KR20200067855A - 제노바이오틱(xenobiotic) 대사에 관련되는 효소들을 선택적으로 규명하기 위한 탐침 (probe) 및 이들을 제조하는 방법 및 사용 방법 - Google Patents

제노바이오틱(xenobiotic) 대사에 관련되는 효소들을 선택적으로 규명하기 위한 탐침 (probe) 및 이들을 제조하는 방법 및 사용 방법 Download PDF

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아론 티. 라이트
수잔 라모스-헌터
크리스토퍼 위드비
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Abstract

숙주 및 이의 미생물총 집단(들)에서 제노바이오틱 (xenobiotic) 대사의 여러 상 (different phase)에 관여하는 효소를 선택적으로 동정하고 성질규명 하는데 사용될 수 있는 활성-근거한 탐침 (activity-based probe)을 서술한다. 서술되는 활성-근거한 탐침은 제노바이오틱 대사에 관여하는 이들의 타겟 활성 효소에만 특이적으로 라벨링되며 및 그러므로 전사체 또는 단백질 존재 측정보다는 진정한 단백질 기능 활성의 측정을 제공한다. 활성-근거한 탐침 또한 이러한 효소들의 다양한 모드의 프로파일링을 제공한다. 활성-근거한 탐침을 제조하는 방법 및 이들의 사용에 대한 예시적 방법이 공개된다.

Description

제노바이오틱(xenobiotic) 대사에 관련되는 효소들을 선택적으로 규명하기 위한 탐침 (probe) 및 이들을 제조하는 방법 및 사용 방법
본 공개는 인간 숙주 및 미생물 유래 둘 다의 제노바이오틱 대사 효소들에 관한 것이다.
관련된 출원들과의 교차 참조
이 출원은 2017년 10월 4일에 제출된 미국 가출원 번호 62/568,151 (U.S. Provisional Application No. 62/568,151), 2017년 11월 28일에 제출된 미국 가출원 번호 62/591,697 (U.S. Provisional Application No. 62/591,697)의 이점을 청구한다; 이전에 출원된 이들 각각은 여기에 그 전문이 참고 문헌으로 병합되었다.
정부 지원에 대한 사사
본 발명은 에너지 성 (Department of Energy)으로부터 지원받은 협약 번호 DE-AC05-76RL01830 (Contract No. DE-AC05-76RL01830)의 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 대한 일정한 권리를 가진다.
미생물 계(microbial communities)를 유전체 또는 전사체 (transcriptomes) 단독으로만 성질 규명하려는 것을 피하려는 연구에 점점 더 관심이 커지고 있다. 그러나, 유전자 함유량에 근거한 미생물총으로부터의 미생물들을 분류하는데 사용되는 형광 자체 혼성법 (fluorescence in situ hybridization) (FISH)을 사용하는 현재의 기술은 단지 기능에 근거한 분류 기전을 제공하는데 아직도 거의 세계적으로 실패하고 있다. 이 기술, 및 다른 많은 기술들은, 유전자 또는 아미노산들을 라벨링하는(labelling) 것에 근거하고 있다; 그러나, 유전자 또는 아미노산의 존재는 똑같은 기능을 갖는 것은 아니다. 생물학적 환경에 존재하는 분석되는 종류 (예를 들어, 미생물, 효소, 독소 및 이와 같은 것들)들을 동정, 분리 및 정량하여 이 종류들 및 이들이 기능을 측정할 수 있도록 하는 새로운 기술들이 필요하다.
요약
본 공개는 제노바이오틱 (xenobiotic) 대사에 관여하는 효소를 실시간 검출하고, 측정하고 및 효소 활성에 영향을 줄 수 있는 활성에 근거한 탐침 (probe)에 관한 것이다. 탐침의 화학식 및 구조는 하기에 서술된다. 또한 여기에 공개되는 실시예에는 탐침을 사용하는 방법에 관한 것으로, 대상 또는 샘플을 제노바이오틱 (xenobiotic) 대사에 관여하는 효소가 여기서 서술된 탐침 실시예에 충분히 결합될 수 있는 시간 동안 노출 시켜 탐침-효소 혼합물 (probe-enzyme conjugate)이 형성될 수 있도록 하는 것이 포함될 수 있으며; 및 형광 검출 기술 (fluorescent detection technique), 비색 검출 기술 (colorimetric detection technique), 질량 분석 기술 (mass spectrometry technique) 또는 이들의 조합을 사용한 탐침-효소 혼합물 분석을 포함할 수 있다. 다른 방법 실시예도 또한 포함된다.
본 공개의 탐침 실시예에 포함되는 장치 및 키트들도 이러한 장치 및 키트들을 사용하는 방법들과 함께 또한 서술된다. 어떤 실시예에서는, 에세이 플렛폼 (assay platform)이 서술되며, 여기에는 기질과 여기에 서술된 대로의 탐침 실시예가 포함될 수 있다.
본 공개의 선행 및 다른 목표 및 특성은, 수반되는 도표들을 참조하여 하기의 상세한 서술로 좀더 분명해질 것이다.
도 1은 제 1상 (Phase I) 및 제 2상 (Phase II) 대사, 및 장내 미생물총 (microbiome) 내에서 일어나는 대사적인 현상을 포함하는 제노바이오틱 대사 (xenobiotic metabolism)의 다른 단계를 보여주는 도식적 예시이다.
도 2는 공개되는 활성에-근거한 탐침 (activity-based probe) (“ABP”) 실시예가 계 (문)-수준((community (phylum)-level)에서의 제노메타볼리즘 (xenometabolism), 세포/분류군-수준 (cell/taxa-level)에서의 제노메타볼리즘 및 효소-수준 (enzyme-level)에서의 제노메타볼리즘을 포함하는 제노메타볼리즘 동안에 모든 단백질 기능 활성 수준을 측정하는데 어떻게 사용될 수 있는가를 보여주는 도식적 도표이다.
도 3은 활성 측정을 위한 적어도 하나의 대표적인 탐침 실시예의 구조를 포함하여, 여기서 서술된 특정한 ABP 실시예에서 제노메타볼리즘 되는 (xenometabolizing) 효소 활성의 요약을 제공한다.
도 4는 활성 글루타치온 트랜스페라아제(glutathione transferases) ("GSTs") 기능의 도식적 예시이며, 환원형 글루타치온(reduced glutathione) (GSH)이 여기서 서술된 대표적인 탐침 실시예에 의해 “G” 및 “H” 부위 결합으로 안정화되는 제노바이오틱(X)에 접합되는(conjugating) 기전을 보여준다.
도 5는 ABP 실시예를 사용하여 여기서 서술된 방법 실시예의 도식적 도표이다.
도 6은 다른 탐침들에 의해 타겟 된 다른 효소들을 동정하기 위해 여기서 서술된 ABP 실시예를 사용한 대표적인 분석법 실시예의 도식적 도표이다.
도 7은 FACS 분석을 사용한 대표적인 방법 실시예의 도식적 도표이다.
도 8a는 여기서 서술된 대표적인 탐침 실시예로 표지된 대장균으로부터의 활성적인, WT b-글루크로니데이즈 (b-glucuronidase)의 결과를 보여주며, 상기 “+”는 10 μM의 탐침이 있는 샘플을 대표하며 “-“는 탐침이 없는 대조군을 대표하며 및 상기 E413A/E505A 활성 부위 돌연변이는 표지 되지 않았다.
도 8b는 생쥐 대장 (large intestine)의 미생물총으로부터 분리된 단백질을 보여주며, 이는 GlcA-ABP (M: MW 마커)로 표지되었다.
도 8c는 FACS로 수집된 '탐침 양성 (Probe Positive)' 및 '탐침 음성 (Probe Negative)' 집단의 지도를 보여준다.
도 9는 도 8a-8d에서 논의된 ABP+/- 집단을 분리하는 일반적인 게이팅 전략 (gating strategy)을 보여주며, 여기서 이벤트 임계값 (event threshold)을 위하여 측면-분산(side-scatter) 및 SYBR 골드 신호 (SYBR Gold signal)를 사용하여, 세포는 전면 및 측면 분산에 게이트 시키고 (gated), 펄스 지속하고, 부스러기 제거를 위하여 CF640-R, 및 그후 CF640-R를 시켰으며; 탐침이 없는 대조군 샘플에서 95% 이상 (>95%)의 이벤트가 ‘탐침 음성 (Probe Negative)’이 되도록 게이트(gate)가 그려졌다.
도 10a는 탐침의 구조 및 클릭 화학 (click chemistry)을 통해 테드라메틸로다민 아자이드 (tetramethylrhodamine azide)를 부착시킨 탐침-β-글루크로니데이즈 혼합물 (probe-b-glucuronidase conjugate)의 형광 (위) 및 쿠마시-염색된 (coomassie-stained) SDS-PAGE (아래)로부터 얻어진 해당 결과들을 보여준다.
도 10b는 이미지 J (ImageJ)를 사용한 라벨 강도 (lablling intensity)의 정량을 보여주며, 여기서 컬럼은 평균을 의미하며 및 오차 크기(error bar)는 평균의 표준 오차를 의미하고 및 * = 조정된 p=0.0203; 및 ** =조정된 p=0.0047으로 던넷의 다중 비교 테스트 (Dunnett’s multiple comparisons test) n=3으로, 원-웨이 아노바(one-way ANOVA) 반복적인 측정에 의해 조정된 것을 의미한다.
도 10c는 대장균 용해액 (E. coli lysate) (WT BW25113, ΔuidA pET32c, 또는 보완체 (complement) DuidA puidA)의 결과를 보여주며, 여러 농도에서의 탐침 실시예로 표지된 것이며, 여기서 표지 된 단백질은 형광 (왼쪽)으로 시각화 되었으며 및 총 단백질은 쿠마시 불루 염색 (오른쪽)을 통하여 이미지화 되었다
도 10d는 전체 대장균을 탐침 실시예 (probe embodiment)로 표지 시키고, 및 표지된 세포에 CF640-R을 부착시킨 실시예로부터 얻은 결과를 보여준다.
도 10e는 탐침 실시예, 시스테인-반응성 IAA 탐침 (cysteine-reactive IAA probe), 또는 매개체(vehicle)만 (DMSO)으로 표지된 대장균 (E. coli) 만 (위쪽 왼쪽), L. 플란타룸 (L. plantarum) 만 (위쪽, 중간), 또는 이들 둘의 혼합(위쪽 오른쪽 및 아래)의 히스토그램 (histograms)을 보여준다.
도 11은 GlcA-ABP+ 및 GlcA-ABP- 분류군(taxa)의 계통발생적 분포를 보여주며, 여기서 빨강 삼각형은 탐침 양성 집단에서 존재가 상당히 증가된 분류군을 의미하고; 파란 삼각형은 탐침 음성 집단에서 존재가 상당히 증가된 분류군을 의미하고; 흰색 원은 존재의 상당한 차이가 관찰 되지 않은 분류군을 의미하며; 및 이 세가지 GlcA-ABP+ 분류군 (왼쪽 및 위쪽 오른쪽) 및 하나의 GlcA-ABP- 분류군 (아래쪽 왼쪽)의 예시들을 보여준다 ((분류군은 웰치 t 테스트 (Welch’s t test) 또는 G-테스트 (G-test) (n=5) 에 의해 벤자미니-혹흐베르그 (Benjamini-Hochberg) 조정된 p < 0.05 일 때 차별적으로 존재한다고 간주된다.
도 12는 모든 생쥐 (위쪽), 대조군 (아래 오른쪽), 또는 반코마이신 (vancomycin) 처리된 (아래 왼쪽) 생쥐로부터 서열 분석된 집단의 브레이-커티스 비유사성 분석 (Bray-Curtis dissimilarity analysis)을 포함한 GlcA-ABP+ 및 GlcA-ABP- 집단에 투입한 것 중에서 β-다양성 (β-diversity)을 보여준다.
도 13a는 반코마이신 처리된 (청록색 네모) 생쥐에 비교하여 대조군(빨강 세모)에서 GlcA-ABP+ 분류군 (taxa)의 계통발생적 분포를 보여준다 ((여기서 분류군은 웰치 t 테스트 (Welch’s t test) 또는 G-테스트 (G-test) (n=3 쌍)에 의해 벤자미니-혹흐베르그 (Benjamini-Hochberg) 조정된 p <0.05 일 때 차별적으로 존재한다고 간주된다)).
도 13b는 대조군 또는 반코마이신으로 처치된 생쥐의 장내 미생물총에서 글루크로니데이즈 (glucuronidase) 활성을 보여준다 ((여기서 한배새끼 쌍 (paired littermate) (n=5)은 선으로 연결되었으며, *: p <0.05는 비율-쌍 스투던트 t-테스트 (ratio-paired Student’s t-test)에 의하며 및 데이터는 세번의 실험 반복의 평균이다).
도 13c는 처치되지 않은 (물) 및 반코마이신으로 처치된 생쥐에서 GlcA-ABP+ 집단의 비교를 보여준다 (여기서 데이터는 한배새끼 다섯 쌍을 대표한다).
도 13d는 두 개의 샘플 OTUs의 글루크로니데이즈 활성 (glucuronidase activity)에 대한 표준화된 로그 풍부함 (normalized log abundance)에 대한 피어슨 관계 플럿 (Pearson correlation plots)을 보여준다 (여기서 결과는 유효수준 0.05에서 의미 있다고 간주된다.
도 14는 도면들 13a-13d에서 서술된 실시예에서 각 한배새끼 쌍에서 (그 부류 수준에서 분류군의 정상화된 상대적 풍부함과) 반코마이신 처치 시 집단의 이동을 보여준다.
도 15a는 1 μM 재조합 인간 GSTm1을 사용하여 여기서 서술된 탐침 실시예로 글루타치온 트랜스페라아제 (glutathione transferase) (GSH 및 GST)를 표지시킨 결과를 보여준다.
도 15b는 1 μM 생쥐 간 세포질액 (사이토졸, cytosol)을 사용하여 여기서 서술된 탐침 실시예로 글루타치온 트랜스페라아제 (glutathione transferase) (GSH 및 GST)를 표지시킨 결과를 보여준다.
도 16a는 탐침-강화된 (probe-enriched) 및 탐침으로 경쟁시킨 (probe competed) 생쥐 간 세포질액 (n=3)의 LC-MS/MS 화학단백체 (LC-MS/MS chemoproteomics) 결과를 보여 주며, 여기서 모든 샘플들은 10 μM의 대표적인 탐침 실시예로 배양시키거나 또는 동등한 농도의 담체 대조군(vehicle control)으로 배양시켰으며; 강화는 탐침-강화된 샘플을 no UV (GSH-ABP를 위해) 또는 DMSO 만 (GST-ABP를 위해)으로 나누어 AMT 표지 존재 (ATM tag abundance)로서 계산 되었다; 특히, 도 16a는 GSH-ABP 강화 (GSH-ABP enrichment)의 화산 플럿 (volcano plot)을 보여 주며, 여기서 흑색점은 탐침 표지 (probe labelling)에 경쟁적인 억제를 보이지 않는 모든 GST들을 대표하고, 초록색 점은 탐침에 비해 2.5x 과량의 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논 (2,3-dichloro-1,4-napthoquinone) (Dichlon)에 의해 탐침 표지가 경쟁적으로 억제된 GST들을 대표하며, 및 파란색 점은 2.5x 과량의 디치론 (Dichlon) 및 2.5x 과량의 S-헥실글루타치온 (S-hexylglutathione)에 의해 탐침 표지가 경쟁적으로 억제된 GST들을 대표한다.
도 16b는 탐침-강화된 및 탐침으로-경쟁시킨 (probe competed) 생쥐 간 세포질액 (n=3)의 LC-MS/MS 화학 단백체 결과를 보여 주며, 여기서 모든 샘플들은 10 μM의 대표적인 탐침 실시예로 배양시키거나 또는 동등한 농도의 담체 대조군으로 배양시켰으며; 강화는 탐침-강화된 샘플을 no UV (GSH-ABP를 위해) 또는 DMSO 만 (GST-ABP를 위해)으로 나누어 AMT 표지 존재 (ATM tag abundance)로서 계산 되었다; 특히, 도 16b는 GSH-ABP 강화의 화산 플럿 (volcano plot)을 보여 주며, 여기서 흑색 점은 탐침 표지 (probe labelling)에 경쟁적인 억제를 보이지 않는 모든 GST들을 대표하고, 파란색 점은 20x S-헥실글루타치온 (S-hexylglutathione)에 의해 탐침 표지가 경쟁적으로 억제 된 GST들을 대표하며, 및 빨강색 점은 10× N-에틸말레이미드 (N-ethylmaleimide)에 의해 탐침 표지가 경쟁적으로 억제된 GST들을 대표한다.
도 17은 G 및 H 부위 결합을 설명하기 위한 생쥐 간 세포질액의 GSH-ABP 및 GST-ABP 표지의 경쟁적 억제 결과의 결과를 제공하며 (n=3), 여기서 모든 샘플에 10 μM의 탐침이 사용되었으며 및 30분 동안 탐침으로 표지하기 전에 생쥐 간 세포질액을 증가되는 농도의 S-헥실글루타치온 또는 에타크리닉 에시드 (ethacrynic acid)로 30분 동안 배양시켰으며; 그후, 클릭 화학을 통해 로다민 (rhodamine)을 탐침-단백질 복합체(probe-protein complexes)에 부착시켰으며 및 단백질은 SDS-PAGE를 통해 분리시키고 이어서 형광 젤 이미징 (fluorescence gel imaging)을 하고 및 탐침 표지 된 GST 밴드를 정량 하였다 (임의의 단위로) ((모든 반복샘플은 % 표지 된 단백질 값으로 표준화되었다 (억제제가 없는 탐침 샘플=100%)).
도 18a는 GSH-ABP 및 GST-ABP를 사용한 GST 활성의 기관 분포 및 GST 활성 에세이를 보여주며, 여기서 GSH-ABP의 SDS-PAGE 형광을 보여준다.
도 18b는 GSH-ABP 및 GST-ABP를 사용한 GST 활성의 기관 분포 및 GST 활성 에세이를 보여주며, 여기서 GST-ABP의 SDS-PAGE 형광을 보여준다.
도 18c는 총 GST-활성에 해당하는 24-28kDa 밴드의 총 형광 강도를 보이는 표지 된 생쥐 간, 폐, 신장, 소장, 쓸개, 및 심장 세포질액으로부터의 결과를 보여준다.
도 18c는 총 GST-활성에 해당하는 24-28kDa 밴드의 총 형광 강도를 보이는 표지 된 생쥐 간, 폐, 신장, 소장, 쓸개, 및 심장 세포질액으로부터의 결과를 보여준다.
도 18d는 GSH-ABP 및 GST-ABP 폐 및 간 GST 타겟의 벤다이어그램 (Venn diagram) 이다.
도 19는 탐침 실시예 전구체의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 20는 탐침 실시예 전구체의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 21은 탐침 실시예 전구체의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 22는 여기서 서술된 탐침 실시예의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 23은 여기서 서술된 탐침 실시예의 13C-NMR 스펙트럼이다.
도 24는 탐침 실시예 전구체의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 25는 탐침 실시예 전구체의 13C-NMR 스펙트럼이다.
도 26은 탐침 실시예 전구체의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 27는 탐침 실시예 전구체의 13C-NMR 스펙트럼이다.
도 28은 여기서 서술된 탐침 실시예의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 29는 여기서 서술된 탐침 실시예의 13C-NMR 스펙트럼이다.
도 30은 다중 탐침 실시예 (multiplexed probing embodiments)를 위한 미세구 (microspheres)를 사용한 예시적인 방법을 보여주며, 여기서 기능에-근거한 탐침 (“P”)은 유동 세포분석 (flow cytometry)이 가능하도록 형광 유리 미세구에 기능화 시켰으며, 여기서 각 형광은 특정한 탐침과 일치 하며; 미세구는 혼합 될 수 있으며 및 생물학적 샘플과 같은 복잡한 생물학적 샘플들의 다기능적 성질을 규명하기 위하여 샘플에 첨가 되며 및 표지시킨 (labelling) 후에, 단백질-탐침-미세구는 더 나아간 분석을 위하여 분류 될 수 있다 (예를 들어, 각 분류된 샘플의 형광 방출 및/또는 단백체 분석에 근거하여 정량 하여 기능적 활성 효소를 동정하고 및 전체적인 기능 활성에의 이들의 상대적인 기여도를 동정하는 전체적인 기능 활성을 결정하는 것).
서열 목록
동반되는 서열 목록에 있는 핵산 서열 목록은 37 C.F.R. § 1.822에서 정의된 대로 뉴클레오타이드 베이스 표준 문자 약어를 사용하여 나타낸다. 각 핵산 서열의단지 한 가닥(one strand)만 보여주나, 상보적 가닥은 표시되는 가닥에 참조되어 포함되는 것으로 이해된다. 여기에 제출된 서열 목록, 2018년 10월 2일에 작성, 2Kb, 은 그 전체가 여기 참고문헌으로 병합된다. 수반되는 서열 목록에서:
서열번호 1은 프라이머 uidA F의 서열이다.
서열번호 2는 프라이머 uidA R의 서열이다.
서열번호 3은 프라이머 pET F의 서열이다.
서열번호 4는 프라이머 pET R의 서열이다.
I. 용어의 설명 및 총괄 (Explanation and Overview of Terms)
본 공개를 좀 더 좋게 서술하고 및 본 공개의 실행에 있어서 이 분야의 통상적인 전문가를 안내하기 위하여 하기의 용어 설명이 제공된다. 여기서 사용된 대로, “포함 (comprising)은 “포함(including)”을 의미하며 및 단수 형태 “a” 또는 “an” 또는 “the” 에는 문맥에서 달리 명확히 제시하는 않는 한 복수 참조도 포함된다. 용어 "or"은, 달리 문맥에서 명확히 제시하는 않는 한 언급된 다른 요소들의 단수 요소 또는 두 개 또는 그 이상의 요소들의 조합을 의미한다.
달리 설명되지 않는 한, 여기서 사용된 모든 기술적 및 과학적인 용어는, 이 공개가 속하는 기술 분야에 있는 통상의 전문가 중의 하나에게 보편적으로 이해되는 똑 같은 의미를 가진다. 여기서 서술된 것과 비슷하거나 또는 똑 같은 방법들이나 재료들이 본 공개를 실행하는데 또는 테스트하는데 사용될 수 있지만, 적절한 방법들 및 재료들이 하기에 서술된다. 재료, 방법, 및 실시예시는 단지 예시적일 뿐이며, 달리 제시되지 않는 한, 제한하려는 의도는 없다. 이 공개의 다른 양상들은 하기의 상세한 서술 및 청구항으로부터 분명해진다.
값의 범위가 주어지는 경우, 각 중간 값은, 달리 문맥에서 분명히 지시되지 않는 한, 하위 한계 값의 1/10까지, 범위의 상위 한계 값과 하위 한계 값 사이 및 언급된 범위 내에서 다른 언급된 또는 중간 값이 이 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 독립적으로 좀더 작은 범위에 포함될 수 있는 이러한 더 작은 범위의 상위 및 하위 한계 값은 또한 이 발명 내에 포함되며, 언급된 범위에서 특별히 제외되는 한계 일 수도 있다. 언급된 범위가 하나 또는 두 개 모두의 한계 값을 포함하는 곳에서는, 포함되는 한계 값 하나 또는 두 개 다를 제외하는 범위도 또한 본 발명에 포함된다.
달리 제시되지 않는 한, 성분의 양, 분자량, 퍼센트, 온도, 시간 및 등등을 표현하는 모든 숫자는, 명세서 또는 청구항에서 사용된 대로 “약(about)”이라는 용어로 수정될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 달리 제시되지 않는 한, 암시적으로 또는 표현적으로, 결정된 숫자적인 계수들은 추구하는 바람직한 성질 및/또는 표준 테스트 컨디션/방법 하에서의 검출에 의존될 수 있는 어림치 다. 논의된 이전의 기술로부터 직접적으로 및 표현적으로 구별되는 실시예 일 때는, 실시예 숫자들은 “약(about)” 이라는 단어가 인용되지 않는 한 어림치는 아니다. 더 나아가, 여기서 인용된 모든 대안들이 다 동등한 것은 아니다.
여기서 공개되는 화합물들은 입체성 센터 (stereogenic centers), 카이랄 축(chiral axes) 및, 예를 들어 비대칭 탄소 원자와 같은, 비슷한 것들 하나 또는 그 이상을 함유할 수 있어, 화학적 접합체 (chemical conjugates)가 다른 입체이성체의 (stereoisomeric) 형태로 존재할 수 있다. 이러한 화합물들은, 예를 들어, 라세미체 (racemates) 또는 광학적으로 활성이 있는 형태가 될 수 있다. 두 개 또는 이상의 비대칭 요소를 가진 화합물에서, 이들 화합물들은 추가로 부분입체이성질체(diastereomers)의 혼합물 일 수 있다. 비대칭 센터를 가진 화합물에서는, 순수 형태 및 이들 혼합물의 모든 광학적 이성체들이 포함된다. 이러한 경우에는, 단일 거울상이성질체 (enantiomers)는, 즉, 광학적으로 활성인 형태, 비대칭 합성, 광학적으로 순수한 전구체로부터 합성, 또는 라세미체의 분리로 얻을 수 있다. 라세미체의 분리는 또한, 예를 들어, 분리 제 (resolving agent)의 존재 하에서 결정화, 또는 예를 들어 카이랄 HPLC 컬럼 (chiral HPLC column)을 사용하는 크로마토그래피와 같은 전통적인 방법으로 달성될 수 있다. 이들을 얻기 위해 사용되는 방법에 관계없이 모든 형태가 여기서 고려된다.
여기서 사용된 입체화학적 정의 및 전통은 일반적으로 S. P. 파커 (P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York); 및 이리엘 및 윌렌 (Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York) 을 따른다. 많은 유기 화합물은 광학적으로 활성인 형태로 존재한다, 즉 이들은 평면-편광 (plane-polarized light)의 평면을 회전할 수 있는 능력을 가진다. 광학적으로 활성이 있는 화합물을 서술하는데 있어, 접두어 D 및 L 또는 R 및 S 는 카이랄 센터(들)에 대한 분자의 절대적 구조를 표시하는데 사용된다. 접두어 d 및 l 또는 (+) 및 (-)는 화합물에 의한 평면-편광의 회전 사인을 지정하는데 사용되며, (-) 또는 l은 화합물이 좌회전 (levorotatory)임을 의미한다. 접두어 (+) 또는 d인 화합물은 우회전 (dextrorotatory) 방향이다.
탐침 (probe)의 모든 형태는 (예를 들어, 수화물(solvates), 광학적 이성체, 거울상이성질 형태, 다중형체 (polymorphs), 유리 화합물 및 염) 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다.
공개되는 여러가지 실시예의 리뷰 (review)를 촉진하기 위하여, 특별한 용어에 대한 하기의 설명이 제공된다. 어떤 기능 그룹 용어에는 “-“기호가 기능 그룹 화학식 시작점에 포함되며; 이 기호는 기능 그룹의 한 부분이 아니고, 대신 어떻게 기능 그룹이 여기에 서술된 화학식에 연결되는가를 의미한다. 예를 들어, 화학식 “-OC(O)Rb”를 가진 기능 그룹은 “-“기호 옆에 있는 산소 원자의 기능 그룹에 의해 기능화 된 화합물의 원자에 부착된다.
아실옥시 (Acyloxy): OC(O)Rb, 여기서 Rb는 수소, 알리파틱 (aliphatic), 아릴 (aryl), 헤테로알리파틱 (heteroaliphatic), 알리파틱-아릴(aliphatic-aryl), 헤테로아릴(heteroaryl), 알리파틱-헤테로아릴(aliphatic-heteroaryl), 헤테로알리파틱-아릴 (heteroaliphatic-aryl), 헤테로알리파틱- 헤테로아릴 (heteroaliphatic-heteroaryl), 및 이들의 어떤 조합들로부터 선택된다.
알데하이드 (Aldehyde): -C(O)H
알리파틱 (Aliphatic): 하나에서 25 탄소 원자 (C1-25), 또는 하나에서 10 탄소 원자 ((C1-10)와 같은, 적어도 하나의 탄소 원자에서 50 개의 탄소 원자 (C1-50) 를 가진 탄화수소 (hydrocarbon) 그룹이며, 및 여기에는 알칸 (alkanes)((또는 알킬 (alkyl)), 알켄 (alkenes) ((또는 알케닐(alkenyl)), 알킨(alkynes) (또는 알키닐 (alkynyl))을 포함하고, 이들의 환형 형태도 포함하며, 및 더 나아가 직쇄- 및 측쇄 형태도 포함되며, 및 모든 입체 및 위치 이성질체도 또한 포함된다.
알리파틱-아로마틱 (Aliphatic-aromatic): 여기서 공개되는 탐침에 커플링 되는(coupled) 또는 될 수 있는 방향족 그룹이며, 여기서 방향족 그룹은 알리파틱 그룹을 통해 커플링 되거나 또는 되게 된다.
알리파틱-아릴 (Aliphatic-aryl): 여기서 공개되는 탐침에 커플링 되는(coupled) 또는 될 수 있는 아릴 그룹이며, 여기서 아릴 그룹은 알리파틱 그룹을 통해 커플링 되거나 또는 되게 된다.
알리파틱-헤테로아로마틱 (Aliphatic-heteroaromatic): 여기서 공개되는 탐침에 커플링 되는(coupled) 또는 될 수 있는 헤테로아로마틱 그룹이며, 여기서 헤테로아로마틱 그룹은 알리파틱 그룹을 통해 커플링 되거나 또는 되게 된다.
알리파틱-헤테로아릴 (Aliphatic-heteroaryl): 여기서 공개되는 탐침에 커플링 되는(coupled) 또는 될 수 있는 헤테로아릴 그룹이며, 여기서 헤테로아릴 그룹은 알리파틱 그룹을 통해 커플링 되거나 또는 되게 된다.
알케닐 (Alkenyl): 두 개에서 25개 탄소 원자 (C2-25), 또는 두 개에서 10개 탄소 원자 (C2-10) 와 같은 적어도 두 개 탄소 원자에서 50 개 탄소 원자(C2-50)를 가지며, 및 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 가진 불포화 단일가 탄화수소이며, 여기서 불포화 단일가 탄화수소는 모 알켄 (parent alkene)의 하나의 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거하여 유도될 수 있다. 알케닐 그룹은 측쇄, 직-쇄, 환형 (예를 들어, 사이클로알케닐 (cycloalkenyl), 시스(cis), 또는 트란스 (trans) (예를 들어, E 또는Z)가 될 수 있다.
알콕시 Alkoxy: -O-알킬(-O-alkyl), -O-알케닐(-O-alkenyl), 또는 -O-알키닐 (-O-alkynyl)과 같은 -O-알리파틱으로, 예시적인 실시예에는, 이것에 만 국한하지 않으나, 메톡시 (methoxy), 에톡시 (ethoxy), n-프로폭시 (n-propoxy), 이소프로폭시 (isopropoxy), n-부톡시 (n-butoxy), t-부톡시 (t-butoxy), sec-부톡시 (sec-butoxy), n-펜톡시 (n-pentoxy) 가 포함된다.
알킬 (Alkyl): 하나에서 25 탄소 원자 (C1-25), 또는 하나에서 10 탄소 원자 ((C1-10)와 같은, 적어도 하나의 탄소 원자에서 50 개의 탄소 원자 (C1-50)를 가진 포화 단일가 탄화수소이며, 여기서 포화 단일가 탄화수소는 모 화합물 (parent compound) (예를 들어, 알칸)의 하나의 탄소 원자로부터 하나의 수소를 제거하여 유래될 수 있다. 알킬 그룹은 측쇄, 직쇄, 또는 환형 (예를 들어, 사이클로알킬)이 될 수 있다.
알키닐 (Alkynyl): 두 개에서 25개 탄소 원자 (C2-25), 또는 두 개에서 10개 탄소 원자 (C2-10)와 같은, 적어도 두 개 탄소 원자에서 50 개 탄소 원자(C2-50)를 가지고, 및 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중결합을 가진 불포화 단일가 탄화수소이며, 여기서 불포화 단일가 탄화수소는 모 화합물 (parent compound) 알킨의 하나의 탄소 원자로부터 하나의 수소를 제거하여 유래될 수 있다. 알키닐 그룹은 측쇄, 직쇄, 또는 환형 (예를 들어, 사이클로알키닐)이 될 수 있다.
알킬아릴/알케닐아릴/알키닐아릴(Alkylaryl/Alkenylaryl/Alkynylaryl): 여기서 공개되는 탐침에 커플링 되거나 또는 커플링 될 수 있는 아릴 그룹이며, 여기서 아릴 그룹은 각각 알킬 (alkyl), 알케닐(alkenyl), 또는 알키닐(alkynyl) 그룹을 통해 커플링 되거나 또는 커플링 되게 된다.
알킬헤테로아릴 / 알케닐헤테로아릴 / 알키닐헤테로아릴 ( Alkylheteroaryl / Alkenylheteroaryl /Alkynylheteroaryl): 여기서 공개되는 탐침에 커플링 되거나 또는 커플링 될 수 있는 헤테로아릴 그룹이며, 여기서 헤테로아릴 그룹은 각각 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 그룹을 통해 커플링 되거나 또는 커플링 되게 된다.
아마이드 (Amide): -C(O)NRbRc 여기서 각 Rb 및 Rc는 독립적으로 수소, 알리파틱 (aliphatic), 아릴(aryl), 헤테로알리파틱 (heteroaliphatic), 알리파틱-아릴(aliphatic-aryl), 헤테로아릴 (heteroaryl), 알리파틱-헤테로아릴 (aliphatic-heteroaryl), 헤테로알리파틱-아릴 (heteroaliphatic-aryl), 헤테로알리파틱-헤테로아릴 (heteroaliphatic-heteroaryl), 또는 이들의 어떤 조합으로부터 선택된다.
아민 (Amine): -NRbRc, 여기서 Rb 및 Rc는 독립적으로 수소, 알리파틱 아릴, 헤테로알리파틱, 알리파틱-아릴, 헤테로아릴, 알리파틱-헤테로아릴, 헤테로알리파틱-아릴, 헤테로알리파틱-헤테로아릴, 또는 이들의 어떤 조합으로부터 선택된다.
방향족 (아로마틱) (Aromatic): 달리 특별히 구별하지 않는 한, 단일 링 ((예를 들어, 페닐, 피리디닐(pyridinyl), 또는 피라졸일(pyrazolyl)) 또는 적어도 하나의 링은 방향족 ((예를 들어, 나프틸 (naphthyl), 인도일 (indolyl), 또는 피라졸로피리디닐 (pyrazolopyridinyl)) 인 다중 축합된 링을 가진 5 에서부터 15개의 링 원자의 환형, 혼합 그룹 또는 잔기; 즉 적어도 하나의 링, 및 선택적으로 다중 축합된 링은 연속적이고, 비국소적인 π-전자 체계 (delocalized π-electron system)를 가진다. 전형적으로, 평면으로부터 멀어진 π-전자의 숫자는 헥켈 법칙 (H
Figure pct00001
ckel rule) (4n + 2)에 따른다. 모 구조 (parent structure)에 부착되는 지점은 전형적으로 축합된 링 시스템의 방향족 부분을 통해서이다. 예를 들어, . 그러나, 어떤 실시예시에서는, 문맥 또는 표현되는 공개에서 부착 지점은 축합된 링 시스템의 비-방향족 부분을 통해서이다. 예를 들어,
Figure pct00002
. 그러나, 어떤 실시예시에서는, 문맥 또는 표현되는 공개에서 부착 지점은 축합된 링 시스템의 비-방향족 부분을 통해서이다. 예를 들어,
Figure pct00003
. 방향족 그룹 또는 잔기는, 링에, 아릴 그룹 또는 잔기와 같은, 단지 하나의 탄소 원자를 포함할 수 있거나, 또는 하나 또는 그 이상의 링 탄소 원자 및 헤테로아릴 그룹 또는 잔기에서와 같은, 고립 전자 쌍 (lone pair electron) (예를 들어, S, O, N, P, 또는Si)을 포함하는 하나 또는 그 이상의 링 헤테로원자를 포함할 수 있다.
아릴 (Aryl): 5 에서 10 개의 탄소 원자 (C5-C10)와 같은, 적어도 5 개 탄소 원자 내지 15개 탄소 원자 (C5-C15)를 포함하는 방향족 카보사이클 (aromatic carbocyclic) 그룹이며, 단일 링 또는 다중 축합된 링을 가지고 있으며, 이 축합된 링들은 여기서 공개 되는 화합물의 나머지 위치에 부착 되는 지점이 방향족 카보사이클 (aromatic carbocyclic) 그룹의 원자를 통해서 이면 방향족이 될 수도 또는 아닐 수도 있다. 아릴 그룹은 수소가 아닌, 알리파틱 (aliphatic, 헤테로알리파틱 (heteroaliphatic), 아릴, 헤테로아릴 (heteroaryl), 다른 기능 그룹, 또는 이들의 어는 조합과 같은, 다른 하나 또는 그 이상의 그룹으로 치환될 수 있다. 어떤 실시예에서는, 아릴 링은, 이것에만 국한되지 않으나, 페닐, 나프틸 (naphthyl), 안트라세닐 (anthracenyl), 인데닐 (indenyl), 아주레닐 (azulenyl), 풀루오레닐 (fluorenyl), 테트라시아노안타퀴노디메틸 (tetracyanoanthaquinodimethyl), 및 이와 같은 것으로부터 선택된다.
아조 화합물 (Azo Compound): R1-N=N-R2 그룹을 함유하는 화합물, 여기서 R1 및 R2 은 전형적으로 방향족 그룹이다. 아조 화합물은, 예를 들어, 식품, 화장품, 약품, 및 다른 산업에서 색조제로서 널리 사용된다.
아조환원효소 (Azoreductase): NADH 및 FMN를 보조인자로 하여 전자 공여에 의해 아조 결합 (azo bond)을 함유하는 화합물을 환원적으로 쪼갤 수 있는 플라빈-의존 (Flavin-dependent) ((전형적으로 플라빈 모노뉴클레오티드 (Flavin mononucleotide)) 효소인 박테리아 및 진핵세포 효소들에서 발견되는 다양한 효소의 한 그룹. 라이안 (Ryan, A. Br. J. Pharmacol. (2017) 174: 2161-73)에서 서술된 대로, 장내 박테리아의 몇몇 종은 아조환원효소 활성을 가진 것으로 동정되었다.
벤질 카보닐 (Benzyl carbonyl): -C(O)Ph.
결합 (Binding): 결합, 및 이의 다른 문법적 형태, 는 화합물 기질 사이에 지속되는 끌어당김을 의미한다.
결합 특이성 (Binding specificity): 결합 특이성은 특정한 파트너에 결합하고 다른 분자에는 결합하지 않는 것 둘 다에 관련된다. 기능적으로 중요한 결합은 낮은 친화력으로부터 높은 친화력의 범위에서 일어날 수 있으며, 및 디자인 요소들 (design elements)은 바람직하지 않은 교차-상호작용 (cross-interactions)을 억제할 수 있다. 번역 후 수정 (post-translational modification)은 또한 상호작용의 화학 및 구조를 변경시킬 수 있다. “잡다한 결합 (Promiscuous binding)”은 구조적 유연성 (structural plasticity)의 정도가 관여될 수 있으며, 이는 다른 부류의 잔기가 다른 파트너와 결합하는데 중요한 결과를 가져오게 할 수도 있다. “상대적 결합 특이성 (Relative binding specificity)”은 생화적 시스템에서 한 분자가 이의 타겟 또는 파트너와 분별적으로 상호작용하는 성질이며, 이로서 각 개별적인 타겟 또는 파트너의 성질에 따라 뚜렷하게 이들에게 영향을 준다.
카복실 (Carboxyl): -C(O)ORb, 여기서 Rb 은 알리파틱 (aliphatic), 아릴, 헤테로알리파틱 (heteroaliphatic), 알리파틱-아릴 (aliphatic-aryl), 헤테로아릴 (heteroaryl), 알리파틱-헤테로아릴 (aliphatic-heteroaryl), 헤테로알리파틱-아릴 (heteroaliphatic-aryl), 헤테로알리파틱-헤테로아릴 (heteroaliphatic-heteroaryl), 수소, 및 이들의 어느 조합이다.
화학 결합(Chemical Bond): 혼합된 응집체가 한 단위로서 기능하도록 하기에 충분히 강한 원자들 사이의 끌어당기는 힘. 다른 원리 형태의 결합에는 금속성 (metallic), 공유성 (covalent), 이온성 (ionic) 및 브리지 (bridge)가 포함된다. “금속성 결합 (Metallic bonding)”은 모든 가능한 궤도 사이에서 비국소적인 방식으로 공유되는 바깥 껍질 전자에 대한 결정(crystal) 내의 모든 원자 핵의 끌어당김이다. “공유 결합 (Covalent bonding)”은 전자가 두 원자 핵에 의해 공유될 때 가장 흔하게 이루어진다. 전통적인 단일 공유결합은 두 개 전자의 공유와 관련된다. 또한 4 개의 공유되는 전자로 이중 결합, 6 개의 공유되는 전자로 삼중 결합, 및 중간적 다중성 결합이 있을 수 있다. 공유 결합은 두 원자들에 의해 전자들이 동등하게 공유되는 비극성 (nonpolar)에서부터, 결합되는 전자들이 아주 고르지 않게 공유되는 극도의 극성 (extremely polar)인 범위에 있을 수 있다. 결합하는 전자가 원자들 중 하나에 전적으로 결합하고 있어, 그 원자를 음성 이온으로 만들고 다른 원자는 양성 이온 형태로 놓아 둘 때는 고르지 않는 공유의 한계가 일어난다. “정전기성(또는 이온) 결합 ((Electrostatic (or ionic) bonding))” 은 반대로 충전된 이온들 사이에의 정전기적 끌림이다. “브리지 또는 수소 결합 (Bridge or hydrogen bonds)”은 수소 화합물이 관여하며, 이때 수소는 + 또는 - 전기를 소유한다.
클릭 화학 (Click Chemistry): 화합물을 만드는 화학적 합성 방법으로서 효과적인 시약 조건을 사용하여 함께 연결시킬 수 있고 및 순한 용매 또는 증발, 추출, 또는 증류와 같은 손쉬운 방법을 사용하여 제거되거나 추출될 수 있는 용매에서 수행될 수 있는 방법. 이러한 기준을 만족시키는 몇 가지 형태의 반응이 동정 되어 왔으며, 에폭사이드 (epoxides) 및 아지리딘 (aziridines)의 친핵적인 링 열림 반응 (nucleophilic ring opening reactions), 하이드라존 (hydrazones) 및 헤테로사이클 (heterocycles)의 형성과 같은 비-알돌 (non-aldol) 타입의 카보닐 반응 (carbonyl reactions), 에폭사이드의 산화적 형성 및 미카엘 에디션 (Michael Additions)과 같은 탄소-탄소 다중 결합에 첨가, 및 환형첨가 반응 (cycloaddition reactions) 이 포함 된다. 클릭 화학의 대표적인 실시예시에는 아자이드 (azide) 및 알킨 (alkyne)을 결합시켜 트리아졸 (triazole)을 형성시키는 반응이다. 구리-촉매에 의한 아자이드-알킨 환형첨가 (azide-alkyne cycloaddition) (CuAAC)는 촉매가 없는 1,3-디폴라 환형첨가 (1,3-dipolar cycloaddition)에 비교하여 107에서 108의 막대한 속도 가속화 양상을 보여준다. 이 반응은 넓은 온도 범위 내에서 성공적이며, 수용성 조건 및 pH 범위 4 부터 12에서 민감하지 않으며, 및 넓은 범위의 기능 그룹을 견딜 수 있다. 크로마토그래피 또는 재결정화 필요 없이 단순한 여과 또는 추출에 의해 순수한 생산물이 분리될 수 있다.
클릭 가능한 기능 그룹 (Clickable Functional Group): 클릭 화학에서 생산물을 형성하는 데 사용될 수 있는 기능 그룹. 어떤 실시예에서, 클릭 가능한 기능 그룹은 아자이드 (azide) 또는 알킨(alkyne) 이다.
접촉 (Contact): 닿아 있거나 또는 아주 가까이 있는 상태 또는 조건. 어떤 실시예시에서, 접촉은, 예를 들어, 실험 관내에서 또는 체외에서 샘플 (세포 또는 단백질을 함유하는 것과 같은)에 시약을 첨가하여 일어난다.
대조군 (Control): 활성-근거한 탐침이 없는 샘플.
디클로로 디온 ( Dichloro Dione ): 적어도 구조의 한 부분이
Figure pct00004
그룹을 가진 구조를 지닌 그룹.
구별 라벨 (Differential Label): 단일 세포 또는 개체의 구조, 성분 또는 단백질의 성질을 규명하거나 또는 대비하기 위하여 사용되는 염색, 염료, 마커 또는 활성 탐침.
에스터 (Ester): -C(O)ORb, 여기서 Rb는 수소, 알리파틱, 아릴, 헤테로알리파틱, 알리파틱-알릴, 헤테로아릴, 알리파틱-헤테로아릴, 헤테로알리파틱-아릴, 헤테로알리파틱-헤테로아릴, 또는 이들의 어느 조합으로부터 선택된다.
효소 결합 그룹 (또는 EBG) ((Enzyme Binding Group (or EBG): 효소에 공유적으로 결합하게 되는 여기서 서술된 탐침의 일부분인 분자, 또는 기능 그룹, 또는 이들의 조합. 어떤 실시예에서는, EBG는 효소와 반응하기 위하여 탐침으로부터 효소 활성적인 그룹 제거에 의해 및/또는 EBG를 환원시키거나, EBG를 산화시키거나, 또는 이들의 조합과 같은 EBG의 화학적인 수정에 의해 활성화된다. 어떤 추가의 실시예에서는, EBG는, 효소와의 결합을 촉진시키기 위하여 광화학적으로 활성화시킬 수 있다.
효소 활성화 그룹 (또는 ERG) ((Enzyme Reactive Group (or ERG)): 여기서 서술된 탐침에 부착되며 및 효소적인 절개 및/또는 화학적인 대체와 같은 것을 통해, 효소에 의하여 탐침으로부터 제거될 수 있는 분자, 또는 기능 그룹, 또는 이들의 조합. 여기서 공개되는 특별한 실시예에서, ERG를 제거하는 효소는 제노바이오틱 (xenobiotic) 대사에 관여하는 효소이다. 효소에 의해 효소적으로 쪼개질 수 있는 ERG의 대표적인 실시예시에는 당 (sugar) ((글루크로닌 산 (glucuronic acid)과 같은)), 설페이트 (sulfates) 및 포스페이트 (hosphates) 가 포함된다. 효소에 의해 대체될 수 있는 ERG의 대표적인 실시예시에는, 할라이드에 (halides) 만 국한되지 않으나, 페놀-함유하는 분자, 및 이와 같은 것들이 포함된다.
효소 특이성 (Enzyme specificity): 효소는 촉매하는 반응 및 이들의 기질에 대해 매우 특이적이다. 일반적으로, 효소 특이성에는 4가지 뚜렷한 타입이 있다: (1) 절대적인 특이성 (Absolute specificity) -이 효소는 단지 하나의 반응만 촉매 한다; (2) 그룹 특이성 (Group specificity) -이 효소는, 아미노, 인, 및 메틸 그룹과 같은, 특정한 기능 그룹을 가진 분자에 만 단지 작용한다; (3) 연결 특이성 (Linkage specificity)-이 효소는 나머지 분자의 구조에 상관 없이 특정한 타입의 화학적 결합에 만 작용한다; 및 (4) 입체 화학적 특이성 (Stereochemical specificity)-이 효소는 특별한 입체적 또는 광학적 이성질체에 작용한다. 효소들은 커다란 정도의 특이성을 보인다 하더라도, 보조인자들이 많은 아포효소 (apoenzyme)로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티트 (nicotinamide adenine dinucleotide) (NAD)는 많은 수의 탈수소화 반응에서 수소 수용체 (hydrogen acceptor)로서 작용하는 보조효소이다.
형광 (Fluorescence): 어떤 분자에서 일어나는 세가지-상태 과정의 결과로서, 일반적으로, 이는 한 분자 또는 나노구조가 전기적으로 자극된 후 기저 상태 (ground state)로 이완되었을 때 “형광발색단 (fluorophores)" 또는 " 형광 염료 (fluorescent dyes)” 로서 언급된다. 단계1은 빛 에너지의 흡수를 통해 형광발색단의 자극이 관여된다; 단계 2는 일부의 에너지 손실로 일시적으로 자극된 형태가 관련되며; 및 단계 3 은 빛의 방출을 동반하면서 형광발색단의 기저 상태로의 회복이 관여된다.
형광 염료, 형광색소, 형광발색단 (Fluorescent dye, Fluorochrome or Fluorophore): 분자가 형광을 나타내도록 하는 성분. 이 성분은 분자 내에서 특정한 파장의 에너지를 흡수하고 다른 파장 (그러나 동등하게 특정한)에서 에너지를 재-방출하는 기능 그룹이다. 방출되는 에너지의 양 및 파장은 염료 및 염료의 화학적인 환경에 모두에 의존된다. 많은 염료들이 알려져 있으며, 이것에 만 국한 하지 않으나, 플루로오레신 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate) (FITC), R-피코에리스린 ((R-phycoerythrin) (PE)), PE-텍사스 레드 텐덤 (PE-Texas Red Tandem), PE-Cy5 텐덤 (PE-Cy5 Tandem), 프로피디움 아이오댐 (propidium iodem), EGFP, EYGP, ECF, DsRed, 알로피코시아닌 (allophycocyanin) (APC), PerCp, SYTOX 그린(SYTOX Green), 쿠마린(courmarin), 알렉사 플루오아(Alexa Fluors) (350, 430, 488, 532, 546, 555, 568, 594, 633, 647, 660, 680, 700, 750), Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 훽스트 33342 (Hoechst 33342), DAPI, 훽스트 (Hoechst 33258), SYTOX 불루(SYTOX Blue), 크로모마이신 A3 (chromomycin A3), 미트라마이신 (mithramycin), YOYO-1, SYTOX 오렌지 (SYTOX Orange), 에티디움 부로마이드 (ethidium bromide), 7-AAD, 아크리딘 오렌지 (acridine orange), TOTO-1, TO-PRO-1, 티아졸 오렌지 (thiazole orange), TOTO-3, TO-PRO-3, 티아졸 오렌지 (thiazole orange), 프로피디움 아이오다이드 (propidium iodide) (PI), LDS 751, 인도-1-(Indo-1), 플루오-3 (Fluo-3), DCFH, DHR, SNARF, Y66F, Y66H, EBFP, GFPuv, ECFP, GFP, AmCyanl, Y77W, S65A, S65C, S65L, S65T, ZsGreenl, ZsYellowl, DsRed2, DsRed 모노머 (DsRed monomer), AsRed2, mRFP1, HcRedl, 모노클로로비만 (monochlorobimane), 칼세인 (calcein), 디라이트 플루오아 (DyLight Fluors), 시아니인 (cyanine), 하이드록시쿠마린 (hydroxycoumarin), 아미노쿠마린 (aminocoumarin), 메톡시쿠마린 (methoxycoumarin), 케스케이드 불루 (Cascade Blue), 루시퍼 옐로우 (Lucifer Yellow), NBD, PE-Cy5 접합체 (PE-Cy5 conjugates), PE-Cy7 접합체 (PE-Cy7 conjugates), APC-Cy7 접합체 (APC-Cy7 conjugates), Red 613, 풀루오레신 (fluorescein), FluorX, BODIDY-FL, TRITC, X￢로다민 (X￢rhodamine), 리사민 로다민 B (Lissamine Rhodamine B), 텍사스 레드(Texas Red), TruRed, 및 이들의 유도체가 포함 된다.
할로겐 (Halogen): 풀루오로 (fluoro), 클로로 (chloro), 브로모 (bromo), 또는 요도 (iodo)로부터 선택되는 원자.
헤테로알리파틱 (Heteroaliphatic): 하나에서 15 개 헤테로원자, 또는 하나에서 5 개의 헤테로원자와 같은, 적어도 하나의 헤테로원자에서 20 개의 헤테로원자를 포함하는 알리파틱 그룹으로, 이는 이것에 만 국한하지 않으나, 산소 (oxygen), 질소(nitrogen), 유황(sulfur), 셀레늄 (selenium), 인 (phosphorous), 및 그룹 내에서 이들의 산화된 형태로부터 선택될 수 있다. 예시적인 헤테로알리파틱 그룹에는, 이것에 만 국한하지 않으나, 에텔 (ether), 티오에텔 (thioether), 에스터 (ester), 아민 (amine), 카복시(carboxy), 카보닐 (carbonyl), 또는 아마이드 (amide)를 포함하는 알리파틱 그룹이 포함된다.
헤테로알리파틱-아로마틱 (Heteroaliphatic-aromatic): 여기서 서술된 탐침에 커플되거나 또는 커플 될 수 있는 아로마틱 그룹으로, 여기서 아로마틱 그룹은 헤테로알리파틱 그룹을 통해 커플 되거나 또는 커플 되게 된다.
헤테로알리파틱-아릴 (Heteroaliphatic-aryl): 여기서 서술된 탐침에 커플 되거나 또는 커플 될 수 있는 아릴 그룹으로, 여기서 아릴 그룹은 헤테로알리파틱 그룹을 통해 커플 되거나 또는 커플 되게 된다.
헤테로알킬/헤테로알케닐/헤테로알키닐(Heteroalkyl/Heteroalkenyl/Heteroalkynyl): 하나에서 15 개 헤테로원자, 또는 하나에서 5 개 헤테로원자와 같은, 적어도 하나의 헤테로원자에서 20개 헤테로원자를 포함하는 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 그룹이며 (이는 측쇄로, 직쇄로, 또는 환형이 될 수 있다), 이는 이것에 만 국한하지 않으나, 산소 (oxygen), 질소(nitrogen), 유황(sulfur), 셀레늄 (selenium), 인 (phosphorous), 및 그룹 내에서 이들의 산화된 형태로부터 선택될 수 있다.
헤테로아로마틱 (Heteroaromatic): 하나에서 15 개 헤테로원자 또는 하나에서 5 개의 헤테로원자와 같은, 적어도 하나의 헤테로원자에서 20 개의 헤테로원자를 포함하는 아로마틱 그룹으로, 이는 이것에 만 국한하지 않으나, 산소 ,질소, 유황, 셀레늄, 인, 및 그룹 내에서 이들의 산화된 형태로부터 선택될 수 있다.
헤테로아릴 (Heteroaryl): 하나에서 4개 헤테로원자와 같은, 적어도 하나의 헤테로원자에서 6 개의 헤테로원자를 포함하는 아릴 그룹으로, 이는 이것에 만 국한하지 않으나, 산소, 질소, 유황, 셀레늄, 인 및 그룹 내에서 이들의 산화된 형태로부터 선택될 수 있다. 그러한 헤테로아릴 그룹은 단일 링 또는 두 개 또는 그 이상의 융합된 링을 가질 수 있으며, 이 융합된 링은 아로마틱 일 수도 또는 아닐 수도 있으며 및/또는 부착하는 지점이 이 아로마틱 헤테로아릴 그룹의 한 원자를 통하는 것이라면, 헤테로원자를 포함할 수도 있다. 어떤 실시예에서, 헤테로아릴 링은, 이것에 만 국한하지는 않으나, 피리디닐(pyridinyl), 퀴놀리닐 (quinolinyl), 퀴나졸리닐 (quinazolinyl), 퀴녹사리닐 (quinoxalinyl), 벤조퀴놀리닐 (benzoquinolinyl), 벤조퀸옥살리닐 (benzoquinoxalinyl), 벤조퀸아졸리닐 (benzoquinazolinyl), 인돌일 (indolyl), 인돌리닐 (indolinyl), 벤조후라닐 (benzofuranyl), 벤조티오페닐(benzothiophenyl), 벤즈이미디졸일 (benzimidizolyl), 퓨리닐 (purinyl), 카바졸일 (carbazolyl), 아크리디닐 (acridinyl), 펜아지닐 (phenazinyl), 및 이와 유사한 것으로부터 선택된다.
헤테로알리파틱-헤테로아로마틱 (Heteroaliphatic-heteroaromatic): 여기서 서술된 탐침에 커플 되거나 또는 커플 될 수 있는 헤테로아로마틱 그룹으로, 여기서 헤테로아로마틱 그룹은 헤테로알리파틱 그룹을 통해 커플 되거나 또는 커플 되게 된다.
케톤 (Ketone): -C(O)Rb, 여기서 Rb는 알리파틱 (aliphatic), 아릴, 헤테로알리파틱, 알리파틱-아릴, 헤테로아릴, 알리파틱-헤테로아릴, 헤테로알리파틱-아릴, 헤테로알리파틱 - 헤테로아릴 및 이들의 어느 조합으로부터 선택된다.
라벨 (표지) (Label): 공간적으로 분자의 위치를 찾기 위하여 또는 반응 또는 정제 계획도에 따라 추적하기 위하여 분자에 병합되는 추적 가능 한 성분. 일반적으로, 검출되거나 또는 측정될 수 있는 그러한 그룹 또는 원자를 첨가하는 것.
리아제 (Lyase): 산화 또는 물의 첨가 없이C-C 또는 C-X 결합을 ((여기서 X=O, N, S, P 또는 할라이드halides이다)을 쪼개는 효소. 미생물 폴리삭카라이드 리아제 ((Microbial polysaccharide lyases (PLs))는 카복시릭 에시드 (carboxylic acid)에 대비하여 β 위치에 글라이코시딕 결합 (glycosidic bond)을 함유하는 폴리삭카라이드를 ((예를 들어, 알기네이트 (alginate), 펙틴(pectin), 콘드로이틴 (chondroitin), 및 헤파란 (heparan))을 수정한다. 미생물 C-S β-리아제 (Microbial C-S β-lyases)는 음식물 화합물 및 간 효소들에 의하여 형성되는 제노바이오틱스의 시스테인-S-접합체(cysteine-S-conjugates) 둘 다에서 발견되는 C-S 결합을 쪼갠다. 이 효소들은 피리독살 5-포스페이트 (pyridoxal 5-phosphate) (PLP) 및 시스테인-유래 치환체의 α-아미노 그룹 사이에서 알디민 연결 (aldimine linkage)을 생성시켜, 인접한 양성자 (프로톤, protone)를 산성화시킨다. β-제거 (β-elemination)는 티올-함유하는 대사물 (thiol-containing metabolite) 및 아미노아크릴레이트 (aminoacrylate)를 방출시키며, 후자는 자동적으로 쪼개져 암모니아 및 피루베이트 (pyruvate)를 형성한다. 미생물은 더 나아가 이들 티올을 대사 시킬 수 있어, 이들의 물리적 성질 및 신체 내에서의 위치를 변경시킨다. 예를 들어, 장내 박테리아 C-S β-리아제는 폴리클로리네이트된 바이페닐 (polychlorinated biphenyls)의 시스테인-S-접합체를 쪼개 티올 대사물을 생산하며 이는 더 나아가 메틸화 되고 및 숙주의 지방친화성 조직에 축척 된다.
조정 (Modulate): 어떤 측정 또는 비율을 조절 (regulate), 변경 (alter), 적응 (adapt), 또는 adjust (조정) 하는 것.
NADPH-사이토크롬 P450 옥시도리덕데이즈 (NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase) (POR): 마이크로좀성 사이토크롬 P450 (P450), 사이토크롬 b5 (cytochrome b5), 스쿠알렌 모노-옥시제네이즈 (squalene mono-oxygenase), 및 헴 옥시제네이즈 (heme oxygenase)에 전자를 전달하는 데 관여하는 플라보단백질 (flavoprotein). POR 으로부터, 작은 마이크로좀성 헤모단백질인, 사이토크롬 b5에 전자 전달은 지방산 불포화화효소 (desaturase) 및 신장효소 (elongase) 활성을 지지하기 때문에 지방산 대사에 중요하다. 사이토크롬 b5는 또한 마이크로좀성 P450에 전자를 전달하는 역할을 한다. 스쿠알렌 모노-옥시제네이즈는 POR에 의해 공여 받은 전자를 스테롤 생합성을 지지하는데 사용한다. 추가적인 전자 수용체는 헴 옥시제네이즈 (heme oxygenase) 이며, 이 효소는 헴 (heme)을 빌리베르딘 (biliverdin), 철(iron), 및, 일산화 탄소(carbon monoxide)로 분해시킨다. POR은 또한 직접적으로 항종양제 마이토마이신 C (mitomycin C) 및 티라파자민(tirapazamine)과 같은 전구약물의 전자-하나의 환원적 바이오활성화를 촉진시킬 수 있다. 리딕 등 (Riddick, DS et al, Drug Metabolism and Disposition (2013) 41 (1): 12-23).
니트로환원효소 (니트로리덕테이즈 Nitroreductase): 6 개의 전자를 필요로 하여 니트로 화합물을 모두 일차 아민 대사물로 (예를 들어, RNO2 → RNO → RNHOH → RNH2) 환원시키는 효소 ((예를 들어, 세포질 분획에 있는 잔틴 옥시데이즈(xanthine oxidase), 알데하이드 옥시데이즈 (aldehyde oxidase); 및 마이크로좀성 분획에 있는 NADPH-사이토크롬 P-450 환원제 (NADPH-cytochrome P-450 reductase)). 지바이다 (Zbaida, S., in Enzyme Systems that Metabolise Drugs and Other Xenobiotics (2002), John Wiley & Sons Ltd., chapter 16, pages 555-66).
정상 건강한 대조군 (Normal Healthy Control): 질병의 증상 또는 다른 임상적 증후를 가지지 않는 개체.
인산염 (Phosphate): 여기서 서술된 탐침 실시예에 부착되었을 때는 -P(O)(O-)2 또는 -P(O)(OH)2의 구조를 가지고 및 탐침 실시예에 부착되지 않았을 때는 P(O)(O-)3 or P(O)(OH)3 구조를 가진 기능 그룹. 어떤 음성적 인산 그룹이든, 해당하는 산소 원자에 음성 전기의 균형을 맞출 수 있는, K+, Na+, Li+, 또는 이와 비슷한 것의 알카리 금속 이온; 암모늄 이온, 또는 다른 양성적으로 전기를 띤 이온화 된 유기 화합물과 같은, 적절한 반대 이온을 포함할 수 있다.
광-활성화된 (Photo-activate): 빛과 같은 빛을 발할 수 있는 에너지 원을 사용하여 기능을 하게 하거나 또는 활성 (활성화)하게 또는 조절하게 하는 것.
보고 잔기 (Reporting Moiety): 육안으로 또는 기계적으로 검출될 수 있는 신호 (시그날)를 생산할 수 있는 능력을 가진 기능성 그룹 또는 분자. 공개되는 특정한 실시예에서는, 보고 잔기는 효소에 공유적으로 부착되게 되기 때문에, 이 보고 잔기는 적절한 검출 방법을 사용하여 효소를 가시화 또는 검출하는 능력을 제공한다.
샘플 (Sample): 생물분자, 예를 들어 핵산 분자 (예를 들어, 유전체DNA, cDNA, RNA, 및/또는mRNA), 단백질, 및/또는 세포를 함유하는 생물학적 시료 (biological specimen). 예시적인 샘플에는 말초 혈액 (또는 혈장 또는 혈청과 같은 이의 분획), 소변, 타액, 객담, 조직 생검체 (tissue biopsy), 볼 스와프 (cheek swabs), 배설물(fecal) 샘플 ((예를 들어, 대변(stool) 샘플)), 호흡기 시료 (respiratory specimen), 외과적 시료 (surgical specimen), 미세 주사 바늘 흡입물 (fine needle aspirates), 양수검사 샘플 (amniocentesis samples) 및 부검 재료 (autopsy material)와 같은 한 개체 (및 박테리아와 같은 하나 또는 그 이상의 병균을 함유 할 수도 있는 개체)로부터의 세포 또는 세포 용해액 (cell lysate)을 함유하는 것들이다. 한 실시예시에서, 샘플은, 개체의 위, 소장, 대장, 또는 직장과 같은 개체의 장으로부터 얻는다. 샘플은 직접 사용될 수도 있으나, 공개되는 방법으로 분석하기 이전에 농축하거나, 여과, 용해, 세척, 및/또는 희석시킬 수 있다.
개체 (Subject): 척추동물과 같은 생물체, 예를 들어 인간인 포유류 같은 생물체. 포유류에는, 이것에 만 국한하지 않으나, 쥐, 유인원, 인간, 농장 동물, 스포츠용 동물, 및 애완 동물이 포함된다. 한 실시예시에서, 개체는 원숭이 또는 다른 비-인간 영장류, 생쥐, 쥐, 토끼, 돼지, 염소, 양, 개, 고양이, 말, 또는 소와 같은 비-인간 포유류 개체이다. 어떤 실시예시에서 개체는 파충류, 양서류, 물고기, 또는 새 (bird)이다. 개체는 공개되는 방법 및 장치를 사용하여 분석되는 샘플의 소스로서 역할을 할 수 있다.
황산염 (Sulfate): 여기서 서술된 탐침 실시예에 부착되었을 때는 SO2O- 또는 -SO2OH의 구조를 가지고 및 탐침 실시예에 부착되지 않았을 때는 SO2(O-)2 또는 SO2(OH)2 구조를 가진 기능 그룹. 어떤 음성적 황산염 그룹이든, 해당하는 산소 원자에 음성 전기의 균형을 맞출 수 있는, K+, Na+, Li+, 또는 이와 비슷한 것의 알카리 금속 이온; 암모늄 이온, 또는 다른 양성적으로 전기를 띤 이온화 된 유기 화합물과 같은, 적절한 반대 이온을 포함할 수 있다.
독성물질 (Toxicant): 인간에 의해 만들어진 또는 인간의 활동으로 환경에 뿌려지는 독극물, 예를 들어 살충제.
제노바이오틱 (Xenobiotic): 약리학적으로, 내분비학적으로, 또는 독성학적으로 활성이 있는 화학적 물질로 이것에 노출되어 있는 생물체의 천연적 성분은 아닌 물질. 제노바이오틱의 예에는, 제한 없이, 음식물, 음식물 보조제, 발암제, 톡신 및 약물이 포함된다.
상기 제공된 용어들의 설명은 불허용 하는 치환 패턴을 포함하려는 의도는 아니다 (예를 들어, 5개 다른 그룹으로 치환된 메틸, 및 이와 같은 것). 그러한 불허용 하는 치환 패턴은 이 분야 통상적인 전문가에게는 쉽게 인식된다. 여기서 공개된 화학식 및 특이적인 화합물들에서, 수소 원자가 존재하며 및 기능 그룹 또는 다른 원자가 제시되지 않은 곳에서는 공식적인 원자가 요건 (그러나 필수적으로 제시되지 않을 수도 있다)을 채운다. 예를 들어,
Figure pct00005
로 그려지는 페닐 링은, 그러한 수소 원자가 그려져 있지 않더라도, “하나”의 탄소가 아닌 페닐 링 각 탄소 원자에 붙어 있는 수소 원자를 포함한다.
여기서 공개되는 및/또는 상기에 정의된 어떤 기능 그룹이든, 여기서 달리 제시되지 않는 한, 치환 또는 비치환 될 수 있다. 여기서 논의된 간행물은 본 출원의 제출 일자 전에 공개된 것만 제공되며 및 각 각은 그 전문이 참고 문헌으로 병합된다. 본 공개가 선 발명에 의한 그러한 간행물을 선행하지 않는 것이라고 인정하는 것으로 여기서 간주되어서는 안된다. 더 나아가, 제공된 간행물의 날짜는 실제 발표된 날짜와 다를 수 있으며 이는 별도로 독립적으로 확인할 필요가 있다.
II. 서론 (Introduction)
A. 약물 대사 (Drug Metabolism)
생물학적 세포막 통과를 촉진시키고 및 이어서 그들의 작용 부위에 접근을 촉진시키는 약물의 친유성 성질은 신체로부터의 이들의 배출을 방해한다. 변화되지 않은 약물의 신장 배출은 거의 모든 치료제의 전반적인 제거에 단지 중간 정도의 역할 만한다, 왜냐하면 사구체 (glomerulus)를 통해 여과되는 대부분의 친유성 화합물은 신장 세관 (renal tubule)을 통과하는 동안에 전체 순환계로 다시 재흡수 되기 때문이다. 그러므로 약물 및 다른 제노바이오틱스의 좀 더 친수성인 대사물로의 대사는 이들 화합물들을 신체로부터 제거하고 및 이들의 생물학적 활성을 종료하는데 필수적이다. 많은 대사적 생물학적전환 반응이 스테로이드, 비타민 및 지방산을 포함하는 내부적 화합물들에도 적용된다. 일반적으로, 생물학적전환 반응은 쉽게 배출될 수 있는 좀 더 극성이고, 불활성인 대사물을 생성하지만, 어떤 경우에는, 강력한 생물학적 활성 또는 독성을 가진 대사물이 생성된다. 약물의 불활성적인 대사물을 야기하는 많은 대사적 생물학적전환 반응은 또한 내생적인 화합물들의 생물학적으로 활성이 있는 대사물을 생성한다. 굿만 및 길만 (Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman, JG and Limbird, L. Eds, 10th Ed. McGraw-Hill Companies, Inc., Intl Edn (2001) at 12 - 15).
약물 대사의 특징은 커다란 개인-간 (inter-individual) 다양성으로 자주 커다란 차이를 가져오는 결과가 되며, 그 결과로서, 약물의 제거 비율 및 이의 혈장 농도-시간 프로화일 (plasma-concentration -time)의 다른 성질이 된다. 그러한 다양성은 왜 환자들이 표준 용량의 약물에 있어 다른 반응을 보이는 주된 이유이며 및 특정한 개인을 위하여 최적의 용량 용법에서 고려되어야 한다. 각 특정한 약물의 상대적인 기여도에 따라 유전적, 환경적, 및 질병-상태 요소들의 조합이 약물 대사에 영향을 준다.
B. 제1 상 및 제2 상 대사 (Phase I and Phase II Metabolism).
제노바이오틱스의 대사는 보통 두 개의 뚜렷한 단계가 관여한다. 제 1 상 대사는 마이크로좀 사이토크롬 P-450 모노옥시게나제 (microsomal cytochrome P-450 monooxygenases)에 의해 제노바이오틱스의 초기 산화, 환원, 또는 탈알킬화 (dealkylation)가 관여되며 (Guengerich, F.P. Chem. Res. Toxicol. 4: 391-407 (1991)); 이 단계는 제 2 상 반응에 필수적인, 하이드록실- (hydroxyl-) 또는 아미노 (amino) 그룹을 제공하는데 자주 필요하다. 산화는 제 1 상 반응에서 가장 흔하다.
제 2 상 대사는 접합 (conjugation), 즉, 약물에의 이온화 된 그룹의 부착, 이 관여된다. 이 그룹에는 글루타치온 (glutathione), 메틸 (methyl) 또는 아세틸 (acetyl) 그룹이 포함되며, 이들은 일반적으로 제노바이오틱스가 좀더 물에 용해되고 및 생물학적으로 활성이 있게 한다. 자주 관련되는 제 2 상 접합 반응은 글루타치온 S-트랜스페라아제 (glutathione S-transferases) (Beckett, G.J. & Hayes, J.D., Adv. Clin.Chem. 30: 281-380 (1993)), 에폭사이드 하이드롤레이즈 (epoxide hydrolases), 설포트랜스페라아제 (sulfotransferases) (Falany, CN, Trends Pharmacol. Sci. 12: 255-59 (1991)), 및 UDP-글루크로닐-트랜스페라아제 (UDP-glucuronyl-transferases) (Bock, KW, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:129-50 (1991)) 에 의해 촉진된다.
C. 생체전환 부위 (Site of Biotransformation )
제노바이오틱스의 대사적인 전환은 일반적으로 그 성격 상 효소적이다. 약물의 생체전환에 관련되는 효소 체계는, 조사된 각 조직에서 어느 정도의 대사적 활성를 가진다 하더라도, 간에 위치해 있다. 상당한 대사 능력을 가진 다른 기관들에는 위장 관, 신장 및 폐가 포함된다. 약물의 비경구적이 아닌 투여 (경구적 투여) 후에는, 용량의 상당한 부분이 전신적 순환계에 도달하기 이전에 장 표피 또는 간에서 대사적으로 불활성화 된다. 이 “첫 번째 통과 (first pass)” 대사는 대사가 잘되는 약물의 경구적 활용을 상당히 제한한다 (Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman, JG and Limbird, L. Eds, 10th Ed. McGraw-Hill Companies, Inc., Intl Edn (2001) at 12 - 15).
약물의 생체전환은 미토콘드리아, 핵 외피 (nuclear envelope) 및 원형질 막 (plasma membrane)에서 또한 일어날 수 있다 하더라도, 주어진 세포 내에서, 대부분의 약물-대사 활성은, 소포체 (enoplasmic reticulum) 및 세포질 (cytosol)에서 발견된다. 제 1상 반응에 관여하는 효소 체계는 주로 소포체에 위치해 있으며, 반면에 제 2 상 접합 효소 체계는 주로 세포질에 있다. 소포체에서 제 1 상을 통해 생체전환 된 약물은 자주 같은 부위에서 접합되거나 또는 같은 세포내의 세포질 분획에서 접합된다.
D. 사이토크롬 P450 모노옥시게나제 체계 ( Cytochrome P450 Monooxygenase System)
사이토크롬 P450 효소들은 모든 살아 있는 생물체에 널리 분포되어 있는 헴-티올화된 단백질 (heme-thiolate proteins)의 상과 (superfamily) 이다. 이 효소들은 제노바이오틱스를 포함한, 과다한 화학적으로 다양한, 내생적 및 외부적 화합물들의 대사에 관여한다. 이들은 보통 분자 산소의 한 원자를 기질에 도입시키고 다른 원자는 물에 병합시키는 복합성분 전자-전달 체인 (multicomponent electron-transfer chain)에서 말단 옥시데이즈 (terminal oxidase)로서 작용한다. 마이크로좀에서, 전자들은, 활면 소포체 (smooth endoplasmic reticulum) 의 지방 막에 있는 사이토크롬 P450와 가깝게 연관되어 있는, 사이토크롬 P450 환원효소 (cytochrome P450 reductase)를 통해 NADPH로부터 공급된다. 사이토크롬 P450는 방향족 및 측쇄 수산화 (aromatic and side-chain hydroxylation); N-, O- 및 S-탈알킬화 (N-, O- and S-dealkylation); N-산화 (N-oxidation); N-수산화 (N-hydroxylation); 설포옥시데이션 (sulfoxidation); 탈아민화 (deamination); 탈할로겐화 (dehalogenation); 및 탈유황화 (desulfuration)를 포함하는 많은 산화적 반응들을 촉매 한다. 몇 개의 환원적 반응들도, 일반적으로 낮은 산소 장력 하에서, 또한 이러한 효소들에 의해 촉진된다.
대략적으로 57개 사이토크롬 P450가 사람에서 기능적으로 활성적이며, 이중 대략 40개가 제노바이오틱 대사에 관여한다. 이들은 17개 과 (familiy) 및 많은 아과 (subfamily)로 분류된다. CYP1, CYP2, 및 CYP3 과에서 약 8에서 10개의 아형은 사람에서 모든 약물 대사 반응에 주로 관여된다. CYP3A4 및 CYP3A5는 함께 50%의 약물의 대사에 관여된다. 다른 과의 멤버들은 스테로이드, 지방산, 비타민 및 다른 내생적 화합물의 생합성 및 분해에 중요하다. 각 개체의 CYP 아형은, 상당한 중복이 자주 있다 하더라도, 기질의 구조적 형태 근거하여 특징적인 기질 특이성을 가진 것으로 보인다.
CYP 효소 체계 이외에, 화학적 산화를 위한 다른 효소는 사이클로옥시게나제 ((cyclooxygenase (COX))라고도 알려진 프로스타글란딘 H 합성효소 (prostaglandin H synthase) (PGHS) 이며, 이는 아라키도네이트 (arachidonate) 대사 및 프로스타글란딘 (prostaglandins), 프로스타사이클린 (prostacyclins) 및 트롬복산(tthromboxanes)과 같은 프로스타노이드 (prostanoids) 형성에서의 초기 효소이다. 내생적 기질, 하이드로퍼옥시-엔도퍼옥사이드 (hydroperoxy-endoperoxide) (PGG2)를 하이드록시-엔도퍼옥사이드 (hydroxy-endoperoxide) (PGH2)로 환원시키는 동안에, PGHS 효소는 지노바이오티스를 동시-산화시킬 수 있다. 이 반응에서, 페놀 화합물, 방향족 아민, 및 폴리사이클릭 방향족 탄화수소 (polycyclic aromatic hydrocarbons)와 같은 넓은 범위의 화학물이 전자 공여체로서 작용할 수 있다. 간에 있는 수많은 CYP 효소와 달리, PGHS는 간 이외의 조직에서 제노바이오틱스 대사의 또 다른 효소이다. 보겔 ((Vogel, C., Curr. Drug Metab. (2000) 1(4): 391-404)).
E. 가수분해 효소 (Hydrolytic enzymes)
몇 몇의 비 특이적 에스테레이즈 (esterases) 및 아미데이즈 (amidases)가 사람의 간, 장, 및 다른 조직의 소포체에서 동정되었다. 에스터(easter) 및 아마이드 (amide)의 가수분해 후에 노출된 알코올 및 아민 (amine) 그룹은 접합 반응에 적절한 기질이다. 굿만 & 길만 (Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman, JG and Limbird, L. Eds, 10th Ed. McGraw-Hill Companies, Inc., Intl Edn (2001) at 12 - 15).
마이크로좀 에폭사이드 하이드로레이즈 (Microsomal epoxide hydrolase)는 필수적으로 모든 조직의 소포체에서 발견되며, 및 사이토크롬 P450 효소들에 가까운 곳에 존재한다. 에폭사이드 하이드로레이즈는 일반적으로 해독 효소 (detoxification enzymes) 로 간주되며, 사이토크롬 P450 산화 반응으로부터 발생되는 아주 반응력이 좋은 아랜 옥사이드 (arene oxides)를 불활성인 수용성 (water-soluble) 트란스디하이드로디올 (transdihydrodiol) 대사물로 가수분해 시킨다.
글라코시데이즈 (Glycosidases) 및 설파테이즈(sulfatases)는 약물 대사를 위해 중요한 더 나아간 가수분해제 (하이드로레이즈)이다. 이들은 글리코사민글라이칸 (glycosaminoglycans) 및 스테로이드 (steroids)를 포함하는 내생적인 기질을 주로 대사 시키나, 이들은 또한 어떤 제노바이오틱 기질들도 받아들인다; 이는 특히 베타-글루크로니데이즈 (beta-glucuronidase)에 대해서는 맞다. 장 미생물군 (gut flora)은 글루크로나이드 (glucuronides) 또는 황산염 (sulfates)으로서 담즙을 통해 배출되는 화합물들을 탈접합 (deconjugate) 시킬 수 있다; 탈접합 생산물은 자주 장으로부터 재흡수 되어 장간 순환 (enterohepatic circulation)을 초래한다. 글리코시데이즈 (Glycosidases)는 많은 경우에 독성화 시킨다; 자주, 천연물의 독성 및 돌연변이유발성질은 배당체 (glycosides)에 있는 당 잔기에 의해 은닉 (masked) 되며 및 탈당화 (deglycosylation)는 이들의 독성 효과를 나타내게 한다. 오에쉬-버트로모위즈, F. 오에쉬 (Oesch-Bertlomowicz, F. Oesch, Comprehensive Medicinal Chemistry II (2007) 5: 193-214). 오가노설페이트 에스터 분열은 (Organosulfate ester cleavage) 설파타제 (sulfatase) 효소에 의해 촉진되어, 해당하는 알코올 및 무기 황산염이 형성되는 결과가 된다. 설파타제 (sulfatase)는 SULTs의 작용에 의해 형성된 황산염 에스터 (sulfate esters)의 가수분해를 촉진시킨다. 세 부류의 설파타제 효소가 발견되었으며 및 촉매에 사용되는 보조인자의 유형에 의해 구별된다. 그룹 1 효소는, 아릴설파타제 (arylsulfatases) 라고 하며, 아케아 (archaea), 박테리아(bacteria), 및 진핵세포 (eukaryotes)에서 발견되고 및 칼슘 또는 마그네슘 이온 및 포밀글라이신 (formylglycine) (FGly) 보조인자를 필요로 한다. FGly는 시스테인 (cysteine) 또는 세린 (serine) 측쇄 (side chain)의 번역-후 산화 (post-translational oxidation)에 의해 형성되는 제 1 유형 설파타제의 활성 부위에서 거의 전적으로 발견되는 촉매적으로 필수적인 잔기이다. 애펠, MJ, 베르토찌, C.R. (Appel, MJ, Bertozzi, C.R., ACS Chem. Biol. (2015) 10(1): 72-84). 진핵세포 설파타제 효소들은 스테로이드, 지방, 및 글루코사미노글라이칸 (glycosaminoglycans)에서 황산염 에스터 연결부위의 가수분해와 같은, 다양한 여러 공정에 관여된다. 쉐파아트, E.M., 브로데릭, JB (Schepart, E.M., Broderick, JB, in Comprehensive Natural Products II (2010) 8: 625-661).
프로테아제 (Protease) 및 펩티데이즈 (peptidase) 효소는 널리 분포되어 있으며 및 폴리펩티드 약물의 생체전환에 관여된다.
F. 접합 반응 (Conjugation reactions)
내생적 화합물의 활성화 형태 및 적절한 트랜스페라아제 (transferase) 효소 둘 다가 접합 대사물 형성에 필요하다.
G. 글루크론화 ( Glucuronidation )
글루크론화는 R-OH, R-NH2, R-COOH 및 다른 것과 같은 여러 가능한 기능 그룹 중 하나와 유리딘 5’ 디포스포글루크론산 (uridine 5’ diphosphoglucuronic acid)의 반응이 관여된다. 이 반응은, 많은 조직에 있는, UGTs ((또한 글루크로닐트랜스페라아제 (glucuronyltransferases)라고도 불린다))에 의해 대사 된다. 사이토크롬 P450 효소와 함께, UGTs는 대사 경로 80% 이상을 대표한다. 글루크론화되는 부위는 일반적으로 전자-풍부한 친핵성 헤테로원자 (산소, 질소 또는 유황)이다. 데그루트, MJ 등 (DeGroot, MJ et al, Comprehensive Medicinal Chemistry II (2007) 5: 809-25). UGTs는 두개의 뚜렷한 유전자 과 (family)를 가진다: UGT1 및 UGT2로서, 후자는 유전적 다형성을 보인다. 사람에서는, 16개까지의 아과 (subfamily) 1A 및 2B에 속하는 기능적으로 다른 UGT 동질체 (isoform)가 규명되었다.
(https ://www.pharmacogenomics.pha.ulaval.ca/ugt-alleles-nomenclature/), 이들은 뚜렷하지만 교차되는 기질 특이성을 가진다. 경구로 투여된 제제들의 일차-통과 글루크론화(first-pass glucuronidation) (또는 UGTs에 의한 조기 제거)는 보통 경구 생리활성이 좋지 않고 효과가 부족한 결과가 되기 때문에, 페놀릭 (phenolics)류의 심도 있는 글루크론화는, 예를 들어, 경구 생리활성에 장애가 될 수 있다. 우, B. 등 (Wu, B. et al, J. Pharm. Sci (2011) 100(9): 3655-81). 에제티미베 (ezetimibe) 및 모르핀 (morphine)의 글루크로나이드는 모 화합물과 같거나 또는 보다 더 강력하다. 대두 및 다른 콩류에서 발견되는 어떤 천연 이소플라본 페놀릭류의 글루크로나이드 ((예를 들어, 다이드제인 (daidzein) 및 제니스테인 (genistein))는, 에스트로겐 수용체 결합 (estrogen receptor binding) 및 자연 살상 세포 활성화 (natural killer cell activation)를 포함하는, 접합되지 않은 모 화합물의 생물학적 활성보다 약한 활성을 유지한다.
H. 설폰화 (Sulfonation)
제노바이오틱스 및 스테로이드 및 신경전달물질과 같은 작은 내생적 기질들의 설폰화는 자연에 널리 분포되어 있으며, 및 미생물에서 사람까지의 생물체에서 일어난다. 설폰화 과정은 설포(sulfo) (SO3 -) 잔기가, 일반적으로 수용체 분자의 하이드록실 (hydroxyl)로 이전됨이 관여되며, 이는 설포트란스페라제 (sulfotransferases) (SULTs)에 의해 촉진된다. 이 반응의 보편적인 설폰산염 (sulfonate) 공여자는 3’-포스포아데노신 5’-포스토설포네이트 (3’-phosphoadenosine 5-phosphosulfonate) (PAPS)이다. 대부분의 제노바이오틱스 ((예를 들어, 아세토아미노펜 (acetaminophen)) 및 작은 내생적 기질 (예를 들어, 도파민)의 경우, 설폰화는 일반적으로 좀 더 수용성인 산물로 만들게 하고, 이로서 신장 또는 담즙을 통한 배설을 도와주며, 및 생물학적 활성을 더 적게 하는 탈독성화 경로로 간주된다. 어떤 제노바이오틱스, 예를 들어 하이드록실 헤테로사이클릭 아민 (hydroxyl heterocyclic amines) 및 하이드록시메틸 폴리사이클릭 아로마틱 하이드로카본 (hydroxymethyl polycyclic aromatic hydrocarbons)에서, 설폰화는 돌연변이성이고 및 발암성을 가진 반응력이 높은 친전자성이 되게 한다. 머리카락 성장 자극제 미녹시딜 (minoxidil) 및 신경내분비 펩티드(neuroendocrine peptide) 콜레시스토키닌 (cholecystokinin)의 설폰화는 이들의 생물학적 효과를 내게 하고, 이의 수용성을 증가시키고 및 생물학적 활성을 감소시킨다. 가마지, N. 등 (Gamage, N. et al, Toxicological Sci. (2006) 90(1): 5-22). 사람에서는 세 가지 SULT 과인, SULT1, SULT2, 및 SULT4가 알려 졌으며 이들은 뚜렷하지만 기질 특이성이 중복되는 적어도 13 개의 뚜렷한 멤버들을 함유한다. SULTS의 넓은 기질 특이성은 이러한 효소들의 다양한 형태가 존재한다는 사실 때문이며, 및 어떤 동형체 (isoform)의 결합 부위는 유연해서 (plastic), 효소가 여러가지 구조를 수용할 수 있게 하여 작은 방향족 (small aromatics), L-모양 방향족 (L-shaped aromatics), 및 융합된 링 (fused ring) 화합물과 상호작용할 수 있게 한다.
I. 아세틸화 (Acetylation)
두 개의 N-아세틸트랜스페라아제 (N-acetyltransferases) (NAT1 and NAT2)가 아민, 하이드라진(hydrazines) 및 설폰아민 (sulfonamide)의 아세틸화에 관여된다. 대부분의 약물 접합체와는 반대로, 아세틸화된 대사물은 자주 모 약물 (parent drug) 보다 덜-수용성이다. 굿만 & 길만 ((Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman, JG and Limbird, L. Eds, 10th Ed. McGraw-Hill Companies, Inc., Intl Edn (2001) at 12 - 15)).
J. 글루타치온 S- 트랜스페라아제 ( Glutathione S- Transferase )
글루타치온 S-트랜스페라아제 (Glutathione S-transferases)는 알리파틱 (aliphatic), 아로마틱 (aromatic), 또는 헤테로사이클릭 (heterocyclic) 라디칼 (radical)은 물론 에폭사이드 (epoxides) 및 아랜 옥사이드 (arene oxides)를 글루타치온 (glutathione) (GSH)에 첨가시키는 것을 촉진한다. 이들 글루타치온 접합체들은 그후 주로 신장 효소에 의해 시스테인 (cysteine) 유도체로 쪼개지며 및 그후 아세틸화 되고, 이로서 N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine) 유도체가 형성된다. 반응성이 있는 중간 물질로 전환되고 그후 GSH에 결합되는 화합물들의 예에는, 이것에 만 국한하지 않으나, 브로모벤젠 (bromobenzene), 클로로포름 (chloroform), 및 아세트아미노펜 (acetaminophen)이 포함된다. 그러한 독성물질은 GSH를 고갈시킬 수 있다. GSH의 고갈은 지질 과산화(lipid peroxidation)에 대항하는 신체의 방어 능력을 감소시킬 수 있다. 산화환원효소 (oxidoreductase) 부류의 효소인 글루타치온 퍼옥시데이즈 (Glutathione peroxidase) (GPx)는 글루타치온 산화를 통해 과산화 수소 (hydrogen peroxide) 및 오가닉 퍼옥사이드(organic peroxides)의 해독성 환원을 촉진시킨다. GSH는 이황화 (disulfide)로 연결된 이배체 (GSSG)로 산화되며, 이는 능동적으로 세포 밖으로 펌프 되며 및 대개는 환원된 글루타치온으로 재전환 되기는 어렵다.
GSH는 또한 글루타치온 퍼옥시데이즈 (glutathione peroxidase)의 보조인자이다. 그러므로, 글루타치온이 다른 경로로 재합성이 되지 않는 한, 산화된 글루타치온의 사용은 사용가능한 글루타치온 양의 감소와 연관된다.
산화환원효소 부류의 플라보프로테인 (flavoprotein) 효소인, 글루타치온 환원효소는 (Glutathione reductase) (NADPH), 세포의 글루타치온을 환원형으로 유지시키는데 필수적이다 ((칼버그 및 메너빅(Carlberg & Mannervick, J. Biol. Chem. 250: 5475-80 (1975)). 이는 NADPH 존재 하에서 산화된 글루타치온 (GSSG)을 환원된 글루타치온으로의 환원을 촉진시키며 및 적혈구에서 약 500:1의 높은 세포내 GSH/GSSG 비율을 유지한다.
GSH의 합성은, 음식물 소스로부터 또는 시스티오네이즈 (cystathionase) 경로를 통해 음식물 메티오닌의 전환에 의해 얻어져야만 하는 조건적 필수 아미노산인, 시스테인을 요구한다. 만약 시스테인 공급이 충분하면, 정상적인 GSH 수준이 유지된다. 만약 증가된 GSH 소모인 경우에 GSH 항상성 유지하기에 시스테인 공급이 불충분하면, GSH 고갈이 일어난다. 급성 GSH 고갈은 심한 --자주 치명적인―산화적 및/또는 알킬화 상처의 원인이 되며, 및 아세트아미노펜과 같은 GSH-고갈하는 약물의 투여, 또는 GSH를 고갈시키는 질병 및 컨디션 때문에 일어나는 만성 및 천천히 일어나는 GSH 부족은, 비슷하게 쇠약하게 할 수 있다.
K. 환원효소 (Reductases)
알도-케토 환원효소 (aldo-keto reductases) (AKRs) 및 짧은 체인 탈수소화효소/환원효소 (dehydrogenases/reductases) (SDRs)는 제노바이오틱스 카보닐 (carbonyl)이 관여하는 산화-환원 반응을 촉진하는 주 효소들이다. AKRs은 CYPs 또는 다른 효소 체계에 의한 대사적 전환에 의해 도입되거나, 또는 모 제노바이오틱 (parent xenobiotic)에 존재하는 카보닐의 산화화원 전환 (redox transformation)에 관여된다. AKR1B에 대한 연구를 추진하는 주된 추진력은, 예를 들어, 이 효소가 고혈당 부상에 잠재적으로 관여한다는 것이며 및 당뇨 합병증의 치료에 특이적인 AKR1B1 억제제의 전망이다.
L. 장 미생물총에 의한 대사물 형성 (Metabolite formation by gut microbiota)
제노바이오틱스의 미생물적 대사는 사람 숙주내에서 일어나는 대사공정과 동시에 일어나고 및 자주는 경쟁하는 맥락에서 이해되어야 한다. 경구로 섭취되는 화합물들은 상부 GI 관을 통과하여 소장으로 가며 여기서 이들은 소화 효소들에 의해 수정될 수 있으며 및 숙주 조직 (host tissue)에 의해 흡수된다. 바로 흡수된 제노바이오틱스는 장 상피세포 사이를 또는 장 상피세포를 통해 통과되며, 여기서 이들은 간 문맥 (portal vein)을 통해 간으로 전달되기 전에 숙주 효소에 의해 가공된다. 간의 풍부한 대사 효소 집단에 노출된 후, 제노바이오틱스 및 이들의 대사물은 전신 순환계로 들어가며, 조직으로 분포되며 잠재적으로 멀리 떨어져 있는 기관에 영향을 준다. 반면에, 정맥 주사로 투여된 화합물들은 이 “일차-통과 (first-pass)” 대사를 피해가고 및 바로 전신 순환계로 유입된다. 순환계에 있는 화합물은 궁극적으로 더 나아가 대사되고 및/또는 배출되며, 이는 일반적으로 담관을 통해 장 루맨 (gut luman)으로 되돌아 일어나거나 (담도 배출) 또는 신장을 통해 소변으로 가서 일어난다. 장 루맨으로 되돌아온 대사물은 계속해서 대장으로 가서, 여기서 결국 대변으로 배출될 수 있거나, 또는 이들은 소장에서 장간 순환 (enterohepatic circulation)으로 알려진 과정을 통해 잠재적으로 숙주 세포에 의하여 재흡수 될 수 있다. 코펠, N. 등 (N. et al., Science (2017) 356 (6344): 1246 DOI: 10.1126/science.aag2770).
제노바이오틱스는 그러므로 여러 경로를 통해 장 미생물을 만날 수 있다. 소장에서 흡수된 화합물들과는 반대로, 잘 흡수되지 않는 제노바이오틱스는 소장을 통해 계속적으로 대장으로 가며 및 장 미생물에 의해 전환될 수 있다. 바로 흡수된 화합물들 및 다른 경로를 (예를 들어, 정맥 주사) 통해 투여된 화합물들은 또한 담도 배출을 통해 장 미생물에 닿을 수 있다. 장 미생물 대사 산물은 숙주에 의해 흡수될 수 있어 전신적으로 순환될 수 있거나 또는 GI 관을 덮고 있는 상피세포와 국부적으로 상호 작용할 수 있다. 궁극적으로, 이들 미생물 대사물들은 대변으로 배출되거나 또는 신장에 의해 여과되고 및 소변으로 배출된다. 전체적으로, 인간 및 미생물 에서의 전환은 숙주 및 미생물 멤버들 둘 다에게 영향을 주는 복잡한 서로 얽힌 대사 넷트워크를 생성한다.
전신적 흡수 후 산화적 및 접합적인 대사가 선호적인 것과는 반대로 장 미생물총에 의한 대사는 대부분 환원적이며 가수분해적이다 ((클라센CD 및 쿠이 JY (Klaassen CD and Cui JY, (2015) Drug Metab. Dispos. 43:1505-1521)). 제노바이오틱 대사와 연관된 많은 효소 부류들 ((가수분해제 (hydrolases), 라아제(lyases), 산화환원효소 (oxidoreductases), 및 트랜스페라아제 (transferases)) 및 여기서 강조된 많은 효소들이 서열분석 된 장 미생물 중에 널리 분포되어 있다. 그러므로 제노바이오틱의 많은 중요한 전환은 많은 다른 계통발생적 그룹의 장 미생물에 의해 수행될 수 있을 것 같다. 그러나, 서열 유사성이 높은 효소들이 차별되는 화학적 반응을 촉진시킬 수 있으므로 광범위한 해석은 기질 특이성을 예측하지 못하다는 것을 주지하는 것이 중요하다. 대사 활성은 가까이 연관된 균주들을 사이에 불연속적으로 분포될 수 있고 및 수평적 유전자 전달을 통해 얻어 질 수 있으므로, 장 미생물 대사 능력을 계통발생적 분석으로부터 만 추론하는 것은 문제가 있게 한다. 코펠, N.등 ((Koppel, N. et al., Science (2017) 356 (6344): 1246; DOI: 10.1126/science.aag2770)).
약물- 및 제노바이오틱-대사하는 제 1상 효소들 (약물/제노바이오틱을 산화하는 효소들을 포함) 및 제 2 상 효소들 (약물/제노바이오틱의 접합/수정을 촉진하여 접합된 물질로 하는 효소를 포함)의 발현과 활성이 인간과 같은 포유류의 전체적인 약동학적 프로파일의 주된 결정 인자이므로, 거의 모든 약학적 약물에 대해 이들의 대사적 프로파일을 검증하는 것이 필요하다. 즉, 제 1상 및 제 2 상 효소들에 의해 약물들이 어떻게 대사 되는가 하는 것이다. 이러한 효소에는 전형적으로 간 및 장 미생물총에 존재하는 효소들이 포함된다. 마찬가지로, 잠재적으로 독성인 제노바이오틱스 (예를 들어, 살충제 및 환경에 있는 다른 화학적 오염물질)는 인간에서의 대사를 검증할 필요가 있다.
인간의 장 (gut)은 모든 인간 집단에 널리 있는 잘-정의된 핵심 셋트 (core set)의 생물체가 부족하나, 그럼에도 건강한 개인에 걸쳐 있는 미생물총은 1,000 개 이상 (>1000)의 미생물 분류군의 다른 조합으로부터 일어나는 제노바이오틱 대사를 위한 공통의 기능적 능력을 가지고 있다. 한 개인 내에서도, 일생 동안에 미생물총이 그 조성이 변한다 하더라도 지노메타볼리즘 (xenometbolism)은 대체적으로 유지된다. 이는 환경- 또는 약리학적으로-유도된 독성 및 질병에 대한 장 미생물총-가능한 감수성에 대한 분자적 근거를 이해한다는 것은 메타지놈 (metagenome) 단독 만으로는 쉽게 추론될 수 없다는 것을 제시한다. 이는 또한 분류학적 조성이 개인 간에 차이가 있는 것이 다양한 지노메타볼릭 기능 (xenometabolic function)을 나타내게 하지는 않을 수도 있다는 것을 제시한다. 미생물총-제노바이오틱 상호작용의 좀더 정확한 모델은 지노메타볼리즘을 세가지 구조적 수준에서 고려한다: 커뮤니티 지노메타볼리즘 (community xenometabolism), 분류군-수준의 지노메타볼리즘 (taxa-level xenometabolism), 및 효소-수준 (enzynme-level)의 지노메타볼리즘. 복합적인 지노메타볼릭 경로는 이들 계층적 스케일 내에서 및 사이의 상호 작용을 통해 자주 나온다. 커뮤니티 수준에서는, 공간적 및 조성적 구조는 증식, 활성, 및 특정 분류군 (taxa)의 생존에 영향을 준다. 종의 수준 (species level)에서는, 지노메타볼리즘을 위한 효소들의 발현은 여러가지 조절 기전에 의해 조절된다. 최종적으로, 효소 수준에서 실제의 생체 전환이 수행된다.
현재, 제노바이오틱 대사는 간 마이크로좀 추출물을 제노바이오틱으로 처치하여 주로 결정하고, 그후 얼마간의 배양 후에 제노바이오틱의 어떤 대사물이 존재하는지를 결정한다. 대사물이 결정된 후에 그후 제노바이오틱이 거친 대사 타입에 대한 가정을 할 수 있다. 어떤 것이 존재 하느냐에 대하여는, 이들 효소 과 (enzyme family)의 단백질 수준을 결정하는 데는 오랫동안 항체가 있어왔다. 각 개별적인 효소의 기여에 대한 측정치가 아닌 효소 과 (enzyme family)의 활성에 대한 측정치를 제공하는 비색 (colorimetric) 및 형광 활성 에세이가 있다. 더 나아가, RNA 또는 단백질의 풍부함은 기능적 활성의 수준과는 거의 상관하지 않는다. 그러므로, 제노바이오틱 대사를 평가하는 현재의 방법은 각 개별적이 효소의 활성 기여도에 관하여 충분한 정보를 제공하지 않는다. 추가로, 메타지노믹 (metagenomics) 및 메타트란스크립톰 (metatranscriptomics)과 같은, 장 미생물총에서 제노바이오틱스를 평가하는 현재의 접근 방법은, 상기 논의된 3 가지 구조적 수준에서 첫 번째 두 가지 수준에 대하여 언급할 수 있으나, 세 번째에 대하여 내생적으로 언급하기 어렵다. 이러한 기술들은 이러한 활성과 관련 있는 생물체 또는 효소들을 동정하기에는 충분하지 않다. 예를 들어, 미생물총에서 기능을 분석하는 공통의 접근 방법은 커뮤니티 내의 총 활성을 측정하는 일반적인 에세이를 사용하는 것이며, 및 가장 많이 존재하는 분류군 및 효소들을 동정하기 위하여 커뮤니티로부터 얻은 메타지놈 및 메타트란스크립톰을 사용하는 것이다; 이들은 그후 관찰된 축적된 활성의 우세한 드라이버로 여겨진다 (도 1).
RNA 공정 및 안정성, 필수적인 번역 후 수정, 작은 분자 또는 효소의 산화적 억제, 또는 필수적인 단백질-단백질 및 보조인자 효소 상호작용을 포함하는, 많은 인자들이 유전자 또는 전사체 (transcript)의 풍부함과 효소의 기능과의 직접적인 상관관계를 방해한다. 전사체 풍부함과 효소 풍부함의 상관 관계는 40%정도로 낮다. 그러므로, 전사체와 효소 기능의 상관관계는 더 더욱 낮다. 미생물총에서 기능을 특정한 분류군 (taxa) 및 효소에 정확하게 지정하기 위하여, 새로운 접근 방법이 필요하다, 특히 도 2에서 제시된 것과 같이 모든 수준에서 기능적 활성을 측정할 수 있는 방법이 필요하다.
억제, 항생제 사용 숙주의 다이어트, 장내 세균불균형 (dydbiosis), 지속적인 유기 오염물질, 또는 다른 기전을 통한 장 미생물의 지노메타볼리즘의 교란은 숙주의 건강에, 특히 장 콜로니화가 손상된 초기 시기에, 변화를 가져오는 결과가 된다. 좋은 건강을 위하여 무엇이 이상적인 마이크로바이옴 조성 (microbiome composition) 을 구성하는지는 명확하지 않으나, 마이크로바이옴이 숙주와 함께 일련의 대사적 기능을 수행할 수 있다는 의견일치가 자라나고 있다. 지노메타볼리즘에 관여된다고 알려진 효소 과 (family) 에는 β-글루크로니데이즈 (β-glucuronidases), 아조환원효소 (azoreductases), 니트로환원효소 (nitroreductases), 설파타제 (sulfatases), 및 b-시스테인 리아제 (b-cysteine lyases)가 포함된다. 중요하게, 제노바이오틱에의 노출은 장 미생물총의 조성의 변화를 초래할 수 있고, 잠재적으로 지노메타볼릭 활성을 변경시킨다. 이는 복잡한 피드백 루프 (feedback loop)를 초래할 수 있다. 예를 들어, 유기 오염물질 2,3,7,8-테트라클로로디벤조디옥신 (2,3,7,8-tetrachlorodibenzodioxin) (TCDD)을 포함하는, 아릴 하이드로카본 수용체 (aryl hydrocarbon receptor) (AhR) 작용제(agonists)는 숙주의 대사 및 면역력을 변경시킬 수 있다. 최근 사실에서는 AhR 또한 장 미생물총의 조성을 조절할 수 있다고 제시하며, 및 C57BL6/J Ahr -/- 생쥐는 다양한 장 조성 및 대사적 활성을 가지고 있다. 그러므로 AhR의 제노바이오틱 활성화는 숙주 대사 및 면역성을 변경시키고, 장 미생물총을 변화시킨다. 이는 장 미생물총에 의한 지노메타볼리즘의 변화를 초래할 수 있고, 잠재적으로 생리적 항상성 (physiological homeostasis)을 교란시키고 및 제노바이오틱-유래한 질병에 한 역할을 한다. 미생물총이-매개하는 독성 및 질병 감수성의 기능적 및 분자적 근거를 정의하기 위하여, 노출 위험 평가를 개선하기 위하여, 및 독성 및 감수성에 대한 기능적 바이오마커를 동정하기 위하여, 이 교란 동안의 지노메타볼리즘의 모든 수준을 추적하는 전략의 개발이 필요하다. 본 발명가들은 그러한 전략을 개발하였다.
미생물총-제노바이오틱 상호 작용이 전체적인 대사에 중요한 역할을 하는 반면에, 이와 관련되는 분자적 기전을 이해하는 데는 지식적 틈새 (knowledge gap)가 존재한다. 실제로, 지금까지의 이러한 이해의 많은 경우는 항생제 처치, 무균 동물 (gnotobiotic animals), 또는 전체적인 미생물총으로 또는 미생물총 없이 대사물의 운명을 동정하는 실험 관내 시스템을 사용한 실험으로부터 유래되었다. 그러한 연구는 활성 효소 및 미생물을 동정하는 분자-규모 (molecular-scale)의 해결을 제공할 수 없다. 메타지노믹 (metagenomic) 및 메타트란스크립토믹 (metatranscriptomic) 연구는 이러한 해결을 제공할 수 있다; 그러나, 한 유전자가 존재하거나 또는 발현한다는 것이 한 단백질이 생산되거나 또는 그 단백질이 활성적이라는 것을 반드시 제시하는 것은 아니다. 한 예로, 정제된 β-글루크로니데이즈 (β-glucuronidases)의 활성이 다를 수 있다는 것을 감안하면, 성공적으로 번역된 글루크로니데이즈라도 글루크론화된 대사물에 같은 영향을 주는 것은 아니다. 이러한 차이는 서열분석 기술 한가지 만 사용하여 동정될 수 없으나, 그러나 활성에-근거한 (activity-based) 전략을 결합하면 기능적으로-활성 (functionally-active)인 미생물총 집단을 밝힐 수 있다. 본 발명가들은 강력한 활성-근거한 전략을 개발하였으며, 이 전략은 생체내 기능적 활성을 분자-규모의 측정으로 추론하는 것을 넘어서 움직여야 할 필요성을 직접적으로 다루며, 및 숙주, 미생물총, 및 제노바이오틱스가 어떻게 상호 작용하는가에 대한 좀 더 완전한 이해의 방안을 제공하기 위하여 화학 생물학 (chemical biology) 기술의 사용을 강조한다.
III 탐침 실시예 (Probe Embodiments)
본 공개는 미생물총이-매개하는 독성 및 질병 감수성에 대한 기능적 및 분자적 근거를 정의하는데 효과적인 활성-근거한 탐침 (Activity-Based Probe) ((또한 여기서 “ABP” 또는 “탐침(probe”)이라고도 언급된다))을 제공한다. 공개되는 ABP 실시예는 작은 분자 기질로서 촉매적으로 활성적인 타겟 효소에 의해 활성화되면, 그 효소와 공유결합을 형성한다. 이 탐침은 활성 효소가 존재할 때 만 결합하기 때문에, ABP는 용해물 (lysate), 살아있는 세포, 또는 조직에서 특정한 효소 활성을 보여주는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체 상 지지체 (solid phase support)에 타겟 효소-탐침 복합체를 첨가하기 전에, 타겟 효소를 함유하는 환자의 샘플을 탐침과 반응시킬 수 있고, 이로서 직접적인 타겟 효소-탐침 복합체 (target enzyme-probe complex)를 검출하기 위하여 클릭 가능한 기능 그룹을 함유하는 리포터 분자와 반응이 가능한 탐침에 있는 클릭할 (clickable) 수 있는 기능 그룹이 있다는 것을 생각 할 수 있다. 대안으로, 타겟 효소를 함유하는 환자의 샘플을 탐침과 반응시키기 전에, 탐침을 고체 상 지지체 표면에 부착시키기 위해, 탐침의 클릭가능한 기능그룹을 클릭가능한 기능 그룹-유도된 고체 상 지지체 표면과 반응시켜 탐침을 먼저 고착시키고, 및 그 후 타겟-효소 결합의 간접 검출을 위하여 두 번째 리포터가 사용될 수 있다고 생각 할 수 있다. 그러므로 이 공개는 탐침을 레진 (resin) 또는 지지체 (support)에 부착시키는 것을 촉진하는 잔기를 가진 탐침을 포함하고, 또는 이 탐침이 붙는 효소가 강화되고 및 단백체로 측정되도록 탐침을 라벨시키고, 및/또는 이 탐침이 붙는 효소와 탐침이 더 나아가 분석 ((예를 들어, 이미징 (imaging), SDS-PAGE, 또는 형광-활성화된-세포 분류 (fluorescence-activated cell sorting (또는 “FACS”)) 될 수 있도록 탐침을 라벨 시키는 것이 포함된다. 여기서 서술된 ABP는 탐침을 지지체 또는 레진에 부착시키거나 또는 상기 서술된 대로 탐침 (및 탐침이 부착되게 되는 효소)을 라벨 시키는데 사용될 수 있는 효소-결합 그룹 (enzyme-binding group) 및 태그 잔기 (tag moiety) (또는 이들의 전구체)를 포함하는 구조를 가진다. 어떤 실시예에 따라서는, ABP는 아래 보여준, 일반적인 화학식 I을 만족시키는 구조를 가질 수 있다.
Figure pct00006
인간과 장 미생물총 타겟 둘 다에 포함되는 제노바이오틱 대사에 관여되는 타겟 효소에 탐침이 결합 되는 예시적 시나리오는 (Exemplary scenarios), 제한 없이 다음이 포함된다 : (1) 탐침의 EBG로부터 ERG를 쪼개는 효소로, 이는 효소에 결합될 수 있는 활성화된 EBG를 생산한다; (2) EBG의 타겟 효소에의 선택적 결합, 여기서 탐침은 다른 그룹을 형성하기 위하여 효소에 의해 화학적으로 수정될 수 있는 그룹을 가지고 그후 EBG를 활성화 시켜 탐침이 효소에 결합 될 수 있게 하고; (3) ERG 그룹은 효소에 의해 대체되어 탐침의 EBG는 효소에 결합 되도록 한다.
화학식 I에 관련하여, “EBG”는 효소-결합 그룹 (enzyme-binding group) 이고, “Tag”는 탐침을 가시화하기 위하여 사용될 수 있는 라벨 잔기를 대표하며; 및 ”pTag”는 Tag 잔기로 전환될 수 있거나 또는 탐침을 지지체 또는 레진에 붙이는데 사용될 수 있는 전구체 잔기를 대표한다. 화학식 I에서 보여준 대로, 어떤 ABP 실시예는 더 나아가 효소-반응성 그룹 (enzyme-reactive group) (또는 “ERG”)을 포함할 수 있으나, 이 그룹은 모든 실시예에서 존재할 필요는 없다. ERG의 선택적인 존재는 화학식 I에서 점선으로 나타난다. ERG가 존재하는 실시예에서는, 이는 EBG에 직접적으로 또는 간접적으로 붙는 기능 그룹 또는 분자가 될 수 있으며 및 효소에 의해 EBG로부터 쪼개질 수 있거나 또는 효소에 의해 탐침으로부터 대체될 수 있다. 어떤 실시예에서는, ERG는, 만약 존재한다면, 직접적으로 또는 간접적으로 EBG에 커플 될 수 있다. 어떤 실시예에서는, ERG는 직접적으로 또는 간접적으로 Tag 또는, 다른 한편으로 pTag에 커플 될 수 있다. “직접적으로 커플된 (directly coupled)” 이라는 구절은 참조 그룹이 중간에 다른 것이 없이 서로 화학적으로 커플 됨을 의미한다. “간접적으로 커플된 (indirectly coupled)” 이라는 구절은 참조 그룹이 다른 잔기 (예를 들어, 기능 그룹, 링커, 또는 이들의 조합)를 통하여 서로 화학적으로 커플 됨을 의미한다.
어떤 실시예에 따르면, 화학식 I의 EBG는 화학적으로 수정되면 효소에 결합할 수 있는 그룹이 될 수 있다. 대표적인 EBGs 실시예가 여기서 서술된다. 예시적인 공개되는 실시예에서는, EBG는 ERG를 화학적으로 수정하는 같은 효소에 결합할 수 있는 그룹이 될 수 있다. 어떤 실시예에서는, 효소가 탐침 실시예의 ERB를 쪼갠 후에 EBG는 효소에 공유적으로 결합하게 된다. ERG를 쪼갤 수 있거나 또는 ERG를 대체할 수 있는 예시적인 효소들에는, 이것에 만 국한하지 않으나, NAD(P)H 퀴논 옥시도리덕테이즈 활성((NAD(P)H quinone oxidoreductase activity)이 있는 효소 ((예를 들어, NAD(P)H 퀴논 옥시도리덕테이즈 (NAD(P)H quinone oxidoreductase)), 알도케토환원효소 활성 (aldoketoreductase activity)이 있는 효소((예를 들어, 알도케토환원효소 (aldoketoreductase)), 글루크로니데이즈 트란스페라제 (glucuronidase transferases), 설파타제 (sulfatases), 포스파타제 (phosphatases), 및 프로스타글란딘 H 신테이즈 (prostaglandin H synthases) (PGHSs) 가 포함된다.
어떤 추가의 실시예에 따르면, 효소가 EBG의 기능 그룹을 화학적으로 수정한 후에 (예를 들어, EBG의 기능 그룹을 환원 또는 산화시키는 것과 같은) EBG는 효소에 공유적으로 결합하게 된다. EBG의 기능 그룹을 화학적으로 수정하여 EBG 그룹을 활성화시키는 예시적 효소들에는, 이것에만 국한하지 않으나, 아조(azo)-기능 그룹을 아민으로 전환시키는, 플라빈-의존형 NADH 선호하는 아조환원효소 (Flavin-dependent NADH preferred azoreductases), 플라빈-의존형 NADPH 선호하는 아조환원효소 (Flavin-dependent NADPH preferred azoreductases), 플라빈-없는 NADPH 선호하는 아조환원효소 (Flavin-free NADPH preferred azoreductases)를, 제한없이, 포함하는 아조환원효소 (azoreductases), 또는 니트로 (nitro) 그룹을 아민으로 환원시키는 니트로환원효소 (nitroreductases) 가 포함된다.
어떤 추가의 실시예에 따르면, 단순히 효소 및 탐침을 섞어서 EBG를 효소에 공유적으로 결합되게 할 수 있다. 이러한 방식으로 EBG와 반응시킬 수 있는 효소의 예시에는 β-시스테인 리아제 (β-cysteine lyases)와 같은, β-시스테인 라아제 활성 (β-cysteine lyase activity) 이 있는 효소가 포함된다.
더 추가의 실시예에 따르면, EBG 내에서 광화학적 반응을 유도하는 광원 (light source)에 노출된 후 EBG는 효소에 공유적으로 결합되게 될 수 있어 EBG는 효소의 기능 그룹과 공유결합을 형성할 수 있다. 그러한 실시예에서 EBG에 결합할 수 있는 예시적인 효소에는, 이것에 만 국한하지 않으나, 글루타치온 S. 트란스페라제 (glutathione S transferases), 글루크로노실트란스페라제 (glucuronosyltransferases), 및 설포트란스페라제 (sulfotransferases) 가 포함된다.
Tag (또는 pTag) 잔기는 탐침이 효소에 결합되기 전 또는 결합된 후에 탐침을 더 수정시키는 손잡이 (handle)를 제공한다. Tag 잔기를 포함하는 실시예에서, Tag 잔기는 생물학적 샘플에서 사용이 적합한 검출 기술을 사용하여 검출될 수 있는 리포터 잔기가 될 수 있다. 적절한 Tag 잔기들에는, 검출될 수 있는 신호(시그날)를 발생시킬 수 있는 기능 그룹 및/또는 분자가 포함되며, 이 신호들은 형광 검출 기술 (fluorescence detection techniques), 비색 검출 기술 (colorimetric detection techniques), 결합 에세이 기술 (binding assay techniques), 및 이와 비슷한 것들을 사용하여 검출될 수 있다. 예시적인 공개 실시예에 따르면, Tag 잔기는, 예를 들어, 형광발색단 (fluorophore), 친화력-에 근거한 결합 쌍의 결합 파트너 (binding partner of an affinity-based binding pair), 양자점 (quantum dot), 염료(dye), 및 이와 비슷한 것들이 될 수 있다. 예를 들어, Tag 잔기는 바이오틴 잔기 (biotin moiety), 아비딘 또는 스트랩타비딘 잔기 (avidin or streptavidin moiety), 형광 잔기 (fluorescein moiety), 로다민 잔기 (rhodamine moiety), 쿠마린 잔기 (coumarin moiety), 퀴닌 잔기 (quinine moiety), 또는 이들의 조합이 될 수 있다.
탐침이 pTag 잔기를 포함하는 실시예에 따르면, pTag 잔기는 Tag 잔기를 제공하도록 더 나아가 수정될 수 있으며 및/또는 탐침을 지지체 또는 레진에 고정시키는데 사용될 수 있다. 그러한 실시예에 따르면, pTag 잔기는 전형적으로 그 자체가 Tag 잔기를 포함 하는 화학적인 커플링 파트너와 화학적으로 커플 될 수 있거나 또는 지지체 또는 레진에 결합 되는 기능 그룹이다. 예를 들어, pTag 잔기는 Tag 잔기 및 클릭 가능한 기능 그룹을 포함하거나 (Tag-함유하는 화합물이라고 언급) 또는 지지체- 또는 레진-결합된 클릭 가능한 기능 그룹을 포함하는 (지지체-함유하는 화합물이라고 언급)별도의 화합물에 화학적으로 커플 될 수 있는 클릭 가능한 기능 그룹을 포함할 수 있다. pTag 잔기, Tag-함유하는 화합물, 및/또는 지지체-함유하는 화합물을 위하여 선택될 수 있는 클릭 가능한 그룹 예시에는, 이것에 만 국한하지 않으나, 알킨 그룹 (alkyne groups) 및 아자이드 그룹 (azide groups)이 포함된다. Tag-함유하는 화합물은 형광발색단 (fluorophore), 친화력-에 근거한 결합 쌍의 결합 파트너 (binding partner of an affinity-based binding pair), 양자점 (quantum dot), 염료(dye), 및 이와 비슷한 것들과 같은, 적어도 하나의 Tag 잔기를 포함할 수 있다. 지지체-함유하는 화합물은 지지체 또는 레진, 예를 들어, 생물학적 분석에서 전형적으로 사용되는 것을 포함할 수 있고, 여기서 지지체 또는 레진의 기능 그룹은 클릭 가능한 그룹에 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들어, 공유적으로) 결합될 수 있다. 오직 예시로, 어떤 탐침 실시예는 알킨 (alkyne)을 포함하는 pTag moiety를 포함할 수 있다. 이 탐침 실시예는 Tag 잔기 및 아자이드를 함유하는 Tag-함유하는 화합물 또는 지지체 및 아자이드를 포함하는 지지체-함유하는 화합물 과 각각 커플 될 수 있다. 화학식 I에서 나타난 Tag 잔기를 제공하기 위하여 알킨 및 아자이드는 클릭 화학을 통해 화학적으로 커플링될 수 있다. 어떤 그러한 실시예에 따르면, Tag 전구체 및 Tag- 함유하는 화합물의 클릭 가능한 그룹은 다르다; 즉, 만약 하나가 알킨을 포함하면, 그때는 다른 하나는 아자이드를 포함하여서 (또는 반대로) 두 개의 성분을 연결하고 및 탐침을 형성하는데 클릭 화학이 사용될 수 있도록 한다. 어떤 실시예에 따르면, 탐침이 효소에 결합되기 전 또는 결합 후에, pTag 잔기 및 해당하는 Tag-함유하는 화합물 또는 지지체-함유하는 화합물을 조합하기 위하여 클릭 화학이 사용될 수 있다.
어떤 실시예에 따르면, ABP는 두 개 또는 그 이상의 Tag 잔기들 및/또는 pTag 잔기들과 같은, 복수의 Tag 잔기들 및/또는 pTag 잔기들을 포함할 수 있다. 어떤 그러한 실시예에 따르면, 두 개 또는 그 이상의 Tag 잔기들 및/또는 pTag 잔기들은 EBG에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된다. 어떤 실시예에 따르면, 탐침은 EBG에 부착된 (직접적으로 또는 간접적으로) 두 개의 Tag 잔기를 포함할 수 있다. 어떤 그러한 실시예에 따르면, 각 Tag 잔기는 같은 잔기 또는 서로 다른 잔기 일 수 있다. 또 다른 실시예에 따르면, 탐침은 EBG에 부착된 (직접적으로 또는 간접적으로) 두 개의 pTag 잔기를 포함할 수 있다. 어떤 그러한 실시예에 따르면, 각 pTag 잔기는 같은 잔기 또는 서로 다른 잔기 일 수 있다. 단지 예시로서, 하나의 pTag 잔기는 알킨 그룹을 포함할 수 있고 및 다른 pTag 잔기는 아자이드 그룹을 포함할 수 있다; 두 pTag 잔기의 각각은 알킨 그룹을 포함할 수 있거나; 또는 두 pTag 잔기의 각각은 아자이드 그룹을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에 따르면, 탐침은 하나의 Tag 잔기와 하나의 pTag 잔기를 포함할 수 있다.
어떤 실시예에 따르면, 탐침은 하기의 화학식 II를 만족하는 구조를 가질 수 있다.
Figure pct00007
화학식 II와 관련하여, ERG (만약 존재한다면)는 효소에 의해 EBG로부터 쪼개질 수 있거나 또는 대체될 수 있는 기능 그룹 또는 분자이다; EBG는 제 2상 대사와 관련된 효소와 공유적으로 결합할 수 있거나 또는 장 마이크로바이옴에 존재 하는 기능 그룹이다; 링커a (Linkera )는 알리파틱 (aliphatic) 그룹, 헤테로알리파틱 (heteroaliphatic) 그룹, 아로마틱(aromatic) 그룹, 알리파틱-아로마틱 (aliphatic-aromatic) 그룹, 헤테로알리파틱-아로마틱 (heteroaliphatic-aromatic) 그룹, 헤테로아로마틱 (heteroaromatic) 그룹, 알리파틱-헤테로아로마틱 (aliphatic-heteroaromatic) 그룹, 또는 헤테로알리파틱-헤테로아로마틱 (heteroaliphatic-heteroaromatic) 그룹을 포함하고; 링커b (Linkerb)및 링커c (Linkerc) (만약 존재한다면) 각각 독립적으로 알리파틱 (aliphatic) 그룹, 헤테로알리파틱 (heteroaliphatic) 그룹, 아로마틱(aromatic) 그룹, 알리파틱-아로마틱 (aliphatic-aromatic) 그룹, 헤테로알리파틱-아로마틱 (heteroaliphatic-aromatic) 그룹, 헤테로아로마틱 (heteroaromatic) 그룹, 알리파틱-헤테로아로마틱, (aliphatic-heteroaromatic) 그룹, 또는 헤테로알리파틱-헤테로아로마틱 (heteroaliphatic-heteroaromatic) 그룹을 포함할 수 있다; 각 Tag 잔기는 (만약 존재한다면) 독립적으로 검출 될 수 있는 시그날을 생산 할 수 있는 기능 그룹 (또는 분자)이다; 각 pTag 잔기는 (만약 존재 한다면, Tag가 존재하지 않을 때와 같은) 클릭 가능한 기능 그룹을 포함한다; 각 n, m, p, 및 q 는 독립적으로 0 또는 1이 될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 n, m, p, 및 q 의 어느 하나 또는 그 이상이 0 인 실시 예에서, n, m, p, 또는 q 에 자격이 있는 그룹이 존재하지 않고 및 전에 간접적으로 서로 커플이 된 그룹은 이제 직접적으로 커플 될 수도 있다 ((예를 들어, EBG-Tag (또는 pTag)). q 가 0인 실시예에서, 링커a (Linkera)는 직접적으로 제시된 Tag 잔기 또는 pTag 잔기에 부착된다.
n이 1 인 예시적 실시예에서는, ERG 가 존재하고 및 EBG에 결합된다. 그러한 실시예에 따르면, ERG는 효소와 같은 것에 의해 EBG 그룹으로부터 쪼개 지거나 또는 대체될 수 있는 기능 그룹 또는 분자이다. 효소적으로 쪼개 질 수 있는 ERGs에는, 이것에만 국한하지 않으나, 글루크론산(glucuronic acid) 잔기, 글루크론산 유도체들 ((예를 들어
Figure pct00008
와 같은 아지리딘-기능화된 글루크론산 그룹(aziridine-functionalized glucuronic acid groups)), 설페이트 (sulfate) ((또는 설퍼닉에시드 (sulfonic acid)) 잔기, 포스페이트 (phosphate) ((또는 포스포릭 에시드 (phosphoric acid)) 잔기, 또는 이와 비슷한 것들이 포함된다. 효소에 의해 대체될 수 있는 대표적인 ERGs 에는 이것에만 국한하지 않으나, 할로겐 (halogen) (예를 들어, I, Cl, F, 또는 Br) 또는 -OPh 화학식의 페놀-포함하는 그룹 (phenol-containing group of formula -OPh)으로, 여기서 Ph 그룹은 선택적으로 수소가 아닌 하나 또는 그 이상의 치환체를 포함한다. 예시적인 공개 실시예에서는, ERG는 글루크론산 (
Figure pct00009
);효소적으로 쪼개지기 전에, 글루크론산 잔기와 아지리딘 (aziridine) 링을 형성하는 질소 원자를 포함하는 ERG에 부착된 글루크론산 유도체; 설페이트 (sulfate) ((또는 이의 프로톤화 된 (protonated) 형태)); 포스페이트 (phosphate) (또는 이의 프로톤화 된 형태); 요도 (iodo), 또는 -OPh 그룹의 산소 원자 대비하여 -CH2ONO2 그룹을 페놀링에 오르토 (ortho), 메타 (meta), 또는 파라 (para) 위치에 선택적으로 포함하는 -OPh 그룹으로부터 선택된다.
예시적인 공개되는 실시예에서는, EBG는 (a) 이 그룹이 궁극적으로 공유결합하게 되는 효소에 의해 화학적으로 수정 될 수 있는 기능 그룹을 포함하고; 또는 (b) EBG에 부착된 ERG를 같은 효소가 쪼갠 후 효소와 반응을 위해 활성화 될 수 있고; 또는 (c) EBG에 부착된 ERG를 효소가 대체 시킨 후 그 효소에 결합 될 수 있고; 또는 (d) 광 원 (light source)에 노출 된 후 효소와 반응 위하여 활성화 될 수 있고; 또는 (e) 효소에 노출 되었을 때 효소와 결합 되게 될 수 있는 기능 그룹을 포함 한다. 예시적인 공개되는 실시예에서는, EBG는 아조 (azo) 그룹, 니트로 (nitro)그룹, 오르토- 또는 파라-퀴논 메티드 (ortho- or para-quinone methide)를 형성할 수 있는 오르토- 또는 파라-치환된 페놀 (ortho- or para-substituted phenol) 그룹, 올레핀 (olefin), 아마이드 (amide), 디클로로 디온 (dichloro dione)그룹, 또는 벤질 카보닐 (benzyl carbonyl) 그룹을 포함할 수 있다.
어떤 실시예에 따르면, EBG는 하기에 제시된 하나 또는 그 이상의 화학식 IIAEBG-IIJEBG를 만족시키는 구조를 가진다. 단지 예시적 목적을 위하여, 탐침의 추가적인 성분 (예를 들어, Linkera, Linkerc, 및/또는 ERG)이 연결성을 보여주기 위하여 제시된다.
Figure pct00010
Figure pct00011
여기서 Y’는 O (이경우 ERG가 존재)이고, -N=NR’’ (여기서 R’’는 염료 또는 다른 리포팅 잔기); 또는 니트로; m은 0에서 5로부터 선택되는 정수이고; 및 R’는 독립적으로 알데하이드 (aldehyde), 케톤(ketone), 에스터(ester), 카복실릭 에시드 (carboxylic acid), 아실 (acyl), 아실 할라이드 (acyl halide), 시아노 (cyano), 설포네이트 (sulfonate), 니트로 (nitro), 니트로조 (nitroso), 4차 아민(quaternary amine), CF3, 알킬 할라이드 (alkyl halide), 또는 이들의 조합으로부터 선택되고;
Figure pct00012
여기서 Y는 -CH3 또는 -CF3이고;
Figure pct00013
어떤 실시예에 따라서, 링커a (Linkera )는 알킬렌 옥사이드 (alkylene oxide), 아민 (amine), 아마이드 (amide), 에스터 (ester), -(CH2)n’- 그룹 (여기서 n’ 은 1에서 25, 또는 1에서 10, 또는 1에서 5, 또는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50와 같은 1에서 50까지 범위의 정수이다), 또는 이들의 어느 조합을 포함할 수 있다. 예시적 공개되는 실시예에서, 링커a (Linkera )는 화학식 IIA-Linkera-IIGLinkera 어느 하나 또는 그 이상을 만족하는 구조를 가질 수 있다. 단지 예시적 목적을 위하여, 탐침의 추가적인 성분 (예를 들어, EBG, R, Tag (또는 pTag), 및/또는 Linkerb)이 연결성을 보여주기 위하여 제시된다.
Figure pct00014
여기서 n’은 1에서 25, 또는 1에서 10, 또는 1에서 5, 또는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50와 같은 1에서 50까지 범위의 정수이다;
Figure pct00015
여기서 n’은 1에서 25, 또는 1에서 10, 또는 1에서 5, 또는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50와 같은 0에서 50까지 범위의 정수이고, 및 Z는 산소 또는 NR'''이며, 여기서 R'''는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이다;
Figure pct00016
여기서 n’은 1에서 25, 또는 1에서 10, 또는 1에서 5, 또는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50와 같은 1에서 50까지 범위의 정수이고, 및 Z는 산소 또는 NR'''이며, 여기서 R'''는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이다.
Figure pct00017
여기서 n’은 1에서 25, 또는 1에서 10, 또는 1에서 5, 또는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50와 같은 1에서 50까지 범위의 정수이고, 및 Z는 산소 또는 NR''' 이며, 여기서 R'''는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이다;
Figure pct00018
여기서 각 n’는 독립적으로 1에서 25, 또는 1에서 10, 또는 1에서 5, 또는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50와 같은 1에서 50까지 범위의 정수이고, 및 Q는 CH2, O, 또는 NR'''이며, 여기서 R'''는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이다; 또는
Figure pct00019
링커b (Linkerb)를 포함하는 실시예서는, 이 잔기는 -(CH2)n’- 그룹 (여기서 n’ 은 1에서 25, 또는 1에서 10, 또는 1에서 5, 또는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50와 같은 1에서 50까지 범위의 정수이다); 아마이드 (amide) 그룹; 또는 이들의 어느 조합을 포함할 수 있다. 예시적인 공개 실시예에서, 링커b (Linkerb) 그룹은 -(CH2)n’- 이 될 수 있으며 여기서 n’은 1에서 5 (1, 2, 3, 4, 또는 5), 또는 -C(O)NR''’CH2- 이 될 수 있고, 여기서 카보닐 (carbonyl) 부분은 링커a (Linkera)에 붙어 있고 및 메틸렌 (methylene) 부분은 Tag (또는 pTag)에 붙어 있으며, 및 여기서 R'''는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이다.
링커c (Linkerc) 포함하는 실시예서는, 이 잔기는 아마이드 (amide), 알리파틱 그룹, 알킬렌 옥사이드 (alkylene oxide) 그룹, 또는 이들의 어느 조합을 포함할 수 있다. 예시적으로 공개되는 실시예에서, 링커c (Linkerc)는 하기에 제시하는 화학식 IIA-Linkerc 또는 IIBLinkerc를 만족하는 구조를 가질 수 있다. 단지 예시적 목적을 위하여, 탐침의 추가적인 성분 (예를 들어, EBG, R, Tag (또는 pTag), 및/또는 Linkera)이 연결성을 보여주기 위하여 제시된다.
Figure pct00020
여기서 n’는 1에서 25, 또는 1에서 10, 또는 1에서 5, 또는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50와 같은 0에서 50까지 범위의 정수이고, 및 Z는 산소 또는 NR'''이며, 여기서 R'''는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이다; 또는
Figure pct00021
여기서 n’는 1에서 25, 또는 1에서 10, 또는 1에서 5, 또는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50와 같은 0에서 50까지 범위의 정수이고, 및 Z는 산소 또는 NR'''이며, 여기서 R'''는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이다.
탐침이 R 그룹을 포함하는 실시예에서는, R 그룹은 R 그룹을 링커a (Linkera)에 연결시키는 카바메이트 (carbamate) 또는 카보네이트 (carbonate)를 포함하는 그룹일 수 있다. 예시적으로 공개되는 실시예에서, R 그룹은 화학식 IIAR-IICR 어느 하나 또는 그 이상을 만족시키는 구조를 가질 수 있다. 단지 예시적 목적을 위하여, 탐침의 추가적인 성분 (예를 들어, EBG, Linkera 및/또는 Linkerb)이 연결성을 보여주기 위하여 제시된다.
Figure pct00022
여기서 Z 및 Z'은 독립적으로 산소 또는 NR'''이며, 여기서 R'''는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이다;
Figure pct00023
여기서 Z 및 Z'은 독립적으로 산소 또는 NR'''이며, 여기서 R'''는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이다;
Figure pct00024
여기서 Z 및 Z'은 독립적으로 산소 또는 NR'''이며, 여기서 R'''는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱고, 및 n'는 1에서 25 또는 1에서 10, 또는 1에서 5 와 같은 1에서부터 50까지 범위의 정수이다; 또는
Figure pct00025
예시적으로 공개되는 실시예에서, 탐침은 하기에 제시되는 구조 어느 것으로부터 선택된 구조를 가질 수 있다.
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
어떤 실시예에 따르면, 탐침은 화학식 IIIA를 만족시키는 구조를 가질 수 있다.
Figure pct00035
화학식 IIIA에 관련하여, 하기의 열거된 치환체가 적용될 수 있다:
ERG는, 만약 존재한다면, 할로겐(halogen), 페놀(phenol), 설페이트(sulfate), 포스페이트(phosphate), 글루크론산 (glucuronic acid), 또는 두 개의 하이드록실 그룹이 EBG의 질소 원자로 대체되어 아지리딘 (aziridine)을 형성한 글루크론산 그룹이 될 수 있다;
EBG는 디클로로 디온 (dichloro dione) 그룹, 페놀 그룹, 올레핀 (olefin), 아조 (azo)그룹, 아마이드 (amide) 그룹, 카보닐 (carbonyl) 그룹, 니트로 (nitro) 그룹, 또는 카본 (carbon) 원자를 포함하는 잔기가 될 수 있다;
각 링커a (Linkera) 및 링커b (Linkerc)는 화학식 II를 위해 상기에 열거된 것이 될 수 있다;
각 Tag, 만약 존재한다면, 독립적으로 검출될 만한 시그날 (signal)을 발생시킬 수 있는 기능 그룹 또는 분자가 될 수 있다; 다른 한편으로, 만약 탐침이 pTag (“Tag 전구체”) 그룹을 포함하면, 그때는 각 pTag는 독립적으로 클릭 가능한 기능 그룹을 포함하는 Tag 전구체가 될 수 있으며; 및 m 은 0 또는 1이 될 수 있다.
화학식 IIIA의 예시적으로 공개된 실시예에서, 다음이 적용될 수 있다:
ERG 가 존재하고 및 요도 (iodo), -OPh 로부터 선택되고, 여기서 Ph 그룹은 수소 이외에 -CH2ONO2 그룹, 또는 글루크론산(glucuronic acid) 그룹과 같은 하나 또는 그 이상의 치환체를 선택적으로 포함할 수 있고 여기서 두 개의 하이드록실 그룹은 EBG의 질소 원자에 의해 대체되어 아지리딘 (aziridine)을 생성한다;
EBG는 화학식 IIAEBG, IIBEBG, IICEBG, IIDEBG, IIEEBG, IIGEBG, IIHEBG, IIIEBG, 또는 IIJEBG 로부터 선택된다;
링커a (Linkera)는 에스터 (ester) 그룹, -(CH2)n’- 그룹, -O(CH2)n’NR''’C(O)(CH2)n’- 그룹이고, 여기서 각 n'은 독립적으로, 1에서 10, 또는 1에서 5, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20과 같은, 1에서 20까지 범위의 정수이고, 및 여기서 R''' 은 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이다;
링커c (Linkerc)는 -NR'''C(O)(CH2)n ’- 그룹 또는 -NR'''C(O)CH2[O(CH2)2]n ’OCH2- 그룹이고, 여기서 각 n'은 독립적으로, 1에서 10, 또는 1에서 5, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20과 같은, 1에서 20까지 범위의 정수이고, 및 여기서 R''' 은 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이다;
각 Tag은, 만약 존재한다면, 형광발색단, (fluorophore), 친화력에-근거한 결합쌍의 결합 파트너, 양자점 (quantum dot), 또는 염료가 될 수 있고; 다른 한편으로, 만약 pTag 그룹이 존재한다면, 그때는 각 pTag는 독립적으로 알킨 (alkyne) 또는 아자이드(azide) 이고; 및
m은 1 이다.
예시적으로 공개된 실시예에서, 화학식 IIIA를 만족시키는 화합물은 하기 제시된 아자이드 (azide)- 및 알킨(alkyne)- 함유하는 화합물로부터 선택될 수 있다.
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
어떤 실시예에서, 탐침은 화학식 IIIB를 만족시키는 구조를 가질 수 있다.
Figure pct00045
화학식 IIIB에 관련하여, 하기의 열거된 치환체가 적용될 수 있다:
EBG는 여기에 서술된 대로 EBG를 광원 (light source)에 노출시킨 후 효소에 결합하게 되는 광-활성화될 수 있는 효소 결합 그룹이 될 수 있고;
링커a (Linkera)는 페놀 그룹이 될 수 있거나 또는 화학식 IIDLinkera를 만족시키는 구조를 가질 수 있고;
링커b (Linkerb)는 -(CH2)n’-로, 여기서 n'는 1에서 5의 범위의 정수이고;
Tag는, 만약 존재한다면, 검출될 만한 시그날 (signal)을 발생시킬 수 있는 기능 그룹 또는 분자가 될 수 있고; 다른 한편으로, 만약 탐침이 pTag (“Tag 전구체”) 그룹을 포함하면, 그때는 pTag는 클릭 가능한 기능 그룹을 포함하는 Tag 전구체가 될 수 있으며; 및
R 은 화학식IIAR, 화학식IIBR, 또는 화학식IICR를 만족하는 구조를 가질 수 있다.
화학식 IIIB의 어떤 예시적 실시예에서, 하기의 치환체 설명이 적용될 수 있다:
EBG는
Figure pct00046
와 같은 디아지리딘 (diaziridine)이 될 수 있거나; 또는 벤조페논 (benzophenone) (예를 들어,
Figure pct00047
);
링커a (Linkera)는 페닐 그룹 또는;
링커b (Linkerb)는 -(CH2)n’- 또는 -(CH2)m[O(CH2)2]n’OCH2-, 가 될 수 있으며, 여기서 각 m은 독립적으로 0 또는 1이고 및 각 n’는 독립적으로, 1에서 25, 또는 1에서 10, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50과 같은, 1에서 50 까지다;
Tag는, 만약 존재한다면, 형광발색단, (fluorophore), 친화력에-근거한 결합쌍의 결합 파트너, 양자점 (quantum dot), 또는 염료가 될 수 있고; 다른 한편으로, 만약 pTag 그룹이 존재한다면, 그때는 각 pTag는 알킨 (alkyne) 또는 아자이드(azide) 이고; 및
R 은 하기의 구조로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00048
여기서 n’는 1에서 25, 또는 1에서 10, 또는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50과 같은 0에서 50까지 범위의 정수이다.
예시적으로 공개된 실시예에서, 화학식 IIIB를 만족시키는 화합물들은 하기에 제시된 화합물들로부터 선택될 수 있다.
Figure pct00049
Figure pct00050
독립적으로, 탐침은 하기에 제시된 화합물 어느 것으로부터도 선택되지 않는다.
Figure pct00051
여기서 R은
Figure pct00052
이다. 그럼에도 불구하고 그러한 화합물들이 여기서 서술된 방법들에 사용될 수 있다는 것도 가능하다.
A. β- 글루크로니데이즈 (β- Glucuronidase ) 및 글루크로노실 트란스페라제 ( Glucuronosyl Transferase ) 탐침 실시예
장 마이크로바이옴에 의해 조절되는 한 경로는 글루크로닐화 (glucuronidation)이다. 글루크로닐화는 포유류의 제 2 상 대사 및 제노바이오틱 제거를 촉진시키며, 글루크론산 (glucuronic acid)의 제노바이오틱스 및 내부적 대사물질에 접합에 의해 일어나서 이들의 용해성을 증가시킨다. 장내에 존재하는 미생물의 β-글루크로니데이즈는 이 접합체를 가수분해 시켜 모 화합물로 되 돌릴수 있어, 변경된 약동학, 치료의 실패, 또는 심각한 부작용을 초래할 수 있다. 최근 연구에서 β-글루크로니데이즈의 해석 ((생물정보학에서, 생물학적 상관성 설명 및 서술을 의미함; 설명 또는 의견제시로 서열 데이터베이스에 첨가하는 생물서열 (biosequence)에 대한 정보의 문서 분야))을 증가시키기 위해 보존된 모티브(conserved motif)가 동정되었다; 그러나, 이러한 유전자들은 장내 미생물총 멤버들 사이에 널리 퍼져 있어, 탈글루크로닌화 (deglucuronidation)에 활성적인 특정한 분류군을 예측하기 매우 어렵게 한다.
제 2상 대사 및 장 마이크로바이옴에서 기능적 활성 규명에 대한 도전을 설명하기 위해, 본 발명가들은 β-글루크로니데이즈에 특이적인 ABP 실시예를 개발하였다. 어떤 실시예에 따라, 이들 ABP 실시예는 상기 서술된 대로 화학식 II 또는 화학식 IIA를 만족하는 구조를 가질 수 있다; 예시적으로 공개된 실시예에서, 이들 ABPs는 또한 하기의 화학식 IVA, IVB, 또는 IVC를 만족시키는 구조를 가진다. 화학식 IVA를 만족시키는 실시예에서, 활성 글루크로니데이즈가 탐침과 반응할 때, 친전자성 o-퀴논 메티드가 형성되며 및 효소의 근처에 있는 친핵성 잔기에 의해 공격 되며, 반응성 그룹과 효소 사이에 공유결합이 형성된다. 화학식 IVC를 만족시키는 실시예에서, 효소의 탐침에의 결합은 형광이 켜지는 (fluorescent turn-on) 반응이 나오게 한다. 탐침의 알킨 핸들 (alkyne handle)은 상기 서술된 대로 클릭화학을 통해 Tag 부착 및/또는 지지체 (support) 또는 레진(resin) 부착을 하게 한다.
Figure pct00053
Figure pct00054
이들 화학식에 관하여, 각 Tag 잔기는, 만약 존재하면, 및/또는 각 pTag 잔기는, 만약 존재하면, 독립적으로 상기 어느 화학식에 대하여 상기 열거된 대로 일 수 있으며 및 링커a (Linkera) 및 링커c (Linkerc)는 상기 어느 화학식에 대하여 열거된 것일 수 있다. 어떤 실시예에 따라, 각 링커a (Linkera) 및 링커c (Linkerc)는 독립적으로 -CH2[O(CH2)2]n’OCH2-, -(CH2)n’-, 또는 -(CH2)n’Ph-, 로부터 선택될 수 있으며, 여기서 각 n’는 독립적으로, 하나에서 25, 또는 하나에서 10, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50과 같이 1에서 50 범위의 정수가 될 수 있다. 다양한 m’은 1 또는 0이 될 수 있다. m 이 0인 실시예에서, 탄소 2는 존재하지 않으며 및 탄소 1 은 링커a (Linkera) 그룹에 부착된다. 그러한 탐침의 대표적인 실시예는 하기에 제시되었으며 및, 특별한 이론에 제한됨이 없이, 어떻게 그러한 탐침 실시예가 효소 커플링에 활성화될 수 있는지에 대한 예시적 기전이 도 3에서 제시되었다. 하기 구조에서 점선 결합 (즉, “----”)이 사용된 곳에서는, 이는 점선 결합으로 붙어 있는 불소 (fluorine) 원자는 선택적으로 존재함을 제시한다 (및 그렇지 않을 때는, 수소 원자가 존재한다).
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
본 발명가들은 또한, 비가역적인 억제제들이 현재 존재하지 않는 효소인, 글루크로노실 트란스페라제 (glucuronosyl transferases)에 특이적으로 결합하는데 사용될 수 있는 ABP 실시예를 개발하였다. 글루크로노실 트란스페라제들은 약물 물질 및 다른 제노바이오틱들의 제 2상 대사에 관련되는 효소들이다. 이 특별한 효소들 중 하나를 타겟으로 하고 및 비가역적인 결합을 형성함으로서, 여기서 서술된 탐침 실시예는 이 제 2 상 효소들의 활성을 결정하거나 또는 영향을 주는데 사용될 수 있다. 글루크로노실 트란스페라제에 결합할 수 있는 탐침은 상기 서술된 대로 화학식 II 또는 화학식 IIIB를 만족하는 구조를 가질 수 있다. 예시적으로 공개되는 실시예에서는, 이들 탐침들은 또한 하기에 제시된 화학식 VA-VC의 어느 하나 또는 그 이상을 만족시키는 구조를 가질 수 있다. 이들 탐침들은 효소에 광-활성화될 수 있고 그후 효소와 결합할 수 있는 ERG를 포함한다. 광-활성화될 수 있는 그룹에는, 이것에 만 국한하지 않으나, 벤조페논 (benzophenone) 그룹 및 디아지린 (diazirine) 그룹 ((예를 들어, 알리파틱 디아지린 (aliphatic diazirines) 및 트리플루오로메틸페닐 디아지린 (trifluoromethylphenyl diazirines))이 포함된다.
Figure pct00059
각 화학식 VA, VB, 및 VC에 관하여, Tag (만약 존재한다면), 또는 pTag (만약 존재한다면)은, 독립적으로 상기 열거된 대로 화학식 IIIB에 대한 것일 수 있다; n은 하나에서 25, 또는 하나에서 10, 또는 하나에서 5와 같이 0에서 50까지로부터 선택될 수 있는 정수가 될 수 있다; m은 1 또는 0이 될 수 있다.
글루크로노실 트란스페라제 ((예를 들어, UDP-글루크로노실 트란스페라제 (UDP-glucuronosyl transferases))에 비가역적으로 결합할 수 있는 대표적인 탐침 실시예들이 하기에 제시된다.
Figure pct00060
Figure pct00061
여기서 각 n'는 독립적으로 0 에서 50까지의 범위이거나 또는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50이다.
B, 글루타치온 S- 트랜스페라아제 탐침 실시예 ( Glutathione S-Transferase Probe Embodiments)
글루타치온 S-트랜스페라아제 (Glutathione S-transferases) (GSTs)는 이들의 세포질, 미토콘드리아, 및 마이크로좀 수퍼훼밀리 (microsomal superfamilies)의 아세포상 (subcellular)의 위치에 따라 분류군되며, 이는 더 나아가 서열 유사성에 근거하여 부류 (class)로 나뉜다. GSTs는 GSH 결합하는 “G” 부위 (“G” site) 및 기질-결합하는 “H” 부위 (“H” site)를 함유한다. 전사체 (transcriptomics) 및/또는 전체 단백체 (global proteomics) 로 측정되는 GSTs의 발현은, 이들의 해독하는 GSH 트랜스페라아제 활성과 자주 일치하지 않는다. 발현과 활성 사이의 이 차이는 알려진 번역-후 수정, 대체 효소-특이적 비-트랜스페라아제 활성, 및 단백질-단백질 상호작용을 변경시키는 활성 때문일 수 있다.
GSTs의 GSH 트랜스페라아제 활성은 GSH-결합하는 G 부위 및 기질 결합하는 H 부위 두 모두의 활성에 의존한다 (도 4 참조). 여기서 서술된 어떤 탐침 실시예는 각 부위를 타겟하고 및 GSTs의 활성을 측정할 수 있으며, 대표적인 실시예시가 도 4에 제시된다. 예시적인 탐침 실시예는 하기 화학식 VIA 또는 VIB의 어느 하나를 만족하는 구조를 가진다.
Figure pct00062
화학식 VIA 및 VIB에 관하여, 하기의 치환체 설명이 적용될 수 있다:
각 X는 독립적으로 할로겐(halogen)이 될 수 있다;
링커a (Linkera)는 알리파틱 (aliphatic) 그룹, 헤테로알리파틱 (heteroaliphatic) 그룹, 아로마틱(aromatic) 그룹, 알리파틱-아로마틱 (aliphatic-aromatic) 그룹, 헤테로알리파틱-아로마틱 (heteroaliphatic-aromatic) 그룹, 헤테로아로마틱(heteroaromatic) 그룹, 알리파틱-헤테로아로마틱 (aliphatic-heteroaromatic) 그룹, 또는 헤테로알리파틱-헤테로아로마틱(heteroaliphatic-heteroaromatic) 그룹을 포함할 수 있다;
Tag는, 만약 존재한다면, 검출될 만한 시그날 (signal)을 발생시킬 수 있는 기능 그룹 또는 분자가 될 수 있고; 다른 한편으로, 만약 탐침이 pTag (“Tag 전구체”) 그룹을 포함하면, 그때는 pTag는 클릭 가능한 기능 그룹을 포함하는 Tag 전구체가 될 수 있으며; 및
화학식 IIIE에 관하여, Y는 할로겐 (halogen) 또는 글루타치온 (glutathione) 잔기가 될 수 있다.
예시적으로 공개되는 실시예에서는, 하기의 치환체 설명이 적용될 수 있다:
각 X는 염소 (chloro)이고;
링커a (Linkera)는 -NR''’C(O)(CH2)n ’-, 또는 -NR''’C(O)CH2[O(CH2)2]n ’OCH2- 이고, 여기서 각 n’는 독립적으로 1에서 10, 또는 1에서 5, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20와 같은 1에서 20까지 범위의 정수이며, 및 여기서 R''’는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이다;
Tag는, 만약 존재한다면, 형광발색단, (fluorophore), 친화력에-근거한 결합쌍의 결합 파트너, 양자점 (quantum dot), 또는 염료가 될 수 있고; 다른 한편으로, 만약 pTag 그룹이 존재한다면, 그때는 각 pTag는 알킨 (alkyne) 또는 아자이드(azide) 이고; 및
화학식 VIB에 관하여, Y는 염소 (chloro) 또는 글루타치온 (glutathione)이 될 수 있다.
예시적으로 공개되는 실시예에서, 탐침은 하기에 제시된 화학식 VIC에 따른 구조를 가질 수 있다.
Figure pct00063
화학식 VIC에 관하여, 링커a (Linkera)는 상기 화학식 IIGLinkera에 대하여 제시된 대로 일 수 있다; EBG는 디아지리딘 (diaziridine) 또는 벤조페논 (benzophenone)과 같은, 광-활성화가능한 그룹이 될 수 있으며; 및 링커b (Linkerb)는 아마이드를 포함할 수 있다. Tag(만약 존재한다면), 또는 pTag (만약 존재한다면), 은 독립적으로 상기 설명된 대로 일수 있다.
예시적인 글루타치온 트랜스페라아제에 비가역적으로 결합할 수 있는 아자이드 (azide)- 또는 알킨 (alkyne)-함유하는 탐침 실시예가 하기에 제시되었다.
Figure pct00064
Figure pct00065
C. 환원효소 탐침 실시예 ( Reductase Probe Embodiments)
어떤 실시예에 따르면, ABP는 아조화원제 (azoreductase), 니트로환원효소 (nitroreductase), NAD(P)H 퀴논 산화환원효소 ((NAD(P)H quinone oxidoreductase)), 또는 알도케토환원효소 (aldoketoreductase) (AKR) 와 같은 환원효소 효소에 선택적으로 결합하는 탐침 일 수 있다. 그런 탐침 실시예는, 화학식 II 또는 화학식 IIIA와 같은, 상기 서술된 화학식의 하나 또는 그 이상을 만족하는 구조를 가질 수 있다.
어떤 실시예에 따르면, 탐침은 아조환원효소에 특이적으로 결합하는 EBG를 포함한다. 그런 탐침 실시예는 아조 (azo) 그룹을 포함하고 이 아조 그룹은 첫번째로 아조환원효소에 의해 화학적으로 수정되어 아민 (amine)을 형성하고, 이는 이로써 EBG ((활성화된 퀴논 메티드 종류 (quinone methide species)를 형성하는 것과 같은))를 활성화시켜 아조환원효소가 탐침에 결합할 수 있게 한다. 아조환원효소를 결합할 수 있는 예시적인 탐침 실시예들이 아래에 제시된다. 어떤 특정한 이론에 제한됨이 없이, 그런 탐침 실시예의 효소 커플링에 대한 활성화의 예시적 기전이 도 3에 제시되었다.
Figure pct00066
추가의 실시예에 따르면, 탐침은 니트로환원효소 (nitroreductase)에 선택적으로 결합하는 EBG를 포함한다. 그런 탐침 실시예는 니트로환원효소에 의해 아민으로 환원될 수 있는 니트로 (nitro) 그룹을 포함하고, 이로써 상기 서술된 아조환원효소 탐침와 비슷한 활성화된 퀴논 메티드 종류 (quinone methide species)를 형성할 수 있다. 니트로환원효소를 타겟으로 하는데 효과적인 탐침의 예시적 실시예들이 하기에 제시된다. 어떤 특정한 이론에 제한됨이 없이, 그런 탐침 실시예의 효소 커플링에 대한 활성화의 예시적 기전이 도 3에 제시되었다.
Figure pct00067
어떤 실시예에 따르면, 탐침은 NAD(P)H 퀴논 산화환원효소 ((NAD(P)H quinone oxidoreductase))에 선택적으로 결합하는 EBG를 포함한다. 그런 탐침 실시예는 NAD(P)H 퀴논 산화환원효소에 의해 대체되는 ERG 그룹을 또한 포함한다. 어떤 실시예에 따르면, ERG는 에스터 (ester) 결합을 통하여 결합되는 페놀 그룹을 가질 수 있다. 페놀성 ERG는 NAD(P)H 퀴논 산화환원효소에 의해 대체될 수 있어 EBG가 NAD(P)H 퀴논 산화환원효소에 결합된다. 그런 탐침의 예시적 실시예가 하기에 제시된다.
Figure pct00068
어떤 실시예에 따르면, 하기에 제시된 탐침은, 여기서 서술된 다른 탐침 하나 또는 그 이상과 조합으로, NAD(P)H 퀴논 산화환원효소에 결합하는데 또한 사용될 수 있다.
Figure pct00069
어떤 실시예에 따르면, 탐침은 알도케토환원효소 (aldoketoreductase) (AKR)의 활성 부위 시스테인 (cysteine) 잔기를 선택적으로 결합하는 EBG를 포함한다. 그런 탐침 실시예는 알도케토환원효소에 의해 쪼개지는 ERG 그룹을 또한 포함한다. 어떤 실시예에 따르면, ERG 그룹은 알도케토환원효소의 시스테인 그룹에 의해 대체되는 반응성 활성 요드 (iodo) 그룹이 될 수 있다. 그런 탐침의 예시적 실시예가 하기에 제시된다.
Figure pct00070
D. 설파타제 및 설포트랜스페라아제 탐침 실시예 ( Sulfatase and Sulfotransferase Probe Embodiments)
또한 여기서 서술된 것은 선택적으로 및 비가역적으로 설파타제 (sulfatase) 효소 및 설포트랜스페라아제 (sulfotransferase) 효소에 결합할 수 있는 탐침 실시예이다. 설파타제 효소에 결합할 수 있는 탐침 실시예는 설파타제에 의하여 탐침의 EBG로부터 첫 번째로 쪼개지는 ERG를 포함한다. 이는 설파타제에 결합될 수 있는 활성화된 ERG (예를 들어, 퀴논 메티드 그룹)를 생산한다. 적절한 탐침은 상기 서술된 화학식 II 및/또는 화학식 IIIA를 만족하는 구조를 가질 수 있다. 설파타제를 타겟으로하는 예시적인 탐침실시예에는 하기 제시된 것들이 포함된다. 어떤 특정한 이론에 제한됨이 없이, 어떻게 그런 탐침 실시예가 효소 커플링을 위하여 활성화될 수 있는가에 대한 예시적 기전이 도 3에 제시되었다.
Figure pct00071
추가의 실시예에 따르면, 탐침은 설포트랜스페라아제 (sulfotransferases)에 선택적으로 결합할 수 있다. 그런 실시예에서, 탐침은 효소에 광-활성화될 수 있고 그후 효소에 결합할 수 있는 광-반응성인 EBG를 포함한다. 상기 서술된 대로, 광-반응성인 EBG는 벤조페논 (benzophenone) 잔기 또는 디아지란 (diazirane) 잔기를 포함할 수 있다. 적절한 탐침은 상기 서술된 대로 화학식 IIIC를 만족시키는 구조를 가질 수 있다. 설포트랜스페라아제에 결합하는데 사용될 수 있는 예시적 탐침 실시예들이 하기에 제시된다.
Figure pct00072
E. 시스테인 리아제 탐침 실시예(Cysteine Lyase Probe Embodiments)
어떤 실시예에 따르면, 탐침은, 장 마이크로바이옴에서 활성인 효소인, 시스테인 리아제 (cysteine lyase)에 선택적으로 결합할 수 있다. 그런 탐침 실시예는 시스테인 리아제의 시스테인 잔기와 공유 결합을 형성하는 올레핀-함유하는 (olefin-containing) EBG를 포함한다. 예시적으로 공개된 실시예에서, EBG는 리아제 (lyase)의 시스테인 잔기의 유황 원자와 공유 결합하는 올레핀을 포함한다. 그런 탐침은 상기 서술된 대로 화학식 II 또는 화학식 IIA를 만족시키는 구조를 가질 수 있다. 예시적인 시스테인 리아제 탐침 실시예들이 하기에 제공된다. 어떤 특정한 이론에 제한됨이 없이, 어떻게 그런 탐침 실시예가 효소 커플링을 위하여 활성화될 수 있는가에 대한 예시적 기전이 도 3에 제시되었다.
Figure pct00073
F. 프로스타글란딘 H 합성제 ( PGHS ) 탐침 실시예 ((Prostaglandin H Synthase ( PGHS ) Probe Embodiments))
어떤 실시예에 따르면, 탐침은, 제 2상 대사에서 활성인 효소인, PGHS에 선택적으로 결합할 수 있다. 그런 탐침 실시예는 PGHS 효소에 의하여 대체되어, 이로서 EBG를 통하여 탐침을 효소에 커플링 시키는, ERG를 포함한다. 적절한 탐침은 상기 서술된 대로 화학식 II 또는 화학식 IIIA를 만족시키는 구조를 가질 수 있다. 예시적인 PGHS 탐침 실시예들이 하기에 제공된다.
Figure pct00074
IV. 탐침 실시예를 제조하는 방법 (Method of Making Probe Embodiments)
본 공개의 활성-근거한 탐침을 제조하는 방법의 예시적인 실시예가 하기에 제공된다. 그런 시약들이 표현적으로 설명되지 않았더라도 어떤 실시예를 위해 해당하는 적절한 시약들이 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
한 예시적인 실시예에서, 활성-근거한 탐침을 제조하는 방법은 하기 계획도 1에 제시된 단계를 포함한다.
Figure pct00075
상기 계획도 1에 제시된 방법의 예시적 실시예들이 하기 계획도 2 및 3A 및 3B에 보여 진다.
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
어떤 예시적 실시예에서, 방법은 하기 계획도 4에 제시된 단계를 포함할 수 있다. 계획도 4에 관하여, “PG”는 니트로-함유하는 (nitro-containing) 시작 재료의 페놀 그룹을 보호하기 위하여 사용되는 보호 그룹을 표시한다. 본 공개의 이익을 위하여, 보호된 페놀의 알데하이드 전환을 위한 적절한 환원효소 및 결과로 얻어지는 1차 알코올을 아마이드-함유하는 (amide-containing) 커플링 파트너와 커플링 하기 위한 커플링 컨디션은 이 분야 기술의 통상 전문가들에 의해 인식 될 것이다.
Figure pct00079
상기 계획도 4에 제시된 방법의 예시적 실시예는 하기의 계획도 5에 보여 진다.
Figure pct00080
추가의 예시적 실시예들이 하기 계획도 6-8에 보여 진다.
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
어떤 실시예에 따라, 탐침 실시예는 하기 계획도 9 에 서술된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 계획도 9에 관하여, 계획도 9에 보여진 시작 구조 (starting structure)와 같은, 광-활성화 가능한 EBG를 포함하는 전구체는, 아마이드 커플링 제를 사용하여, 보여준 프로파길 아민 (propargyl amine)과 같은 알킨 (alkyne) 그룹을 함유하는 아민과 같은, 적절한 아마이드 커플링 파트너와 반응한다. 결과로 얻어진 아마이드 산물의 보호된 아민은 염기 (base) ((예를 들어 피페리딘 (piperidine)) 사용에 의한 것과 같은, 아민 보호 그룹 (예를 들어, Fmoc)을 제거하기에 적절한 컨디션 하에서 탈보호 된다. 결과의 일차 아민 산물은 요도아세틱 안하이드라이드 (iodoacetic anhydride)에 커플시켜 요도아세트아마이드(iodoacetamide) 산물 (예를 들어, 화합물 5)을 형성한다. 요도아세트아마이드 산물은 환원된 글루타치온 잔기 (reduced glutathione moiety)와 커플시켜 탐침을 형성한다. (예를 들어, 탐침 GSH-ABP-G).
Figure pct00084
다른 예시적 방법이 계획도 10에 나타난다.
Figure pct00085
다른 예시적 방법이 계획도 11에 나타난다.
Figure pct00086
계획도 11에 관하여, 사용될 수 있는 컨디션은 다음이 포함된다: a) ) (i)TrCl, Et3N, DMAP, DMF, (ii)NaH, BnBr, TBAI, DMF 0 ℃ 에서 실온 (iii)p-TsOH, MeOH, CH2Cl2,; b) I2, PPh3, 이미다졸 (imidazole), THF, 70 ℃; c) 아연가루 (zinc dust), THF/H2O (9:1), 소니케이션 (sonication), 40 ℃; d) 5, 인디움 가루 (indium powder), La(OTf)3, H2O, 소니케이션 (sonication); e) 2 세대 글룹 촉매 (second-generation Grubbs catalyst), CH2Cl2, 40 ℃; f)(i) DIBAL-H, THF, 0 ℃ 에서 실온, (ii) NaBH4, H2O, EtOAc; g) (i) Cl3CN, DBU, CH2Cl2, 0 ℃ (ii) I2, NaHCO3, H2O; h) (i) 37% HCl, 디옥산 (dioxane), 60 ℃, (ii) NaHCO3, MeOH, 60%, i) Li, NH3, THF, -60 ℃; j) K2CO3, DMF, 더 나아가 할로겐 (halogen)을 포함하는 어느 아자이드(azide)- 또는 알킨 (alkyne)-함유하는 그룹, 80 ℃; 및 k) TEMPO, NaClO, NaBr, NaOH, H2O.
다른 예시적 방법이 계획도 12에 보여 진다.
Figure pct00087
다른 예시적 방법이 계획도 13에 보여 진다.
Figure pct00088
본 공개의 탐침 실시예를 제조하는 또 다른 예시적 방법이 하기 계획도 14에 보여 진다.
Figure pct00089
V. 예시적 방법 (Exemplary Methods)
활성-근거한 탐침은 하기의 예시적 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 관점에 따라, 본 공개는 개체로부터 얻은 샘플에서 제노바이오틱 대사의 효소들 하나 또는 그 이상의 활성을 검출하고 및 측정하는 방법을 제공한다. 그런 방법에는: (a) 개체로부터 샘플 얻고; 및 (b) (i) 타겟 효소에 특이적으로 및 비가역적으로 결합하는 데 효과적인 클릭 화학에 의해 활성화된 활성 탐침에 샘플을 접촉시키고; 및 (ii) 활성 탐침 및 타겟 효소 사이의 결합을 측정하여, 샘플에서 타겟 효소의 활성 검출하는 것이 포함된다.
예를 들어, 다른 관점에 따라, 본 공개는 개체의 장 미생물총에 의해 지노바이노틱의 대사에 기여하는 각 개별 효소를 측정하는 방법을 제공한다. 그런 방법에는: (a) 제노바이오틱을 개체로부터 얻은 샘플과 접촉시키고; (b) 제노바이오틱이 있는 샘플을 배양 기간 동안 배양시키고; (c), 클릭 화학에 의해 활성화된 각 효소 활성 탐침과 샘플을 접촉시켜, 각각 특이적이고 및 비가역적으로 타겟하는 효소에 결합하는데 효과적인, 하나 또는 그 이상의 차별되게 라벨된 효소 활성 탐침에 샘플을 노출 시키고; (d) 대조군과 비교하여 각 활성 탐침과 이의 타겟 효소 사이의 결합을 검출하고, 결합을 측정하거나, 또는 둘 다를 하고; 및 (e) 개별 타겟 효소의 제노바이오틱 대사에의 기여도를 측정한다.
예를 들어, 다른 관점에 따라, 본 공개는 이를 필요로 하는 개체에서 제노바이오틱 대사로 인한 미생물총-독성을 진단하고 및 치료하는 방법을 제공한다. 그러한 방법에는: (a) 제노바이오틱을 개체로부터 얻은 샘플과 접촉시키고; (b) 제노바이오틱이 있는 샘플을 배양 기간 동안 배양시키고; (c) 클릭 화학에 의해 활성화된 각 효소 활성 탐침과 샘플을 접촉시켜, 각각 특이적이고 및 비가역적으로 타겟하는 효소에 결합하는데 효과적인, 하나 또는 그 이상의 차별되게 라벨 된 효소 활성 탐침에 샘플을 노출 시키고; (d) 대조군에 비교하여 각 활성 탐침이 이의 타겟 숙주 효소 및 타켓 미생물총 효소에의 결합을 검출 및 측정하고; (e) 미생물총에 의해-유도된 독성을 지닌 개체를 진단하고, 및 (f) 개체를 (i) 미생물총 집단을 조절하고 및 (ii) 독성을 감소시키는 항생제 (antibacterial agent) 로 치료하는 것을 포함할 수 있다.
어떤 실시예에 따라, “항생제 (antibacterial agent)”라는 용어는, 주로 감염성 질병을 치료하는데 사용되는, 박테리아 및 다른 미생물의 성장을 억제하거나, 또는 박테리아를 파괴하는 능력을 가진 화학적 물질 어는 그룹을 의미한다. 항생제에는, 제한없이, 페니실린 (penicillins), 세파로스포린(cephalosporins), 카바세팸 (carbacephems), 세파마이신 (cephamycins), 카바패냄 (carbapenems), 모노박탐 (monobactams), 아미노글리코사이드 (aminoglycosides), 글리코펩티드 (glycopeptides), 퀴노론 (quinolones), 테트라사이클린 (tetracyclines), 마크로리드 (macrolides), 및 플루오로퀴노론(fluoroquinolones)이 포함된다. 실시예시에는, 제한없이, 페니실린 G (Penicillin G); 메티실린 (Methicillin); 나프실린 (Nafcillin); 옥사실린 (Oxacillin); 크록사실린 (Cloxacillin); 디크록사실린 (Dicloxacillin); 앰피실린 (Ampicillin); 아목시실린 (Amoxicillin); 티카실린 (Ticarcillin); 카베니실린 (Carbenicillin); 메쯔로실린 (Mezlocillin); 아즈로실린 (Azlocillin); 피페라실린 (Piperacillin); 이미패냄 (Imipenem); 아즈트레오남 (Aztreonam); 세팔로틴 (Cephalothin); 세확로아 (Cefaclor); 세?p시틴(Cefoxitin); 세프록시메 (Cefuroxime); 세훠니시드 (Cefonicid); 세프메타졸 (Cefmetazole); 세훠테탄 (Cefotetan); 세프푸로질 (Cefprozil); 로라카베푸 (Loracarbef); 세훼타멧 (Cefetamet); 세훠페라존(Cefoperazone); 세훠탁시메 (Cefotaxime); 세푸티족시메 (Ceftizoxime); 세푸트리악손 (Ceftriaxone); 세프타지디메 (Ceftazidime); 세훼피메 (Cefepime); 세휙시메 (Cefixime); 세푸포독시메 (Cefpodoxime); 세프졸로딘 (Cefsulodin); 플레록사신 (Fleroxacin); 날리디식 에시드 (Nalidixic acid); 노르플록사신 (Norfloxacin); 시프로플록사신 (Ciprofloxacin); 오플록사신 (Ofloxacin); 에녹사신(Enoxacin); 로메플록사신 (Lomefloxacin); 시녹사신 (Cinoxacin); 독시사이클린 (Doxycycline); 미노사이클린 (Minocycline); 테트라사이클린 (Tetracycline); 아미카신 (Amikacin); 겐타미이신 (Gentamicin); 카나마이신 (Kanamycin); 네틸마이신 (Netilmicin); 토브라마이신 (Tobramycin); 스트렙토마이신 (Streptomycin); 아지스로마이신 (Azithromycin); 클라리스로마이신 (Clarithromycin); 에리스로마이신(Erythromycin); 에리스로마이신 에스토레이트 (Erythromycin estolate) ; 에리스로마이신 에틸 섞시네이트 (Erythromycin ethyl succinate); 에리스로마이신 글루코헵토네이트 (Erythromycin glucoheptonate); 에리스로마이신 락토바이오네이트 (Erythromycin lactobionate); 에리스로마이신 스테아레이트 (Erythromycin stearate); 반코마이신(Vancomycin); 테이코플라닌 (Teicoplanin); 클로람페니콜 (Chloramphenicol); 클린다마이신 (Clindamycin); 트리메토프림 (Trimethoprim); 설파메톡사졸 (Sulfamethoxazole); 니트로후란토인 (Nitrofurantoin); 리?c핀 (Rifampin); 무피로신 (Mupirocin); 메트로니다졸 (Metronidazole); 세파렉신 (Cephalexin); 록시트로마이신 (Roxithromycin); 코-아목시클라브에노에이트 (Co-amoxiclavuanate); 피페라실린 (Piperacillin) 및 타조박탐 (Tazobactam)의 조합; 및 이들의 여러가지 염 (salts), 산 (acids), 염기 (bases), 및 다른 유도체들이 포함된다.
어떤 실시예에 따르면, 어떻게 약물 및 다른 제노바이오틱스들이 제 1상 및 제 2상 효소들 및 장 마이크로바이옴에 있는 효소들에 의해 대사 되는가, 어떻게 약물 및 제노바이오틱스들이 그러한 효소들을 억제 (또는 활성화) 하는지, 및 어떻게 개체의 교란이 (예를 들어, 비만, 화학물질에의 노출, 발달적 생애 단계, 등)이 제 1상 및 제 2상 대사 및/또는 장 마이크로바이옴의 영향에 효과적인지를 결정하는데 방법들이 사용될 수 있다.
어떤 실시예에 따르면, 타겟 효소는 제 1상 제노바이오틱 대사에 활성인 효소이다. 어떤 실시예에 따르면, 타겟 효소는 제 2상 제노바이오틱 대사에 활성인 효소이다. 어떤 실시예에 따르면, 타겟 효소는 β-글루크로니데이즈 (β-glucuronidase) 및 글루크로노실 트란스페라제 (glucuronosyl transferase), 글루타치온 S 트란스페라제 (glutathione S transferase), 환원효소 효소 (reductase enzyme), 예를 들어, 아조환원효소 (azoreductase), 니트로환윈제 (nitroreductase), NAD(P)H 퀴논 산화환원효소 (NAD(P)H quinone oxidoreductase), 또는 알도케토환원효소(aldoketoreductase) (AKR), (설파타제 sulfatase) 및 설포트란스페라제 (sulfotransferase); 시스테인 리아제 (cysteine lyase), 및 프로스타글란딘 H 신테이즈 (prostaglandin H synthase) 로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 효소이다. 어떤 실시예에 따르면, 타겟 효소들은 포유류 유래, 미생물 유래 또는 둘 다이다. 어떤 실시예에 따르면, 촉매적 활성을 나타낼 수 있기 전에 활성화가 필요한 효소를 위하여, 방법은 더 나아가 탐침이 효소와 접합하는 것을 촉진시키기 위하여 샘플을 효소 활성제 (예를 들어, NADPH)로서 역할 하는 화합물에 노출시키는 것이 포함된다.
어떤 실시예에 따르면, 제노바이오틱 대사 효소는 β-글루크로니데이즈 (β-glucuronidase)이고 및 탐침은 화학식 IVA, IVB, 또는 IVC의 β-글루크로니데이즈-특이 탐침이다:
Figure pct00090
어떤 실시예에 따르면, 화학식 IVA 또는 IVB의 β-글루크로니데이즈-특이 탐침은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
어떤 실시예에 따르면, 제노바이오틱 대사 효소는 글루크로노실 트랜스페라아제 (glucuronosyl transferase) (예를 들어, UDP-글루크로노실 트랜스페라아제)이고, 및 탐침은 화학식 II, 화학식 IIIB, 화학식 VA, VB, 또는 VC의 글루크로노실 트랜스페라아제-특이 탐침이다.
Figure pct00095
Figure pct00096
어떤 실시예에 따르면, 글루크로노실 트랜스페라아제-특이 탐침은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
여기서 각 n’는 독립적으로 0에서 50까지의 범위, 또는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50이다;
어떤 실시예에 따르면, 제노바이오틱 대사 효소는 글루타치온 S 트랜스페라아제 (glutathione S transferase)이고 및 탐침은 화학식 VIA, 화학식 VIB, 또는 화학식 VIC의 글루타치온 S 트랜스페라아제-특이 탐침이다:
Figure pct00100
어떤 실시예에 따르면, 글루타치온 S 트랜스페라아제-특이 탐침은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
어떤 실시예에 따르면, 제노바이오틱 대사 효소는 환원효소 효소, 예를 들어, 아조환원효소 (azoreductase), 니트로환원효소 (nitroreductase), NAD(P)H 퀴논 산화환원효소 (NAD(P)H quinone oxidoreductase), 또는 알도케토환원효소(aldoketoreductase) (AKR)이고, 및 탐침은 환원효소-특이 탐침이다. 어떤 실시예에 따르면, 탐침은 화학식 II 또는 화학식 IIIA의 환원효소-특이 탐침이다.
Figure pct00104
어떤 실시예에 따르면, 효소가 아조환원효소 (azoreductase)일 때, 탐침은 첫 번째로 아조환원효소에 의해 화학적으로 수정되어 아민을 형성하는 아조 (azo) 그룹을 포함하고, 이는 효소 결합부위를 활성화시켜 활성화된 퀴논 메티드 (quinone methide)를 형성하여 아조환원효소가 탐침에 결합할 수 있게 한다.
어떤 실시예에 따르면, 아조환원효소-특이 탐침은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00105
어떤 실시예에 따르면, 효소가 니트로환원효소 (nitroreductase)일 때, 탐침은 니트로환원효소에 의해 아민으로 환원될 수 있는 니트로 (nitro) 그룹을 포함하고, 이는 효소 결합부위를 활성화시켜 활성화된 퀴논 메티드 (quinone methide)를 형성하여 니트로환원효소가 탐침에 결합할 수 있게 한다.
어떤 실시예에 따르면, 니트로환원효소-특이 탐침은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00106
어떤 실시예에 따르면, 효소는 NAD(P)H 퀴논 산화환원효소 ((NAD(P)H quinone oxidoreductase))이고, 및 탐침은 NAD(P)H 퀴논 산화환원효소에 선택적으로 결합하는 EBG 및 NAD(P)H 퀴논 산화환원효소에 의해 대체될 수 있는 페놀성 ERG그룹을 포함한다.
어떤 실시예에 따르면, NAD(P)H 퀴논 산화환원효소 특이 탐침은:
Figure pct00107
또는,
Figure pct00108
으로 구성된 그룹으로부터 선택 된다.
어떤 실시예에 따르면, 효소는 알도케토환원효소 (aldoketoreductase) 이고, 및 알도케토환원효소-특이 탐침은 알도케토환원효소의 활성 부위 시스테인 잔기에 선택적으로 결합하는 EBG를 포함한다.
어떤 실시예에 따르면, 알도케토환원효소-특이 탐침은:
Figure pct00109
로부터 선택된다.
어떤 실시예에 따르면, 제노바이오틱 대사 효소는 설파타제 (sulfatase) 및 설포트란스페라제 (sulfotransferase) 효소이고 및 탐침은 설파타제 및 설포트란스페라제 특이 탐침이다. 어떤 실시예에 따르면, 탐침은 설파타제에 의해 탐침의 EBG로부터 첫 번째로 쪼개지는 ERG를 함유하는 설파타제 및 설포트란스페라제 특이 탐침이다.
어떤 실시예에 따르면, 설파타제 및 설포트란스페라제 특이 탐침은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00110
어떤 실시예에 따르면, 제노바이오틱 대사 효소는 마이크로바이옴 유래 시스테인 리아제 (cysteine lyase)이고 및 탐침은 시스테인 리아제-특이 탐침이다. 어떤 실시예에 따르면, 시스테인 리아제-특이 탐침은 시스테인 리아제의 시스테인 잔기와 공유 결합을 형성하는 올레핀-함유 (olefin-containing) 효소 결합 그룹을 포함한다. 어떤 실시예에 따르면, 시스테인 리아제-특이 탐침은 화학식 II 또는 화학식 IIIA이다.
Figure pct00111
어떤 실시예에 따르면, 시스테인 리아제-특이 탐침은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00112
어떤 실시예에 따르면, 효소는 프로스타글란딘 H 신테이즈 (prostaglandin H synthase)이고 및 탐침은 프로스타글란딘 H 신테이즈 특이 탐침이다. 어떤 실시예에 따르면, 프로스타글란딘 H 신테이즈 특이 탐침은 프로스타글란딘 H 신테이즈 효소에 의해 대체되는 ERG를 포함하고, 이로써 탐침이 EBG를 통해효소에 커플링 된다. 어떤 실시예에 따르면, 프로스타글란딘 H 신테이즈 탐침은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00113
어떤 실시예에 따르면, 개체는 포유류 개체이다. 어떤 실시예에 따르면, 포유류 개체는 생쥐다. 어떤 실시예에 따르면, 포유류 개체는 인간이다. 어떤 실시예에 따르면, 포유류 개체는 비-인간 영장류이다.
어떤 실시예에 따르면, 샘플은 개체를 제노바이오틱에 노출시킨 후 개체로부터 얻을 수 있으며 및 어느 효소의 제노바이오틱 대사에의 기여도 그후 노출시키지 않은 대조군과 비교할 수 있다. 어떤 실시예에 따르면, 샘플은 세포 (cell) 샘플 (또는, 단백질을 함유하는 것과 같은 이들의 추출물), 기관 (organ) 샘플 (또는 이들의 추출물), 또는 박테리아 (bacterial) 샘플 (또는 이들의 추출물)과 같은, 생물학적 샘플일 수 있다. 어떤 실시예에 따르면, 접촉은 실험관 내, 예를 들어, 인간 간 마이크로좀. 어떤 실시예에 따르면, 샘플은 하나 또는 그 이상의 신체 조직, 체액, 또는 신체 폐기 산물로부터 유래한다.
어떤 실시예에 따르면, 제노바이오틱은 식품, 음식물 보조제, 발암제, 독물 또는 약물이다. 어떤 실시예에 따르면, 제노바이오틱은 독물이다. 예시적인 독물에는, 제한없이, 니트로사아민 (nitrosamines), 알데하이드 (aldehydes), 및 일산화 탄소(carbon monoxide)를 포함할 수 있는, 담배 연기 (cigarette smoke) (능동 또는 수동); 브로모벤젠 (bromobenzene); 클로로포름 (chloroform); 아세트아미노펜 (acetaminophen); 살충제 (pesticides) ((예를들어, 2,3,7,8-테트라클로로디벤조디옥신 (2,3,7,8-Tetrachlorodibenzodioxin)) (TCDD); 유기 물질의 불완전 연소 또는 열분해 동안에 형성되는 널리 퍼져 있는 환경 오염 물질을 의미하는 폴리사이클릭 아로마틱 하이드로카본 (polycyclic aromatic hydrocarbons) (PAHs) 을 포함하며, 예를 들어, 발암성 PAH의 원조형태인, 벤조[a]피렌 (benzo[a]pyrene), 및 덜 널리 퍼져 있지만 매우 강력한 태반통과성 발암성 PAH인, 디벤조[def,p] 크리센 (dibenzo[def,p]chrysene) (DBC), 이 둘 다는 사이토크롬 P450 효소 수퍼훼밀리의 동형체 (isoform)에 의해 대사적으로 활성화 되어 반응성인 발암성 및 세포독성인 대사물을 형성한다.
어떤 실시예에 따르면, 제노바이오틱은 식품, 음식물 보조제, 발암제, 독물 또는 약물이다. 어떤 실시예에 따르면, 제노바이오틱은 독물이다. 예시적인 독물에는, 제한없이, 니트로사아민 (nitrosamines), 알데하이드 (aldehydes), 및 일산화 탄소(carbon monoxide)를 포함할 수 있는, 담배 연기 (cigarette smoke) (능동 또는 수동); 브로모벤젠 (bromobenzene); 클로로포름 (chloroform); 아세트아미노펜 (acetaminophen); 살충제 (pesticides) ((예를들어, 2,3,7,8-테트라클로로디벤조디옥신 (2,3,7,8-Tetrachlorodibenzodioxin)) (TCDD); 유기 물질의 불완전 연소 또는 열분해 동안에 형성되는 널리 퍼져 있는 환경 오염 물질을 의미하는 폴리사이클릭 아로마틱 하이드로카본 (polycyclic aromatic hydrocarbons) (PAHs) 을 포함하며, 예를 들어, 발암성 PAH의 원조형태인, 벤조[a]피렌 (benzo[a]pyrene), 및 덜 널리 퍼져 있지만 매우 강력한 태반통과성 발암성 PAH인, 디벤조[def,p] 크리센 (dibenzo[def,p]chrysene) (DBC), 이 둘 다는 사이토크롬 P450 효소 수퍼훼밀리의 동형체 (isoform)에 의해 대사적으로 활성화 되어 반응성인 발암성 및 세포독성인 대사물을 형성한다.
어떤 실시예에 따르면, 샘플이 활성 근거한 탐침과 배양되는 시간은 탐침이 이의 타겟 효소와 화학적으로 상호작용하도록 하는 시간 기간 또는 충분한 시간의 기간으로 탐침이 특별히 타겟 효소에 결합하게 되어 이로서 탐침-효소 접합체가 형성된다, 예를 들어, 적어도 2분, 적어도 3분, 적어도 3분, 적어도 4분, 적어도 5분, 적어도 6분, 적어도 7분, 적어도 8분, 적어도 9분, 적어도 10분, 적어도 11분, 적어도 12분, 적어도 13분, 적어도 14분, 적어도 15분, 적어도 16분, 적어도 17분, 적어도 18분, 적어도 19분, 적어도 20분, 적어도 21분, 적어도 22분, 적어도 23분, 적어도 24분, 적어도 25분, 적어도 26분, 적어도 27분, 적어도 28분, 적어도 29분, 적어도 30분, 2에서 60분과 같은, 2에서 30분, 2에서 10분, 5에서 10분, 또는 5에서 10분과 같다.
어떤 실시예에 따르면 활성-근거한 탐침의 타켓 효소와 결합은 빛에 의하여 광-활성화된다. 어떤 실시예에 따르면, 광원 (light source)은 10 nm부터 400 nm, 또는10 nm부터 370 nm까지, 또는 10 nm부터 365 nm까지 범위의 파장을 가진 빛과 같은 UV 빛을 제공한다.
검출, 측정 또는 이 둘 다는 효소에 결합된 탐침에 의해 방출되는 시그날 (signal)을 통해서이다. 어떤 실시예에 따르면, 이 시그날은 예를 들어, 바이오틴-아비딘 (biotin-avidin) 또는 효소-리포터 그룹 ((알카라인 포스파테제 (alkaline phosphatase) 또는 호스레데쉬 퍼옥시데이즈 (horseradish peroxidase))이 효소-특이적인 탐침에 결합함으로서 증가 또는 증폭된다. 어떤 실시예에 따르면, 효소에 결합된 탐침의 검출은 하나 또는 그 이상의 형광 (fluorescence) ((예를 들어, 형광 겔 분석 (fluorescent gel analysis), 형광-활성화 세포 분류군 (fluorescence-activated cell sorting), 유동세포 분석 (flow cytometry), 양자 점 분석 (quantum dot analysis)); 비색법 (colorimetry); 유전체 서열 분석(genome sequencing); 또는 질량 분석법(mass spectrometry)에 의한다. 어떤 실시예에 따르면, 여기서 서술된 방법들은 도 5에서 도식적으로 제시된 대로 이 분야 기술에서 전형적으로 사용되는 검출 기술과 조합될 수 있다.
어떤 실시예에 따르면, 활성-근거한 탐침은 더 나아가 Tag-포함하는 기술이다. 어떤 실시예에 따르면, 탐침의 pTag 잔기는 탐침을 지지체 (support) 또는 레진 (resin)을 부착시키는 데 효과적이다. 어떤 그런 실시예에 따르면, 지지체 또는 레진은 클릭가능한 기능 그룹을 포함할 수 있거나, 또는 포함할 수 있도록 수정될 수 있다. 따라서, 활성-근거한 탐침을 지지체 또는 레진에 부착시키는 방법은 지지체 또는 레진의 클릭가능한 기능 그룹을 pTag 잔기에 결합하는 것을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 탐침을 이의 타겟 효소와 반응시키기 전에 지지체 또는 레진을 탐침과 커플 시킬 수 있다. 어떤 실시예에 따르면, 본 공개의 활성-근거한 탐침을 사용한 하나 또는 그 이상의 샘플의 고속 대용량 스크리닝 (high through screening)을 위한 방법은 각 탐침을 별로도 지지체 또는 레진의 뚜렷이 다른 부위에 ((예를 들어, 다수-웰 플레이트 (multi-well plate) 의 웰 또는 웰들)) 부착시키거나, 또는 다중 탐침을 같은 부위 또는 다수-웰 플레이트의 한 웰에 부착시킬 수 있다. 샘플 또는 샘플들을 에세이 하는 예시적 방법이 도 6에 도식적으로 제시된다.어떤 실시예에 따르면, 라벨링이 마이크로바이옴 샘플에서 일어나고 있는 것을 증명하는 방법은 하기와 같다. 개체의 소장 및 대장으로부터 혐기성 조건에서 박테리아를 새롭게 수집한다. 미생물 내용물은 또한 대변이나 또는 대변 조각으로부터 추출될 수 있다. 장이나 대변으로부터 얻은 살아있는 세포는 탐침에 (또는 비교 목적의 대조군에) 노출시키고, 세척시키고, 비드(bead)로 두들겨 용해시키고, 및 그후 여기서 서술된 클릭 화학 시약을 사용하여 Tag-함유하는 화합물 ((예를 들어, 아지도테트라메틸로다민 (azidotetramethylrhodamine))과 섞는다. 살아있는 세포 ABP 라벨링 최적의 조건은 각 ABP 실시예에서 형광으로 라벨된 단백질의 SDS-PAGE를 통하여 얻어진 최고의 시그날-대비-배경 (signal-to-noise) 비율에 의해 결정된다. ABP가 마이크로바이옴 내에서 기능적으로 활성인 효소를 타겟으로 하고, 및 라벨링이 효소 불활성화 결과가 되는지를 확인하기 위하여 ABP 라벨링 전 및 후에 효소 활성 에세이가 사용된다.
어떤 실시예에 따르면, 방법은 ABP-의존적 라벨링 및 장 마이크로바이옴의 기능적 아-집단을 구성하는 분류군 (taxa)를 동정하기 위한 선별(sorting) 연구를 활용하여 마이크로바이옴 내에서의 계층적인 방식으로 (hierarchical manner) 지노메타볼리즘 활성 (xenometabolizing activities)을 타겟으로 하는 것이 포함된다. 그런 실시예는 소장 및 대장 샘플 및 대조군으로부터의 마이크로바이옴을 라벨링하는 단계를 포함한다; 분리된 DNA를 16S rRAN(VA) 서열 분석을 위한 탬프레이트 (template) 로 사용하고; ABP-처리한 샘플, 탐침-양성 샘플에서 좀더 풍부한 분류군을 동정하고; 및 이들의 통계적 유의성을 평가한다. 어떤 실시예에 따르면, 분리된 분류군의 유전체에서 지노메타볼리즘하는 효소의 존재를 확인하는 것은 분리된 장 마이크로바이옴의 PSI-BLAST 분석 및 장 마이크로바이옴의 데이터 베이스에 의한다. 어떤 실시예에 따르면, 여러가지 지노메타볼리즘활성에 관여하는 계통 (phyla) 및 분류군 (taxa)의 분포를 해결하는 것은 세포 분류 (cell sorting)에 의한 것이며, 이는 특정한 활성을 나타내는 장 미생물의 기능적 아-집단에 대한 정보를 제공하고 및 다른 분류군 집단 사이에 특정한 활성의 기능적 중복성의 수준을 보여주는 것이다.
계층적 분석을 완성하기 위하여, 지노메타볼리즘 (xenometabolism)에 관여하는 효소를 규명하기 위하여 정량적 프로테오믹스가 사용된다. 그 방법에는 비드 두들기기 (bead beating)로 같은 ABP-라벨된 마이크로바이옴 샘플을 용해시키고, 탐침-라벨된 효소에 클릭 화학을 사용하여 아지도-바이오틴 (azido-biotin) 화합물과 같은 Tag-함유하는 화합물을 부착시키고; 바이오틴화된-ABP-라벨된 효소 (biotinylated-ABP-labeled enzymes)를 스트렙타비딘 아가로즈 (streptavidin agarose)에 강화시키고, 단백질을 트립신 (trypsin)으로 소화시키고, 및 트립신화된 펩티드 (tryptic peptides)를 텐덤 MS 측정 (tandem MS measurement)을 사용하여 벨로스 (Velos) 또는 QExactive HF LC-MS 플랫폼 (platform)에서 분석하는 것이 포함될 수 있다. 결과로 얻어진 펩티드 스페트라 (peptide spectra)를 장 메타지놈에 대항하여 검색하고 및 AMT tag 접근방법을 사용하여 라벨된 효소를 정량 하는 것은 다양한 지노메타볼리즘효소들 (xenometabolizing enzymes)의 상대적 수준을 정량적으로 읽어 낼 수 있는데 효과적이다. 이는 효소들의 기능적 성질규명 및 해석을 제공하고, 및 그 효소들이 발현된 종/분류군 (species/taxa)로의 그 효소들의 지도 작성을 촉진시킨다.
도 7에 도식적으로 제시된, 효소들을 동정하고 정량화 하는 예시적 방법에는: 글루크로니데이즈 (glucuronidase)를 ((예를 들어, 대장균 (Escherichia coli), 스트렙토코크스 아가락티아에(Streptococcus agalactiae), 및 클로스트리디움 퍼후린겐스 (Clostridium perfringens)로부터 얻은 재조합적으로 발현되고 및 정제된 β-글루크로니데이즈)) 포함하는 샘플을 글루크로니데이즈를 타겟으로 하도록 디자인된 하나 또는 그 이상의 탐침 실시예를 포함하는 용액에 노출시키는 것이 포함된다. 예시적 탐침은 활성적인 글루크로니데이즈에만 공유적으로 결합한다 (도 8a-8d). 이 방법은 더 나아가 살아있는 세포를 탐침으로 처치하고 및 그후 세포를 용해시키고; 그후 용해된 세포 혼합물에, 상기 서술된 것과 같은 적절한 클릭화학 시약과 함께, 로다민-함유하는 아자이드 (rhodamine-containing azide) ((또는 Tag 그룹이 반응할 기능그룹에 따라, 로다민-함유하는 알킨 (alkyne))와 같은, Tag-함유하는 화합물을 첨가하고; 및 그후, 탐침에 Tag를 부착시킨 후, 탐침에 공유적으로 결합된 라벨된 효소를 SDS-PAGE 및/또는 유동세포 분석 (flow cytometry)으로 가시화하는 것이 포함된다. 어떤 실시예에 따르면, 혼합된 집단의 미생물로부터 활성적인 β-글루크로니데이즈를 소유한 세포를 라벨하고 분류하는 방법과 함께 FACS를 병합하는 것은 미생물 커뮤니티 내 관점에서 활성을 연구하는데 유용한 방법이다. 유전체 서열분석은 커뮤니티 멤버를 동정하는데 사용될 수 있고, 이로써 유전자 또는 전사의 형태로의 잠재적인 활성 보다는 제대로 된 활성에 근거하여 특별한 분류군군을 나타내고, 및 숙주-미생물-제노바이오틱 상호작용을 이해하는데 있어 주 장애물을 설명할 수 있다.
VI. 키트 및 장치 (Kits and Devices)
여기서 서술된 탐침 실시예는 생물학적 샘플과 같은 샘플들을 분석하는데 사용될 수 있는 장치 및/또는 키트에서의 사용을 위해 설정될 수 있다. 장치 및 키트는 샘플에 존재하는 다른 종(species)을 평가하고 동정하는데 사용될 수 있고 및 또한 샘플내에 그러한 종이 관여하는 기능/공정을 평가하는데 사용될 수 있다. 특별한 공개되는 실시예에서는, 장치는 하나 또는 그 이상의 탐침 실시예 및 한 기질을 포함할 수 있고, 여기서 탐침은 (또는 복수의 탐침들은) 샘플에 노출되기 전에 기질에 커플 되거나, 또는 여기서 기질 및 탐침은 샘플에 노출된 후 병합될 수 있다. 장치 및 키트 실시예는 다중 사용이 가능하여 하나의 장치 및 키트로 많은 샘플들이 분석될 수 있다.
특별한 실시예에서, 장치의 기질 성분은 세포 샘플과 같은, 샘플에 노출되는 어느 적절한 기질이다. 대표적인 기질에는, 이것에 만 국한하지 않으나, 여기에서 서술된 탐침 실시예와 기능화 될 수 있는 유리에-근거한 (glass-based) 기질이 포함되며 이로써 유리에-근거한 기질의 표면에 존재하는 기능 그룹에 탐침이 커플 된다. 어떤 실시예에서는, 유리 플레이트 (glass plates) 및/또는 유리 미세구(glass microspheres)가 기질 성분으로 사용된다.
장치 및 키트에 사용되는 탐침은 여기서 서술된 어느 탐침 실시예로부터 선택될 수 있다. 어떤 실시예에서, 탐침은 장치의 기질 성분에 탐침을 정착하게 할 수 있는 pTag 그룹을 포함하거나 또는 포함하도록 수정될 수 있다. 특별한 공개되는 실시예에서, pTag 그룹은 클릭 화학을 사용하여 기질 표면에 존재하는 클릭가능한 기능 그룹과 반응할 수 있게 되어 이로써 탐침을 기질에 공유적으로 정착하게 하는 클릭가능한 기능 그룹이다. 어떤 실시예에서, 탐침은 그러한 기술을 사용하여 샘플 노출 전에 기질에 미리-커플(pre-coupled) 시킬 수 있다. 어떤 추가의 실시예에서, 탐침이 샘플에 노출된 후에 그러한 기술을 사용하여 탐침이 기질에 후-커플 되게 (post-coupled) 할 수 있다.
어떤 실시예에서, 장치는 미리-조립되어 탐침 실시예가 기질에 미리-커플 되고 및 샘플을 분석하는데 사용되는 추가의 어느 시약들은 장치내에 미리-함유 (pre-contained) 시킨다. 어떤 다른 실시예에서, 장치는 미리-조립된 장치를 포함하는 키트의 한 부분으로서 제공될 수 있으며 및 샘플을 분석하는데 사용되는 추가의 어느 시약은 키트의 별개의 성분 (예를 들어, 시약 병에 와 같은)으로 제공된다. 키트의 이러한 성분들은 그후 사용하기 전에 사용자에 의해 병합될 수 있다. 또 어떤 추가의 실시예에서, 키트는 탐침 실시예로 처치될 수 있는 기질을 포함할 수 있으며, 이는 키트 내에 별도의 시약 병으로 제공되고, 적절한 커플링 조건을 사용하여 이로서 어느 바람직한 탐침 실시예가 기질과 커플하도록 하여 장치를 사용하기 쉽게 한다.
본 공개의 장치 실시예를 만드는 방법들도 또한 공개된다. 어떤 실시예에서, 클릭가능한 기능 그룹과 같은, pTag 그룹을 포함하는 탐침 실시예시에 기질을 노출시켜 장치를 만들 수 있다. 다른 추가의 실시예에서, pTag 은 기질의 기능 그룹에 화학적으로 결합할 수 있는 다른 기능 그룹이 될 수 있다. 탐침이 클릭 가능한 기능 그룹을 포함하는 실시예에서, 기질은 전형적으로 또한 이의 표면에 탐침의 클릭가능한 기능 그룹과 반응할 수 있는 클릭가능한 기능 그룹을 포함한다. 어떤 실시예에서, 기질은 알콕시실레인 분자 (alkoxysilane molecules)로 수정되어 실란화된 기질 표면 (silanized substrate surface)을 제공하는 하이드록실 그룹 (hydroxyl group)을 가진 표면을 포함하는 유리 기질이다. 어떤 실시예에서, 실란화된 기질 표면은 더 나아가 클릭가능한 기능 그룹을 포함하는 시약과 반응할 수 있다. 특별히 공개된 실시예에서, 탐침의 pTag 그룹은 기질 표면의 기능 그룹과 공유결합을 형성한다 (예를 들어, 하이드록실 그룹, 알콕시실레인 그룹, 클릭 가능한 기능 그룹, 또는 이와 같은 것). 예시적인 알콕시실레인 (alkoxysilane) 분자에는, 이것에 만 국한하지 않으나, 아미노실레인 (aminosilanes) (((예를 들어, (3-아미노프로필)-트리에톡시실레인 ((3-aminopropyl)-triethoxysilane)), (3-아미노프로필)-디에톡시-메틸실레인((3-aminopropyl)-diethoxy-methylsilane)), (3-아미노프로필)-디메틸-에톡시실레인 ((3-aminopropyl)-dimethyl-ethoxysilane)), (3-아미노프로필)-트리메톡시실레인 ((3-aminopropyl)-trimethoxysilane, 및 이와 같은 것))), 글리시드옥시실레인 (glycidoxysilanes) (((예를 들어, (3-글시드옥시프로필)-디메틸-에톡시실레인 ((3-glycidoxypropyl)-dimethyl-ethoxysilane)), 및 이와 비슷한것))), 및 머르갑토실레인 (mercaptosilanes) (((예를 들어, (3-머르캅토프로필)-트리메톡시실레인 ((3-mercaptopropyl)-trimethoxysilane)), (3-머르캅토프로필)-메틸-디메톡시실레인 ((3-mercaptopropyl)-methyl-dimethoxysilane)), 및 이와 같은 것))) 이 포함된다. 어떤 실시예에서, 이러한 대표적인 그룹들은 더 나아가 화학적으로 수정될 수 있어 하나 또는 그 이상의 알콕시실레인의 기능 그룹을 탐침의 기능 그룹과 커플링 될 수 있는 기능그룹으로 전환시킨다. 단지 실시예시로서, 아미노실레인의 아민 그룹은 아자이드 (azide)로 전환될 수 있거나 또는 아자이드-함유하는 시약에 커플 될 수 있어 탐침에 존재하는 pTag 그룹과 클릭 화학 반응을 거칠 수 있는 클릭가능한 그룹을 제공한다 ((클릭가능한 알킨(alkyne)과 같은)). 특별히 공개된 실시예에서, 탐침의 pTag 그룹은 실란화된 (silanized) 기질 표면에 존재하는 하나 또는 그 이상의 기능그룹과 커플링 할 수 있는 기능으로부터 산택 될 수 있다. 예를 들어, 탐침은 하나 또는 그 이상의 알킨 (alkyne)(또는 아자이드 (azide)) 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 실란화된 (silanized) 기질 표면에 존재하는 어느 아자이드 (또는 알킨)와 반응할 수 있다; 또는 하나 또는 그 이상의 카복실릭 에시드 (carboxylic acid) 그룹, 이는 실란화된 (silanized) 기질 표면에 존재하는 어느 아민과 반응할 수 있다; 또는 실란화된 (silanized) 기질 표면에 존재하는 어느 에폭사이드 (epoxides)와 반응 할 수 있는 하나 또는 그 이상의 친핵성(nucleophilic) 기능 그룹; 또는 실란화된 (silanized) 기질 표면에 존재하는 어느 티올 (thiols)과 반응할 수 있는 하나 또는 그 이상의 알켄 (alkene) 잔기를 포함할 수 있다. 기질 표면 및/또는 실란화된 기질표면에 존재하는 하이드록실 그룹에 커플될 수 있는 추가의 탐침 pTag 그룹은 본 공개 덕분에 이 기술 분야의 통상 전문가에게 알려질 것이다.
대표적인 실시예에서, 유리 플레이트 (glass plate) 장치는 트리에톡시실레인아민 (triethoxysilaneamine)과 같은 알콕시실레인 (alkoxysilane) 시약으로 유리 슬라이드를 기능화하여 만들어진다. 그후, 아자이드 잔기를 가진 기질의 표면을 기능화 하기 위하여 NHS-에스터-PEG-아자이드 (NHS-ester-PEG-azide)와 같은 클릭가능한 기능 그룹을 포함하는 시약 용액이 유리 슬라이드에 첨가된다. 기능화 된 유리 슬라이드는 그후 샘플 노출 전에 탐침 실시예에 노출시키거나 또는 샘플에 먼저 노출된 탐침 실시예에 노출시킨다. 탐침은, 기질의 아자이드와 반응할 수 있는, 클릭가능한 알킨과 같은, pTag 그룹을 포함한다. 탐침의 알킨 그룹과 기질의 아자이드 사이에 형성된 트리아졸 (triazole)을 통해 탐침이 유리 슬라이드로의 공유 커플링 되는 것을 촉진하는 반응조건에 유리 슬라이드 및 탐침을 노출시킨다. 이 실시예에서, 반응 조건은 DMSO를 용매로서 사용하고, CuI을 촉매로서, 트리메틸아민 (trimethylamine) ((또는 디이소프로필에틸아민 (diisopropylethylamine))을 염기로 사용하는 것을 포함한다.
다른 실시예에서, 탐침 실시예는 여기서 서술된 방법에서 사용되는 장치를 제공하기 위하여 형광 유리 미세구 (glass microspheres)에 커플 시킬 수 있다. 그런 실시예에서, 단일 탐침 실시예는 단일 미세구 (single microsphere)에 커플 시킬 수 있다. 복수의 미세구가 만들어 질 수 있으며 여기서 복수의 각 미세구가 같은 형태의 탐침 실시예와 커플 되거나 또는 복수의 각 미세구가 다른 형태의 탐침 실시예와 커플 된다. 탐침을 미세구에 커플 시키는데 상기 서술된 대로 비슷한 화학이 사용될 수 있다. 형광 유리 미세구에 커플 되는 탐침을 포함하는 장치 실시예는 몇 개의 다른 효소 타겟를 위한 여러가지 탐침을 하나의 제한된-크기의 샘플에 사용할 수 있게 한다. 추가로, 이러한 장치 실시예는 도 30에서 도식적으로 보여준 대로 형광-활성화된 세포 분류군 (Fluorescence-Activated Cell Sorting) (FACS) 및 프로테오믹스 (proteomics)를 사용하여 타겟 효소를 동시에 직접 정량 하도록 촉진한다. 특별한 실시예에서, 단백질-탐침-형광 미세구는 FACS에 의하여 분류되고 및 정량 된다. 그후 유동세포분석 기기 (flow cytometry instruments)가 정량적인 형광 프로화일을 제공하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 탐침 형태에 따라 분류군하고 및 측정의 해상도를 높이기 위하여 이어서 프로테오믹스 측정을 하기 위하여 풀 FACS 시스템 (full FACS systems)이 사용될 수 있다. 그러한 실시예는 또한 제한된 크기의 샘플에서 타겟 효소를 라벨하기 위하여 탐침-기능화된 미세구를 다중화 (multiplex) 할 수 있는 능력을 제공하며, 및 FACS를 사용하여 주어진 샘플에서 효소 타겟을 먼저 정량 하도록 하고, 및 이어서 질량 분석-근거한 프로테오믹스 (mass spectrometry-based proteomics)를 사용하여 특정한 타겟을 동정하고 및 이 타겟을 정량 하게 하는 능력을 제공한다.
다른 대표적인 실시예에서, 클릭가능한 기능 그룹 (예를 들어, 아자이드)으로 표면-수정된 웰 (well)을 가진 웰-플레이트(well-plate)를 포함하는 장치는, 탐침을 개별 웰에 공유적으로 부착시키키 위하여 표면-수정된 웰의 클릭가능한 기능그룹과 반응할 수 있는 각 각 적어도 하나의 pTag 그룹 (예를 들어, 알킨)을 포함하는 탐침 실시예에 노출된다. 어떤 실시예에서, 단일 웰은 여기에 공유적으로 결합된 복수의 탐침을 포함할 수 있다. 어떤 실시예에서, 웰-플레이트의 다른 웰들은 다른 탐침 실시예로 기능화 될 수 있다.
VII. 몇가지 실시예의 개요 (Overview of Several Embodiments)
여기서 공개되는 것은 화학식 II를 만족하는 구조를 가진 탐침의 실시예다.
Figure pct00114
여기서
ERG는, 만약 존재한다면,
Figure pct00115
;S(O)2OH, 또는 이의 음이온 형태; P(O(OH)2, 또는 이의 음이온 형태; 할로겐 (halogen); 또는 -OPh-CH2-ONO2이고;
EBG는 화학식 IIAEBG- IIJEBG의 하나 또는 그 이상을 만족시키는 구조를 가진다.
Figure pct00116
Figure pct00117
여기서 Y는 CH3 또는 CF3; Y’는 O, NO2, 또는 -N=NR'’, 여기서 R'’는 염료 또는 다른 리포팅 잔기; 및 m은 0에서 5로부터 선택되는 정수이고; 및 R’는 알데하이드 (aldehyde), 케톤(ketone), 에스터(ester), 카복실릭 에시드 (carboxylic acid), 아실 (acyl), 아실 할라이드 (acyl halide), 시아노 (cyano), 설포네이트 (sulfonate), 니트로 (nitro), 니트로조 (nitroso), 4차 아민(quaternary amine), CF3, 알킬 할라이드 (alkyl halide), 또는 이들의 조합;
링커a (Linkera)는 알리파틱 (aliphatic) 그룹, 헤테로알리파틱 (heteroaliphatic) 그룹, 아로마틱(aromatic) 그룹, 알리파틱-아로마틱 (aliphatic-aromatic) 그룹, 헤테로알리파틱-아로마틱 (heteroaliphatic-aromatic) 그룹, 헤테로아로마틱 (heteroaromatic) 그룹, 알리파틱-헤테로아로마틱 (aliphatic-heteroaromatic) 그룹, 또는 헤테로알리파틱-헤테로아로마틱 (heteroaliphatic-heteroaromatic) 그룹을 포함하고;
각 링커b (Linkerb) 및 링커, 만약 존재한다면, 독립적으로 알리파틱 (aliphatic) 그룹, 헤테로알리파틱 (heteroaliphatic) 그룹, 아로마틱(aromatic) 그룹, 알리파틱-아로마틱 (aliphatic-aromatic) 그룹, 헤테로알리파틱-아로마틱 (heteroaliphatic-aromatic) 그룹, 헤테로아로마틱 (heteroaromatic) 그룹, 알리파틱-헤테로아로마틱, (aliphatic-heteroaromatic) 그룹, 또는 헤테로알리파틱-헤테로아로마틱 (heteroaliphatic-heteroaromatic) 그룹을 포함한다;
R, 만약 존재한다면, 카바메이트 (carbamate) 또는 카보네이트(carbonate)를 포함하는 그룹이다;
각 Tag는, 만약 존재한다면, 독립적으로 검출될 수 있는 시그날 (signal)을 생산할 수 있는 기능 그룹 또는 분자이다;
각 pTag는, 만약 Tag가 존재하지 않으면 존재하고, 독립적으로 클릭가능한 기능 그룹을 포함하고; 및
각 n, m, p, 및 q는 독립적으로 0 또는 1이다.
어떤 실시예에서, 링커a (Linkera )는 하나 또는 그 이상의 화학식 IIA-Linkera-IIHLinkera를 만족시키는 구조를 가진 링커 그룹이다.
Figure pct00118
여기서 각 n'는 독립적으로 1에서 50까지 범위의 정수이고; Z는 산소 또는 NR'''이고, 여기서 R'''는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이고; 및 Q는 탄소, 산소, 또는 NR''’이고, 여기서 R'''은 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이다.
상기 실시예의 어느 하나 또는 모두에서, 링커b (Linkerb)는 존재하고 및 -(CH2)n’- 그룹을 포함하고, 여기서 n’는 1에서 50까지 범위의 정수이고; 아미이드 (amide) 그룹; 또는 이들의 조합이다.
상기 실시예의 어느 하나 또는 모두에서, 링커c (Linkerc)는 존재하고 및 화학식 IIALinkerc 또는 화학식 IIBLinkerc를 만족시키는 구조를 가진다.
Figure pct00119
상기 실시예의 어느 하나 또는 모두에서, R 은 존재하고 및 하나 또는 그 이상의 화학식 IIAR-IICR를 만족하는 구조를 가진다.
Figure pct00120
여기서 Z 및 Z'는 독립적으로 산소 또는 NR'''이고, 여기서 R'''는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이고; n'는 1에서 50까지 범위의 정수이다.
상기 실시예의 어느 하나 또는 모두에서, 하나 또는 그 이상의 Tags 가 존재하고 및 여기서 각 Tag는 독립적으로 형광발색단, (fluorophore), 친화력에-근거한 결합쌍의 결합 파트너, 양자점 (quantum dot), 또는 염료이다. 어떤 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 Tags는 독립적으로 로다민 (rhodamine), 플루오레신 (fluorescein), 또는 바이오틴 (biotin) 이다.
상기 실시예의 어느 하나 또는 모두에서, 하나 또는 그 이상의 pTags가 존재하고 및 여기서 각 pTag는 독립적으로 아자이드(azide) 또는 알킨 (alkyne) 이다.
상기 실시예의 어느 하나 또는 모두에서, 탐침은 화학식 IIIA를 만족시키는 구조를 가진다.
Figure pct00121
상기 실시예의 어느 하나 또는 모두에서, ERG는 존재하고 및 요도(iodo); -OPh-CH2-ONO2; 또는
Figure pct00122
이다.
상기 실시예의 어느 하나 또는 모두에서, 링커a (Linkera)는 에스터 (ester) 그룹, -O(CH2)n’NR'''C(O)(CH2)n ’-그룹 또는 -(CH2)n’-그룹이고, 여기서 각 n'은 독립적으로, 1에서 20까지 범위의 정수이고 및 여기서 R'''은 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이다.
상기 실시예의 어느 하나 또는 모두에서, m 은 1 이고 및 링커c (Linkerc)는 -NR'''C(O)(CH2)n’- 그룹 또는 -NR'''C(O)CH2[O(CH2)2]n ’OCH2- 그룹이고, 여기서 각 n'은 독립적으로, 1에서 20까지 범위의 정수이고 및 여기서 R'''은 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이다.
상기 실시예의 어느 하나 또는 모두에서, m 은 1 이고 및 각 Tag은, 만약 존재한다면, 독립적으로 형광발색단, (fluorophore), 친화력에-근거한 결합쌍의 결합 파트너, 양자점 (quantum dot), 또는 염료이고; 또는 만약 pTag 그룹이 존재한다면, 그때는 각 pTag는 독립적으로 알킨 (alkyne) 또는 아자이드(azide) 이다.
상기 실시예의 어느 하나 또는 모두에서, 탐침은 여기서 공개된 탐침 종류 어느 것으로부터 선택될 수 있다.
또한 여기서 공개 되는 것은: 탐침-효소 접합체가 형성되도록 제노바이오틱 대사에 관여 하는 효소와 탐침이 결함 하도록 충분한 시간 동안 개체 또는 샘플을 상기 실시예 어느 하나 또는 모두에 따라 탐침에 노출 시키고; 및 형광 검출 기술 (fluorescent detection technique), 비색적 검출 기술 (colorimetric detection technique), 질량 분석 기술 (mass spectrometry technique), 또는 이들의 조합을 사용하여 탐침-효소 접합체를 분석하는 것을 포함하는 방법 실시예이다.
어떤 실시예에서, 방법은 탐침-효소 접합체를 Tag-함유하는 화합물에 노출시켜 Tag 잔기를 포함하는 탐침-효소 접합체를 형성하는 것을 포함한다.
상기 실시예의 어느 하나 또는 모두에서, 방법은 더 나아가 탐침을 광원 (light source)에 노출시키는 것이 포함된다.
상기 실시예의 어느 하나 또는 모두에서, 방법은 더 나아가 개체의 샘플을 개체로부터 추출하고 및 형광 검출 기술, 비색적 검출 기술, 질량 분석 기술, 또는 이들의 조합을 사용하여 개체의 샘플을 분석하는 것을 포함한다.
상기 실시예의 어느 하나 또는 모두에서, 방법에서 사용된 탐침은 여기서 서술된 어느 탐침 종류로부터 선택될 수 있다.
또한 여기서 공개되는 것은, 상기 실시예 어느 하나 또는 모두에 따른 기질 및 탐침 실시예를 포함하는 에세이 플렛폼 (assay platform) 실시예로, 여기서 탐침은 기질에 공유적으로 부착된다.
VIII. 실시예시
하기의 실시예시들은 이 분야 기술에 통상 전문가에게 탐침 실시예 및 여기서 서술된 방법들을 어떻게 만들고 및 사용하는가에 대한 완전한 공개 및 서술을 제공하기 위해 제시되며, 및 본 발명가들이 이 발명에 대하여 어떻게 간주하는가에 대한 범위를 제한하려는 것은 아니며 또한 하기의 실험들이 모두 또는 수행된 실험만 대표하려는 의도는 아니다. 사용된 숫자에 관하여 (예를 들어, 양, 온도, 등) 정확성을 확실히 하려는 노력이 있었으나, 어떤 실험상의 오류 및 이탈 (deviation)이 설명되기도 한다. 달리 제시되지 않는 한, 부분(part)은 무게로의 부분이며, 분자량은 무게평균 분자량이고, 온도는 섭씨도이고, 및 압력은 대기압 이거나 대기압 근처이다.
균주, 시약, 및 기본 공정 (Strains, reagents, and basic procedures)
화학약품은 달리 기록되지 않는 한 피셔 사이언티픽 (Fisher Scientific) 또는 시그마 알드리치 (Sigma Aldrich)로부터 구입되었다. 클론용 대장균(E. coli)균주 DH5a 및 BL21(DE3)는 라이프 테크놀로지 (Life Technologies)로부터 얻었으며 37oC에서 적절한곳에서는 100 ㎍/㎖ 앰피실린 (ampicillin) 과 함께 루리아-베르타니 배지(Luria-Bertani medium)에서 배양되었다. E. coli BW25113 는 내부 저장고 (in-house stock) 로부터 얻었다. E. coli △uidA 는 콜라이 유전자 저장 센터 (Coli Genetic Stock Center) (균주 JW1609-1) 로부터 얻었다. 락토바실러스 플란타리움 (Lactobacillus plantarum) WCFS1는 ATCC (BAA-793) 로부터 구입하였으며 및 MRS 배지를 사용하여 37oC에서 배양되었다. CF640R 피콜릴 아자이드 (CF640R picolyl azide)는 바이오티눔 (Biotium) 으로부터 구입되었다. 프라이머 (primers)는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지 (Integrated DNA Technologies) 로부터 주문되었다. pET-32c 연구실 스톡 (stock)으로부터 얻었다. puidA 는 깁손 어샘블리 (Gibson Assembly) (NEB)를 사용하여 프라이머들 uidA_F (5’-AACTTTAAGAAGGAGATATAATGTTACGTCCTGTAGAAACCCC-3’) [서열번호 1] , uidA_R (5’-TTGTTAGCAGCCGGATCTCATTAATGGTGATGGTGATGGTGTTGTTTGCCTCCCTGCTG-3’) [서열번호 2], pET_F (5’-CACCATCACCATCACCATTAATGAGATCCGGCTGCTAAC-3’) [서열번호 3]’ 및 pET_R (5’-TATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGGAATTGTTATCCGCTC-3’) [서열번호 4] 로 제조되었다. uidA 발현은 이소프로필-D-티오갈락토피라노사이드 (isopropyl-D-thiogalactopyranoside) (IPTG, 10 μM)를 사용하여 유도되었다.
동물 (animals)
글루크로니데이즈 (glucuronidase) 연구를 위하여, 주령 6-8 주의 여성 C57BL/6J 생쥐는 잭슨 연구실 (Jackson Laboratories)로부터 구입되었으며 및 12시간 빛 (light)/12시간 어둠 (dark light) 사이클로 키웠다. 음식물 (PMI 5002) 및 물은 무제한으로 (ad libitum) 공급되었다. 생쥐는 어떤 처치 시작하기 전에 7일 동안 적응시켰다. 이 기간 동안, 한배새끼 들은 같은 케이지에 같이 키웠다 (co-housed). 이후에, 생쥐는 항생체 처치를 위해 분리된 케이지에 넣었다. 한 세트의 한배새끼는 (n=5) 반코마이신 (0.1 mg/㎖)이 있는 먹는 물에 노출시켰다. 다른 세트는 정상 물을 주었다. 항생제에 대한 부작용 반응을 모니터하기 위하여, 연구자들은 노출시키는 동안에 처치그룹에 대하여 맹목적(blinded) 일수 없으며, 및 이어지는 분석에서 맹목적이지 않았다.
GST 연구를 위하여, 세 마리의 어른 남성 C57BL/6J 생쥐를 잭슨 연구실 (Jackson Laboratory) (Sacramento, CA)로부터 구입하였다. 구입된 생쥐는 주령 6 주였으며 및 표준 연구실 음식물로 먹였다. 생쥐는 각각 개별로 23 ± 1℃ 및 55± 10% 습도로 유지된 방에서 12 시간 빛 /어둠 사이클로 음식물과 물을 자유롭게 접근하도록 하여 키웠다. 생쥐는 2주 기간 동안 표준 연구실 음식물 (standard lab diet0 (SD) ((지방으로부터 10% 칼로리, 단백질로부터 20% 칼로리, 탄수화물로부터 70% 칼로리, 3.83 kcal/g; 연구용 음식물 (Research Diets D12450Bi, New Brunswick, NJ))로 무제한 먹였다. 모든 동물 실험은 실험동물 보호 및 사용에 대한 기관 가이드라인 (institutional guidelines for the care and use of laboratory animal)에 따라 수행되었다. 바텔레 리치랜드 기관 동물 보호 및 사용 위원회 (Battelle Richland Institutional Animal Care and Use Committee)는 프로토콜 (protocol # 2010-45)를 승인하였다
실험관 내 형광 라벨링 및 겔 이미징 ( In vitro fluorescence labeling and gel imaging)
정제된 단백질 (5 μM) 또는 세포 용해물 (cell lysate) (1 mg/㎖)은 다양한 농도의 GlcA-ABP로 1 시간 동안 37oC에서 처치시켰다. 로다민 (Rhodamine)은 구리 (copper) 촉매하는 아자이드-알킨 환형첨가 (azide-alkyne cycloaddition) (CuAAC)를 통해 부착되었으며 및 단백질은 SDS-PAGE를 통하여 분석되었다. 겔은 GE 타이픈 FLA-9500 (GE Typhoon FLA-9500)을 사용하여 이미징 되었으며 및 밴드 강도는 이메지J (ImageJ)를 사용하여 정량하였다.
미생물의 형광 라벨링 및 세포 분류 (Fluorescent labeling of microbes and cell sorting)
하룻 밤 동안의 배양 (5 ㎖)액은 원심분리로 모았으며 1㎖ PBS에 다시 현탁시키고 및 100㎕를 엘리쿼트 (aliquots)로 하였다. 엘리쿼트는 50μM GlcA-ABP, 10μM 요도아세트아마이드 알킨 (iodoacetamide alkyne) (IAA), 또는 동등한 부피의 매체 (vehicle) ('No Probe’; DMSO)로 처치시켰다. 세포는 1 시간 동안 37oC에서 진탕하면서 배양시켰다. 세포는 10,000g에서 5 분 동안 원심분리를 통하여 수집되었으며 및 1 ㎖의 탈산소화된 PBS (deoxygenated PBS)로 3x 세척하였다. 침전물은 100㎕ PBS에 다시 현탁시키고 및 70% 에탄올 (1 ㎖) 로 -20oC에서 하룻밤 동안 고정시켰다. 세포는 1㎖ PBS에 다시 현탁시켜 두 번 세척시켰으며 및 10,000g에서 5 분 동안 원심분리 시켰다. 세포는 250μM CuAAC 반응 버퍼 ((10 μM CF640R 피콜릴 아자이드 (CF640R picolyl azide), 8 mM CuSO4, 2 mM THPTA, PBS:0.5% (w/v) BSA에 있는 10 mM 아스코르빅 에시드 (ascorbic acid))에 다시 현탁 시켰다. 탐침 없는 샘플 (No Probe sample)의 1/2은 형광 없는 대조군으로서 사용되었다 (CF640R이 없는 CuAAC 반응 버퍼). 세포는 어둠에서 회전시키면서 실온에서 1 시간 동안 배양시켰으며 및 상기와 같이 원심분리 시켜 수집하였다. 세포는 1 ㎖ PBS:0.5% BSA에 다시 현탁시켜 4x 세척시켰으며, 어둠에서 실온에서 5분 동안 회전시키면서 배양시켰으며, 및 상기와 같이 원심분리 시켰다. 세포는 SYBR 골드 (SYBR Gold) ((라이프 테크놀로지 (Life Technologies); 1:10,000))와 함께 PBS에 다시 현탁시켰으며 및 멸균된 피복 용액 (autoclaved sheath fluid)이 있는 BD FACSAria IIu를 사용하여 분석하였다. 전진 및 측면 분산 (Forward and side scatter) (488 nm), SYBR Gold ((488 nm 자극 (excitation)); 530/30 nm 검출 필터 (detection filter)) 및 CF640R (633 nm 자극; 660/20 nm 검출 필터) 계수들 (parameters)이 수집되었다. 게이트 (gates)는 탐침 없는 샘플에서 95% 이상 (>95%)의 사건이 탐침 음성으로 분류군되도록 그려졌다 (도 9). 유동세포분석 (Flow cytometry) 데이터는 FACSDiva 8 ((BD 바이오사이어스 (BD Biosciences))를 사용하여 수집되었으며 및 FlowJo 10을 사용하여 분석되었다.
장 미생물의 형광 라벨링 및 분류 (Fluorescence labeling and sorting of gut microbes)
미생물 세포는 일부 수정을 하면서 이전에 서술된 대로 수집되고 및 분류되었다. 회장 (ileum)으로부터 직장 (rectum)까지의 하위 장관이 수집되었으며 및 약 5 ㎖ 멸균 유리 비드 (sterile glass beads) (직경 3 mm) 및 20 ㎖의 탈산소화 된 PBS (deoxygenated PBS)가 있는 50 ㎖ 원추형 튜브 (conical tubes)에 넣었다. 튜브는 빨리 혐기성 챔버로 옮기고, 및 1 mM 디티오트레이톨 (dithiothreitol)이 미생물 회복을 돕기 위하여 첨가되었으며 및 5 분 동안 배양시켰다. 현탁된 장 내용물을 그후 새로운 튜브로 옮기고, 30 초 동안 볼텍스 시키고 (vortexed) 및 큰 조각은 5 분 동안 침전시켰다. 상등액은 수집하고 및 700g에서 15분 동안 원심분리 시켰다. 상등액은 깨끗한 50㎖ 원추형 튜브에 옮기고 및 8,000g에서 15 분 동안 원심 분리시켜 박테리아 세포를 수집하였다. 박테리아 세포 침전물은 1㎖의 탈산소화 된 PBS에 다시 현탁시켜 한번 세척하고 및 8,000g에서 15 분 동안 원심 분리시켰다. 세포는 그후 상기 서술된 대로 라벨 되고 및 분류 되었다.
DNA 분리 및 앰플리콘 서열분석 (DNA isolation and amplicon sequencing)
가능한 곳에서, UV-조사된 유리 튜브 (UV-irradiated glass tubes)에서 4-방향 순도 분류 (4-way purity sort)를 통해 2,000,000 건 ((측면 분산 (side scatter) 및 SYBR Gold을 한계 계수(threshold parameters)로서 사용하여))이 수집되었다. 분류된 세포의 적은 엘리쿼트 (aliquot)를 다시 분석하여 강화됨을 확인하였다. 분류된 세포의 적은 엘리쿼트 (aliquot)를 다시 분석하여 강화됨을 확인하였으며, 여기서 초기 샘플에서의 20% 이하 (<20%)와 비교하여 수집된 세포의 적어도 50-60%는 탐침-양성이었다. 세포는 12,000g에서 10 분 동안 원심분리를 통해 1.5 ㎖ 튜브에 수집하였으며 및 용해 버퍼 (lysis buffer)에 ((50 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, 5 mM EDTA, 0.5% SDS, 및 0.1% β-머르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol)) 다시 현탁 시켰다. 배경 DNA 오염을 조절하기 위하여, 별도의 튜브에 50,000 비드를 수집하였으며 및 용해 버퍼만 있는 튜브 하나를 각 분류마다 제조하였다. 튜브는 4 oC에서 30 분 동안 배양되었으며 및 그후 액체 질소를 사용하여 다섯 번의 얼림/녹힘 사이클 (freeze/thaw cycles)을 통해 용해시켰다. DNA는 그후 추출되고 및 정제되었다 (Zymogen DNA Clean & Concentration-5). 16S rRNA의 V4 부위의 PCR 증폭은 지구 마이크로바이옴 프로젝트 (Earth Microbiome Project)에 의해 개발된 프로토콜을 사용하여 다음과 같이 수행되었다. (i) 샘플은 삼중 (triplicate)으로 증폭되었다, 각 샘플은 25-㎕ PCR 반응으로 3 번 반복하여 증폭될 것을 의미한다; (ii) 각 샘플에 대한 세 번의 PCR 반응을 하나의 부피 (75 ㎕)로 모은다. 이 시점에서 다른 샘플로부터 증폭된 것은 병합하지 않는다; (iii) 각샘플로부터의 앰플리콘 (amplicon)을 아가로즈 겔 (agarose gel)에 건다. 515f-806r에 대한 예상되는 밴드 크기는 ~300-350 bp이다. 낮은-바이오메스 (Low-biomass) 샘플은 희미하거나 또는 보이지 않는 밴드를 생산할 수 있다; PCR 산물의 존재를 증명하기 위하여 바이오어날라이져 (Bioanalyzer)와 같은 대안적인 방법이 사용될 수 있다; (iv) 앰플리콘을 Quant-iT PicoGreen dsDNA 에세이 키트 ((터모휘셔/인비트로젠 (ThermoFisher/Invitrogen) cat. no. P11496; 제조사의 안내서를 따른다)) 로 정량 한다; (V) 각 샘플로부터의 앰플리콘 의 동일한 양 (240 ng) 을 단일, 멸균된 튜브에 합친다. 만약 최종 모은 것이 (final pool) 겔-분리될 것이거나 또는 낮은-바이오메스 샘플로 일할 때는 좀더 높은 양이 사용될 수 있다. 주의: 다중 샘플 플레이트로 일할 때는, 각 샘플 플레이트에 대하여 단일 튜브의 앰플리콘을 생산하는 것이 전형적이다; (V) 앰플리콘 풀 (amplicon pool)을 MoBio UltraClean PCR Clean-Up 키트(cat. no. 12500; 제조사의 안내서를 따른다.) 로 깨끗이 한다. 만약 96 샘플 이상으로 일할 때는, 풀 (pool)은 세척을 위해 똑같이 나눌 필요가 있고 그후 다시 합친다. 선택적 (Optional): 만약 겔에 허위 밴드가 존재하면 (단계 3에서), 최종 풀의 1/2는 겔에 걸 수 있고 및 그후 단지 타겟 밴드만 선택하기 위하여 겔이 추출된다; (vi) 깨끗하게 한 최종 풀 (pool)의 농도 및 A260/A280 비율을 측정한다. 가장 좋은 결과는 A260/A280 가 1.8-2.0 사이 이어야 한다; (vii) 한 앨리쿼트는 서열분석 프라이머와 함께 서열분석을 위해 보내진다. 앰플리콘은 일루미나 Mi Seq (Illumina MiSeq)에서 500 사이클 MiSeq 시약 키트 v2 (500 cycle MiSeq Reagent Kit v2) 로 제조사 안내에 따라 서열분석 되었다.
바이오정보학 분석 (Bioinformatics analysis)
서열분석은 내부 파이브라인 (in-house pipeline)을 사용하여 분석되었다. 간략하게, 초기 서열분석 리드는 (raw sequence reads) 바코드 서열에서 미스메치가 0 이 되도록하면서 EA-Utils를 사용하여 탈다중화(demultiplexed) 하였다. 리드 (read)는 아답터 서열 및 PhiX을 제거하기 위하여 BBDuk2로 질적으로 필터시켜, 해밍거리 (hamming distance) 1에서 메치되는 kmer는 31 bp 로 하였다. 51bp 보다 짧은 것은 버렸다. 리드(read)는 최소 길이 한계 175 및 최대 오차 비율 1%로 USEARCH를 사용하여 합첬다. 서열은 탈복제되고 (dereplicated) (최소 서열 풍부함 2) 및 USEARCH의 거리-근거한 (distance-based), 글리디-클러스터링 (greedy- clustering) 방법을 사용하여 작동중인 분류군 유니트 (operational taxonomic unit)(OTU) 멤버 서열 중에서 블라스트 % (blast%)의 쌍 서열 상동성 (pairwise sequence identity)에서 클러스터 되었다. 키메릭 서열 (chimeric sequences)의 신규 예측은 클러스터링하는 동안에 USEARCH를 사용하여 수행되었다. 분류군 (taxonomy)은 BLAST 얼라인먼트 (BLAST alignments)를 사용하고 이어서 99%에 클러스터 되는 SILVA 데이터베이스 version 123에 걸쳐 최소 공통 선조 지정 (least common ancestor assignments)으로 OTU 서열에 지정되었다. 키메릭 OTU를 동정하기 위하여 USEARCH를 사용하여 OTU 시드 서열 (OTU seed sequences) 은 99%에 클러스터 되는 SILVA 데이터베이스 version 123에 대항하여 여과되었다. 분류된 세포로부터의 샘플에 비교하여 “비드 (Beads)’ 또는 ‘대조군 (Control)’ 샘플에서 리드 수 (read count)가 더 높은 OUT는 더 나아간 분석에서 제외되었다.
차등적 풍부함 분석 (Differential abundance analysis)
각 OTU 및 비교를 위하여, 구성적 데이터 분석 접근 방법 (compositional data analysis approach)을 사용하여 한배새끼 때문인 랜덤 효과 (random effect)를 포함하는 혼합된 효과 모델 (mixed effects model)의 알고리즘에서 R이 전형적인 glm을 대신하는 ALDEx2 package를 사용하여 차등적 풍부함 테스트 (differential abundance test)가 수행되었다. 추가로, 두 그룹 사이에 존재/비존재에 있어 시스템적인 차이를 위한 양적인 g-테스트 (qualitative g-test)가 각 OTU 및 비교를 위하여 수행되었다. 조정된 p <0.05 에서의 차이는 의미 있는 것으로 간주된다. 차등적으로 풍부한 분류군은 GraPhlAn을 사용하여 수행되었다.
β-글루크로니데이즈 활성 에세이 ((β-Glucuronidase activity assays)
장 미생물총 연구에서, 생쥐 모델은 강력한 모델이며, 및 인간 개체에서는 너무 침습성인 실험을 수행할 수 있게 하고 및 혼란한 변수에 대한 좀더 나은 컨트롤을 가지고 수행할 수 있는 가능성을 제공한다 (Nguyen, TLA, et al, Disease Models & Mechanisms (2015) doi: 10.1242/dmm.017400). 예를 들어, 장 미생물총 연구에 필수적인 조작에는 숙주 유전적 배경 조작 ((유전자 적출 (gene knockouts)), 장 미생물총 조성 조작 (세균-없는, 또는 무균 생쥐에 조정적으로 접종, 즉 외부 미생물로 투여된 무균 생쥐) 및 음식물 조정, 항생제 처치 및 대변 이식 (fecal transplantations)을 포함하는 생태계 조정을 포함한다. 각 모델이 그 결과를 인간에게 적용하기에는 고려해야 할 필요가 있는 다른 한계를 가지고 있어, 많은 생쥐모델들이 모델화 된 인간 질병을 정확하게 반복하지는 않더라도, 이 모델들은 인간 미생물총을 조작하고 및 건강 및 질병에서 장 미생물총의 역할에서 인과관계를 잠재적으로 평가하는데 가치 있는 통찰력을 및 유일한 가능성을 제공한다.
생쥐 장으로부터 얻은 미생물은 프로테아제 (protease) 억제제 (cOmplete EDTA-free Protease Inhibitor, Roche)가 있는 PBS에 현탁 시키고 및 비드(bead)로 두들겨 ((Bullet Blender) 용해시켰다. 4-메틸움벨리훼릴-β-D-글루크로나이드 (4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide) (4-MUG; 1 mM)를 50 ㎕ 용해액 (0.9㎍ 총 단백질)에 첨가시켜 최종 농도 500 μM을 얻었다. 특정한 시점에서 (0-240 분), 각 반응의 10 ㎕ 엘리쿼트 (aliquots)을 90 ㎕ of 0.1 M Na2HCO3 (pH = 10)에 첨가시키고 및 어두운 곳에 저장하였다. 플레이트 리더 (plate reader) (Molecular Biosciences)를 사용하여 형광을 측정하고, 가수분해된 기질의 양이 표준곡선에 대비하여 계산되었다. 선형회귀 (linear regression) (GraphPad Prism)를 통해 비율(rate) (mM/s)이 결정되었으며 및 활성은 ㎍ 단백질 당 비율 (rate)로 계산되었다. 세 번의 독립적인 반복으로부터의 값이 평균화 되었으며 및 활성은 비율 쌍 t-테스트 (ratio paired t-test)를 사용하여 생물학적 반복값 (n=5)에 걸쳐 비교 되었다.
상관관계 분석 (Correlation analysis)
글루크로니데이즈 활성은 대조군 및 반코마이신 (vancomycin) 처치된 샘플의 총 집단에서의 OTU 상대 풍부함과 연관시켰다. 물로 처치한 한 샘플 (한배새끼 세트 E 대조군)에서 높은 활성 값이 다른 모든 값보다 매우 커서 통계적 결과에 현저하게 영향을 주어서, 이 샘플들은 분석에서 제외되었다. 추가로, 많은 수의 0을 가진 OTUs (샘플의 2/3 이상이 관찰된 0 값을 가졌다)은, 이러한 OTUs 로부터 얻은 결과는 허위일 가능성이 있으므로, 제외되었다. 나머지 OTUs는, 표준화된 OUT 풍부함 및 글루크로니데이즈 활성 사이의 피어슨 상관관계 (Pearson correlation)가 계산되었으며 및 그 의미에 대한 가설 테스트가 수행되었다. 상관관계는 0.05 수준의 의미에서 의미 있다고 간주되었다.
조직 세포질액의 분리 (Isolation of tissue cytosol)
생쥐 간, 폐, 신장, 장, 비장, 및 심장 조직은 조직 테에러 (tissue tearror)를 사용하여 얼음위에서 갈고, 이어서 유리 다운스 호모게나이져 (glass dounce homogenizer)로 느슨한 막자 (페슬) 에서부터 탄탄한 막자로 15회 파동 (pulse)을 사용하여 얼음으로 차게 한 1X PBS ((pH 7.4, 11.9 mM 포스페이트 (phosphates), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl) 버퍼에 있는 250mM 슈크로즈 (sucrose) 4 ㎖에서 균질화 시켰다. 균질화된 액은 10,000g(4℃)로 25분 동안 회전시키고, 이어서 상등액을 모으고 이는 이어서 100,000g에서 90 분 동안 4℃에서 회전시켰다. 상등액 (세포질 분획)은 침전물 (pellet) (마이크로좀 분획)로부터 분리시키고 및 단백질 농도는 BCA 에세이로 측정하였다.
GST 활성 에세이 (GST Activity Assay)
GST 활성 에세이는 1 mg/㎖ 생쥐 폐, 신장, 장, 비장, 및 심장 세포질액 및 0.5 mg/㎖ 간 세포질액에서 수행되었다. 조직 타입 당 4 번의 기술적 반복으로 측정되었다. 에세이는 96 웰 플레이트에서 수행되었다. 각 웰은 172 ㎕ PBS 에세이 버퍼 (IX PBS, pH 6.5), 4 ㎕의 1X PBS에 있는 GSH (50 mM), 및 20uL 1mg/㎖ (or 0.5 mg/㎖) 세포질액로 구성되었다. 20 ㎕의 추가의 PBS 에세이 버퍼가 단백질이 없는 대조군 웰에 첨가되었다. 에세이를 시작하기 위하여 DMSO에 있는 디니트로클로로벤젠 (dinitrochlorobenzene) (DNCB) (50 mM) 4 ㎕를 각 웰에 첨가시켰다. 흡광도는 340nm에서 매 30초 마다 10분 동안 측정되었다. 각 반복에 대한 흡광도 값의 기울기가 계산되었으며 및 단백질 없는 대조군 샘플의 기울기가 계산된 각 샘플 기울기로부터 차감되었다. GST 활성을 결정하기 위하여 다음의 방정식이 적용되었다: (Abs340/분)/0.00503μM (DNCB 흡광계수) * (1mg/20㎍) = nmol DNCB/분/mg 단백질.
생쥐 간에 있는 GST의 실험관 내 라벨링 및 SDS-PAGE 분석을 위한 HepG2의 프로테오믹스 (In Vitro Labeling of GSTs in mouse liver and HepG2 proteome for SDS-PAGE analysis)
모든 탐침 라벨링은 50 ㎕ 1 mg/㎖ 프로테옴(proteome)에서 진행되었다. 만약 해당하면, 경쟁자가 첨가되었으며, 및 샘플들은 37 oC에서 30분 동안 교반 시키면서 배양되었다. 0.5 ㎕의 적절한 탐침 스톡 (stock)이 각 샘플에 첨가되었다. 0.5 ㎕ DMSO가 탐침이 없는 대조군에 첨가되었다. 배양 후에, GSH-ABP 라벨 된 샘플들 (및 대조군)은 얼음위에서 UV 광선에 7 분 동안 노출시켰다. 탐침과 배양 후에, DMSO에 있는 1.0 ㎕ 로다민-아자이드 (rhodamine-azide) (3 mM), 1.0 ㎕ 소듐 아스코르베이트 (sodium ascorbate) (500 mM), 0.5 ㎕ 트리스(3-하이드록시프로필트리아졸일메틸)아민((Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine)) (200 mM), 및 2.0 ㎕ CuSO4 (100 mM)이 각 샘플에 첨가되었으며, 볼택스 되고 (vortexed), 및 빨리 돌려서 침전 켰다. 모든 샘플들은 실온 어둠에서 90분 동안 배양시켰다. 50 ㎕ 2X SDS 런닝 버퍼 (Running buffer) 및 10 ㎕ 10X 환원효소 (reducing agent)가 그후 각샘플에 첨가되었다. 샘플들은 볼택스 되고 및 95 oC에서 10분 동안 흔들면서 가열시켰다. 7.5 ㎍ 단백질이 그후 10-20% Tris-Gly 또는 4-12% Bis-Tris 겔의 각 웰에 올려지고 및 150 V, 35 mA에서 90분 동안 진행시켰다. 겔은 그후 Typhoon FLA 9500 (General Electric) 또는 FluorChemQ (Alpha-Innotech)에서 이미지화 되고, 이어서, GelCode Blue 염색으로 배양시키고 및 이어서 GelDocEZ (Bio-rad Laboratories)을 사용하여 이미징화 되었다. 겔 이미지 분석은 ImageQuant 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
탐침-매개하는 스트렙타비딘 강화 (Probe-Mediated Streptavidin Enrichment)
모든 생쥐 세포질액 샘플은 PBS 버퍼에 있는1 mg/㎖ 프로테옴의 슈크로즈(sucrose) (250 mM) 500 ㎕로 표준화시켰다. 샘플들은 그후 경쟁자와(만약 해당되면) 30분 동안 37 oC에서 배양시켰다. GST-ABP, GSH-ABP, 또는 동등한 부피의 DMSO 대조군은 프로테옴과 30분 동안 37 oC에서 배양시켰다. GSH-ABP 샘플은 그후 UV 광원에 (파장:365nm; 115V, 15W - Fisher UVP95) 7 분 동안 얼음 위에서 노출시켰다. 클릭 화학 혼합물은 최종농도의 DMSO에 있는 바이오틴-아자이드 (biotin-azide) (60 μM), 소듐 아스코르베이트 (sodium ascorbate) (5 mM), 테트라하이드로프탈릭 안하이드라이드(tetrahydrophthalic anhydride) (THPTA) (2 mM), 및 CuSO4 (4 mM)를 함유한다. 각 시약은 그 순서로 개별적으로 첨가되고, 볼텍스 되고, 회전시켜 침전시키고, 및 실온 어둠에서 90분 동안 배양시켰다. 800 ㎕의 미리-차게한 MeOH를 각 샘플에 첨가시켰다. 샘플들은 단백질 침전을 위하여 -80 oC 냉동고에 30분 동안 놓아 두었다. 샘플들은 14,000g로 4 oC에서 4분 동안 원심분리 시켰다. 상등액은 버리고, 및 침전물은 5 분 동안 공기-건조되도록 하였다. 샘플들은 다시 현탁 시키고 및 PBS에 있는 520 ㎕ SDS (1.2%)에서 초음파 분쇄 (sonicated) 시키고; 이어서 95 oC에서 2분 동안 배양시켰다. 샘플들은 14,000g에서 4분 동안 실온에서 원심분리 시키고, 상등액은 새로운 eppies에 옮기고, 잔류 침전물은 남겨 두었다. 샘플들을 실온으로(rt) 차게 한 후, 이들의 단백질 농도를 BCA 에세이로 결정하였으며 및 샘플들은 0.6 mg/㎖로 500 ㎕ 부피로 표준화시켰다. 100 ㎕ 스트랩타비딘-아가로즈 비드 (Streptavidin-agarose bead)를 PBS에 있는 1㎖ SDS (0.5%) 로 두 번 세척시키고, NH4HCO3 (25 mM)에 있는 1㎖ urea (6 M)로 두 번, 및 1 ㎖ 1X PBS를 사용하여 4x 세척시켰다. 세척은 바이오스핀 디스포져블 크로마토그래피 컬럼 (BioSpin Disposable Chromatography Columns) (Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 진공 여과를 통해 수행되었다. 비드는, 2 번의 1 ㎖ 엘리쿼트 PBS를 사용하여, 4 ㎖ 크리오바이알 (cryovials)로 옮기고, 단백질 샘플을 첨가하고, 및 비드/단백질 혼합물은 37oC에서 1 시간 동안 꺼꾸로 배양시켰다. 샘플은 그후 컬럼으로 다시 첨가되고 및 2 번의, 1 ㎖ 엘리쿼트의 PBS 에 있는 0.5% SDS를 사용하여 세척시키고; 2 번의, 1 ㎖ 엘리쿼트의 새롭게 제조된 NH4HCO3 (25 mM)에있는 우레아 (urea) (6 M); 2 번의, 1 ㎖ 엘리쿼트의 MilliQ 물; 8 번의, 1 ㎖ 엘리쿼트의 PBS; 4번의, 1 ㎖ 엘리쿼트의 NH4HCO3 (25 mM, pH 8) 로 세척 시켰다. 샘플들은 DNA lo-bind 듀브 (Eppendorf)로 2 엘리쿼트의 500 ㎕ PBS를 사용하여 옮기고 이어서 10,500 x g 로 5분 동안 실온에서 원심분리시켰다. 상등액은 버리고 및 비드는 NH4HCO3 (25 mM)에 있는 우레아 (urea) (6 M) 400㎕에 다시 현탁 시켰다. 샘플들은 TCEP (5 mM)로 37℃에서 30분 동안 배양시켜 환원시켰다. 샘플들은 요도아세트아마이드 (iodoacetamide) (10 mM)로 50℃에서 호일 (foil) 아래에서 45분 동안 알킬화 (alkylated) 시켰다. 비드는 컬럼으로 옮기고 및 1 ㎖ PBS로 8x 로 및 1 ㎖ NH4HCO3 (25mM)로 4x 세척시켰다. 이 이후에, 비드는 2 ㎖ NH4HCO3 (25 mM)로 DNA lo-bind 듀브 (Eppendorf)로 옮겼다. 샘플들은 10,500 x g 로 5분 동안 실온에서 원심분리 시키고, 상등액은 버리고 및 200 ㎕ NH4HCO3 (25 mM, pH 8)에 다시 현탁시켰다. 0.075 ㎍ 트립신 (trypsin)을 각 비드 혼합물에 첨가시키고 이어서 37℃에서 하룻밤 동안, 거꾸로 배양시켰다. 다음날 아침, 비드는 10,500g에서 5분 동안 회전시켜 침전시켰다. 상등액은 수집되고 및 샘플들은 스피드벡 (speedvac) (Savant SC110)에 건조될 때까지 놓아 둔다. 펩티드들은 40 ㎕의 25 mM NH4HCO3를 첨가하여 재조성 시키고 및 샘플들은 37℃에서 5분 동안 가열시켰다. 샘플들은 초원심분리 튜브에 옮겨지고 및 100,000 x g에서 돌려 어느 조각도 제거시켰다. 25 ㎕을 유리바이알에 넣어 분석될 때까지 -20 ℃에 저장시켰다.
탐침 강화된 쥐 간 및 폐 세포질액의 LC-MS 분석 (LC-MS Analysis of Probe Enriched Murine Liver and Lung Cytosol)
LC-MS를 위해 제조된 모든 프로테옴 샘플들은 Velos Orbitrap MS를 사용하여 분석되었다. Sadler, NC et al, Applied & Environmental Microbiology (2016) 82 (24): 7227-35. 데이터는 정확한 질량 및 시간 태그 접근 방법 ((accurate mass and time) (AMT) tag approach))을 사용하여 분석되었다. Zimmer, JSD, et al, Mass Spectrometry Reviews (2006): 25(3): 450-82. MS/MS 스펙트라는 Mus musculus Uniprot 단백질 데이터 베이스에 대항하여 탐색 되었다. 이 이후에, 데이터는 MSGF+ 접근 방법을 사용하여 다시스코아(rescore) 되었다. 펩티드는 더 나아가 다음의 기준으로 여과되었다: (i) 단백질 카운트 (protein count) =1, (ii) MT 유일성(MT Uniqueness) ≥ 0.5, 및 (iii) MT FDR ≤ 1%. 펩티드는 log2 로 변형되고 및 선형회귀를 통해 표준화 (normalized) 되었다. 펩티드는 그후 DAntE 를 사용하여 단백질 수준으로 올려졌다. (Polpitiya, A. et al, Bioinformatics (2008) 24(13): 1556-58). 최소 다섯 단백질이 구룹의 테스트 (Grubb’s test)위해 사용되었으며, P 값 절단 (cutoff)는 0.05 이었다. 비-경쟁된 및경쟁된 탐침-라벨된 샘플사이의 유의성은 물론, 탐침 없는 샘플 및 탐침-라벨된 샘플사이의 유의성은 쌍 t-테스트 (paired t-test) 및 계산된 풍부함 배수 변화 (calculated fold change abundances)를 사용하여 결정되었다.
실시예시 1
실험관 내 탐침 라벨링은 대장균 (Escherichia coli), 스트랩토코커스 아가락티아에 (Streptococcus agalactiae), 및 클로스트리디움 퍼후린겐스 (Clostridium perfringens) 로부터 재조합적으로 발현되고 및 정제된 β-글루크로니데이즈로 실시되었다. 효소는 β-글루크로니데이즈 탐침 실시예, GlcA-ABP, 로 처치되었으며, 이는 로자민-아자이드로 태그 되었으며, 및 SDS-PAGE로 분석되었다. GlcA-ABP 라벨링 강도는 월라스 등이 (Wallace et al.) 보고한 이들 효소들의 촉매적 효율에 (catalytic efficiency) 해당하였다 (도 10a 및 10b). 촉매 잔기의 글루타메이트 (glutamate)가 알라닌 (alanine)으로의 돌연변이는 탐침 라벨링을 없애게 하였으며, 이는 GlcA-ABP 탐침이 β-글루크로니데이즈를 활성-의존형식으로 라벨함을 확인한다. 추가의 결과가 도 10c-10f에 보여 진다.
다음으로, 장 미생물총의 글루크로니데이즈-활성 멤버들이 동정되었다. 생쥐 위장관으로부터 미생물이 분리되었으며 및 혐기성 조건 아래에서 GlcA-ABP 탐침과 배양시켰다. 세포는 고정시키고, 형광적으로 태그시키고, 및 탐침 양성 (GlcA-ABP+), 탐침 음성 (GlcA-ABP-), 및 모든세포 집단으로 분류되었다 (FIG. 7; FIG. 9). 각 집단에 대한 커뮤니티 조성 (Community composition) 은 그후 16S rRNA 유전자의 앰플리콘 서열분석에 의해 결정되었으며, 차등적으로 풍부한 분류군 (differentially abundant taxa)이 쌍 정량 분석 (paired quantitative analysis) 및 존재/비존재 분석 (presence/absence analysis)으로 동정되었다. GlcA-ABP 분획이 GlcA-ABP-에 비교하여 통계적으로 증가하는 풍부함을가진 분류군 (taxa)은 글루크로니데이즈-활성이라고 간주되었다. 글루크로니데이즈-활성인 분류군은 박테리오데테스 (Bacteroidetes), 프로테오박테리아 (Proteobacteria), 및 테네리큐테스 (Tenericutes)를 포함하는, 분류학상으로 다양한 것으로 발견되었다; 그러나 대부분의 분류군은 (31/37) 퍼미큐테스(Firmicutes) 이었다 (FIG. 11). 가장 풍부한 GlcA-ABP+ 작동적 분류 유닛트 (operational taxonomic units) (OTUs) 가진 세 개 또한 다양하며, 릭케넬라세아에 (Rikkenellaceae), 아나에로플락스마세아에(Anaeroplasmaceae), 및 에리시페로트리카세아에 (Erysipelotrichaceae) 과를 대표한다. 반대로, GlcA-ABP+ 분획에 비교하여 GlcA-ABP- 분획에서 의미있게 증기하는 풍부함을 가진 OTUs 글루크로니데이즈-비활성으로 간주된다. 이 분획도, 박테리오데테스 (Bacteroidetes), 프로테오박테리아 (Proteobacteria), 및 퍼미큐테스 (Firmicutes) 로부터의 대표적인 서열을 가지면서, 또한 분류학적으로 다양하다. 가장 높은 풍부함을 가진 GlcA-ABP-강화된 OUT는 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae)어었다. 이 결과들은 어떤 분류학적 그룹들은 과 (family) 수준에서 또는 속 (genus) 수준에서 글루크로니데이즈-활성 및 글루크로니데이즈-비활성 OTUs 둘 다를 함유한다는 것을 제시하며, 이는 그러므로 오로지 계통발생적 유사성에만 근거하여 생체 내 대사 활성을 말할 수는 없다는 것을 보여준다.
다양하고, 계통발생적으로 뚜렷한 분류군이 장 내 글루크로니데이즈 활성에 기여하고 있다는 사실에서, 장 미생물총의 방해는 글루크로니데이즈 활성을 없애는 것이 아니고, 오히려 이 활성에 책임이 있는 분류군을 변화시키는 것이라고 가정하였다. 그러므로, 한배새끼 쌍들을, 장 미생물총에 있는 퍼미큐테스 (Firmicutes)을 타겟으로 하는 것으로 알려진, 반코마이신 (vancomycin)이 있는 또는 없는 물에 노출시켰다 (도 12). 퍼미큐테스 (Firmicutes)가 처치하지-않은 생쥐에서 대부분의 탐침 양성 분류군으로 구성하므로 (도 11), 반코마이신 처치는 GlcA-ABP+ 집단 조성에의 변화 (shift)의 원인이 될 것으로 기대 되었다. 반코마이신 처치는 한배상 새끼 5 세트 중 4 세트에서 글루크로니데이즈 활성이 감소되었으나, 제거되지는 않았다 (도 13a). 따라서, GlcA-ABP+ 라벨링의 강도 (intensity) 도 또한 감소되었다 (도 13b). 항생제 처치 후 변화된 글루크로니데이즈-활성 분류군을 동정하기 위하여, 반코마이신 처치된 (Abx-GlcA-ABP+) 및 처치되지 않은 (GlcA-ABP+) 한배새끼 새끼의 GlcA-ABP+ 집단이 비교 되었다. 반코마이신 처치는 퍼미큐테스 (Firmicutes)의 상대적 풍부함을 현저하게 감소시켰으며, 및 프로테오박테리아 (Proteobacteria), 베루코미크로비아 (Verrucomicrobia), 및 박테리오데테스 (Bacteroidetes)의 상대적 풍부함을 해당하게 증가시켰다. 반코마이신 처치된 GlcA-ABP+ 집단과 비교하여, 대조군 GlcA-ABP+ 집단은 퍼미큐테스 (Firmicutes) ((특히 클로스트리디알레스 (Clostridiales)), 박테리오데테스 (Bacteroidetes), 테네리큐테스 (Tenericutes), 및 액티노박테리아 (Actinobacteria) 문 (phyla) 으로부터의 OTUs가 의미 있게 강화되었다 (도 13c). 반면에, Abx-GlcA-ABP+ 집단은 프로테오박테리아 (Proteobacteria) 집단에 속하는 OTUs에 의미 있게 강화되었다; 추가로, 항생제 처치 후에 두 개의 락토바실루스 (Lactobacillus) 분류군이 또한 GlcA-ABP+ 집단에서 의미 있게 좀더 풍부하였다. 그러한 이질적인 분류군이 다른 조건하에서 (즉, 항생제 방해) 같은 기능을 끌어 낼 수 있는 능력은 기질 다양성 및 이러한 효소들의 활용성을 부각시킨다. 글루크로나이드 (glucuronides)의 β-글루크로니데이즈 (β-glucuronidases)에의 결합은 대사물 (metabolite) 보다는 주로 글루크론산 (glucuronic acid)에 의해 매개되며, 미생물이 탄소와 에너지를 여러 모 대사물 (parent metabolites) 로부터 글루크론산 형태에서 추출하도록 한다. 그러므로, β-글루크로니데이즈는 유전학적으로 널리 퍼져 있고 및 여러 기질을 가수분해할 수 모두 있음으로서 높은 정도의 기능적 풍부함을 보여준다. 그 결과, 커뮤니티 구조의 방해는 기능을 완전히 제거하지 않으면서 기능적 구성원 (functional guild)의 조성을 변경시킬 수 있다. 이는 미래에는 장에서의 탈글루크론화 활성(deglucuronidation activity)을 치료적으로 조작하는 것은 특정한 분류군을 첨가하거나 또는 제거하여 가능한 것은 아니고, 여러 장내 분류군으로부터의 효소를 억제할 수 있는 억제제들이 필요할 것임을 암시한다. 분리된 장 미생물총의 유전적 예측 및 실험관 내 분석으로 이런 결과를 이전에 제시했지만, 여기서 서술된 에세이는, 처음으로, 생체 자체 내 활성 검출과 이와 관련된 기능적 분류군의 동정의 커플링을 통해, 마이크로바이옴에서 분자 스케일에서 생화학적 활성을 확인하였다.
추가적으로, 총 집단에서 이의 풍부함이 글루크로니데이즈 활성과 양성적으로 상관관계가 있는 OTUs가 동정되었으며 및 반코마이신 노출 후 고갈된 그것과 비교 되었다. 글루크로니데이즈 활성과 양성적으로 상관관계가 의미있게 있는 12 OTUs가 동정되었다. 두 실시예시에서 OTU92는 클로스트리디아레스 (Clostridiales)에 해당하고 및 OTU164, 루미노코커스 (Ruminococcus )에 해당함을 보여준다 (도 13d). 이들 12 OTUs 중에서, 10개는 GlcA-ABP+ 집단에서 Abx-GlcA-ABP+ 집단 보다 의미 있게 더 풍부했으며 (도 13c), 이는 이들 분류군이 처치되지 않은 생쥐에서 글루크로니데이즈 활성에 관여함을 제시하고, 및 반코마이신 노출시 감소된다. 나머지 두 개의 OTUs 중, 하나는 GlcA-ABP+ 및 Abx-GlcA-ABP+ 를통하여 한 샘플에서만 단지 발견되어, 통계적 분석을 방해하였다. 다른 하나의 OUT는 악커만시아(Akkermansia) OTU이었다. 흥미롭게도, 현저한 악커만시아(Akkermansia)의 증가는 반코마이신 처치된 생쥐 중에 하나에서 관찰되었으며 (F 세트), 이는 또한 항생제 처치 후에 글루크로니데이즈 활성의 증가를 보여준 단지 한 쌍의 한배새끼 새끼였다. 이 결과들은 대사적으로 활발한 장 마이크롬의 아집단 내에는 기능적 유연성 또는 풍부함이 있음을 확실하게 하며, 및 여기서 서술된 탐침 및 에세이 실시예는 이러한 정보를 평가하는데 사용될 수 있다.
실시예시 2
GSH-결합하는 G-부위 및 기질 결합 H 부위에서 활성-근거한 (activiy-based) GSTs 프로화일링이 가능한 두개의 탐침이 개발되었으며, 및 포유류 모델 시스템에서 GST을 타겟하고 활성을 측정할 수 있는 능력이 평가되었다. 첫번째 탐침, GSH-ABP-G는 GSH를 모방함으로서 글루타치온-결합 G 부위를 타겟하기 위해 디자인되었다. 광반응성인 벤조페논 (benzophenone) 및 말단 알킨 (terminal alkyne) 이 GSH의 티올 (thiol)에 붙여졌다. 이는 UV가 조사되었을 때 탐침이 GST에 비가역적으로 결합하게 하며, 및 이어서 클릭 화학 후에는 타겟으로한 단백질의 강화를 하게한다. GST 효소들은 GSH의 펩티드 구조를 인식하고 및 결합하며, 반면에 GSH 티올 (thiol)은 GST-매개한 제노바이오틱에의 부착을 위해 친핵체 (nucleophile) 로 기능한다. 그러므로, G 부위를 타겟 하기 위하여 티올은 알킨 및 벤조페논 함유하는 링커로 수정된다. G 부위를 타겟하는 광친화성 탐침에 보완하기 위하여, H 부위 활성을 규명하기 위한 기전-근거한 탐침 (mechanism-based probe) 이 개발되었다. 두 번째 탐침, GST-ABP-H,는 인간 및 설치류 GST 동종효소 (isoenzymes)에 대한 광범위 비가역적 억제제인, 디치론 (Dichlon) (2,3 디클로로-1,4-나프토퀴논) (2,3 dichloro-1,4-naphthoquinone)으로부터 유래되었다. GST-ABP-H는, 디치론 (Dichlon)의 소수성 (hydrophobicity) 및 친전자성 (electrophilicity), H 부위 결합 분자들의 성질들, 때문에 H 부위에 결합할 것이라고 가정되었다. 추가로, 디치론 잔기는 또한 GST H 부위내에서 보존된 촉매성 타이로신 (conserved catalytic tyrosines)에 결합하는 능력이 있다는 증거가 제시되었다.
재조합 GST (도 15a)의 농도 의존적인 라벨링이 평가되었다. 두 개의 탐침 실시예인, GSH-ABP-G 및 GST-ABP-H, 가 증가되는 농도로, 포유류 간에서 높이 발현되는 GST 동종효소인, 재조합 인간 GSTM1에 적용되었다. 배양 30분 후에, 형광 로다민 리포터 (fluorescent rhodamine reporter)가 클릭화학으로 첨가되었으며, SDS-PAGE는 두 탐침 모두 농도-의존적으로 재조합 GSTM1 효소에 타겟 됨을 보여주었다 (도 15a). 두 탐침 모두는 그후 더 나아가 탐침 타겟팅을 테스트하기 위 하여 증가되는 농도로 생쥐 간 용해액의 세포질 분획에 적용되었다 (도 15b). 두 탐침은 24kDa에 두 개의 뚜렷한 밴드에 강하게 라벨 되었다. 아래 밴드는, 간에서 매우 풍부한 23.6kDa 단백질, GST1 밴드, 일 것이다. 위의 밴드는 아마도, 분자량이 대략적으로26kDa인, mu 및 알파 (alpha) 부류로부터의 GST 타겟인 것으로 보인다. 이들 단백질 이외에, GST-ABP-H 탐침도 다양한 더 큰 분자량의 단백질들을 농도-의존적으로 라벨링 하는 것을 보여준다. GSH-ABP-G 탐침 실시예가 높은 선택성을 보여주는 반면에, GST-ABP-H 탐침 실시예는, 이의 강한 친전자성 성질 때문 일 것 같아서, 타겟-밖의(off-target) 라벨링에 좀더 민감한 것 같아 보인다 (도 15b). 각 탐침에 의해 타겟 되는 특이적인 GST 동종효소를 결정하기 위하여, 생쥐 간 라벨링 및 특정한 억제제 존재하에서 라벨링 한 것에 대한 LC-MS에 근거한 프로테오믹스 분석이 수행되었다. (도 16a 및 16b). 프로테오믹스에서 GSH-ABP-G 탐침 실시예는 GSTs에 대한 높은 특이성을 보여주는 것으로 나타났다 (도 16a). 27개의 탐침-타겟된 단백질들이 UV에 노출 안된 대조군에 비교하여 배수 변화 (fold-change)가 3 이 넘어 통계적으로 유의성이 있는 GSH-ABP-G 탐침 실시예의 타켓들인 것으로 결정되었다. 이들 27개 단백질 중에서, 8 개는 알려진 GSTs이고 및 뮤(mu), 알파 (alpha), 파이 (pi), 테타 (theta), 카파 (kappa), 및 제타 (zeta) 부류 (classes) 멤버를 포함한다. 나머지 단백질은GSH결합이 알려진 5 개 단백질, 알려진 항산화제 및 약물 결합 활성이 있는 1 개 단백질, 및 알려진GSH 결합 활성이 없는 간에 아주 풍부한 5 개의 단백질들이 포함된다. GST-ABP-H 탐침 실시예도 또한 GST의 뮤 (mu), 알파 (alpha), 파이 (pi), 테타 (theta), 오메가 (omega) 카파 (kappa), 및 제타 (zeta) 부류(classes)의 12 멤버들의 강화를 촉진시켰다 (도 16b). 그러나, 겔(gel)로의 연구에서처럼, GST-ABP-H 탐침에 대한 프로테오믹스 결과들은 GSH-ABP-G 탐침에 대한 것보다 상당히 더 어프-타겟 라벨링 (off target labeling)이 됨을 제시한다. 이 어프-타겟 (off-targets)들의 평가에서 이들 중 많은 단백질들은 GSTs와 유사한, 알려진 반응성인 티올(thiol)을 가진 것으로 나타났다. GSTs 내에서, GSH-ABP-G 탐침은 GSTM2, M1, A3, P1, M4, T1, K1, MAAI (Z)에 대한 선택성을 보이며 및 GST-ABP-H는 GSTT2, T1, 및 Z 동종효소에 대한 선택성을 보인다. 이 결과들은 두 탐침 모두 대부분의 세포질 GST 부류 많은 멤버들을 동종효소-특이적으로 타겟 하는데 효과적임을 증명한다.
탐침의 선택성, 및 전체적인 풍부함 프로화일링 (global abundance profiling)에 대항하 여ABP 접근방법의 가치를 보여주기 위하여, ABP 라벨링 결과들이 간 용해액에 대한 전체적인 프로테오믹스 분석과 비교되었다. 전체적 분석으로 단지 6 개의 GST만이 동정되었으나, ABP-라벨링은, 강화되지 않은 용해액에서 검출된 모든 GST를 포함하여, 12 개의 GST를 검출하는 결과를 가져왔다. 그러므로 ABPs는 활성적이고 및 풍부함이 적은 GSTs를 규명할 수 있게 한다.
탐침의 활성-특이적 결합과 일반적인 반응성을 구별하기 위하여, 및 G 또는 H 부위 특이성에 대한 이들의 선택성을 규명하기 위하여, 생쥐 간 용해액에서 GST-ABP-H 및GSH-ABP-G 라벨링을 몇 개의 상관 있는 억제제들과 경쟁시켰다. GSH-ABP-G 탐침에 의한 G-부위의 라벨링을 평가하기 위하여, G 부위 결합을 경쟁하기 위하여GSH를 과량으로 넣었다. GSH -경쟁하는 탐침 라벨링의 SDS-PAGE 및 LC-MS분석은 의미있는 억제를 보이지 않았다 (데이터 보이지 않음). 특정한 이론에 억매임이 없이, 억제함이 없는 것은 실험관 내 샘플에서는 글루타치온 다이설파이드 (glutathione disulfides) (GS-SG)의 형성 때문 일 수 있다. GS-SG 형성을 방지하지 위하여 잠재적으로 활성-수정하는 환원효소 첨가의 필요성을 피하기 위하여, 탐침 라벨링은, 이중황화 결합 (disulfide) bonds)을 할 수 없는 GSH 접합체인, S-헥실글루타치온 (S-hexylglutathione)과 경쟁시켰다. S-헥실글루타치온은 GST의 GSH-ABP-G 라벨링을, 효과적인 농도 1.77 μM (10 μM 탐침에 대한) 로, 농도 의존적인 방식으로 억제하며, GSH-ABP-G 탐침의 G 부위 특이성을 제공한다 (도 17). GST-ABP-H 탐침이 GST의 H부위를 타겟으로 하는지를 확인하기 위하여, G 부위 억제제인 S-헥실글루타치온 (S-hexylglutathione)에 의한 GST-ABP 억제의 경쟁이 H 부위의 억제제로 알려진 에타크리닉 에시드(ethacrynic acid)에 의한 경쟁에 비교 되었다. 결과는 도 17에 요약된다. S-헥실글루타치온은 EC50 41.5 μM로 GST-ABP-H 탐침 라벨링의 상당한 억제를 보였다. 이 경쟁은 S-헥실글루타치온의 접합된 헥실 (hexyl) 잔기와 GST H 부위 사이의 알려진 상호작용 때문이라는 것을 생각할 만하다. G 부위 억제제가 GST-ABP-H 결합을 감소시키더라도, H 부위 억제제인, 에타크리닉 에시드는 (ethacrynic acid), 휠씬 더 효과적인 것으로 기대 되었다. 에타크리닉 에시드는 S-헥실글루타치온에 비교하여 GST-ABP-H 효소 라벨링 억제에 거의 12x 더 강력 했으며, 이는 GST-ABP-H는 선택적으로 GST H 부위를 타겟 하는 것을 제시한다 (도 17). GST-ABP-G 라벨링도 또한 에타크리닉 에시드와 경쟁 되었다; GST-ABP-G 라벨링이0.44 μM (10 μM 탐침에 대하여)에서 억제되는 것이 발견되었다. 그러므로 에타크리닉 에시드는 G 부위에 GSTA-ABP-G 및 GST-ABP-H 둘 다의 접근을 차단할 수 있다. H 부위에의 에타크리닉 에시드의 존재는 H 부위에 놓여있을 가능성이 있는 GST-ABP-G의 알킨 및 벤조페논 잔기에 방해가 될 가능성이 또한 높다.
GSTs 및GSH-결합 단백질의 특이적인 라벨링을 결정하기 위하여, S-헥실글루타치온 경쟁된 간 세포질액의 프로테오믹스 분석 (도 16a 및 16b)이 수행되었다. GSTA3, M1, 및 P1의 GST-ABP-H 및 GSH-ABP-G 라벨링이 S-헥실글루타치온에 의해 상당히 억제되었으며 (변화배수 (fold change) >3.0, p≤0.05) 및 변화배수 억제로 (fold-change repression) 분류하였을 때 모든 억제된 타겟 중 상위 세 개였으며, 이는 두 탐침 모두GST의 활성 부위를 라벨링 함을 제시한다.
서술된 탐침의 부속부위 (subsite)의 호완성은 탐침의 각 효소 특이성을 조사하는 유일한 접근 방법을 제공한다. 디치론 (Dichlon)과의 경쟁은, 몇 가지 GSTs의 대략적이 분자량인, 24kDa 단백질의 라벨링을 선택적으로 억제한다. 억제는 H-부위 점령에 대한 디치론 (Dichlon)과 티올-첨부된 알킨/벤조페논(thiol-appended alkyne/benzophenone) 잔기 사이의 경쟁 때문 일 수 있다. 그러므로, 이 결과들은 GSH-ABP-G가 GST 활성부위 내에 결합한다는 것을 제시할 뿐만 아니라, 이들은 또한 더 나아가 디치론 (Dichlon), GST-ABP-H 모 분자 (parent molecule), 이GST 활성부위 내에 결합한다는 증거를 또한 제공한다. 디치론(Dichlon) (25 μM) 경쟁된 GSH-ABP-G 라벨된 생쥐 간 용해액에 대한 LC-MS가 수행되었다 (도 16a). GSTP1, M4, A3, M1, K1, 및 M2의 GSH-ABP-G 라벨링은 디치론(Dichlon) (FC>2, p≤0.05)과 비교하였을 때, 상당히 억제되었으며, 이는 GST-ABP 모 분자가 다양한 GST 부류를 GSH-ABP-G와 같이 거의 같은 결합 부위에 선택적으로 억제한다는 것을 제시하며, 더 나아가 GST-ABP-H는 GSTs의 활성부위에 결합한다는 것이 확인되었다. GST-ABP-H의 디치론(Dichlon) 잔기에 알킨의 클릭가능한 기능 그룹을 첨가하는 효과를 조사하기 위해, 생쥐 간 세포질액의 GST-ABP-H 라벨링을 디치론(Dichlon)과 경쟁시켰다. 억제는 모든 측정가능한 형광 밴드의 감소 결과를 보였으며, 이는 알킨-첨가된 클릭가능한 기능 그룹은 반응성에 의미 있는 영향을 주지는 않음을 제시한다.
GST-ABP-H의 일반적인 반응성 대비 이의 활성-특이적인 라벨링을 구별하기 위하여, 단백질의 시스테인 (cysteine) 잔기를 알킬화 (alkylate) 하는데 보통 사용되는 시약인 N-에틸말레이미드 (N-ethylmaleimide) (NEM)를 사용하여 경쟁적 탐침 라벨링이 수행되었다. 100 μM NEM로 경쟁된 GST-ABP-H 라벨링의 프로테오믹스 분석은 대부분의 GST 동종효소의 결합에 대한 경쟁은을 보여주지 못했으며, 이는 시스테인 결합은 GST-ABP-H의 첫번째 아미노산 타겟이 아닐 수 있다는 것을 제시한다. 이전의 연구들와 조합하여, 이러한 결과들은 타이로신 (tyrosine)이 GST-ABP-H에 의해 비가역적으로 결합하는 일차적이 잔기임을 제시한다.
다음에는 간, 폐, 신장, 장, 비장, 및 심장의 용해액을 포함한 기관의 제노바이오틱 대사에 관련 있는 부위-특이적인 GST 활성의 변화를 검출하기 위한 탐침의 능력이 평가가 되었다. 탐침 라벨링 및 형광 겔 이미징을 통해 측정된GST 활성이 총 집합체 GST 활성을 측정하는 비색적인 (colorimetric) GST 활성 에세이와 비교 되었다 (도 18a-18d). ABP라벨링 형광강도는 형광 시그날의 정량으로 측정되었다. 간GST 활성은 ABP 라벨링에서 가장 높았으며, 이어서 폐 및 신장이었다. 이 측정치들은 비색 에세이로 측정된 총GST 활성에 거의 해당한다. 폐 용해액에 대한 가 프로테오믹스 연구에서 그후 수행되었다. 11개의 GST 동종효소가 GST-ABP-H에 의해 강화되었으며, 및 3 개의 GST효소가 GSH-ABP-G에 의해 강화되었다 (도 18d). 두 탐침 모두 폐 GSTA4의 높은 강화를 보여주었으며, 이 단백질은 간 용해액에서는 이 두 탐침 어느 것으로도 의미 있게 강화되지 않았다. GST-ABP-H 및 GSH-ABP-G는 간에서 GSTM의 강화를 보인 반면에, 폐 용해액에서는 활성이 검출되지 않았다. GST-ABP-H는 또한 간 용해액에서 GSTM6를 강화시켰으나, 폐에서는 아니다. 이는 mRNA 발현 분석과 일치하며 및 이 효소들이 생쥐 간에 비교하여 생쥐 폐에서 감소되는 발현을 보여준다는 데이터를 보여주는것과 일치한다. 이 데이터는 제노바이오틱 대사에서 GSTs의 조직-특이적인 기여도를 조사하는데 있어서 이들 보완적인 탐침들의 효력을 보여준다.
탐침이 GST 활성에 대한 생리적으로 상응하는 변화를 검출한다는 것을 증명하기 위해서, 표준으로 먹인 (fed standard) (10% fat) 또는 고 지방 (high fat), 비만발생적인 (obesogenic), 차우 (chow) (60% fat)로 20-주 기간동안 먹인 생쥐의 장에서 ABP-측정된 GST 활성이 비교 되었다. 뮤(mu) 및 파이 (pi) GST 부류를 포함하는 몇몇의 GST 동종효소에서, 통계적으로 유의성이 있는 변화가 음식물-유도된 비만에 반응하여 보였다. 비만 생쥐의 장 GST에서 활성의 증가는 비만으로부터 오는 산화적 스트레스에 대한 반응 일 것 같다.
실시예시 3
NMR 스팩트라는 499.8 MHz 1H, 125.7 MHz 13C NMR 스펙트로메터(spectrometer)에서 25 ℃ 에서 기록 되었다 케미칼 시프트 (chemical shifts)는 NMR 용매 잔류 피크에 참고하여 파트 퍼 밀리언 (parts per million) (ppm - δ)으로 보고 되며, 커프링 항수 (coupling constants) (J) 는 헤르츠 (hertz) (Hz)로이고, 다중성 (multiplicities)은: 싱글렛(singlet) (s), 더블렛 (doublet) (d), 트리플렛 (triplet) (t), 더블렛의 더블렛 (doublet of doublets) (dd), 트리플렛의 더블렛 (doublet of triplets) (dt), 더블렛 더블렛의 더불렛 (doublet of doublet of doublets (ddd), 및 멀티플렛 (multiplet) (m)으로 기록 되는 것으로 표시된다. 모든 화합물들을 정제하기 위하여 바오타지 전제 시스템 (Biotage purification system)을 사용하여 실리카 겔 후레쉬 컬럼 크로마토그래피 (Silica gel flash column chromatography)을 사용하였으며 이를 위해 미리-넣어진(pre-packed) 컬럼은 루크노바(Luknova)로부터 얻었다. 시약 및 용매는 상업적 공급자로부터 구했으며 및 더 나아간 정제 없이 그대로 사용되었다. 필요할 때 마다, 무수 용매는 자체 용매 정제 시스템으로부터 얻었다. 모든 반응들은 TLC 및 터모 사이언티픽의 LTQ-MS (Thermo Scientific LTQ-MS)를 사용하여 모니터 되었다. 반응은 필요할 때마다 질소 (N2) 대기 ((nitrogen (N2) atmosphere)) 하에서 수행되었다. 새로운 화합물들의 성질규명을 위해, 1H, 13C NMR, 19F 및 LTQ-MS 데이터들이 포함되었으며, 알려진 화합물인 경우에는 적절한 참고 문헌과 함께 1H NMR 데이터만 보고된다.
GST-AB-H 탐침 합성을 위한 공정 (Process for synthesizing GST-AB-H probes):
Figure pct00123
2,3- 디클로로 -5- 니트로나프타렌 -1,4- 디온 ( 2,3- dichloro -5- nitronaphthalene -1,4-dione). 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논 (2,3-dichloro-1,4-naphthoquinone) (5 g, 0.022 mmol)을 천천히 연기나는 HNO3 (15 g) 및 농축된 H2SO4 (50 g)의 혼합물에 첨가하고 및 70℃에서 교반하면서 3시간 동안 가열시켰다. 그후 어두운 갈색 용액을 얼음-물(ice-water) (200 ㎖)에 쏟아 부어 밝은 황색 고체를 얻었으며 이는 여과로 모으고 및 물로 세척시켰다. EtOAc/헥산(Hexane) (20:80)으로 후레쉬 크로마토그래피 분리를 하여 두 분획을 얻었고 이를 아세토니트릴(acetonitrile) 및 물 용액으로 얼린 후 동결건조시켜 2,3-디클로로-5-니트로나프타렌-1,4-디온(2,3-dichloro-5-nitronaphthalene-1,4-dione) (1, 3.91 g, 70%) 및 2,3-디클로로-6-니트로나프타렌-1,4-디온 (2,3-dichloro-6-nitronaphthalene-1,4-dione) (2, 1.68 g, 28%)의 혼합물을 황색 고체로 얻었다. 화합물 1(Compound 1): 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 8.40 (d, J = 7.9, 1H,), 7.95 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 7.9 Hz, 1H) ppm (FIG. 19).; 화합물 2 (Compound 2): 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 9.00 (br s, 1H), 8.64 (dd, J = 8.5, 2.0 Hz, 1H), 8.42 (d, J = 8.5 Hz, 1H) (도 20).
5-아미노-2,3- 디클로로 나프탈렌-1,4- 디온 ( 5-amino-2,3- dichloronaphthalene -1,4-dione). 2,3-디클로로-5-니트로나프타렌-1,4-디온 (2,3-dichloro-5-nitronaphthalene-1,4-dione) (1) (0.501g, 1.84 mmol)을 농축된 염산 (concentrated hydrochloric acid) (30 ㎖)에 현탁 시켰다. SnCl2 (2.61 g, 13.78 mmol)을 이 혼합물에 첨가시키고 및 75℃에서 30분 동안 교반 되게 두었다. TLC로 1 이 사라진 것을 확인한 후에, 이 반응 혼합물은 실온으로 냉각시켰다. 이 내용물을 얼음을 함유하는 500 ㎖의 엘렌마이어 플라스크 (Erlenmeyer flask)에 옮기고 및 얼음베스 (ice bath)에 놓아 두었다. 10 M의 NaOH 용액을 일정하게 교반 시키면서 비등이 멈출 때까지 천천히 첨가시켰다. 이 용액의pH가 9 이상인 것을 확인한 후에, 내용물을 분리 깔때기 (separatory funnel)로 옮기고 및 CH2Cl2로 추출하였다. 유기층은 물 및 브라인 (brine)으로 세척시키고, 소듐 설페이트 (sodium sulfate) 위에서 건조시키고 및 용매를 로타리 증발기 rotatory evaporator)에서 증발시켜 아민 3의 보라색 고체로 하였다 (0.215 g, 48%).1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 7.56 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.7 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.80 (br, 2H) ppm (도 21).
N-(6,7- 디클로로 -5,8- 디옥소 -5,8- 디하이드로나프탈렌 -1-일) 헥스 -5- 인아마이드 ))((N-(6,7-dichloro-5,8-dioxo-5,8-dihydronaphthalen-1-yl)hex-5-ynamide). 3 (0.025 g, 0.103 mmol)을 메탄올(methanol) (20 ㎖) 및 트리에틸아민(triethylamine) (0.030 g, 0.210 mmol)을 함유하는 플라스크에 넣고 및 10분 동안 교반되도록 놓아 두었다. 새롭게 제조된 5-헥시노일 클로라이드 (5-hexynoyl chloride) (0.030 g, 0.211 mmol)를 이 혼합물에 첨가시키고 및 2 시간 동안 교반 되게 놓아 두었다. TLC 및 LTQ-MS (m/z 336.01 - M+H)로 반응을 완성한 후에, 반응은 물로 멈추게 (quenched) 하고 및 분리 깔때기를 사용하여 CH2Cl2 로 추출하였다. 유기층은 물, 브라인 (brine)으로 세척시키고, 소듐 설페이트 (sodium sulfate) 위에서 건조시키고 및 로타리 증발기 rotatory evaporator)를 사용하여 증발시켜 오렌지 고체를 얻었다. 플레쉬 크로마토그래피 ((1:1,헥산(Hexane):에틸 아세테이트 (Ethyl Acetate))를 사용하여 최종으로 정제하여 4 를 오렌지 고체로 얻었다 (23 mg, 65%). 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 11.71 (s, 1H), 9.16 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 2.69 (t, J = 7.3 Hz), 2H), 2.35 (dt, J = 6.5, 2.0 Hz, 2H), 2.01-1.97 (obscured m, 3H), ppm (도 22); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ 179.5, 175.7, 172.2, 142.3, 136.9, 135.7, 134.1, 131.3, 126.8, 123.5, 114.7, 82.9, 69.5, 37.0, 33.7, 23.7, 22.8, 17.8 ppm (도 23); LTQ-MS Calcd for C16H11Cl2NO2 - 335.011; found 335.011.
GSH-ABP-G 탐침 합성 공정 (Process for synthesizing GSH-ABP-G probes):
Figure pct00124
2-아미노-3-(4- 벤조일페닐l )-N-( 프로프 -2-인-1-일) 프로판아미도 ((2-amino-3-(4-benzoylphenyl)-N-(prop-2-yn-1-yl)propenamide). Fmoc-4-벤조일-L-페닐알라닌 (Fmoc-4-benzoyl-L-phenylalanine) (1.00 g, 2.03 mmol)을 DCM (10 ㎖)을 함유하는 둥근바닥 플라스크에 넣었다. DIPEA (3.54 ㎖, 20.3 mmol)를 플라스크에 넣고, 이어서 HATU (1.08 g, 2.84 mmol)를 넣었다. DMF (1.50 ㎖)를 넣어 시약들을 완전히 용해시켰다. 반응 혼합물을 30분 동안 교반시켰다. 프로파길아민 (Propargylamine) (0.156 ㎖, 2.44 mmol)을 반응 혼합물에 첨가시키고 및 실온에서 6 시간 동안 교반하면서 놓아 두었다. 반응 혼합물을 브라인 용액 (100 ㎖)에 첨가시키고 및 분리 깔때기를 사용하여 DCM (20 ㎖)으로 3 회 추출하였다. 유기층은 합치고, 소듐 설페이트 (sodium sulfate) 위에서 건조시키고, 및 DCM은 로타리 증발기 (rotary evaporation) 로 제거시켜 거친 황색 오일을 얻었다. DCM (8 ㎖)을 황색오일에 첨가하고, 이어서 피페리딘 (piperidine) (2.0 ㎖, 20.24 mmol)을 첨가하고 및 30분 동안 교반되게 하였다. DCM은 로타리 증발기로 제거시키고 및 생산물은 DCM에서 MeOH로 (0-20% MeOH)의 직선 구배 (linear gradient)로 정제시켜 4를 황색 오일 (0.21 g, 34%) 로 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 8.27 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.72 - 7.62 (m, 5H), 7.57 - 7.52 (m, 2H), 7.40 - 7.35 (m, 2H), 3.86 - 3.82 (m, 2H), 3.43 (dd, J = 8.2, 5.2 Hz, 1H), 3.09 - 3.06 (m, 1H), 3.01 - 2.68 (m, 2H) ppm (도 24); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 195.97, 168.21, 140.27, 137.44, 136.46, 133.22, 130.33, 130.18, 130.01, 129.05, 80.48, 74.27, 53.79, 38.68, 28.65 ppm (도 25); LTQ-MS Calcd for C19H18N2O2 - 306.14; found 307.22 (MH+).
3-(4- 벤조일페닐 )-2-(2- 요오드아세트아미도 )-N-( 프로프 -2-인-1-일) 프로판아마이드 . (( 3-(4-benzoylphenyl)-2-(2-iodoacetamido)-N-(prop-2-yn-1-yl)propenamide)). 4 (0.036 g, 0.12 mmol)를 둥근바닥 플라스크에 있는DCM (1 ㎖)에 용해시켰다. 요도아세틱 안하이드라이드 (Iodoacetic anhydride) (0.10 g, 0.28 mmol)를 플라스크에 첨가시키고 및 실온에서 15분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 EtOAc에서 MeOH로 (0-20% MeOH)의 직선 구배 (linear gradient)를 사용하여 플래쉬 크로마토그래피를 통해 정제시켰다. 용매는 정제된 분획으로부터 로타리 증발기 (rotary evaporation)를 사용하여 제거시켜 5를 흰색 고체로 얻었다(0.053 g, 95%).1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 8.49 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.17 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.72 - 7.61 (m, 5H), 7.58 - 7.51 (m, 2H), 7.43 - 7.37 (m, 2H), 4.52 (td, J = 9.2, 4.9 Hz, 1H), 3.84 (td, J = 5.0, 2.5 Hz, 2H), 3.11 - 3.09 (m, 1H), 3.07 - 2.80 (m, 2H), 1.75 (s, 2H) ppm (도 26); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 195.94, 171.24, 169.60, 143.70, 137.67, 135.52, 132.96, 130.00, 129.92, 129.79, 128.98, 81.35, 73.54, 53.92, 38.14, 28.44, 22.92 ppm (도 27); LTQ-MS Calcd for C21H19IN2O3 - 474.04; found 475.08 (MH+).
N5-(3-((2-((3-(4- 벤조일페닐 )-1-옥소-1-( 프로프 -2-인-1- 일아미도 )프로판-2-일)아미도)-2-옥소에틸)티오)-1-((카복시메틸)아미노)-1-옥소프로판-2-일)글루타민 (((N5-(3-((2-((3-(4-benzoylphenyl)-1-oxo-1-(prop-2-yn-1-ylamino)propan-2-yl)amino)-2-oxoethyl)thio)-1-((carboxymethyl)amino)-1-oxopropan-2-yl)glutamine))). 5 (0.048 g, 0.10 mmol)을 포타슘 포스페이트 버퍼 (potassium phosphate buffer) (10 ㎖, pH 7.2)에 용해시켰다. 이 용액에 환원된 글루타치온 (Reduced glutathione0 (0.20 g, 0.65 mmol)을 천천히 첨가시켰으며 및 실온에서 하룻밤 동안 (o/n) 교반시켰다. 반응 혼합물은 그후 역상 플래쉬 크로마토그래피 (reverse-phase flash chromatography)를 사용하여 H2O에서 ACN (0-100% ACN)로의 직선 구배 (linear gradient)로 정제시켰다. 정제된 분획은 로타리 증발시키고 및 동결건조 시켜 GSH-ABP를 흰색 고체(0.019 g, 28%)로 얻었다. +H NMR (D2O, 500 MHz): δ 7.67 - 7.56 (m, 5H), 7.47 - 7.42 (m, 2H), 7.34 - 7.28 (m, 2H), 4.55 (dt, J = 8.9, 6.8 Hz, 1H), 4.36 (dt, J = 10.2, 5.1 Hz, 1H), 3.80 (qd, J = 17.6, 2.5 Hz, 2H), 3.65 - 3.50 (m, 3H), 3.19 - 2.97 (m, 4H), 2.70 - 2.52 (m, 2H), 2.46 - 2.41 (m, 1H), 2.40 - 2.33 (m, 2H), 2.06 - 1.95 (m, 2H) ppm (도 28); 13C NMR (D2O, 125 MHz): δ 200.34, 175.94, 174.77, 173.90, 172.28, 171.98, 171.29, 142.21, 136.70, 135.46, 133.44, 130.72, 130.16, 129.31, 128.50, 79.17, 71.83, 54.80, 54.08, 52.76, 43.28, 36.99, 34.76, 33.22, 31.38, 28.69, 26.14 ppm (FIG. 29); LTQ-MS Calcd for C31H35N5O9S - 653.22; found 652.28 (MH-).
Figure pct00125
2-(2-포밀-4니트로페녹시)-6-(메톡시카보닐)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리아세테이트 ((2-(2-formyl-4-nitrophenoxy)-6-(methoxycarbonyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triyl triacetate)) (3)의 제조.
교반 바 (stir bar)가 있는 깨끗하고 건조된 100㎖ 둥근 바닥 플라스크에 1 (0.749 g, 1.89 mmol), 2-하이드록시-5-니트로벤즈알데하이드 (2-hydroxy-5-nitrobenzaldehyde) (0.316 g, 1.89 mmol), 아세토니트릴 (acetonitrile) (50 ㎖)을 넣고 및 5분 동안 교반 되도록 하였다. 이 반응 혼합물에 Ag2O (0.435 g, 1.89 mmol)를 조심하여 첨가시키고 및 실온에서 4 시간 동안 교반 하였다. LTQ-MS (m/z 484; M+H)로 원하는 질량을 주는 여과된 엘리쿼트를 사용하여 반응의 완성을 확인한 후에, 반응은 멈추게 하고 및 Ag2O를 세라이트 베드 (celite bed) 위에서 여과하여 없앴다. 용매는 로타리 증발기를 사용하여 제거하여 검은 갈색의 거친 생산물을 얻게 되었으며, 이는 더 나아가 플래쉬 크로마토그래피 ((에틸 아세테이트 (ethyl acetate): 헥산 (hexanes); 1:2))를 사용하여 정제시켜 원하는 알데하이드 3를 담황색 고체로서 얻었다(0.62 g; 67 %).1H NMR (CDCl3; 500 MHz) δ 10.32 (s, 1H), 8.70 (br s, 1H), 8.41 (d, J = 6.5 Hz, 1 H), 7.28 (d, J = 9.9 Hz, 1 H), 5.46-5.39 (obscured m, 5H), 3.73 (s, 3H), 2.02 (m, 9 H,) ppm.
2-(2-(디플루오로메틸)-4-니트로페녹시)-6-(메톡시카보닐)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리아세테이트 ((2-(2-(difluoromethyl)-4-nitrophenoxy)-6-(methoxycarbonyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triyl triacetate (4)의 제조.
화합물 3 (0.401 g, 0.83 mmol)를 무수 디클로메탄 (anhydrous dichloromethane) (50 ㎖)에 녹이고, 얼음 베스 (ice bath)에서 냉각시키고 및 5분 동안 일정한 N2 몰아 내기(purge of N2) 하에서 교반 시켰다. 디에틸아미노설퍼 트리플루오라이드 (Diethylaminosulfur trifluoride) (DAST) (0.66 g, 4.2 mmol)를 무수 디클로로메탄 (5 ㎖)에 녹이고 및 한 방울씩 반응혼합물에 첨가하고 이 이후에 반응 혼합물은 0 ℃에서 3 시간동안 교반시켰다. TLC and LTQ-MS로 반응의 완성을 확인한 후에, 반응은 수용성 NaHCO3 (aqueous NaHCO3) 용액으로 멈추게 하였다. 내용물은 50 ㎖ 디클로로메탄(dichloromethane)을 함유하는 분리 깔때기로 옮기고 및 유기층은 물 (3 x 25 ㎖) 및 브라인(brine) (1 x 25 ㎖)으로 세척하고 이 이후에 디클로로메탄 층은 분리시키고, 무수 MgSO4 위에서 건조시키고,및 여과시켰다. 용매는 로타리 증발기를 사용하여 증발시켜 거친 생산물을 얻었으며 이는 더 나아가 에틸 아세테이트: 헥산 (ethyl acetate: hexanes)(1 : 2)을 사용하여 플래쉬 크로마토그래피로 정제시켜 4 (0.39 g, 92%)를 흰색 고체로 얻었다. 1H NMR (CD 3 OD; 500 MHz) δ 8.42 (s, 1H), 7.45 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.03-6.81 (br t, J = 54.4 Hz, 1H), 5.67 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 5.50 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 5.32 (obscured t, 1H), 5.25 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 4.61 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 3.72 (s, 3 H), 2.07-2.03 (br s, 9 H,) ppm.
2-(2-(디플루오로메틸)-4-(헥스-5-인아미도)펜옥시)-6-(메톡시카모닐)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5 트리일 트리아세테이트 ((2-(2-(difluoromethyl)-4-(hex-5-ynamido)phenoxy)-6-(methoxycarbonyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triyl triacetate)) (6)의 제조.
교반 바 (stir bar)가 있는 깨끗하고 건조된 50㎖ 둥근 바닥 플라스크에 N-2 를 5분 동안 흐르게 하였으며, 화합물 4 (0.201 g, 0.39 mmol)을 넣고 및 EtOAc (25 ㎖)에 녹였다. 여기에 활성화시킨 (105 ℃ 오븐에서 하룻 밤 동안 가열) Pd/C (0.4 g)를 첨가하고 및 반응 혼합물은 버블링 하는 H2 가스로 (풍선을 통해) 반응 혼합물을 통해 5 분 동안 몰아냈다(purge). 그후 반응은 H2 가스 풍선 하에서 1-20시간 동안 유지되었다. TLC (2:1 Hex/EtOAc) 로 반응 완성을 확인한 후, H2 가스 풍선은 조심스럽게 떼어 내고 및 반응 혼합물은 N2 로 몰아냈다 (purged with N2). N2 흐름 하에서, 이 내용물은 셀라이트 베드 (Celite bed)위에서 디클로로메탄 (dichloromethane)을 용매로 사용하여 여과시켰다. 여과액은 로타리 증발기를 사용하여 용매를 증발시켜 농축시켜 아민 5 (5 amine 5) (0.180 g, 95%)를 엷은 황색 고체로 얻었으며, 질량은 LTQ-MS (m/z 476; M+H)를 사용하여 확인되었으며 및 이 화합물은 정제없이 다음 단계에 사용되었다.
교반 바가 있는 100 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에 5-헥시노익 에시드 (5-hexynoic acid) (1.00 g)를 넣고, 디클로로메탄 (dichloromethane) (50 ㎖)에 녹였으며 및 여기에 SOCl2 (10 eq)가 첨가되었다. 이 반응 혼합물은 6 시간 동안 환류시키고, 그후 용매는 로타리 증발기를 사용하여 증발시켜 헥시노일 클로라이드 (hexynoyl chloride)를 거친 오일로 얻었으며, 이는 그후 아민 5와 반응되었다.
아민 (Amine) 5 (0.125 g, 0.26 mmol)은 트리메틸 아민 (trimethyl amine) (0.080 g, 0.78 mmol)을 함유하는 무수 디클로로메탄 (anhydrous dichloromethane) (25 ㎖)에 녹이고 및 5 분 동안 교반시켰다. 헥시노일 클로라이드 (Hexynoyl chloride) (0.070 g, 0.53 mmol)를 디클로로메탄 (dichloromethane) (2 ㎖)에 녹이고 반응 혼합물에 한 방울씩 5 분에 걸쳐 천천히 첨가시켰다. 결과의 용액은 그후 12 시간 동안 디클로로메탄 (dichloromethane) (2 ㎖)실온에서 교반시키고 결국 LTQ-MS (m/z 570, M+H)를 사용하여 완성을 확인하였다. 반응 혼합물은 디클로로메탄 (dichloromethane) (50 ㎖)으로 희석시키고 및 내용물은 분리 깔때기로 옮겼다. 유기층은 포화된 (saturated) NaHCO3 (2 x 25 ㎖), H2O (2 x 30 ㎖) 및 부라인(brine)(1 x 50 ㎖)으로 세척시켰다. 유기층은 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 및 로타리 증발기를 사용하여 증발시켜 농축시켜 거친 생산물을 얻었으며, 이는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (flash column chromatography) (1:1 EtOAc/Hex) 로 정제시켜 6 (0.161 g, 77%)를 흰색 고체로 얻었다. 1H NMR (CD 3 OD, 500 MHz): δ 7.77 (s, 1H), 7.69 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.96-6.74 (br t, J(H,F) = 55.5 Hz, 1H), 5.49-5.44 (obscured d, 1H), 5.40 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.26-5.20 (m, 2H), 4.52 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 2.50 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.30- 2.27 (m, 3H), 2.04-2.03 (m, 9H), 1.91-1.87 (m, 2H); 13C NMR (CD 3 OD, 125 MHz): δ 172.3, 169.9, 169.7, 167.4, 134.3, 123.3, 117.3, 116.0, 98.7, 82.6, 71.6, 71.5, 70.7, 69.3, 68. 9, 51.9, 35.0, 24.1, 19.0, 18.9, 17.2; 19F NMR (CD 3 OD, 470 MHz) -111.26, -111.38, -111.90, -112.02, -121.23, -121.34, -121.87, -121.98; HRMS m/z (M+ H) calculated for C27H29F2NO11: 569.51, observed: 570.49.
6-(2-(디플루오로메틸)-4-(헥스-5-인아미도)펜옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카복실릭 에시드 ((6-(2-(difluoromethyl)-4-(hex-5-ynamido)phenoxy)-3,4,5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxylic acid)) (GlcA-ABP)의 제조.
100 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에서 6 (0.101 g, 0.175 mmol)를 무수 MeOH (20 ㎖)에 녹이고 및 5 분 동안 교반시켰다. 메탄올에 있는 NaOCH3 (25% wt/v; 0.030 g, 0.536 mmol)를 메탄올 (methanol) (5 ㎖)에 용해시키고 및 반응 혼합물에 주사기로 천천히 첨가하였다. 이 반응 혼합물은 실온에서 3 시간 동안 교반시켰다. LTQ-MS (m/z 428, M-H)로 반응의 완성을 확인한 후에, 반응은 멈추게 하고 용매는 로타리 증발기를 사용하여 증발시켜 거친 오일을 남겼다. 최종 정제는 100% 에틸 아세테이트로(ethyl acetate)를 사용하여 플래쉬 크로마토그래피로 최종 정제하여 GlcA-ABP를 황-갈색 고체(0.061 g, 80%)를 얻었다. 1H NMR (CD 3OD, 500 MHz): δ 8.53 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.62 (br d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.29 (obscured s, 1H), 7.27-7.06 (br t, J = 55.5 Hz, 1H), 4.58 (br s, 1H), 3.78 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 3.57-3.55 (m, 1H), 3.54-3.51 (m, 2H), 3.35 (s, 1H), 2.50 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.30-2.27 (m, 3H), 1.93-1.87 (m, 2H); 13C NMR (CD 3OD, 125 MHz): δ 172.3, 169.8, 168.8, 151.5, 149.3, 135.0, 133.7, 123.3, 117.1, 116.8, 82.7, 76.3, 75.2, 73.2, 72.0, 68.8, 35.0, 24.2, 17.2; 19F NMR (CD 3 OD, 470 MHz) -114.70, -114.81, 115.34, -115.46, -116.98, -117.09, -117.62, -117.74; HRMS m/z (M+ ) calculated for C19H21F2NO8: 429.37, observed: 428.11 [M-H].
실시예시 4
이 실시예시에서, 대표적인 장치 실시예가 다음의 단계를 사용하여 만들어 졌다. 휫셔브랜드 (Fisherbrand) 현미경 슬라이드는 슬라이드를 ~100 ㎖의 20% 질산 (nitric acid)에 85C에서 2 시간 동안 담거서 깨끗하게 하였다. 슬라이드는 그후 제거하고 및 비이커 가득의 밀리큐 물 (milliQ H2O) 밀에 두었다. 1 분 동안 담근 후에, 슬라이드는 새로운 비이커의 밀리큐 물 (milliQ H2O)로 옮기고 및 5 분 동안 있게 하였다. 슬라이드는 그 후 35% H2O2 용액에 옮기고 75oC에 1 시간동안 두었다. 슬라이드는 그후 제거하고 및 비커 가득의 milliQ H2O에 넣었다. 1분 동안 담근 후, 슬라이드는 새로운 비이커의 밀리큐 물 (milliQ H2O)로 옮기고 및 5 분 동안 있게 하였다. 슬라이드는 110oC 오븐에서 1 시간 동안(적어도) 건조하였다. 웰 커버는 밀리큐(milliQ)로 적시고 및 슬라이드 표면에 부착하였다. 웰이-부착된 슬라이드는 그후 오븐에 다시 넣어 30분 동안 건조되게 하였다. 이 장치는 표면에 1.6 ㎖ 밀리큐 (milliQ)를 첨가하여 새는지 검사하였다. 만약 10분 후 새지 않으면, 밀리큐 (milliQ)를 버리고오븐에 다시 넣어 ~ 15분동안 두고, 및 바로 기능화로 진행시켰다. 각 슬라이드는 1.568 ㎖ (총1.6 ㎖) 의 pH ~=4.5 (초산과 함께)인 3:1 milliQ:MeOH 용액에 있는 32 uL 의 트리에톡시실레인아민 (triethoxysilaneamine)으로 하룻밤 동안 실온에서 흔들면서 기능화시켰다. 슬라이드는 DMSO 2x, 에탄올 2x, 로 세척하고, 그후 오븐에 1 시간 동안 두었다. 1.5 ㎖ DMSO + 100 uL TEA에 있는 5 mg NHS-에스터-PEG-아자이드 (NHS-ester-PEG-azide) 용액을 슬라이드에 하고 및 하룻밤 동안 실온에서 흔들리게 하였ㄷ다. 슬라이드는 DMSO 3x 로 세척하였다. 각 슬라이드에 대해 1.6 ㎖ 총 부피의 DMSO를 용매로, 100 uM 탐침, 및 20 uM CuI로 클릭 화학이 수행되었다. 반응은 실온에서 흔들면서 하룻밤 동안 진행되도록 하였다. 슬라이드는 DMSO 3x로 세척시켰다.
실시예시 5
이 실시예시에서, 대표적인 장치가 샘플을 분석하는데 사용되었다. 특히, 이 장치 (상기 실시예시 4로부터 기능화된 기질과 같은)는 생물학적 샘플을 함유하는 수용액 (예를 들어 PBS)으로 2x 세척한다. 샘플은 기능화 된 장치 표면에 3시간 동안 흔들면서 (실온에서 또는 원하는 온도에서) 적용된다. 슬라이드는 PBS로 1x 세척한다. 그후, 슬라이드는 4% SDS로 1x 실온에서 흔들면서 세척한다 (5 분). 그후, 슬라이드는 DMSO로 2x 세척한다 (5 분, 그후 30분 흔들면서). 다음으로, 슬라이드는 PBS로 1x 세척하고, 이어서 0.5% BSA가 있는 PBS로 2x 실온에서 흔들면서 세척한다 (첫번째 세척은 5분 동안, 두 번째 세척은 30분 동안). 그후 슬라이드는 4% SDS로 2x 실온에서 흔들면서 세척한다 (첫번째 세척은 5 분 동안, 두 번째 세척은 하룻밤 동안). 그후 슬라이드는 PBS로 1x, 밀리큐 (milliQ)로 1x로 세척한다. 그후 슬라이드는 6M 우레아 (urea)로 실온에서 흔들면서 세척한다 (1 시간). 그후 슬라이드는 1M NaCl 2x로 2x (각 1분) 세척한다. 그후 슬라이드는 밀리큐 (milliQ)로 2x로 세척한다 (각 1분). 그후 슬라이드는 2.5 mM NH4HCO3 (pH 8)로 1x 세척한다 (5 분 흔들면서). 다음으로, 1.59 ㎖ 2.5 mM NH4HCO3 (pH 8)가 각 웰에 첨가된다. 20 ug 트립신 (trypsin) (바이알에)을 100 uL 2.5 mM NH4HCO3 (pH 8)로 희석하여 제조하고 및 10 uL 트립신 (trypsin) 용액 (.2 ug/uL)을 각 웰 표면에 첨가한다 (총 2 ug). 장치는 실온에서 하룻 밤 동안 흔들리도록 한다. 샘플은 수집되고 및 에펜도르프 튜브 (eppendorf tube)에 넣는다. 샘플은 얼리고 및 동결건조 되고 및 그후 50 uL 2.5 mM NH4HCO3 (pH 8)에 다시 현탁 시킨다. 단백질 농도를 측정하기 위하여 10 uL를 Quant-IT 에세이에 사용한다. 또한, 40 uL의 샘플을 유리 초원심분리 튜브로 옮기고, 이를 TLA 120.1 로터 (rotor)에서 53,000 rpm으로 20분 동안 돌렸다. 25 uL의 상등액을 수집하고 및 분석을 위해 MS 바이알 삽입 (MS vial inserts)으로 옮겼다.
실시예시 6
이 실시예시에서, 다중화 장치 (multiplexing device)로 유리 미세구 (glass microspheres)가 사용된다. 에펜도르프 튜브(1.5㎖ 최대)에 있는 용해액 (lysate) 또는 순수한 단백질 (50uL, 전형적으로 1mg/㎖) 용액에 두기능 탐침 (bifunctional probe) (100uM)을 첨가하고 및 37oC에서 1시간 동안 교반하지 않고 배양하였다. 이 용액에 DBCO-로다민(Rhodamine)545 (100uM)를 첨가하고 및 37oC에서 1시간 동안 500 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 차거운 (-20oC) MeOH (500-1000uL)로 세척하고 및 4oC에서 16xg로 2m 동안 원심분리를 수행하였다. 상등액은 (사용된 형광발색단에 따라, 밝은 핑크 일 것임) 제거되고 및 이 세 단계를 반복하고 두 번 반복한다. 에펜도르프 튜브 벽이 핑크 일 수 있으며, 이는 정상이다. 샘플은 건조되게 한다. 그후 5-10%의 기능화 된 아자이드 미세구 (functionalized azide microspheres) MeOH 현탁액을 단백질을 함유하는 에펜도르프에 첨가한다. MS는 튜브 바닥으로 파이펫하고 및 완전히 건조되도록 한다 (~30m, 부피에 따라). PBS에 있는 100uL 0.4% BSA를 다시 첨가하고, 미세구는 소니케이션 (sonication)으로 다시현탁시키고, 및 그후 볼텍스하고 및 손으로 섞는다 (튜브 바닥을 실험대위에서 두들기면 잘 작용한다). 미세구를 다시현탁 시킨 후, 클릭화학 조건 (50uL당, NaAsc 250mm, 0.5uL, THPTA 200mm, 0.25uL, CuSO4 100mm, 1uL) 이 사용되며 및 샘플은 37oC에서 1시간 동안 1500 rpm으로 섞으면서 배양한다. 미세구는 이 단계에서 세척시키고 (단지 PBS에 있는 0.4% BSA 로 2X 만 필요) 및 형광발색단에 기반한 리딩에 사용한다. 일단 완성되면, 샘플은 다음과 같이 세척한다: 1X PBS에 있는 0.4% BSA, PBS에 있는 4% SDS, 6M Urea, 2M NaCl, 그후 부피 (100uL) 25mM NH4HCO3, pH 8로 환원한다. 샘플은 프로테오믹스를 위해 새로운 트립신 (trypsin) (1ng/uL)으로, 37oC에서 12-24시간 동안 섞음 없이 배양하여 제조될 수 있다. 질량분석 (mass-spec) 샘플을 준비하기 전에 단백질 양을 측정하기 위해 BCA가 수행될 수 있다.
본 공개의 원리가 적용될 수 있는 많은 가능한 실시예의 관점에서, 제시된 실시예는 단지 바람직한 실시예시일 뿐이고 및 제한하는 것으로 간주해서는 아니라는 것을 인식하여야 한다. 오히려, 그 범위는 하기의 청구항에서 정의된다. 그러므로 우리는 이 청구의 범위 및 정신 내에 있는 모든 발명을 청구한다.
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Claims (20)

  1. 화학식 II를 만족하는 구조를 가진 탐침(probe)으로서,
    Figure pct00126

    여기서
    ERG는, 만약 존재한다면,
    Figure pct00127
    S(O)2OH, 또는 이의 음이온 형태; P(O(OH)2, 또는 이의 음이온 형태; 할로겐 (halogen); 또는 -OPh-CH2-ONO2 이고;
    EBG는 화학식 IIAEBG- IIJEBG의 하나 또는 그 이상을 만족시키는 구조를 가지는 탐침이고
    Figure pct00128

    여기서 Y는 CH3 또는 CF3; Y'는 O, NO2, 또는 -N=NR'', 여기서 R''은 염료 또는 다른 리포팅 잔기; 및 m은 0에서 5로부터 선택되는 정수이고; 및 R'는 알데하이드 (aldehyde), 케톤(ketone), 에스터(ester), 카복실산 (carboxylic acid), 아실 (acyl), 아실 할라이드 (acyl halide), 시아노 (cyano), 설포네이트 (sulfonate), 니트로 (nitro), 니트로조 (nitroso), 4차 아민(quaternary amine), CF3, 알킬 할라이드 (alkyl halide), 또는 이들의 조합이고;
    링커a (Linkera)는 알리파틱 (aliphatic) 그룹, 헤테로알리파틱 (heteroaliphatic) 그룹, 아로마틱(aromatic) 그룹, 알리파틱-아로마틱 (aliphatic-aromatic) 그룹, 헤테로알리파틱-아로마틱 (heteroaliphatic-aromatic) 그룹, 헤테로아로마틱 (heteroaromatic) 그룹, 알리파틱-헤테로아로마틱 (aliphatic-heteroaromatic) 그룹, 또는 헤테로알리파틱-헤테로아로마틱 (heteroaliphatic-heteroaromatic) 그룹을 포함하고;
    각 링커b (Linkerb) 및 링커, 만약 존재한다면, 독립적으로 알리파틱 (aliphatic) 그룹, 헤테로알리파틱 (heteroaliphatic) 그룹, 아로마틱(aromatic) 그룹, 알리파틱-아로마틱 (aliphatic-aromatic) 그룹, 헤테로알리파틱-아로마틱 (heteroaliphatic-aromatic) 그룹, 헤테로아로마틱 (heteroaromatic) 그룹, 알리파틱-헤테로아로마틱, (aliphatic-heteroaromatic) 그룹, 또는 헤테로알리파틱-헤테로아로마틱 (heteroaliphatic-heteroaromatic) 그룹을 포함하고;
    R, 만약 존재한다면, 카바메이트 (carbamate) 또는 카보네이트(carbonate)를 포함하는 그룹이고;
    각 Tag는, 만약 존재한다면, 독립적으로 검출될 수 있는 신호 (signal)을 발생시킬 수 있는 작용기 또는 분자이고;
    각 pTag는, 만약 Tag가 존재하지 않으면 존재하고, 독립적으로 클릭 가능한(clickable) 작용기를 포함하고; 및
    각 n, m, p, 및 q는 독립적으로 0 또는 1인 탐침(probe).
  2. 제1항에 있어서, 여기서 링커a (Linkera )는 하나 또는 그 이상의 화학식 IIA-Linkera-IIHLinkera를 만족시키는 구조를 가진 링커 그룹인 탐침으로서,
    Figure pct00129

    여기서 각 n'는 독립적으로 1에서 50까지 범위의 정수이고; Z는 산소 또는 NR'''이고, 여기서 R'''는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이고; 및 Q는 탄소, 산소, 또는 NR'''이고, 여기서 R'''은 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱인 탐침.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 여기서 링커b (Linkerb)는 존재하고 및 -(CH2)n’- 그룹을 포함하고, 여기서 n'는 1에서 50까지 범위의 정수이고; 아마이드 (amide) 그룹; 또는 이들의 조합인 탐침.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 링커c (Linkerc)는 존재하고 및 화학식 IIALinkerc 또는 화학식 IIBLinkerc를 만족시키는 구조를 가진 탐침이고,
    Figure pct00130

    여기서 n'는 1에서 50까지 범위의 정수이고; Z는 산소 또는 NR'''이고, 여기서 R''' 는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱인 탐침.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 R은 존재하고 및 하나 또는 그 이상의 화학식 IIAR-IICR를 만족하는 구조를 가진 탐침.
    Figure pct00131

    여기서 Z 및 Z'는 독립적으로 산소 또는 NR'''이고, 여기서 R''' 는 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱이고; n'은 1에서 50까지 범위의 정수인 탐침.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 Tag가 존재하고 및 여기서 각 Tag는 독립적으로 형광체(fluorophore), 친화도에-근거한 결합쌍의 결합 파트너, 양자점 (quantum dot), 또는 염료인 탐침.
  7. 제6항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 Tag는 독립적으로 로다민 (rhodamine), 플루오레신 (fluorescein), 또는 비오틴 (biotin) 인 탐침.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 pTag가 존재하고 및 여기서 각 pTag는 독립적으로 아자이드(azide) 또는 알킨 (alkyne)인 탐침.
  9. 제1항에 있어서, 여기서 화합물이 화학식 IIIA를 만족시키는 구조를 가진 탐침.
    Figure pct00132

  10. 제9항 또는 제10항에 있어서, ERG는 존재하고 및 요도(iodo); -OPh-CH2-ONO2; 또는
    Figure pct00133
    인 탐침
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 링커a (Linkera)는 에스터 (ester) 그룹, -O(CH2)n’NR'''C(O)(CH2)n’-그룹 또는 -(CH2)n’-그룹이고, 여기서 각 n'은 독립적으로, 1에서 20까지 범위의 정수이고 및 여기서 R''' 은 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱인 탐침.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 m 은 1이고 및 링커c (Linkerc)는 -NR'''C(O)(CH2)n ’- 그룹 또는 -NR'''C(O)CH2[O(CH2)2]n ’OCH2- 그룹이고, 여기서 각 n'은 독립적으로, 1에서 20까지 범위의 정수이고 및 여기서 R''' 은 수소, 알리파틱, 또는 아로마틱인 탐침.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 m은 1이고 및 각 Tag는, 만약 존재한다면, 독립적으로 형광체(fluorophore), 친화도에-근거한 결합쌍의 결합 파트너, 양자점 (quantum dot), 또는 염료이고; 또는 만약 pTag 그룹이 존재한다면, 그때는 각 pTag는 독립적으로 알킨 (alkyne) 또는 아자이드(azide) 인 탐침.
  14. 하기로부터 선택된 탐침으로서:
    Figure pct00134

    Figure pct00135

    Figure pct00136

    Figure pct00137

    Figure pct00138

    Figure pct00139

    Figure pct00140


    여기서 n'는 0 에서 50이고; 또는
    Figure pct00141
    인 탐침.
  15. 개체 또는 샘플을 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 탐침에 충분한 시간동안 노출시켜 제노바이오틱 대사에 관여하는 효소와 탐침이 결합하여 탐침-효소 접합체가 형성되도록 하는 단계; 및
    탐침-효소 접합체를 형광 검출 기술 (fluorescent detection technique), 비색적 검출 기술 (colorimetric detection technique), 질량 분석 기술 (mass spectrometry technique), 또는 이들의 조합을 사용하여 분석하는 단계; 를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, Tag 잔기를 포함하는 탐침-효소 접합체를 형성시키기 위해 탐침-효소 접합체를 Tag-함유하는 화합물에 노출시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  17. 제15항에 또는 제16항에 있어서, 탐침을 광원(light source)에 노출시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 개체의 샘플을 개체로부터 추출하고 및 형광 검출 기술, 비색적 검출 기술, 질량 분석 기술, 또는 이들의 조합을 사용하여 개체의 샘플을 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 탐침은:
    Figure pct00142

    Figure pct00143

    Figure pct00144

    Figure pct00145

    Figure pct00146

    Figure pct00147
    로부터 선택되는 방법.
  20. 기질(substrate); 및
    제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 탐침, 상기 탐침은 기질에 공유결합된 것; 을 포함하는 분석 플랫폼 (assay platform).
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