NO324776B1 - Okso-2H-pyridin-, okso-2H-kinolin- og okso-1H-isokinolinderivater, deres fremstilling, farmasoytiske sammensetninger inneholdende dem og deres anvendelse - Google Patents

Description

Oppfinnelsens felt

Denne oppfinnelse er innenfor feltet for medisinsk kjemi og vedrører okso-2H-pyridin-, okso-2H-kinolin- og okso-lH-isokinolinderivater som angitt i krav 1 og farmasøytiske sammensetninger derav, som hemmer caspaser som medierer celleapoptose og inflammasjon. Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av forbindelsene for fremstilling av et medikament for å behandle eller forebygge sykdommer hvor caspaseaktivitet er implisert. Videre vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte ved fremstilling av forbindelsene.

Oppfinnelsens bakgrunn

Apoptose, eller programmert celledød, er en prinsipiell mekanisme ved hvilken organismer eliminerer uønskede celler. Dereguleringen av apoptose, enten usedvanlig stor apoptose eller den manglende evne til å gjennomgå den, har blitt implisert i flere sykdommer slik som cancer, akutte inflammatoriske og autoimmune forstyrrelser, iskemiske sykdommer og visse nevrodegenerative forstyrrelser (se generelt Science, 1998, 281, 1283-1312; Ellis et al., Ann. Rev. Cell. Biol., 1991, 7, 663).

Caspaser er en familie av cystein-protease-enzymer som er nøkkelmediatorer i signalveiene for apoptose og celledisassemblering (Thornberry, Chem. Biol., 1998, 5, R97-R103). Disse signalveier varierer avhengig av celletype og stimulus, men alle apoptoseveier synes å konvergere ved en felles effektorvei som fører til proteolyse av nøkkelproteiner. Caspaser er involvert i både effektorfasen av signalveien og vider oppstrøm ved dens initiering. Oppstrøms caspaser involvert i initieringshendelser blir aktivert og aktiverer i sin tur andre caspaser som er involvert i de senere faser av apoptose.

Caspase-1, den første identifiserte caspase, er også kjent som interlevkinkonverterende enzym eller "ICE." Caspase-1 konverterer forløper interlevkin-ip ("pIL-iP") til den pro-inflammatoriske aktive form ved spesifikk spalting av pIL-ip mellom Asp-116 og Ala-117. Foruten caspase-1 er det også elleve andre kjente humane caspaser, hvorav alle spaltes spesielt ved aspartylresiduer. De er også observert å ha strenge krav til minst fire aminosyreresiduer på den N-terminale side av spaltingsstedet.

Caspasene har blitt klassifisert i tre grupper avhengig av aminosyresekvensen som er foretrukket eller primært kjent igjen. Gruppen av caspaser, som inkluderer caspaser 1, 4, 5 og 13, har blitt vist å foretrekke hydrofobe aromatiske aminosyrer i posisjon 4 på den N-terminale side av spaltingsstedet. En annen gruppe som inkluderer caspaser 2, 3 og 7, kjenne igjen aspartylresiduer i både posisjon 1 og 4 på den N-terminale side av spaltingsstedet, og fortrinnsvis en sekvens av Asp-Glu-X-Asp. En tredje gruppe, som inkluderer caspaser 6, 8, 9 og 10, tolererer mange aminosyrer i den primære gjenkjennelsessekvens, men synes å foretrekke residuer med forgrenede, alifatiske sidekjeder slik som valin og leucin i posisjon 4.

Caspasene har også blitt gruppert i henhold til deres oppfattede funksjon. Den første subfamilie består av caspaser-1 (ICE), 4, 5 og 13. Disse caspaser har blitt vist å være involvert i proinflammatorisk cytokinprosessering og spiller derfor en viktig rolle i inflammasjon. Caspase-1, det mest studerte enzym i denne klasse, aktiverer IL-ip-forløperen ved proteolytisk spalting. Dette enzym spiller derfor en nøkkelrolle i den inflammatoriske respons. Caspase-1 er også involvert i prosesseringen av interferon-y-induserende faktor (IGIF) som stimulerer produksjonen av interferon-gamma, en nøkkelimmunoregulator som modulerer antigen-presentasjon, T-celleaktivering og celleadhesjon.

Resten av caspasene utgjør den andre og tredje subfamilie. Disse enzymer er av sentral viktighet i de intracellulære signalveier som fører til apoptose. En subfamilie består av enzymene involvert i initiering av hendelser i den apoptotiske vei, inklusive transduksjon av signaler fra plasma-membranen. Medlemmer av denne subfamilie inkluderer caspaser-2, 8, 9 og 10. Den andre subfamilie, bestående av effektorcapsasene 3, 6 og 7, er involvert i de siste nedstrøms spaltingshendelser som resulterer i den systematiske nedbrytning og død av cellen ved apoptose. Caspaser involvert i oppstrøms signaltransduksjonen aktiverer nedstrøms-caspasene, som deretter ødelegge DNA-reparasjonsmekanismer, fragment DNA, tar fra hverandre celle cytoskjelettet og til sist fragmenterer cellen.

Kunnskap om fire-aminosyresekvensen primært kjent igjen av caspasene har blitt anvendt for å designe

caspaseinhibitorer. Reversible tetrapeptidinhibitorer har blitt fremstilt som har strukturen CH3CO-[P4]-[P3]-[P2]-CH(R)CH2C02H hvor P2 til P4 representerer en optimal aminosyre-gjenkjennelses-sekvens og R er et aldehyd, nitril eller keton i stand til å binde til caspase-cystein-sulfhydrylen. Rano og Thornberry, Chem. Biol. 4, 149-155

(1997); Mjalli, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 3, 2689-2692 (1993); Nicholson et al., Nature 376, 37-43 (1995). Irreversible inhibitorer basert på den analoge tetrapeptid gjenkjennelsessekvens har blitt fremstilt hvor R er et acyloksymetylketon -COCH2OCOR' . R' er eksemplifisert ved en eventuelt substituert fenyl slik som 2,6-diklorbenzoyloksy og hvor R er COCH2X hvor X er en utgående gruppe slik som F eller Cl. Thornberry et al., Biochemistry 33, 3934 (1994); Dolle et al., J Med. Chem. 37, 563-564 (1994).

Anvendbarheten til caspaseinhibitorer for å behandle en variasjon av pattedyrs sykdomstilstander assosiert med en økning i cellulær apoptose har blitt demonstrert ved å anvende peptidiske caspaseinhibitorer. For eksempel har caspaseinhibitorer i gnagermodeller blitt vist å redusere infarktstørrelse og hemme kardiomyocyttapoptose etter myokardinfarkt, redusere lesjonsvolum og nevrologisk mangel resulterende fra slag, redusere post-traumatisk apoptose og nevrologisk mangel i traumatisk hjerneskade, være effektiv i behandling av fulminant leverdestruksjon, og til forbedret overlevelse etter endotoksisk sjokk. Yaoita et al., Circulation, 97, 276 (1998); Endres et al., J Cerebral Blood Flow and Metabolism, 18, 238, (1998); Cheng et al., J. Clin. Invest., 101, 1992 (1998); Yakovlev et al., J Neuroscience, 17, 7415 (1997); Rodriquez et al., J. Exp. Med., 184, 2067 (1996); Grobmyer et al., Mol. Med., 5, 585

(1999).

Generelt er de peptidiske inhibitorer beskrevet over svært potente mot noen av caspaseenzymene. Imidlertid har ikke denne potens alltid blitt reflektert i cellulære apoptosemodeller. I tillegg er peptidinhibitorer typisk karakterisert ved uønskede farmakologiske egenskaper slik som dårlig oral absorpsjon, dårlig stabilitet og rask metabolisme. Plattner og Norbeck, i Drug Discovery Technologies, Clark og Moos, Eds. (Ellis Horwood, Chichester, England, 1990).

Ved å erkjenne behovet for å forbedre de farmakologiske egenskaper til de peptidiske caspaseinhibitorer, har peptidomimetiske inhibitorer blitt rapportert. Blant disse har inhibitorer hvor P3-aminosyren har blitt erstattet med derivater av 3-aminopyridin-2-oner og 5-aminopyrimidin-4-oner fått mye oppmerksomhet (US-patent 5,756,466 (Bemis et al.); Dolle et al. J. Med. Chem. 39, 2438, (1996); Golec et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 7, 2181, (1997); Semple et al, Biorg. Med. Chem. Lett. 7, 1337, (1997)) og ført til forbindelser med generell struktur:

hvor R<1> er hydrogen eller forskjellige grupper, R<2> er hydrogen, metyl eller etyl, R3 er alkyl, fenyl eller fenalkyl og R<4> er forskjellige grupper.

På grunn av de iboende problemer med de peptidiske inhibitorer, fortsetter det å være et behov for små-molekyl, ikke-peptid caspaseinhibitorer som er potente, stabile og penetrerer membraner for å gi effektiv hemming av apoptose in vivo. Slike forbindelser vile være ekstremt nyttige i behandlingen av de ovennevnte sykdommer hvor caspaseenzymer spiller en rolle.

Oppsummering av oppfinnelsen

Det har nå blitt funnet at forbindelser av denne oppfinnelse og farmasøytiske sammensetninger derav er effektive som inhibitorer av caspaser og cellulær apoptose. Disse forbindelser har den generelle formel IA som er angitt i det videre.

Forbindelsene av denne oppfinnelse har potente hemningsegenskaper over en rekke caspasemål med god virkning i cellulære apoptosemodeller. I tillegg er disse forbindelser forventet å ha forbedret cellepenetrasjon og farmakokinetiske egenskaper og, som en følge av deres potens, ha forbedret virkning mot sykdommer hvor caspaser er implisert.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Denne oppfinnelse tilveiebringer nye forbindelser og farmasøytisk akseptable derivater derav, som er nyttige som caspaseinhibitorer. Disse forbindelser har den generelle formel IA:

hvor R<1> er R eller -CH2Y;

R er Ci-6-alkyl eller fenyl eventuelt substituert med halogen;

Y er halogen eller -OC=0(R);

R2 er C02H;

R3 er hydrogen eller et C1-6 rettkjedet eller forgrenet alkyl;

hver av R4-R6 er uavhengig valgt fra hydrogen eller R; eller R4 og R<5> eller R<6> eller R<7> sammen med karbonatomene til hvilke de er bundet danner en fenylring og R7 er valgt fra hydrogen eller fenyl.

Begrepet "halogen" betyr F, Cl, Br eller I.

Forbindelser av denne oppfinnelse hvor R<2> er COOH og y = 1 er gamma- -ketosyrer som kan eksistere i løsning, enten som den åpne form 1 eller den cykliserte hemiketalform 2. Fremstillingen heri av enten den ene eller den andre isomere form er ment å inkludere den andre. I figuren er Xi nitrogen, X2 og X3 er karbon og ringen har to dobbeltbindinger og tilsvarer ringen i forbindelse IA

Likeledes vil de være åpenbart for fagmannen at visse forbindelser av denne oppfinnelse kan eksistere i tautomere former eller hydratiserte former, alle slike former av forbindelsene er innenfor rammen av oppfinnelsen. Med mindre annet er angitt, er strukturer avbildet heri også ment å inkludere alle stereokjemiske former av strukturen; dvs. R- og S-konfigurasjonene for hvert asymmetriske senter. Derfor er enkelte stereokjemiske isomerer samt enantiomere og diastereomere blandinger av de foreliggende forbindelser innenfor rammen av oppfinnelsen. Med mindre annet er angitt er strukturer avbildet heri også ment å inkludere forbindelser som er forskjellige bare i forekomsten av ett eller flere isotopisk anrikede atomer. For eksempel er forbindelser som har de foreliggende strukturer unntatt utskiftingen av et hydrogen med et deuterium eller tritium, eller utskiftingen av et karbon med et <13>C- eller <14>C-anriket karbon innenfor rammen av denne oppfinnelse.

Foretrukne forbindelser med formel IA er de forbindelser hvor R<1> er CH2F, R<2> er C02H, R3 er H eller metyl, R<4->R<6> er uavhengig valgt fra hydrogen, R, fenyl eller halogen = substituert fenyl, og R<7> er hydrogen eller fenyl. Eksempler på IA-forbindelser er vist i tabell 1.

En annen utførelse av denne oppfinnelse vedrører forbindelser med formel IB hvor R4 og R<5> sammen med karbonatomene til hvilke de er bundet danner en fenylring. Eksempler på lB-forbindelser er vist i tabell 2.

En annen utførelse av denne oppfinnelse vedrører forbindelser med formel IC hvor X2 er karbon, bindingen mellom X2 og det nærliggende CR4 er en dobbeltbinding, og R<6 >og R7 danner sammen med karbonatomene til hvilke de er bundet en fenylring. Eksempler på IC-forbindelser er vist i tabell 3.

Forbindelsene av denne oppfinnelse kan generelt fremstilles ved fremgangsmåter kjent for fagmannen for analoge forbindelser, som illustrert ved de generelle skjemaer under og ved de preparative eksempler som følger.

Reagenser: (a) NaH/THF; (b) NaOH/THF/H20; (c) EDC/DMAP/HOBt; (d) Dess-Martin perjodinan; (e) TFA/DCM

I skjema I over tilsvarer ringen inneholdene Xi, X2 og X3 ringen i formel IA, dvs. Xi er nitrogen og X2 og X3 er karbon og ringen har to dobbeltbindinger.

I skjema I over er de følgende forkortelser anvendt: EDC er 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid; HOBT er 1-hydroksybenzotriazol; TFA er trifluoreddiksyre; DCM er diklormetan; og DMAP er 4-dimetylaminopyridin. Startheterocykelen 1 er enten kommersielt tilgjengelig eller fremstilles ved fremgangsmåter analoge med dem beskrevet av Fuss og Koch, Synthesis (1990), 681-685, med mindre annet er angitt. Startheterocykelen 1 behandles først med natriumhydrid, deretter med en ester 2 (LG er en utgående gruppe slik som brom eller O-triflat). Den resulterende ester 3 (f.eks. Y<1> = alkyl) hydrolyseres først ved å anvende base eller, når Y<1> er en t-butylgruppe, ved å anvende trifluoreddiksyre. Syren 3 (Y<1> = H) kobles deretter med aminoalkoholen 4. Avhengig av naturen til R<1> og R<2> kan et aminoketon anvendes, istedenfor aminoalkoholen, som unngår det etterfølgende oksidasjonstrinn. I tilfellet av fluormetylketoner hvor R<1> er CH2F, kan aminoalkoholen 4 erholdes i henhold til metoden til Revesz et al., Tetrahedron Lett., 1994, 35, 9693. Til sist oksideres hydroksylen i forbindelse 5 og forbindelsen behandles passende i henhold til naturen til R<2>. For eksempel, hvis produktet I krever at R2 er en karboksylsyre, så er R<2> i 4 fortrinnsvis en ester og sluttrinnet i skjemaet er hydrolyse.

Følgelig vedrører ett aspekt av denne oppfinnelse en generell fremgangsmåte ved fremstilling av forbindelser med formel I-A omfattende trinnene:

(a) å tilveiebringe en syre eller et syrederivat med formel 11-A,

II-A

(b) å koble II-A med en aminoalkohol eller et aminoketon med formel 4 for å gi et intermediat med formel III-A,

og

(c) å konvertere intermediat III-A til forbindelse I-A, hvori Y<1> er hydrogen eller Ci-6-alkyl;

Z er =0 eller OH;

R<1> er R eller -CH2Y;

R er en Ci-6-alkyl eller fenyl eventuelt substituert med halogen;

Y er halogen eller -0C=0(R);

R2 er C02H;

R3 er hydrogen eller et C1-6 rettkjedet eller forgrenet alkyl;

hver av R4-R6 er uavhengig valgt fra hydrogen eller R, eller R<4> og R5 eller R6 og R<7> sammen med karbonatomene til hvilke de er bundet danner en fenylring og

R7 er valgt fra hydrogen eller fenyl.

Denne fremgangsmåte er spesielt nyttig for å fremstille kirale forbindelser av denne oppfinnelse, hvor karbonet som bærer R<3->substituenten er stereokjemisk anriket. Intermediatsyrer eller syrederivater med formel II-A kan erholdes i kiral form. Trinn (b) kobling av II-A og 4 for å gi III-A kan utføres i henhold til enhver passende fremgangsmåte. Det er forstått at når 4 er et keton (Z = 0), kan det være nødvendig å generere det i nærvær av II-A, for eksempel, ved in situ avbeskyttelse av aminogruppen. I trinn (c) vil omdannelsen av III-A for å gi I-A avhenge av naturen til Z og R<2>. Syntetisk manipulasjon av disse grupper, om nødvendig, kan utføres som beskrevet heri eller i henhold til andre metoder familiære for fagmannen.

Eksempel 1

5- fluor- 4- okso- 3- [ ( S) - 2- ( 2- okso- 2Jf- pyridin- l- yl) - propionylamino]- pentansyre ( 1A- 2)

Trinn A: ( S)- 2-( 2- okso- 2fl- pyrid- l- yl)- propionsyre- etylester

En omrørt løsning av lfZ-Pyridin-2-on (500 mg, 5,2 6 mmol) i vannfri THF (50 ml) ved romtemperatur ble behandlet porsjonsvis med 60% NaH (231 mg, 5,78 mmol). Reaksjonsblandingen ble holdt i 10 min deretter tilsatt over 5 min til en løsning av (R)-2-trifluormetansulfonyloksy)-propionsyre-etylester (1315 mg, 5,2 6 mmol) i vannfri THF (2,5 ml) ved romtemperatur. Den resulterende blanding ble omrørt i 2 timer, deretter konsentrert. Residuet ble løst i etylacetat, og den resulterende løsning ble vasket med iskald, fortynnet HC1. Den organiske fase ble fjernet og den vandige fase re-ekstrahert med etylacetat. De kombinerte organiske ekstrakter ble tørket (MgSCM, filtrert og konsentrert. Residuet ble renset ved flashkromatografi (20% opp til 80% etylacetat i heksan) for å gi tittelforbindelsen som en gul olje (480 mg, 46%): [a] 27D = -56,4° (c=0,275, CH2C12) ; XH NMR (400 MHz CDC13) 5 1,3(3H, t) , 1,65(3H, d) , 4,2(2H, q) , 5,6(1H, q) , 6,2(1H, t) , 6,4(1H, d) , 7,2-7,3(2H, m) .

Trinn B: ( S)- 2-( 2- okso- 2H- pyridin- l- yl)- propionsyre

En omrørt blanding av (S)-2-(2-okso-2if-pyrid-1-yl)-propionsyre-etylester (364 mg, 1,87 mmol), THF (2 ml), vann (1 ml) og natriumhydroksid (90 mg, 2,24 mmol) ble holdt ved romtemperatur i 1 time, deretter konsentrert under redusert trykk. Residuet ble løst i eter og den resulterende løsning vasket med vann. Den organiske fase ble kastet og den vandige fase ble surgjort med konsentrert HC1 deretter ekstrahert flere ganger med etylacetat. De kombinerte organiske ekstrakter ble tørket (MgSCM), filtrert og konsentrert. Residuet ble triturert med eter for å gi tittelforbindelsen som et fargeløst fast stoff (84 mg, 27%): [a]<31>D= -50° (c=0,2, CH3OH) ; <X>H NMR (400 MHz, DMSO) 8 1,5(3H, d), 5,1(1H, q), 6,2(1H, t) , 6,4(1H, d) , 7,4(1H, m) , 7, 6(1H, d) .

Trinn C: 5- fluor- 4- hydroksy- 3-[ ( S)- 2-( 2- okso- 2Jf- pyridin- l-yl)- propionylamino]- pentansyre- tert- butylester

En omrørt blanding av (S) -2- (2-okso-2f/-pyridin-l-yl) -

propionsyre (70 mg, 0,42 mmol), 3-amino-5-fluor-4-hydroksy-pentansyre-tert-butylester (91 mg, 0,44 mmol), HOAt (63 mg, 0,46 mmol) og DMAP (59 mg, 0,48 mmol) og vannfri THF (5 ml) ble avkjølt til 0°C deretter ble EDC (88 mg, 0,46 mmol)

tilsatt. Blandingen ble tillatt å varme til romtemperatur i løpet av 16 timer deretter konsentrert under redusert trykk. Residuet ble renset ved flashkromatografi (3% metanol i etylacetat) for å gi tittelforbindelsen som et hvitt skum (137 mg, 92%): <X>H NMR (400 MHz, CDC13) 5 1,3-1,5(9H, 2xs), 2,5-2,7(2H, m), 3,4-3,7(lH, m), 3,9-4,6(4H, m) , 5,4-5,6(lH, m) , 6,2-6,3(lH, m), 6,5-6,6(1H, m), 7,1-7,6(3H, m) ; 19F NMR (376 MHz, CDC13) 5 -230, 14, -230, 14, - 230,17, -230,95, -231,07.

Trinn D: 5- fluor- 4- okso- 3-[( S)- 2-( 2- okso- 2ff- pyridin- l- yl)-propionylamino]- pentansyre- tert- butylester

En omrørt løsning av 5-fluor-4-hydroksy-3-[(S)-2-(2-okso-2ff-pyridin-l-yl) -propionylamino] -pentansyre-tert-butylester (135 mg, 0,38 mmol) i vannfri DCM (5 ml) ble behandlet med 1,1,1-triacetoksy-1,1-dihydro-l,2-benziodoksol-3(1H) -on (193 mg, 0,4 6 mmol) ved 0°C. Den resulterende blanding ble holdt ved 0°C i 1,5 time, fortynnet med etylacetat, deretter helt i en 1:1 blanding av mettet vandig natriumhydrogenkarbonat og mettet vandig natriumtiosulfat. Den organiske fase ble fjernet og den vandige fase re-ekstrahert med etylacetat. De kombinerte organiske ekstrakter ble tørket (Na2SC>4) og konsentrert. Residuet ble renset ved flashkromatografi (1% metanol i etylacetat) for å gi tittelforbindelsen som en fargeløs gummi (125 mg, 93%): XH NMR (400 MHz, CDC13) 5 1,2-1,4 (9H, 2xs), 2,6-2,9(2H, m) , 4,7-4,9(1H, m) , 4,9-5,3(2H, m) , 5,6-5,7(lH, m) , 6,2-6,3(lH, m), 6,5-6,6(lH, m), 7,2-7,4(lH, m), 7,5-7,6(lH, m) , 8,0-8,2 (1H, m) ; <13>C NMR (100 MHz, CDC13) 5 16, 57, 16, 87, 28,24, 28,29, 36,44, 36,60, 52,50, 52,62, 52,90, 53,09,

82,31, 82,44, 83,51, 83,72, 85,33, 85,55, 107,35, 107,44, 120,45, 120,49, 134,42, 134,67, 140,22, 140,36, 162,85, 162,98, 169,93, 169,99, 170,59, 170,63, 202,58, 202,64, 202,75, 202, 80; 19F NMR (376 MHz, CDC13) 5 -231, 94, -231, 96, -232,48, -232,49.

Trinn E: 5- fluor- 4- okso- 3-[ ( S)- 2-( 2- okso- 2Jf- pyridin- l- yl)-propionylamino]- pentansyre

Trifluoreddiksyre (2 ml) ble tilsatt til en omrørt iskald løsning av 5-fluor-4-okso-3- [ (S)-2- (2-okso-2ff-pyridin-l-yl)-propionylamino]-pentansyre-tert-butylester (115 mg, 0,32 mmol)i vannfri diklormetan (2 ml). Blandingen ble omrørt ved 0°C i 0,5 time deretter ved romtemperatur i 0,5 time. Blandingen ble konsentrert under redusert trykk og deretter ble residuet løst igjen i tørr diklormetan. Denne prosess ble gjentatt flere ganger for å fjerne overskudd trifluoreddiksyre. Gummien ble lyofilisert to ganger fra vann med HPLC-kvalitet for å gi tittelforbindelsen som et offwhite fast stoff: IR (fast stoff) 1789, 1730, 1654 cm"<1>; <X>H NMR (400 MHz, DMSO) 8 1,4-1,6 (3H, m) , 2,5-2,9 (2H, m) , 4,2-4,7 (2H, m) , 5,0-5,5 (2H, m) , 6,2-6,3 (1H, m) , 6,3-6,5 (1H, m) , 7,3-7,4 (1H, m) , 7,6-7,7 (1H, m) , 8,4-8,9 (1H, m) ; <13>C NMR (100 MHz, DMSO) 8 17, 15, 17, 27, 17, 61, 17, 87, 17,94, 33,50, 33,57, 35,02, 35,23, 35,31, 52,69, 53,08, 53,31, 53,42, 53,47, 53,79, 53,91, 54,49, 54,85, 81,55, 81,92, 83,31, 83,68, 83,95, 84,07, 85,72, 85,84, 105,87, 106,07, 106,19, 119,67, 119,86, 120,26, 137,05, 137,31, 137,36, 137,40, 137,43, 140,60, 140,65, 140,74, 140,85, 162,14, 162,18, 162,28, 162,32, 171,25, 171,48, 171,62, 171,69, 172,55, 172,63, 173,63, 173,67, 174,52, 203,04, 203,18, 203,28, 203,42; MS (FAB +ve, HR) Beregnet for Ci3Hi6FN205 (MH+) 299, 1043, funnet 299, 1045.

Eksempel 2

5- fluor- 3- [ 2- ( 2- okso- 2Jf- pyridin- l- yl) - acetylamino] - 4- okso-pentansyre ( lA- 1) ble fremstilt på en måte lignende den beskrevet i eksempel 1 unntatt at i trinn A erstattes (R)-2-trifluormetansulfonyloksy)-propionsyre-etylester av bromeddiksyre-etylester. Produktet ble isolert som et gult fast stoff: IR (fast stoff) 1657, 5, 1694, 3, 1781, 3 cm"1; XH NMR (400 MHz, DMSO) 8 2,5-2,9(2H, m) , 4,3-4,7(3,5H, m), 5, 1-5, 5 (1, 5H, m) , 6,2(1H, m) , 6,3-6,4(lH, m) , 7,4(1H, m) , 7,6(1H, m) , 8,5-9,0(lH, m) ; 13C NMR (100 MHz, DMSO) 8 (DMSO) 28,71, 33,17, 51,13, 51,64, 51,70, 52,25, 52,91, 80,96, 81,74, 82,72, 83,46, 83,59, 85,35, 105,16, 105,23, 105,31, 119,54, 140,71, 140,82, 140,89, 161,82, 161,87, 161,94, 167,62, 167,73, 168,18, 172,12, 173,14, 173,80, 202,76, 202, 89; 19F (376 MHz, DMSO) 8 -226, 9(t), -231,8(t), -233, 3 (t) .

Eksempel 3

5- f luor- 3 - [ 2 - ( 6- metyl- 2- okso- 2Jf- pyridin- l- yl) - acetylamino] - 4- okso- pentansyre ( 1A- 3) ble fremstilt på en måte lignende

den beskrevet i eksempel 2 for å gi fargeløse krystaller: IR (fast stoff) 3276, 1741, 1716, 1669, 1642, 1548, 1414, 1377, 1352, 1273, 1248, 1227, 1189, 1163, 1043, 796 cm"<1>;XH NMR (400 MHz, DMSO) 8 2,25 (3H, s), 2,55-2,95 (2H, m), 4,3-4,8 (3H, m), 5,1-5,35 (2H, m), 6,06 (1H, m), 6,22 (1H, m), 7,27 (1H, m), 8,51, 8,82 (1H, 2 x d);13C NMR (100 MHz, DMSO) 8 20,83, 34,83, 46,47, 52,15, 83,52, 85,29, 103,82, 116,32, 139,97, 162,8, 167,8, 172,0, 173,1, 202,86.

Eksempel 4

5- fluor- 3- [ 2- ( 4- fenyl- 2- okso- 2Jf- pyridin- l- yl) - acetylamino] - 4- okso- pentansyre ( 1A- 4) ble fremstilt fra 4-fenylpyrimin-2-on (Iwasaki et al, J. Med. Chem. 1996, 39, 2696) på en måte lignende den beskrevet i eksempel 2 for å gi et fargeløst fast stoff: IR (fast stoff) 3307,5, 3216,5, 1787,8, 1659,7, 1582,9, 1567,6, 1219,4, 1055,5, 927,5, 763, 6 cm"1; XH NMR (400 MHz, DMSO) 8 2, 66 (1H, m) , 2,85 (1H, m) , 4,31-4,72 (3H, m), 5,28 (2H, m) , 6,59 (1H, m), 6,69 (1H, m), 7,51 (3H, m), 7,70 (3H, m), 8,50-8,95 (1H, br); <13>C NMR (100 MHz, DMSO) 8 33,2, 34,7, 47,6, 50,8, 51,4, 52,3, 83,6, 85,4, 103,8, 104,0, 104,2 , 104,3, 115,3, 127,0, 129,4, 129,9, 137,1, 140,7, 151,4, 151,6, 161,9, 162,0, 167, 8, 168, 2, 172, 1, 173, 1, 202, 7, 202, 9; <19>F (376

MHz, DMSO)

8 -226,8 (t), -231,8 (t), -233,27 (t).

Eksempel 5

5- fluor- 3- [ 2- ( 3- fenyl- 2- okso- 2if- pyridin- l- yl) - acetylamino] - 4- okso- pentansyre ( 1A- 5) ble fremstilt fra 3-fenylpyrimin-2-on. 3-fenylpyrimin-2-on ble fremstilt ved bromering av pyrimidin-2-on (Oswald og Martinu J. Am. Chem. Soc, 1982, 104, 4142), etterfulgt av palladium-mediert kobling med benzenborsyre i henhold til en prosedyre beskrevet av Damewood et al. ( J. Med. Chem., 1994, 37, 3303). Resten av syntesen ble fullført på en måte lignende den beskrevet i eksempel 2 for å gi et fargeløst fast stoff: IR (fast stoff) 3392,3, 2941,1, 1745,4, 1673,9, 1635,4, 1564,0, 1396, 3, 1236,2, 1203, 4, 775, 5, 700, 9 cm"<1>; <X>H NMR (400 MHz, DMSO) 8 2,64 (1H, m), 2,79 (1H, m), 4,21-4,81 (3H, m), 5,29 (2H,m), 6,37 (1H, m), 7,28-7,41 (3H, m) , 7, 62-7,25 (4H, m) , 8,2-8,9 (1H, brm);13C NMR (100 MHz, DMSO) 8 32,2, 34,8, 47, 6, 51, 9, 52, 2, 52, 3, 80, 9, 82, 7, 83, 6, 85, 4, 103, 8, 104,0, 105,4, 105,5, 105,6, 127,6, 127,7, 128,2, 129,6, 137,0, 137,1, 137,2, 138,6, 138,8, 139,5, 140,1, 158,4, 160,8, 160,9, 162,7, 167,7, 168,2, 169,9, 172,1, 173,1, 202,7, 202, 9; 19F (376 MHz, DMSO) 8 -226, 8 (t) , -231,6 (t), -233,2 (t). Eksempel 6

5- fluor- 4- okso- 3-[ ( S)- 2-( 2- okso- 2ff- kinolin- l- yl) - propionylamino]- pentansyre ( 1B- 1) ble fremstilt på en måte lignende den beskrevet i eksempel 1 for å gi et hvitt pulver: IR (fast stoff) 1782, 1737, 1641 cm"1; XH NMR (400 MHz, DMSO) 8 1,5 (3H, m) , 2,3-2,4 (0,5H, m), 2,6-3,1 (1,5H, m) , 4,2-4,8 (1,6H, m), 5,0-5,5 (1,4H, m), 5,5-6,0 (1H, br s), 6,6 (1H, m), 7,3 (1H, m), 7,3-7,7 (2H, br m), 7,7-7,8 (1H, m) , 7,9-8,0 (1H, m) , 8,2-8,5 (1H, br m) ; <13>C NMR (100 MHz, DMSO) 8 14,06, 14,13, 14,25, 14,39, 32,77, 32,85, 34,29, 34,43, 51,75, 51,99, 52,30, 53,05, 83,41, 83,49,

85,17, 85,26, 114,56, 114,94, 115,13, 115,38, 120,95,

121,43, 121,35, 121,61, 122,34, 122,42, 122,48, 129,53, 129,59, 129,65, 130,66, 130,84, 130,91, 130,95, 131,18, 140,24, 140,32, 158,36, 158,70, 160,98, 161,41, 161,47, 167,71, 170,38, 171,86, 172,14, 172,16, 173,26, 202,35, 202,49, 202,53, 202,66; MS (FAB +ve, HR) Beregnet for Ci7Hi8FN205 (MH+) 349, 1200, funnet 349, 1206.

Eksempel 7

7

5- fluor- 4- okso- 3- [ ( S) - ( R) - 2- ( 2- okso- 2Jf- kinolin- l- yl) - acetylamino]- pentansyre ( 1B- 2) ble fremstilt på en måte lignende den beskrevet i eksempel 2 for å gi et hvitt pulver: IR (fast stoff) 1784, 1738, 1703, 1638 cm"1; XH NMR (400 MHz, DMSO) 8 2,5-3,2 (2H, m) , 4,3-4,7 (1,3H, m) , 4,8-5,4 (3,7H, m) , 6,6 (1H, m), 7,2-7,3 (2H, m) , 7,5-7,6 (1H, m) , 7,7-7,8 (1H, m) , 7,9-8,0 (1H, m) , 8,5-9,0 (1H, m) ; <13>C NMR (100 MHz, DMSO) 8 33,25, 34,90, 44,51, 44,64, 44,74, 47,71, 52,81, 81,22, 81,59, 82,98, 83,32, 83,51, 85,28, 114,80, 120,48, 120,53, 120,97, 121,09, 122,36, 122,41, 129,24, 131,02, 131,06, 131,21, 139,92, 139,99, 140,27, 140,34, 140,48, 161,48, 161,56, 167,54, 167,74, 168,09, 172,08, 173,13, 173,93, 202,59, 202,73; MS (FAB +ve, HR) Beregnet for Ci6Hi6FN205 (MH+) 335, 1043 funnet 335, 1046.

Eksempel 8

5- f luor- 4- okso- 3 - [ 2-( l- okso- lJf- isokinolin- 2- yl)-acetylamino]- pentansyre ( lC- 1) ble fremstilt på en måte lignende den beskrevet i eksempel 2 for å gi et hvitt

pulver: IR (fast stoff) 1778, 1738, 1688, 1646 cm"<1>; <X>H NMR (400 MHz, DMSO) 8 2,6-3,2 (2H, m) , 4,3-4,7 (3H, m), 5,1-5,4 (2H, m) , 6,6 (1H, m) , 7,4-7,6 (2H, m) , 7,6-7,8 (2H, m) , 8,2 (1H, m) , 8,4-8,9 (1H, m) ; <13>C NMR (100 MHz, DMSO) 8 33,20, 34,85, 51,01, 51,40, 47,59, 52,19, 52,91, 81,03, 81,72, 82,79, 83,44, 83,56, 85,32, 104,89, 104,97, 105,05, 125,57, 125,59, 126,48, 126,88, 126,93, 127,25, 127,28, 132,70, 132,74, 134,44, 134,48, 137,61, 137,64, 161,51, 161,58, 161,64, 167,95, 168,07, 168,46, 172,60, 173,13, 173,81, 202,72, 202,86, 204,52; MS (FAB +ve, HR) Beregnet for Ci6Hi6FN205 (MH+) 335, 1043, funnet 335, 1044.

Eksempel 9

5- fluor- 4- okso- 3- [ ( S) - 2- ( l- okso- lJf- isokinolin- 2- yl) - propionylamino]- pentansyre ( 1C- 2) ble fremstilt på en måte lignende den beskrevet i eksempel 1 for å gi et hvitt pulver: IR (fast stoff) 1783, 1739, 1646 cm"<1>; <X>H NMR (400 MHz, DMSO) 8 1,5-1,6 (3H, m) , 2,5-3,0 (2H, m) , 4,3-4,8 (1,7H, m), 5,0-5,7 (2,3H, m), 6,6-6,7 (1H, m), 7,4-7,6 (2H, m) , 7,6-7,8 (2H, m) , 8,2 (1H, m) , 8,2-8,9 (1H, m) ; 13C NMR (100 MHz, DMSO) 8 16,07, 16,71, 16,80, 17,03, 17,28, 17,32, 32,99, 34,58, 34,71, 52,24, 52,46, 52,82, 52,88, 53,06, 53,20, 53,49, 53,80, 54,18, 83,43, 83,52, 85,20, 85,29, 105,19, 105,33, 105,37, 105,46, 105,49, 125,43, 125,48, 125,53, 125,57, 126,35, 126,42, 126,87, 126,91, 126,94, 127,02, 127,41, 127,49, 127,58, 130,28, 130,44, 130,50, 130,57, 131,47, 132,81, 137,09, 137,11, 137,15, 161,13, 161,26, 161,34, 161,42, 170,74, 170,91, 171,18, 171,30, 172,04, 172,09, 172,31, 173,15, 173,18, 202,56, 202,68,

202,70, 202, 82; MS (FAB +ve, HR) Beregnet for Ci7Hi8FN205 MH+) 349,1200, funnet 349,1198.

Eksempel 16

2 , 6- diklor- benzosyre 4- karboksy- 2- okso- 3- [ 2 - ( 1- okso- lJf-isokinolin- 2- yl)- propionylamino]- butylester ( 1C- 5) Trinn I: 2, 6- diklor- benzosyre 4- tert- butoksykarbonyl- 2- hydroksy- 3-[ 2- ( l- okso- lJf- isokinolin- 2- yl) - propionylamino] - butylester En omrørt løsning av 2-(l-okso-lfZ-isokinolin-2-yl) - propionsyre (150 mg, 0,7 mmol) og 2,6-diklor-benzosyre 3-allyloksykarbonylamino-4- tert-butoksykarbonyl-2-hydroksy-butylester (319 mg, 0,7 mmol) i en blanding av vannfri DMF (1,5 ml) og CH2CI2 (4,5 ml) ved romtemperatur ble behandlet med en katalytisk mengde bis(trifenylfosfin)palladium(II) klorid, etterfulgt av dråpevis tilsetning av tributyltinnhydrid (279 ?m, 1,0 mmol). Etter 5 minutter ble HOBt (186 mg, 1,4 mmol) tilsatt, reaksjonsblandingen ble avkjølt til 0°C, EDC (132 mg, 0,7 mmol) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble tillatt å omrøre i 16 timer ved å varme langsomt til romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble helt på iskald 1 M HC1 og ekstrahert med EtOAc og deretter ble den organiske fase vasket med mettet vandig natriumbikarbonat, etterfulgt av mettet

natriumkloridløsning, tørket (Na2S04), filtrert og konsentrert. Residuet ble triturert med bensin og deretter renset på flash ved å anvende som eluent 1:1 bensin/EtOAc for å gi undertittelforbindelsen som et fargeløst skum (190 mg, 48%); <X>H NMR (400 MHz CDC13) 5 1,3-1,5 (10H, m) , 1,65-1,75 (3H, 2 x d), 2,5-2,7 (2H, m) , 4,1-4,5 (3H, m) , 5,6 (1H, 2 x q) , 6,6 (1H, 2 x d) , 7,1-7,6 (8H, m) , 7,7 (1H, m) , 8,4 (1H, d).

Trinn J: 2, 6- diklor- benzosyre 4- tert- butoksykarbonyl- 2-okso- 3-[ 2-( l- okso- lJf- isokinolin- 2- yl) - propionylamino] - butylester

En omrørt løsning av 2,6-diklor-benzosyre 4- tert-butoksykarbonyl-2-hydroksy-3- [2- (l-okso-lff-isokinolin-2-yl)-propionylamino]-butylester (183 mg, 0,32 mmol) i vannfri DCM (3 ml) ble behandlet med 1,1,1-triacetoksy-1,1-dihydro-1,2-benziodoksol-3(1H)-on (147 mg, 0,34 mmol) ved 0°C. Den resulterende blanding ble holdt ved 0°C i 5 timer, fortynnet med DCM, deretter helt i en 1:1 blanding av mettet vandig natriumhydrogenkarbonat og mettet vandig natriumtiosulfat. Den organiske fase ble fjernet og den vandige fase re-ekstrahert med DCM. De kombinerte organiske ekstrakter ble tørket (Na2SC>4), filtrert og konsentrert. Residuet ble renset ved flashkromatografi ved å anvende som eluent 60:40 bensin/EtOAc for å gi undertittelforbindelsen som et fargeløst skum (116 mg, 64%) : <X>H NMR (400 MHz,

CDC13) 5 1,2-1,4 (9H, 2 x s), 1,7 (3H, d) , 2,7-3,0 (2H, m) , 4,9-5,1 (4H, m) , 5,8 (1H, m) , 6,6 (1H, 2 x d) , 7,2-7,6 (7H, m) , 8,4 (1H, m) ; MS (FAB +ve) 57 6.

Trinn K: 2, 6- diklor- benzosyre 4- karboksy- 2- okso- 3-[ 2-( 1-okso- lJf- isokinolin- 2- yl) - propionylamino] - butylester

Trifluoreddiksyre (2 ml) ble tilsatt til en omrørt iskald løsning av 2,6-diklor-benzosyre 4-tert-butoksykarbonyl-2-okso-3-[2-(l-okso-lf/-isokinolin-2-yl) -propionylamino] - butylester (110 mg, 0,19 mmol) i vannfri diklormetan (2 ml). Blandingen ble omrørt ved 0°C i 1 time og ved romtemperatur i 0,5 time. Reaksjonsblandingen ble konsentrert under redusert trykk og deretter ble residuet løst igjen i tørr diklormetan. Denne prosess ble gjentatt flere ganger for å fjerne overskudd trifluoreddiksyre. Residuet ble deretter lyofilisert to ganger fra vann med HPLC-kvalitet og deretter renset ved omvendt fase HPLC ved å anvende en gradienteluent av 10:90 CH3CN:vann til 100:0 CH3CN:vann for å gi tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff (17 mg, 16%): IR (fast stoff) 3295, 1736, 1648, 1618, 1590 cm"1; XH NMR (400 MHz, DMSO) 1,57 (3H, 2 x d) , 2,64-2,80 (2H, m), 4,73 (1H, m), 5,14-5,33 (2H, m) , 5,44-5,53 (1H, m), 6,67 (1H, m), 7,44-7,74 (7H, m), 8,20 (1H, d), , 8, 77-8, 83 (1H, bd) ; <13>C NMR (100 MHz, DMSO) 16,72, 16, 90 , 53,77, 105,36, 105,49, 125,48, 126,37, 126,90, 127,49, 128,85, 130,52, 130,67, 131,15, 132,47, 132,82, 132,93, 137,09, 137,12, 161,38, 163,56, 163,64, 171,15, 171,25; MS (FAB +ve, HR) Beregnet for C24H20CI2N2O7 (MH+) 519, 072 6, funnet 519,0701.

Eksempel 17

5- f luor- 3 - [ 2 - ( 6- etyl- 2- okso- 2Jf- pyridin- l- yl) - acetylamino] - 4- okso- pentansyre ( 1A- 6) ble fremstilt på en måte lignende den beskrevet i eksempel 2 for å gi fargeløse krystaller: IR (fast stoff) 1792,9, 1664,9, 1644,4, 1547,1, 1209,1, 1045, 2, 1019, 6, 922,3 cm"<1>; <X>H NMR (400 MHz, DMSO) 8 1,15 (3H, t), 2,52-2,71 (3H, m) , 2,74-2, 93 (1H, m) , 4,28-4,81 (4H, m), 5,25 (1H, m), 6,10 (1H, m), 6,29 (1H, m), 7,37 (1H, m) , 7, 85-8, 85 (1H, m) , 12,50 (lH,brs); <13>C NMR (100 MHz, DMSO) 5 12,4, 12,45, 25,5, 25,6, 25,7, 33,2, 34,8 ,45,6, 46,1, 47,7, 52,2, 52,8, 81,2, 83,0, 83,4, 83,6, 85., 103,7, 103,8, 103,9, 104,0, 116,4, 116,5, 139,9, 140,0 ,152,6 ,162,7, 162,9, 167,8, 167,9, 168,3, 172,1, 173,1, 202,7, 202, 9 ;19F (376MHz, DMSO) -226, 9 (t), -231,6 (t), -233, 1 (t); MS (FAB +ve, HR) Beregnet for C14H17FN2O5 (M+) 312,1122 funnet 312,1115.

Forbindelsene av denne oppfinnelse er designet for å hemme caspaser. Derfor kan forbindelsene av denne oppfinnelse undersøkes for deres evne til å hemme apoptose, frigivelsen av IL-ip eller caspaseaktivitet direkte. Assayer for hver av aktivitetene er kjent i faget og er beskrevet under i detalj i testdelen.

I henhold til en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning omfattende en forbindelse av denne oppfinnelse eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, som beskrevet over, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Hvis farmasøytisk akseptable salter av forbindelsene av denne oppfinnelse anvendes i disse sammensetninger, er de salter, fortrinnsvis avledet fra uorganiske eller organiske syrer og baser. Inkludert blant slike syresalter er de følgende: acetat, adipat, alginat, aspartat, benzoat, benzensulfonat, bisulfat, butyrat, citrat, kamforat, kamforsulfonat, cyklopentanpropionat, diglukonat, dodekylsulfat, etansulfonat, fumarat, glukoheptanoat, glyserofosfat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, hydroklorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroksyetansulfonat, laktat, maleat, metansulfonat, 2-naftalensulfonat, nikotinat, oksalat, pamoat, pektinat, persulfat, 3-fenyl-propionat, pikrat, pivalat, propionat, succinat, tartrat, tiocyanat, tosylat og undekanoat. Basesalter inkluderer ammoniumsalter, alkalimetallsalter, slik som natrium- og kaliumsalter, alkalijordmetallsalter, slik som kalsium- og magnesiumsalter, salter med organiske baser, slik som dicykloheksylaminsalter, N-metyl-D-glukamin, og salter med aminosyrer slik som arginin, lysin og så videre.

Dessuten kan de basisk nitrogeninneholdende grupper kvaterniseres med slike midler som lavere alkylhalider, slik som metyl-, etyl-, propyl- og butylklorid, bromider og jodider; dialkylsulfater, slik som dimetyl-, dietyl-, dibutyl- og diamylsulfater, langkjedede halider slik som de-cyl-, lauryl-, myristyl- og stearylklorider, bromider og jodider, aralkylhalider, slik som benzyl- og fenetyl-bromider og andre. Vann- eller oljeløselig eller dispersible produkter erholdes derved.

Farmasøytisk akseptable bærere som kan anvendes i disse sammensetninger inkluderer, men er ikke begrenset til, ionebyttere, alumina, aluminiumstearat, lecitin, serumproteiner, slik som humant serum albumin, buffersubstanser slik som fosfater, glysin, sorbinsyre, kaliumsorbat, delvise glyseridblandinger av mettede vegetabilske fettsyrer, vann, salter eller elektrolytter, slik som protaminsulfat, dinatriumhydrogenfosfat, kaliumhydrogenfosfat, natriumklorid, sinksalter, kolloidal silika, magnesiumtrisilikat, polyvinylpyrrolidon, cellulosebaserte substanser, polyetylenglykol, natriumkarboksymetylcellulose, polyakrylater, vokser, polyetylenpolyoksypropylen-blokkpolymerer, polyetylenglykol og ullfett.

I henhold til en foretrukket utførelse er sammensetningene av denne oppfinnelse formulert for farmasøytisk administrasjon til et pattedyr, fortrinnsvis et menneske.

Slike farmasøytiske sammensetninger av den foreliggende oppfinnelse kan administreres oralt, parenteralt, ved inhalasjonsspray, topisk, rektalt, nasalt, bukkalt, vaginalt eller via et implantert reservoar. Begrepet "parenteralt" som anvendt heri inkluderer subkutane, intravenøse, intramuskulære, intra-artikulære, intra-synoviale, intrasternale, intratekale, intrahepatiske, intralesjonelle og intrakranielle injeksjons- eller infusjonsteknikker. Fortrinnsvis administreres sammensetningene oralt eller intravenøst.

Sterile injiserbare former av sammensetningene av denne oppfinnelse kan være vandige eller oljeaktige suspensjoner. Disse suspensjoner kan formuleres i henhold til teknikker kjent i faget ved å anvende passende dispergerings- eller fuktemidler og suspensjonsmidler. Det sterile injiserbare preparat kan også være en steril injiserbar løsning eller suspensjon i et ikke-toksisk parenteralt akseptabelt fortynningsmiddel eller løsningsmiddel, for eksempel som en løsning i 1,3-butandiol. Blant de akseptable vehikler og løsningsmidler som kan anvendes er vann, Ringers løsning og isoton natriumkloridløsning. I tillegg anvendes konvensjonelt steril, fikserte oljer som et løsningsmiddel eller suspensjonsmedium. For dette formål kan enhver harmløs fiksert olje anvendes inklusive syntetiske mono-eller diglyserider. Fettsyrer, slik som oleinsyre og dens glyseridderivater er nyttige i fremstillingen av injiserbare, som naturlige farmasøytisk akseptable oljer også er, slik som olivenolje eller ricinusolje, spesielt i deres polyoksyetylerte versjoner. Disse oljeløsninger eller suspensjoner kan også inneholde et langkjedet alkoholfortynningsmiddel eller dispergeringsmiddel, slik som karboksymetyl-cellulose eller lignende dispergeringsmidler som er vanlig anvendt i formuleringen av farmasøytisk akseptable doseringsformer inklusive emulsjoner og suspensjoner. Andre vanlig anvendte surfaktanter, slik som Tween'er, Span'er og andre emulgeringsmidler eller biotilgjengelighets forsterkere som er vanlig anvendt i fremstillingen av farmasøytisk akseptable fast stoff, væske, eller andre doseringsformer kan også anvendes for formuleringsformål.

De farmasøytiske sammensetninger av denne oppfinnelse kan administreres oralt i enhver oralt akseptabel doseringsform inklusive, men ikke begrenset til, kapsler, tabletter, vandige suspensjoner eller løsninger. I tilfellet av tabletter for oral anvendelse, inkluderer bærere som er vanlig anvendt laktose og maisstivelse. Smøremidler, slik som magnesiumstearat, tilsettes også typisk. For oral administrasjon i en kapselform, inkluderer anvendelige fortynningsmidler laktose og tørket maisstivelse. Når vandige suspensjoner er krevet for oral anvendelse, kombineres den aktive ingrediens med emulgerings- og suspensjonsmidler. Hvis ønsket, kan visse søtnere, smaks-eller fargestoffer også tilsettes.

Alternativt kan de farmasøytiske sammensetninger av denne oppfinnelse administreres i form av suppositorier for rektal administrasjon. Disse kan fremstilles ved å blande midlet med en passende ikke-irriterende eksipient som er fast ved romtemperatur, men flytende ved rektal temperatur og derfor vil smelte i rektum for å frigi legemidlet. Slike materialer inkluderer kakaosmør, bivoks og polyetylenglykoler.

De farmasøytiske sammensetninger av denne oppfinnelse kan også administreres topisk, spesielt når målet for behandling inkluderer områder eller organer lett tilgjengelige ved topisk applikasjon, inklusive sykdommer i øyet, huden, eller det lavere intestinale system. Passende topiske formuleringer fremstilles lett for hvert av disse områder eller organer.

Topisk applikasjon for det lavere intestinale system kan bevirkes i en rektal suppositorieformulering (se over) eller i en passende klysterformulering. Topisk transdermale plastre kan også anvendes.

For topiske applikasjoner kan de farmasøytiske sammensetninger formuleres i en passende salve inneholdende den aktive komponent suspendert eller løst i en eller flere bærere. Bærere for topisk administrasjon av forbindelsene av denne oppfinnelse inkluderer, men er ikke begrenset til, mineralolje, parafinolje, vaselin, propylenglykol, polyoksyetylen, polyoksypropylenforbindelse, emulgerende voks og vann. Alternativt kan de farmasøytiske sammensetninger formuleres i en passende lotion eller krem inneholdende de aktive komponenter suspendert eller løst i en eller flere farmasøytisk akseptable bærere. Passende bærere inkluderer, men er ikke begrenset til, mineralolje, sorbitanmonostearat, polysorbat 60, cetylestere voks, cetearylalkohol, 2-oktyldodekanol, benzylalkohol og vann.

For oftalmisk anvendelse kan de farmasøytiske sammensetninger formuleres som mikroniserte suspensjoner i isoton, pH-justert, steril saltløsning, eller, fortrinnsvis, som løsninger i isoton, pH-justert, steril saltløsning, enten med eller uten et konserveringsmiddel slik som benzylalkoniumklorid. Alternativt, for oftalmiske anvendelser kan de farmasøytiske sammensetninger formuleres i en salve slik som vaselin.

De farmasøytiske sammensetninger av denne oppfinnelse kan også administreres ved nasal aerosol eller inhalasjon. Slike sammensetninger fremstilles i henhold til velkjente teknikker i faget for farmasøytisk formulering og kan fremstilles som løsninger i saltløsning, ved å anvende benzylalkohol eller andre passende konserveringsmidler, absorpsjonsfremmer for å øke biotilgjengelighet, fluorkarboner, og/eller andre konvensjonelle oppløsnings-eller dispergeringsmidler.

De over beskrevne sammensetninger er spesielt nyttige i terapeutiske applikasjoner som vedrører en IL-l-mediert sykdom, en apoptosemediert sykdom, en inflammatorisk sykdom, en autoimmun sykdom, en destruktiv benforstyrrelse, en proliferativ forstyrrelse, en infeksjonssykdom, en degenerative sykdom, en sykdom assosiert med celledød, en sykdom relatert til overdrevet alkoholinntak, en virusmediert sykdom, retinale forstyrrelser, uveitt, inflammatorisk peritonitt, osteoartritt, pankreatitt, astma, "adult respiratory distress syndrome", glomerulonefritt, revmatoid artritt, systemisk lupus erythematosus, skleroderma, kronisk tyroiditt, Graves sykdom, autoimmun gastritt, diabetes, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun nøytropeni, trombocytopeni, kronisk aktiv hepatitt, myasthenia gravis, inflammatorisk tarmsykdom, Crohns sykdom, psoriasis, atopisk dermatitt, arrdannelse, graft vs vert sykdom, organtransplantat avvisning, organapoptose etter brannskade, osteoporose, levkemier og relaterte forstyrrelser, myelodysplastisk syndrom, multippel myelomrelatert benforstyrrelse, akutt myeloisk levkemi, kronisk myeloisk levkemi, metastatisk melanom, Kaposis sarkom, multippelt myelom, hemoragisk sjokk, sepsis, septisk sjokk, brannsår, Shigellose, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom, Kennedys sykdom, prionsykdom, cerebral iskemi, epilepsi, myokardiskemi, akutt og kronisk hjertesykdom, myokardinfarkt, kongestive hjertesvikt, aterosklerose, koronararteri-bypass-graft, spinal muskulær atrofi, amyotrofisk lateral sklerose, multippel sklerose, HIV-relatert encefalitt, aldring, alopeci, nevologisk skade som skyldes slag, ulcerøs kolitt, traumatisk hjerneskade, ryggmargsskade, hepatitt-B, hepatitt-C, hepatitt-G, gulfeber, denguefeber, eller japansk encefalitt, forskjellige former av leversykdom, renal sykdom, polycystisk nyresykdom, H. pylori-assosiert gastrisk og duodenal ulcussykdom, HIV-infeksjon, tuberkulose og meningitt. Forbindelsene og sammensetninger er også nyttige i behandling av komplikasjoner assosiert med koronararterie-bypass-grafter. Mengden av forbindelse tilstede i de over beskrevne sammensetninger bør være tilstrekkelig til forårsake en detekterbar minsking i alvorligheten av sykdommen eller i caspaseaktivitet og/eller celleapoptose, som målt ved ethvert av assayene beskrevet i eksemplene.

I henhold til en annen utførelse kan sammensetningene av denne oppfinnelse ytterligere omfatte et annet terapeutisk middel. Slike midler inkluderer, men er ikke begrenset til, trombolytiske midler slik som vevsplasminogenaktivator og streptokinase. Når et andre middel anvendes, kan det andre middel administreres enten som en separat doseringsform eller som del av en enkelt doseringsform med forbindelsene eller sammensetningene av denne oppfinnelse.

Det bør også bli forstått at en spesifikk dosering og behandlingsregime for enhver spesiell pasient vil avhenge av en variasjon av faktorer, inklusive aktiviteten til den spesifikk forbindelse anvendt, alderen, kroppsvekten, generell helse, kjønn, diett, administrasjonstid, ekskresjonshastighet, legemiddelkombinasjon, og vurderingen til den behandlende lege og alvorligheten av den spesielle sykdom som behandles. Mengden av aktive ingredienser vil også avhenge av den spesielle forbindelse og det andre terapeutiske middel, hvis tilstedeværende, i sammensetningen.

For at denne oppfinnelse skal bli bedre forstått, fremsettes de følgende preparative og testeksempler. Disse eksempler er bare for illustrasjonsformål og skal ikke tolkes som begrensende for rammen av oppfinnelsen på noen måte.

Eksempel 28

Enzymassayer

Assayene for caspasehemming er basert på spaltingen av et fluorgent substrat av rekombinante, rensede humane caspaser -1, -3, -7 eller -8. Assayene kjøres i hovedsak på den samme måte som dem rapportert av Garcia-Calvo et al. (J. Biol. Chem. 273 (1998), 32 608-32 613), ved å anvende et substrat spesifikt for hvert enzym. Substratet for caspase-1 er Acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp-amino-4-metylkumarin. Substratet for caspase-3, -7 og -8 er Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-amino-4-metylkumarin.

Den observerte hastighet for enzyminaktivering ved en spesiell inhibitorkonsentrasjon, kobs, beregnes ved direkte tilpasninger av dataene til ligningen avledet av Thornberry et al. (Biochemistry 33 (1994), 3943-3939) ved å anvende et ikke-lineært minste-kvatraters analyse computerprogram (PRISM 2,0; GraphPad software). For å oppnå den andre ordens hastighetskonstant, kinact, plottes kobs-verdier mot deres respektive inhibitorkonsentrasjoner og kinact-verdier beregnes deretter ved å beregne lineær regresjon.

Tabell 8 viser hemming av caspase-l-aktivitet for valgte forbindelser av denne oppfinnelse som bestemt ved metoden over.

Tabell 9 viser hemming av caspase-3-aktivitet for valgte forbindelser av denne oppfinnelse som bestemt ved metoden over.

Tabell 10 viser hemming av caspase-7 og -8-aktivitet for valgte forbindelser av denne oppfinnelse som bestemt ved metodene over.

Eksempel 29

Hemming av IL- ip- sekresjon fra blandet populasjon av perifere blod mononukleære celler ( PBMC)

Prosessering av pre-IL-ip av caspase-1 kan måles i cellekultur ved å anvende en variasjon av cellekilder. Humane PBMC erholdt fra friske donorer gir en blandet populasjon av lymfocytt- og mononukleære celler som produserer et spektrum av interlevkiner og cytokiner i respons på mange klasser av fysiologiske stimulatorer.

Eksperimentell prosedyre

Testforbindelsen løses i dimetylsulfoksid (DMSO, Sigma #D-2650) for å gi en 100 mM stamløsning. Denne fortynnes i komplett medium bestående av RPMI inneholdende 10% varmeinaktivert FCS (Gibco BRL #10099-141), 2 mM L-glutamin (Sigma, #G-7513), 100U penicillin og 100 n.g/m.1 streptomycin (Sigma #P-7539). Testforbindelsens sluttkonsentrasjons-område er fra 100 ^M ned til 6 nM over åttefortynnings-trinn. Den høyeste konsentrasjon av testforbindelse er ekvivalent med 0,1% DMSO i assayet.

Humane PBMC isoleres fra Buffy Coats erholdt fra blodbanken ved å anvende sentrifugering på Ficoll-Paque levkocytt separasjonsmedium (Amersham, #17-1440-02) og det cellulære assay utføres i en steril 96-brønns flatbunnet plate (Nunc) . Hver brønn inneholder 100 ^.1 av cellesuspensjonen, lxlO<5> celler, 50 ul av forbindelsesfortynninger og 50 ul LPS (Sigma #L-3012) ved 50 ng/ml sluttkonsentrasjon. Kontroller består av celler +/- LPS-stimulering og en seriell fortynning av DMSO fortynnet på den samme måte som forbindelse. Platene inkuberes i 16-18 timer ved 37°C i 5% CO2 & 95% fuktighetsatmosfære.

Etter 16-18 timer høstes supernatantene etter sentrifugering av platene ved 100 x g ved 18°C i 15 min og analyseres for sitt IL-ipinnehold. Måling av modent IL-ip i supernatanten utføres ved å anvende Quantikine-kittene (R&D Systems) i henhold til produsentens instruksjoner. Modne IL-ipnivåer på ca 600-1500 pg/ml observeres for PBMCer i positive kontrollbrønner.

Forbindelsenes hemmende potens kan representeres ved en IC5o~verdi, som er konsentrasjonen av inhibitor ved hvilken 50% av det modne IL-ip detekteres i supernatanten sammenlignet med de positive kontroller.

Tabell 11 viser hemming av IL-ipsekresjon fra perifere blod mononukleære celler for valgte forbindelser av denne oppfinnelse som bestemt ved metodene over.

Eksempel 30

Anti- Fas- indusert apoptoseassay

Cellulær apoptose kan induseres ved bindingen av Fas-ligand (FasL) til dens reseptor, CD95 (Fas). CD95 er en av en familie med beslektede reseptorer, kjent som selvmordsreseptorer, som kan utløse apoptose i celler via aktivering av caspase-enzymkaskaden. Prosessen inititieres ved bindingen av adaptormolekylet FADD/MORT-1 til det cytoplasmiske domene av CD-95-reseptor-ligand komplekset. Caspase-8 binder deretter FADD og blir aktivert, hvilket initierer en kaskade av hendelser som involverer aktiveringen av nedstrøms caspaser og deretter cellulær apoptose. Apoptose kan også induseres i celler som uttrykker CD95, f.eks. Jurkat E6.1 T-cellelymfom-cellelinje, ved å anvende et antistoff, heller enn FasL, til å kryssbinde celleoverflaten CD95. Anti-Fas-indusert apoptose utløses også via aktiveringen av caspase-8. Dette gir basisen av et cellebasert assay for å screene forbindelser for hemming av den caspase-8-medierte apoptotiske vei.

Eksperimentell prosedyre

Jurkat E6.1 celler dyrkes i komplett medium bestående av RPMI-1640 (Sigma No) + 10% føtalt kalveserum (Gibco BRL No,10099-141) + 2 mM L-glutamin (Sigma No. G-7513). Cellene høstes i log-vekstfasen. 100 ml Celler ved 5-8xl0<5 >celler/ml overføres til sterile 50 ml Falcon sentrifugerør og sentrifugeres i 5 minutter ved 100xg ved romtemperatur. Supernatanten fjernes og de kombinerte cellepelleter resuspenderes i 25 ml komplett medium. Cellene telles og tettheten justeres til 2xl0<6> celler/ml med komplett medium.

Testforbindelsen løses i dimetylsulfoksid (DMSO)(Sigma No.

D-2650) for å gi en 100 mM stamløsning. Denne fortynnes til 400 uM i komplett medium, fortynnes deretter serielt i en 96-brønns plate før tilsetning til celleassayplaten.

100 ul av cellesuspensjonen (2xl0<6> celler) tilsettes til hver brønn i en steril 96-brønns rundbunnet clusterplate (Costar No. 3790). 50 ul forbindelsesløsning ved den passende fortynning og 50 ul anti-Fas-antistoff, klon CH-11 (Kamiya No.MC-060) ved en sluttkonsentrasjon på 10 ng/ml tilsettes til brønnene. Kontrollbrønner settes opp minus antistoff og minus forbindelse, men med en seriell fortynning av DMSO som vehikkelkontroll. Platene inkuberes i 16-18 timer ved 37°C i 5% C02 og 95% fuktighet.

Apoptose av cellene måles ved kvantifisering av DNA-fragmentering ved å anvende et ^Celledød-deteksjonsassay' fra Boehringer-Mannheim, No. 1544 675. Etter inkubering i 16-18 timer sentrifugeres assayplatene ved 100xg ved romtemperatur i 5 minutter. 150 ul av supernatanten fjernes og erstattes med 150 ul nytt komplett medium. Cellene høstes deretter og 200 ul av lysebufferen supplert i assaykittet tilsettes til hver brønn. Cellene tritureres for å sikre fullstendig lyse og inkuberes i 30 minutter ved 4°C. Platene sentrifugeres deretter ved 1900xg i 10 minutter og supernatantene fortynnes 1:20 i anskaffet inkubasjonsbuffer. 100 ul av denne løsning analyseres deretter eksakt i henhold til produsentens instruksjoner levert med kittet. OD^snm måles 20 minutter etter tilsetning av sluttsubstratet i en SPECTRAmax Plus plateleser (Molecular Devices). OD405nm plottes versus forbindelseskonsentrasjon og ICso-verdiene for forbindelsene beregnes ved å anvende kurvetilpasningsprogrammet SOFTmax Pro (Molecular Devices) ved å anvende fire-parameter tilpasningsvalget.

Tabell 12 viser resultatene av aktiviteten til valgte forbindelser av denne oppfinnelse i det FAS-induserte apoptoseassay.

Selv om vi har beskrevet flere utførelser av denne oppfinnelse, er det åpenbart at våre basiseksempler kan endres for å gi andre utførelser som anvender forbindelsene og fremgangsmåtene av denne oppfinnelse. Derfor vil det bli verdsatt at rammen av denne oppfinnelse defineres av de vedlagte krav heller enn av de spesifikke utførelser som har blitt representert eksempelvis.

Claims (16)

1. Forbindelse med formel IA: hvor R<1> er R eller -CH2Y; R er Ci-6-alkyl eller fenyl eventuelt substituert med halogen; Y er halogen eller -OC=0(R); R2 er C02H; R3 er hydrogen eller et C1-6 rettkjedet eller forgrenet alkyl; hver av R4-R6 er uavhengig valgt fra hydrogen eller R; eller R<4> og R<5> eller R6 eller R7 sammen med karbonatomene til hvilke de er bundet danner en fenylring og R7 er valgt fra hydrogen eller fenyl.

2. Forbindelse ifølge krav 1, hvor R<1> er CH2Y og Y er F.

3. Forbindelse ifølge krav 2, hvor R<3> er hydrogen eller C1-3 alkyl.

4. Forbindelse ifølge krav 1, hvor R<1> er CH2Y og Y er F eller -OC=0(R); R<2> er C02H; R3 er hydrogen eller C1-3 alkyl, hver av R4-R6 er uavhengig valgt fra hydrogen eller R; og R<7 >er hydrogen eller fenyl.

5. Forbindelse valgt fra dem listet i tabell 1 under:

6. Farmasøytisk sammensetning omfattende: a) en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5; og b) en farmasøytisk akseptabel bærer, adjuvans eller vehikkel.

7. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 for fremstilling av et medikament for å behandle eller forebygge en sykdom valgt fra en IL-l-mediert sykdom, en apoptosemediert sykdom, en inflammatorisk sykdom, en autoimmun sykdom, en destruktiv benforstyrrelse, en proliferativ forstyrrelse, en infeksjonssykdom, en degenerativ sykdom, en sykdom assosiert med celledød, en sykdom relatert til overdrevet alkoholinntak, en virusmediert sykdom, retinale forstyrrelser, uveitt, inflammatorisk peritonitt, osteoartritt, pankreatitt, astma, "adult respiratory distress syndrome", glomerulonefritt, revmatoid artritt, systemisk lupus erythematosus, skleroderma, kronisk tyroiditt, Graves sykdom, autoimmun gastritt, diabetes, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun nøytropeni, trombocytopeni, kronisk aktiv hepatitt, myasthenia gravis, inflammatorisk tarmsykdom, Crohns sykdom, psoriasis, atopisk dermatitt, arrdannelse, graft vs vert sykdom, organtransplantat avvisning, organapoptose etter brannskade, osteoporose, levkemier og beslektede forstyrrelser, myelodysplastisk syndrom, multippel myelom-relatert benforstyrrelse, akutt myeloisk levkemi, kronisk myeloisk levkemi, metastatisk melanom, Kaposis sarkom, multippelt myelom, hemoragisk sjokk, sepsis, septisk sjokk, brannsår, Shigellose, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom, Kennedys sykdom, prionsykdom, cerebral iskemi, epilepsi, myokardiskemi, akutt og kronisk hjertesykdom, myokardinfarkt, kongestive hjertesvikt, aterosklerose, koronararteri-bypass-graft, spinal muskulær atrofi, amyotrofisk lateral sklerose, multippel sklerose, HIV-relatert encefalitt, aldring, alopeci, nevrologisk skade som skyldes slag, ulcerøs kolitt, traumatisk hjerneskade, ryggmargsskade, hepatitt-B, hepatitt-C, hepatitt-G, gulfeber, denguefeber eller japansk encefalitt, forskjellige former av leversykdom, renal sykdom, polycystisk nyresykdom, H. pylori-assosiert gastrisk og duodenal ulcussykdom, HIV-infeksjon, tuberkulose og meningitt.

8. Anvendelse ifølge krav 7, hvor sykdommen er en apoptosemediert sykdom, en inflammatorisk sykdom, en autoimmun sykdom, en destruktiv benforstyrrelse, en proliferativ forstyrrelse, en infeksjonssykdom, en degenerativ sykdom, en sykdom assosiert med celledød, en sykdom relatert til overdrevet alkoholinntak, en virusmediert sykdom, inflammatorisk peritonitt, glomerulonefritt, diabetes, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun nøytropeni, trombocytopeni, kronisk aktiv hepatitt, arrdannelse, graft vs vert sykdom, organtransplantat avvisning, organapoptose etter brannskade, osteoporose, levkemier og beslektede forstyrrelser, myelodysplastisk syndrom, metastatisk melanom, hemoragisk sjokk, sepsis, septisk sjokk, brannsår, Shigellose, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom, Kennedys sykdom, prionsykdom, cerebral iskemi, epilepsi, myokardiskemi, akutt og kronisk hjertesykdom, myokard-infarkt, kongestiv hjertesvikt, aterosklerose, koronararteri-bypass-graft, spinal muskulær atrofi, amyotrofisk lateral sklerose, multippel sklerose, HIV-relatert encefalitt, aldring, alopeci, nevrologisk skade som skyldes slag, traumatisk hjerneskade, ryggmargsskade, hepatitt-B, hepatitt-C, hepatitt-G, forskjellige former av leversykdom, renal sykdom, polycystisk nyresykdom, H. pylori-assosiert gastrisk og duodenal ulcussykdom, HIV-infeksjon, tuberkulose, meningitt.

9. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 for fremstilling av et medikament for å hemme en caspase-mediert funksjon.

10. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 for fremstilling av et medikament for å minske IGIF- eller IFN-y-produksjon.

11. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 for fremstilling av et medikament for behandling av komplikasjoner assosiert med koronararteri-bypass-grafter.

12. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 for fremstilling av en sammensetning for å bevare celler.

13. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 for fremstilling av et medikament for å bevare organer i forbindelse med en organtransplantasjon eller for bevaring av blodprodukter.

14. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 for fremstilling av et medikament for behandling av cancer som en komponent i immunterapi.

15. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 7-14 hvori et annet terapeutisk middel er tilstedet i medikamen-tet .

16. Fremgangsmåte ved fremstilling av en forbindelse med formel I-A, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnene: (a) å tilveiebringe en syre eller et syrederivat med for- mel II-A, (b) å koble II-A med en aminoalkohol eller et aminoketon med formel 4 for å gi et intermediat med formel III-A, og (c) å konvertere intermediat III-A til forbindelse I-A, hvori Y<1> er hydrogen eller Ci-6-alkyl; Z er =0 eller OH; R<1> er R eller -CH2Y; R er en Ci-6-alkyl eller fenyl eventuelt substituert med halogen; Y er halogen eller -0C=0(R); R2 er C02H; R3 er hydrogen eller et Ci-6 rettkjedet eller forgrenet alkyl; hver av R4-R6 er uavhengig valgt fra hydrogen eller R, eller R4 og R<5> eller R<6> og R<7> sammen med karbonatomene til hvilke de er bundet danner en fenylring og R7 er valgt fra hydrogen eller fenyl.