미드, 이온성 및 비이온성 세제를 포함하는 계면활성제 및 폴리에틸렌 글리콜이 사용될 수 있다. 용매 및 상기 논의된 바와 같은 습윤제의 혼합물이 또한 유용하다.
본원에서 논의된 화합물의 직장 투여를 위한 좌제는 활성제를 적합한 비자극성 부형제, 예를 들어 코코아 버터, 합성 모노-, 디- 또는 트리글리세라이드, 지방산 또는 상온에서 고체이나 직장 온도에서 액체이어서 직장에서 용융되어 약물을 방출할 수 있는 폴리에틸렌 글리콜을 혼합함으로써 제조될 수 있다.
경구 투여용 고체 투여 제형은 캅셀제, 정제, 환제, 분말 및 입제를 포함할 수 있다. 상기 고체 투여 제형에서, 본 발명의 화합물은 명시된 경로의 투여에 적합한 하나 이상의 보조제와 보통 배합된다. 각각 투여되는 경우, 화합물은 락토스, 수크로스, 전분, 알칸산의 셀룰로스 에스테르, 셀룰로스 알킬 에스테르, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 산화마그네슘, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘 염, 겔라틴, 아카시아 검, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈 및/또는 폴리비닐 알코올과 혼합된 후, 통상적인 투여를 위해 정제화되거나 캅셀화될 수 있다. 상기 캅셀제 또는 정제는 하이드록시프로필메틸 셀룰로스중의 활성 화합물의 분산으로 제공될 수 있는 서방성 제형을 함유할 수 있다. 캅셀제, 정제 및 환제의 경우, 투여 제형은 또한 완충제, 예를 들어 나트륨 시트레이트, 또는 탄산마그네슘, 탄산칼슘, 중탄산마그네슘 또는 중탄산칼슘을 포함할 수 있다. 정제 및 환제는 부가적으로 장용피로 제조될 수 있다.
치료학적 목적으로, 비경구 투여용 제형은 수성 또는 비수성 등장 멸균 주사용 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 상기 용액 및 현탁액은 경구 투여용 제형에서 용도로 언급된 하나 이상의 담체 또는 희석제를 가지는 멸균 분말 또는 과립으로부터 제조될 수 있다. 화합물은 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 옥수수 오일, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 참깨 오일, 벤질 알코올, 염화나트륨 및/또는 각종 완충액중에 용해될 수 있다. 기타 보조제 및 투여 방식은 약제학적 분야에 익히 널리 공지되어 있다.
경구 투여용 액체 투여 제형은 당해 분야에서 통상 사용되는 비활성 희석제, 예를 들어 물을 함유하는 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엑릭서를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 또한 보조제, 예를 들어 습윤제, 유화제 및 현탁제, 및 감미제, 향미제 및 방향제를 포함할 수 있다.
투여되는 약제학적 활성 화합물의 양 및 본 발명의 화합물 및/또는 조성물과 함께 심혈관 질환 치료용 투여 섭생은 각종 인자, 예를 들면 연령, 체중, 성별 및 개체의 의학적 상태, 질환의 중증도, 투여의 경로 및 빈도 및 사용되는 특정 화합물에 좌우되어서, 상당히 다양할 수 있다. 일반적으로 허용되고 효과적인 1일 투여량은 1일당 약 0.1 내지 약 6000㎎/체중㎏, 더욱 전형적으로 1일당 100 내지 약 2500㎎/체중㎏, 및 가장 바람직하게 1일당 약 200 내지 약 1200㎎/체중㎏일 수 있다.
상기한 상세한 설명은 당해 분야의 숙련가에게 본 발명을 수행하는 데 도움을 주기 위해 제공한다. 또한, 이러한 상세한 설명은, 본 발명의 취지 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서, 당해 분야의 숙련가에 의해 본원에 논의된 양태의 개질 및 변형이 제조될 수 있는 바와 같이, 본 발명을 제한하지 않는다고 해석되어야 한다.
본 특허원에 인용된 모든 출원, 특허, 특허원 및 기타 참조문헌은 각각의 개별 출원, 특허, 특허 출원 또는 기타 참조문헌이 특정하고 개별적으로 참조로서 인용된 바와 같이, 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되어 있다.
추가의 퇴고 없이, 당해 분야의 숙련가는 상기한 기술을 사용하여 본 발명을 충분한 정도로 사용할 수 있다고 사료된다. 따라서, 다음의 바람직한 특정 양태는 단지 예시이며, 어떠한 방법으로도 나머지 개시 부분을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1
대두 단백질로부터의 HMF의 동정
대두 단백질의 HMF내에 존재하는 폴리펩타이드는 활성 콜레스테롤-저하 특성을 갖는다 (실시예 2 참조). 이들 폴리펩타이드의 기원 및 부분 서열을 동정하기 위한 연구를 수행하였다. 사용된 방법은 다음과 같다:
A. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동.
폴리아크릴아미드 겔 전기영동 방법을 당해 분야에 공지된 방법에 따라 수행하였다. 몇가지 상이한 방법을 본 발명에서 사용하였으며, 이는 다음과 같다:
B. 트리스-글리신 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)
완전한 또는 분쇄된 대두를 동결시키고 이들을 진동 분쇄기 (분쇄는 대두 단백질 분리물에 필요하지 않다)에서 분쇄시키고 pH=8.0의 0.03M 트리스 (Tris), 0.01M 2-머캅토에탄올을 사용하여 실온에서 1시간 동안 단백질을 추출하여 분석을 위한 대두 단백질 샘플을 제조한다. SDS 가용성 용액 (0.0625M 트리스, 2.3% SDS, 5% β-머캅토에탄올, 10% 글리세롤, pH6.8, 추적 염료로서 미량의 브로모페놀 블루) 중 이들 단백질의 용액 4mg/㎖을 제조한다. 샘플을 70℃에서 10분 동안 가열하고, 5분 동안 냉각시킨 후 원심분리하여 불용성 물질을 펠렛으로 만든다. 10 내지 20% 총 아크릴아미드 겔 (문헌[참조: Laemmli (1970)]에 기술된 바와 같이) 상에 각 샘플 상등액 5㎕ (20㎍)을 로딩 (loading)하고 겔당 15-30mA (정전류) 또는 60-100볼트 (정전압)에서 전기영동하여 분리한다. 추적 염료가 겔 바닥의 2mm내에 있을 때 전기영동을 종결한다. 문헌[참조: Malone et al, (2001)]의 방법 번호 2에 따라, 쿠마시(Coomassie)를 SYPRO 오렌지로 대체할 수 있다.
C. NuPAGE 겔 전기영동에 의한 SDS-PAGE 분석
4 ×NuPAGE LDS 샘플 완충액(샘플 용적의 1/4로서의 NOVEX 카탈로그 # NP0003 및 샘플 용적 1/10으로서의 500mM 디티오트레이톨)을 사용하여, 트리스 글리신 SDS-PAGE 부분에 기술된 바와 같이 샘플을 제조한다. Novex 4-12% 아크릴아미드 비스-트리스 겔상에 각 샘플 상등액 4㎕(16㎍)을 로딩한다. Novex Xcell 2 소형-겔 탱크를 NuPAGE MES 전개(running) 완충액(50mM MES, 50mM 트리스, 3.5mM SDS, 1.025mM EDTA, pH=7.7)로 충전하고 추적 염료가 겔 바닥의 홈에 도달할 때까지 200볼트(정전압)에서 전기영동시켜 단백질을 분리한다. 트리스-글리신 SDS-PAGE 프로토콜에 기술된 바와 같이 겔을 염색한다.
D. 대두 단백질의 2-D PAGE
트리스-글리신 SDS-PAGE 부분에 기술된 바와 같이 대두 단백질을 추출한다. 총 단백질 0.6 내지 1.05mg을 함유하는 최종 용적 450㎕에 8M 요소, 2% CHAPS, 0.35% 디티오트레이톨, 0.2% 양쪽성 전해질 및 15% 이소프로판올을 함유하는 샘플을 보충한다. 당해 용액 중 430㎕을 사용하여 길이 18㎝이며 pH 3-10인 부동 pH 구배(IPG) 무수 스트립을 24 내지 30시간 동안 재팽윤시킨다(재팽윤동안 광유로 스트립을 덮는다). 물에 침지시킨 전극 스트립을 사용하여, 다음의 전압 램핑 접근법을 사용하여 50,000-70,000 볼트-시간동안 IPG 스트립(광유로 덮인)을 포커싱한다. 100볼트(v)에서 1시간, 이어서 200v에서 1시간, 400v에서 2시간, 400 내지 10000볼트의 선형 램프에서 14시간, 이어서 10000볼트에서 48시간 이하에서 시작하여 총 최종 볼트-시간에 도달한다. 각각의 IPG 스트립을 샘플 평형 용액(62.5mM 트리스, 2.3% SDS, 5% 2-머캅토에탄올, 추적 염료로서 pH6.8의 미량의 브로모페놀 블루) 1.5㎖에 3.5분 동안 침지시킨다. 스트립을 뽑아낸 후, 각각을 10-20% 아크릴아미드 트리스 글리신 겔상에 두어, 평형화 용액 중 고온의 1% 아가로스를 사용하여 당해 장소에서 이를 밀봉한다. 트리스-글리신 SDS-PAGE 부분에 기술된 바와 같이, 2차원 겔을 전개시키고 이들을 염색한다.
E. 아크릴아미드 겔 내에서의 단백질의 동일계내 트립신화
겔 밴드 또는 스팟(spot)을 절단해내어, 이들을 1500㎕들이 실리콘화 미세원심분리기 튜브에 둔다. 50% 메탄올(세척당 30분)을 사용하여 2회 세척하여 염색을 제거한다. 겔 조각을 50% 아세토니트릴(200mM 암모늄 아세테이트 pH=8.0)에서 15분 동안 평형화시킨다. 2회 반복하여 세척한다. 15분 동안 100% 아세토니트릴로 세척한 후, 스피드백(Speedvac)에서 무수상태로 증발시킨다. pH-8.0의 200mM 암모늄 아세테이트 중 10% 아세토니트릴에서 서열 분석 등급의 변형된 트립신(Sequencing Grade Modified Trypsin)(Promega 카탈로그 # V5111) 20㎍/㎖을 사용하여 37℃에서 16 내지 20분 동안 트립신 처리한다. 20분 동안 Nutator로 교반하 며 50% 아세토니트릴, 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 펩타이드를 추출한다. 암모늄 아세테이트 중 80% 아세토니트릴, 0.1% TFA를 사용하여 20분 동안 반복적으로 추출한다. 30분 동안 최종 추출을 반복한다. 모든 상등액 및 무수 추출물을 스피드백에서 배합한다.
F. 수득된 밴드내에 존재하는 폴리펩타이드의 트립신 분해된 폴리펩타이드를 제공하기 위한 밴드의 트립신 처리
수득된 밴드내에 존재하는 폴리펩타이드의 트립신 분해된 폴리펩타이드를 제공하기 위해, 겔내에서 다음의 프로토콜에 따라 밴드의 트립신 분해를 수행하였다:
1) 겔 스팟을 절단해내어, 가장 큰 치수의 1mm 미만의 임의의 조각를 제조한다. 겔 조각을 1500㎕들이 실리콘화된 미세원심분리기 튜브에 둔다.
2) 겔 조각을 50% 메탄올(세척당 30분)로 2회 이상 세척하여(튜브당 200㎕) 염색을 제거한다. 쿠마시로 염색된 겔을 추가로 수회 세척하여 염색을 제거한다. 겔 조각을 당해 용액에 저장할 수 있다. Nutator를 사용하여 튜브를 교반한다.
3) 겔 조각을 50% 아세토니트릴(NH4OH로 pH=8.0으로 조정한 200mM 암모늄 아세테이트) 200㎕를 사용하여 세척당 15분 동안 세척한 후, 추가로 1회 30분 동안 세척한다. Nutator를 사용하여 교반한다.
4) 100% 아세토니트릴로 15분 동안 세척한다.
5) 겔 조각으로부터 용액을 배출시키고 스피드백을 사용하여 무수상태로 증발시킨다(15분).
6) 트립신의 20㎍ 바이알(vial)에 10% 아세토니트릴(NH40H를 사용하여 pH 7.8-8.3으로 조정한 200mM NH40Ac) 1㎖을 첨가하여 트립신 모액을 제조한다(Promega Sequencing Grade Modified Trypsin-카탈로그 # V5111을 사용한다).
7) 각각의 튜브내의 겔 조각을 포함하기에 충분한 트립신 용액을 첨가하여 단백질을 분해한다. 통상, 20㎕가 충분하다.
8) 조각을 37℃에서 16 내지 20시간 동안 항온처리한다.
9) 실온으로 튜브를 냉각시키고, 미세 원심분리기 튜브의 습기를 바닥으로 내린다.
10) 20분 동안 Nutator로 교반하며, 50% 아세토니트릴, 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 200㎕를 사용하여 펩타이드를 추출한다.
11) 각각의 튜브의 상등액을 개별적으로 수집한 후, 80% 아세토니트릴, 0.1% TFA 200㎕를 사용하여 Nutator로 15분간 교반하며 재추출한다.
12) 각각의 튜브에서 미리 수집한 상등액에 추가된 상등액을 수집한 후, 80% 아세토니트릴, 0.1% TFA 200㎕를 사용하여 Nutator로 30분 동안 교반하며 최종 용적으로 1회 추출한다.
13) 각각의 튜브에서 상등액을 수집하고 미리 수집한 상등액에 첨가한다. 스피드백에서 추출물을 건조시킨다.
G. MALDI-TOF 분석
밴드로부터 트립신 분해한 폴리펩타이드를 레이저 탈착(MALDI용) 또는 전자분무(LC/MS 및 LC/MS/MS용)를 사용하여 이온화하여 질량 스펙트럼을 제조하였다. 펩타이드의 질량은 MALDI를 사용하여 혼합물로서 측정하며; 트립신 분해된 펩타이드는 분리되지 않았다. 약간 변형된 공개된 과정(문헌[참조: Shevchenko et al., 1996])을 사용하여 MALDI 분석을 위한 샘플을 제조하였다. 0.1% TFA 10㎕를 무수 펩타이드를 함유하는 각각의 튜브에 첨가하여 당해 샘플을 재구성하였다. 니트로셀룰로스 10mg/㎖ 및 아세톤 및 이소프로필 알콜의 1:1(v/v) 혼합물의 α-시아노-4-하이드록시신남산 20mg/㎖을 용해시켜 매트릭스를 제조하였다. MALDI 플레이트상에 매트릭스 용액 0.5㎕를 운반하여 매트릭스를 점적하였다. 유사하게, 각 샘플로부터의 샘플 1㎕를 점적된 매트릭스 위에 침적시킨다. 샘플을 약 10분 동안 매트릭스상에서 건조시켜 펩타이드가 니트로셀룰로스에 확실히 결합되도록 한다. 최종 용적으로, 5% 포름산 5㎕를 각각의 스팟에 침적시키고 진공선을 사용하여 당해 용액을 즉시 흡입해내어 수성 세척을 3회 수행한다. 이어서 MALDI 질량 분광측정 분석을 위해 MALDI 샘플 플레이트를 질량 분광측정기로 옮긴다. 반사이온(reflectron) 모드에서 Voyager DE-STR(Perseptive Biosystems, Framingham, MA)을 사용하여 당해 데이타를 수집한다. 공지된 트립신 자가분해 피크를 사용하여 스펙트럼을 내부적으로 측정한다. 트립신 분해된 펩타이드 질량의 피크 목록을 산출하고, 단백질을 동정하기 위해, 이들을 MS-Fit 검색 장비를 사용하여 NCBI 비-중복 단백질 서열 데이타베이스에 대비하여 검색한다(문헌[참조: Clauser et al., (1999)]).
때때로, 매치는 "경계적"이며 확인을 필요로 하거나, 데이타가 약하거나 단 순히 의미있는 매치가 아니다. 이러한 경우, 나노 LC/MS/MS를 사용한다. 당해 방법에서, 분해된 혼합물을 역상 칼럼상에 주입하여 펩타이드를 분리시키고 한번에 하나씩(또는 한번에 2개씩) 질량 분광측정기(이러한 경우, 전자분무, 직렬 질량 분광측정기)로 도입한다. 질량 분광측정기는 펩타이드의 질량을 측정하고, 다른 모든 것을 여과하여 가장 충분한 것을 분리해내고, 펩타이드가 Ar 기체와 충돌하는 경우, 충돌 세포로 펩타이드를 전달한다. 펩타이드는 아미드 결합에서 단편 분해되는 경향이 있기 때문에, 당해 단편은 아미노산 서열의 지표일 수 있다. 단편 데이타를 데이타를 단백질 서열 데이타베이스에 매치시키는, 데이타베이스 검색 도구에 제공될 수 있다. 매치를 얻기 위해 트립신 분해된 펩타이드의 부분 서열 및 본래 질량을 사용한다. MS/MS 데이타를 사용하여 높은 신뢰성을 갖는 단일 트립신분해된 펩타이드로부터 단백질을 동정할 수 있다.
H. 나노 HPLC
나노 HPLC를 사용하여 정제된 단백질(전기영동으로 정제한)로부터 트립신 분해된 단편을 분리하여 한번에 단 1개(또는 여러 개)의 펩타이드를 전자분무, 직렬 질량 분광측정기에 도입한다. 샘플을 자가샘플기, 구배 및 보조 펌프를 장착한 CapLC(Waters, Milford, MA) 시스템으로 주입한다. 5㎕를 "㎕ 픽업(pickup)" 모드를 통해 주입하고 300㎛ ×5mm C18 트랩핑 카트릿지(LC Packings, San Francisco, CA)를 통해 가동상태에서 탈염한다. 샘플을 3분 동안 고유속(30㎕/분)으로 탈염시켰다. 펩타이드를 질량 분광측정기에 도입하기 전에 100㎛ ×150mm Magic C18 컬럼(Michrom bioResources, Auburn, CA)상에서 분리하였다. 약 30분에 걸쳐 저유기상으로부터 고유기상까지 전형적인 역상 농도 구배를 사용하였다. 이동상 A는 0.1% 포름산이고 B는 100% 아세토니트릴, 0.1% 포름산이었다. 유기 이동상과 함께 유속 또한 선형으로 증가하였다. 당해 시스템은 대략 300 내지 700nL/분의 컬럼 유속을 도출하는 소분할 유동을 사용하였다.
I. MS/MS 분석 및 데이타 처리
LC/MS/MS에는, 트립신 분해된 펩타이드를 질량 분광측정기(이상적으로)에 한번에 하나씩 도입하는 분리 단계(역상 LC)가 있다. 먼저 펩타이드의 질량을 측정하고, 이어서 당해 펩타이드로부터의 단편의 질량을 측정하기 때문에, MS/MS 또는 직렬 MS로 지칭된다. 트립신 분해된 펩타이드를 정지 기체(Ar)와 충돌시켜 단편화하고 단편의 질량을 측정한다. 이는 흔히 최소한 펩타이드 일부의 서열을 제공할 수 있다. 데이타 의존성 MS/MS 연구를 Q-Tof 질량 분광측정기(Micromass, Beverly, MA)상에서 수행하였다. 흡입구는 변형된 피코팁을 고정하도록 설계된 나노스프레이 공급원이다(New Objective, Cambridge, MA). CAD에 사용된 충돌 에너지를 펩타이드의 질량 및 전하 상태에 근거하여 측정한다. 데이타를 ProteinLynx 버전 3.4(Micromass, Beverly, MA)로 처리하여 피크 서열 파일을 산출한다. 데이타를 검색 엔진 MASCOT(Matrix Science, London, UK)를 사용하여 NCBI 비-중복 단백질 서열 데이타베이스에 대비하여 검색한다. 당해 검색 엔진은 최고 20개의 일치를 보고하였다. 당해 데이타베이스에서 어떠한 등록물과도 매치되지 않는 서열 데이타는 NCBI로부터의 dbEST 데이타베이스 및 내부적으로 산출된 서열 데이타베이 스에 대비하여 검색한다.
J. 연구 1
OBAP-풍부(rich)로 지칭되는 대두 단백질 분리물로부터의 HMF를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 분리하였다. 5개의 폴리펩타이드를 함유하는 겔의 밴드 또는 영역을 트립신 처리하고 질량 분광기를 사용하여 아미노산 서열에 대해 분석하였다(도 7). 당해 밴드의 기원을 표 2에서와 같이 동정하였다:
밴드 단백질 동정 주석
A 글리시닌 AlaBx(72296) 자동화 매치, 2개 서열*
B 글리시닌 G1(99907) 자동화 매치, 2개 서열*
C 잠정적 올레오신이라는 주석이 붙여진 dbEst 서열:
YETNSSLNNPPSR(서열 10)
D 알파 서브유니트 베타-콘글리시닌(72289) 다수의 펩타이드
E 알파 서브유니트 베타-콘글리시닌(72289) 다수의 펩타이드-베타 콘글리시닌의 다른 서브유니트와 대부분 공통적임
* 글리시닌 서열을 함께 배열하여 G1 글리시닌의 기본 서브유니트의 잔기 401번 내지 435번을 제조한다 (72296, AlaBx 전구체) (서열 1)
(VFDGELQEGRVLIVPQNFVVAARSQSDNFEYVSFK) (서열 1)
A VFDGELQEGR 및 SQSDNFEYVSFK
B A에서와 같이 동일한 2개를 합함: VLIVPQNFVVAAR
K. 연구 2
상기한 잠정적 올레오신 서열은 공지된 올레오신 서열에 매치되지 않았다. 저분자량의 대두 올레오신 (~18kDa)의 서열은 공지되어 있지 않았다. 다음의 연구의 목적은 상기한 "잠정적 올레오신" 서열이 18kDa 대두 올레오신으로부터의 것인지의 여부를 측정하기 위한 것이다. 오일-바디-결합 단백질 (p34 단백질 및 올레오신)을 정제하고 폴리아크릴아미드 겔상에서 분리하였다 (도 8). 밴드를 트립신 처리하고 MS에 의해 분석하였다.
소수성 도메인에 바로 후속되는, 올레오신의 양쪽성 N-말단 영역으로부터 방출된 트립신 분해된 펩타이드의 존재가 HMF로부터 분리된 12kDa 밴드내에서 확인되었다. 아미노산 당 평균 질량은 111.1Da이다. 따라서, 12kDa 펩타이드 내의 아미노산의 수는 대략 108개의 아미노산이다. 따라서, HMF내에서 발견되는 펩타이드는 또한 올레오신의 소수성 도메인의 일부를 함유해야만 한다. 서열 YETNNSSLNNPPSR (서열 10)은 단백질의 소수성 코어 영역의 시작 바로 전에 해당되는 잠정적 올레오신의 잔기 33번 내지 45번을 나타낸다.
결과: 서열, YETNSSSLNNPPSR (서열 10)이 저분자량 대두 올레오신내에서 발견됨을 확증하였다.
밴드 단백질 동정 주석
AA 가능한 티올 프로테아제 전구체 1개의 펩타이드가 확증됨
BB P24 올레오신 이소형 A(P89) 다수의 펩타이드가 gi1709459(A)와 일치함
CC P24 올레오신 이소형 B(P91) 또는 A(P89) 다수의 펩타이드가 gi266689(B) & gi1709459(A)와 일치함
DD 저분자량(16-24kD) 올레오신 2개의 펩타이드가 확증됨: (T)YETNSSLNNP(P), (R)AkdYGSYA(Q), 많은 내부 EST들이 일치함.

L. 연구 3
연구 1에서 특성을 밝힌 HMF를 소량의 베타-콘글리시닌을 갖는 대두 단백질 분획물로부터 제조하였다. 이는 HMF내에 존재하는 글리시닌 서브유니트의 동정을 도왔다. 가능한 경우, 어떤 베타-콘글리시닌 서열이 HMF내에서 동정될 수 있는지를 측정하기 위해 다음의 연구를 수행하였다. 대두 단백질 분리물을 제조하기 위해 G1 글리시닌이 결여된 대두를 사용하였고 분리물은 HMF를 제조하기 위해 펩신으로 분해하였다. HMF를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 분리하였고 (도 9) 밴드를 트립신 처리하고 MS를 사용하여 특성을 밝혔다.
결과: 베타-콘글리시닌으로부터의 폴리펩타이드 서열이 동정되었다.
밴드 MALDI로부터의 단백질 동정
A1 베타-콘글리시닌의 베타 서브유니트
A2 A1과 동일
A3 베타-콘글리시닌의 알파 또는 알파-주요 서브유니트*
A4 A3과 동일한 펩타이드
A5 A3과 동일한 펩타이드
A6 A3과 동일한 펩타이드
* 전구체 알파-주요 베타-콘글리시닌(121286): QNPSHNKCLR(서열 18) 및 하기 기재한 4191814의 서열
*베타 콘글리신의 알파-주요 서브유니트(4191814): NQYGHVR(서열 6), 및 하기 기재한 7442025의 서열
*베타-콘글리시닌의 알파-서브유니트(7442025): NILEASYDTKFEEINK(서열 8), LQESVIVEISKK(서열 4), QQQEEQPLEVRK(서열 5)

실시예 2
콜레스테롤 흡수에 대한 HMF의 효과
Caco-2 세포주는 사람 직장결장 암종으로부터 유래된 것으로, 장의 상피 세포 생리학을 연구하는데 통상적으로 사용된다. 상기 세포는 콜레스테롤, 글루코스, 아미노산, 비타민, 지방산, 담즙산 및 약물 전달 과정을 연구하는데 사용되어 왔다[참조: Hidalgo et al., 1989; Artursson, 1990; Homan and Hamelehle, 1998]. 상기 세포는 장관세포내의 단백질과 유사하게 조절되는 지질 및 스테롤 대사 효소 및 수송 단백질을 발현한다[참조: Levy et al., 1995], 또한, 이들 세포는 콜레스 테롤 흡수에서 역활을 할 수 있는 최근에 동정된 단백질인 SR-B1[참조: Werder et al., 2001]뿐만 아니라 장의 상피 세포에 의한 순 콜레스테롤 흡수를 매개하는데 있어 역활을 할 수 있는 ATP-결합 카셋트 수송체 패밀리의 각종 단백질[참조: Taipalensuu et al., 2001]을 발현하는 것으로 공지되어 있다.
대두 단백질은 HMF의 공급원이다. 간략하게 언급하면, 대두 단백질을 펩신과 함께 17시간 동안 항온처리하고 (수성상 중 0.2% NaCl, 38℃, pH 1.1, 펩신은 대두 단백질 분리물의 5%이었다), 20분 동안 90℃에서 가열 처리하여 펩신을 불활성화시키고, 빙상에서 냉각시키고, pH를 0.2M Na2CO3를 이용하여 6.21로 조정하고, 4,500g에서 20분 동안 원심분리하였다. 상기 펠렛을 물로 3회 세척하고 HMF임을 동정하였다.
A. 콜레스테롤 흡수 검정을 위한 Caco-2 세포의 배양
1. 96웰 코스타르 (Costar) 고형 백색 조직-배양물 처리된 플레이트 (Costar #3917)를 다음과 같이 랫트 꼬리 콜라겐으로 예비피복시킨다:
(a) 0.02N 아세트산 중의 20㎍/ml 랫트 꼬리 콜라겐 용액 (Becton Dickinson/Collaborative Biomedical 제품 카탈로그 번호 40236)을 제조한다:
0.02N 아세트산: 17.4N 아세트산 11.5ml/10m 멸균 H2O를 첨가한다.
0.02N 아세트산 10ml당 콜라겐 60㎕ (3.32mg/ml)를 첨가한다.
(b) 콜라겐 용액 250㎕/96웰 플레이트의 웰을 첨가하고 층류 후드에서 밤새 실온에서 유지되도록 한다.
(c) 각 웰을 DMEM 1×250㎕으로 세정한 다음, DMEM 100ml으로 세정하였다.
2. 70 내지 80% 컨플루언스 (confluence)의 Caco-2 세포 (41회 내지 60회 계대배양된 세포를 사용한다)의 2 T-150 플라스크 (Costart #430825)를 Ca2+ 및 Mg2+를 함유하지 않는 둘베코 포스페이트 완충된 염수 10ml로 세정한다.
3. 0.25% 트립신/EDTA 용액 6ml을 각 플라스크에 첨가하고 37℃에서 5분 내지 10분 동안 항온처리한다.
4. 10ml 피펫을 사용하여 T-150 플라스크의 세포를 세척 제거하고 세포 덩어리를 파괴시킨다. 세포 현탁액을 50ml 시험관으로 옮긴다.
5. 10% 태아 송아지 혈청, 1X 비필수 아미노산, 50mg/ml 겐타마이신을 함유하는 완전 배지 DMEM 12ml을 상기 세포 현탁액에 첨가하고 혼합하고, 세포를 2000rpm (Sorval RT7)에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화시킨다.
6. 배지를 제거하고 완전 배지 20ml으로 대체시킨다. 10ml 피펫을 사용하여 세포를 분산시킨다[약 80% 컨플루언스의 2×T150 플라스크는 약 10×106개의 세포로 구성된다].
7. 세포를 96웰 콜라겐-피복된 미세역가 플레이트에 웰당 3200개 세포/100㎕의 밀도로 분주한다.
8. 격일로 세포에 완전 배지를 공급한다. 세포는 분주한지 13일 후 콜레스테롤 흡수에 필수적인 표면 수용체를 발현할 것이다.
B. 콜레스테롤 흡수 검정
Caco-2 세포에 의한 미셀 (micell) 콜레스테롤의 흡수는 문헌[참조: Field et al. (1991)]에 의해 보고된 방법을 변형시켜 수행하였다. 본 발명들의 방법은 다음과 같이 기술한다:
1. Caco-2 세포에서의 콜레스테롤 흡수를 억제하는 능력에 대해 시험하고자 하는 화합물/펩타이드를 DMSO중의 스톡 용액으로서 용해시킨다. 스톡 용액으로부터의 시험 화합물의 희석액을 펜탄올 중에서 제조한다. Caco-2 콜레스테롤 흡수 억제 검정에서 사용될 화합물의 희석액의 농도는 검정하고자 하는 목적하는 최종 희석액보다 10배 높아야하는데, 즉 웰중의 2mM 용액을 피펫팅하여 검정시에 최종 용적이 200μM가 되도록 한다. 시토스탄올을 200mM에서 최대 억제를 갖는 대조군 콜레스테롤 흡수 억제제 (0% 콜레스테롤 흡수 대조군)로서 사용한다. 단독의 용매를 100% 콜레스테롤 흡수 억제제 (높은 dpm)로서 사용한다.
2. 대조군 및 시험 화합물/펩타이드의 희석액을 3회 폴리프로필렌 얕은-웰 (Sigma M-4029)로 피펫팅한다.
3. 플레이트를 GeneVac 장치에서 35 내지 45℃로 밤새 건조시킨다. 플레이트를 다음 단계 전에 완전히 건조되었는지 확인한다.
4. 3H-콜레스테롤 미셀 혼합물을 격벽 라이너 캡이 장착된 Trace-Clean 호박색 바이알 (VWR 카탈로그 번호 15900-036)에서 다음과 같이 제조한다:
10X 스톡 미셀 용액 1.0ml (10X 스톡 미셀 용액= 50mM 타우로콜레이트, 1mM 올레산, 1mM 콜레스테롤)에 37.5㎕ 3H-콜레스테롤 (NEN 카탈로그 번호 NET-725) (0.75nmol chol)=37.5μCi 3H-콜레스테롤을 첨가한다 (용액은 방사선표지=추적자로서 0.075% chol을 함유한다). 미세역가 검정 플레이트당 1.8ml을 제조하여 과량이 생성되도록 한다.
5. 피펫으로 15㎕/웰의 희석액 CH3Cl:MeOH (1:1)을 건조된 플레이트의 모든 웰로 옮겨서 건조된 잔사를 용매화시킨다. 이를 위해 폴리프로필렌 저장소를 사용하고 저장소를 빙상에서 유지시켜 용매의 증발을 최소화한다.
6. 동일한 플레이트에, 빙상에서 폴리프로필렌 저장소를 사용하여 3H-콜레스테롤 혼합물 15㎕을 각 웰에 첨가하여 방사선표지 용액을 함유하도록 한다.
7. 플레이트를 약 20 내지 30분 동안 질소로 플러싱하면서 예비가열된 37℃ 증발 챔버 (VWR)에서 건조시킨다.
8. 건조된 웰을 50㎕/웰의 에틸 에테르로 세정하고 증발 챔버에서 재건조시킨다. 에테르 세정을 다시 1회 반복하고 건조시킨다.
9. 플레이트를 진공 건조기에 밤새 놓아둔다.
10. Quadra 96 워크스테이션을 사용하여 실온 행크스 균염 용액 (Hank's Blanced Salt Solution; HBSS) (Sigma H-8264) 150㎕를 각각의 건조된 웰로 피펫팅한다. 미셀 지질의 최종 농도는 다음과 같다: 5mM 타우로콜레이트, 100μM 올레산, 100μM 콜레스테롤 및 3.75μCi/ml 3H-콜레스테롤 (또는 약 5μM).
11. 플레이트를 접착성 밀봉 테이프 (Packard TopSeal-A Adhesive Sealing Tape 또는 Sigma Mylar Sealing Tape T-2162)로 밀봉하고 Labline 플레이트 진탕기 모델 4625 (설정=6)상에서 실온에서 30분 이상 진탕시켜 미셀을 가용화시킨다.
12. 96웰 플레이트 (상기한 바와 같음)에 분주된 Caco-2 세포를 자동화 세포 세척기를 사용하여 HBSS로 5회 세척한다. 이는 단계 13 직전에 수행한다. 다음 단계에서 미셀을 첨가하기 전에 플레이트를 종이 타월에 살짝 눌러서 과량의 지질을 제거한다.
13. 가용화된 미셀 100㎕을 Quadra 96 워크스테이션을 사용하여 적절히 표지된 Caco-2 세포 플레이트로 옮긴다. 상기 플레이트를 다시 37℃ 항온처리기에 4시간 동안 놓아둔다.
14. 세포를 자동화 세포 세척기를 사용하여 HBSS (1mM TC) 중의 차가운 1mM 타우로콜레이트로 5회 세척한다.
15. 200㎕/웰의 신틸레이션 칵테일 (Packard MicroScint 40, 카달로그 번호 6013641)을 Quadra 96 워크스테이션을 사용하여 피펫으로 세포 플레이트로 피펫팅한다.
16. 플레이트를 가열 밀봉 테이프 (Packard TopSeal-S 가열 밀봉 필름)로 밀봉하고, 이 플레이트 (설정= 6 이상)를 20분 이상 진탕시켜 형광제와 세포 샘플을 혼합한다.
17. 상기 플레이트를 암실에서 밤새 유지시킨다.
18. Packard TopCount NXT 장치를 사용하여 dpm을 계수한다.
19. 결과를 다음과 같이 대조군 (억제제 없음)의 %로서 계산한다.
Figure 112004047269714-pct00008
다양한 공급원의 대두 HMF는 Caco-2 세포에 의한 콜레스테롤 흡수의 용량 의존적 억제를 설명한다 (예를 들어, 도 10 참조). 콜레스테롤 흡수를 50% 감소시키는데 요구되는 HMP의 농도는 베타-콘글리시닌 시험 (4.7mg/mL)을 제외하고는 1.2 내지 2.9mg/mL이었다.
실시예 3
HMF의 작용 기작의 분자 약리학적 특징
시험 화합물/펩타이드가 콜레스테롤 흡수 검정용으로 제조된 미셀 용액 (실시예 2의 제조 방법 참조)내로의 3H-콜레스테롤의 용해도에 영향을 미치는지를 결정하기 위해, 다음과 같은 검정을 수행하였다:
1. 미셀을 단계 11까지를 포함하는 실시예 2의 방법에 기술된 바와 같이 제조하였다.
2. 가용화된 미셀 20㎕을 Quadra 96 워크스테이션을 사용하여 불투명 코스타르 플레이트 (Costar #3917)로 옮긴다.
3. 200㎕/웰의 신틸레이션 칵테일 (Packard MicroScint 40, 카탈로그 번호 6013641)을 Quadra 96 워크스테이션을 사용하여 미세역가 플레이트 웰로 피펫팅한다.
4. 플레이트를 가열 밀봉 테이프 (Packard TopSeal-S 가열 밀봉 필름)로 밀봉하고 상기 플레이트 (설정= 6 이상)를 20분 이상 진탕시켜 형광제와 미셀 샘플을 혼합한다.
5. 상기 플레이트를 암실에서 밤새 유지시킨다.
6. Packard TopCount NXT 장치를 사용하여 dpm을 계수한다.
7. 결과를 다음과 같이 대조군 (억제제 없음)의 %로서 계산한다.
Figure 112004047269714-pct00009
8. 시험 화합물/펩타이드가 미셀로부터 3H-콜레스테롤을 제거하였다면, 시험 화합물/펩타이드 dpm의 감소가 보다 고농도의 시험 화합물/펩타이드의 경우에 나타날 것이다. 그렇지 않다면, 가용화된 미셀 중의 dpm은 시험된 시험 화합물/펩타이드의 희석액의 범위에 걸쳐서 상당히 일정하게 유지될 것이다.
도 11은 이것이 시토스탄올에 의한 콜레스테롤 억제의 1차 기작과 대조적임을 설명한다.
실시예 4
대두 단백질 HMF의 특성 규명
적은 양의 오일 바디 결합 단백질을 갖는 대두 단백질 분리 분획물 (OBAP (-)), 오일 바디 결합 단백질이 풍부한 분획물 (OBAP(+)) 및 대조군으로부터의 HMF의 수율을 비교하였다. 이 모두는 동일한 대두로부터 제조하였다 (다양성 A2247)
간략하게 언급하면, 대두 단백질의 분획물을 펩신과 함께 17시간 동안 항온처리하고 (수성상 중 0.2% NaCl, 38℃, pH 1.4, 펩신은 대두 단백질 분리물의 5%이었다), 90℃에서 20분 동안 가열 처리하여 펩신을 불활성화시키고, 빙상에서 냉각시키고, 0.2M Na2CO3를 이용하여 pH를 6.21로 조정하고, 4,500g에서 20분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 물로 2회 세척하고 동결건조시켰다. 건조 펠렛의 중량을 검정에서 사용된 본래 양의 대두 단백질 분리물의 중량과 비교하여 HMF의 수율을 측정하였다[(최종 중량/초기 중량)×100]. OBAP(+) 및 대조군 대두 단백질 샘플은 둘다 HMF를 생성하였다. 그러나, OBAP(-) 분획물은 어떠한 HMF도 산출하지 않았으며, 이는 올레오신 및/또는 올레오신과 결합된 성분 (예: 사포닌, 인지질)이 대두 단백질의 분해성을 조절함을 나타낸다.
다음은 대두 단백질을 대두 단백질 분리물 (SPI)로 분획하는데 사용된 과정이다:
A. 과정 1: OBAP(-)
1. 탈지 대두 조각 (제조원: Cargill) 1kg을 증류수 15kg에 첨가한다. pH를 1N NaOH를 이용하여 7.5로 조정한다. 실온에서 1시간 동안 혼합한다.
2. 혼합물을 10,000g에서 10분 동안 원심분리하고 상등액을 수집한다.
3. Na2SO4 및 CaCl2를 각각 30mM의 농도에서 상기 상등액에 첨가한다.
4. 단계 3의 상등액의 pH를 2N HCl을 이용하여 pH 2.8로 조정한다. 혼합물을 10,000g에서 10분 동안 원심분리한다. 상등액을 수집한다.
5. (단계 4의) 상등액을 증류수로 4배 (예를 들어, 1L에서 4L로) 희석시킨다. pH를 2N NaOH를 이용하여 4.5로 조정한다. 10,000g에서 10분 동안 원심분리한다. 침전물을 수집한다.
6. 단계 5의 침전물을 증류수에 재용해시키고 pH를 2N NaOH를 이용하여 7.5로 조정한다.
7. 중화된 단백질 혼합물을 200℃의 유입구 온도, 90 내지 95℃의 배출구 온도에서 분무 건조시킨다.
B. 과정 2: OBAP(+)
1. 탈지 대두 조각 (제조원: Cargill) 1kg을 증류수 15kg에 첨가한다. pH를 1N NaOH를 이용하여 7.5로 조정한다. 실온에서 1시간 동안 혼합한다.
2. 혼합물을 10,000g에서 10분 동안 원심분리하고 상등액을 수집한다.
3. Na2SO4 및 CaCl2를 각각 30mM의 농도에서 상기 상등액에 첨가한다.
4. 단계 3의 상등액의 pH를 2N HCl을 이용하여 pH 2.8로 조정한다. 혼합물을 10,000g에서 10분 동안 원심분리한다. 침전물을 수집한다.
5. 단계 4의 상등액을 증류수에 재용해시키고 pH를 2N NaOH를 이용하여 7.5로 조정한다.
6. 중화된 단백질 혼합물을 200℃의 유입구 온도, 90 내지 95℃의 배출구 온도에서 분무 건조시킨다.
C. 과정 3: 대조군
1. 탈지 대두 조각 (제조원: Cargill) 1kg을 증류수 15kg에 첨가한다. pH를 1N NaOH를 이용하여 7.5로 조정한다. 실온에서 1시간 동안 혼합한다.
2. 혼합물을 10,000g에서 10분 동안 원심분리하고 상등액을 수집한다.
3. 상등액을 증류수로 4배 (예를 들어, 1L에서 4L로) 희석시킨다. pH를 2N HCl을 이용하여 4.5로 조정한다. 10,000g에서 10분 동안 원심분리한다. 침전물을 수집한다.
4. 단계 5의 침전물을 증류수에 재용해시키고 pH를 2N NaOH를 이용하여 7.5로 조정한다.
5. 중화된 단백질 혼합물을 200℃의 유입구 온도, 90 내지 95℃의 배출구 온도에서 분무 건조시킨다.
한 연구에서, 샘플의 총 단백질 함량은, OBAP(-) (94.8%), OBAP(+) (91.8%) 및 대조군 (68%)[참조: Official Methods of Analysis of the AOAC, 16th Edition, 1995, 990.02, Locator #4.2.08]이었다. 각 분획으로부터의 HMF의 수율을 측정하였다. 결과는 OBAP(-) 샘플로부터 HMF가 산출되지 않았음을 입증하였다 (표 5 참조). 본 연구는 비록 오일 바디 결합 단백질이 HMF의 큰 비율을 구성하지 않는다 해도 HMF를 수득하는데 있어 OBAP의 중요성 및/또는 상기 분획물과 결합된 인지질, 이소플라본 및 사포닌의 중요성을 나타냈다.
동일한 연구에서, OBAP(-), OBAP(+) 및 대조군 대두 단백질 분리물의 트립신 억제제의 활성은 각각 24, 31.5 및 47.5 TIU/mg이었다 (표준 AACC 방법, 1995, 제9판, 방법 71 내지 10을 사용함). 이러한 활성은 샘플로부터의 HMF의 수율과 상호관련성이 없으므로, OBAP(-) 분리물 중의 트립신 억제제의 활성의 결여가 HMF 형성의 결여를 유발할 수 있다는 가능성을 배제한다.
대두 단백질 샘플의 키모트립신 억제제 활성은 샘플로부터의 HMF의 수율과 상호관성이 없었다 (표 5) (AACC, 제10판, 방법 22 내지 40).
샘플 mg당 키모트립신 억제 단위 및 HMF의 수율
CTIU/mg HMF 수율
글리시닌 2.0 5
베타-콘글리시닌 2.3 14
OBAP(-) 5.2 0
BC-무효과 8.8 8
중간체 9.2 24
OBAP(+) 24.5 8
글리시닌-무효과 39.2 19

아이오와 주립대의 시험연구용 시설 (15kg 시험연구용 시설 제2호; 참조: Wu et al., 1999)에서 제조된 다른 대두 분획물을 또한 입수하였다. 상기 샘플 중의 올레오신의 양도 올레오신 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅으로 측정하였다 (도 12 참조). 이는 다시 보다 높은 양의 올레오신을 함유한 샘플이 보다 높은 수율의 HMF를 생성시킴을 입증하였다 (표 6).
펩신 분해된 SPI 샘플 (OBAP 및 대조군), 미분해된 SPI 샘플 (대조군, OBAP(-), OBAP(+)), 오일 바디 단백질 제제 및 대조군 대두 IA-2032의 분쇄된 대두 샘플을 18% 트리스/글리신 겔상에서 분리시키고 PVDF 막으로 옮겼다. 이들 블롯을 올레오신에 대한 항혈청으로 프로빙하였다 (도 13). 상기 항혈청은 QIAexpressionist (QIAGEN Inc., Valencia, CA)에 기술된 바와 같이 이. 콜라이내에서 과발현시켜 이. 콜라이로부터 정제한 전체길이 올레오신 단백질을 사용하여 래빗에서 개발하였다. 이들 블롯은 높은 양의 올레이신을 함유한 샘플이 보다 높은 수준의 HMF를 생성시켰음을 설명한다 (표 6).
실시예 5
HMF 수율에 대한 에탄올 추출의 효과
어느 정도로 높은 수율의 중간체 분획이 인지질, 사포닌 및 이소플라본으로부터 초래되는지를 알기 위해, 상기 성분들을 70% 에탄올을 사용하여 분획물로부터 추출하고, 이 분획물을 HMF 수율에 대해 재시험하였다. 결과는 50%보다 낮은 수율이었다. 추출된 분획물의 낮은 수율의 분획물 (글리시닌)에의 첨가는 분획의 HMF의 수율 (80%)을 개선시키는 것을 도왔다. 이러한 결과 (표 6 참조)는 프로테아제에 의한 분해에 내성인 HMF 폴리펩타이드의 능력이 부분적으로 알콜 추출성 성분, 예를 들어, 사포닌, 이소플라본 및 인지질의 존재에 따라 좌우될 수 있음을 제시한다. 이전의 실시예로부터의 결과도 또한 간략한 설명과 함께 표 6에 포함되어 있다. 이러한 요약으로부터의 결론은 올레오신, 베타-콘글리시닌, 알콜 추출성 성분 (인지질, 사포닌, 이소플라본) 및 염기성 글리시닌 서브유니트가 콜레스테롤 저하 물질로서 작용할 수 있는 HMF의 고수율에 기여한다는 것이다. 가장 중요한 성분은 지단백질 (올레오신 및 결합된 인지질)이다. 베타-콘글리시닌 및 글리시닌을 함유하는 대두 단백질 성분의 콜레스테롤 저하 특성은 식물의 지단백질 (예: 올레오신과 결합된 인지질) 또는 다른 공급원 (예: 난황 지단백질)을 첨가함으로써 향상될 수 있는 것으로 사료된다.
공급원 물질과 HMF 수율의 비교
물질 ID 올레오신 및 결합된 인지질, 이소플라본 및 사포닌 염기성 글리시닌 베타-콘글리시닌 HMF의 수율(%)
OBAP-결핍 - + + 0
글리시닌 - +++ _ 5
글리시닌+알콜 추출물 +(올레오신은 없음) +++ - 5
베타 콘글리신
무효과		 + ++ - 8
OBAP-풍부 + + - 8
베타-콘글리시닌 + - +++ 14
글리시닌
무효과		 + - ++ 19
중간체 분획물 + + + 24
알콜 추출물이 다시 첨가된, 알콜 추출된 중간체 분획물 + + + 23
알콜 추출된 중간체 분획물 +(인지질, 사포닌 및 이소플라본은 없음) + + 13
본원에서 기술된 모든 조성물 및 방법은 본 내용의 견지에서 과도한 실험 없이 제조 및 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 양태의 측면에서 기술되며, 당해 분야의 숙련가라면 본 발명의 개념, 취지 및 범주에서 벗어남이 없이 이러한 조성물 및 방법 및 본원에서 기술하는 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 가해질 수 있음을 인지할 것이다. 보다 구체적으로는, 화학적으로 및 생리학적으로 관련되는 특정 제제가 본원에서 기술하는 제제를 대체할 수 있으며, 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있음을 인지할 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 명백한 모든 이러한 유사한 대체 및 변형은 청구의 범위에 의해 한정되는 바와 같이 본 발명의 취지, 범주 및 개념내에 있는 것으로 간주된다.
참조문헌
하기의 문헌은 이들이 본원에 제공된 것들을 보충하는 예시적 과정 또는 기타 세부사항을 제공하는 정도로 본원에 특별히 참조문헌으로서 인용된다:
Figure 112004047269714-pct00010
Figure 112004047269714-pct00011
<110> MONSANTO TECHNOLOGY LLC <120> Oil body associated protein compositions and methods of use thereof for reducing the risk of cardiovascular disease <130> 5-2001-020790-9 <150> US 60/373,460 <151> 2002/04/18 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 1 Val Phe Asp Gly Glu Leu Gln Glu Gly Arg Val Leu Ile Val Pro Gln 1 5 10 15 Asn Phe Val Val Ala Ala Arg Ser Gln Ser Asp Asn Phe Glu Tyr Val 20 25 30 Ser Phe Lys 35 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 2 Leu Arg Met Ile Thr Leu Ala Ile Pro Val Asn Lys Pro Gly Arg Phe 1 5 10 15 Glu Ser Phe Phe Leu 20 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 3 Ile Phe Val Ile Pro Ala Gly Tyr Pro Val Val Val Asn Ala Thr Ser 1 5 10 15 His Leu Asn Phe Phe Ala Ile Gly Ile 20 25 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 4 Leu Gln Glu Ser Val Ile Val Glu Ile Ser Lys Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 5 Gln Gln Gln Glu Glu Gln Pro Leu Glu Val Arg Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 6 Asn Gln Tyr Gly His Val Arg 1 5 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 7 Ala Ile Val Ile Leu Val Ile Asn Glu Gly Asp Ala Asn Ile Glu Leu 1 5 10 15 Val Gly Leu <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 8 Asn Ile Leu Glu Ala Ser Tyr Asp Thr Lys Phe Glu Glu Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 9 Val Lys Phe Ile Thr Ala Ala Thr Ile Gly Ile Thr Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 10 Tyr Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Asn Pro Pro Ser Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 11 Ile Phe Val Ile Pro Ala Gly Tyr Pro Val Val Val Asn Ala Thr Ser 1 5 10 15 Asp Leu Asn Phe Phe Ala Phe Gly Ile 20 25 <210> 12 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 12 Met Thr Thr Gln Val Pro Pro His Ser Val Gln Val His Thr Thr Thr 1 5 10 15 Thr His Arg Tyr Glu Ala Gly Val Val Pro Pro Gly Ala Arg Phe Glu 20 25 30 Thr Ser Tyr Glu Ala Gly Val Lys Ala Ala Ser Ile Tyr His Ser Glu 35 40 45 Arg Gly Pro Thr Thr Ser Gln Val Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Pro 50 55 60 Val Gly Gly Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Thr 65 70 75 80 Leu Thr Gly Leu Ala Val Ala Thr Pro Leu Phe Val Leu Phe Ser Pro 85 90 95 Val Leu Val Pro Ala Thr Val Ala Ile Gly Leu Ala Val Ala Gly Phe 100 105 110 Leu Thr Ser Gly Ala Phe Gly Leu Thr Ala Leu Ser Ser Phe Ser Trp 115 120 125 Ile Leu Asn Tyr Ile Arg Glu Thr Gln Pro Ala Ser Glu Asn Leu Ala 130 135 140 Ala Ala Ala Lys His His Leu Ala Glu Ala Ala Glu Tyr Val Gly Gln 145 150 155 160 Lys Thr Lys Glu Val Gly Gln Lys Thr Lys Glu Val Gly Gln Asp Ile 165 170 175 Gln Ser Lys Ala Gln Asp Thr Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Arg 180 185 190 Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Lys 195 200 205 Val Glu Ala Arg Asp Val Lys Arg Thr Thr Val Thr Ala Thr Thr Ala 210 215 220 Thr Ala 225 <210> 13 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 13 Met Thr Thr Val Pro Pro His Ser Val Gln Val His Thr Thr Thr His 1 5 10 15 Arg Tyr Glu Ala Gly Val Val Pro Pro Ala Arg Phe Glu Ala Pro Arg 20 25 30 Tyr Glu Ala Gly Ile Lys Ala Pro Ser Ser Ile Tyr His Ser Glu Arg 35 40 45 Gly Pro Thr Thr Ser Gln Val Leu Ala Val Val Ala Gly Leu Pro Val 50 55 60 Gly Gly Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Thr Leu 65 70 75 80 Thr Gly Leu Val Val Ala Thr Pro Leu Phe Ile Ile Phe Ser Pro Val 85 90 95 Leu Ile Pro Ala Thr Val Ala Ile Gly Leu Ala Val Ala Gly Phe Leu 100 105 110 Thr Ser Gly Val Phe Gly Leu Thr Ala Leu Ser Ser Phe Ser Trp Ile 115 120 125 Leu Asn Tyr Ile Arg Glu Thr Gln Pro Ala Ser Glu Asn Leu Ala Ala 130 135 140 Ala Ala Lys His His Leu Ala Glu Ala Ala Glu Tyr Val Gly Gln Lys 145 150 155 160 Thr Lys Glu Val Gly Gln Lys Thr Lys Glu Val Gly Gln Asp Ile Gln 165 170 175 Ser Lys Ala Gln Asp Thr Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Arg Asp 180 185 190 Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Arg Asp Ala Lys Val Glu Ala 195 200 205 Arg Asp Val Lys Arg Thr Thr Val Thr Ala Thr Thr Ala Thr Ala 210 215 220 <210> 14 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 14 Met Ala Asp Arg Asp Arg Ser Gly Ile Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Gln Gln Gln Gly Arg Pro Pro Met Gly Glu Gln Val Lys Gly Met Ile 20 25 30 His Asp Lys Gly Pro Thr Ala Ser Gln Ala Leu Thr Val Ala Thr Leu 35 40 45 Phe Pro Leu Gly Gly Leu Leu Leu Val Leu Ser Gly Leu Ala Leu Ala 50 55 60 Ala Ser Thr Val Gly Leu Ala Val Ala Thr Pro Val Phe Leu Leu Phe 65 70 75 80 Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Ala Leu Leu Ile Gly Thr Ala Val Ala 85 90 95 Gly Phe Leu Thr Ser Gly Ala Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Ser Leu 100 105 110 Thr Cys Leu Ala Asn Thr Ala Arg Gln Ala Phe Gln Arg Thr Pro Asp 115 120 125 Tyr Val Glu Glu Ala Arg Arg Arg Met Ala Glu Ala Ala Ala His Ala 130 135 140 Gly His Lys Thr Ala Gln Ala Gly His Gly Ile Gln Ser Lys Ala Gln 145 150 155 160 Glu Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ala Gly Gly Gly Arg Thr Ser Ser 165 170 175 <210> 15 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 15 Met Ala Asp His His Arg Gly Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly 1 5 10 15 Asp Leu Gln Arg Gly Gly Gly Met His Gly Glu Ala Gln Gln Gln Gln 20 25 30 Lys Gln Gly Ala Met Met Thr Ala Leu Lys Ala Ala Thr Ala Ala Thr 35 40 45 Phe Gly Gly Ser Met Leu Val Leu Ser Gly Leu Ile Leu Ala Gly Thr 50 55 60 Val Ile Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Val Leu Val Ile Phe Ser Pro 65 70 75 80 Val Leu Val Pro Ala Ala Ile Ala Leu Ala Leu Met Ala Ala Gly Phe 85 90 95 Val Thr Ser Gly Gly Leu Gly Val Ala Ala Leu Ser Val Phe Ser Trp 100 105 110 Met Tyr Lys Tyr Leu Thr Gly Lys His Pro Pro Ala Ala Asp Gln Leu 115 120 125 Asp His Ala Lys Ala Arg Leu Ala Ser Lys Ala Arg Asp Val Lys Asp 130 135 140 Ala Ala Gln His Arg Ile Asp Gln Ala Gln Gly Ser 145 150 155 <210> 16 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 16 Met Ala Asp Arg Asp Arg Ser Gly Ile Tyr Gly Gly Ala His Ala Thr 1 5 10 15 Tyr Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gly Gly Gly Gly Arg Pro Met Gly Glu 20 25 30 Gln Val Lys Lys Gly Met Leu His Asp Lys Gly Pro Thr Ala Ser Gln 35 40 45 Ala Leu Thr Val Ala Thr Leu Phe Pro Leu Gly Gly Leu Leu Leu Val 50 55 60 Leu Ser Gly Leu Ala Leu Thr Ala Ser Val Val Gly Leu Ala Val Ala 65 70 75 80 Thr Pro Val Phe Leu Ile Phe Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Ala Leu 85 90 95 Leu Ile Gly Thr Ala Val Met Gly Phe Leu Thr Ser Gly Ala Leu Gly 100 105 110 Leu Gly Gly Leu Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Asn Thr Ala Arg Gln 115 120 125 Ala Phe Gln Arg Thr Pro Asp Tyr Val Glu Glu Ala Arg Arg Arg Met 130 135 140 Ala Glu Ala Ala Ala Gln Ala Gly His Lys Thr Ala Gln Ala Gly Gln 145 150 155 160 Ala Ile Gln Gly Arg Ala Gln Glu Ala Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly 165 170 175 Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Arg Ala Ser Ser 180 185 <210> 17 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 17 Met Ala Thr Thr Thr Tyr Asp Arg His His Val Thr Thr Thr Gln Pro 1 5 10 15 Gln Tyr Arg His Asp Gln His Thr Gly Asp Arg Leu Thr His Pro Gln 20 25 30 Arg His Glu Gln Gly Pro Ser Thr Gly Lys Ile Met Val Ile Met Ala 35 40 45 Leu Leu Pro Ile Thr Gly Ile Leu Phe Gly Leu Ala Gly Ile Thr Ser 50 55 60 Ser Asp Gly Tyr Arg Ala Ser Leu Ala Thr Pro Leu Phe Val Ile Phe 65 70 75 80 Ser Pro Val Ile Val Pro Ala Met Ile Ala Ile Gly Leu Ala Val Thr 85 90 95 Gly Phe Leu Thr Ser Gly Thr Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Leu 100 105 110 Ser Tyr Leu Phe Asn Met Val Arg Arg Ser Thr Met Ser Val Pro Asp 115 120 125 Gln Met Asp Tyr Val Lys Gly Lys Leu Gln Asp Val Gly Glu Tyr Thr 130 135 140 Gly Gln Lys Thr Lys Asp Leu Gly Gln Lys Ile Gln His Thr Ala His 145 150 155 160 Glu Met Gly Asp Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gly Gly Lys Glu 165 170 175 Gly Arg Lys Glu Gly Gly Lys 180 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 18 Gln Asn Pro Ser His Asn Lys Cys Leu Arg 1 5 10

Claims (55)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. VFDGELQEGRVLIVPQNFVVAARSQSDNFEYVSFK (서열 1), VFDGELQEGR, SQSDNFEYVSFK 또는 VLIVPQNFVVAAR의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는, 콜레스테롤 수준을 감소시키기 위한 조성물.
KR1020047016758A 2002-04-18 2003-04-17 심혈관 질환의 위험성을 감소시키기 위한 오일 바디 결합 단백질 조성물 및 이의 사용 방법 KR101238752B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37346002P 2002-04-18 2002-04-18
US60/373,460 2002-04-18
PCT/US2003/012009 WO2003088749A1 (en) 2002-04-18 2003-04-17 Oil body associated protein compositions and methods of use thereof for reducing the risk of cardiovascular disease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20050060031A KR20050060031A (ko) 2005-06-21
KR101238752B1 true KR101238752B1 (ko) 2013-03-06

Family

ID=29251031

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020047016758A KR101238752B1 (ko) 2002-04-18 2003-04-17 심혈관 질환의 위험성을 감소시키기 위한 오일 바디 결합 단백질 조성물 및 이의 사용 방법

Country Status (14)

Country Link
US (1) US7541329B2 (ko)
EP (1) EP1494536B1 (ko)
JP (1) JP5219326B2 (ko)
KR (1) KR101238752B1 (ko)
CN (2) CN102240040B (ko)
AU (1) AU2003221982B2 (ko)
BR (1) BRPI0309421B8 (ko)
CA (1) CA2482464C (ko)
HK (1) HK1162127A1 (ko)
IL (1) IL164647A (ko)
MX (1) MXPA04010310A (ko)
NO (1) NO333937B1 (ko)
NZ (1) NZ536466A (ko)
WO (1) WO2003088749A1 (ko)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITMI20020147A1 (it) * 2002-01-29 2003-07-29 Indena Spa Estrazione purificazione e modificazione di polipeptidi da seme di soia
AU2005291805A1 (en) * 2004-10-06 2006-04-13 Sembiosys Genetics Inc. Methods for the modulation of oleosin expression in plants
WO2006101181A1 (ja) * 2005-03-23 2006-09-28 Fuji Oil Company, Limited 肝機能障害予防もしくは改善組成物、及び肝機能障害予防もしくは改善法
WO2007026674A1 (ja) * 2005-08-29 2007-03-08 Fuji Oil Company, Limited 大豆蛋白質組成物を配合する麺類および麺皮類
US7695744B1 (en) 2005-11-16 2010-04-13 Kareem M Zubair Natural supplement of cholesterol lowering oil seeds and nuts and method of manufacture
JP4963044B2 (ja) * 2006-07-05 2012-06-27 不二製油株式会社 ユビキチンリガーゼ阻害剤
JP3944864B1 (ja) * 2006-07-31 2007-07-18 株式会社Ｊ−オイルミルズ メタボリックシンドロームの予防および改善用組成物
US9101161B2 (en) * 2006-11-02 2015-08-11 The Coca-Cola Company High-potency sweetener composition with phytoestrogen and compositions sweetened therewith
US8124157B2 (en) 2006-12-14 2012-02-28 Fuji Oil Company, Limited Noodles and noodle skins comprising soybean protein composition and the method of making same
US20110020519A1 (en) * 2008-01-04 2011-01-27 Aveka, Inc. Encapsulation of oxidatively unstable compounds
WO2009089117A1 (en) * 2008-01-04 2009-07-16 Hormel Foods Corporation Encapsulation of oxidatively unstable compounds
JP5752874B2 (ja) * 2008-08-08 2015-07-22 株式会社ファンケル 血流改善組成物
KR101876471B1 (ko) * 2009-05-26 2018-07-16 (주)아모레퍼시픽 콩 추출물을 함유하는 혈액 순환 개선 및 혈관 건강 증진용 조성물
EP2611283B1 (en) 2010-08-30 2016-08-10 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Oil globule protein and uses thereof
US9238010B2 (en) * 2011-01-13 2016-01-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vesicles and nanostructures from recombinant proteins
US20140024714A1 (en) * 2011-02-07 2014-01-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Artificial oil bodies
WO2013052853A2 (en) * 2011-10-07 2013-04-11 Purdue Research Foundation Products containing partially hydrolyzed soy beta-conglycinin, and related methods

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000019839A2 (en) 1998-10-07 2000-04-13 Monsanto Company High-beta-conglycinin products and their use
WO2000030663A1 (en) 1998-11-25 2000-06-02 Nutri Pharma Asa Composition comprising soy protein, dietary fibres and a phytoestrogen compound and use thereof in the prevention and/or treatment of type 2 diabetes, the metabolic syndrome and associated cardiovascular diseases

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3642490A (en) 1967-03-27 1972-02-15 Ralston Purina Co Method of treating vegetable protein
US3694221A (en) 1970-01-30 1972-09-26 Ralston Purina Co Enzyme modified protein process
NZ183822A (en) * 1976-05-03 1980-05-08 Itt Method for preparing a lipoprotein emulsion :an egg yolk replacer
US4360537A (en) 1976-05-03 1982-11-23 International Telephone And Telegraph Corporation Lipoprotein emulsions for food use and methods for preparing the same
US5725899A (en) * 1978-03-16 1998-03-10 Cole; Morton S. Protein-lipid emulsifying and gelling composition and method of preparing same
CN86105538A (zh) 1986-07-25 1988-02-24 平乡县粮食局油脂加工厂 一种食用油精炼方法
WO1989001495A1 (en) 1987-08-07 1989-02-23 Fuji Oil Company, Limited Cholesterol-level depressant
JPH0725796B1 (ko) * 1987-08-07 1995-03-22 Fuji Oil Co Ltd
CA2077020A1 (en) 1991-09-03 1993-03-04 Yoshikazu Isono Process for producing lipoprotein-containing substance having reduced lipid content and food containing substance thus produced
FR2681219B1 (fr) 1991-09-16 1993-11-26 Ard Sa Produit lipidoproteique derive de la farine de ble, son procede de preparation et ses applications.
JPH05168428A (ja) * 1991-12-21 1993-07-02 Yuichiro Onozuka 大豆からの麺状食品製造法
ATE275959T1 (de) * 1992-05-19 2004-10-15 Graham Edmund Kelly Verwendung von isoflavon phyto-östrogen extrakten von soja oder klee
US5559220A (en) * 1993-09-14 1996-09-24 Midwest Research Institute Gene encoding acetyl-coenzyme A carboxylase
EP0790060B1 (en) * 1995-09-06 2003-11-12 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Substance ameliorant le metabolisme des graisses
US5968516A (en) * 1995-10-03 1999-10-19 Liu; Yaguang Soybean drug and new method of extracting soybean saponins
IL125729A (en) 1996-02-29 2001-09-13 Nutri Pharma As Preparation and its use as a food supplement or to reduce lipids in the blood serum
US5855892A (en) 1997-09-19 1999-01-05 Potter; Susan M. Method for decreasing LDL-cholesterol concentration and increasing HDL-cholesterol concentration in the blood to reduce the risk of atherosclerosis and vascular disease
DE69936837T2 (de) * 1998-01-07 2008-05-08 Diamond, George B. Knusprige frittierprodukte in traubenkeimoel
WO1999045961A1 (en) * 1998-03-12 1999-09-16 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Tertiary structure of peanut allergen ara h 1
JP3030339B2 (ja) * 1998-08-07 2000-04-10 農林水産省農業生物資源研究所長 ダイズグリシニンを発現するトランスジェニック植物
EP1131047A1 (en) 1998-11-25 2001-09-12 SemBioSys Genetics, Inc. Oil bodies as topical delivery vehicles for active agents
US6544566B1 (en) * 1999-04-23 2003-04-08 Protein Technologies International, Inc. Composition containing plant sterol, soy protein and isoflavone for reducing LDL cholesterol
US6413569B1 (en) * 1999-09-29 2002-07-02 Archer-Daniels-Midland Company Use of isolated soy protein for making fresh, unripened cheese analogs
JP3441411B2 (ja) 1999-10-12 2003-09-02 明治乳業株式会社 コレステロール低減化ペプチド
AU1280601A (en) 1999-11-18 2001-05-30 Societe Des Produits Nestle S.A. Recombinant oleosins from cacao and their use as flavoring or emulsifying agents
US6864362B2 (en) * 2000-03-16 2005-03-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company Hypoallergenic transgenic soybeans
JP3619137B2 (ja) 2000-09-28 2005-02-09 日本水産株式会社 オイルボディ様またはシェル状ナノカプセルおよびその製造方法
AU2001290293A1 (en) * 2000-09-28 2002-04-08 Ajinomoto Co. Inc. Oleosin/phospholipid complex and process for producing the same
AU2001290324A1 (en) * 2000-09-29 2002-04-08 Fuji Oil Company Limited Composition for diminishing neutral fat in blood
AU2001292291B2 (en) * 2000-10-02 2006-03-02 Fuji Oil Company, Limited Fractionated soybean protein and process for producing the same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000019839A2 (en) 1998-10-07 2000-04-13 Monsanto Company High-beta-conglycinin products and their use
WO2000030663A1 (en) 1998-11-25 2000-06-02 Nutri Pharma Asa Composition comprising soy protein, dietary fibres and a phytoestrogen compound and use thereof in the prevention and/or treatment of type 2 diabetes, the metabolic syndrome and associated cardiovascular diseases

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Biological Chemistry, Vol.265(23), pp.13843-13848(1990) *
NCBI Accession Number 1FXZ_A(2001.10.09) *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2005523007A (ja) 2005-08-04
IL164647A0 (en) 2005-12-18
BRPI0309421B1 (pt) 2018-06-26
IL164647A (en) 2009-07-20
CA2482464A1 (en) 2003-10-30
EP1494536B1 (en) 2013-06-19
BRPI0309421A8 (pt) 2017-12-05
MXPA04010310A (es) 2005-02-17
US7541329B2 (en) 2009-06-02
CN102240040A (zh) 2011-11-16
BRPI0309421B8 (pt) 2021-05-25
BR0309421A (pt) 2005-02-01
US20050214346A1 (en) 2005-09-29
NO20044575L (no) 2005-01-17
CN102240040B (zh) 2014-12-24
NZ536466A (en) 2008-04-30
AU2003221982B2 (en) 2009-04-23
WO2003088749A1 (en) 2003-10-30
JP5219326B2 (ja) 2013-06-26
NO333937B1 (no) 2013-10-28
EP1494536A4 (en) 2009-10-28
CN1662142A (zh) 2005-08-31
AU2003221982A1 (en) 2003-11-03
HK1162127A1 (en) 2012-08-24
KR20050060031A (ko) 2005-06-21
CA2482464C (en) 2013-06-25
EP1494536A1 (en) 2005-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101238752B1 (ko) 심혈관 질환의 위험성을 감소시키기 위한 오일 바디 결합 단백질 조성물 및 이의 사용 방법
US10051878B2 (en) Aqueous processing of oilseed press cake
Sandoval-Oliveros et al. Isolation and characterization of proteins from chia seeds (Salvia hispanica L.)
Wang et al. A new frontier in soy bioactive peptides that may prevent age‐related chronic diseases
WO2012006384A9 (en) Rothia species gluten-degrading enzymes and uses thereof
KR101705938B1 (ko) 피부 콜라겐 생성 촉진제
Abedini et al. Oilseed cakes in the food industry; a review on applications, challenges, and future perspectives
Karnjanapratum et al. Purification and identification of antioxidant peptides from gelatin hydrolysates of unicorn leatherjacket skin.
Jiang et al. Identification and analysis of antioxidant peptides from sorghum (Sorghum bicolor L. Moench) on the basis of in vitro simulated gastrointestinal digestion
JP4461680B2 (ja) 血中中性脂肪低減用組成物
Jin et al. Influence of in vitro digestion on antioxidative activity of coconut meat protein hydrolysates
RU2300898C2 (ru) Способ экстрагирования, очистки и ферментативной модификации альфа`субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента
KR101230650B1 (ko) 홍어 껍질 유래의 알츠하이머 질병의 억제 또는 예방을 위한 조성물
Xu et al. Isolation, identification and molecular docking of anti-inflammatory peptides from walnut (Juglans regia L.) meal hydrolysates
Song et al. In vitro gastrointestinal digestion of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) protein: Release and structural characteristics of novel bioactive peptides stimulating gut cholecystokinin secretion
Majumder Characterization of Chemical, Nutritional, and Techno-Functional Properties of Protein-Rich Fractions Obtained from Canola Cold-Pressed Cake
KR102644928B1 (ko) 갈색거저리 유충 단백질을 이용한 근육 질환의 예방 또는 개선용 두부의 제조방법
Zhang et al. Angiotensin i converting enzyme inhibitory peptides from sword bean
Huang et al. In vitro gastrointestinal digestion of highland barley protein: identification and characterization of novel bioactive peptides involved in gut cholecystokinin secretion
KR20230036870A (ko) 갈색거저리 유충 단백질을 이용한 근육 질환의 예방 또는 개선용 두부
Chelliah et al. Role of Antihypertensive Peptides from Plant (sesame, almond and pumpkin) Seed Storage Protein
El-Ramahi Isolation and characterization of proteins from defatted flaxseed meal
Song et al. Identification and target of action of cholecystokinin‐releasing peptides from simulated digestion hydrolysate of wheat protein
Zhang Identification, Characterization and in Vitro Activity of Novel Hypolipidemic Peptides in Protein Hydrolysate from Protaetia Brevitarsis Larvae
Parolari LEGUME PROTEINS FOR THE MANAGEMENT OF CHRONIC DISEASES: HYPERLIPIDEMIA AND DIABETES

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
E902 Notification of reason for refusal
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160211

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170221

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180208

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190212

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200129

Year of fee payment: 8