CN111433176B - 用于选择性表征异生物质代谢中涉及的酶的探针以及制造和使用该探针的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了基于活性的探针，该探针可用于选择性鉴定和表征宿主及其微生物群中异生物质代谢不同阶段所涉及的酶。所描述的基于活性的探针仅特异性标记其参与异生物质代谢的靶活性酶，因此可提供真正蛋白质功能活性的量度，而不是转录本或蛋白质丰度的量度。基于活性的探针还提供了这些活性酶的多模态分析。还公开了用于制备基于活性的探针的方法和其使用的示例性方法。

Description

用于选择性表征异生物质代谢中涉及的酶的探针以及制造和 使用该探针的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求享有于2017年10月4日提交的美国临时申请62/568,151和于2017年11月28日提交的美国临时申请62/591,697的较早申请日期的权益；这些在先申请中的每一个均通过引用整体并入本文。
致谢政府支持
本发明是在由能源部授予的合同号为DE-AC05-76RL01830的政府支持下完成的。政府拥有本发明中的某些权利。
技术领域
本公开涉及人宿主和微生物群来源的异生物质代谢的酶。
背景
避免仅通过基因组或转录组来表征微生物群落的研究兴趣正在增长。然而，当前使用荧光原位杂交(FISH)用于基于基因含量从微生物群落中分选微生物的技术仍然几乎普遍不能提供仅基于功能的分选机制。这项技术以及其他许多技术都是基于基因或氨基酸的标记。然而，基因或氨基酸的存在不一定等同于功能。需要新的技术来鉴定、分离和量化生物环境中存在的分析物种类(例如，微生物、酶、毒素等)，以便可以确定此种类及其功能。
发明简述
本公开涉及基于活性的探针，其能够实时检测、测量和影响异生物质代谢中所涉及的酶的酶活性。探针分子式和结构在本文中描述。本文还公开了使用所述探针的方法的实施方案，其可以包括将受试者或样品暴露于本文所述的探针实施方案一段足够的时间，以使所述探针结合至异生物质代谢中所涉及的酶，从而形成探针-酶缀合物；使用荧光检测技术、比色检测技术、质谱技术或其组合来分析探针-酶缀合物。还描述了其他方法实施方案。
还描述了包括本公开的探针实施方案的装置和试剂盒，以及使用该装置和试剂盒的方法。在一些实施方案中，描述了测定平台，其可以包括如本文所述的底物和探针的实施方案。
根据下面的详细描述，本公开的前述和其他目的和特征将变得更加明显，下面的详细描述参照附图进行。
附图简要说明
图1是显示异生物质代谢的不同阶段的示意图，包括I相和II相代谢，以及肠道微生物组中发生的代谢事件。
图2为示意图，显示了所公开的基于活性的探针(“ABP”)实施方案如何可用于测量异生物质代谢期间的蛋白质功能活性的所有水平，包括群落(门)水平的异生物质代谢、细胞/分类单元水平的异生物质代谢和酶水平的异生物质代谢。
图3提供了本文所述的某些ABP实施方案的异生物质代谢酶活性的概述，包括用于测量该活性的至少一种代表性探针实施方案的结构。
图4是活性谷胱甘肽转移酶(“GST”)功能的示意图，其显示了通过本文所述的代表性的探针实施方案将还原型谷胱甘肽(GSH)缀合至通过“G”和“H”位点结合稳定的异生物质(X)的机制。
图5是本文描述的利用ABP实施方案的方法实施方案的示意图。
图6是使用本文所述的ABP实施方案来鉴定由不同探针靶向的不同酶的代表性测定实施方案的示意图。
图7是使用FACS分析的代表性方法实施方案的示意图。
图8A示出了用本文所述的代表性探针实施方案标记的来自大肠杆菌(E.coli)的活性WT b-葡糖醛酸糖苷酶的结果，其中“+”代表具有10μM探针的样品，“-”代表不具有探针的对照，并且其中E413A/E505A活性位点突变体未标记。
图8B显示了从小鼠大肠微生物组分离的蛋白质，其由GlcA-ABP标记(M：分子量标志)。
图8C是通过FACS收集的“探针阳性”和“探针阴性”群体的图。
8D显示GlcA-ABP探针阳性(红色三角形)群体与探针阴性(蓝色三角形)相比，分类单元显著富集(调整后的p值≤0.05)。
图9示出了用于分离8A-8D中讨论的ABP+/-群体的总体门控策略，其中使用侧向散射和SYBR Gold信号作为事件阈值，在正向和侧向散射、脉冲持续时间、CF640-R上对细胞进行门控以去除碎片，然后CF640-R；绘制门控，使“无探针”对照样品中>95％的事件被视为“探针阴性”。
图10A显示了通过点击化学对用四甲基若丹明叠氮化物标记的探针-β-葡糖醛酸糖苷酶缀合物的荧光(顶部)和考马斯染色(底部)SDS-PAGE分析的探针结构和相应的结果。
图10B示出了使用ImageJ对标记强度的定量，其中列表示平均值，误差线表示平均值的标准误差，并且*＝调整后的p＝0.0203；而**＝通过重复测量单次方差分析(Dunnett's多重比较检验，n＝3)调整后的p＝0.0047。
图10C显示了来自大肠杆菌裂解物(WT BW25113，ΔuidA pET32c，或补体ΔuidApuidA)的结果，其以不同浓度的探针实施方案标记，其中标记的蛋白通过荧光可见(左)，总蛋白通过考马斯蓝染色成像(右)。
图10D显示了来自以下实施方案的结果，其中全细胞大肠杆菌用探针实施方案标记，并且标记的细胞带有CF640-R标签。
图10E显示仅用探针实施方案、半胱氨酸反应性IAA探针或仅用媒介物(DMSO)标记的大肠杆菌(左上)、植物乳杆菌(L.plantarum)(中上)或两者的混合物(右上和下)的直方图。
图11示出了GlcA-ABP+和GlcA-ABP-分类单元的系统发育分布，其中红色三角形表示在探针阳性群体中丰度显著增加的分类单元；蓝色三角形表示在探针阴性群体中丰度显著增加的分类单元；白色圆圈表示未观察到丰度的显著差异；显示了三个GlcA-ABP+分类单元(左和右上)和一个GlcA-ABP-分类单元(左下)的示例(通过Welch's t检验或G检验(n＝5)，Benjamini-Hochberg调整的p<0.05时，分类单元被认为是具有丰度差异)。
图12显示了GlcA-ABP+和GlcA-ABP-群体中的β-多样性，包括对所有(顶部)、对照(右下)或万古霉素处理(左下)小鼠的测序群体进行Bray-Curtis差异分析。
图13A显示了与万古霉素处理的小鼠(青色正方形)相比，对照组(红色三角形)中GlcA-ABP+分类单元的系统发育分布(其中通过Welch's t检验或G检验(n＝3对)，Benjamini-Hochberg调整的p<0.05时，分类单元被认为是具有丰度差异)。
图13B显示了在对照或万古霉素处理的小鼠的肠道微生物组中的葡萄糖醛酸糖苷酶活性(其中成对的同窝仔畜(n＝5)通过线相连，*：通过比率配对的Student t-检验，p＜0.05，数据是三次实验重复的平均值)。
图13C显示了在未处理的(水)和万古霉素处理的小鼠中GlcA-ABP+群体的比较(其中数据代表五对同窝仔畜)。
图13D显示了两个示例性OTU的葡糖醛酸糖苷酶活性与归一化的对数丰度的皮尔逊相关图(其中显著性水平为0.05的结果被认为具有显著性)。
图14显示了对于图13A-13D所描述的实施方案，万古霉素处理后每个同窝仔畜对(在分类水平上具有分类单元的归一化相对丰度)的群体迁移。
图15A显示了使用1μM重组人GSTm1用本文所述的探针实施方案标记谷胱甘肽转移酶(GSH和GST)的结果。
图15B显示了使用1μM小鼠肝细胞溶质用本文所述的探针实施方案标记谷胱甘肽转移酶(GSH和GST)的结果。
图16A显示了富含探针和竞争探针的小鼠肝细胞溶质(n＝3)的LC-MS/MS化学蛋白质组学结果，其中所有样品与10μM代表性探针实施方案或等浓度的媒介物对照一起温育；富集计算为探针富集样品的AMT标签丰度除以无UV(对于GSH-ABP)或仅DMSO(对于GST-ABP)对照；具体而言，图16A显示了GSH-ABP富集的火山图，其中黑点代表未证明对探针标记具有竞争性抑制作用的所有GST，绿点代表其探针标记被2.5×过量的2,3-二氯-1,4-萘醌(Dichlon)竞争性抑制的GST，蓝点代表其探针标记被2.5×过量的Dichlon和2.5×过量的S-己基谷胱甘肽竞争性抑制的GST。
图16B显示了富含探针和竞争探针的小鼠肝细胞溶质(n＝3)的LC-MS/MS化学蛋白质组学结果，其中所有样品与10μM代表性探针实施方案或等浓度的媒介物对照一起温育；富集计算为探针富集样品的AMT标签丰度除以无UV(对于GSH-ABP)或仅DMSO(对于GST-ABP)对照；具体而言，图16B示出了GST-ABP富集的火山图，其中黑点代表其探针标记未被竞争性抑制的所有GST，蓝点代表其探针标记被20×S-己基谷胱甘肽竞争性抑制的GST，红点代表其探针标记被10×N-乙基马来酰亚胺竞争性抑制的GST。
图17提供了对小鼠肝细胞溶质的GSH-ABP和GST-ABP标记以描绘G和H位点结合(n＝3)的竞争性抑制结果的结果，其中在所有样品中使用了10μM的探针并且将增加浓度的S-己基谷胱甘肽或依他尼酸与小鼠肝细胞溶质温育30分钟，然后标记探针30分钟。然后，通过点击化学将若丹明连接到探针-蛋白质复合物上，并通过SDS-PAGE解析蛋白质，然后进行荧光凝胶成像和探针标记的GST条带定量(任意单位)(所有重复均归一化为％标记的蛋白质值(不含抑制剂的探针样品＝100％)。
图18A显示了使用GSH-ABP和GST-ABP的GST活性的器官分布，以及GST活性测定，其中显示了GSH-ABP的SDS-PAGE荧光。
图18B显示了使用GSH-ABP和GST-ABP的GST活性的器官分布，以及GST活性测定法，其中显示了GST-ABP的SDS-PAGE荧光。
图18C显示了来自标记的小鼠肝、肺、肾、肠、脾和心脏的细胞溶质的结果，显示出24-28kDa条带的总荧光强度，其与总GST活性相对应。
图18D是GSH-ABP和GST-ABP肺和肝GST靶标的维恩图。
图19是探针实施方案前体的1H-NMR谱。
图20是探针实施方案前体的1H-NMR谱。
图21是探针实施方案前体的1H-NMR谱。
图22是本文描述的探针实施方案的1H-NMR谱。
图23是本文描述的探针实施方案的13C-NMR谱。
图24是探针实施方案前体的1H-NMR谱。
图25是探针实施方案前体的13C-NMR谱。
图26是探针实施方案前体的1H-NMR谱。
图27是探针实施方案前体的13C-NMR谱。
图28是本文描述的探针实施方案的1H-NMR谱。
图29是本文描述的探针实施方案的13C-NMR谱。
图30显示了使用微球用于多路复用标记实施方案的示例性方法，其中基于功能的探针(“P”)在荧光玻璃微球上被官能化以实现流式细胞术，其中每个荧光团与特定探针匹配；可以将微球混合并添加到样品中，以对复杂的生物样品(例如生物样品)进行多功能表征，在标记后，可以对蛋白质-探针-微球进行分选以进行进一步分析(例如，确定基于每个分选样品的荧光发射和/或蛋白质组学分析定量的总体功能活性，以鉴定功能活性酶及其对总体功能活性的相对贡献)。
序列表
如37C.F.R.§1.822所定义，使用核苷酸碱基的标准字母缩写来显示所附序列表中列出的核酸序列。每种核酸序列仅显示一条链，但互补链应理解为通过任何参照所显示链的内容而被包括。随此提交的序列表于2018年10月2日产生，大小为2Kb，在此全文引入作为参考。在随附的序列表中：
SEQ ID NO：1是引物uidA_F的序列。
SEQ ID NO：2是引物uidA_R的序列。
SEQ ID NO：3是引物pET_F的序列。
SEQ ID NO：4是引物pET_R的序列。
详细说明
一、术语解释与概述
提供以下术语解释和缩写来更好地描述本发明并引导本领域技术人员实施本发明。如本文中所用，除非上下文另外明确表示，否则“包含”是指“包括”且单数形式的“一(a/an)”或“所述(the)”包括多个提及物。除非上下文另外明确表示，否则术语“或”是指所述可选要素的单个要素或两个或更多要素的组合。
除非另外解释，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本公开所属领域的一般技术人员通常所理解的相同含义。尽管在实施或测试本公开中可使用与本文所述的方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文中描述合适的方法和材料。所述材料、方法和实例只是说明性且并不打算限制。本公开的其他特征由下文的具体实施方案和权利要求书明显可知。
在提供数值范围的情况下，应理解为，除非上下文另有明确规定，否则每个中间值均应为下限单位的十分之一，介于该范围的上限和下限之间的中间值和任何其他规定或在所述规定范围内的中间值均包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，在所述范围内任何明确排除的限制下也包括在本发明内。在所述范围包括一个或两个极限的情况下，不包括两个包括的极限的范围也包括在本发明中。
除非另外说明，否则说明书或权利要求书中使用的表达组分量、分子量、温度、时间等的所有数值都理解为由术语“约”来修饰。因此，除非另外隐含或明确表示，否则列举的数值参数为可取决于所寻求的理想特性的近似值和/或如本领域技术人员已知的在标准测试条件/方法下的检测极限值。在直接且明确区别于所述现有技术的实施方案中，实施方案数值并非近似值，除非引用词语“约”。此外，并非本文叙述的所有替代方案都是等同的。
本文公开的化合物可包含一种或多种不对称元件，例如立体异构中心、手性轴等，例如，不对称碳原子，使得化学缀合物可以以不同的立体异构形式存在。这些化合物可以是例如外消旋体或旋光形式。对于具有两个或更多个不对称元件的化合物，这些化合物还可以是非对映异构体的混合物。对于具有不对称中心的化合物，包括纯形式的所有光学异构体及其混合物。在这些情况下，可以通过不对称合成，由光学纯的前体合成或通过拆分外消旋物来获得单一对映体，即旋光形式。外消旋物的拆分也可以例如通过常规方法来完成，例如在拆分剂存在下结晶，或使用例如手性HPLC柱进行色谱法。本文考虑了所有形式，无论用于获得它们的方法如何。
本文所用的立体化学定义和惯例一般遵循S.P.Parker,Ed.,McGraw-HillDictionaryofChemicalTerms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；以及Eliel,E.and Wilen,S.,StereochemistryofOrganic Compounds(1994)John Wiley&Sons,Inc.,New York。许多有机化合物以旋光活性形式存在，即它们具有旋转平面偏振光平面的能力。在描述旋光活性化合物时，前缀D和L或R和S用于表示分子围绕其手性中心的绝对构型。前缀d和I或(+)和(-)用于表示该化合物使平面-偏振光旋转的符号，其中(-)或1表示该化合物是左旋的。前缀(+)或d的化合物为右旋。
探针的所有形式(例如溶剂化物、旋光异构体、对映体形式、多晶型物、游离化合物和盐)可以单独或组合使用。
为便于阅读本公开的各种实施方案，提供以下具体术语的解释。某些官能团术语在官能团公式的开头包含“-”符号；该符号不是官能团的一部分，而是表示官能团如何与本文所述的分子式连接。例如，具有化学式“-OC(O)Rb”的官能团通过紧邻“-”符号的官能团的氧原子连接至官能化化合物的原子。
酰氧基：-OC(O)Rb，其中Rb选自氢、脂族基、芳基、杂脂族基、脂族基-芳基、杂芳基、脂族基-杂芳基、杂脂族基-芳基、杂脂族基-杂芳基及其任意组合。
醛基：-C(O)H。
脂族基：具有至少一个碳原子至50个碳原子(C1-50)，例如1至25个碳原子(C1-25)或1至10个碳原子(C1-10)的烃基，其包括烷烃(或烷基)、烯烃(或烯基)、炔烃(或炔基)，包括其环状形式，并且进一步包括直链和支链排列，以及所有立体和位置异构体。
脂族基-芳族基：与或能够与本文公开的探针偶联的芳族基团，其中该芳族基团经由脂族基团偶联或者变得偶联。
脂族基-芳基：与或能够与本文公开的探针偶联的芳基，其中该芳基经由通过脂族基团偶联或者变得偶联。
脂族基-杂芳族基：与或能够与本文公开的探针偶联的杂芳族基团，其中杂芳族基团经由脂肪族基团偶联或者变得偶联。
脂族基-杂芳基：与或能够与本文公开的探针偶联的杂芳基基团，其中杂芳基基团经由脂肪族基团偶联或者变得偶联。
烯基：具有至少两个碳原子至50个碳原子(C2-50)，例如2至25个碳原子(C2-25)或2至10个碳原子(C2-10)，以及至少1个碳-碳双键的不饱和一价烃，其中不饱和一价烃可通过从母体烯烃的一个碳原子上除去一个氢原子而得到。烯基可以是支链、直链、环状(例如环烯基)、顺式或反式(例如E或Z)。
烷氧基：-O-脂族基，例如-O-烷基、-O-烯基或-O-炔基，示例性的实施方案包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基。
烷基：具有至少一个碳原子至50个碳原子(C1-50)，例如1至25个碳原子(C1-25)或1至10个碳原子(C1-10)的饱和一价烃，其中饱和一价烃可以通过从母体化合物(例如烷烃)的一个碳原子中除去一个氢原子而得到。烷基可以是支链、直链或环状的(例如环烷基)。
炔基：具有至少两个碳原子至50个碳原子(C2-50)，例如2至25个碳原子(C2-25)或2至10个碳原子(C2-10)，以及至少一个碳-碳叁键的不饱和一价烃，其中所述不饱和一价烃可通过从母体炔的一个碳原子上除去一个氢原子而得到。炔基可以是支链、直链或环状的(例如，环炔基)。
烷基芳基/链烯基芳基/炔基芳基：与或能够与本文公开的探针偶联的芳基，其中所述芳基分别经由烷基、烯基或炔基偶联或者变得偶联。
烷基杂芳基/链烯基杂芳基/炔基杂芳基：与或能够与本文公开的探针偶联的杂芳基，其中所述杂芳基分别经由烷基、烯基或炔基偶联或者变得偶联。
酰胺基：-C(O)NRbRc，其中Rb和Rc各自独立地选自氢、脂族基、芳基、杂脂族基、脂族基-芳基、杂芳基、脂族基-杂芳基、杂脂族基-芳基、杂脂族基-杂芳基及其任何组合。
胺基：–NRbRc，其中Rb和Rc各自独立地选自氢、脂族基、芳基、杂脂族基、脂族基-芳基、杂芳基、脂族基-杂芳基、杂脂族基-芳基、杂脂族基-杂芳基以及任何它们的组合。
芳香族基：除非另有说明，否则为5至15个环原子的环状共轭基团或部分，该环状共轭基团或部分具有单个环(例如苯基、吡啶基或吡唑基)或多个稠合环(其中至少一个环为芳族环，例如萘基、吲哚基或吡唑并吡啶基)；也就是说，至少一个环以及任选地多个稠环具有连续的离域π电子系统。通常，平面π电子的数量对应于Huckel法则(4n+2)。与母体结构的附接点通常是通过稠环系统的芳族部分。例如，但是，在某些实施例中，上下文或明确公开内容可能表明附接点是通过稠环系统的非芳族部分。例如，芳族基团或部分可以在环中，例如在芳基基团或部分中仅包含碳原子，或者它可以包含一个或多个环碳原子和一个或多个包含孤对电子的环杂原子(例如，S，O，N，P或Si)，例如在杂芳基基团或部分中。
芳基：包含至少5个碳原子至15个碳原子(C5-C15)，例如5个至10个碳原子(C5-C10)的芳族碳环基团，其具有单环或多个稠环，所述稠环可以是芳族的或可以不是芳族的，只要与本文公开的化合物的其余位置的附接点是通过芳族碳环基团的原子即可。芳基可以被氢以外的一个或多个基团取代，例如脂族基、杂脂族基、芳基、杂芳基、其他官能团或其任意组合。在一些实施方案中，芳基环选自但不限于苯基、萘基、蒽基、茚基、薁基、芴基、四氰基邻喹啉二甲基(tetracyanoanthaquinodimethyl)等。
偶氮化合物：包含R1-N＝N-R2基团的化合物，其中R1和R2典型地是芳族基团。例如，偶氮化合物在食品、化妆品、制药和其他工业中被广泛用作着色剂。
偶氮还原酶：在细菌和真核生物酶中发现的一组不同的酶，其为黄素依赖性酶(通常为黄素单核苷酸)，能够通过NADH和FMN作为辅因子的电子供体还原性裂解含偶氮键的化合物。如Ryan,A.Br.J.Pharmacol.(2017)174:2161-73中所述，已经鉴定出几种肠道细菌具有偶氮还原酶活性。
羰基苄基：-C(O)Ph。
结合：结合及其其他语法形式是指化学物质之间的持久吸引力。
结合特异性：结合特异性既涉及与特定配手的结合，又涉及不与其他分子的结合。功能上重要的结合可能会在从低到高的亲和力范围内发生，并且设计元件可能会抑制不良的交叉交互作用。翻译后修饰也可以改变相互作用的化学和结构。“混杂结合”可能涉及一定程度的结构可塑性，这可能导致残基的不同子集，它们对于与不同配手结合是重要的。“相对结合特异性”是这样的特征，即在生化系统中，分子与其靶标或配手的相互作用不同，从而根据各个靶标或配手的身份显著地影响它们。
羧基：-C(O)ORb，其中Rb为脂族基、芳基、杂脂族基、脂族基-芳基、杂芳基、脂族基-杂芳基、杂脂族基-芳基、杂脂族基-杂芳基、氢及其任意组合。
化学键：原子之间的吸引力足够强大，足以使结合的聚集体作为一个单元起作用。键的不同主要类型包括金属键、共价键、离子键和桥键。“金属键”是晶体中所有原子核对外壳电子的吸引力，这些外壳电子以离域的方式在所有可用轨道之间共享。当两个原子核共享电子时，最常见的结果是“共价键”。常规的单价共价键涉及两个电子的共享。也可能有带有四个共享电子的双键，带有六个共享电子的叁键和中间多重性的键。共价键的范围从非极性(涉及两个原子均匀共享的电子)到极极性(其中键合电子非常不均匀地共享)。当键合电子与一个原子呆在一起，使该原子变成负离子，而另一个原子以正离子形式存在时，就会出现不均匀分配的限制。“静电(或离子)键”是带相反电荷的离子之间的静电吸引。“桥键或氢键”涉及氢的化合物，其中氢带有+或-电荷。
点击化学(click chemistry)：使用试剂制备化合物的化学合成方法，这些试剂可以在有效的试剂条件下结合在一起，并且可以在良性溶剂中或可以在通过使用简便的方法(例如蒸发、萃取或蒸馏)而被除去或萃取的溶剂中进行。已经鉴定出满足这些标准的几种类型的反应，包括环氧化物和氮丙啶类化合物的亲核开环反应、非羟醛型羰基反应(例如腙和杂环的形成)、碳-碳多键的加成(例如氧化形成环氧化物和迈克尔加成反应)、以及环加成反应。点击化学的代表性例子是将叠氮化物和炔烃偶合形成三唑的反应。与未催化的1,3-偶极环加成相比，铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)具有从107至108的巨大的速率加速。它在很宽的温度范围内都能成功使用，对水性条件和4到12的pH值不敏感，并且可以耐受各种官能团。可以通过简单的过滤或萃取来分离纯产物，而无需色谱或重结晶。
可点击的官能团：可在点击化学中用于形成产物的官能团。在一些实施方案中，可点击的官能团是叠氮化物或炔烃。
接触：接触或紧邻的状态或条件。在一些实例中，例如通过向样品(例如含有细胞或蛋白质的试剂)添加试剂，在体外或离体进行接触。
对照：没有基于活性的探针的样品。
二氯二酮：具有以下结构的基团，其中该结构的至少一部分具有基团。
差异标记：一种染色剂、染料、标志或活性探针，用于表征或对比单个细胞或生物的结构、成分或蛋白质。
酯基：-C(O)ORb，其中Rb选自氢、脂族基、芳基、杂脂族基、脂族基-芳基、杂芳基、脂族基-杂芳基、杂脂族基-芳基、杂脂族基-杂芳基或其任何组合。
酶结合基团(或EBG)：作为本文所述探针的一部分的分子或官能团或其组合，其与酶共价结合。在一些实施方案中，可以通过从探针上除去酶反应性基团和/或通过化学修饰EBG(例如通过还原EBG，氧化EBG或其组合)来使EBG活化以与酶反应。在一些其他实施方案中，EBG可以被光化学活化以促进与酶的结合。
酶反应基团(或ERG)：与本文所述探针连接且能够通过酶从该探针上去除(例如通过酶促裂解和/或化学置换)的分子或官能团或其组合。在具体公开的实施方案中，去除ERG的酶是涉及异生物质代谢的酶。能够被酶酶切的ERG的代表性例子包括糖(例如葡萄糖醛酸)、硫酸盐(酯)和磷酸盐(酯)。能够被酶置换的ERG的代表性例子包括但不限于卤化物、含酚的分子等。
酶特异性：酶在催化的反应及其底物中具有高度特异性。通常，酶特异性有四种不同类型：(1)绝对特异性：该酶仅催化一种反应；(2)基团特异性：该酶仅作用于具有特定官能团的分子，例如氨基、磷酸酯基和甲基基团；(3)连接特异性：该酶将作用于特定类型的化学键，而与分子结构的其余部分无关；和(4)立体化学特异性：该酶将作用于特定的空间或旋光异构体。尽管酶表现出高度的特异性，但辅因子可能会服务于许多脱辅基酶。例如，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是许多脱氢酶反应的辅酶，在其中它充当氢受体。
荧光：当分子或纳米结构在被电激发后松弛到其基态时，在某些分子中发生的三态过程的结果，通常称为“荧光团”或“荧光染料”。第1阶段涉及通过吸收光能激发荧光团；第2阶段涉及瞬态激发寿命，但有一些能量损失；以及第3阶段涉及荧光团返回其基态并伴有光的发射。
荧光染料、荧色物或荧光团：使分子发荧光的分子组分。该组分是分子中的官能团，该官能团吸收特定波长的能量并在不同(但同样特定)的波长处重新发出能量。发射能量的量和波长取决于染料和染料的化学环境。许多染料是已知的，包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)、R-藻红蛋白(PE)、PE-Texas Red Tandem、PE-Cy5 Tandem、碘化丙锭、EGFP、EYGP、ECF、DsRed、别藻蓝蛋白(APC)、PerCp、SYTOX绿、香豆素、Alexa Fluors(350、430、488、532、546、555、568、594、633、647、660、680、700、750)、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Hoechst 33342、DAPI、Hoechst 33258、SYTOX蓝、铬霉素A3、光神霉素、YOYO-1、SYTOX橙色、溴化乙锭、7-AAD、吖啶橙、TOTO-1、TO-PRO-1、噻唑橙、TOTO-3、TO-PRO-3、噻唑橙、碘化丙啶(PI)、LDS 751、Indo-1、Fluo-3、DCFH、DHR、SNARF、Y66F、Y66H、EBFP、GFPuv、ECFP、GFP、AmCyanl、Y77W、S65A、S65C、S65L、S65T、ZsGreenl、ZsYellowl、DsRed2、DsRed单体、AsRed2、mRFP1、HcRedl、单氯二胺(monochlorobimane)、钙黄绿素、DyLight Fluors、青色素、羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、级联蓝、荧光黄、NBD、PE-Cy5缀合物、PE-Cy7缀合物、APC-Cy7缀合物、Red 613、荧光素、FluorX、BODIDY-FL、TRITC、X-若丹明、李斯曼若丹明B、德克萨斯红、TruRed及其衍生物。
卤素：选自氟、氯、溴或碘的原子。
杂脂族基：包含至少1个杂原子至20个杂原子，例如1至15个杂原子，或1至5个杂原子的脂族基团，所述杂原子可选自但不限于基团内的氧、氮、硫、硒、磷和其氧化形式。示例性的杂脂族基团包括但不限于包含醚、硫醚、酯、胺、羧基、羰基或酰胺的脂族基团。
杂脂族基-芳族基：与或能够与本文公开的探针偶联的芳族基团，其中该芳族基团经由杂脂族基团偶联或者变得偶联。
杂脂族基-芳基：是或可以与本文公开的探针偶联的芳基，其中该芳基经由杂脂族基团偶联或者变得偶联。
杂烷基/杂烯基/杂炔基：烷基、烯基或炔基(可以是支链、直链或环状的)，其包含至少1个杂原子至20个杂原子，例如1至15个杂原子，或1至5个杂原子，所述杂原子可以选自但不限于基团内的氧、氮、硫、硒、磷和其氧化形式。
杂芳族基团：包含至少1个杂原子至20个杂原子，例如1至15个杂原子，或1至5个杂原子的芳族基团，所述杂原子可以选自但不限于基团内的氧、氮、硫、硒、磷和其氧化形式。
杂芳基：在环内包含至少1个杂原子至6个杂原子，例如1个至4个杂原子的芳基，所述杂原子可以选自但不限于环内发氧、氮、硫、硒、磷和其氧化形式。此类杂芳基可具有单个环或两个或更多个稠合环，该稠合环可以是或可以不是芳族和/或包含杂原子，条件是附接点通过芳族杂芳基的原子。在一些实施方案中，所述杂芳基环选自但不限于吡啶基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、苯并喹啉基、苯并喹喔啉基、苯并喹唑啉基、吲哚基、吲哚啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、嘌呤基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基等。
杂脂族基-杂芳族基：与或能够与本文公开的探针偶联的杂芳族基团，其中杂芳族基团经由杂脂族基团偶联或变得欧联。
酮：-C(O)Rb，其中Rb选自脂族基、芳基、杂脂族基、脂族基-芳基、杂芳基、脂族基-杂芳基、杂脂族基-芳基、杂脂族基-杂芳基及其任何组合。
标记：掺入分子中的可追踪成分，以便在空间上定位分子或跟随其通过反应或纯化方案。作为动词，添加可以被检测或测量的基团或原子。
裂解酶：一种不依赖氧化或加水即可破坏C-C或C-X键(其中X＝O、N、S、P或卤化物)的酶。微生物多糖裂解酶(PL)修饰在相对于羧酸(例如藻酸盐、果胶、软骨素和乙酰肝素)的β位含有糖苷键的多糖。微生物C-Sβ-裂解酶可裂解在饮食化合物和异生物质的半胱氨酸-S-缀合物中发现的C-S键，它们是由肝酶形成的。这些酶在5-磷酸吡哆醛(PLP)和半胱氨酸衍生的取代基的α-氨基之间产生醛亚胺键，酸化相邻的质子。β-消除作用释放出含硫醇的代谢物和氨基丙烯酸酯，后者自发地断裂下来形成氨和丙酮酸。微生物可以进一步代谢这些硫醇，从而改变其物理特性和在体内的定位。例如，肠道细菌的C-Sβ-裂解酶裂解多氯联苯的半胱氨酸-S-缀合物产生硫醇代谢物，该代谢物进一步被甲基化并积聚在亲脂性宿主组织中。
调节：调控、更改、改编或调整为一定的度量或比例。
NADPH-细胞色素P450氧化还原酶(POR)：一种黄素蛋白，参与电子转移至微粒体细胞色素P450(P450)、细胞色素b5、角鲨烯单加氧酶和血红素加氧酶。电子从POR转移到细胞色素b5(一种微小的微粒体血蛋白)，在脂肪酸代谢中很重要，因为它支持脂肪酸去饱和酶和延长酶的活性。细胞色素b5在电子转移到微粒体P450中也起作用。角鲨烯单加氧酶利用POR所提供的电子来支持固醇的生物合成。另一个电子受体是血红素加氧酶，该酶可将血红素降解为胆绿素、铁和一氧化碳。POR还可以直接催化前药(如抗肿瘤药丝裂霉素C和替拉帕明)的单电子还原生物活化。Riddick,DS et al,Drug Metabolism and Disposition(2013)41(1):12-23。
硝基还原酶：一种酶(例如，细胞溶质级分中的黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶；以及微粒体级分中的NADPH-细胞色素P-450还原酶)将硝基化合物还原为伯胺代谢物，总共需要六个电子，例如RNO2→RNO→RNHOH→RNH2。每个还原步骤都需要两个电子。Zbaida,S.,in EnzymeSystems that Metabolise Drugs and Other Xenobiotics(2002),John Wiley&SonsLtd.，第16章，第555-66页。
正常健康对照：没有症状或疾病的其他临床证据的受试者。
磷酸基：当连接至本文所述的探针实施方案时具有结构-P(O)(O-)2或-P(O)(OH)2，且当未连接至探针实施方案时具有结构P(O)(O-)3或P(O)(OH)3的官能团。任何阴离子磷酸基可包含平衡相应氧原子上的负电荷的合适的平衡离子，例如碱金属离子如K+、Na+、Li+等，铵离子或其他带正电的离子化有机化合物。
光活化：导致使用能够产生辐射的能源(例如光)起作用或行动(活化)或控制。
报告部分：能够产生视觉和/或仪器检测信号的官能团或分子。在具体公开的实施方案中，报告部分提供了使用适当的检测方法可视化或检测酶的能力，因为报告部分变得与酶共价连接。
样品：包含生物分子，例如核酸分子(例如，基因组DNA、cDNA、RNA和/或mRNA)、蛋白质和/或细胞的生物样品。示例样品是包含来自受试者的细胞或细胞裂解物的样品(并且可能包含一种或多种病原体，例如细菌)，例如外周血(或其一部分，例如血浆或血清)、尿液、唾液、痰、组织活检、脸颊拭子、粪便样本(例如粪便样本)、呼吸道样本、外科手术样本、细针抽吸、羊膜穿刺术样本和尸检材料。在一实施例中，样品获自受试者的消化道，例如受试者的胃、小肠、大肠或直肠。样品可以直接使用，但也可以在用所公开的方法进行分析之前进行浓缩、过滤、裂解、洗涤和/或稀释。
受试者：生物，例如脊椎动物，例如哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿猴、人类、农场动物、运动动物和宠物。在一个实例中，所述受试者是非人类哺乳动物受试者，例如猴子或其他非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、兔、猪、山羊、绵羊、狗、猫、马或牛。在一些实施例中，受试者是爬行动物、两栖动物、鱼或鸟。受试者可以作为使用所公开的方法和设备分析的样品的来源。
硫酸基：当连接至本文所述的探针实施方案时具有结构-SO2O-或-SO2OH且当未连接至探针实施方案时具有结构SO2(O-)2或SO2(OH)2的官能团。任何阴离子硫酸基都可以包含平衡相应氧原子上的负电荷的合适的平衡离子，例如碱金属离子如K+、Na+、Li+等，铵离子或其他带正电的离子化有机化合物。
毒物：人为制造的或通过人为活动而进入环境的毒药，例如农药。
异生物质(Xenobiotic)：一种药理、内分泌或毒理学活性的化学物质，不是其暴露的生物的自然成分。异生物质的例子包括但不限于食物、饮食补充剂、致癌物、毒素和药物。
上面提供的术语的描述并不旨在包括不允许的取代模式(例如，被5个不同的基团取代的甲基等)。这样的不允许的取代模式对于本领域普通技术人员来说是容易识别的。在本文公开的分子式和特定化合物中，在未示出官能团或其他原子的情况下，存在氢原子并完成任何形式化合价要求(但不一定必须示出)。例如，被绘制为的苯环包含与除碳之外的苯环的每个碳原子相连的氢原子，即使这样氢原子未示出。
除非本文另外指出，否则本文公开和/或以上定义的任何官能团可以被取代或未被取代。本文讨论的出版物仅以在本申请申请日前的公开内容提供，并且通过引用将其全部内容并入本文。本文中的任何内容均不应解释为承认本公开无权凭借在先发明而早于该出版物。此外，提供的发布日期可能与实际发布日期有所不同，实际发布日期可能需要独立确认。
二、介绍
A.药物代谢
药物的亲脂特性会促进其穿过生物膜并随后到达其作用部位，从而阻碍其从体内排泄。未改变药物的肾脏排泄在大多数治疗剂的总体清除中仅起适度作用，因为通过肾小球过滤的亲脂性化合物在通过肾小管的过程中大部分被重新吸收回体循环。因此，药物和其他异生物质代谢为亲水性更高的代谢物对于从体内消除这些化合物并终止其生物活性至关重要。许多代谢生物转化反应也适用于内源性化合物，包括类固醇、维生素和脂肪酸。尽管一般而言，生物转化反应会生成很容易被排泄的更极性的、无活性的代谢物，但在某些情况下，会生成具有强大生物活性或毒性的代谢物。导致药物无活性代谢物的许多代谢生物转化反应也产生内源性化合物的生物活性代谢物。(Goodman&Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics,Hardman,JG and Limbird,L.Eds,10thEd.McGraw-Hill Companies,Inc.,Intl Edn(2001)，第12-15页)。
药物代谢的特点是个体之间的较大可变性，这通常会导致明显的差异，从而导致药物的消除速率和血浆浓度-时间曲线的其他特征。这种可变性是患者对标准剂量药物反应不同的主要原因，必须在针对特定个体优化剂量方案时予以考虑。遗传、环境和疾病状态因素的组合会影响药物的代谢，每种因素的相对贡献取决于特定的药物。
B.I相和II相代谢
异生物质的代谢通常涉及两个不同的阶段。I相代谢涉及微粒体细胞色素P-450单加氧酶对异生物质的初始氧化、还原或脱烷基(Guengerich,F.P.Chem.Res.Toxicol.4:391-407(1991))；通常需要此步骤以提供对II相反应必不可少的羟基或氨基。氧化是最常见的I相反应。
II相代谢涉及缀合，即离子化基团与药物的连接。这些基团包括谷胱甘肽、甲基或乙酰基，它们通常使异生物质更易溶于水且生物活性较低。经常涉及的II相缀合反应由谷胱甘肽S-转移酶(Beckett,G.J.&Hayes,J.D.,Adv.Clin.Chem.30:281-380(1993))、环氧水解酶、磺基转移酶(Falany,CN,Trends Pharmacol.Sci.12:255-59(1991))和UDP-葡萄糖醛酸基转移酶(Bock,KW,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26:129-50(1991))催化。
C，生物转化的位置
异生物质的代谢转化通常本质上是酶促的。尽管所检查的每个组织都有一定的代谢活性，但参与药物生物转化的酶系统位于肝脏中。具有明显代谢能力的其他器官包括胃肠道、肾脏和肺。在非肠胃外给药后，大部分剂量可能会在到达全身循环之前在肠上皮或肝脏中被代谢失活。这种“首过”代谢极大地限制了高代谢药物的口服可用性。(Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,Hardman,JG and Limbird,L.Eds,10th Ed.McGraw-Hill Companies,Inc.,Intl Edn(2001)，12 -15)。
在给定的细胞内，大多数药物代谢活性都存在于内质网和细胞溶质中，尽管线粒体、核膜和质膜中也可能发生药物生物转化。I相反应涉及的酶系统主要位于内质网，而II相缀合酶系统主要位于细胞溶质。通常，通过内质网中I相反应进行生物转化的药物会在相同位置或相同细胞的细胞溶质级分中缀合。
D，细胞色素P450单加氧酶系统
细胞色素P450酶是血红素硫醇盐蛋白的超家族，广泛分布于所有活生物体中。这些酶参与了许多化学上多样化的、内源性和外源性化合物(包括异生物质)的代谢。通常，它们在多组分电子转移链中起末端氧化酶的作用，该链将分子氧的一个原子引入底物中，而另一个原子则掺入水中。在微粒体中，电子是通过细胞色素P450还原酶由NADPH提供的，该酶与光滑内质网脂质膜中的细胞色素P450紧密关联。细胞色素P450催化许多氧化反应，包括芳族和侧链羟基化，N-、O-和S-脱烷基，N-氧化，N-羟基化，硫氧化，脱氨脱卤和脱硫。通常在低氧张力的条件下，这些酶还催化许多还原反应。
人体中约有57种细胞色素P450具有功能活性，其中约40种涉及异生物质代谢。这些分为17个家族和许多亚族。CYP1、CYP2和CYP3家族中大约8至10个同工型主要参与人类所有药物代谢反应的大部分。CYP3A4和CYP3A5共同参与约50％的药物代谢。其他家族的成员在类固醇、脂肪酸、维生素和其他内源性化合物的生物合成和降解中很重要。尽管通常存在相当大的重叠，但基于底物的结构特征，每个单独的CYP亚型似乎都具有特征性的底物特异性。
除CYP酶系统外，用于化学氧化的另一种酶是前列腺素H合酶(PGHS)，也称为环氧酶(COX)，它是花生四烯酸代谢和前列腺素类(例如前列腺素、前列环素和血栓烷)形成中的初始酶。在将内源性底物氢过氧内过氧化物(PGG2)还原为羟基过氧化物(PGH2)的过程中，PGHS酶能够共氧化异生物质。在该反应中，多种化学物质可以用作电子供体，例如酚类化合物、芳族胺和多环芳族烃。与肝脏中许多CYP酶相反，PGHS是肝外组织中涉及异生物质代谢的另一种酶。Vogel,C.,Curr.Drug Metab.(2000)1(4):391-404。
E，水解酶
在人肝、肠和其他组织的内质网中已经鉴定出许多非特异性酯酶和酰胺酶。酯和酰胺水解后暴露的醇和胺基是适合缀合反应的底物。Goodman&Gilman’sThePharmacological Basis of Therapeutics,Hardman,JG and Limbird,L.Eds,10thEd.McGraw-Hill Companies,Inc.,Intl Edn(2001)，12–15。
微粒体环氧化物水解酶基本上存在于所有组织的内质网中，并且与细胞色素P450酶非常接近。环氧化物水解酶通常被认为是一种解毒酶，可以将细胞色素P450氧化反应产生的高反应性芳烃氧化物水解为无活性的水溶性反式二氢二醇代谢物。
糖苷酶和硫酸酯酶是对药物代谢重要的其他水解酶。它们主要代谢包括糖胺聚糖和类固醇的内源性底物，但它们也接受某些异生物质底物，这对于β-葡糖醛酸糖苷酶来说尤其如此。肠道菌群可以使通过胆汁排泄的化合物以葡萄糖醛酸苷或硫酸盐的形式解缀合，解缀合的产物通常从肠中重新吸收，导致肠肝循环。糖苷酶在许多情况下都具有毒性。通常，天然产物的毒性和诱变性被糖苷中的糖部分所掩盖，去糖基化导致其毒性作用。Oesch-Bertlomowicz,F.Oesch,Comprehensive Medicinal Chemistry II(2007)5:193-214。硫酸酯酶催化有机硫酸酯的裂解，从而形成相应的醇和无机硫酸盐。硫酸酯酶催化由SULT作用形成的硫酸酯的水解。已经发现了三类硫酸酯酶，它们通过用于催化的辅因子的类型来区分。I类酶(称为芳基硫酸酯酶)存在于古细菌、细菌和真核生物中，需要钙或镁离子和甲酰甘氨酸(FGly)辅因子。FGly是催化必不可少的残基，几乎仅存在于由半胱氨酸或丝氨酸侧链的翻译后氧化形成的I型硫酸酯酶的活性位点中。Appel,MJ,Bertozzi,C.R.,ACS Chem.Biol.(2015)10(1):72-84。真核硫酸酯酶参与许多过程，例如类固醇、脂质和糖胺聚糖中硫酸酯键的水解。Schepart,E.M.,Broderick,JB,in Comprehensive NaturalProducts II(2010)8:625-661。
蛋白酶和肽酶广泛分布，并参与多肽药物的生物转化。
F.缀合反应
活化形式的内源化合物和合适的转移酶都是形成缀合代谢物所必需的。
G.葡萄糖醛酸化
葡糖醛酸化涉及尿苷5'二磷酸葡糖醛酸与许多可能的官能团之一(例如R-OH、R-NH2、R-COOH等)反应。该反应被存在于许多组织中的UGT(也称为葡萄糖醛酸转移酶)代谢。UGT与细胞色素P450酶一起代表了80％以上的代谢途径。葡萄糖醛酸化的位点通常是富含电子的亲核杂原子(氧、氮或硫)。DeGroot,MJ et al,Comprehensive MedicinalChemistry II(2007)5:809-25。UGT分为两个不同的基因家族：UGT1和UGT2，后者显示出遗传多态性。在人类中，已鉴定出多达16个属于亚家族1A和2B的不同功能性UGT亚型(https://www.pharmacogenomics.pha.ulaval.ca/ugt-alleles-nomenclature/)，它们具有独特但重叠的底物特异性。例如，酚类药物的广泛葡萄糖醛酸化可能成为其口服生物利用度的障碍，因为口服药物的首过葡萄糖醛酸化(或被UGT过早清除)通常导致不良的口服生物利用度和缺乏疗效。Wu,B.et al,J.Pharm.Sci(2011)100(9):3655-81。依泽替米贝和吗啡的葡糖醛酸苷与母体化合物相比是等效或更有效的。在大豆和其他豆类中发现的某些天然异黄酮酚醛酸(例如大豆苷元和染料木黄酮)的葡糖醛酸苷保留了未缀合母体的较弱生物活性，包括雌激素受体结合和自然杀伤细胞活化。
H.磺化
异生物质和小的内源性底物，如类固醇和神经递质的磺化在自然界广泛分布，并存在于从微生物到人类的各种生物中。磺化过程涉及通过磺基转移酶(SULT)催化的磺基(SO3 -)部分通常向受体分子上的羟基的转移。用于这些反应的通用磺酸盐供体是3'-磷酸腺苷5-磷酸磺酸盐(PAPS)。对于大多数异生物质(例如对乙酰氨基酚)和小的内源性底物(例如多巴胺)，通常认为磺化是一种排毒途径，导致更多的水溶性产物，从而有助于它们通过肾脏或胆汁排泄，以及较低的生物活性。例如，对于某些异生物质，例如羟基杂环胺和羟甲基多环芳烃，磺化反应会导致具有高反应性的亲电子试剂，这些亲电子试剂具有诱变性和致癌性。毛发生长刺激剂米诺地尔和神经内分泌肽胆囊收缩素的磺化作用引起其生物学作用，增加其水溶性并降低其生物学活性。Gamage,N.et al,Toxicological Sci.(2006)90(1):5-22。在人类中，已鉴定出三个SULT家族SULT1、SULT2和SULT4，它们至少包含具有不同但重叠的底物特异性的十三个不同成员。SULTS广泛的底物特异性是由于以下事实：这些酶存在多种形式，并且某些同工型的结合位点是可塑性的，从而使该酶可以采用不同的结构，从而可以与小的芳族化合物、L型芳族化合物和稠环化合物相互反应。
I.乙酰化
两种N-乙酰基转移酶(NAT1和NAT2)涉及胺类化合物、肼化合物和磺酰胺化合物的乙酰化。与大多数药物缀合物相比，乙酰化代谢物的水溶性通常低于母体药物。Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,Hardman,JG and Limbird,L.Eds,10th Ed.McGraw-Hill Companies,Inc.,Intl Edn(2001)，12–15。
J.谷胱甘肽S-转移酶
谷胱甘肽S-转移酶催化向谷胱甘肽(GSH)中添加脂肪族、芳香族或杂环自由基以及环氧化物和芳烃氧化物。然后，这些谷胱甘肽缀合物主要通过肾酶被裂解成半胱氨酸衍生物，然后被乙酰化，从而形成N-乙酰基半胱氨酸衍生物。转化为反应性中间体然后与GSH结合的化合物的实例包括但不限于溴苯、氯仿和对乙酰氨基酚。这些毒物可能会消耗GSH。谷胱甘肽的消耗会削弱人体抵抗脂质过氧化的能力。谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是一种氧化还原类酶，它通过谷胱甘肽的氧化催化过氧化氢和有机过氧化物的解毒还原。GSH被氧化成二硫键连接的二聚体(GSSG)，该二聚体被主动泵出细胞，并且在很大程度上无法用于再转变为还原型谷胱甘肽。
GSH也是谷胱甘肽过氧化物酶的辅因子。因此，除非通过其他途径重新合成谷胱甘肽，否则氧化谷胱甘肽的利用与可利用的谷胱甘肽量的减少有关。
谷胱甘肽还原酶(NADPH)是氧化还原酶类的一种黄素酶，对于维持其还原形式的细胞谷胱甘肽至关重要(Carlberg&Mannervick,J.Biol.Chem.250:5475-80(1975))。它在NADPH存在下催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原为还原型谷胱甘肽(GSH)，并在红细胞中维持约500：1的高细胞内GSH/GSSG比。
GSH的合成需要半胱氨酸，这是一种必须从饮食中获取的条件性必需氨基酸，或者必须通过胱硫醚酶途径通过饮食中的蛋氨酸转化而获得。如果半胱氨酸供应充足，则可以维持正常的GSH水平。面对增加的GSH消耗，如果半胱氨酸的供应不足以维持GSH稳态，则会发生GSH耗尽。急性谷胱甘肽耗竭会导致严重的、常常是致命的氧化和/或烷基化损伤，由于服用消耗GSH的药物(如对乙酰氨基酚)或耗尽GSH的疾病和状况而引起的慢性或缓慢出现的GSH缺乏，同样会使人衰弱。
K.还原酶
醛-酮还原酶(AKR)和短链脱氢酶/还原酶(SDR)是催化涉及异生物质羰基的氧化还原反应的主要酶。AKR参与由CYP或其他酶系统通过代谢转化引入的羰基的氧化还原转化，或存在于母体异生物质上。例如，驱动AKR1B研究的主要动力是该酶可能参与高血糖损伤，以及特异性AKR1B1抑制剂有望用于处理糖尿病并发症。Barski,O.A.et al,DrugMetab.Rev.(2008)40(4):553-624。
L，肠道菌群代谢物形成
必须在人类宿主中同时发生且经常竞争的代谢过程的背景下理解异生物质的微生物代谢。口服摄入的化合物通过上消化道到达小肠，在那里它们可以被消化酶修饰并被宿主组织吸收。易吸收的异生物质在小肠上皮细胞之间或通过小肠上皮细胞，在这里它们可被宿主酶处理，然后通过门静脉运输到肝脏。暴露于肝脏中丰富的代谢酶后，异生物质及其代谢物进入全身循环，分布到组织中，并可能影响远端器官。相比之下，静脉内施用的化合物可避免这种“首过”代谢，并立即引入全身循环。循环系统中的化合物最终会进一步代谢和/或排泄，通常是通过胆管回到肠腔(胆汁排泄)或通过肾脏进入尿液。返回肠腔的代谢物可以继续进入大肠，最终在粪便中排泄，或者可能通过肠肝循环被小肠中的宿主细胞重吸收。Koppel,N.et al.,Science(2017)356(6344):1246DOI:10.1126/science.aag2770。
因此，异生物质可能会通过多种途径遇到肠道微生物。与在小肠中吸收的化合物相反，吸收不良的异生物质继续通过小肠进入大肠，并且可能被肠道微生物转化。易吸收的化合物和通过其他途径(例如静脉注射)给药的化合物也可以通过胆汁排泄到达肠道微生物。肠道微生物代谢的产物可以被宿主吸收并全身循环或与衬在胃肠道内的上皮细胞局部相互作用。最终，这些微生物代谢物通过粪便排泄或被肾脏过滤并在尿液中消除。总的来说，人类和微生物的转化产生了一个复杂的、相互交织的代谢网络，该网络既影响微生物群的宿主，又影响微生物群的成员。
与全身吸收后通常的氧化和共轭代谢(conjugative metabolism)相反，肠道细菌的代谢大部分是还原性和水解性的(Klaassen CD and Cui JY,(2015)DrugMetab.Dispos.43:1505–1521)。与异生物质代谢相关的许多酶类别(水解酶、裂解酶、氧化还原酶和转移酶)在此处重点介绍，它们广泛分布于测序的肠道微生物中。因此，很可能异生物质的许多重要转化都可以通过肠道微生物的多个不同系统发育群来进行。但是，至关重要的是要注意，宽泛注释不能预测底物特异性，因为具有高度序列相似性的酶可以催化不同的化学反应。代谢活性也可以不连续地分布在密切相关的菌株中，并通过水平基因转移获得，这使得仅通过系统发育分析来推断肠道微生物的代谢能力就存在问题。Koppel,N.et al.,Science(2017)356(6344):1246；DOI:10.1126/science.aag2770。
因为药物和异生物质代谢的I相酶(包括氧化药物/异生物质的酶)和II相酶(包括促进药物/异生物质与缀合物结合/修饰的酶)的表达和活性是哺乳动物(如人类)的总体药代动力学特征中的主要决定因素，几乎每种药物都需要对其代谢特征进行评估，也就是说，该药物如何通过I相和II相酶代谢。此类酶通常包括肝脏和肠道微生物组中的酶。同样，需要评估可能有毒的异生物质(例如环境中的农药和其他化学污染物)的人体新陈代谢。
人的肠道缺乏一套涵盖所有人类群体的明确定义的核心生物体，但是健康个体中的微生物群具有异生物质代谢的共同功能能力，这些能力是由>1,000个微生物分类单元的不同组合产生的。即使在个体内，尽管一生中成分发生变化，微生物群中的异生物质代谢仍能得到很大程度的维持。这表明，仅通过基因组学就不能轻易推断出肠道微生物群对环境或药理学引起的毒性和疾病易感性的分子基础。这也表明系统发育组成上的个体差异可能不会产生变化的异生物质代谢功能。一个更准确的微生物-异生物质相互作用模型在三个结构水平上考虑异生物质代谢：群落异生物质代谢、分类单元水平异生物质代谢和酶水平异生物质代谢。复杂的异生物质代谢途径通常通过这些层级水平内部和之间的相互作用而出现。在群落水平上，空间和组成结构影响特定分类单元的增殖、活动和生存。在物种水平上，异生物质代谢酶的表达受多种调控机制控制。最后，在酶水平上进行实际的生物转化。
目前，异生物质的代谢主要是通过用异生物质处理肝微粒体提取物，然后测定经过一定温育时间后存在的异生物质的代谢物来确定的。确定代谢物后，可以对异生物质经历的代谢类型做出假设。至于存在的东西，长期以来存在用于确定这些酶家族的蛋白质表达水平的抗体。还有比色法和荧光活性测定法，可提供酶家族活性的读数，但不能提供单个酶的贡献。此外，RNA或蛋白质丰度很少与功能活性水平相关。因此，目前用于评估异生物质代谢的方法不能提供有关单个酶活性贡献的足够信息。此外，目前评估肠道微生物组中异生物质的方法，例如元基因组学和转录组学，可以解决上述三个结构水平中的前两个水平，但本质上无法解决第三个水平。这些技术不足以鉴定负责该活性的生物或酶。例如，解析微生物组功能的一种常用方法是使用一种通用的测定方法来测量群落中的总活性，并使用从群落中获得的元基因组和元转录组来鉴定含量最高的分类单元和酶，然后推断出这些是观察到的累积活性的主要驱动因素(图1)。
许多因素阻碍基因或转录物丰度与酶功能的直接相关性，包括RNA加工和稳定性、必需的翻译后修饰、酶的小分子或氧化抑制作用或必需的蛋白质-蛋白质和辅因子酶相互作用。转录物丰度与酶丰度的相关性低至40％。因此，转录物与酶功能的相关性甚至更低。为了将功能精确地分配给微生物组中的特定分类单元和酶，需要新的方法，特别是可以在所有水平上测量功能活性的方法，如图2所示。
通过抑制、抗生素的使用、宿主饮食、营养不良、持久性有机污染物或其他机制对肠道微异生物质代谢的干扰会导致宿主健康的变化，特别是在肠道群集受损的早期生活中。目前尚不清楚什么是构成良好健康状况的理想微生物组的组成，但越来越多的共识是，微生物组应能够与宿主一起执行一系列代谢功能。已知与异生物质代谢有关的酶家族包括β-葡糖醛酸糖苷酶、偶氮还原酶、硝基还原酶、硫酸酯酶和b-半胱氨酸裂解酶。重要的是，异生物质的暴露可以改变肠道菌群的组成，从而可能改变异生物质代谢的活性。这可能导致复杂的反馈循环。例如，包括有机污染物2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(TCDD)在内的芳烃受体(AhR)激动剂可以改变宿主的新陈代谢和免疫力。最近的证据表明，AhR也可以调节肠道微生物组的组成，C57BL6/J Ahr-/-小鼠的肠道组成和代谢活性也不同。因此，AhR的异生物质活化会改变宿主的代谢和免疫力，从而改变肠道菌群。这可能导致肠道菌群改变异生物质代谢，潜在地破坏生理稳态，并在异生物质诱发的疾病中起作用。需要制定策略来跟踪整个扰动中异生物质代谢的所有水平，以定义微生物群介导的毒性和疾病易感性的功能和分子基础，以改善暴露风险评估，并确定毒性和易感性的功能性生物标志物。本发明人已经开发出这种策略。
尽管微生物与异生物质的相互作用在整体代谢中起着重要作用，但在理解负责的分子机制方面存在知识空白。确实，迄今为止，大多数这种理解都来自使用抗生素处理、悉生动物或体外系统进行的实验，该实验可以确定是否存在整个微生物群的代谢物。这类研究无法通过鉴定活性酶和微生物来提供分子规模的分辨率。元基因组和转录组学研究可以提供这种解决方案；然而，基因的存在或表达并不一定表明产生了蛋白质或该蛋白质具有活性。例如，鉴于纯化的β-葡糖醛酸糖苷酶活性的差异，即使成功翻译的葡糖醛酸糖苷酶也不太可能对葡糖醛酸化的代谢物产生相同的影响。不能仅使用测序技术来识别这些差异，但是与基于活动的策略结合可以阐明微生物群的功能活性种群。本发明人已经开发了一种基于活性的强大策略，该策略直接解决了从推断推向原位功能活性的分子规模测量的需求，并突出了使用化学生物学工具为更全面地理解宿主、微生物群和异生物质如何相互作用提供了途径。
三、探针实施方案
本公开提供基于活性的探针(在本文中也称为“ABP(Activity-Based Probe)”或“探针”)，其有效地定义了微生物群介导的毒性和疾病易感性的功能和分子基础。所公开的ABP实施方案是小分子底物，其在被催化活性靶酶活化后与该酶形成共价键。因为仅当存在活性酶时探针才结合，所以ABP可用于证明裂解物、活细胞或组织中的特定酶活性。例如，考虑到在将靶酶-探针复合物添加至固相支持物之前，可以将包含靶酶的患者样品与探针反应，从而使探针上的可点击官能团可用于与包含可点击官能团的报告分子反应，可直接检测靶酶-探针复合物。备选地，考虑了可以首先通过使探针的可点击的官能团与衍生自可点击的官能团的固相支持物表面反应来固定探针，以将探针附着到固相支持物上，然后使其与包含靶酶的患者样品反应，然后可以使用第二个报告分子间接检测靶酶与探针的结合。因此，本公开内容包括包含如下部分的探针，所述部分有助于将探针粘附至树脂或支持物，或标记探针以使其结合的酶可以通过蛋白质组学富集和测量，和/或标记探针以使其与和其结合的酶可以进行进一步分析(例如，成像、SDS-PAGE或荧光活化的细胞分选(或“FACS”))。
本文所述的ABP具有包含酶结合基团和标签部分(或其前体)的结构，该结构可如上所述用于将探针附着至支持物或树脂，或标记探针(以及其所附着的酶)。根据一些实施方案，ABP可以具有满足通式I的结构，如下所示。
探针与包括人和肠道微生物群靶标的异生物质代谢中涉及的靶酶结合的示例性情景包括但不限于：(1)酶从探针的EBG裂解ERG，产生活化的可与酶结合的EBG；(2)EBG与靶酶的选择性结合，其中探针包含被酶化学修饰的基团，形成另一个基团，该基团随后活化EBG，从而探针可以与酶结合；以及(3)ERG基团被酶置换，使得探针的EBG与酶结合。
关于式I，“EBG”代表酶结合基团，“标签”代表可用于可视化探针的标记部分；“p标签”代表可被转化为标签部分或可用于将探针连接至支持物或树脂的前体部分。如式I所示，一些ABP实施方案可以进一步包含酶-反应性基团(或“ERG”)，但是该基团不必在所有实施方案中都存在。ERG的任选存在由式I中的虚线表示。在存在ERG的实施方案中，它可以是直接或间接连接到EBG的官能团或分子，可以通过酶从EBG上裂解，或者可以通过酶从探针上置换出来。在一些实施方案中，如果存在ERG，则其可以直接或间接地偶联至EBG。在一些实施方案中，EBG可以直接或间接偶联至标签或p标签。短语“直接偶联”是指所提及的基团彼此化学偶联而其间没有任何结合。短语“间接偶联”是指所提及的基团通过另一部分(例如，官能团、连接体或其组合)彼此化学偶联。
根据一些实施方案，式I的EBG可以是在化学修饰后能够结合酶的基团。本文描述了EBG的代表性实施方案。在示例性公开的实施方案中，EBG可以是能够结合化学修饰ERG的相同酶的基团。在一些实施方案中，在酶已经裂解了探针实施方案的ERG之后，EBG变得与酶共价结合。可以裂解ERG或取代ERG的示例性酶包括但不限于能够具有NAD(P)H醌氧化还原酶活性的酶(例如，NAD(P)H醌氧化还原酶)、能够具有醛糖还原酶活性的酶(例如，醛糖还原酶)、葡糖醛酸糖苷酶转移酶、硫酸酯酶、磷酸酶和前列腺素H合酶(PGHS)。
根据一些另外的实施方案，在酶已经化学修饰了EBG的官能团之后(例如，诸如通过还原或氧化EBG的官能团)，EBG变得与酶共价结合。可以通过化学修饰EBG的官能团来活化EBG基团的示例性酶包括但不限于偶氮还原酶，包括但不限于黄素依赖性的NADH优选的偶氮还原酶，黄素依赖性的NADPH优选的偶氮还原酶，无黄素的NADPH优选的将偶氮官能团还原为胺的偶氮还原酶，或将硝基还原为胺的硝基还原酶。
根据一些另外的实施方案，EBG可以通过简单地组合酶和探针而变得与酶共价结合。可以以这种方式与EBG反应的示例性酶包括能够具有β-半胱氨酸裂解酶活性的酶，例如β-半胱氨酸裂解酶。
根据另外的实施方案，在暴露于在EBG内诱导光化学反应的光源之后，EBG可以与酶共价结合，从而它可以与酶的官能团形成共价键。在这样的实施方案中，可以与EBG结合的示例性酶包括但不限于谷胱甘肽S转移酶、葡萄糖醛糖基转移酶和磺基转移酶。
标签(或p标签)部分为探针与酶结合之前或之后进一步修饰探针提供了条件。在包含标签部分的实施方案中，该标签部分可以是报告部分，其能够使用适于与生物样品一起使用的检测技术来检测。合适的标签部分包括可以产生可检测信号的官能团和/或分子，可以使用荧光检测技术、比色检测技术、结合测定技术等来检测该信号。根据示例性公开的实施方案，标签部分可以是例如荧光团、基于亲和力的结合对的结合伴侣、量子点、染料等。例如，标签部分可以是生物素部分、抗生物素蛋白或链霉亲和素部分、荧光素部分、若丹明部分、香豆素部分、奎宁部分或其组合。
根据其中探针包含p标签部分的实施方案，可以进一步修饰p标签部分以提供标签部分和/或可以用于将探针固定到支持物或树脂上。根据这样的实施方案，该p标签部分通常是可以与本身包含标签部分或结合到支持物或树脂上的化学偶联伴侣化学偶联的官能团。例如，p标签部分可包含可点击的官能团，该可点击的官能团可化学偶联至包含标签部分和可点击的官能团的单独化合物(称为含标签化合物)或包含结合在支持物或树脂上的可点击的官能团(称为含支持物的化合物)。可以为标签部分、含标签化合物和/或含支持物的化合物选择的示例性可点击的官能团包括但不限于炔基和叠氮基。含标签化合物可以包含至少一个标签部分，例如荧光团、基于亲和力的结合对的结合伴侣、量子点、染料等。含支持物的化合物可以包含支持物或树脂，例如通常用于生物学分析的支持物或树脂，其中支持物或树脂的官能团直接或间接(例如，共价地)结合到可点击的官能团上。仅作为示例，一些探针实施方案可以包括包含炔的p标签部分。该探针实施方案可与包含标签部分和叠氮化物的含标签化合物或包含载体和叠氮化物的含载体化合物偶联。炔烃和叠氮化物可以通过点击化学反应进行化学偶联，以提供式I所示的标签部分。根据一些此等实施方案，所述标签前体的可点击官能团与含标签化合物不同，也就是说，如果一个包含炔，则另一个包含叠氮化物(反之亦然)，因此可以使用点击化学将两个成分连接起来并形成探针。根据一些实施方案，在探针已经与酶结合之前或之后，点击化学可用于结合p标签部分和相应的含标签化合物或含支持物的化合物。
根据一些实施方案，ABP可包含多个标签部分和/或p标签部分，例如两个或更多个标签部分和/或p标签部分。根据一些这样的实施方案，两个或更多个标签部分和/或p标签部分被附着(直接或间接)到EBG。根据一些实施方案，探针可以包含两个(直接或间接)附着于EBG的标签部分。根据一些这样的实施方案，每个标签部分可以是相同的部分或彼此不同的部分。根据其他实施方案，探针可包含两个(直接或间接)附着于EBG的p标签部分。根据一些这样的实施方案，每个p标签部分可以是相同的部分或彼此不同的部分。仅举例来说，一个p标签部分可包含炔基，另一p标签部分可包含叠氮基；两个p标签部分的每一个可以包含炔基；或两个p标签部分中的每个可包含叠氮基团。根据其他实施方案，探针可以包含一个标签部分和一个p标签部分。
根据一些实施方案，探针可以具有满足以下式II的结构。
关于式II，ERG(如果存在的话)是可以被酶裂解或置换为EBG的官能团或分子；该EBG是能够与参与II相代谢的酶共价键合或存在于肠道微生物组中的官能团；连接体a包括脂族基、杂脂族基、芳族基、脂族基-芳族基、杂脂族基-芳族基、杂芳族基、脂族基-杂芳族基或杂脂族基-杂芳族基；连接体a以及连接体c(当存在时)各自独立地可以包含脂族基团、杂脂族基团、芳族基团、脂族基-芳族基、杂脂族基-芳族基、杂芳族基团、脂族基-杂芳族基或杂脂族基-杂芳族基；每个标签部分(如果存在的话)独立地是能够产生可检测信号的官能团(或分子)；每个p标签部分(如果存在，例如当不存在标签时)包含可点击的官能团；n、m、p和q各自可以分别为0或1。在n、m、p和q中的任何一个或多个为0的实施方案中，则不存在用n、m、p或q限定的基团，以前间接偶联在一起的基团现在可以直接偶联(例如，EBG-标签(或p标签))。在q为0的实施方案中，连接体a直接连接至所示的标签部分或p标签部分。
在n为1的示例性实施方案中，ERG存在并结合至EBG。根据一些这样的实施方案，ERG是可以例如通过酶从EBG基团裂解或置换的官能团或分子。可以酶促裂解的ERG包括但不限于葡糖醛酸部分、葡糖醛酸衍生物(例如氮丙啶官能化的葡糖醛酸基团，例如)、硫酸盐(或磺酸)部分、磷酸盐(或磷酸)部分等。可以被酶置换的代表性ERG包括但不限于卤素(例如I、Cl、F或Br)或式-OPh的含酚基团，其中Ph基团任选地包含一个或多个氢以外的取代基。在示例性公开的实施方案中，ERG选自葡萄糖醛酸/>葡萄糖醛酸衍生物，在酶促裂解之前，连接到包含氮原子的ERG上，该氮原子与葡萄糖醛酸部分形成氮丙啶环；硫酸盐(或其质子化形式)；磷酸盐(或其质子化形式)；碘或-OPh，相对于-OPh基团的氧原子，在苯环的邻位、间位或对位任选包含-CH2ONO2基团。
在示例性公开的实施方案中，EBG包含以下官能团：(a)能够被最终与之共价结合的酶化学修饰；或(b)在酶裂解连接到EBG的ERG之后，能够被活化以与相同的酶反应；或(c)在酶取代附着在EBG上的ERG之后能够与该酶结合；或(d)在暴露于光源后能够被活化以与酶反应；或(e)在暴露于酶后能够与该酶结合。在示例性公开的实施方案中，EBG可包含偶氮基、硝基、能够形成邻或对醌甲基化物的邻或对取代的酚基、烯烃、酰胺、二氯二酮基或苄基羰基。
根据一些实施方案，EBG具有满足一个或多个如下式所示的式IIAEBG-IIJEBG的结构。仅出于示例性目的，示出了探针的附加组件(例如连接体a、连接体c和/或ERG)以示出连接性。
/>
其中Y′为O(在这种情况下存在ERG)、-N＝NR″(其中R″为染料或其他报告部分)或硝基；m是0至5的整数；每个R'独立地选自醛、酮、酯、羧酸、酰基、酰基卤、氰基、磺酸基、硝基、亚硝基、季胺、CF3、烷基卤或其组合；
其中Y是-CH3或-CF3；
/>
根据一些实施方案，连接体a可以包含环氧烷、胺、酰胺、酯、-(CH2)n’-基团(其中n'是1到50的整数，例如1到25或1到10或1到5，或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50)或其任意组合。在示例性公开的实施方案中，连接体a可具有满足式IIA连接体a-IIG连接体a中的任何一个或多个的结构。仅出于示例性目的，示出了探针的其他组分(例如，EBG、R、标签(或p标签)和/或连接体b)以显示连接性。
其中n'是1至50的整数，例如1至25，或1至10，或1至5；或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50；
其中n'是0至50的整数，例如1至25，或1至10，或1至5，或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，并且Z是氧或NR”'，其中R”'是氢、脂族基或芳族基；
其中n'是1至50的整数，例如1至25，或1至10，或1至5，或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，并且Z是氧或NR”'，其中R”'是氢、脂族基或芳族基；
其中n'是1至50的整数，例如1至25，或1至10，或1至5，或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，并且Z是氧或NR”'，其中R”'是氢、脂族基或芳族基；
其中每个n'独立地是1至50的整数，例如1至25，或1至10，或1至5，或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，且Q为CH2、O或NR”'，其中R”'是氢、脂族基或芳族基；或
/>
在包含连接体b的实施方案中，该部分可以包含-(CH2)n’-基团(其中n'是1至50的整数，例如1至25，或1至10，或1至5，或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50)、酰胺基或其任何组合。在示例性公开的实施方案中，连接体b基团可以是-(CH2)n’-基团，其中n'是1至5(1、2、3、4或5)，或-C(O)NR”'CH2-，其中羰基部分连接至连接体b，亚甲基部分连接至标签(或p标签)，且其中R”'为氢、脂族基或芳族基。
在包含连接体c的实施方案中，该部分可以包含酰胺、脂族基、环氧烷基或其任何组合。在示例性公开的实施方案中，连接体c可以具有满足以下所示的式IIA连接体c或IIB连接体c的结构。仅出于示例性目的，示出了探针的其他组分(例如，EBG、R、标签(或p标签)和/或连接体a)以显示连接性。
其中n'是0至50的整数，例如1至25，或1至10，或1至5，或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，且Z为氧或NR”'，其中R”'为氢、脂族基或芳香族基；
其中n'是0到50的整数，例如1到25，或1到10，或1到5，或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，Z是氧或NR”'，其中R”'是氢、脂族基或芳族基。
在探针包含R基团的实施方案中，R基团可以是包含将R基团连接至连接体a的氨基甲酸酯或碳酸酯的基团。在示例性公开的实施方案中，R基团可具有满足式IIAR-IICR中的任何一个或多个的结构。仅出于示例性目的，示出了探针的附加组件(例如，EBG、连接体a和/或连接体b)以显示连接性。
其中Z和Z'独立地是氧或NR”'，其中R”'是氢、脂族基或芳基族；
其中Z和Z'独立地是氧或NR”'，其中R”'是氢、脂族基或芳族基；
其中Z和Z'独立地为氧或NR”'，其中R”'为氢、脂族基或芳族基，且n'为0至50的整数，例如1至25，或1至10，或1至5；或者
在示例性公开的实施例中，探针可以具有选自以下所示的任何结构的结构。
/>
/>
/>
(其中n'如上所述)
根据一些实施方案，探针可以具有满足式IIIA的结构。
关于式IIIA，可以使用以下列举的取代基：
ERG，如果存在的话，可以是卤素、苯酚、硫酸酯、磷酸酯、葡糖醛酸或葡糖醛酸基团，其中两个羟基已被EBG的氮原子取代而形成氮丙啶；
EBG可以是包含二氯二酮基、酚基、烯烃、偶氮基、酰胺基、羰基、硝基或碳原子的部分；
连接体a和连接体c各自可以如上式II所述；
每个标签(如果存在)独立地可以是产生可检测信号的官能团或分子；或者，如果探针包含p标签(“标签前体”)，则每个p标签独立地可以是包含可点击的官能团的标签前体；和
m可以是0或1。
在式IIIA的示例性公开实施方案中，可以适用以下内容：
存在ERG并且其选自碘、-OPh，其中Ph基团可任选地包含一个或多个除氢以外的取代基，例如-CH2ONO2基团或葡糖醛酸基团，其中两个羟基已被EBG的氮原子取代形成氮丙啶；
EBG选自式IIAEBG、IIBEBG、IICEBG、IIDEBG、IIEEBG、IIGEBG、IIHEBG、IIIEBG或IIJEBG；
连接体a是酯基、-(CH2)n’-基、-O(CH2)n’NR”'C(O)(CH2)n’-基，其中每个n′独立地是1至20的整数，例如1至10，或1至5，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，其中R”'是氢、脂族基或芳族基；
连接体c是–NR”'C(O)(CH2)n’-基团或–NR”'C(O)CH2[O(CH2)2]n’OCH2-基团，其中每个n'独立地是1到20的整数，例如1到10，或1到5，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，其中R”'为氢、脂族基或芳族基；
如果存在，每个标签可以是荧光团、基于亲和力的结合对的结合伴侣、量子点或染料；或者，如果存在p标签基团，则每个p标签独立地为炔或叠氮化物；且
m是1。
在示例性公开的实施方案中，满足式IIIA的化合物可以选自以下所示的含叠氮和炔基的化合物。
/>
/>
/>
在一些实施方案中，探针可以具有满足式IIIB的结构。
关于式IIIB，可以应用以下列举的取代基：
EBG可以是光可活化的酶结合基团，其在如本文所述将EBG暴露于光源后变得与酶结合；
连接体a可以是苯基，或者可以具有满足式IID连接体a的结构；
连接体b为-(CH2)n’-，其中n'为1至5的整数；
如果存在，标签可以是产生可检测信号的官能团或分子；或者，如果探针包含p标签(“标签前体”)，则p标签可以是包含可点击的官能团的标签前体；且
R可以具有满足式IIAR、式IIBR或式IICR的结构。
在式IIIB的一些示例性实施方案中，可以应用以下列举的取代基：
EBG可以是二氮丙啶(diaziridine)，例如或二苯甲酮(例如
连接体a可以是苯基或
连接体b可以是-(CH2)n’-或-(CH2)m[O(CH2)2]n’OCH2-，其中每个m独立地为0或1，以及每个n'独立地为1至50，例如1至25，或1至10，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50；
如果存在，标签可以是荧光团、基于亲和力的结合对的结合伴侣、量子点或染料；或者，如果存在p标签基团，则该p标签是炔烃或叠氮化物；和
R可以选自以下结构：
其中n'是0到50的整数，例如1到25，或1到10，或者0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
在示例性公开的实施方案中，满足式IIIB的化合物可以选自以下所示的化合物。
/>
独立地，该探针不选自以下所示的任何化合物。
其中R是然而这些化合物可能被用于本文所述方法。
A.β-葡糖醛酸糖苷酶和葡萄糖醛酸转移酶探针的实施方案
肠道微生物组调节的一种途径是葡萄糖醛酸化。葡萄糖醛酸化促进了哺乳动物的II相代谢和异生物质的清除，这是由于葡糖醛酸与异生物质和内源性代谢物的结合介导的，从而增加了它们的溶解度。肠道中存在的微生物β-葡糖醛酸糖苷酶可将该缀合物水解回母体化合物，从而导致药效学改变、处理失败或严重的副作用。最近的工作已经确定了保守的基序，以改善β-葡糖醛酸糖苷酶的注释(在生物信息学中，意味着对生物学相关特征的阐明和描述；有关生物序列的信息的文本字段，这些文本字段通过解释或评论方式添加到序列数据库中)；然而，这些基因在肠道菌群的成员中广泛分布，这使得在去葡糖醛酸化中有活性的特定分类单元的预测变得极为困难。
为了解决表征II相代谢和肠微生物组中的功能活性的挑战，发明人已经开发了对β-葡糖醛酸糖苷酶特异的ABP实施方案。根据一些实施方案，这些ABP实施方案可以具有满足如上所述的式II或式IIA的结构；在示例性公开的实施方案中，这些ABP具有也满足以下式IVA、IVB或IVC的结构。在满足式IVA的实施方案中，当活性葡糖醛酸糖苷酶与探针反应时，亲电邻苯二甲酰甲基形成并被酶的附近亲核残基攻击，从而在反应基团和酶之间形成共价键。在满足式IVC的实施方案中，酶与探针的结合产生荧光开启响应。如上所述，探针的炔烃手柄可通过点击化学作用实现标签附着和/或支撑或树脂附着。
活化和荧光开启响应
参考这些分子式，每个标签部分(如果存在)和/或每个p标签部分(如果存在)可以独立地如上对于任何上述分子式所述，并且连接体a和连接体c可以各自为对于以上任何一个分子式所述。根据一些实施方案，连接体a和连接体c各自可以独立地选自-CH2[O(CH2)2]n’OCH2-、-(CH2)n’-、或-(CH2)n’Ph-，其中每个n'独立地可以是1到50的整数，例如1到25或1到10，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。变量m'可以为1或零。在其中m为零的实施方案中，不存在碳2，且碳1连接至连接体a基团。此类探针的代表性实施方案如下所述，并且不限于特定理论，图3中示出了如何活化此类探针用于酶偶联的示例性机制。在以下结构中使用虚线键(即“---”)的情况下，这表示与虚线键连接的氟原子是任选存在的(当不存在时，存在氢原子)。
/>
发明人还开发了可用于特异性结合葡糖醛酸糖基转移酶的ABP实施方案，它是用于目前不存在不可逆抑制剂的酶。葡萄糖醛糖基转移酶是参与药物和其他异生物质的II相代谢的酶。通过靶向并与这些特定酶之一形成不可逆键，本文所述的探针实施方案可用于确定或影响这些II相酶的活性。能够结合葡糖醛酸糖基转移酶的探针可以具有满足如上所述的式II或式IIB的结构。在示例性公开的实施方案中，这些探针还可具有满足以下所示的式VA-VC中的任何一个或多个的结构。这些探针包含可以被光活化、然后与酶结合的ERG。可以被光活化的基团包括但不限于二苯甲酮基和二氮丙啶基(例如，脂族二氮丙啶和三氟甲基苯基二氮丙啶)。
/>
关于式VA、VB和VC中的每一个，标签(如果存在)或p标签(如果存在)可以独立地如以上对于式IIIB所述；n可以是0至50的整数，例如1至25，或1至10，或1至5；并且m可以为1或零。
可以不可逆地结合葡糖醛酸糖基转移酶(例如UDP-葡糖醛酸糖基转移酶)的代表性探针实施方案如下所示。
/>
其中每个n'独立地从0到50，或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
B.谷胱甘肽S-转移酶探针实施方案
谷胱甘肽S-转移酶(GST)按其亚细胞位置分为细胞溶质、线粒体和微粒体超家族，根据序列同源性进一步分为几类。GST包含结合GSH的“G”位点和结合底物的“H”位点。通过转录组学和/或整体蛋白质组学测量的GST的表达通常与其解毒GSH转移酶活性无关。表达和活性之间的这种差异可归因于已知的翻译后修饰、替代的酶特异性非转移酶活性以及改变蛋白-蛋白相互作用的活性。
GST的GSH转移酶活性依赖于结合GSH的G位点和结合底物的H位点的活性(见图4)。本文描述的某些探针实施方案可以靶向每个位点并测量GST的活性，代表性实例在图4中示出。示例性的探针实施方案具有满足以下式VIA或VIB中任一项的结构。
关于式VIA和VIB，可以采用以下列举的取代基：
每个X独立地可以是卤素；
连接体a可包含脂族基团、杂脂族基团、芳族基团、脂族基-芳族基、杂脂族基-芳族基、杂芳族基团、脂族基-杂芳族基或杂脂族基-杂芳族基；
如果存在，标签可以是产生可检测信号的官能团或分子；或者，如果探针包含p标签(“标签前体”)，则标签可以是包含可点击的官能团的标签前体；和
关于式IIIE，Y可以是卤素或谷胱甘肽部分。
在示例性公开的实施方案中，可以应用以下列举的取代基：
每个X是氯；
连接体a是–NR”'C(O)(CH2)n’-或–NR”'C(O)CH2[O(CH2)2]n’OCH2-，其中每个n′独立地是1至20的整数，例如1至10，或1至5，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，其中R”'为氢、脂族基或芳族基；
如果存在，标签可以是荧光团、基于亲和力的结合对的结合伴侣、量子点或染料；或者，如果存在p标签基团，则p标签为炔或叠氮化物；
关于式VIB，Y可以是氯或谷胱甘肽。
在示例性公开的实施方案中，探针可具有根据以下所示的式VIC的结构。
对于式VIC，连接体a可以如上式IIG连接体a所示；EBG可以是可光活化的基团，例如二氮丙啶或二苯甲酮；连接基b可包含酰胺。标签(如果存在)或p标签(如果存在)可以独立地如上所述。
可以不可逆地结合谷胱甘肽转移酶的示例性的含叠氮或炔的探针实施方案如下所示。
/>
C.还原酶探针实施方案
根据一些实施方案，ABP可以是与还原酶选择性结合的探针，所述还原酶诸如偶氮还原酶、硝基还原酶、NAD(P)H醌氧化还原酶或醛糖酮还原酶(AKR)。此类探针实施方案可具有满足上述一个或多个式，例如式II或式IIIA的结构。
根据一些实施方案，所述探针包含选择性结合偶氮还原酶的EBG。这样的探针实施方案包含首先被偶氮还原酶化学修饰以形成胺的偶氮基团，其由此活化EBG(例如，例如通过形成活化的醌甲基化物物质)，使得偶氮还原酶可以结合至探针。可以结合偶氮还原酶的示例性探针实施方案如下所示。在不限于任何特定理论的情况下，在图3中示出了用于活化此类探针实施方案以进行酶偶联的示例性机制。
根据另外的实施方案，探针包含选择性结合硝基还原酶的EBG。这样的探针实施方案包含可以被硝基还原酶还原成胺的硝基，从而可以形成与上述偶氮还原酶探针实施方案相似的活化的醌甲基化物。有效地靶向硝基还原酶的探针的示例性实施方案如下所示。在不限于特定理论的情况下，在图3中示出了用于活化此类探针实施方案以进行酶偶联的示例性机制。
根据一些实施方案，所述探针包含与NAD(P)H醌氧化还原酶选择性结合的EBG。这样的探针实施方案还包含被NAD(P)H醌氧化还原酶置换的ERG基团。根据一些实施方案，ERG可以是通过酯键与EBG结合的酚基。酚类ERG可以被NAD(P)H醌氧化还原酶置换，从而使EBG与NAD(P)H醌氧化还原酶结合。
下面示出了这种探针的示例性实施例。
根据一些实施方案，下文所述的探针还可以与本文所述的一种或多种其他探针组合用于与NAD(P)H醌氧化还原酶结合。
根据一些实施方案，探针包含选择性结合醛酮还原酶(AKR)活性位点半胱氨酸残基的EBG。这样的探针实施方案还包含被醛酮还原酶切割的ERG基团。根据一些实施方案，ERG基团可以是被醛酮还原酶的半胱氨酸基团置换的反应性碘基团。下面示出了这种探针的示例性实施例。
D.硫酸酯酶和磺基转移酶探针实施方案
本文还描述可以选择性和不可逆地结合硫酸酯酶和磺基转移酶的探针实施方案。可以结合硫酸酯酶的探针实施方案包括ERG，其首先被硫酸酯酶从探针的EBG上裂解下来。这产生可以与硫酸酯酶结合的活化的ERG(例如，醌甲基化物基团)。合适的探针可以具有满足如上所述的式II和/或式IIIA的结构。靶向硫酸酯酶的示例性探针实施方案包括以下所示的那些。不受任何特定理论的限制，图3中示出了如何活化此类探针实施方案用于酶偶联的示例性机制。
根据一些另外的实施方案，探针可以选择性地结合磺基转移酶。在这样的实施方案中，探针包含光反应性EBG，其可以被光活化然后结合到酶上。如上所述，光反应性EBG可包含二苯甲酮部分或二氮丙啶部分。合适的探针可以具有满足如上所述的式IIIC的结构。可以用于结合磺基转移酶的示例性探针实施方案如下所示。
E.半胱氨酸裂解酶探针实施方案
根据一些实施方案，探针可以选择性地结合半胱氨酸裂解酶，该半胱氨酸裂解酶是在肠道微生物组中有活性的酶。这样的探针实施方案包含与半胱氨酸裂解酶的半胱氨酸部分形成共价键的含烯烃的EBG。在示例性公开的实施方案中，EBG包含与裂解酶的半胱氨酸部分的硫原子共价结合的烯烃。合适的探针可以具有满足如上所述的式II或式IIA的结构。以下提供了示例性的半胱氨酸裂解酶探针实施方案。不受任何特定理论的限制，图3中示出了如何活化此类探针实施方案用于酶偶联的示例性机制。
F.前列腺素H合酶(PGHS)探针实施方案
根据一些实施方案，探针可以选择性地结合PGHS，PGHS是在II相代谢中具有活性的酶。这样的探针实施方案包含被PGHS酶置换的ERG，从而通过EBG将探针偶联至酶。合适的探针可以具有满足如上所述的式II或式IIIA的结构。
以下提供了示例性的PGHS探针实施方案。
IV，制备探针实施方案的方法
下面提供用于制造本公开的基于活性的探针的方法的示例性实施方案。应该理解的是，即使没有明确叙述，也可以使用适合于某些实施方案的合适的试剂。
在一个示例性实施方案中，用于制备基于活性的探针的方法可包括以下方案1中所示的步骤。
方案1
方案1中所示的上述方法的示例性实施方案如下在方案2、方案3A和3B所示。
方案2
方案3A
方案3B
在一些示例性实施例中，该方法可以包括以下方案4中所示的步骤。参考方案4，“PG”表示可用于保护含硝基起始原料的酚基的保护基。利用本公开的益处，本领域普通技术人员将认识到用于转化被保护的苯酚的醛的合适的还原剂以及用于将所得的伯醇与含酰胺的偶联配偶体偶联的偶联条件。
方案4
下面方案中显示了方案4中上述方法的示例性实施方案。
方案5另外的示例性实施例在下面的方案6-8中示出。
方案6
/>
方案7
方案8
根据一些实施方案，可以使用以下方案9中所述的方法来制备探针实施方案。参考方案9，包含可光活化的EBG的前体，例如方案9中所示的起始结构，使用酰胺偶联剂与合适的酰胺偶联配偶体，例如包含如所示的炔丙基胺的炔基的胺反应。在适合于除去胺保护基团(例如Fmoc)的条件下，例如通过使用碱(例如哌啶)，将所得酰胺产物的被保护的胺去保护。将所得的伯胺产物与碘乙酸酐偶联以形成碘乙酰胺产物(例如化合物5)。然后将碘乙酰胺产物顺式与还原的谷胱甘肽部分偶联以形成探针(例如，探针GSH-ABP-G)。
方案9
方案10中显示了另一种示例性方法。
方案10
方案11中示出了另一示例性方法。
方案11
参考方案11，可以使用的条件包括：a)(i)TrCl，Et3N，DMAP，DMF，(ii)NaH，BnBr，TBAI，DMF，0℃至室温；(iii)p-TsOH，MeOH，CH2Cl2；b)I2，PPh3，咪唑，THF，70℃；c)锌粉，THF/H2O(9：1)，超声处理，40℃；d)化合物5，铟粉，La(OTf)3，H2O，超声处理；e)第二代格鲁布斯催化剂，CH2Cl2，40℃；f)(i)DIBAL-H，THF，0℃至室温，(ii)NaBH4，H2O，EtOAc；g)(i)Cl3CN，DBU，CH2Cl2，0℃，(ii)I2，NaHCO3，H2O；h)(i)37％HCl，二噁烷，60℃，(ii)NaHCO3，MeOH，60％，i)Li，NH3，THF，-60℃；j)K2CO3，DMF，进一步包含卤素的任何含叠氮化物或炔的基团，80℃；k)TEMPO，NaClO，NaBr，NaOH，H2O。
方案12中显示了另一种示例性方法。
方案12
方案13中显示了另一种示例性方法。
方案13
下面在方案14中示出了用于制造本公开的探针实施方案的另一种示例性方法。
方案14
五、示例性方法
基于活性的探针可以用于以下示例性方法中。例如，根据一个方面，本公开提供一种检测和测量获自受试者的样品中异生物质代谢的一种或多种靶酶的活性的方法。这样的方法可以包括：(a)从受试者获得样品；和(b)检测样品中靶酶的活性，通过(i)使样品与通过点击化学活化的能有效地特异性和不可逆地结合靶酶的活性探针接触；(ii)测量活性探针与靶酶之间的结合。
例如，根据另一方面，本公开提供一种用于确定个体的酶对受试者的肠道菌群对异生物质代谢的贡献的方法。这样的方法可以包括：(a)使异生物质与从受试者获得的样品接触；(b)将样品与异生物质一起温育一个温育期；(c)将样品暴露于一种或多种差异标记的酶活性探针，通过使样品与通过点击化学活化的每种酶活性探针接触，每种酶均有效地特异性和不可逆地结合其靶酶；(d)与对照相比，检测每个活性探针与其靶酶之间的结合，测量结合或两者；和(e)确定各个靶酶对异生物质代谢的贡献。
例如，根据另一方面，本公开提供一种在需要其的受试者中诊断和处理由于异生物质的代谢而引起的微生物群介导的毒性的方法。这种方法可以包括：(a)使异生物质与获自受试者的样品接触；(b)将样品与异生物质一起温育一个温育期；(c)将样品暴露于一种或多种差异标记的酶活性探针，通过使样品与通过点击化学活化的每种酶活性探针接触，每种酶活性探针均有效地特异性和不可逆地结合其靶酶；(d)与对照相比，检测和测量每种活性探针与其靶宿主酶和靶微生物菌群的结合；(e)诊断受试者的微生物群诱导的毒性；(f)用有效地(i)调节微生物群和(ii)降低毒性的抗菌剂处理受试者。
根据一些实施方案，术语“抗菌剂”是指具有抑制细菌和其他微生物的生长或破坏其能力的化学物质中的任何一种，其主要用于处理传染病。抗菌剂包括但不限于青霉素、头孢菌素、羧苄青霉素、头孢霉素、碳青霉烯、单杆菌酰胺、氨基糖苷、糖肽、喹诺酮、四环素、大环内酯和氟喹诺酮。实例包括但不限于青霉素G、甲氧西林、纳夫西林、奥沙西林、氯西林、双氯西林、氨苄西林、阿莫西林、替卡西林、羧苄青霉素、美洛西林、阿奇洛林、哌拉西林、亚胺培南、氨曲南、头孢噻吩、头孢克洛、头孢西丁、头孢呋辛、头孢尼考、头孢美唑、头孢替坦、头孢曲唑、氯碳头孢、头孢他美、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、头孢克肟、头孢泊肟、头孢磺啶、氟罗沙星、萘啶酸、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星依诺沙星、洛美沙星、西诺沙星、强力霉素、米诺环素、四环素、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素奈替米星、妥布霉素、链霉素阿奇霉素克拉霉素、红霉素、依司红霉素、红霉素琥珀酸乙酯、红霉素葡庚糖酸盐、乳酸红霉素、硬脂酸红霉素、万古霉素、替考拉宁、氯霉素、克林霉素、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑、呋喃妥因、利福平、莫匹罗星、甲硝唑、头孢氨苄、罗红霉素、复方含氧尿酸、哌拉西林和他唑巴坦的组合，及其各种盐、酸、碱和其他衍生物。
根据一些实施方案，该方法可用于确定肠道微生物组中的I相和II相酶和肠道微生物组中的酶如何代谢药物和其他异生物质，药物和异生物质如何抑制(或活化)此类酶，以及受试者的扰动(例如肥胖、化学暴露、发育阶段等)如何有效影响I相和II相代谢和/或肠道微生物组。
根据一些实施方案，靶酶是在I相异生物质代谢中有活性的酶。根据一些实施方案，靶酶是在II相异生物质代谢中有活性的酶。根据一些实施方案，靶酶是选自以下中的一种或多种：β-葡糖醛酸糖苷酶和葡糖醛酸糖基转移酶，谷胱甘肽S转移酶，还原酶，例如偶氮还原酶、硝基还原酶、NAD(P)H醌氧化还原酶或醛酮还原酶(AKR)，硫酸酯酶和磺基转移酶，半胱氨酸裂解酶和前列腺素H合酶。根据一些实施方案，靶酶是哺乳动物来源的、微生物组来源的或两者。根据一些实施方案，对于需要先活化的酶才能表现出催化活性，该方法进一步包括将样品暴露于用作酶活化剂的化合物(例如NADPH)，以便于探针与酶的缀合。
根据一些实施方案，异生物质代谢的酶是β-葡糖醛酸糖苷酶，所述探针是式IVA、IVB或IVC的β-葡糖醛酸糖苷特异性探针：
根据一些实施方案，式IVA或IVB的β-葡糖醛酸糖苷酶特异性探针选自：
/>
根据一些实施方案，异生物质代谢的酶是葡糖醛酸糖基转移酶(例如UDP-葡糖醛酸糖基转移酶)，并且探针是式II、式IIIB、式VA、VB或VC的葡糖醛酸糖基转移酶特异性探针。
根据一些实施方案，葡糖醛酸糖基转移酶特异性探针选自：
其中每个n'独立地从0到50，或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
根据一些实施方案，异生物质代谢的酶是谷胱甘肽S-转移酶并且探针是式VIA、式VIB或式VIC的谷胱甘肽S-转移酶特异性探针：
根据一些实施方案，谷胱甘肽S-转移酶特异性探针选自：
/>
根据一些实施方案，异生物质代谢的酶是还原酶，例如偶氮还原酶、硝基还原酶、NAD(P)H醌氧化还原酶或醛糖酮还原酶(AKR)，并且该探针是还原酶特异性探针。根据一些实施方案，所述探针是式II或式IIIA的还原酶特异性探针。
根据一些实施方案，在酶为偶氮还原酶的情况下，探针包含首先被偶氮还原酶化学修饰以形成胺的偶氮基，其活化酶结合基团以形成活化的醌甲基化物，使得偶氮还原酶可以与探针结合。
根据一些实施方案，偶氮还原酶特异性探针选自：
/>
根据一些实施方案，在酶是硝基还原酶的情况下，探针包含可以被硝基还原酶还原成胺的硝基，其活化酶结合基团以形成活化的醌甲基化物，使得硝基还原酶可以与探针结合。
根据一些实施方案，所述硝基还原酶特异性探针选自：
根据一些实施方案，该酶是NAD(P)H醌氧化还原酶，并且该探针包含与NAD(P)H醌氧化还原酶选择性结合的EBG和可以被NAD(P)H醌氧化还原酶置换的酚类ERG基团。
根据一些实施方案，NAD(P)H醌氧化还原酶特异性探针选自
根据一些实施方案，所述酶是醛酮还原酶，并且所述醛酮还原酶特异性探针包含EBG，其选择性地结合醛酮还原酶的活性位点半胱氨酸残基。
根据一些实施方案，醛酮还原酶特异性探针选自：
根据一些实施方案，异生物质代谢的酶是硫酸酯酶和磺基转移酶，探针是硫酸酯酶和磺基转移酶特异性探针。根据一些实施方案，所述探针是硫酸酯酶和磺基转移酶特异性探针，其包含ERG，所述ERG首先被所述硫酸酯酶从所述探针的EBG裂解。
根据一些实施方案，硫酸酯酶和磺基转移酶特异性探针选自：
根据一些实施方案，异生物质代谢的酶是微生物组来源的半胱氨酸裂解酶，并且探针是半胱氨酸裂解酶特异性探针。根据一些实施方案，半胱氨酸裂解酶特异性探针包含与半胱氨酸裂解酶的半胱氨酸部分形成共价键的含烯烃的酶结合基团。根据一些实施方案，半胱氨酸裂解酶特异性探针具有式II或式IIIA。
根据一些实施方案，半胱氨酸裂解酶特异性探针选自：
根据一些实施方案，所述酶是前列腺素H合酶，所述探针是前列腺素H合酶特异性探针。根据一些实施方案，前列腺素H合酶特异性探针包含被前列腺素H合酶置换的ERG，从而通过EBG将探针偶联至酶。根据一些实施方案，前列腺素H合酶探针选自：
根据一些实施方案，该受试者是哺乳动物受试者。根据一些实施方案，哺乳动物受试者是小鼠。根据一些实施方案，哺乳动物受试者是人。根据一些实施方案，哺乳动物受试者是非人灵长类动物。
根据一些实施方案，可以在受试者暴露于异生物质后从受试者获得样品，然后可以将对异生物质代谢有贡献的任何酶与未暴露的对照进行比较。根据一些实施方案，样品可以是生物样品，例如细胞样品(或其提取物，例如一种包含蛋白质的提取物)、器官样品(或其提取物)或细菌样品(或其提取物)。根据一些实施方案，所述接触是体外的，例如人肝微粒体。根据一些实施方案，样品衍生自身体组织、体液或身体废物中的一种或多种。
根据一些实施方案，异生物质是食物、饮食补充剂、致癌物、有毒物或药物。根据一些实施方案，异生物质是有毒的。示例性有毒物包括但不限于香烟烟雾(主动或被动)，其可包括亚硝胺、醛和一氧化碳；溴苯；氯仿；对乙酰氨基酚；杀虫剂(例如2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(TCDD)；多环芳烃(PAH)，意味着在不完全燃烧或热解有机物质期间形成的广泛环境污染物，例如苯并[a]芘(典型致癌的PAH)，和二苯并[def,p](DBC)(一种不那么普遍但高效的经胎盘的致癌PAH)，两者均被细胞色素P450酶超家族的同工型代谢活化，从而形成反应性致癌和细胞毒性代谢物。
根据一些实施方案，样品与基于活性的探针的温育时间是足以使探针与其靶酶发生化学相互作用以使得探针与靶酶特异性结合从而形成探针-酶缀合物的一段时间，例如至少2分钟，至少3分钟，至少4分钟，至少5分钟，至少6分钟，至少7分钟，至少8分钟，至少9分钟，至少10分钟，至少11分钟，至少12分钟，至少13分钟，至少14分钟，至少15分钟，至少16分钟，至少17分钟，至少18分钟，至少19分钟，至少20分钟，至少21分钟，至少22分钟，至少23分钟，至少24分钟，至少25分钟，至少26分钟，至少27分钟，至少28分钟，至少29分钟，至少30分钟，例如2至60分钟，2至30分钟，2至10分钟，5至10分钟或5至15分钟。
根据一些实施方案，基于活性的探针与靶酶的结合是用光进行光活化。根据一些实施例，光源提供UV光，诸如具有范围从10nm至400nm，或从10nm至370nm，或从10nm至365nm的波长的光。
根据一些实施方案，检测、测量或两者均通过与酶结合的探针发出的信号进行。根据一些实施方案，例如通过生物素-亲和素或酶报告基团(碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)与酶特异性探针的结合来增强或放大信号。根据一些实施方案，通过一种或多种荧光(例如，荧光凝胶分析、荧光活化的细胞分选、流式细胞术、量子点分析)、比色法基因组测序或质谱来检测与酶结合的探针。根据一些实施例，本文描述的方法可以与本领域中通常使用的、如图5中示意性地示出的检测技术相结合。
根据一些实施方案，基于活性的探针进一步包含含标签的化合物。根据一些实施方案，探针的p标签部分有效地将该探针附于支持物或树脂上。根据一些这样的实施方案，所述支持物或树脂可包含或可被改性以包含可点击的官能团。因此，将基于活性的探针附着到支持物或树脂的方法可包括将支持物或树脂的可点击官能团结合至p标签部分。在替代实施方案中，在使探针与其靶酶反应之前，可以将支持物或树脂偶联至探针。根据一些实施方案，一种使用本公开内容的基于活性的探针用于高通量筛选一个或多个样品的方法，可以包括将每个探针分别附着至支持物或树脂的离散区域(例如，多孔板的一个或多个孔)，或将多个探针附着于多孔板的相同区域或孔中。图6中示意性地示出了用于测定一个或多个样品的示例性方法。
根据一些实施方案，用于验证在微生物组样品中正在发生标记的方法如下。细菌是在厌氧条件下从受试者的小肠和大肠中新鲜收集的。微生物含量也可以从粪便或粪便颗粒中提取。将来自肠道或粪便的活细胞暴露于探针(或出于比较目的的对照)，洗涤，通过珠子敲打进行裂解，然后使用本文所述的点击化学试剂与含标签的化合物(例如叠氮四甲基若丹明)合并。最佳活细胞ABP标记条件由每个ABP实施方案中通过荧光标记蛋白的SDS-PAGE获得的最高信噪比确定。在ABP标记之前和之后使用酶活性测定法，以确认ABP靶向微生物组中的功能活性酶，并且标记导致酶失活。
根据一些实施方案，该方法包括通过使用依赖于ABP的标记和分类研究来鉴定组成肠道微生物组功能亚群的分类单元，以分级方式靶向微生物组的异生物质代谢活性。这样的实施方案包括标记来自小肠和大肠样品以及对照的微生物组的步骤；使用分离的DNA作为模板进行16S rRNA(V4)测序；鉴定在ABP处理的探针阳性样品中含量更高的分类单元，并评估其统计意义。根据一些实施方案，通过肠微生物组分离物的PSI-BLAST分析和肠元基因组数据库来确认分离的分类单元的基因组中异生物质代谢酶的存在。根据一些实施方案，通过细胞分选来解决涉及各种异生物质代谢活动的门和分类单元的分布，其提供关于进行特定活性的肠道微生物的功能亚群的信息，并阐明不同分类单元中特定活性中功能冗余的水平。
为了完成层次分析，定量蛋白质组学用于表征异生物质代谢中涉及的酶。该方法可以包括通过珠子敲打来裂解相同的ABP标记的微生物组样品，使用点击化学将含标签的化合物(例如叠氮基-生物素化合物)连接至探针标记的酶；在链霉亲和素琼脂糖上富集生物素化ABP标记的酶，用胰蛋白酶消化蛋白质，并使用串联MS测量在Velos或QExactive HFLC-MS平台上分析胰蛋白酶肽。针对肠道元基因组搜索所得的肽谱，并使用AMT标签方法定量标记的酶，可以有效地定量读出各种异生物质代谢酶的相对活性水平。这提供了酶的功能表征和注释，并有助于将酶定位回表达酶的物种/分类单元。
在图7中示意性地示出的用于鉴定和定量酶的示例性方法包括：将包含葡糖醛酸糖苷酶(例如，从大肠杆菌、无乳链球菌和产气荚膜梭菌获得的重组表达和纯化的β-葡糖醛酸糖苷酶)的样品暴露于包含设计用于靶向葡糖醛酸糖苷酶的一种或多种探针实施方案的溶液。示例性探针仅共价结合至活性葡糖醛酸糖苷酶(图8A-8D)。该方法可以进一步包括用探针处理活细胞，然后裂解细胞；然后，向裂解的细胞混合物中添加含标签的化合物，例如含若丹明的叠氮化物(或含若丹明的炔烃，取决于标签基团将与之反应的官能团)，以及合适的点击化学试剂，例如上述试剂；然后，将标签附加到探针上后，通过SDS-PAGE和/或流式细胞仪可视化已与探针共价结合的标记酶。根据一些实施方案，将FACS与该方法结合以标记和分选来自混合微生物种群的具有活性β-葡糖醛酸糖苷酶的细胞对于研究微生物群落的活性是有用的。基因组测序可用于鉴定群落成员，从而基于真实活性而不是基因或转录本形式的潜在活性揭示特定的分类单元，并解决了理解宿主-微生物-异生物质相互作用的主要障碍。
六、试剂盒和装置
本文描述的探针实施方案可被配置用于在装置和/或试剂盒中使用，所述装置和/或试剂盒可用于分析样品，例如生物样品。该装置和试剂盒可用于评估和鉴定样品中存在的不同物质，还可以评估涉及样品中此类物质的功能/过程。在特定公开的实施方案中，该装置可包括一个或多个探针实施方案和基底，其中在暴露于样品之前将探针(或多个探针)偶联至基底，或者其中基底和探针能够接触样品后结合在一起。装置和试剂盒实施方案能够具有多种用途，使得可以用单个装置或试剂盒分析许多样品。
在特定的实施方案中，装置的基底组分是暴露于样品如细胞样品的任何合适的基底。代表性的基底包括但不限于可以用本文所述的探针实施方案功能化的玻璃基基底，使得探针与存在于玻璃基基底表面上的官能团偶联。在一些实施方案中，玻璃板和/或玻璃微球体用作基底组分。
装置和/或试剂盒中使用的探针可以选自本文公开的任何探针实施方案。在一些实施方案中，探针包含或被修饰以包含能够将探针锚定至装置的基底组分的p标签基团。在一些特别披露的实施方案中，p标签基团是可点击的官能团，其可使用点击化学反应与存在于基底表面上的可点击的官能团反应，从而将探针共价锚定到基底上。在一些实施方案中，可以在使用此类技术进行样品暴露之前将探针预偶联至基底。在一些另外的实施方案中，可以在探针已经暴露于样品之后使用此类技术将探针后偶联至基底。
在一些实施方案中，装置被预先组装，使得探针实施方案被预偶联到基底，并且在分析样本中使用的任何其他试剂被预先包含在装置内。在一些其他实施方案中，该装置可以作为包括预组装装置的试剂盒的一部分提供，并且用于分析样品的任何其他试剂作为试剂盒的单独组件提供(例如在试剂瓶中)。然后，用户可以在使用前将试剂盒的这些组件组合在一起。在又一些其他实施方案中，试剂盒可包含可以用探针实施方案处理的底物，所述探针实施方案由试剂盒内的单独试剂瓶提供，使用合适的偶联条件，从而将任何所需的探针实施方案偶联到基质上，以备设备所用。
还公开了制造本公开的装置实施方案的方法。在一些实施方案中，可以通过将基底暴露于包含p标签基团(例如可点击的官能团)的探针实施方案来制造装置。在另外的实施方案中，p标签可以是能够与基底的官能团化学结合的不同官能团。在探针包含可点击的官能团的实施方案中，基底通常在其表面上还包含可与探针的可点击的官能团反应的可点击的官能团。在一些实施方案中，基底是玻璃基底，其包含具有羟基的表面，该羟基可以用烷氧基硅烷分子改性以提供硅烷化的基底表面。在一些实施方案中，硅烷化的基底表面可以进一步与包含可点击的官能团的试剂反应。在特定公开的实施方案中，探针的p标签基团与基底表面的官能团(例如，羟基、烷氧基硅烷基团、可点击的官能团等)形成共价键。示例性的烷氧基硅烷分子包括但不限于氨基硅烷(例如，(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷，(3-氨基丙基)-二乙氧基-甲基硅烷，(3-氨基丙基)-二甲基-乙氧基硅烷，(3-氨基丙基)-三甲氧基硅烷等)，环氧丙氧基硅烷(glycidoxysilane)(例如(3-环氧丙氧基丙基)-二甲基乙氧基硅烷等)和巯基硅烷(例如(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷，(3-巯基丙基)-甲基-二甲氧基硅烷等)。在一些实施方案中，这些代表性基团可以被进一步化学修饰以将烷氧基硅烷的一个或多个官能团转化为能够与探针的官能团偶联的官能团。仅举例来说，氨基硅烷的胺基可被转化为叠氮化物或可与含叠氮化物的试剂偶联以提供能够与探针上存在的p标签基团进行点击化学反应的可点击基团(例如作为可点击的炔烃)。在特定公开的实施方案中，探针的p标签基团可以选自能够与存在于硅烷化的基底表面上的一个或多个官能团偶联的官能团。例如，探针可以包含一个或多个炔(或叠氮化物)部分，其可以与硅烷化基底表面上存在的任何叠氮化物(或炔烃)反应；或一个或多个羧酸基团，其可以与硅烷化基底表面上存在的任何胺反应；或一个或多个可以与硅烷化基底表面上存在的任何环氧化物反应的亲核官能团；或可以与硅烷化基底表面上存在的任何硫醇反应的一个或多个烯烃部分。受益于本公开，本领域普通技术人员将认识到可以与存在于基底表面和/或硅烷化的基底表面上的羟基偶联的另外的探针p标签基团。
在一个代表性的实施方案中，通过用诸如三乙氧基硅烷胺的烷氧基硅烷试剂官能化载玻片来制造玻璃板装置。然后，将包含可点击官能团的试剂溶液(例如NHS-酯-PEG-叠氮化物)添加至载玻片，以用叠氮化物部分官能化基底表面。然后将功能化的载玻片在样品暴露之前暴露于探针实施方案或暴露于首先暴露于样品的探针实施方案。探针包含可与基底的叠氮化物反应的p标签基团，例如可点击的炔烃。载玻片和探针暴露于促进探针通过探针的炔基与基底的叠氮基之间形成的三唑与载玻片共价偶联的反应条件。在该实施方案中，反应条件包括使用DMSO作为溶剂，使用Cul作为催化剂以及使用三甲胺(或二异丙基乙基胺)作为碱。
在另一个实例中，探针实施方案可与荧光玻璃微球偶联以提供用于本文所述方法的装置。在这样的实施方案中，单个探针实施方案可以偶联至单个微球。可以制成多个微球，其中多个微球的每一个与相同类型的探针实施方案偶联，或者其中多个微球的每一个与不同类型的探针实施方案偶联。如上所述的类似化学可用于将探针偶联至微球。包括与荧光玻璃微球偶联的探针的装置实施方案使得能够将多种探针用于单个有限大小的样品中的几种不同的酶靶。另外，这些装置实施方案使用荧光活化的细胞分选(FACS)和如图30中示意性描绘的蛋白质组学促进串联直接定量靶酶。在特定的实施方案中，通过FACS对蛋白质-探针-荧光微球进行分选和定量。然后，可以使用流式细胞仪提供定量的荧光图，或者可以使用完整的FACS系统按探针类型分选并进行后续的蛋白质组学测量，以提高测量分辨率。这样的实施方案还提供了在有限大小的样品中将探针功能化的微球多路复用以标记靶酶的能力，以及使用FACS首先定量给定样品中酶靶标的数量，然后使用基于质谱的蛋白质组学鉴定特定靶标并量化这些靶标的能力。
在另一个代表性的例子中，将包括孔板的装置暴露于探针实施方案中，该孔板具有用可点击的官能团(例如叠氮化物)表面修饰的孔，所述探针实施方案每个包含至少一个p标签基团(例如炔烃)，可以与表面修饰的孔的可点击官能团反应，以将探针共价连接到单个孔。在一些实施方案中，单个孔可包含与其共价结合的多个探针。在一些实施方案中，可以用不同的探针实施方案使孔板的不同孔功能化。
七、几个实施方案的概述
本文公开了具有满足式II的结构的探针的实施方案。
其中如果存在，ERG是S(O)2OH或其阴离子形式，P(O(OH)2或其阴离子形式，卤素，或-OPh-CH2-ONO2；
EBG具有满足式IIAEBG-IIJEBG中的一个或多个的结构：
其中Y是CH3或CF3，Y'是O、NO2或-N＝NR”，其中R”是染料或其他报告部分，m是0至5的整数，以及R'选自醛、酮、酯、羧酸、酰基、酰基卤、氰基、磺酸盐、硝基、亚硝基、季胺、CF3、烷基卤或其组合，
连接体a包括脂族基、杂脂族基、芳族基、脂族基-芳族基、杂脂族基-芳族基、杂芳族基、脂族基-杂芳族基或杂脂族基-杂芳族基；
如果存在，连接体b和连接体中的每一个独立地包含脂族基、杂脂族基、芳族基、脂族基-芳族基、杂脂族基-芳族基、杂芳族基、脂族基-杂芳族基或杂脂族基-杂芳族基；
如果存在，R是包含氨基甲酸酯或碳酸酯的基团；
如果存在，每个标签独立地包含能够产生可检测信号的官能团或分子；
每个p标签，如果不存在标签则其存在，独立地包含可点击的官能团；且
n、m、p和q各自独立地为0或1。
在一些实施方案中，连接体a是具有满足式IIA连接体a-IIH连接体a中的一个或多个的结构的连接体基团：
其中每个n'独立地为1至50的整数，Z是氧或NR”'，其中R”'是氢、脂族基或芳族基，Q为碳、氧或NR”'，其中R”'为氢、脂族基或芳族基。
在以上实施方案的任何一个或全部中，连接体b存在并包括-(CH2)n’-基团，其中n'为1至50的整数，酰胺基或其组合。
在任何一个或所有以上实施方案中，连接体c存在并具有满足式IIA连接体c或式IIB连接体c的结构：
其中n'为0至50的整数，以及Z是氧或NR”'，其中R”'是氢、脂族基或芳族基。
在任何一个或所有以上实施方案中，R存在并且具有满足式IIAR-IICR任何一个或多个的结构，
/>
其中Z和Z'独立地是氧或NR”'，其中R”'是氢、脂族基或芳族基，n'是0至50的整数。
在任何一个或所有以上实施方案中，存在一个或多个标签，并且其中每个标签独立地是荧光团、基于亲和力的结合对的结合伴侣、量子点或染料。在一些实施方案中，一个或多个标签独立地是若丹明、荧光素或生物素。
在任何一个或所有以上实施方案中，存在一个或多个p标签，并且其中每个p标签独立地是叠氮化物或炔烃。
在任何一个或所有以上实施方案中，所述探针具有满足式IIIA的结构
在任何一个或所有以上实施方案中，ERG存在且为碘、-OPh-CH2-ONO2或
在任何一个或所有以上实施方案中，连接体a是酯基、-O(CH2)n’NR”'C(O)(CH2)n’-基团或-(CH2)n’-基团，其中每个n'独立地是1至20的整数，并且其中R”'是氢、脂族基或芳族基。
在任何一个或所有以上实施方案中，m为1，且连接体c是-NR”'C(O)(CH2)n’-基团或–NR”'C(O)CH2[O(CH2)2]n’OCH2-基团，其中每个n'独立地为1至20的整数，并且其中R”'是氢、脂族基或芳族基。
在任何一个或所有上述实施方案中，m为1，并且如果存在，每个标签独立地为荧光团、基于亲和力的结合对的结合伴侣、量子点或染料，或者如果p标签基团存在，则每个p标签独立地为炔烃或叠氮化物。
在任何一个或所有以上实施方案中，探针可以选自本文公开的任何探针种类。
本文还公开了方法的实施方案，其包括：将受试者或样品暴露于根据任何一个或所有以上实施方案的探针足够长的时间，以使所述探针与参与异生物质代谢的酶结合，从而形成探针-酶缀合物；以及使用荧光检测技术、比色检测技术、质谱技术或其组合来分析该探针-酶缀合物。
在一些实施方案中，该方法包括将所述探针-酶缀合物暴露于含标签的化合物以形成包含标签部分的探针-酶缀合物。
在任何一个或所有上述实施例中，该方法还包括将所述探针暴露于光源。
在任何一个或所有以上实施方案中，该方法进一步包括从所述受试者中提取受试者样品并使用荧光检测技术、比色检测技术、质谱技术或其组合来分析所述受试者样品。
在任何一个或所有以上实施方案中，该方法中使用的探针可以选自本文所述的任何探针种类。
本文还公开了测定平台的实施方案，其包括基底和根据任何一个或所有以上实施方案的探针实施方案，其中所述探针共价附于基底。
八、实施例
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供关于如何制作和使用本文所述的探针和方法的实施方案的完整公开和描述，并且无意于限制发明人将其视为本发明的范围，也不意图将以下实验视为全部或仅有的实验。已经尽力确保所使用的数字(例如数量、温度等)的准确性，但是应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
菌株、试剂和基本程序
除非另有说明，否则化学品是从Fisher Scientific或Sigma Aldrich购买的。克隆的大肠杆菌菌株DH5α和BL21(DE3)获自Life Technologies，并在适当的情况下用含有100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基在37℃的条件下进行培养。大肠杆菌BW25113是从内部库存中获得的。大肠杆菌ΔuidA获自Coli遗传储备中心(菌株JW1609-1)。植物乳杆菌WCFS1购自ATCC(BAA-793)，并在37℃下使用MRS培养基培养。CF640R吡啶甲基叠氮化物购自Biotium。引物是从Integrated DNA Technologies订购的。pET-32c从实验室库存中获得。使用Gibson Assembly(NEB)和以下引物构建puidA：
uidA_F(5'-AACTTTAAGAAGGAGATATAATGTTACGTCCTGTAGAAACCCC-3')[SEQ ID NO:1]，
uidA_R(5'-TTGTTAGCAGCCGGATCTCATTAATGGTGATGGTGATGGTGTTGTGTGTGCCTCCCTGCTG-3')[SEQ ID NO：2]，
pET_F(5'-CACCATCACCATCACCATTAATGAGATCCGGCTGCTAAC-3')[SEQ ID NO：3]和
pET_R(5'-TATATCTCCTTCTTAAAAAATTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGGAATTGTTATCCGCTC-3')[SEQ ID NO：4]。使用异丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG，10μM)诱导uidA的表达。
动物
为了进行葡糖醛酸糖苷酶研究，从杰克逊实验室购买了6-8周龄的雌性C57BL/6J小鼠，并以12小时光照/12小时黑暗的光照周期饲养。随意提供食物(PMI 5002)和水。在任何处理开始之前使小鼠适应7天。在此期间，同窝仔畜被共同饲养。此后，将小鼠放在单独的笼子中进行抗生素处理。一组同窝仔畜(n＝5)暴露于饮用水中的万古霉素(0.1mg/mL)。另一组则饲喂普通水。为了监测对抗生素的不良反应，研究人员在暴露期间不能对处理组不知情，在随后的分析中也不会不知情。
为了进行GST研究，从杰克逊实验室(加利福尼亚州萨克拉门托)购买了三只成年雄性C57BL/6J小鼠。购买的小鼠为6周龄，接受标准实验室饮食。将小鼠单独饲养在保持在23±1℃和55±10％湿度的房间中，光照/黑暗周期为12小时，可自由获取食物和水。在标准实验室饮食(SD)(来自脂肪的热量占10％，来自蛋白质的热量占20％，来自碳水化合物的热量占70％，3.83kcal/g；Research Diets D12450Bi，新泽西州新不伦瑞克省)下随意喂养小鼠两周时间。所有动物实验均按照有关护理和使用实验动物的机构指南进行。BattelleRichland机构动物护理和使用委员会批准的协议#2010-45。
体外荧光标记和凝胶成像
在37℃下用不同浓度的GlcA-ABP处理纯化的蛋白质(5μM)或细胞裂解物(1mg/mL)1小时。若丹明通过铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应(CuAAC)连接，蛋白质通过SDS-PAGE分析。使用GE Typhoon FLA-9500对凝胶成像，并使用ImageJ对条带强度进行定量。
微生物的荧光标记和细胞分选
通过离心收集过夜培养物(5mL)，将其重悬于1mL PBS中，并将100μL转移至等分试样中。用50μM GlcA-ABP、10μM碘乙酰胺炔(IAA)或等体积的媒介物(“无探针”；DMSO)处理等分试样。将细胞在37℃振荡温育1小时。通过以10,000g离心5分钟收集细胞，并用1mL脱氧的PBS洗涤3次。将沉淀重悬于100μL PBS中，并在-20℃下用70％乙醇(1mL)固定过夜。通过重悬于1mL PBS中并以10,000g离心5分钟将细胞洗涤两次。将细胞重悬于250μM CuAAC反应缓冲液(10μM CF640R甲基吡啶叠氮化物，8mM CuSO4，2mM TH PTA，位于PBS:0.5％(w/v)BSA中的10mM抗坏血酸)。无探针样品的一半用作无荧光对照(不含CF640R的CuAAC反应缓冲液)。将细胞在黑暗中于室温旋转温育1小时，并如上所述通过离心收集。通过重悬于1mL PBS：0.5％BSA中，将细胞洗涤4次，在室温下于黑暗中旋转温育5分钟，并如上所述离心。用SYBRGold(Life Technologies；1：10,000)将细胞重悬于PBS中，并使用带有高压灭菌的鞘液的BD FACSAria llu进行分析。收集前向和侧向散射(488nm)，SYBR Gold(488nm激发；530/30nm检测滤光片)和CF640R(633nm激发；660/20nm检测滤光片)参数。绘制门以使“无探针”样品中>95％的事件归类为“探针阴性”(图9)。使用FACSDiva 8(BD Biosciences)收集流式细胞仪数据，并使用FlowJo10进行分析。
肠道微生物的荧光标记和分选
如先前描述的进行一些修改，收集并分选微生物细胞。收集从回肠到直肠的下肠道，并将其放入50mL锥形管中，该锥形管中包含约5mL无菌玻璃珠(直径3mm)和20mL脱氧PBS。将试管快速转移至厌氧室，并加入1mM二硫苏糖醇以帮助微生物恢复，并温育5分钟。然后将悬浮的肠内容物转移到新试管中，涡旋振荡30秒，并在5分钟内沉淀出大碎片。收集上清液，并在700g离心15分钟。将上清液转移至干净的50mL锥形瓶中，并在8,000g下离心15分钟以收集细菌细胞。细菌细胞沉淀通过重悬于1mL脱氧PBS中洗涤一次，并以8,000g离心15分钟。然后如上所述对细胞进行标记和分选。
DNA分离和扩增子测序
在可能的情况下，通过四向纯度分选在紫外线照射的玻璃管中收集了2,000,000个事件(使用侧向散射和SYBR Gold作为阈值参数)。通过重新分析一小部分分选的细胞来确认富集。富集通过重新分析一小部分分选的细胞来确认，与初始样品中的<20％相比，至少50-60％的收集细胞是探针阳性的。通过在1.5mL试管中以12,000g离心10分钟收集细胞，并重悬于裂解缓冲液(50mM NaCl，10mM Tris HCl，5mM EDTA，0.5％SDS和0.1％β-巯基乙醇)。为了控制背景DNA污染，在单独的试管中收集了50,000个珠子，每种样品仅准备了一个试管的裂解缓冲液。将试管在4℃下温育30分钟，然后使用液氮通过五个冷冻/融化循环进行裂解。然后提取DNA并纯化(Zymogen DNA Clean&Concentration-5)。使用EarthMicrobiome Project开发的方案，对16S rRNA基因的V4区进行PCR扩增：(i)一式三份扩增样品，意指每个样品将在三份25-μL PCR反应中进行扩增；(ii)将每个样品的PCR反应一式三份合并为一个体积(75μL)。此时不要合并来自不同样品的扩增子；(iii)在琼脂糖凝胶上电泳每个样品的扩增子。515f-806r的预期条带大小为～300-350bp。低生物量样品可能会产生微弱或没有可见的条带；可以使用其他方法，例如生物分析仪来验证PCR产物的存在；(iv)使用Quant-iT PicoGreen dsDNA分析试剂盒(ThermoFisher/Invitrogen目录号P11496；遵循制造商的说明)；(v)将来自每个样品(240ng)的等量扩增子合并到单个无菌管中。如果最终的样品池将被凝胶分离或使用低生物量的样品，则可以使用更高的量。注意：当使用多个样品板时，通常为每个样品板生产单个扩增子管。(v)使用MoBio UltraCleanPCR Clean-Up Kit(目录号12500；遵循制造商的说明)清洁扩增子池。如果处理的样品超过96个，则可能需要将样品池均匀分割以进行清洁，然后重新组合。可选：如果在凝胶上存在杂散带(在步骤3中)，则可以在凝胶上电泳最终池的一半，然后提取凝胶以仅选择目标条带；(vi)测量已清洁的最终池的浓度和A260/A280比率。为了获得最佳结果，A260/A280的比例应在1.8-2.0之间；(vii)与测序引物一起发送一份用于测序的等分试样。按照制造商的说明，使用500循环的MiSeq Reagent Kit v2，在lllumina MiSeq上对扩增子进行测序。
生物信息学分析
使用内部管线分析序列。简而言之，使用EA-Utils对原始序列读数进行多路分解，其中条形码序列中允许存在零错配。用BBDuk2对读数进行质量过滤以去除衔接子序列和汉明距离(hamming distance)为1、匹配的kmer长度为31bp的PhiX。短于51bp的读数被丢弃。使用USEARCH合并读数，最小长度阈值为175bp，最大错误率为1％。对序列进行重复复制(最小序列丰度为2)，并使用USEARCH的基于距离的贪婪聚类方法在操作分类单元(OTU)成员序列之间以成对％配对序列同一性进行聚类。在聚类期间使用USEARCH对嵌合序列进行从头预测。使用BLAST比对将分类法分配给OTU序列，然后在SILVA数据库版本123中将最不常见的祖先分配聚类为99％。OUSE种子序列针对SILVA数据库版本123(以99％聚类)过滤，以使用USEARCH鉴定嵌合OTU。与来自分选细胞的样品相比，“珠子”或“对照”样品中的读取计数更高的OTU被排除在分析之外。
差异丰度分析
对于每个OTU和比较，使用成分数据分析方法进行差异丰度测试，该方法使用R中的ALDEx2软件包，用混合效应模型取代算法中的典型glm，混合模型包括考虑同窝仔的随机效应。此外，针对每个OTU和比较，对两组之间存在/不存在的系统差异进行了定性g检验。调整后的p<0.05的差异被认为是显著的。使用GraPhlAn绘制了差异丰度的分类单元的图。
β-葡萄糖醛酸糖苷酶活性测定
在肠道菌群研究中，小鼠模型是一种功能强大的工具，它提供了进行对人类受试者而言过于侵入性的实验以及更好地控制混杂因素的可能性(Nguyen，TLA，et al，DiseaseModels and Mechanisms(2015)doi：10.1242/dmm.01 7400)。例如，肠道菌群研究必不可少的操作包括宿主遗传背景操作(基因敲除)、肠道菌群组成操作(在无菌或易生细菌的小鼠中进行有控制的接种，即对无菌微生物小鼠进行外部微生物接种)和生态系统干预措施，包括饮食干预措施、抗生素处理和粪便移植。即使许多小鼠模型不能准确地概括出人类建模的疾病，每种模型都有不同的局限性，需要将这些结果转化为人类，这些模型仍提供了宝贵的见解和独特的可能性来操纵人类微生物群，并可能评估肠道菌群在健康和疾病中作用的因果关系。
将来自小鼠肠的微生物细胞悬浮于具有蛋白酶抑制剂(完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂，Roche)的PBS中，并通过珠子敲打(Bullet Blender)进行裂解。将4-甲基伞形酮基-β-D-葡糖醛酸苷(4-MUG；1mM)添加至50μL裂解物(0.9μg总蛋白)中以达到500μM的终浓度。在特定时间点(0-240分钟)，将每个反应的10μL等分试样添加到90μL的0.1M Na2HCO3(pH＝10)，并在黑暗中保存。使用酶标仪(Molecular Biosciences)测量荧光，并相对于标准曲线计算水解底物的量。通过线性回归(GraphPad Prism)确定速率(mM/s)，并以每μg蛋白质的速率计算活性。将来自三个独立重复的值取平均值，并使用比率配对t检验比较跨生物学重复(n＝5)的活性。
相关分析
在对照和万古霉素处理的样本总数中，葡糖醛酸糖苷酶活性与OTU相对丰度相关。在水处理中，一个样品(同窝组E对照)的高活性值远大于所有其他值，这些值大大影响了统计结果，因此将这些样品排除在分析之外。此外，排除了具有大量零的OTU(超过2/3的样本观察到0个计数)，因为这些OTU的任何结果都可能是虚假的。对于其余的OTU，计算归一化的OTU丰度和葡萄糖醛酸糖苷酶活性之间的Pearson相关性，并进行显著性假设检验。相关性在0.05的显著性水平下被认为是显著的。
组织细胞溶质的分离
使用组织撕裂器在冰上切碎小鼠肝、肺、肾、肠、脾和心脏组织，然后在4mL冰冷的含250mM蔗糖的1×PBS(pH 7.4，11.9mM磷酸盐，137mM NaCl，2.7mM KCl)缓冲液中，使用玻璃杜恩斯匀浆器，以松紧的杵的15个脉冲进行匀浆。将匀浆液在10,000g(4℃)离心25分钟，然后收集上清液，随后将其在4℃下以100,000g离心90分钟。从沉淀物(微粒体部分)中分离出上清液(细胞溶质部分)，并通过BCA测定法测定蛋白质浓度。
GST活性测定
在1mg/ml小鼠肺、肾、肠、脾和心脏的细胞溶质和0.5mg/ml的肝细胞溶质上进行GST活性测定。测量每种组织类型的四个技术重复。该测定在96孔板中进行。每个孔由172μLPBS测定缓冲液(1×PBS，pH 6.5)、4μL 1×PBS中的GSH(50mM)和20μL 1mg/mL(或0.5mg/ml)的细胞溶质组成。将20μl另外的PBS测定缓冲液添加至无蛋白质对照孔。将在DMSO中的4μL二硝基氯苯(DNCB)(50mM)加入到每个孔中以开始测定。每30秒测量340nm处的吸光度10分钟。计算每个重复的吸光度值的斜率，并从每个计算的样品斜率中减去无蛋白对照的斜率。为了确定GST活性，使用以下方程式：(Abs340/分钟)/0.00503μM(DNCB消光系数)*(1mg/20μg)＝nmol DNCB/min/mg蛋白质。
小鼠肝脏和HepG2蛋白质组中GST的体外标记以进行SDS-PAGE分析
所有探针标记均在50μL 1mg/mL蛋白质组上进行。如果适用，加入竞争剂，将样品在搅拌下于37℃温育30分钟。0.5μL合适的探针储备液添加到每个样品中。0.5μl DMSO添加至所有无探针对照。温育后，将GSH-ABP标记的样品(和对照)在冰上暴露于紫外线7分钟。与探针温育后，将DMSO中的1.0μL若丹明-叠氮化物(3mM)、1.0μL抗坏血酸钠(500mM)、0.5μL三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(200mM)和2.0μLCuSO4(100mM)加入每个样品中，涡旋并快速离心。将所有样品在室温下在黑暗中温育90分钟。然后将50μL 2×SDS电泳缓冲液和10μL 10×还原剂添加至每个样品。将样品涡旋并在摇动下在95℃加热10分钟。然后将7.5μg蛋白质上样至10-20％Tris-Gly或4-12％Bis-Tris凝胶的每个孔中，并在150V、35mA下电泳90分钟。然后将凝胶在Typhoon FLA 9500(General Electric)或FluorChemQ(Alpha-Innotech)上成像，然后与GelCode Blue染料一起温育，并随后使用GelDocEZ(Bio-radLaboratories)成像。凝胶图像分析是使用ImageQuant软件进行的。
探针介导的链霉亲和素富集
将所有小鼠肝细胞溶质样品在含蔗糖(250mM)的PBS缓冲液中归一化为500μL1mg/mL蛋白质组。然后将样品与竞争者(如果适用)在37℃下温育30分钟。将GST-ABP、GSH-ABP或等体积的DMSO对照与蛋白质组在37℃下温育30分钟。然后将GSH-ABP样品在冰上暴露于紫外线(波长：365nm；115V，15W-Fisher UVP95)中7分钟。点击化学混合物包含终浓度的DMSO中的生物素-叠氮化物(60μM)、抗坏血酸钠(5mM)、四氢邻苯二甲酸酐(THPTA)(2mM)和CuSO4(4mM)。将每种试剂按该顺序分别添加，涡旋，离心分离，然后在室温下于黑暗中温育90分钟。将800μL预冷的MeOH添加到每个样品中。将样品置于-80℃的冰箱中30分钟以诱导蛋白质沉淀。将样品在4℃下以14,000g离心4分钟。弃去上清液，并使沉淀物风干5分钟。将样品重悬并在520μL含SDS(1.2％)的PBS中超声处理；然后在95℃下温育2分钟。将样品在室温下以14,000g离心4分钟，将上清液转移至新的管子中，留下任何残留的沉淀。将样品冷却至室温(rt)后，通过BCA测定确定其蛋白质浓度，并将其归一化至500μL的体积，浓度0.6mg/mL。100μL链霉亲和素琼脂糖珠用1mL含SDS(0.5％)的PBS洗2次，用1mL含尿素(6M)的NH4HCO3(25mM)洗2次，再用1mL1×PBS洗涤4次。使用BioSpin一次性色谱柱(Bio-Rad实验室)通过真空过滤进行洗涤。使用2个1mL等分试样的PBS将小珠转移至4mL冷冻管中，添加蛋白质样品，并将小珠/蛋白混合物在37℃温育1h，并进行倒置。然后将样品加回到色谱柱中，并用以下洗涤：1mL等分试样的含0.5％SDS的PBS溶液洗2次；1mL等分试样的新鲜制备的含尿素(6M)的NH4HCO3(25mM)洗2次；1mL等分试样的MilliQ水洗2次；1mL等分试样的PBS洗8次；1mL等分试样的NH4HCO3(25mM,pH 8)洗4次。使用2等分试样的500μL PBS将样品转移至DNA lo-bindtube(Eppendorf)，然后在室温下以10,500g离心5分钟。弃去上清液，并将珠粒重悬于400μL含尿素(6M)的NH4HCO3(25mM)中。通过在37℃下与TCEP(5mM)温育30分钟来还原样品。样品在50℃和箔下用碘乙酰胺(10mM)烷基化45分钟。将小珠转移到柱子上，用1mL PBS洗涤8次，用1mL NH4HCO3(25mM)洗涤4次。之后，将珠子转移到含有2mL NH4HCO3(25mM)的DNAlo-bindtube(Eppendorf)中。将样品在室温下以10,500g离心5分钟，弃去上清液，然后重悬于200μLNH4HCO3(25mM,pH 8)中。0.075μg胰蛋白酶添加到每种微珠混合物中，然后在37℃温育过夜，并颠倒。第二天早晨，将珠子以10,500g的速度离心5分钟。收集上清液，并将样品置于speedvac(Savant SC1 10)上直至干燥。通过添加40μL 25mM NH4HCO3并在37℃下加热样品5分钟来重构肽段。将样品转移至超速离心管中，并以100,000g旋转，以去除任何碎屑。将25μL加至玻璃小瓶中，以储存在-20℃直至分析。
探针富集的小鼠肝和肺细胞溶质的LC-MS分析
使用Velos Orbitrap MS对准备用于LC-MS的所有蛋白质组学样品进行分析。Sadler,NC et al,Applied&Environmental Microbiology(2016)82(24):7227-35.使用准确的质量和时间(AMT)标签方法分析数据。Zimmer,JSD,et al,Mass SpectrometryReviews(2006):25(3):450-82.针对小家鼠Uniprot蛋白数据库搜索了MS/MS谱。之后，使用MSGF+方法对数据进行重新评分。根据以下标准进一步过滤肽：(i)蛋白质计数＝1，(ii)MT唯一性≥0.5和(iii)MT FDR≤1％。肽经log2转化并通过线性回归归一化。然后使用DAntE将肽累积至蛋白质水平(Polpitiya,A.et al,Bioinformatics(2008)24(13):1556-58)。至少五种蛋白质用于Grubb检验，P值截止值为0.05。使用配对的t检验和计算出的倍数变化丰度，确定无探针和探针标记样品之间以及无竞争和竞争探针标记样品之间的显著性。
实施例1
用来自大肠杆菌、无乳链球菌和产气荚膜梭菌的重组表达和纯化的β-葡糖醛酸糖苷酶进行体外探针标记。用β-葡糖醛酸糖苷酶探针实施方案GlcA-ABP处理酶，其用若丹明-叠氮化物标记，并通过SDS-PAGE分析。GlcA-ABP标记强度与Wallace等人报道的这些酶的催化效率相对应(图10A和10B)。从谷氨酸到丙氨酸的催化残基的突变消除了探针标记，证实GlcA-ABP探针以活性依赖性方式标记β-葡糖醛酸糖苷酶(图10A和10B)。附加结果示于图10C-10E中。
接下来，鉴定了肠道菌群的葡糖醛酸糖苷酶活性成员。从小鼠胃肠道中分离出微生物，并在厌氧条件下与GlcA-ABP探针一起温育。固定细胞，进行荧光标记，并分选为探针阳性(GlcA-ABP+)、探针阴性(GlcA-ABP-)和所有细胞的群体(图7，图9)。然后通过16S rRNA基因的扩增子测序确定每个群体的群落组成，并通过配对定量分析和存在/不存在分析鉴定差异丰度的分类单元。与GlcA-ABP-馏分相比，GlcA-ABP+馏分中统计学增加的分类单元被认为是葡糖醛酸糖苷酶活性的。发现具有葡糖醛酸苷酶活性的分类单元在分类学上是多样的，包括拟杆菌、变形杆菌和软壁菌。但是，大多数的分类单元(31/37)是厚壁菌(图11)。三个丰度最高的GlcA-ABP+操作分类单元(OTU)也各不相同，分别代表理研菌科(Rikenellaceae)、厌氧原体科(Anaeroplasmaceae)和丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)。相反，与GlcA-ABP+馏分相比，GlcA-ABP-馏分的丰度显著增加的OTU被认为是葡糖醛酸糖苷酶无活性的。该级分在分类学上也是多样的，具有来自拟杆菌、变形杆菌和厚壁菌的代表性序列。丰度最高的富含GlcA-ABP的OTU是毛螺菌科。这些结果表明，一些在科甚至属水平上的分类学组同时含有葡糖醛酸糖苷酶活性和非活性OTU，这表明不能仅仅根据系统发育相似性来归属体内代谢活性。
考虑到多种系统发育上不同的分类单元有助于肠道中的葡糖醛酸糖苷酶活性，因此假设破坏肠道菌群不一定会废除葡糖醛酸糖苷酶活性，而是会改变负责该活性的分类单元。因此，将成对的同窝仔畜暴露于有或没有万古霉素的水，万古霉素是一种已知可靶向肠道菌群中的厚壁菌的抗生素(图12)。在未处理的小鼠中，由于厚壁菌组成了大部分的探针阳性分类单元(图11)，因此预计万古霉素处理会导致GlcA-ABP+群体组成发生变化。万古霉素处理降低但没有消除5组同窝仔畜中4组的葡糖醛酸糖苷酶活性(图13A)。因此，GlcA-ABP+标记的强度也降低了(图13B)。为了确定在抗生素处理后迁移的葡糖醛酸糖苷酶活性分类单元，比较了万古霉素处理(Abx-GlcA-ABP+)和未处理(GlcA-ABP+)同窝仔畜的GlcA-ABP+群体。万古霉素处理显著降低了厚壁菌的相对丰度，并且相应地增加了变形菌(Proteobacteria)、疣微菌(Verrucomicrobia)和拟杆菌(Bacteroidetes)的相对丰度(图14)。与万古霉素处理的GlcA-ABP+群体相比，对照GlcA-ABP+群体显著富集了来自厚壁菌(特别是梭状芽孢杆菌)、拟杆菌、软壁菌和放线菌门的OTU(图13C)。相反，Abx-GlcA-ABP+群体中富含属于变形杆菌的OTU。此外，抗生素处理后，GlcA-ABP+群体中的两个乳杆菌分类单元也明显丰度更高。这种不同的分类单元在不同条件下(即抗生素扰动)引发相同功能的能力突出了这些酶的底物多样性和实用性。葡糖醛酸苷与β-葡糖醛酸糖苷酶的结合主要是由葡糖醛酸而不是代谢物介导的，从而允许微生物从多种母体代谢物中以葡糖醛酸的形式提取碳和能量。因此，β-葡糖醛酸糖苷酶由于在遗传上广泛分布并且能够水解多种底物而表现出高度的功能冗余。结果，群落结构的扰动可能会改变功能分组(functional guild)的组成，而不会完全消除功能。这表明，将来可能无法通过添加或消除特定的分类单元来对肠道中的去葡糖醛酸化活性进行处理性操作，但是将需要能够抑制多种肠道分类单元中酶的抑制剂。尽管之前对肠道菌群分离物的遗传预测和体外分析表明了这一结果，但本文所述的测定方法首次通过结合原位活性检测与鉴定责任功能分类单元的能力，确认了微生物组分子水平的生化活性。
此外，确定了总群体中的丰度与葡萄糖醛酸糖苷酶活性呈正相关的OTU，并将其与万古霉素暴露后消耗的OTU进行了比较。确定了与葡萄糖醛酸糖苷酶活性显著正相关的12个OTU。示出了两个实施例，对应于梭菌的OTU92和对应于瘤胃球菌的OTU164(图13D)。在这12个OTU中，10个在GlcA-ABP+群体中比Abx-GlcA-ABP+群体中的丰度显著更高(图13C)，这表明这些分类单元负责未处理小鼠中的葡糖醛酸糖苷酶活性，并且在万古霉素暴露后降低。在其余两个OTU中，1个仅在GlcA-ABP+和Abx-GlcA-ABP+的单个样本中被发现，这妨碍了统计分析。另一个OTU是阿克曼菌(Akkermansia)OTU。有趣的是，在一只经万古霉素处理的小鼠(F组)中观察到阿克曼菌的急剧增加，这也是在抗生素处理后唯一表现出葡糖醛酸糖苷酶活性增加的窝畜。这些结果证实了肠道微生物组的代谢活性亚群中存在功能可塑性或冗余，并且本文所述的探针和测定实施方案可用于访问该信息。
实施例2
开发了两种探针以使GST结合G位点和底物结合H位点的GST能够进行基于活性的蛋白质谱分析，并验证了它们在哺乳动物模型系统中靶向和测量GST活性的能力。第一个探针GSH-ABP-G设计为通过模仿GSH靶向GST的谷胱甘肽结合G位点。将光反应性二苯甲酮和末端炔烃附加到GSH的硫醇上。这使得当紫外线辐射时，探针与GST靶标不可逆结合，并在点击化学反应后随后富集了靶蛋白。GST酶识别并结合GSH的肽结构，而GSH硫醇则作为亲核试剂，用于GST介导的异生物质附着。因此，为了靶向G位点，用含炔和二苯甲酮的连接体修饰巯基。为了补充靶向G位点的光亲和探针，开发了一种旨在表征H位点活性的基于机制的探针。第二种探针GST-ABP-H衍生自Dichlon(2,3-二氯-1,4-萘醌)，它是人类和啮齿类GST同工酶的广谱不可逆抑制剂。据推测，由于Dichlon的疏水性和亲电性，GST-ABP-H将结合H位点，这是H位点结合分子的特性。此外，证据表明，Dichlon部分也可能具有结合GST H位点内保守的催化酪氨酸的能力。
评价了重组GST的浓度依赖性标记(图15A)。将两个探针实施方案GSH-ABP-G和GST-ABP-H以递增的浓度应用于重组人GSTM1，一种在哺乳动物肝脏中高度表达的GST同工酶。温育30分钟后，通过点击化学添加荧光若丹明报告分子，并且SDS-PAGE显示两种探针均显示出浓度依赖性的重组GSTM1酶的靶向(图15A)。然后将两种探针以递增的浓度施加于小鼠肝裂解物的细胞溶质级分以进一步测试探针靶向(图15B)。两种探针均在24kDa处强烈标记两个不同的条带。较低的条带可能是GSTP1，一种在肝脏中高丰度的23.6kDa蛋白。较高的条带显示了μ和α类的可能的GST靶标，其分子量约为26kDa。除这些蛋白质外，GST-ABP-H探针还显示了各种更高分子量蛋白质的浓度依赖性标记。尽管GSH-ABP-G探针实施方案显示出高选择性，但GST-ABP-H探针实施方案似乎更易受到脱靶标记的影响，这可能是由于其强亲电性质造成的(图15B)。为了确定每种探针靶向的特异性GST同工型，进行了基于LC-MS的小鼠肝标记的蛋白质组学分析，以及在存在特异性抑制剂的情况下进行标记(图16A和16B)。蛋白质组学表明，GSH-ABP-G探针实施方案显示了对GST的高度特异性(图16A)。确定27种探针靶向的蛋白质是GSH-ABP-G探针实施方案的统计学显著靶标，其变化倍数是无紫外线暴露对照的3倍。在这27种蛋白质中，有8种是已知的GST，包括μ、α、π、θ、κ和ζ(zeta)类成员。其余的蛋白质包括五种已知与GSH结合的蛋白质，一种具有已知的抗氧化剂和药物结合活性的蛋白质，以及五种在肝脏中高丰度且没有已知GSH结合活性的蛋白质。GST-ABP-H探针实施方案还促进了GSTμ、α、π、θ、ω、κ和ζ类的12种成员的富集(图16B)。但是，与凝胶研究一样，GST-ABP-H探针的蛋白质组学结果表明，与GSH-ABP-G探针相比，脱靶标记明显更多。对脱靶的评估表明，这些蛋白质中有许多具有类似于GST的已知反应性硫醇。在GST中，GSH-ABP-G探针对GSTM2、M1、A3、P1、M4、T1、K1、MAAI(Z)具有选择性，而GST-ABP-H探针对GSTT2、T1和Z同功酶具有选择性。这些结果证实了两种探针对大多数细胞溶质GST类的许多成员的同工酶特异性靶向的有效性。
为了证明探针的选择性以及ABP方法在总体丰度分析方面的价值，我们将ABP标记结果与肝脏裂解物的整体蛋白质组学分析进行了比较。通过全局分析仅识别出6个GST，但是ABP标记导致检测到12个GST，包括在未富集的裂解物中检测到的所有GST。因此，ABP能够表征有活性和低丰度的GST。
为了区分探针的活性特异性结合和一般反应性，并表征其对G或H位点特异性的选择性，对小鼠肝裂解物的GST-ABP-H和GSH-ABP-G标记物与几种相关抑制剂进行了竞争。为了通过GSH-ABP-G探针评估G位点标记，添加了过量的GSH以竞争G位点结合。对GSH竞争探针标记的SDS-PAGE和LC-MS分析显示没有明显的抑制作用(数据未显示)。不受限于特定理论，抑制的缺乏可归因于体外蛋白质组样品中谷胱甘肽二硫化物(GS-SG)的形成。为了避免潜在添加可能会修饰活性的还原剂以防止GS-SG的形成，探针标记与S-己基谷胱甘肽(一种不能形成二硫键的GSH缀合物)竞争。S-己基谷胱甘肽以浓度依赖性的方式抑制GST的GSH-ABP-G标记，有效浓度为1.77μM(相对于10μM探针)，从而证实了GSH-ABP-G探针的G位点特异性(图17)。
为了确认GST-ABP-H探针靶向GST的H位点，将G位点抑制剂S-己基谷胱甘肽对GST-ABP的竞争抑制作用与已知的H位点抑制剂依他尼酸的竞争进行了比较。结果总结在图17中。S-己基谷胱甘肽显示出对GST-ABP-H探针标记的显著抑制，EC50为41.5μM(图17)。可以说，这种竞争是由于S-己基谷胱甘肽的缀合己基部分与GST H位点之间的相互作用所致。尽管G位点抑制剂降低了GST-ABP-H结合，但预计H位点抑制剂依他尼酸会更有效。与S-己基谷胱甘肽相比，依他尼酸在抑制GST-ABP-H酶标记方面的效力几乎高12倍，表明GST-ABP-H选择性靶向GST H位点(图17)。GST-ABP-G标记也与依他尼酸竞争；发现其以0.44μM(相对于10μM探针)抑制GST-ABP-G标记。因此，依他尼酸可能会阻止GSTA-ABP-G和GST-ABP-H接近G位点。H位点中依他尼酸的存在也可能干扰可能位于H位点的炔烃和GST-ABP-G的二苯甲酮部分。
为了确定GST和GSH结合蛋白的特异性标记，进行了S-己基谷胱甘肽竞争的肝细胞溶质的蛋白质组学分析(图16A和16B)。S-己基谷胱甘肽显著抑制GST3、M1和P1的GST-ABP-H和GSH-ABP-G标记(倍数变化>3.0，p≤0.05)，并且按倍数变化抑制排序是所有抑制目标的前三位，表明这两个探针都标记了GST的活性位点。
所述探针的亚位点互补性提供了一种独特的方法来检查每种探针的酶特异性。与Dichlon的竞争选择性地抑制了24kDa蛋白的标记，这大约是几个GST的重量。这种抑制作用可能是由于Dichlon和巯基附加的炔烃/二苯甲酮部分之间对占据H位的竞争所致。因此，这些结果不仅表明GSH-ABP-G在GST活性位点内结合，而且还提供了进一步的证据表明Dichlon(GST-ABP-H母体分子)在GST活性位点内结合。LC-MS在Dichlon(25μM)竞争的GSH-ABP-G标记的小鼠肝细胞溶质上进行(图16A)。当与Dichlon竞争时，GSTP1、M4、A3、M1、K1和M2的GSH-ABP-G标记被显著抑制(FC>2，p≤0.05)，这表明GST-ABP母体分子选择性抑制位于与GSH-ABP-G相同的结合区域附近的多种GST类别，进一步证实GST-ABP-H与GST的活性位点结合。为了研究炔烃可点击官能团的添加对GST-ABP-H的Dichlon部分反应性的影响，将小鼠肝细胞溶质的GST-ABP-H标记与Dichlon进行竞争。抑制作用导致所有可测量的荧光带降低，表明炔烃可点击的官能团不会显著影响反应性。
为了区分GST-ABP-H的一般反应性与其活性特异性标记，使用了N-乙基马来酰亚胺(NEM)(一种通常用于烷基化蛋白质的半胱氨酸残基的试剂)进行竞争性探针标记(图16B)。100μM NEM竞争的GST-ABP-H标记的蛋白质组学分析无法竞争大多数GST同工酶的结合，表明半胱氨酸结合可能不是GST-ABP-H靶向的主要氨基酸。与先前的研究相结合，这些结果表明酪氨酸是GST-ABP-H不可逆结合的主要残基。
接下来，评估了探针检测与异生物质代谢有关的器官(包括肝、肺、肾、肠、脾和心脏裂解物)的位点特异性GST活性变化的能力。将通过探针标记和荧光凝胶成像确定的GST活性与测量GST活性的总聚集体的比色GST活性测定法进行比较(图18A-18D)。通过定量荧光信号确定ABP标记的荧光强度。ABP标记显示肝脏GST活性最高，其次是肺和肾。这些测量值与通过比色测定法确定的总GST活性密切相关。然后进行了肺裂解物的蛋白质组学研究。11种GST同工酶由GST-ABP-H富集，而3种GST酶由GSH-ABP-G富集(图18D)。两种探针均显示出肺GSTA4的高度富集，这是一种在肝脏裂解物中均未显著富集的蛋白质。虽然GST-ABP-H和GSH-ABP-G在肝脏中显示GSTM4富集，但在肺裂解物中未检测到活性。GST-ABP-H还可以在肝裂解物中富集GSTM6，但在肺中不行。这与mRNA表达分析和数据表明相比于肝脏这些酶在小鼠肺中的表达降低是一致的。该数据证明了这些互补探针在检查GST在异生物质代谢中的组织特异性作用的有效性。
为了验证探针检测到GST活性的生理相关变化，在20周的时间里，比较了ABP测定的喂食标准品(10％脂肪)或高脂、致肥胖、成年食物(60％脂肪)的小鼠肠道中的GST活性。在饮食引起的肥胖症中，包括μ和πGST类的成员，观察到了几种GST同工酶的统计学显著变化。肥胖小鼠肠道GST的活性增加可能是对肥胖引起的氧化应激的反应。
实施例3
于25℃下在499.8MHz 1H，125.7MHz 13C NMR光谱仪上记录NMR光谱。化学位移以相对于NMR溶剂残留峰的百万分率(ppm-δ)表示，偶合常数(J)以赫兹(Hz)为单位，多重性表示为：记录的单峰(s)、双峰(d)、三重峰(t)、双峰的双峰(dd)、三重峰的双峰(dt)、双峰的双峰的双峰(ddd)和多重峰(m)。使用Biotage纯化系统，使用硅胶快速柱色谱法纯化所有化合物，并从Luknova获得预装柱。试剂和溶剂购自商业供应商，无需进一步纯化即可直接使用。必要时，可从我们内部的溶剂纯化系统中获得无水溶剂。使用TLC和Thermo ScientificLTQ-MS监测所有反应。必要时，反应在氮气(N2)气氛下进行。为了表征新化合物，已包括1H、13C NMR、19F和LTQ-MS数据，而对于已知化合物，仅报道了1H NMR数据以及适当的文献参考。
合成GST-AB-H探针的方法：
2,3-二氯-5-硝基萘-1,4-二酮。将2,3-二氯-1,4-萘醌(5g，0.022mmol)缓慢加入发烟HNO3(15g)和浓H2SO4(50g)的混合物中，并在搅拌下在70℃加热3小时。然后将深褐色溶液倒入冰水(200mL)中，得到亮黄色固体，将其通过过滤收集并用水洗涤。用EtOAc/己烷(20:80)快速色谱分离产生两个级分，在乙腈和水溶液中冷冻后冻干，得到黄色固体状的2,3-二氯-5-硝基萘-1,4-二酮(1，3.91g，70％)和2,3-二氯-6-硝基萘-1,4-二酮(2，1.68g，28％)的混合物。化合物1：1H NMR(CDCl3,500MHz):δ8.40(d,J＝7.9,1H,),7.95(t,J＝7.7Hz,1H),7.79(d,J＝7.9Hz,1H)ppm(图19)。化合物2:1H NMR(CDCl3,500MHz):δ9.00(brs,1H),8.64(dd,J＝8.5,2.0Hz,1H),8.42(d,J＝8.5Hz,1H)(图20)。
5-氨基-2,3-二氯萘-1,4-二酮。将2,3-二氯-5-硝基萘-1,4-二酮(1)(0.501g，1.84mmol)悬浮于浓盐酸(30mL)中。将SnCl2(2.61g，13.78mmol)加入该混合物中，并在75℃下搅拌30分钟。通过TLC确认化合物1的消失后，将反应混合物冷却至室温。将内容物转移至装有冰的500mL锥形瓶中，并置于冰浴中。在恒定搅拌下缓慢加入10M的NaOH溶液，直到所有的泡腾停止。在确认该溶液的pH值高于9后，将内容物转移至分液漏斗中，并用CH2Cl2萃取。有机层用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，并在旋转蒸发仪上蒸发溶剂，得到紫色固体胺3(0.215g，48％)。1H NMR(CDCl3,500MHz):7.56(d,J＝8.5Hz,1H),7.7(t,J＝7.7Hz,1H),6.95(d,J＝8.6Hz,1H),6.80(br,2H)ppm(图21)。
N-(6,7-二氯-5,8-二氧代-5,8-二氢萘-1-基)己-5-炔基酰胺。将化合物3(0.025g,0.103mmol)加至含有甲醇(20mL)和三乙胺(0.030g，0.210mmol)的烧瓶中，并搅拌10分钟。将新鲜制备的5-己酰氯(0.030g，0.211mmol)加入反应混合物中，并搅拌2小时。通过TLC和LTQ-MS(m/z 336.01–M+H)完成反应后，将反应用水淬灭，并使用分液漏斗用CH2Cl2萃取。有机层用水、盐水洗涤，经硫酸钠干燥，并使用旋转蒸发仪蒸发，得到橙色固体。使用快速色谱法(1：1，己烷：乙酸乙酯)的最终纯化得到橙色固体形式的4(23mg，65％)。1H NMR(CDCl3,500MHz):δ11.71(s,1H),9.16(d,J＝9.0Hz,1H),7.95(d,J＝7.5Hz,1H),7.76(t,J＝8.0Hz,1H),2.69(t,J＝7.3Hz),2H),2.35(dt,J＝6.5,2.0Hz,2H),2.01-1.97(模糊的m,3H),ppm(图22)；13C NMR(CDCl3,125MHz)δ179.5,175.7,172.2,142.3,136.9,135.7,134.1,131.3,126.8,123.5,114.7,82.9,69.5,37.0,33.7,23.7,22.8,17.8ppm(图23)；C16H11Cl2NO2的LTQ-MS计算值–335.011；实测值335.011。
合成GSH-ABP-G探针的方法：
2-氨基-3-(4-苯甲酰基苯基)-N-(丙-2-炔-1-基)丙酰胺。将Fmoc-4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸(1.0g，2.03mmol)加入到含有DCM(10mL)的圆底烧瓶中。将DIPEA(3.54mL，20.3mmol)加入到烧瓶中，然后加入HATU(1.08g，2.84mmol)。加入DMF(1.50mL)以完全溶解试剂。将反应混合物搅拌30分钟。将炔丙基胺(0.156mL，2.44mmol)加入反应混合物中，并在室温下搅拌6小时。将反应混合物加入盐水溶液(100mL)中，并在分液漏斗中用DCM(20mL)萃取3次。合并有机层，经硫酸钠干燥，并通过旋转蒸发除去DCM，得到粗黄色油。将DCM(8mL)加入到黄色油中，然后加入哌啶(2.0mL，20.24mmol)，并搅拌30分钟。通过旋转蒸发除去DCM，并使用DCM至MeOH(0-20％MeOH)的线性梯度纯化产物，得到黄色油状的4(0.21g，34％)。1HNMR(DMSO-d6,500MHz):δ8.27(t,J＝5.4Hz,1H),7.72–7.62(m,5H),7.57–7.52(m,2H),7.40–7.35(m,2H),3.86–3.82(m,2H),3.43(dd,J＝8.2,5.2Hz,1H),3.09–3.06(m,1H),3.01–2.68(m,2H)ppm(图24)；13C NMR(DMSO-d6,125MHz):δ195.97,168.21,140.27,137.44,136.46,133.22,130.33,130.18,130.01,129.05,80.48,74.27,53.79,38.68,28.65ppm(图25)；C19H18N2O2的LTQ-MS计算值-306.14；实测值307.22(MH+)。
3-(4-苯甲酰基苯基)-2-(2-碘乙酰胺基)-N-(丙-2-炔-1-基)丙酰胺。将4(0.036g,0.12mmol)溶解于圆底烧瓶中的DCM(1mL)中。将碘乙酸酐(0.10g，0.28mmol)添加至该烧瓶中，并在室温下搅拌15分钟。反应混合物通过快速色谱纯化，使用EtOAc至MeOH(0-20％MeOH)的线性梯度洗脱。通过旋转蒸发从纯化的级分中除去溶剂，得到白色固体5(0.053g，95％)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ8.49(t,J＝5.5Hz,1H),8.17(d,J＝8.5Hz,1H),7.72–7.61(m,5H),7.58–7.51(m,2H),7.43–7.37(m,2H),4.52(td,J＝9.2,4.9Hz,1H),3.84(td,J＝5.0,2.5Hz,2H),3.11–3.09(m,1H),3.07–2.80(m,2H),1.75(s,2H)ppm(图26)；13C NMR(DMSO-d6,125MHz):δ195.94,171.24,169.60,143.70,137.67,135.52,132.96,130.00,129.92,129.79,128.98,81.35,73.54,53.92,38.14,28.44,22.92ppm(图27)；C21H19IN2O3的LTQ-MS计算值-474.04；实测值475.08(MH+).
N5-(3-((2-((3-(4-苯甲酰基苯基)-1-氧代-1-丙-2-炔-1-基氨基)丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)硫代)-1-((羧甲基)氨基)-1-氧丙烷-2-基)谷氨酰胺。将5(0.048g,0.10mmol)溶解在磷酸钾缓冲液(10mL，pH 7.2)中。将还原的谷胱甘肽(0.20g，0.65mmol)缓慢添加至溶液中，并在室温下搅拌过夜。然后使用反相快速色谱法以H2O至ACN(0-100％ACN)的线性梯度纯化反应混合物。将纯化的级分旋转蒸发并冻干以获得白色固体形式的GSH-ABP(0.019g，28％)。+H NMR(D20，500MHz)：δ7.67-7.56(m，5H)，7.47-7.42(m，2H)，7.34-7.28(m，2H)，4.55(dt，J＝8.9，6.8Hz，1H)，4.36(dt，J＝10.2，5.1Hz，1H)，3.80(qd，J＝17.6，2.5Hz，2H)，3.65-3.50(m，3H)，3.19-2.97(m，4H)，2.70-2.52(m，2H)，2.46-2.41(m，1H)，2.40-2.33(m，2H)，2.06-1.95(m，2H)ppm(图28)；13C NMR(D20，125MHz)：δ200.34，175.94，174.77，173.90，172.28，171.98，171.29，142.21，136.70，135.46，133.44，130.72，130.16，129.31，128.50，79.17、71.83、54.80、54.08、52.76、43.28、36.99、34.76、33.22、31.38、28.69、26.14ppm(图29)；C31H35N5O9S的LTQ-MS计算值-653.22；实测值652.28(MH-)。
制备2-(2-甲酰基-4-硝基苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(3)。
在带有搅拌棒的干净且干燥的100mL圆底烧瓶中装入1(0.749g，1.89mmol)、2-羟基-5-硝基苯甲醛(0.316g，1.89mmol)、乙腈(50mL)并搅拌5分钟。将Ag2O(0.435g，1.89mmol)小心地加入到反应混合物中，并在室温下搅拌4小时。在使用给出所需质量的过滤的等分试样通过LTQ-MS(m/z 484；M+H)确认反应完成之后，停止反应，并在硅藻土床上过滤出Ag2O。用旋转蒸发仪除去溶剂，得到深棕色粗产物，将其用快速色谱法进一步纯化(乙酸乙酯：己烷；1∶2)，得到所需的醛3，为浅黄色固体(0.62g；67％)。1H NMR(CDCl3；500MHz)δ10.32(s，1H)，8.70(br s，1H)，8.41(d，J＝6.5Hz，1H)，7.28(d，J＝9.9Hz，1H)，5.46-5.39(模糊的m，5H)，3.73(s，3H)，2.02(m，9H)ppm。
制备2-(2-(二氟甲基)-4-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三乙酯(4)。
将化合物3(0.401g，0.83mmol)溶于无水二氯甲烷(50mL)中，在冰浴中冷却，并在恒定的N2吹扫下搅拌5分钟。将三氟化二乙氨基硫磺(DAST)(0.66g，4.2mmol)溶于无水二氯甲烷(5mL)中，并逐滴添加至反应混合物中，随后将反应混合物在0℃下搅拌3小时。通过TLC和LTQ-MS确认反应完成后，将反应用NaHCO3水溶液淬灭。将内容物转移至包含50mL二氯甲烷的分液漏斗中，用水(3×25mL)和盐水(1×25mL)洗涤有机层，然后将二氯甲烷层分离，用无水MgSO4干燥并过滤。使用旋转蒸发仪蒸发溶剂，得到粗产物，将其通过使用乙酸乙酯：己烷(1∶2)的快速色谱法进一步纯化，得到4(0.39g，92％)，为白色固体。1H NMR(CD3OD；500MHz)δ8.42(s,1H),7.45(d,J＝9.0Hz,1H),7.03-6.81(br t,J＝54.4Hz,1H),5.67(d,J＝7.5Hz,1H),5.50(t,J＝9.5Hz,1H),5.32(模糊的t,1H),5.25(t,J＝9.5Hz,1H),4.61(d,J＝9.5Hz,1H),3.72(s,3H),2.07-2.03(br s,9H,)ppm。
制备2-(2-(二氟甲基)-4-(己-5-基酰胺基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(6)。
将干净且干燥的带有搅拌棒的50mL圆底烧瓶用N2冲洗5分钟，然后加入化合物4(0.201g，0.39mmol)，并溶于EtOAc(25mL)。向其中加入活化的(在105℃的烤箱中加热过夜)Pd/C(0.4g)，并通过向反应混合物中通入氢气(通过气球)5分钟来净化反应混合物。然后将反应在H2气球下保持15-20小时。通过TLC(2∶1Hex/EtOAc)确认反应完成后，小心地分离H2气球，并用N2吹扫反应混合物。在氮气流下，使用二氯甲烷作为溶剂在硅藻土床上过滤内容物。通过使用旋转蒸发仪蒸发溶剂浓缩滤液，得到为淡黄色固体的胺5(0.180g，95％)，使用LTQ-MS(m/z 476；M+H)确认质量，化合物不经纯化用于下一步骤。
向具有搅拌棒的100mL圆底烧瓶中加入5-己酸(1.00g)，将其溶于二氯甲烷(50mL)中，并向其中加入SOCl2(10eq)。将反应混合物回流6小时，然后使用旋转蒸发仪蒸发溶剂，得到为粗油的己酰氯，然后使其与胺5反应。
将胺5(0.125g，0.26mmol)溶解在含有三甲胺(0.080g，0.78mmol)的无水二氯甲烷(25mL)中，并搅拌5分钟。将己酰氯(0.070g，0.53mmol)溶解在二氯甲烷(2mL)中，并在5分钟内缓慢滴加到反应混合物中。然后将得到的溶液在室温下搅拌12小时，最终使用LTQ-MS(m/z 570，M+H)确认完成。将反应混合物用二氯甲烷(50mL)稀释，并将内容物转移至分液漏斗。有机层用饱和NaHCO3(2×25mL)、H2O(2×30mL)和盐水(1×50mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤，并通过使用旋转蒸发仪蒸发溶剂浓缩，得到粗产物，将其通过快速柱色谱法纯化(1：1EtOAc/Hex)，得到6(0.161g，77％)，为白色固体。1H NMR(CD3OD，500MHz)：δ7.77(s，1H)，7.69(d，J＝9.0Hz，1H)，7.19(d，J＝9.0Hz，1H)，6.96-6.74(brt，J(H，F)＝55.5Hz，1H)，5.49-5.44(模糊的d，1H)，5.40(d，J＝8.0Hz，1H)，5.26-5.20(m，2H)，4.52(d，J＝10.0Hz，1H)，3.73(s，3H)，2.50(t，J＝7.5Hz，2H)，2.30-2.27(m，3H)，2.04-2.03(m，9H)，1.91-1.87(m，2H)；13C NMR(CD3OD，125MHz)：δ172.3，169.9，169.7，167.4，134.3，123.3，117.3，116.0，98.7，82.6，71.6，71.5，70.7，69.3，68.9，51.9，35.0，24.1，19.0，18.9，17.2；19F NMR(CD3OD，470MHz)-111.26，-111.38，-111.90，-112.02，-121.23，-121.34，-121.87，-121.98；C27H29F2NO11的HRMS m/z(M+H)计算值：569.51，实测值：570.49。
制备6-(2-(二氟甲基)-4-(己-5-基酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(GlcA-ABP)。
将6(0.101g,0.175mmol)在100mL圆底烧瓶中溶解于无水MeOH(20mL)中，并搅拌5分钟。将甲醇中的NaOCH3(25％wt/v；0.030g，0.536mmol)溶解在甲醇(5mL)中，并通过注射器缓慢添加至反应混合物中。将反应混合物在室温搅拌3小时。通过LTQ-MS(m/z 428，M-H)确认反应完成后，停止反应，并使用旋转蒸发仪蒸发溶剂，得到原油。通过使用100％乙酸乙酯的快速色谱法最终纯化，得到GlcA-ABP，为黄棕色固体(0.061g，80％)。1H NMR(CD3OD,500MHz):δ8.53(s,1H),7.80(s,1H),7.62(br d,J＝7.5Hz,1H),7.29(模糊的s,1H),7.27-7.06(br t,J＝55.5Hz,1H),4.58(br s,1H),3.78(d,J＝9.5Hz,1H),3.57-3.55(m,1H),3.54-3.51(m,2H),3.35(s,1H),2.50(t,J＝7.5Hz,2H),2.30-2.27(m,3H),1.93-1.87(m,2H)；13C NMR(CD3OD,125MHz):δ172.3,169.8,168.8,151.5,149.3,135.0,133.7,123.3,117.1,116.8,82.7,76.3,75.2,73.2,72.0,68.8,35.0,24.2,17.2；19F NMR(CD3OD,470MHz)-114.70,-114.81,115.34,-115.46,-116.98,-117.09,-117.62,-117.74；C19H21F2NO8的HRMS m/z(M+)计算值:429.37,实测值:428.11[M-H].
实施例4
在该实施例中，使用以下步骤来形成代表性的装置实施例。通过将载玻片浸入85℃的约100mL 20％硝酸中2小时，对Fisherbrand显微镜载玻片进行清洁。然后将载玻片取出，放入装有MilliQ H2O的烧杯中。浸泡1分钟后，将玻片移至新的milliQ H2O烧杯中，静置5分钟。然后将载玻片在75℃转移到35％H2O2溶液中1小时。然后将载玻片取出，放入装有MilliQ H2O的烧杯中。浸泡1分钟后，将玻片移至新的milliQ H2O烧杯中，静置5分钟。将载玻片移至甲醇烧杯中，静置5分钟。将载玻片在110C烤箱中干燥1小时(至少)。孔盖用milliQ润湿并附着在载玻片表面上。然后将附着良好的玻片放回烤箱30分钟，以便干燥。通过向表面添加1.6mL milliQ对装置进行泄漏测试。如果10分钟后没有泄漏，则丢弃milliQ H2O，放回烤箱中约15分钟，然后直接进行功能化。每个载玻片在1.568mL(总共1.6mL)pH约4.5(含乙酸)的3：1milliQ：MeOH溶液中，用32μL三乙氧基硅烷胺进行功能化，并在室温下摇动过夜。将载玻片用DMSO洗涤2次，乙醇洗涤2次，然后置于烤箱中1小时。将含5mg NHS-酯-PEG-叠氮化物的1.5mL DMSO+100μL TEA溶液加到玻片上，并在室温下摇动过夜。用DMSO洗涤载玻片3次。对于各载玻片进行点击化学，以总体积为1.6mL的DMSO为溶剂，含100μM探针和20μMCul。在室温下摇动过夜进行反应。用DMSO洗涤载玻片3次。
实施例5
在该实施例中，代表性装置用于分析样品。具体而言，用含有生物样品(例如，PBS)的水溶液将装置(例如，来自以上实施例4的功能化基底)洗涤两次。将样品摇动(室温或所需温度)施加到功能化装置表面3小时。将载玻片用PBS洗涤1次。然后，将载玻片用4％SDS洗涤1次，并在室温下摇动(5分钟)。然后，将载玻片用DMSO洗涤2次(5分钟，然后摇动30分钟)。接下来，将载玻片用PBS洗涤1次，然后用具有0.5％BSA的PBS洗涤2次，并在室温下摇动(第一次洗涤5分钟，第二次洗涤30分钟)。然后将载玻片用4％SDS于室温摇动洗涤2次(第一次洗涤5分钟，第二次洗涤过夜)。然后将载玻片用PBS洗涤1次，用milliQ洗涤1次。然后将玻片用6M尿素在室温下摇动洗涤(1小时)。然后将玻片用1M NaCl洗涤2次(每次1分钟)。然后将载玻片用milliQ洗涤2次(每次1分钟)。然后将载玻片用2.5mM NH4HCO3(pH 8)洗涤1次(摇动5分钟)。接下来，向每个孔中加入1.59mL 2.5mM NH4HCO3(pH 8)。用100μL 2.5mM NH4HCO3(pH 8)稀释20μg胰蛋白酶(在小瓶中)，并将10μL胰蛋白酶溶液(0.2μg/uL)添加到每个孔表面(总计2μg)。将该装置在室温下摇动过夜。收集样品并将其放入eppendorf管中。将样品冷冻并冻干，然后重悬于50μL 2.5mM NH4HCO3(pH 8)中。10μL用于Quant-IT测定以确定蛋白质浓度。同样，将40μL样品转移到玻璃超速离心管中，将其在TLA 120.1转子中以53,000rpm离心20分钟。收集25μL上清液，并转移到MS小瓶插入物中进行分析。
实施例6
在该实施例中，玻璃微球用于提供多路复用装置。向在Eppendorf管(最佳1.5mL)中的裂解物或纯蛋白(50μL，通常为1mg/mL)溶液中添加双功能探针(100μM)，并在不搅拌的情况下于37℃温育1h。向该溶液中加入DBCO-若丹明545(100μM)，并在37℃下以500rpm搅拌温育1小时。用冷(-20℃)的MeOH(500-1000μL)洗涤，并在4℃以16g离心2m。去除上清液(基于所用的荧光团将变为亮粉色)，并将这三个步骤重复两次。Eppendorf的壁可能是粉红色的，这是正常的。使样品干燥。然后，将功能化叠氮化物微球在MeOH中的5-10％悬浮液添加到含蛋白质的Eppendorf管中。将MS移入试管底部，使其完全干燥(约30分钟，取决于体积)。100μL含0.4％的PBS添加回去，通过超声重悬微球，然后进行涡旋和手动搅动(在台式机上敲击试管底部效果很好)。重悬微球后，使用点击化学条件(每50μL，NaAsc 250mm，0.5μL，THPTA 200mm，0.25μL，CuSO4 100mm，1μL)，将样品在37℃下以1500rpm搅拌温育1小时。清洗此阶段的微球(只需要含0.4％BSA的PBS洗2次即可)并用于基于荧光的读数。完成后，按以下步骤洗涤样品：1次含0.4％BSA的PBS，含4％SDS的PBS，6M尿素，2M NaCl，然后回到25mMNH4HCO3，pH 8的体积(100μl)。可以用新鲜的胰蛋白酶(1ng/μL)制备蛋白质组学样品，在37℃下温育12-24h，无需搅拌。可以在准备质谱样品之前进行BCA以确定蛋白质量。
鉴于可以将本公开的原理应用于其的许多可能的实施方案，应当认识到，所示出的实施方案仅是优选实施例，并且不应被视为限制。相反，范围由所附权利要求书限定。因此，我们要求保护所有落入这些权利要求的范围和精神内的发明。
序列表
<110> 巴特尔纪念研究院
Wright, Aaron T.
Ramos-Hunter, Susan
Whidbey, Christopher
<120> 用于选择性表征异生物质代谢中涉及的酶的探针以及制造和使用该探针的方法
<130> 23-99777-03
<150> US 62/568,151
<151> 2017-10-04
<150> US 62/591,697
<151> 2017-11-28
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> uidA_F primer
<400> 1
aactttaaga aggagatata atgttacgtc ctgtagaaac ccc 43
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> uidA_R primer
<400> 2
ttgttagcag ccggatctca ttaatggtga tggtgatggt gttgtttgcc tccctgctg 59
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pET_F primer
<400> 3
caccatcacc atcaccatta atgagatccg gctgctaac 39
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pET_R primer
<400> 4
tatatctcct tcttaaagtt aaacaaaatt atttctagag gggaattgtt atccgctc 58

Claims (19)

1.一种探针，其具有满足式II的结构，
其中如果存在，ERG是S(O)2OH或其阴离子形式，P(O)(OH)2或其阴离子形式，卤素，或-OPh-CH2-ONO2；
EBG具有满足式IIBEBG、IICEBG和IIEEBG-IIHEBG中的一个或多个的结构，
其中Y是CH3或CF3，Y'是O、NO2或-N＝NR”，其中R”是染料或其他报告部分，条件是：如果Y'是NO2或-N＝NR”，则式II中的n是0；m’是0至5的整数，以及R'选自醛、酮、酯、羧酸、酰基、酰基卤、氰基、磺酸酯、硝基、亚硝基、季胺、CF3、烷基卤或其组合；
连接体a包括脂族基、杂脂族基、芳族基、脂族基-芳族基、杂脂族基-芳族基、杂芳族基、脂族基-杂芳族基或杂脂族基-杂芳族基；
如果存在，连接体b和连接体c中的每一个独立地包括脂族基、杂脂族基、芳族基、脂族基-芳族基、杂脂族基-芳族基、杂芳族基、脂族基-杂芳族基或杂脂族基-杂芳族基；
如果存在，R是包含氨基甲酸酯或碳酸酯的基团；
如果存在，每个标签独立地选自荧光团、基于亲和力的结合对的结合伴侣、量子点或染料；
如果不存在标签则存在p标签，每个p标签独立地选自叠氮化物或炔烃；且
n、m、p和q各自独立地为0或1。
2.根据权利要求1所述的探针，其中连接体a是具有满足式IIA连接体a至IIH连接体a中的一个或多个的结构的连接体基团，
其中每个n’独立地为1至50的整数，Z是氧或NR”’，其中R”’是氢、脂族基或芳族基，以及Q为碳、氧或NR”’，其中R”’为氢、脂族基或芳族基。
3.根据权利要求1所述的探针，其中连接体c存在并具有满足式IIA连接体c或式IIB连接体c的结构：
其中n’为0至50的整数，以及Z是氧或NR”’，其中R”’是氢、脂族基或芳族基。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的探针，其中R存在并且具有满足式IIAR-IICR的任何一个或多个的结构，
其中Z和Z’独立地是氧或NR”’，其中R”’是氢、脂族基或芳族基，以及n’是0至50的整数。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的探针，其中存在一个或多个标签。
6.根据权利要求5所述的探针，其中所述一个或多个标签独立地是若丹明、荧光素或生物素。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的探针，其中存在一个或多个p标签。
8.根据权利要求1所述的探针，其中所述探针具有满足式IIIA的结构，
9.根据权利要求8所述的探针，其中所述ERG存在且为碘或-OPh-CH2-ONO2。
10.根据权利要求8或9所述的探针，其中连接体a是酯基、-O(CH2)n'NR”'C(O)(CH2)n’-基团或-(CH2)n’-基团，其中每个n'独立地是1至20的整数，并且其中R”'是氢、脂族基或芳族基。
11.根据权利要求8或9所述的探针，其中m是1，并且连接体c是-NR”'C(O)(CH2)n’-基团或-NR”'C(O)CH2[O(CH2)2]n’OCH2-基团，其中每个n'独立地是1至20的整数，并且其中R”'是氢、脂族基或芳族基。
12.根据权利要求8或9所述的探针，其中m为1，并且如果存在，每个标签独立地为荧光团、基于亲和力的结合对的结合伴侣、量子点或染料，或者如果p标签基团存在的话，则每个p标签独立地为炔烃或叠氮化物。
13.一种探针，其选自
其中n'是0至50；或者
14.一种用于检测和/或测量酶活性的方法，包括：
将受试者或样品暴露于根据权利要求1-13中任一项所述的探针足够长的时间，以使所述探针与异生物质代谢所涉及的酶结合，从而形成探针-酶缀合物；以及
使用荧光检测技术、比色检测技术、质谱技术或其组合来分析所述探针-酶缀合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其还包括将所述探针-酶缀合物暴露于含标签的化合物以形成包含标签部分的探针-酶缀合物。
16.根据权利要求14所述的方法，其还包括将所述探针暴露于光源。
17.根据权利要求14所述的方法，其还包括从所述受试者中提取受试者样品并使用荧光检测技术、比色检测技术、质谱技术或其组合来分析所述受试者样品。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述探针选自：
其中n'是0至50；或者
19.一种测定平台，其包括：
基底；以及
根据权利要求1至13中任一项所述的探针，其中所述探针与所述基底共价结合。
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