NO326292B1 - Sammensetning som omfatter castanosperminester og IFN-alfa, anvendelse av nevnte castanospeminester eller nevnte kombinasjon samt kit inneholdende nevnte kombinasjon - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Den foreliggende oppfinnelsen er relatert til anvendelsen av visse kastanosperminestere for fremstilling av et medikament for behandling av hepacivirus infeksjon. Oppfinnelsen vedrører også sammensetninger som omfatter nevnte kastanosperminestere i kombinasjon med EFN-a, anvendelse av slike kombinasjonspreparater samt kit inneholdende nevnte kombinasjon.

Oppfinnelsens bakgrunn

Flavivirus

Flavivirusgruppen (familien Hepacivirus) omfatter slektene Flavivirus, Pestivirus og Hepacivirus og inkluderer det forårsakende agens til flere humane sykdommer og forskjellige dyresykdommer som forårsaker vesentlige tap i husdyrsindustrien.

Familien Hepacivirus (medlemmer er heri referert til som flavivirus) inkluderer slektene Flavivirus (for eksempel gulfebervirus, dengue virus, japansk encefalittvirus og flått-bært encefalittvirus), Pestivirus (for eksempel bovint viralt diaré virus, klassisk svinefeber virus og "border" sykdomsvirus), Hepacivirus (hepatitt C virus) og for tiden uklassifiserte medlemmer av Hepacivirus (for eksempel GB virustypene A, B og C).

Den fulle listen av medlemmer av Hepacivirus defineres i detalj av den internasjonale komité for virustaksonomi (den nåværende godtatte taksonomiske definisjon beskrives i: Virus Tazonomy: The Claccification and Nomenclature of Viruses. The Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (bok). M.H.V. van Regenmortel, CM. Fauquet, D.H.L. Bishop, E.B. Carstens, M.K. Estes, S.M. Lemon, J. Maniloff, M.A. Mayo. D.J. McGeoch, CR. Pringle, R.B. Wickner (2000). Virus Taxonomy, Vllth report of the ICTV. Academic Press, SanDiego), er inkorporert heri ved referanse.

Det kanskje mest viktige flaviviruset er imidlertid hepatitt C virus (HSV). HSV ble første gang identifisert i 1989 og det har blitt klart at dette viruset er ansvarlig for de fleste tilfeller av post-transfusjon non-A, non-B hepatitt. HCV er nå faktisk ansett som en av de vanligste infeksjonene forårsakende kronisk leversykdom og verdens helseorganisasjon estimerer at 170 millioner mennesker er kronisk infisert. HCV-infeksjon resulterer i en kronisk infeksjon i 85% av de affiserte pasienter, og omtrent 20-30% av disse vil utvikles til cirrhose og i siste nivå lever sykdom, ofte komplisert av hepatocellulær karcinoma.

Studiet av HCV har blitt forsinket av vanskelighetene med å dyrke virusene effektivt i cellekultur. I fraværet av et egnet cellekultursystem i stand til å understøtte replikasjon av humant HCV er imidlertid BVDV en akseptert cellekulturmodell. HCV og BVDB deler en vesentlig grad av lokal proteinhomologi, en felles replikasjonsstrategi og sannsynligvis den samme subcellulære lokaliseringen for viral utvikling.

HCV er et enveloped pluss-tråd RNA-virus tilhørende Hepacivirus familien, men klassifisert i en egen slekt Hepacivirus. HCV-genomet består av enkle lange åpne leserammer som koder et -3000 aminosyreresidium polyprotein. Dette polyproteinet prosesseres under og etter translasjon til minst 10 forskjellige produkter, inkludert to N-linkede glykosylerte proteiner El og E2.

Genomet bærer ved 5'- og 3'-endene ikke-translaterte regioner (NTR) som danner stabile sekundære og tertiære strukturer. 5' NTR bærer et internt ribosom startsett (IRES) som muliggjør direkte binding av ribosomer nært til startkodonet til den åpne leserammen (ORF). Translasjon av HCV RNA er følgelig mediert av IRES heller enn den CAP-avhengige mekanismen typisk anvendt av cellulært mRNA.

Innen polyproteinet er delingsproduktene ordnet som følger: kjerne (C), envelope protein 1 (El), E2, p7, ikke-strukturelt protein 2 (NS2), NS3, NS4A, NS4B, NS5A og NS5B. Kjerneproteinet er et meget basisk RNA bindeprotein som er den største konstituenten av nukleokapsidet. Envelope proteinene El og E2 er høyt glukosylerte type 1 membranproteiner forankret gjennom den karboksyterminale regionen. De er omsluttet av lipid envelope til viruspartikkelen og assosierer for å danne stabile heterodimerer. Delingsproduktet p7 er et lite hydrofobisk peptid med ukjent funksjon. De ikke-strukturelle proteinene er involvert i viral replikasjon og innehar protease (NS2/NS3), helikase (NS3) og RNA polymeraseaktiviteter (NS5B).

Binding til vertscellen krever sannsynligvis interaksjonen av E2 eller E1/R2 komplekset med en reseptor som er tilstede på celleoverflaten.

På grunn av mangelen på en effektiv cellekultur replikasjonssystem er forståelsen av HCV partikkel assembly meget begrenset. Fraværet av komplekse glykaner, lokaliseringen av uttrykte HCV glykoproteiner i det endoplasmatiske retikulum (ER) og fraværet av disse proteinene på celleoverflaten antyder imidlertid at tidlig virion morfogenese skjer ved budding inn i intracellulære vesikler fra ER. I tillegg flater ikke modne E1-E2 heterodimerer ER og ER-retensjonssignaler har blitt identifisert i de C-terminale regionene til både El og E2.1 dette tilfellet vil viruset bli eksportert via den konstitutive sekretoriske vei. I samsvar med denne antagelsen ble komplekset N-koblede flykaner funnet på overflaten til partielt rensede viruspartikler, noe som antyder at viruset går igjennom Golgi.

Opptil nylig var interferon-a (EFN-a) den eneste terapien med bevist effekt ved behandling av HCV-infeksjon. Med IFN-a viser opp til 50% av pasientene en respons på behandling, men dette er ikke bærekraftig i flertallet av pasientene og det er vesentlige bivirkninger. Nylig har større suksess blitt oppnådd ved å anvende EFN-a i kombinasjon med nukleosidanalogen ribavirin, men fortsatt forskning er påkrevd for å identifisere nye terapeutiske kandidater med mer potent antiviral aktivitet og færre alvorlige bivirkninger.

Det er derfor et behov for forbedrede antivirale legemidler generelt, og anti-HCV legemidler spesielt.

Glykoproteiner og viral utvikling

Glykoproteiner klassifiseres i to store klasser i henhold til bindingen mellom sukker og aminosyre i proteinet. Den mest vanlige og mest studerte er N-glykosidbindingen mellom et asparagin i proteinet og et N-acetyl-D-glukosaiminresidium i oligosakkaridet. N-bundne oligosakkarider, etter påsetting på en polypeptid bakkjede prosesseres av en serie spesifikke enzymer i det endoplasmatiske retikulum (ER) og denne prosesseirngsveien har blitt godt karakterisert.

I ER er ct-glukosidase I ansvarlig for fjerningen av det terminale a-1,2-glukoseresidiumet fra forløper oligosakkaridet og oc-glukosidase II fjerner de to gjenværende a-1,3 bundne glukoseresidiumer, før fjerning av mannoseresidiene ved mannosidaer og videre prosesseringsreaksjoner med forskjellige transferaser. Disse oligosakkarid "trimming" reaksjonene gjør glykoproteinene i stand til å folde korrekt og til å interagere med chaperonproteiner slik som kalneksin og kalretikulin for transport gjennom Golgi-apparatet.

Inhibitorer av nøkkelenzymer i denne biosyntetiske reaksjonsveien, spesielt de som blokkerer a-glukosidaser og a-mannosidaser, har blitt vist å forebygge replikasjon av flere membranomsluttede ("enveloped") vira. Slike inhibitorer kan fungere ved å interferere med flodingen av de virale membranglykoprotein, for derved forhindre den tidlige virus-vertscelle interaksjon etter påfølgende fusjon. De kan også muligens forhindre viral duplisering ved å forhindre konfensjon av ordentlig glykoprotein nødvendig for ferdigstillingen av den virale membranen.

Det har for eksempel vært rapportert at de ikke-spesifikke glykosyleringsinhibitorene 2-deoksy-D-glukose og P-hydroksynorvalin inhiberer ekspresjon av HIV glykoproteiner og blokkerer dannelsen av syncytia (Blough et al., Biochemical og Biophysical Research Communications, 141(1), 33-38 (1986)). Viral multiplisering i HIV-infiserte celler behandlet med disse midlene stoppes, sannsynligvis på grunn av utilgjengeligheten av glykoprotein nødvendig for dannelsen av viral membran.

En annen rapport ble glykosyleringsinhibitoren 2-deoksy-2-fluor-D-mannose funnet å ha antiviral aktivitet mot influensainfiserte celler ved å forhindre glykosyleringen av viralt membranprotein (McDowell et al., Biochemistry, 24(27), 8145-52 (1985)). Denne rapporten studerte også den antivirale aktiviteten av 2-deoksyglukose og 2-deoksy-2-fluorglukose og fant at hver av dem inhiberer viral proteinglykosylering ved forskjellige mekanismer.

Lu et al. (1995) presenterer bevis for at N-bundet glykosylering er nødvendig for hepatitt B-virussekresjon (Virology 213: 660-665) mens Block et al. (1994) viser at sekresjon av humant hepatitt B-virus inhiberes av iminosukkeret N-butyldeoksynojirimycin (PNAS 91: 2235-2239). Se også WO 9929321.

Taylor et al.(1988) viser tap av cytomegalovirusinfeksøsitet etter behandling med kastanospermin eller andre platealkaloider og relaterer dette til avvikende glykoproteinsyntese (Antiviral Res. 10: 11-26). St også US patent 5,0004,746.

Taylor et al (1994) viser at inhibering av a-glukosidase I i de

glykoproteinprosesserende enzymene av 6-0-butanoylkastanospermin har konsekvenser for HIV-infiserte T-celler (Antimicrob. Ag. Chemother. 38: 1780-1787) mens Sunkara et al. (1989) beskriver anti-HIV aktivitet av kastanosperminanaloger (Lancet TJ 1206). Se også US patent 5,0004,746.

US patent 5,385,911 fremlegger anti-herpes aktivitet i visse kastanosperminestere.

Mange andre kjente glykosyleringsinhibitorer har imidlertid blitt funnet å ikke ha noen antiviral aktivitet. Følgelig er den antivirale aktiviteten generelt mot membranomsluttede vira og spesielt den anti-flavivirale aktiviteten av glykosyleringsinhibitorer nokså uforutsigelig.

Glukosidaseinhibitorer

Kastanospermin og visse iminosukkere slik som deoksynojirimycin (DNJ) er ER a-glukosidaseinhibitorer og inhiberer potent de tidligere faser av

glykoproteinprosessering. Deres virkninger varierer imidlertid sterkt avhengig av systemet hvor de er applisert og de kan vise nokså forskjellige spesifisiteter, hvor kastanospermin er relativt spesifikt for a-glukosidase I.

Kastanospermin er et alkaloid originalt isolert fra frøene fra Castanospermim australe med den følgende formel:

Systematisk kan denne forbindelsen navngis på flere forskjellige måter som følger: [1S-(la,6p,7a,8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizineterol eller [IS, (lS,6S,7R,8R,8aR)-1,6,7,8-tetrahydroksyindolizidin eller 1,2,4,8-tetradeoksy-1,4,8-nitrilo-L-glycero-D-galaktooktitol. Eller det første systematiske navnet "kastanospermin" vil bli anvendt i diskusjonen nedenfor.

Branza-Nichita et al. (2001) J. Virol 75/8): 3527-3536 viser at iminosukkeret N-butyldeoksynojirimycin har en antiviral virkning mot pestiviruset BVDV. Forfatterne gjør det imidlertid klart at mens behandling med a-glukosidaseinhibitorer kan affisere livssyklusene til dette og andre membranomsluttede vira, så er det ikke mulig å generalisere i forhold til andre vira ettersom virkningene kan avhenge i stort monn på den spesielle foldingsreaksjonsveien anvendt av de virale proteinene.

Courageot et al. (2000) J. Virol. 74(1): 564-572 rapporterer at ct-glukosidaseinhibitorene kastanospermin og DNJ reduserer dengue virusproduksjon i en in vitro musemodell. Ingen vesentlige forskjeller i aktiviteten mellom iminosukkerinhibitoren DNJ og kastanospermin ble imidlertid rapportert.

WO 99/29321 fremlegger anvendelsen av a-glukosidaseinhibiorer generelt (og iminosukkere spesielt) ved behandling av blant annet HCV-infeksjoner. Ingen spesifikke referanser gjøres imidlertid til kastanospermin (eller estere eller derivater av denne) i denne sammenheng. Istedenfor fokuserer dokumentet på aktivitene til forskjellige iminosukkere.

Chouckhi et al. (1998) J. Virol. 72(5): 3851-3858 rapporterer om virkningen av kastanospermin på interaksjon mellom HCV glykoproteiner og deres chaperoner. Kastanospermin forhindret ikke interaksjon mellom HCV glykoproteiner og chaperonkalnekxin og kalretikulin. Tvert imot økte faktisk kastanospermin bindingen av glykoproteiner til kalretikulin. Forfatterne foreslår at HCV glykoproteinprosessering muligens ikke er sensitiv til inhibitorer av glykoproteintrimming (slik som kastanospermin), og konkluderer at: binding of HCV glycoproteins to and release from calnexin or calreticulin could be independent of trimming .... of the N-linked glycans.

(Choukhi et al, side 3856, kolonne 1)

På tross av slike teorier har de nåværende oppfinnerne overraskende funnet at visse estere av kastanospermin faktisk viser antiviral aktivitet mot medlemmer av Hepacivirus (inkludert HCV). Videre har de funnet at den terapeutiske indeksen er uventet meget overlegen i forhold til de fremvist av andre a-glukosidaseinhibitorer innen iminosukkerklassen (esterne viser relativ høy antiviral aktivitet og relativ lav toksisitet). Uten å være bundet til noen teori på postuleres det at disse uventede egenskapene til kastanosperminesteret muligens reflekterer deres relative spesifisitet for en viss klasse av glykoproteinprosesserende enzymer (dvs. oc-glukosidase I).

Oppsummering av oppfinnelsen

Et første aspekt ved oppfinnelsen vedrører anvendelse av en castanosperminester for fremstilling av et medikament for behandling av hepacivirus infeksjon som omfatter en castanosperminester ifølge formelen:

hvor

R, Ri og R2 er uavhengig hydrogen, Ci.14 alkanoyl, C2-14 alkenoyl, cykloheksankarbonyl, Ci-8 alkoksyacetyl,

naftalenkarbonyl, eventuelt substituert med metyl eller halogen;

fenyl(C2-6 alkanoyl) hvor fenylet valgfritt substitueres med metyl eller halogen;

cinnamoyl;

pyridinkarbonyl valgfritt substituert med metyl eller halogen;

dihydropyridinkarbonyl valgfritt substituert med Ci. 10 alkyl;

tiofenkarbonyl fritt substituert med metyl eller halogen; eller furankarbonyl valgfritt substituert med metyl eller halogen;

Y er hydrogen, Cm alkyl, Cm alkoksy, halogen, trifluormetyl, Cm alkylsulfonyl, Ci.4 alkylmerkapto, cyano eller dimetylamino;

Y' er hydrogen, Cm alkyl, Cm alkoksy, halogen eller kombineres med Y for å gi 3,4-metylendioksy;

Y" er hydrogen, Ci-4 alkyl, Ci.4 alkoksy eller halogen; med

R, Ri og R2 valgt på en slik måte at minst en av dem, men ikke mer enn to av dem, er hydrogen;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller derivat derav.

I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen er R, Ri og R2 hver uavhengig hydrogen, Ci.10 alkanoyl, C2-10 alkenoyl, Ci.8 alkoksyacetyl eller hvor Y er hydrogen, Cm alkyl, CMalkoksy, halogen, trifluormetyl, Cm alkylsulfonyl, Cm alkylmerkapto, cyano eller dimetylamino;

Y' er hydrogen, C1.4 alkyl, Cm alkoksy, halogen eller kombineres med Y for å gi 3,4-metylendioksy;

Y" er hydrogen, Cm alkoksy eller halogen; med

R, Ri og R2 valgt på en slik måte at minst en av dem, men ikke flere enn to av dem, er hydrogen.

I en annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen er R, Ri og R2 hver uavhengig hydrogen, Ci-8 alkanoyl, C2-8 alkenoyl, Ci.8 alkoksyacetyl eller et benzoyl valgfritt substituert med et alkyl eller halogen; med R, Ri og R2 valgt på en slik måte at en av dem, men ikke mer en to av dem, er hydrogen.

I en ytterligere utførelsesform er R, Ri og R2 hver uavhengig hydrogen, d-s alkanoyl, C2-8 alkenoyl, C2-8 alkoksyacetyl eller et benzoyl valgfritt substituert med en metyl-, brom-, klor- eller fluorgruppe; med R, Ri, R2 valgt på en slik måte at minst en av dem, men ikke mer enn to av dem, er hydrogen.

Det er videre foretrukket at Ri er et Ci-s alkanoyl, C2-10 alkenoyl, Ci-s alkoksyacetyl eller et benzoyl valgfritt substituert med et alkyl eller halogengruppe, mer foretrukket er Ri er et Ci-s alkanoyl, C2-8 alkenyol, Ci.8 alkoksyacetyl eller et benzoyl valgfritt substituert med en metyl-, brom-, klor- eller fluorgruppe.

I en foretrukket utførelsesform er castanosperminesteren valgt fra:

(a) [lS-(la,6p,7a,8(3,8a(3)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol 6-benzoat; (b) [lS-(la,6p,7a,8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol 7-benzoat; (c) [lS-(la,6p,7a,8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol6-(4-metylbenzoat); (d) [lS-(la,6p,7a,8p,8aP)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol 7-(4-brombenzoat); (e) [1 S-(la,6p,7a,8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol 6,8-dibutanoat; (f) [lS-(la,6p,7a,8p,8aP)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol6-butanoat; (g) [lS-(la,6p,7a,8p,8aP)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol 6-(2-furankarbonxylat); (h) [lS-(la,6p,7a,8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol 7-(2,4-diklorbenzoat); (i) [lS-(la,6p,7a,8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol6-(3-heksenoat); (j) [lS-(la,6p,7a,8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol 6-oktanoat; (k) [lS-(la,6p,7a,8p,8ap)]-oktahydro- 1,6,7,8-indolizintretol 6-pentanoat; (1) en O-pivaolylester; (m)en 2-etylbutyrylester;

(n) en 3,3-dimetylbutyrylester;

(o) en cyklopropanoylester;

(p) en 4-metoksybenzoatester;

(q) en 2-aminobenzoyatester; og

(r) en blanding av en eller alle av (a)-(q).

Mer foretrukket er castanosperminesteren [lS-(la,6p,7a, 8p,8aP)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizinetetrol 6-benzoat, [lS-(la,6p,7a, 8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizinetetrol 6-butanoat, [lS-(la,6p,7a, 8p,8aP)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizinetetrol 6-pentanoat eller [lS-(la,6p,7oc, 8P,8aP)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizinetetrol 6-(2-furankarboksylat).

Medikamentet ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter fortrinnsvis en farmasøytisk akseptabel eksipient og nevnte hepacivirus er fortrinnsvis hepatitt C virus (HCV).

Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter en castanosperminester som definert ovenfor i kombinasjon med interferon-a (IFN-a). Fortrinnsvis omfatter nevnte sammensetning også en farmasøytisk akseptabel eksipient.

I en utførelsesform ifølge det andre aspekt av oppfinnelsen er castanosperminesteren [lS-(la,6p,7a, 8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizinetetrol 6-butanoat.

Et tredje aspekt ved oppfinnelsen angår anvendelse av sammensetningen ifølge det andre aspekt ved oppfinnelsen, for fremstilling av et medikament for behandling av en hepacivirus infeksjon. Fortrinnsvis er nevnte hepacivirus HCV.

Et fjerde aspekt ved oppfinnelsen vedrører Farmasøytisk kit av deler, kjennetegnet ved at det omfatter en castanosperminester som definert ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen i kombinasjon med interferon-a. Fortrinnsvis er castanosperminesteren og/eller interferon-a er i en enhetsdoseform. Det er videre foretrukket at nevnte kit videre omfatter instruksjoner for anvendelse ved behandling av en hepacivirus infeksjon slik som en HCV infeksjon.

En utførelsesform ifølge det fjerde aspekt ved oppfinnelsen er castanosperminesteren [lS-(la,6p,7oc, 8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizinetetrol 6-butanoat

Tilleggsterapeutikaene diskutert ovenfor kan administreres sammen med kastanosperminesterne ifølge oppfinnelsen. Alternativt kan kastanosperminesterne og tilleggsterapeutikaene administreres sekvensielt.

Sammensetningen beskrevet ovenfor omfatter videre valgfritt et farmasøytisk akseptabelt bindemiddel. Følgelig omfatter oppfinnelsen også en farmasøytisk sammensetning omfattende sammensetningen beskrevet ovenfor.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen anvendes fortrinnsvis i terapi eller profylakse.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Som anvendt heri er begrepet "flavivirus" intendert å dekke hvilket som helst medlem av Hepacivirus familien.

Uttrykket "et farmasøytisk akseptabelt salt" er intendert å dekke et hvilket som helst ikke-toksisk organisk eller uorganisk syreaddisjonssalt av baseforbindelsene.

Illustrative organiske syrer som danner egnede salter inkluderer hydroklor-, hydrobrom-, svovel- og fosforsyre og syremetallsalter slik som natriummonohydrogenortofosfat og kaliumhydrogensulfat. Illustrative organiske syrer som danner egnede salter inkluderer mono-, di- og trikarboksylsyrer. Illustrasjoner på slike syrer er for eksempel eddik-, glykol, melke-, pyruvin-, malon-, suksin-, glutar-, fumar-, malin-, vin-, sitron-, askorbin-, malein-, hydroksymalein-, benzo-, hydroksybenzo-, fenyleddik-, kanel-, salicyl- og 2-fenoksybenzosyre. Andre organiske syrer som danner egnede salter er sulfonsyrer slik som metansulfonsyre og 2-hydroksyetansulfonsyre.

Disse saltene og baseforbindelsene kan eksistere i enten en hydrert eller vesentlig vannfri form. Syresaltene fremstilles ved standardteknikker slik som ved løsing av fri base i vandige eller vandige-alkoholløsninger eller andre egnede løsemidler inneholdende den egnede syre og isolering ved fordamping av oppløsningen, eller ved reaksjon av den frie basen i et organisk løsemiddel hvor saltet separeres direkte og kan oppnås ved kondensering av løsningen.

Generelt er syreaddisjonssaltene i sammensetningene ifølge oppfinnelsen krystalliske materialer som er løselig i vann og forskjellige hydrofile organiske løsemidler og til sammenligning med deres frie baseformer, viser høyere smeltepunkt og en økt løsningsevne.

Uttrykket "et farmasøytisk akseptabelt derivat" er ment å dekke etter pro-legemidler som har større resistens mot hydrolyse og forøket lipofilisitet. Slike pro-legemidler viser raskt fjerning fra gastrointestianl trakt når levert oralt og en "depot effekt" som vedlikeholder konsentrasjonen av det aktive legemiddelet ved målet (for eksempel leveren).

Cm alkanoylgruppene referert til ovenfor kan være rette eller forgrenete kjeder eller cykliske og kan eksemplifiseres ved formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, cyklopropankarbonyl, heksanoyl, oktanoyl og dekanoyl.

Cm alkenoylgruppene referert til ovenfor kan være rette eller forgrenede kjeder eller cykliske, men har minst en karbon-karbon dobbelbinding. Eksempler inkluderer propenoyl, butenoyl, isobutenoyl, heksenoyl, oktenoyl og decenoyl.

Cm alkoksyacetylet referert til ovenfor kan være metoksyacetyl, etoksyacetyl og butoksyacetyl.

Halogenene referert til ovenfor kan eksemplifiseres ved fluorin, klorin, bromin eller jodin.

C2-6 alkanoylgruppene referert til ovenfor kan være acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl og heksanoyl.

Cm alkylgruppene referert til ovenfor, enten alene eller som en del av en alkoksy, en alkylsulfonyl eller en alkylmerkaptogruppe kan være rett eller forgrenet kjedealkylgrupper inneholdende opp til 4 karbonatomer. Eksempel på forskjellige slike grupper er metyl, etyl, propyl, butyl, metoksy, etoksy, butoksy, metylsulfonyl, etylsulfonyl, metylmerkapto og etylmerkapto.

Fenyl(C2-6 alkanoylgruppene referert til ovenfor kan være benzenacetyl og benzenpropionyl.

De forskjellige naftalenkarbonyl, pyridinkarbonyl-, tiofenkarbonyl og furankarbonylgruppene referert til ovenfor inkluderer forskjellige posisjonsisomerer og disse kan være naftalen-1-karbonyl, natalen-2-karbonyl, nikotinoyl, isonikotinoyl, N-metyldihydropyridin-3-karbonyl, tiofen-2-karbonyl, tiofen-3-karbonyl, furan-2-karbonyl og furan-3-karbonyl. Naftalen-, pyridin- tiofen- og furangruppene kan videre valgfritt substitueres som antydet ovenfor.

Esterene ifølge foreliggende oppfinnelse er frembrakt ved reaksjonen av kastanospermin med et egnet syreklorid eller anhydrid i inert løsemiddel. Halidet kan være et klorid eller bromid og anhydridet inkluderer blandede anhydrider. Den relative mengden av syrehalidene eller anhydridene anvendt, den relative mengde av løsemiddel, temperaturen og reaksjonstiden kontrolleres for å minimalisere antallet av hydroksygrupper som acetyleres. Følgelig anvendes bare et begrenset overskudd av syrederivatene, som betyr opp til omkring tre-dobbelt overskudd av alkyleringsmiddelet.

Anvendelse av et løsemiddel i relativt store mengder virker fortynnende på reaktantene og undertrykker mengden av høyere acetylerte produkter som dannes. Løsemiddelet anvendt er fortrinnsvis et som løser reaktantene uten å reagere med dem.

Det er videre foretrukket å utføre reaksjonen i nærværet av et tertiært amin som reagerer med og fjerner syrer dannet i løpet av reaksjonen. Det tertiære aminet kan legges til blandingen eller det kan anvendes i overskuddet og virke som løsemiddelet. Pyridin er et foretrukket løsemiddel i denne forbindelsen. Som antydet ovenfor kontrolleres tiden og temperaturen for å begrense mengden acetylering som finner sted.

Fortrinnsvis utføres reaksjonen med kjøling i et isbad i en periode på omkring 16 timer for å gi monoesterne med reaksjonstiden forlenget for en lengre periode slik som 7 dager hvis diestere ønskes. Reaksjonen kan faktisk bli utført ved høyere temperaturer og oppvarming kan anvendes så lenge de forskjellige faktorene involvert er ordentlig kontrollert.

Når reaksjonen er utført som beskrevet vil den endelige reaksjonsblandingen fremdeles inneholde en betydelig mengde av ureagert kastanospermin. Dette ureagerte materialet kan gjenvinnes fra reaksjonsblandingen og resirkuleres i senere reaksjoner og derved øke mengden av kastanospermin konvertert til ester. Denne resirkuleringen er spesielt viktig når reaksjonen utføres under betingelser som favoriserer isoleringen av monoestere.

Prosedyrene som beskrevet ovenfor gir generelt 6- eller 7-monoestere eller 6,7- eller 6,8-diestere. Andre isomerer kan oppnås ved egnet anvendelse av blokkeringsgrupper.

Følgelig kan for eksempel kastanospermin reageres med 2-(dibrommetyl)benzoylklorid for å gi 6,7-diester. Denne diester reagerer så med et egnet syrehalid eller anhydrid for å gi den tilsvarende 8-ester. De to beskyttende gruppene fjernes lett ved konversjon av de to dibromometylgruppene til formyl (ved å bruke sølvperklorat og 2,4,6-kollidin i vandig aceton) fulgt av hydrolyse av formylbenzosyreesteren oppnådd ved å bruke morfolin og hydroksinion.

Den antydede prosedyren kan anvendes på en lignende måte for å gi diesterisomerer.

Med 1,8-O-isopropylidenkastanospermin eller 1,8-cykloheksylidenkastanospermin favoriseres nesten utelukkende dannelsen av 6-esteren i reaksjonen med et syreklorid i en standard esterifiseringsprosedyre. Isopropyliden eller cykloheksylidengruppen fjernes så ved behandling med en syre slik som 4-toluensulfonsyre. Utgangsketalforbindelsene oppnås selv fra kastanospermin 6,7-dibenzoat. Dette dibenzoatet reageres med 2-metoksypropen eller 1-metoksycykloheksan og syre for å introdusere 1,8-O-isopropyliden eller 1,8-O-cykloheksylidengruppen og de to benzoatestergruppene fjernes ved hydrolyse med base slik som natriumhydroksid eller ved transesterifisering med natrium eller kaliumalkoksid som katalysator.

Medisinske anvendelser

Oppfinnelsen finner anvendelse i medisin, for eksempel i terapimetoder og/eller profylakse. Metodene inkluderer veterinære anvendelser.

Som anvendt heri refererer begrepet "flaviviral infeksjon" til en hvilken som helst tilstand eller lidelse som involverer (for eksempel forårsakes, forverres eller karakteriseres av) et flavivirus i cellene eller kroppen til nevnte pasient.

Begrepet "pasient" som anvendt heri betyr pattedyr slik som primater, inkludert mennesker, sauer, hester, kveg, griser, hunder, katter, rotter og mus.

Posologi

Medikamentene anvendt i den foreliggende oppfinnelsen kan administreres ved oral eller parenterale ruter, inkludert intravenøst, intramuskulær, intreperitoneal, subkutan, transdermal, luftveis (aerosol), rektal, vaginal og topikal (inkludert bukal og sublingual) administrering.

Mengden av kastanosperminesteren administrert kan variere sterkt i henhold til den spesielle doseringsenhet anvendt, behandlingsperiode, alder og kjønn til pasienten behandlet, naturen og omfanget av tilstanden behandlet og den spesielle kastanosperminesteren valgt.

Videre kan kastanosperminesteren anvendes som andre midler kjent for å være nyttige i behandlingen av flavivirale infeksjoner (som beskrevet ovenfor) og i slike utførelsesformer kan dosen justeres i henhold til dette.

I tilfelle av kastanosperminesterprolegemiddelderivater som viser større resistens mot hydrolyse og øket lipofilisitet kan lavere doser anvendes. Som forklart ovenfor, viser slike prolegemidler rask fjerning fra gastrointestinal traktus når avlevert oralt, mens de frembringer en depoteffekt som opprettholder konsentrasjonen av det aktive legemiddelet ved målet (for eksempel leveren).

Følgelig vil den effektive mengde av kastanosperminester administrert generelt være i området fra omkrint 15 mg/kg til 500 mg/kg. En enhetsdosering kan inneholde fra 25 til 500 \ ig av kastanosperminesteren og kan bli tatt en eller flere ganger per dag. Kastanosperminesteren kan administreres med en farmasøytisk bærer ved å anvende konvensjonelle doseringsenhetsformer enten oralt, parenteralt eller topikalt som beskrevet nedenfor.

Den foretrukne rute for administrering er oral administrering. Generelt vil en egnet dose være innenfor området 0,1 til 300 mg/kg kroppsvekt til mottageren per dag. Fortrinnsvis innenfor området 6-150 mg/kg kroppsvekt per dag og mest foretrukket innenn området 15 til 100 mg/kg kroppsvekt per dag.

Den ønskede dose er fortrinnsvis presentert som to, tre, fire, fem, seks eller flere subdoseringer administrert i egnede intervaller gjennom dagen. Disse subdosene kan administreres i enhetsdoseirngsformer, for eksempel inneholdende 10-1 500 mg, fortrinnsvis 20-1 000 mg og mest foretrukket 50-700 mg av den aktive ingrediens per enhets doseringsform.

Formulering

Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan frembringes i kombinasjon med et farmasøytisk akseptabelt bindemiddel. Ethvert egnet bindemiddel kan anvendes, inkludert for eksempel inerte fortynnere, disintegrerende midler, bindemidler, smørende midler, søtende midler, smaksmidler, fargemidler og preserverende midler. Egnede inerte fortynnere inkluderer natrium og kalsiumkarbonat, natrium og kalsiumfosfat og laktose, mens maisstivelse og algininsyre er egnede disintgrerende midler. Bindingsmidler kan inkludere stivelse og gelatin, mens smøremiddelet, hvis tilstede, vil generelt være magnesiumstearat, stearinsyre eller talk.

De farmasøytiske sammensetningene kan ta en hvilken som helst egnet for å inkludere for eksempel tabletter, eliksirer, kapsler, løsninger, suspensjoner, pulvere, granuler og aerosoler.

Den farmasøytiske sammensetningen kan ta form av et sett av deler, hvor settet kan omfatte sammensetningen ifølge oppfinnelsen som instruksjoner for anvendelse og/eller en mengde forskjellige komponenter i enhetsdoseirngsform.

Tabletter for oral anvendelse kan inkludere den aktive ingrediens blandet med farmasøytisk akseptable bindemidler slik som inerte fortynnere, disintegrerende midler, bindemidler, smøremidler, søtningsmidler, smakstilsetninger, farge og preserverende midler. Egnede inerte fortynnere inkluderer natrium og kalsiumkarbonat, natrium og kalsiumfosfat og laktose, mens maisstivelse og algininsyre er egnede disintegrerende midler. Bindemidler kan inkludere stivelse og gelatin, mens smøremiddelet vil generelt være magnesiumstearat, stearinsyre eller talk. Hvis ønsket kan tablettene være dekket med et materiale slik som glyserylmonostearat eller glyseryldistearat for å forsinke absorpsjon i gastrointestinal trakt.

Kapsler for oral anvendelse inkluderer harde gelatinkapsler hvor den aktive ingrediensen blandes med en fast fortynner, og myke gelatinkapsler hvor den aktive ingrediensen blandes med vann eller en olje slik som peanøttolje, flytende parafin eller olivenolje.

Formuleringer for rektal administrering kan frembringes som en stikkpille med en egnet base omfattende for eksempel kakaosmør eller et salicylat.

Formuleringer egnet for vaginal administrering kan frembringes som pessar, tamponger, kremer, geler, pastaer, skum eller sprayformuleringer inneholdende i tillegg til den aktive ingrediensen slike bærere som er kjent innen faget å være egnet.

For intramuskulær, intraperitoneal, subkutan og intravenøs anvendelse vil forbindelsene ifølge oppfinnelsen generelt være frembrakt i sterile vandige løsninger eller suspensjoner, bufret til en egnet pH og isotonisitet.

Egnede vandige bærere inkluderer Ringer' s solution og isotont natriumklorid. Vandige suspensjoner i henhold til oppfinnelsen kan inkludere suspenderende midler slik som cellulosederivater, natriumalginat, polyvinylpyrrolidon og tragakantgummi, og et vætende middel slik som lecitin. Egnede preserveirngsmidler for vandige suspensjoner inkluderer etyl og n-propyl p-hydroksybenzoat.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også presenteres som liposomformuleringer.

For oral administrering kan kastanosperminesteren formuleres som faste eller flytende prepareringer slik som kapsler, piller, tabletter, trocher, lozenger, smeltepiller, pulvere, granuler, løsninger, suspensjoner, dispersjoner eller emulsjoner (hvor løsninger, suspensjoner, dispersjoner eller emulsjoner kan være vandige eller ikke vandige). Den faste enhetsdoseirngsformen kan være en kapsel som kan være av vanlig hard eller myk skallet gelatin type inneholdende for eksempel surfaktanter, smøremidler og inerte fyllere slik som laktose, sukkrose, kalsiumfosfat og maisstivelse.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes i tabletter med vanlige tablettbaser slik som laktose, sukkrose og maisstivelse i kombinasjon med bindere slik som akasia, maisstivelse eller gelatin, disintegrerende midler intendert til å assistere opprydningen og løsningen av tabletten etter administrering slik som potetstivelse, algininsyre, maisstivelse og guargummi, smøremidler ment å forbedre flyten av tablettgraunleringer og for å forhindre adhesjon av tabelttmateriale til overflatene til tabelttstanseringene og stansene, for eksempel talk, stearinsyre eller magnesium, kalsium eller sinkstearat, fargestoffer, fargemidler og smaksmidler ment å øke de estetiske kvalitetene til tablettene og gjøre dem mer akseptable for pasienten.

Egnede eksipienter for anvendelse i orale flytende doseringsformer inkluderer tynnere slik som vann og alkoholer, for eksempel etanol, benzylalkohol og polyetylenalkoholene, enten med eller uten tillegg av en farmasøytisk akseptabel surfaktant, suspensjonsmiddel eller emulsjonsmiddel.

Kastanosperminesterderivatene ifølge oppfinnelsen kan også administreres parenteralt, dvs. subkutant, intravenøst, intramuskulært eller interpeirtonealt.

I slike utførelsesformer frembringes medikamentet som en injiserbar dose av forbindelsen i en fysiologisk akseptabel fortynner med en farmasøytisk bærer som kan være en steril væske eller en blanding av væsker. Egnede væsker inkluderer vann, saltløsning, vandig dekstrose og relaterte sukkerløsninger, en alkohol (slik som etanol, isopropanol eller heksadecylalkohol), glykoler (slik som propylenglykol eller polyetylenglykol), glyserolketaler (slik som 2,2-dimetyl-l,3-dioksolan-4-metanol), estere (slik som polyetylenglyko1)400), en olje, en fettsyre, en fettsyreester eller glyserid, eller et acetylert fettsyreglyserid med eller uten tillegg av en farmasøytisk akseptabel surfaktant (slik som en såpe eller en detergent), suspensjonsmiddel (slik som pektin, karomers, metylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose eller karboksymetylcellulose), eller emulsjonsmidler og andre farmasøytiske adjuvanser. Illustrasjoner på oljer som kan anvendes ved parenterale formuleringer ifølge oppfinnelsen er av petroleum, animal, vegetal eller syntetisk opprinnelse, for eksempel peanøttolje, soyaolje, sesamolje, bomullsfrøolje, maisolje, olivenolje, petrolatum og mineraloljer.

Egnede fettsyrer inkluderer oleinsyre, stearinsyre og isostearinsyre. Egnede fettsyreestere er for eksempel etyloleat og isopropylmyristat.

Egnede såper inkluderer fettalkalimetaller, ammonium og trietanolaminsalter og egnede detergenter inkludert kationiske detergenter for eksempel

dimetyldialkylammoniumhlaider, alkylpyridiniumhalider og alkylaminacetater; anioniske detergenter for eksempel alkyl, aryl og olefinsulfonater, alkyl, olefln, eter og monoglyseirdsulfater og sulfosuksinater; ikke-ioniske detergenter for eksempel fettaminoksider, fettsyrealkanolamider og polyoksyetylenpolypropylenkopolymerer; og

amfotere detergenter for eksempel alkyl-P-aminopropionater og 2-alkylimidazolin kvartemære ammoniumsalter, så vel som blandinger.

De parenterale sammensetningene kan inneholde typisk fra omkring 0,5 til omkrint 25% av vekt av kastanosperminesterderivatet med formel 1 i løsning. Preservasjonsmidler og buffere kan også bli anvendt med fordel. For å minimalisere eller eliminere irritasjon ved initieringsstedet kan slike sammensetninger inneholde en ikke-ionisk surfaktant med en hydrofil-lipofil balanse (HLB) fra omkring 12 til omkring 17. Mengden av surfaktant i slike formuleringer er i området fra omkring 5 til omkring 15% av vekt. Surfaktanten kan være en enkelt komponent med ovenstående HLB eller kan være en blanding av to ytterligere komponenter med den ønskede HLB. Illustrasjoner på surfaktanter anvendt i parenterale formuleringer er klassen polyetylensorbitan fettsyreestere, for eksempel sorbitanmonooleat og de høymolekylære vektadduktene til etylenoksid med en hydrofobisk base dannet ved kondensering av propylenoksid med propylenglykol.

Kastanosperminesterderivater kan også administreres topikalt, og når så gjøres, kan bæreren med fordel omfatte en løsning, salve eller gelbase. Basen kan, for eksempel omfatte en eller flere av de følgende: petrolatum, lanolin, polyetylenglykoler, bivoks, mineralolje, fortynnere slik som vann og alkohol og emulsjonsmidler og stabilisatorer. Topikale formuleringer kan inneholde en konsentrasjon av kastanosperminesteret eller dets farmasøytiske salt fra omkring 0,1 til omkring 10% vekt per enhet volum.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet med referanse til de følgende eksempelvise utførelsesformer som bare er illustrative og ikke ment å være begrensende på noen måte. Det vil bli anerkjent at modifikasjoner i detaljer kan gjøres som likevel faller innenfor oppfinnelsens rekkevidde.

Eksempler

Celler, vira og inhibitorer

MDBK-celler (NBL-1) (ATCC CCL22) oppnådd fra bovine nyre og cytopatisk (cp) BVDV (samme NADL) (ATCC VR-534) var tilgjengelig fra American Type Culture Collection (ATCC).

MDBK-celler ble dyrket i Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (Sigma, poole, Dorset) supplementert med 10% FCS, 2 mM L-glutamin, 50 U/ml penicillin og 50 Hg/ml streptomycin.

6-0-butanoylkastanospermin (Bucast; Celgosivir; VIR-222; MDL 28, 574A) ble syntetisert som tidligere beskrevet (Liu, P.S., Hoekstra, W.J. og King, C.H.R. (1990), Synthesis of potent anti-HIV agents: esters of castanospermine. Tetrahedron Lett. 31: 1535-1549) og levert av Aventis (tidligere kjent som Marin Merrell Dow). Kastanospermin (IS, 6S, 7R, 8R, 8aR-l, 6, 7, 8 tetrahydroksyindolizin) isolert fra Moreton Bay kastanjetreet, Castanospermum australe, som tidligere beskrevet (Liu, P.S. og Rhinehart, B.L. (1986), "Isolation of castanospermin and it suse as an anti-diabetic agent". Eur. Patent EP 0202661) og ble levert av Aventis. N-butyldeoksynojirimycin (N-butyl-DNJ) og N-nonyldeoksynojirimycin (NN-DNJ) ble kjøpt fra Toronto Research Chemicals, Canada, Bucast, kastanospermin og N-butyl-DNJ ble laget som 100 mM stock-oppløsninger i vann. NN-DNJ ble lagt som 100 mM stock-løsninger i DMSO. Stock-løsninger ble lagret ved -20°C.

Plakkreduksjonsassay

MDBK-celler ble lagt i 6-brønns cellekulturplater (Nuncion™, Nunc, Danmark) og dyrket til konfulens. Cellene vaskes to ganger i varm fosfatbuffret saltløsning (PBS) og infiseres så med BVDV NADL (150 pfu/brønn) i 0,25 ml PBS inneholdende 1% hesteserum og 1 mM MgCh. Cellekulturplatene ble så innkubert ved 37°C i 1 time ved 5% CO2 og platene ble vugget hvert 15-20 minutt. Virusinokkulumet ble så fjernet og erstattet med 3 ml 0,5% low-gelling temperaturagarose overlegg fortynnet i DMEM supplementert med 5% hesteserum, 2 mM L-glutamin, 50 U/ml penicillin og 50 ug/ml streptomycin og inneholdende forskjellige konsentrasjoner av testforbindelse eller ingen testforbindelse. Minst duplikat eller triplikatbrønner ble anvendt for hver konsentrasjon av testforbindelsen. Agarosen stivnet ved romtemperatur i 15 minutter og ble så innkubert ved 37°C ved 5% CO2. Etter 3 dagers innkubering ble cellene fiksert ved å tilsette 1,5 ml av en 10% formaldehydløsning over agaroverlaget og fikk stå over natt. Agaren ble forsiktig fjernet fra brønnene og cellene farget med 0,3% metylen-blått i PBS i 10 minutter ved romtemperatur. Overflødig farging ble fjernet og cellene ble vasket med PBS før tørking av platene, og telling av virale plakk mikroskopisk. Doseresponslinjer ble plottet ut ifra gjennomsnittlig antall plakk tilstede versus logg av konsentrasjon til forbindelsen. 50% inhibitorisk konsentrasjon (IC50) ble utregnet etter lineær regresjonsanalyse.

XTT cytopasisitetsassay

MDBK-celler ble lagt i 96-brønns cellekulturplater (Costar® 3596, Corning Incorp., USA) og dyrket til konfluens. Cellene ble vasket 2 ganger i varm fosfatbufret saltløsning (PBS) og så infisert med BVDV NADL (100 pfu/brønn) i 100 ul DMEM supplementert med 5% hesteserum, 2 mM L-glutamin, 50 U/ml penicillin og 50 ug/ml streptomycin. Noen brønner ble narreinfisert for å fungere som kontroller. Videre ble 100 ul DMEM supplementert som ovenfor, men inneholdende forskjellige konsentrasjoner av testforbindelse eller ingen testforbindelse lagt til hver brønn.Triplikatbrønner ble anvendt for hver konsentrasjon av forbindelsen. I parallell ble uinfiserte celler behandlet med forbindelse for å vurdere cytotoksisitet. Platene ble så innkubert ved 37°C i 5% C02. Etter 6 dager ble 25 ul 1 mg/ml 2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl]-2H-tetrazolium-5-karboksanilid (XTT) / 25 uM fenazinmetosulfat (PMS) løsning (XTT og PMS kjøpt fra Sigma, Poole, Dorset, UK) lagt til hver brønn og platene innkubert i 2 timer ved 37°C med 5% C02. Absorbansen ble så bestemt ved 450 nm. Data ble plottet som O.D. versus logg av konsentrasjon til forbindelsen og 50% inhibitorisk konsentrasjon (IC50) ble utregnet.

Antiviral aktivitet

Ut ifra et plakkreduksjonsassay i MDBK-celler inhiberte både kastanospermin og Bucast dannelsen av BVDV-plakk på doseavhengig måte (se Figur 1). Bukast var omtrent 13 ganger mer potent enn kastanospermin, som notert tidligere med hensyn til aktivitet mot HIV. Gjennomsnittlig IC50 for Bucast var 16,25 uM + 7,5 uM sammenlignet med en gjennomsnittlig IC50 på 216,6 um + 55,0 uM for kastanospermin (Tabell 2).

Det var ingen tegn på cytotoksisitet ved konsentrasjoner opp til 1000 uM bedømt ut ifra mikroskopisk eksaminering av celle monolagene. I parallelle

plakkreduksjonseksperimenter viste a-glukosidase I inhibitorene N-butyl-DNJ og N-nonyl-DNJ bare delvis inhibering ved konsentrasjonene >100 uM og >300 uM,

henholdsvis. N-nonyl-DNJ var klart cytotoksisk for cellene ved konsentrasjoner på 300 uM.

Lignende resultater ble oppnådd når et XTT cytopatisitetsassay ble anvendt for å bestemme anti-BVDV virkning og cytotoksisitet av a-glukosidase I inhibitorene i

parellell. Som vist i Figur 2 beskyttet både Bucast og kastanospermin MDBK-celler mot virusindusert celledød uten å vise noen cytotoksisitet i uinfiserte behandlede celler. I de samme eksperimentene viste verken N-butylæ-DNJ eller N-nonyl-DNJ noen beskyttelse mot den cytopatiske effekten til BVDV. Mens N-butyl-DNJ viste ingen cytotoksisitet, som observert tidligere i plakkreduksjonseksperimenter, var N-nonyl-DNJ klart cytotoksisk for MDBK-celler. Den kalkulerte 50% cytotoksiske konsentrasjoner til N-nonyl-DNJ var 120 uM. Ved å bruke en infeksjons multiplisitet (MOI) på omkring 0,01, så var gjennomsnittlig IC50-verdier for Bucast og kastanospermin i dette cytopatisitetsassayet 36 uM + 22 uM og 400 uM, henholdsvis (Tabell 3).

I et eksperiment viste N-nonyl-DNJ noe antiviral aktivitet, men selektivitetsindeksen var bare dobbel.

Undersøkelse av virkningen av virus MOI på den anti-BVDV aktiviteten til Bucast antydet at det var mer potent når lavere forhold av infeksiøst virus xelleantall ble anvendt (se Figur 3 og Tabell 4).

En viss antiviral virkning kunne oppnås med N-butyl-DNJ når en meget lav MOI ble anvendt, men denne inhibitor var 10 ganger mindre potent enn Bucast.

XTT cytopatisitetsassayet ble anvendt for å bedømme evnen til humant leukocytt interferon (interferon a) til å inhibere den cytopatiske effekt av BVDV på MDBK-celler og en IC50-verdi på 1,3 interferon resistensenheter (IRU) per brønn ble vist. Videre eksperimenter viser at ICso-verdiene på interferon a ble redusert i nærvær av Bucast og interferon a i kombinasjon. Også IC50-verdiene for Bucast ble redusert ved å anvende denne kombinasjonen. Kombinasjonsindeksene (CI) ble kalkulert ved å bruke formelen til Suhnel (Antiviral Research, 13,23-40). En CI-verdi på mindre enn 1 indikerer en synergistisk interaksjon og verdier på mindre enn 0,8 er antatt å indikere et statistisk signifikant resultat. Kombinasjonen av interferon a og Bucast produserte CI-verdier i området fra 0,28 til 0,46. Disse resultatene antyder derfor en synergistisk effekt når Bucast anvendes i nærvær av interferon a.

Disse data oppsummeres i Tabell 5.

Ekvivalens

Den foregående beskrivelsen beskriver nåværende foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelsen. Flere modifikasjoner og variasjoner i praktisering av oppfinnelsen forventes å være åpenbar for en fagmann innen feltet ved bedømmelse av disse beskrivelsene. Disse modifikasjonene og variasjonene er intendert å være omfattet av kravene vedlagt heri.

Claims (23)

1. Anvendelse av en castanosperminester for fremstilling av et medikament for behandling av hepacivirus infeksjon som omfatter en castanosperminester ifølge formelen: hvor R, Ri og R2 er uavhengig hydrogen, C1-14 alkanoyl, C2-14 alkenoyl, cykloheksankarbonyl, Ci-g alkoksyacetyl, naftalenkarbonyl, eventuelt substituert med metyl eller halogen; fenyl(C2-6 alkanoyl) hvor fenylet valgfritt substitueres med metyl eller halogen; cinnamoyl; pyridinkarbonyl valgfritt substituert med metyl eller halogen; dihydropyridinkarbonyl valgfritt substituert med Ci.10 alkyl; tiofenkarbonyl fritt substituert med metyl eller halogen; eller furankarbonyl valgfritt substituert med metyl eller halogen; Y er hydrogen, Ci.4 alkyl, Cm alkoksy, halogen, trifluormetyl, Cm alkylsulfonyl, Cm alkylmerkapto, cyano eller dimetylamino; Y' er hydrogen, Cm alkyl, Cm alkoksy, halogen eller kombineres med Y for å gi 3,4-metylendioksy; Y" er hydrogen, Cm alkyl, Cm alkoksy eller halogen; med R, Ri og R2 valgt på en slik måte at minst en av dem, men ikke mer enn to av dem, er hydrogen; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller derivat derav.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor R, R\ og R2 er hver uavhengig hydrogen, Cmo alkanoyl, C2-10 alkenoyl, Cj-g alkoksyacetyl eller hvor Y er hydrogen, Cm alkyl, CMalkoksy, halogen, trifluormetyl, Cm alkylsulfonyl, Cm alkylmerkapto, cyano eller dimetylamino; Y' er hydrogen, Cm alkyl, Cm alkoksy, halogen eller kombineres med Y for å gi 3,4-metylendioksy; Y" er hydrogen, Cm alkoksy eller halogen; med R, Ri og R2 valgt på en slik måte at minst en av dem, men ikke flere enn to av dem, er hydrogen.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvor R, Ri og R2 er hver uavhengig hydrogen, Ci.8 alkanoyl, C2-8 alkenoyl, Ci-g alkoksyacetyl eller et benzoyl valgfritt substituert med et alkyl eller halogen; med R, Ri og R2 valgt på en slik måte at en av dem, men ikke mer en to av dem, er hydrogen.

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvor R, Rjog R2 er hver uavhengig hydrogen, d-8 alkanoyl, C2-8 alkenoyl, C2-8 alkoksyacetyl eller et benzoyl valgfritt substituert med en metyl-, brom-, klor- eller fluorgruppe; med R, Ri, R2 valgt på en slik måte at minst en av dem, men ikke mer enn to av dem, er hydrogen.

5. Anvendelse ifølge krav 1, hvor Ri er et Ci-g alkanoyl, C2-10 alkenoyl, Ci-g alkoksyacetyl eller et benzoyl valgfritt substituert med et alkyl eller halogengruppe.

6. Anvendelse ifølge krav 1, hvor Ri er et d-8 alkanoyl, C2-8 alkenyol, d-s alkoksyacetyl eller et benzoyl valgfritt substituert med en metyl-, brom-, klor- eller fluorgruppe.

7. Anvendelse ifølge krav 1, hvor castanosperminesteren velges fra: (a) [lS-(la,6(3,7a,8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol 6-benzoat; (b) [lS-(la,6p,7a,8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol 7-benzoat; (c) [lS-(la,6p,7a,8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol6-(4-metylbenzoat); (d) [ 1 S-(l a,6p,7a,8p,8aP)]-oktahydro-1,6,7,8-indolizintretol 7-(4-brombenzoat); (e) [1 S-(la,6p,7a,8p,8aP)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol 6,8-dibutanoat; (f) [1 S-(la,6p,7a,8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol 6-butanoat; (g) [lS-(la,6p,7a,8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol 6-(2-furankarbonxylat); (h) [lS-(la,6p,7a,8p,8aP)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol 7-(2,4-diklorbenzoat); (i) [lS-(la,6p,7a,8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol6-(3-heksenoat); (j) [lS-(la,6p,7a,8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol6-oktanoat; (k) [lS-(la,6p,7a,8p,8ap)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizintretol 6-pentanoat; (1) en O-pivaolylester; (m)en 2-etylbutyrylester; (n) en 3,3-dimetylbutyrylester; (0) en cyklopropanoylester; (p) en 4-metoksybenzoatester; (q) en 2-aminobenzoyatester; og (r) en blanding av en eller alle av (a)-(q).

8. Anvendelse ifølge krav 1, hvor castanosperminesteren er [lS-(la,6p,7a, 8p,8aP)]-oktahydro-1,6,7,8-indolizinetetrol 6-benzoat.

9. Anvendelse ifølge krav 1, hvor castanosperminesteren er [lS-(la,6p,7oc, 8p,8aP)]-oktahydro-1,6,7,8-indolizinetetrol 6-butanoat.

10. Anvendelse ifølge krav 1, hvor castanosperminesteren er [lS-(la,6p,7a, 8p,8aP)]-oktahydro-1,6,7,8-indolizinetetrol 6-pentanoat.

11. Anvendelse ifølge krav 1, hvor castanosperminesteren er [lS-(lct,6p,7a, 8p,8aP)]-oktahydro-1,6,7,8-indolizinetetrol 6-(2-furankarboksylat).

12. Anvendelse ifølge ett av kravene 1-11, hvor medikamentet videre omfatter en farmasøytisk akseptabel eksipient.

13. Anvendelse ifølge krav 1-12, hvor hepaciviruset er hepatitt C virus (HCV).

14. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en castanosperminester definert i et hvilket som helst av kravene 1-11 i kombinasjon med interferon-a (IFN-a).

15. Sammensetning ifølge krav 14, karakterisert ved at castanosperminesteren er [lS-(lot,6P,7a, 8p,8aP)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizinetetrol 6-butanoat.

16. Sammensetning ifølge hvilket som helst av kravene 14 - 15 karakterisert ved at den videre omfatter en farmasøytisk akseptabel eksipient.

17. Anvendelse av en sammensetning ifølge hvilket som helst av kravene 14 -16, for fremstilling av et medikament for behandling av en hepacivirus infeksjon.

18. Anvendelse ifølge krav 17, hvori hepaciviruset er HCV.

19. Farmasøytisk kit av deler, karakterisert ved at det omfatter en castanosperminester som definert ifølge hvilket som helst av kravene 1-11 i kombinasjon med interferon-a.

20. Kit ifølge krav 19, karakterisert ved at castanosperminesteren og/eller interferon-a er i en enhetsdoseform.

21. Kit ifølge krav 19 eller 20, karakterisert ved at det videre omfatter instruksjoner for anvendelse ved behandling av en hepacivirus infeksjon.

22. Kit ifølge krav 21, karakterisert ved at hepacivirus infeksjonen er en HCV infeksjon.

23. Kit ifølge et hvilket som helst av kravene 19-22, karakterisert ved at castanosperminesteren er [1S-(lct,6p,7a, 8p,8aP)]-oktahydro-l,6,7,8-indolizinetetrol 6-butanoat.