CN115551494A - Gpx4化合物和组合物以及使用它们的治疗方法 - Google Patents

Gpx4化合物和组合物以及使用它们的治疗方法 Download PDF

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H·刘
F·福鲁哈尔
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Abstract

本公开内容尤其提供了调节GPX4活性的化合物。也提供了含有相同化合物的药物组合物。进一步提供了与其他治疗剂联合使用所述化合物或组合物在受试者中治疗或改善癌症的影响的方法，在受试者中调节GPX活性的方法，在细胞中诱导铁死亡的方法，和在受试者中治疗或改善癌症的影响的方法。

Description

GPX4化合物和组合物以及使用它们的治疗方法
对相关申请的交叉参考
本申请要求2020年12月7日提交的美国临时专利申请系列号63/122,143和2020年3月13日提交的美国临时专利申请系列号62/989,425的权益，所述申请通过引用整体并入本文。
本公开内容的领域
本公开内容尤其提供了调节GPX4活性的化合物。还提供了含有相同化合物的药物组合物，以及使用这样的化合物和组合物的方法。
序列表的通过引用并入
本申请含有对氨基酸和/或核酸序列的引用，所述序列已经作为文件大小为5KB、创建于2021年3月8日的序列表文本文件“CU21144-seq.txt”与本文同日提交。前述序列表根据37 C.F.R.§1.52(e)(5)特此通过引用整体并入。
政府资助
本公开内容在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)颁布的授权编号CA209896下在政府支持下完成。美国政府具有本公开内容中的某些权力。
本公开内容的背景
癌细胞依赖于它们的脂质组成来建立和调节膜结构完整性、形态、代谢、迁移、侵袭性和其它功能。例如，在构成真核细胞膜的数千种脂质种类中，含多不饱和脂肪酸(PUFA)的磷脂(PUFA-PL)的丰度和定位是决定细胞膜的流动性的主要因素(Agmon等人.2017)。由于PUFA-PL中的双键的顺式构象阻碍了脂肪酰基尾部的有效堆积，升高的PUFA-PL水平有助于增加膜流动性和使其变薄(Agmon等人.2018)。但是，PUFA-PL易于通过铁催化的与双烯丙基位置的分子氧的反应(由脂氧合酶和不稳定的铁催化)而发生过氧化反应(Yang等人.2016)。因此，一些癌细胞依赖于关键的蛋白网络来消除它们的PUFA-PL过氧化物；在这个防御网络中心的一种关键蛋白是硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)。当GPX4活性受损时，脂质过氧化可以造成铁死亡(Stockwell等人.2017)，这是一种氧化性的、铁依赖性的非凋亡性细胞死亡形式(Dixon等人.2012)。铁死亡充当一种天然的肿瘤抑制和免疫监视机制，并可以被对GPX4上瘾的细胞中的外源试剂诱导(Dixon和Stockwell,2019)。已经关于其对铁死亡诱导化合物的敏感性筛选了来自不同来源组织的癌细胞(Viswanathan等人.2017)。已经发现，包括GPX4抑制剂在内的铁死亡诱导剂选择性地靶向具有间质或其它耐药性识别标志(signature)的癌症(Viswanathan等人.2017)。与间质状态与抗药性相关相一致，一项关于持久性癌细胞的独立研究揭示了对GPX4的类似选择性依赖性，所述持久性癌细胞被提出通过休眠状态从常规细胞毒性治疗中逃脱，并然后恢复以造成肿瘤复发(Hangauer等人.2017)。
对持久细胞的检查还揭示了间质标志物的上调和上皮标志物的下调(Hangauer等人.2017)。间质状态基因的过表达与上皮-间质转化(EMT)有关。由于EMT会增加肿瘤细胞的运动性并使原发性肿瘤能够侵入到远处部位，因此EMT是转移中的关键步骤。EMT还使癌细胞对细胞凋亡和化学疗法产生抗性(Viswanathan等人.2017)。EMT需要质膜重塑以增加流动性，这与PUFA-PL的生物合成增加有关。鉴于PUFA-PL比饱和或单不饱和脂肪酸PL更容易发生过氧化，处于EMT状态的细胞具有增加的对GPX4的依赖性以除去这些脂质过氧化物(Viswanathan等人.2017)。因此，经历EMT获得对细胞凋亡抗性的癌细胞变得容易发生通过GPX4抑制诱导的脂质过氧化和铁死亡(Viswanathan等人.2017)。随着癌细胞演变为高度间质耐药性状态并变得对细胞凋亡具有抗性，人们可能会通过铁死亡选择性地靶向这样的细胞；在这方面最有效的化合物是GPX4抑制剂(Viswanathan等人.2017)。例如，GPX4-敲除的高间质的治疗抗性的黑素瘤的体内异种移植物在停用ferrostatin-1(在Stockwell实验室发现的一种抑制GPX4损失的亲脂性抗氧化剂)以后退化，并且在停用达拉菲尼和曲美替尼治疗后没有复发，而野生型GPX4异种移植物在两个实验中继续生长(Viswanathan等人.2017)。GPX4抑制剂对持久性和EMT癌细胞具有选择性致死性，对亲本细胞和非转化细胞具有最小影响，从而提示，对GPX4的成瘾创造了一个大的治疗窗口。
因此，需要开发用于治疗侵袭性耐药癌症和其它GPX4相关疾病的GPX4抑制剂。本公开内容旨在满足这些和其它需要。
本公开内容的概要
在肿瘤学中最紧迫的问题之一是转移性的、耐药性的癌症。事实上，大多数癌症患者的死亡是由侵袭性的、转移性的、耐药性的癌症造成。一个令人惊讶的发现是，随着癌症演变成侵袭性的和耐药性的形式，它们对GPX4抑制具有极高的敏感性。这些数据提供了一种诱人的可能性，即可以通过使用GPX4抑制剂来治疗最具侵袭性的赘生性疾病，并且用这些抑制剂治疗的理想患者是已经用尽其它治疗选择的终末期患者。在2012年，我们报道了肿瘤抑制细胞死亡的一种新形式的存在，即铁死亡(Dixon等人.2012)。在2014年，我们发现铁死亡的关键负调节剂是脂质修复酶GPX4，证明GPX4在铁死亡中起作用的方式类似于癌基因Bcl-2在细胞凋亡中起作用的方式(Yang等人.2014)。我们发现了第一种GPX4抑制剂--纳摩尔效能小分子RSL3(Yang等人.2014)。在2017年，我们报道了已经经历上皮至间质(EMT)转化的癌细胞变得对铁死亡和对GPX4抑制剂超敏(Viswanathan等人.2017)。我们还发现了RSL3如何抑制GPX4，从而获得与GPX4结合的RSL3的共晶结构，这揭示了在GPX4上的一个新颖的药物结合位点。除了别的以外，我们提出利用这一发现来寻找具有良好ADMET性能的药物样GPX4抑制剂，其可以被开发为具有高EMT基因表达识别标志的耐药性癌症的一流GPX4抑制剂。
因此，本公开内容的一个实施方案是根据式(1)的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000041
其中：
R1、R2和R3独立地选自H、D、O、N、卤素、醚、酯、酰胺、C(O)、(O)C(R)、C(O)O、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基，其中所述醚、酯、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
其中R选自H、D、O、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
前提条件是，所述化合物不是
Figure BDA0003936150330000042
本公开内容的另一个实施方案是根据式(2)的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000051
其中：
虚线指示任选的双键的存在；
X和Y独立地选自C、N、S和O；
R1、R2、R3和R4独立地选自无原子、H、D、O、N、卤素、醚、酯、酰胺、C(O)、(O)C(R)、C(O)O、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基，其中所述醚、酯、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自N、O、Sn、卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
其中R选自H、D、O、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
前提条件是，所述化合物不是
Figure BDA0003936150330000052
在某些实施方案中，所述化合物具有选自以下的结构：
Figure BDA0003936150330000061
Figure BDA0003936150330000062
或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐。
本公开内容的另一个实施方案是根据式(3)的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000071
其中：
虚线指示任选的双键的存在；
X1、X2、X3和Y独立地选自C、N、S和O；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自无原子、H、D、O、N、卤素、醚、酯、酰胺、C(O)、(O)C(R)、C(O)O、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基，其中所述醚、酯、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
其中R选自H、D、O、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
前提条件是，所述化合物不是
Figure BDA0003936150330000072
本公开内容的另一个实施方案是根据式(4)的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000081
其中：
虚线指示任选的双键的存在；
X1、X2和X3独立地选自C、N、S和O；
Y是C或N；
R1和R2独立地选自无原子、H、D、-OH、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C2-6烯基、C2-6烯基-芳基和C2-6烯基-杂芳基，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C2-6烯基、C2-6烯基-芳基和C2-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自N、环氧、-OH、卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，或者R1和R2可以一起形成C3-12碳环，所述碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自O、N、卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合；
R3选自H、D、O、N、卤素、醚、酯、酰胺、氨基、C(O)、(O)C(R)、C(O)O、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基，其中所述醚、酯、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
R4和R5独立地选自无原子、H、D、-OH、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C2-6烯基、C2-6烯基-芳基和C2-6烯基-杂芳基，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C2-6烯基、C2-6烯基-芳基和C2-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自N、环氧、-OH、卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，或者R4和R5可以一起形成C3-12碳环，所述碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自O、N、卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合；
R6选自H、D、O、N、卤素、醚、酯、酰胺、氨基、C(O)、(O)C(R)、C(O)O、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基，其中所述醚、酯、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
其中R选自H、D、O、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
前提条件是，所述化合物不是
Figure BDA0003936150330000091
本公开内容的另一个实施方案是包含一种或多种本文中公开的化合物和药学上可接受的载体、辅助剂(adjuvant)或媒介物的组合物，包括药物组合物。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)相关疾病的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的一种或多种本文中公开的化合物或本文中公开的组合物。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中调节谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的活性的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的一种或多种本文中公开的化合物或本文中公开的组合物。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中增加过氧化物的水平的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的一种或多种本文中公开的化合物或本文中公开的组合物。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在细胞中诱导铁死亡的方法，所述方法包含使所述细胞与有效量的一种或多种本文中公开的化合物或本文中公开的组合物接触。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用i)有效量的第一抗癌剂，其为一种或多种本文中公开的化合物或本文中公开的组合物，和ii)有效量的第二抗癌剂。
本公开内容的一个额外实施方案是用于在有此需要的受试者中治疗或改善谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)相关疾病的影响的试剂盒，其包含与其使用说明书一起包装的有效量的一种或多种本文中公开的化合物或本文中公开的组合物。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)相关疾病的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的一种或多种具有选自以下的结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000101
Figure BDA0003936150330000111
Figure BDA0003936150330000112
和它们的组合。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)相关疾病的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的具有以下结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000121
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中增加过氧化物的水平的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的一种或多种具有选自以下的结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000122
Figure BDA0003936150330000131
Figure BDA0003936150330000132
和它们的组合。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在细胞中诱导铁死亡的方法，所述方法包含使所述细胞与有效量的一种或多种具有选自以下的结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐接触：
Figure BDA0003936150330000141
Figure BDA0003936150330000142
和它们的组合。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用i)有效量的第一抗癌剂，和ii)有效量的第二抗癌剂，其中所述第一抗癌剂是一种或多种具有选自以下的结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000143
Figure BDA0003936150330000151
Figure BDA0003936150330000161
和它们的组合。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用i)有效量的第一抗癌剂，和ii)有效量的第二抗癌剂，其中所述第一抗癌剂是具有以下结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000162
附图简述
申请文件含有至少一张彩色照片。在请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有彩色照片的本专利申请的副本。
图1A和1B显示，肝细胞癌疗法索拉非尼和乐伐替尼(lenvatinib)诱导铁死亡。在图1A中，用10μM索拉非尼或爱拉斯汀(erastin)处理24小时的HT-1080细胞显示出活力的丧失，所述活力的丧失被用铁死亡抑制剂β-巯基乙醇(β-ME)、ferrostatin-1(fer-1)或去铁胺(DFO)的共同处理所抑制。在图1B中，用12.5μM乐伐替尼处理72小时的SKHEP1 HCC细胞显示出细胞数目的减少，所述细胞数目的减少被用铁死亡抑制剂fer-1或利普司他汀(liproxstatin)中的任一种的共同处理所抑制。
图2显示了报道的GPX4抑制剂的结构。这些报道的化合物均不适合开发为药物；因此，需要新的骨架。
图3显示了与GPX4C66S结合的ML162的结构(Eaton等人.2019)。它揭示了ML162结合在活性位点。
图4显示了与RSL3结合的GPX4的共晶结构。
图5A-5C显示，证明RSL3的MALDI质谱图不在活性位点结合。在图5A中，显示了证明RSL3与GPX4U46C在体外结合的MALDI质谱图。在图5B和5C中，我们产生了GPX4的全cys突变体，其中所有半胱氨酸都突变为丙氨酸或丝氨酸，且活性位点硒代半胱氨酸突变为半胱氨酸以实现蛋白表达。虽然证实了ML162结合该U46C(GPX4的全Cys(-)突变体)，但RSL3未显示与该突变体的结合。
图6A-6E显示了GPX4抑制剂发现。图6A显示了与GPX4上的结合位点的计算机环境(in silico)对接。图6B显示了通过MST对结合的验证。图6C显示了通过SPR对结合的分析。图6D显示了通过GPX4特异性活性测定对酶抑制作用的检查。图6E显示了基于图6D中的数据计算的GPX4产物/底物比率。注：LOC1(LOC880)、LOC2(LOC957)、LOC3(LOC1886)和LOC4(LOC4873)。
图7A和7B显示，HSQC NMR数据表明命中化合物(hit compound)结合RSL3结合位点。图7A显示了单独的GPX4或与RSL3一起的GPX4的HSQC NMR。图7B显示了单独的GPX4或与LOC1886一起的GPX4的HSQC NMR。
图8A-8I显示，半胱氨酸66是RSL3和ML162在GPX4上的结合位点。图8A显示了RSL3以及GPX4与RSL3的共晶结构。图8B显示了ML162以及GPX4与ML162的共晶结构。图8C显示，缺少cys66结合位点的GFP-标记的GPX4C66S的过表达保护HT-1080细胞免于RSL3和ML162诱导的铁死亡的程度大于GFP-标记的GPX4WT的过表达，表明在细胞背景下RSL3和ML162与GPX4的cys66结合。图8D显示，缺乏cys66结合位点的无标签GPX4C66S的过表达也保护HT-1080细胞免于RSL3和ML162诱导的铁死亡的程度大于无标签GPX4WT的过表达，排除了GFP标签干扰的可能性。图8E显示，GFP-标记的GPX4C66S的过表达提供了与GFP-标记的GPX4WT等效的对FIN56和FINO2的保护，证实了由于在cys66处共价结合位点的丧失而针对RSL3和ML162的特异性保护。图8F显示了GFP-标记的全Cys(-)和全Cys(-)A66C GPX4的构建，以验证Cys66结合位点。图8G显示，与全Cys(-)GPX4相比，无酶活性的全Cys(-)A66C GPX4的过表达提供了显著的针对RSL3和ML162的保护，表明Cys66与RSL3和ML162结合，并因此保护G401细胞中的内源活性GPX4免受抑制剂的影响。图8H显示，如预期的，与全Cys(-)GPX4相比，无酶活性的全Cys(-)A66C GPX4的过表达对FIN56和FINO2致死性没有表现出影响。图8I显示，虽然全Cys(-)GPX4不能被RSL3共价修饰并因此对用WT GPX4观察到的RSL3诱导的降解具有抗性，但具有Cys66结合位点的全Cys(-)A66C GPX4易受RSL3诱导的降解的影响，这基于用RSL3处理的过表达全Cys(-)或全Cys(-)A66CGPX4的G401的蛋白质印迹。
图9A-9F显示，RSL3和ML162特异性地结合GPX4的Sec46和Cys66。图9A显示了GFP-标记的全Cys(-)A10C、全Cys(-)A46C、全Cys(-)A46U、全Cys(-)A107C和全Cys(-)A148CGPX4的构建，它们分别仅携带一个表面(硒醇)半胱氨酸。图9B显示，与全Cys(-)相比，WTGPX4、全Cys(-)A46U GPX4或全Cys(-)A66C GPX4的过表达显著保护G401细胞免受RSL3的影响，而具有其它半胱氨酸的GPX4的过表达不会。图9C显示，与全Cys(-)相比，WT GPX4、全Cys(-)A46C GPX4、全Cys(-)A46U GPX4或全Cys(-)A66C GPX4的过表达显著保护G401细胞免受ML162的影响，而具有其它半胱氨酸的GPX4的过表达不会。图9D显示，WT GPX4、全Cys(-)A46U GPX4和全Cys(-)A66C GPX4易于发生RSL3诱导的降解，而具有其它半胱氨酸的GPX4则不然，证实了对硒代半胱氨酸46和半胱氨酸66的选择性。图9E显示，GPX4U46C_C66S(其酶活性低于WT)的过表达对FIN56或FINO2处理没有表现出影响。图9F显示，如预期的，GPX4U46C_C66S(其酶活性低于WT，但是缺乏两个结合位点)的过表达显著保护HT1080细胞免于RSL3和ML162诱导的铁死亡。
图10A-10G显示，Cys66和Cys10参与调节GPX4的双重功能。图10A显示，关于IKE敏感性试验了过表达GFP-标记的WT、全Cys(-)、全Cys(-)A10C、全Cys(-)A46C、全Cys(-)A46U、全Cys(-)A66C、全Cys(-)A107C和全Cys(-)A148C GPX4的G401细胞。图10B显示，在我们的假设中，除了GPX4(I)的典型谷胱甘肽依赖性催化循环外，GPX4还可以利用第二个GPX4蛋白的Cys10上的硫醇作为还原剂以形成二聚体中间体，然后将其用第三个GPX4蛋白的Cys66上的硫醇再生以完成催化循环(II)。图10C显示了在常规G401和过表达全Cys(-)、全Cys(-)A10C、全Cys(-)A66C和全Cys(-)A148C GPX4的G401细胞中的内源性GPX4的酶活性。图10D显示，在不同空间群(P3121、P21和P1)中GPX4晶体的堆积模式中，C10、C46和C66始终彼此紧密接近。图10E和图10F显示，与用空载体转染的HT1080相比，关于IKE、ML162、FIN56和IKE敏感性试验了过表达GFP-标记的WT或C10S-C66S GPX4的HT1080细胞。图10G显示了与用空载体转染的HT1080相比，过表达GFP-标记的WT或C10S-C66SGPX4的HT1080细胞中GPX4的酶活性。
图11A-11F显示，Cys66是在GPX4上的RSL3的变构结合位点。在图11A中，完整蛋白MALDI MS显示在体外与GPX4U46C 1:1共价结合的RSL3。图11B显示，RSL3在体外未共价结合GPX4全Cys(-)-A46C的半胱氨酸46，而ML162却结合。图11C显示，RSL3与Cys66的结合抑制了GPX4的还原磷脂氢过氧化物的能力。图11D显示，解析了15N-GPX4U46C的1H,15N-HSQC-NMR谱的主链归属。图11E显示，RSL3与Cys66变构位点的结合通过单独的15N-GPX4U46C及其与RSL3的复合物的1H,15N-HSQC-NMR谱的重叠得到证实。图11F显示，如在2D-相互作用简图中所示，在GPX4U46C-RSL3的共晶结构中与RSL3相互作用的残基在HSQC-NMR谱中表现出化学位移。
图12A-12I显示，先导优化的化合物库的筛选鉴定了与Cys66变构位点结合的先导化合物。图12A-12C显示，GPX4与CDS9、TMT10或MAC5576的共晶结构揭示，这些抑制剂都结合GPX4的半胱氨酸66。图12D显示，将热迁移测定应用于筛选先导优化的化合物库中的9,719种化合物用于GPX4U46C的体外结合剂，这将改变GPX4U46C的熔化温度(|ΔTm|>2℃)。图12E显示，1H,15N-HSQC-NMR谱表明LOC1886(一种DSF筛选的热门命中化合物)与Cys66结合位点相互作用并导致GPX4U46C的整体构象变化。图12F显示了LOC1886的结构。图12G显示，与DMSO或LOC1886一起预温育的GPX4U46C的完整蛋白MALDI MS分析显示LOC1886共价地结合GPX4。图12H显示，LOC1886抑制HT1080细胞裂解物中的细胞GPX4的还原磷脂氢过氧化物的能力。图12I显示，LOC1886诱导HT1080的铁死亡，这可以通过fer-1(一种铁死亡特异性抑制剂)来挽救。
图13A-13D显示，R152H突变对GPX4结构的影响的计算机环境分析预测显著的构象变化以及局部环和活性位点的灵活性增加。图13A显示，R152H突变的计算分析预测了局部蛋白表面的变化，这造成疏水袋的丧失。R152H变体与野生型的重叠提示在R152H周围的环的主要构象变化。图13B显示，表面的改变主要来源于Gln123和Thr139之间的环的显著构象变化，在野生型中Arg152的侧链形成了多个氢键，而在突变体中His152没有。图13C显示，基于模型结构的MD模拟预测了局部环的额外灵活性和突变体的活性位点。图13D显示，与GPX4R152R相比，在Cys46与其催化配偶体Gln81/Trp136之间的距离增加并且在GPX4R152H的MD模拟中呈现出相当宽的分布。
图14A-14E显示了细胞模型中GPX4R152H的表征。在图14A中，NADPH偶联的GPX4活性测定提示，细胞的GPX4R152H具有比WT GPX4低得多的酶活性。使用用pBP空载体转染的HT1080，获得GFP-GPX4的活性，并然后用GFP-GPX4的WB强度进行归一化。在图14B中，在不含a-生育酚的培养基中监测具有内源性GPX4敲除和注释的GPX4WT或GPX4R152H过表达的细胞系的活力。在图14C和14D中，当将它们在含有100μMα-生育酚的培养基中培养时，或者当将它们在没有α-生育酚的培养基中培养5天时，试验了具有内源性GPX4敲除和注释的GPX4WT或GPX4R152H过表达的细胞系的GPX4酶活性。图14E显示，与GPX4WT相比，GPX4R152H的过表达针对由RSL3、ML162和IKE诱导的铁死亡的保护作用较小。
图15A-15C显示了在分子模型中GPX4R152H的表征。图15A显示了在
Figure BDA0003936150330000211
分辨率的GPX4R152H_U46C的晶体结构。与Arg152形成多个氢键的周围环(124-133)是完全无序的。与野生型的重叠也揭示了在活性位点周围的Lys48的构象变化。图15B显示，与GPX4U46C(PDB:2OBI)相比，R152H变体中催化三联体之间的距离增加。图15C显示，Lys48从GPX4R152H结构中的活性位点显著转移。
图16A-16J显示，Lys48调节GPX4的酶功能。图16A显示，细胞GPX4K48A突变体完全丧失了其酶活性。图16B显示，GPX4K48A的过表达针对RSL3、ML162和IKE诱导的铁死亡完全没有保护作用。在图16C中，GPX4U46C_K48A的晶体结构与GPX4U46C的晶体结构较好地对齐。一个微小区别在于环124-133。在图16D中，在WT、K48A和K48L GPX4的多个100ns MD模拟中记录了催化残基Cys46和Trp136之间的距离。图16E显示，在氧化的GPX4U46C(Cys46-SO3H)的晶体结构中，Lys48与氧化的Cys46紧密接近。图16F显示，在氧化的WT、K48A和K48L GPX4(Cys46-SO3H)的多个100ns MD模拟中记录了催化残基Cys46和Trp136之间的距离。在图16G中，GPX4U46C_K48L的晶体结构与GPX4U46C的晶体结构较好地对齐。一个微小区别在于环124-133。图16H显示，细胞GPX4K48L表现出比WT GPX4更高的酶活性。图16I显示，GPX4K48L的过表达比WTGPX4针对RSL3诱导的铁死亡更具保护性。图16J显示，GPX4K48L的过表达针对IKE诱导的铁死亡完全没有保护作用。
图17A-17G显示，GPX4R152H对由GPX4抑制剂诱导的降解的抗性揭示了由FIN56/RSL3诱导的GPX4降解的泛素/蛋白酶体依赖性机制。图17A显示，GPX4R152H的过表达针对FIN56具有特别保护作用。图17B显示，HT1080 OE GFP-WT-GPX4和HT1080 OE GFP-R152H-GPX4中的内源性GPX4都容易受到RSL3/ML162/FIN56诱导的降解。图17C显示，GFP-WT-GPX4容易受到RSL3/ML162/FIN56诱导的降解，而GPX4R152H对RSL3/ML162/FIN56诱导的降解具有抗性。图17D显示，在HT1080 OE GFP-K125R-K127R-GPX4中，GFP-GPX4K125R_K127R对RSL3/ML162/FIN56诱导的降解具有抗性，而内源性GPX4容易受到影响。图17E显示了用RSL3或/和MG132处理后HT1080的蛋白质印迹。图17F显示了用RSL3或/和MG132处理后HT1080的GPX4酶活性。图17G显示用RSL3或/和MG 132处理后A673的蛋白质印迹。
图18A-18G显示，含硒化合物和半胱氨酸的补充被试验为对过表达GFP-GPX4R152H的HT1080细胞的概念验证处理。在图18A-18D中，在用0.25μM RSL3、0.6μM IKE、5μM FIN56或5μM FINO2处理的HT1080 OE GFP-R152H-GPX4中试验了含硒化合物和半胱氨酸的拯救效果。在图18E中，针对RSL3、IKE、FIN56和FINO2在扩展浓度下试验了亚硒酸钠的拯救效果。图18F显示了含硒化合物和N-乙酰基-半胱氨酸对HT1080的毒性试验。在图18G中，IKE对硒毒性的抑制也在常规HT1080中重现。
图19A-19G显示，病理学分析在患者成纤维细胞中得到验证。图19A显示，RAG01(患者，具有在GPX4中的纯合R152H突变)和RAG02(患者的父亲/母亲(parent)，具有在GPX4中的杂合R152H突变)表达无法区分的GPX4蛋白水平。图19B显示，RAG01具有低于RAG02的GPX4酶活性。图19C显示，RAG01对RSL3、ML162、IKE和FIN56诱导的脂质过氧化和铁死亡比RAG02更敏感。图19D显示，GPX4R152H比GPX4WT更耐受由RSL3和ML162诱导的降解。E，GPX4的平均细胞免疫荧光。图19F显示了GPX4的平均细胞质免疫荧光与GPX4的平均细胞核免疫荧光的比率。在图19G中，呈现了每个细胞系的九个代表性免疫荧光图像，显示了DAPI和GPX4荧光。
图20A-20K显示了对患者成纤维细胞的概念验证处理。试验了含硒化合物、半胱氨酸、抗氧化剂和铁死亡抑制剂的补充作为对患者成纤维细胞的概念验证处理。
图21A-21B显示，概念验证处理在Pfa1细胞中得到验证，所述Pfa1细胞被敲除内源性GPX4并被转染以过表达人(图21A)或鼠(图21B)mScarlet GPX4WT(红色)或GPX4R152H(蓝色)。
本公开内容的详细描述
在本公开内容中，GPX4抑制剂被开发用于尤其是具有高间质状态基因表达识别标志的癌症。所有已知的GPX4抑制剂(图2)都是或假定是与GPX4的活性位点硒代半胱氨酸反应的共价抑制剂；开发针对GPX4而非其它硒代半胱氨酸活性位点(诸如在GPX1、GPX2、GPX3和GPX6中)的选择性化合物可能具有挑战性。在一项令人兴奋的最新进展中，我们鉴定了在GPX4上的变构位点，其允许GPX4失活而不靶向活性位点硒代半胱氨酸。具体地，我们解析了与GPX4结合的RSL3的x-射线结构，从而揭示了远离活性位点的变构位点。这个新的变构位点允许更大的选择性和基于结构的第一种变构GPX4抑制剂的设计。这代表了在寻找靶向GPX4的治疗剂中的一个令人兴奋的、可能改变游戏的进展。
因此，本公开内容的一个实施方案是根据式(1)的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000231
其中：
R1、R2和R3独立地选自H、D、O、N、卤素、醚、酯、酰胺、C(O)、(O)C(R)、C(O)O、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基，其中所述醚、酯、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
其中R选自H、D、O、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
前提条件是，所述化合物不是
Figure BDA0003936150330000241
本公开内容的另一个实施方案是根据式(2)的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000242
其中：
虚线指示任选的双键的存在；
X和Y独立地选自C、N、S和O；
R1、R2、R3和R4独立地选自无原子、H、D、O、N、卤素、醚、酯、酰胺、C(O)、(O)C(R)、C(O)O、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基，其中所述醚、酯、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自N、O、Sn、卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
其中R选自H、D、O、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
前提条件是，所述化合物不是
Figure BDA0003936150330000251
本公开内容的另一个实施方案是根据式(3)的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000252
其中：
虚线指示任选的双键的存在；
X1、X2、X3和Y独立地选自C、N、S和O；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自无原子、H、D、O、N、卤素、醚、酯、酰胺、C(O)、(O)C(R)、C(O)O、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基，其中所述醚、酯、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
其中R选自H、D、O、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
前提条件是，所述化合物不是
Figure BDA0003936150330000261
本公开内容的另一个实施方案是根据式(4)的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000262
其中：
虚线指示任选的双键的存在；
X1、X2和X3独立地选自C、N、S和O；
Y是C或N；
R1和R2独立地选自无原子、H、D、-OH、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C2-6烯基、C2-6烯基-芳基和C2-6烯基-杂芳基，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C2-6烯基、C2-6烯基-芳基和C2-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自N、环氧、-OH、卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，或者R1和R2可以一起形成C3-12碳环，所述碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自O、N、卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合；
R3选自H、D、O、N、卤素、醚、酯、酰胺、氨基、C(O)、(O)C(R)、C(O)O、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基，其中所述醚、酯、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
R4和R5独立地选自无原子、H、D、-OH、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C2-6烯基、C2-6烯基-芳基和C2-6烯基-杂芳基，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C2-6烯基、C2-6烯基-芳基和C2-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自N、环氧、-OH、卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，或者R4和R5可以一起形成C3-12碳环，所述碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自O、N、卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合；
R6选自H、D、O、N、卤素、醚、酯、酰胺、氨基、C(O)、(O)C(R)、C(O)O、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基，其中所述醚、酯、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
其中R选自H、D、O、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
前提条件是，所述化合物不是
Figure BDA0003936150330000281
本公开内容的另一个实施方案是包含一种或多种本文中公开的化合物和药学上可接受的载体、辅助剂或媒介物的组合物，包括药物组合物。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)相关疾病的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的一种或多种本文中公开的化合物或本文中公开的组合物。
在某些实施方案中，所述GPX4相关疾病选自癌症、神经症性障碍、神经变性障碍、脊椎干骺端发育异常(spondylometaphyseal dysplasia)、混合型脑瘫、脑桥小脑发育不全和男性不育。
在某些实施方案中，所述GPX4相关疾病是癌症。癌症的非限制性例子包括肝细胞癌、肉瘤、神经胶质瘤、肾细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤、结肠癌、弥散性大B细胞淋巴瘤、白血病、肺癌、透明细胞癌和非小细胞肺癌。在某些实施方案中，所述癌症是肝细胞癌。
在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，所述哺乳动物选自人类、兽医动物和农业动物。在某些实施方案中，所述受试者是人。
在某些实施方案中，所述癌症是转移性的。在某些实施方案中，所述癌症处于上皮至间质(EMT)转化下。在某些实施方案中，所述癌症是对铁死亡超敏性的和/或对GPX4上瘾的。在某些实施方案中，所述癌症是对标准癌症治疗难治的。标准癌症治疗的非限制性例子包括化学疗法、辐射疗法、靶向疗法、免疫疗法和它们的组合。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中调节谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的活性的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的一种或多种本文中公开的化合物或本文中公开的组合物。在某些实施方案中，所述调节包含抑制GPX4活性。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中增加过氧化物的水平的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的一种或多种本文中公开的化合物或本文中公开的组合物。过氧化物的非限制性例子包括过氧化氢、有机氢过氧化物、脂质过氧化物和它们的组合。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在细胞中诱导铁死亡的方法，所述方法包含使所述细胞与有效量的一种或多种本文中公开的化合物或本文中公开的组合物接触。
在某些实施方案中，所述细胞具有异常脂质积累。在某些实施方案中，所述细胞是癌细胞。在某些实施方案中，所述癌细胞选自肝细胞癌、肉瘤、神经胶质瘤、肾细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤、结肠癌、弥散性大B细胞淋巴瘤、白血病、肺癌、透明细胞癌和非小细胞肺癌。在某些实施方案中，所述癌症是肝细胞癌。
在某些实施方案中，所述细胞是人细胞。在某些实施方案中，其中所述癌细胞是转移性的。在某些实施方案中，所述癌细胞处于上皮至间质(EMT)转化下。在某些实施方案中，所述癌细胞是对铁死亡超敏性的和/或对GPX4上瘾的。在某些实施方案中，通过NADPH丰度、GCH1表达、NF2-YAP活性、EMT识别标志和GPX4表达来鉴定对铁死亡的超敏反应。在某些实施方案中，所述癌细胞是对标准癌症治疗难治的。标准癌症治疗的非限制性例子包括化学疗法、辐射疗法、靶向疗法、免疫疗法和它们的组合。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用i)有效量的第一抗癌剂，其为一种或多种本文中公开的化合物或本文中公开的组合物，和ii)有效量的第二抗癌剂。
在某些实施方案中，所述第二抗癌剂选自化学疗法、辐射疗法、靶向疗法、免疫疗法和它们的组合。在某些实施方案中，所述第二抗癌剂是免疫疗法，诸如检验点抑制剂疗法，包括PD-1和CTLA-4抑制剂疗法。免疫疗法的非限制性例子包括伊匹木单抗(ipilimumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、奥法木单抗(ofatumumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、达雷木单抗(daratumumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、talimogenelaherparepvec、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、来那度胺、地努妥昔单抗(dinutuximab)和它们的组合。
在某些实施方案中，所述受试者是人。
在某些实施方案中，所述癌症是转移性的。在某些实施方案中，所述癌症处于上皮至间质(EMT)转化下。在某些实施方案中，所述癌症是对铁死亡超敏性的和/或对GPX4上瘾的。在某些实施方案中，所述癌症是对标准癌症治疗难治的。
在某些实施方案中，所述癌症选自：肝细胞癌、肉瘤、神经胶质瘤、肾细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤、结肠癌、弥散性大B细胞淋巴瘤、白血病、肺癌、透明细胞癌和非小细胞肺癌。在某些实施方案中，所述癌症是肝细胞癌。
在某些实施方案中，在所述第二抗癌剂之前、同时地或之后，将所述第一抗癌剂施用给所述受试者。
本公开内容的一个额外实施方案是用于在有此需要的受试者中治疗或改善谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)相关疾病的影响的试剂盒，其包含与其使用说明书一起包装的有效量的一种或多种本文中公开的化合物或本文中公开的组合物。
所述试剂盒还可以包括本公开内容的每种化合物(例如，其可以呈药物组合物的形式)和其它试剂(例如，缓冲液、平衡盐溶液等)的合适贮存容器，例如，安瓿、小瓶(vial)、试管等，用于将活性剂施用给受试者。本公开内容的化合物和/或药物组合物和其它试剂可以以任何方便形式(例如，以溶液或以粉末形式)存在于试剂盒中。所述试剂盒可以进一步包括包装容器，其任选地具有一个或多个用于容纳化合物和/或药物组合物和其它任选的试剂的分隔区。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)相关疾病的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的一种或多种具有选自以下的结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000311
Figure BDA0003936150330000321
Figure BDA0003936150330000322
和它们的组合。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)相关疾病的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的具有以下结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000323
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中增加过氧化物的水平的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的一种或多种具有选自以下的结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000331
Figure BDA0003936150330000341
Figure BDA0003936150330000342
和它们的组合。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在细胞中诱导铁死亡的方法，所述方法包含使所述细胞与有效量的一种或多种具有选自以下的结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐接触：
Figure BDA0003936150330000343
Figure BDA0003936150330000351
Figure BDA0003936150330000352
和它们的组合。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用i)有效量的第一抗癌剂，和ii)有效量的第二抗癌剂，其中所述第一抗癌剂是一种或多种具有选自以下的结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000361
Figure BDA0003936150330000371
Figure BDA0003936150330000372
和它们的组合。
本公开内容的另一个实施方案是一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用i)有效量的第一抗癌剂，和ii)有效量的第二抗癌剂，其中所述第一抗癌剂是具有以下结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure BDA0003936150330000373
本文中使用的术语“治疗”、“处理”及其语法变体是指使个体受试者经受计划、方案、过程或补救，其中期望在受试者(例如，患者)中获得生理学应答或结果。具体地，本公开内容的方法和组合物可用于减缓疾病症状的发展，或延迟疾病或病症的发作，或中止疾病发展的进程。但是，因为每个被治疗的受试者可能不会对特定的计划、方案、过程或补救有应答，因此治疗不要求在每一个和每个受试者或受试者群体(例如，患者群体)中实现期望的生理学应答或结果。因此，给定的受试者或受试者群体(例如，患者群体)可能对治疗没有应答或应答不充分。
本文中使用的术语“改善”及其语法变体是指降低受试者中疾病的症状的严重性。
本文中使用的“受试者”是哺乳动物，优选人。除了人类之外，在本公开内容的范围内的哺乳动物类别包括，例如，农业动物、兽医动物、实验动物等。农业动物的一些例子包括牛、猪、马、山羊等。兽医动物的一些例子包括狗、猫等。实验动物的一些例子包括灵长类动物、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等。在本公开内容的上下文中，短语“有此需要的受试者”是指需要治疗GPX4相关障碍(诸如，例如，癌症)的受试者。可替换地，短语“有此需要的受试者”是指诊断出GPX4相关障碍(诸如，例如，癌症)的受试者。
本文中使用的“脂质过氧化”是指脂肪、油、蜡、固醇、甘油三酯等的氧化降解。脂质过氧化已经与许多变性疾病相关联，诸如动脉粥样硬化、缺血-再灌注、心力衰竭、阿尔茨海默氏病、风湿性关节炎、癌症和其它免疫学障碍(Ramana等人,2013)。
本文中使用的“铁死亡”是指铁依赖性的受调节的细胞死亡。铁死亡的特征是致死性脂质活性氧的大量铁依赖性积累(Dixon等人,2012)。铁死亡与细胞凋亡、坏死和自噬不同.(Id.)。
本文中使用的术语“调节”、“调控”、“调节剂”及其语法变体是指改变(诸如增加或减少)GPX4的活性。在该实施方案中，“接触”是指使化合物和任选的一种或多种另外的治疗剂与需要这种调节的细胞紧密接近。这可以如下实现：使用将药物递送给受试者的常规技术，或者在体外情况下，例如通过将化合物和任选的其它治疗剂提供给细胞所在的培养基。
本文中使用的“药学上可接受的盐”是指本公开内容的化合物的盐，其如本文中所定义是药学上可接受的且其具有期望的药理学活性。这样的盐包括与以下酸形成的酸加成盐：无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸诸如乙酸、丙酸、己酸、庚酸、环戊烷丙酸、羟乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、邻-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、对-氯苯磺酸、2-萘磺酸、对甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、葡萄庚糖酸、4,4'-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等。药学上可接受的盐还包括在存在的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应时可以形成的碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基还原葡糖胺等。
在本公开内容中，化合物或药物组合物的“有效量”或“治疗有效量”是这样的化合物或组合物的量：当施用给受试者时，其足以实现如本文所述的有益或期望结果。有效的剂型、施用模式和剂量可以凭经验确定，并且做出这种确定是在本领域的技术范围内。本领域技术人员应理解，剂量将随以下因素而变化：施用途径，排泄速率，治疗的持续时间，所施用的任何其它药物的种类，受试者的年龄、大小和物种，和例如医学和兽医学领域众所周知的类似因素。一般而言，根据本公开内容的化合物或药物组合物的合适剂量将是这样的化合物或组合物的量：其为有效产生所需效果而无副作用或具有最小副作用的最低剂量。根据本公开内容的化合物或药物组合物的有效剂量可以作为2、3、4、5、6个或更多个亚剂量施用，全天以适当的间隔分别施用。
根据本公开内容的化合物或药物组合物或包含这样的化合物的组合物的剂量的合适的非限制性例子是从约1ng/kg至约1000mg/kg，诸如从约1mg/kg至约100mg/kg，包括从约5mg/kg至约50mg/kg。本公开内容的化合物或药物组合物的其它代表性剂量包括约1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、800mg/kg、900mg/kg或1000mg/kg。
本公开内容的化合物、组合物或药物组合物可以以任何期望的和有效的方式施用：用于口服摄入，或作为软膏剂或滴剂用于局部施用给眼睛，或用于胃肠外施用或任何适当方式的其它施用，诸如腹膜内、皮下、局部、真皮内、吸入、肺内、直肠、阴道、舌下、肌肉内、静脉内、动脉内、鞘内或淋巴管内。此外，本公开内容的化合物、组合物或药物组合物可以与其它治疗联合施用。如果需要的话，可以将本公开内容的化合物、组合物或药物组合物包封或以其它方式保护免受胃或其它分泌物。
本公开内容的组合物或药物组合物是药学上可接受的且包含与以下物质混合的一种或多种活性成分：一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂，和任选地，一种或多种其它化合物、药物、成分和/或物质。无论选择的施用途径，通过本领域技术人员已知的常规方法，将本公开内容的化合物/组合物/药物组合物配制成药学上可接受的剂型。参见，例如，Remington,The Science and Practice of Pharmacy(第21版,Lippincott Williams andWilkins,Philadelphia,PA.)。更一般而言，“药学上可接受的”是指，其可用于制备通常安全、无毒且既不是在生物学上也不是在其它方面不希望的组合物，并且包括对于兽医学应用以及人药物应用而言可接受的那些。
药学上可接受的载体和稀释剂是本领域众所周知的(参见，例如，Remington,TheScience and Practice of Pharmacy(第21版,Lippincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA.)和The National Formulary(American PharmaceuticalAssociation,Washington,D.C.))，且包括糖(例如，乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇)、淀粉、纤维素制品、磷酸钙(例如，磷酸二钙、磷酸三钙和磷酸氢钙)、柠檬酸钠、水、水溶液(例如，盐水、氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、含乳酸盐的林格氏注射液)、醇(例如，乙醇、丙醇和苯甲醇)、多元醇(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇)、有机酯(例如，油酸乙酯和甘油三酯)、可生物降解的聚合物(例如，聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐))、弹性体基质、脂质体、微球、油(例如，玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、棉籽油和花生油)、可可脂、蜡(例如，栓剂蜡)、石蜡、有机硅、滑石粉、silicylate等。用在本公开内容的组合物中的每种药学上可接受的载体或稀释剂必须是“可接受的”，其含义是，与制剂的其它成分相容且对受试者无害。适合用于选择的剂型和预期施用途径的载体或稀释剂是本领域众所周知的，且使用本领域的普通技术可以确定对于所选的剂型和施用方法而言可接受的载体或稀释剂。
本公开内容的组合物或药物组合物可以任选地含有在这样的组合物中常用的额外成分和/或物质。这些成分和物质是本领域众所周知的，且包括(1)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(2)粘合剂，诸如羧甲纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和阿拉伯胶；(3)保湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、淀粉羟乙酸钠、交联的羧甲基纤维素钠和碳酸钠；(5)溶液缓凝剂，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如季铵化合物；(7)润湿剂，诸如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土黏土；(9)润滑剂，诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇和月桂基硫酸钠；(10)助悬剂，诸如乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminummetahydroxide)、膨润土、琼脂和黄蓍胶；(11)缓冲剂；(12)赋形剂，诸如乳糖、奶糖、聚乙二醇、动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、可可脂、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、有机硅、膨润土、硅酸、滑石粉、水杨酸盐、氧化锌、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末；(13)惰性稀释剂，诸如水或其它溶剂；(14)防腐剂；(15)表面活性剂；(16)分散剂；(17)控释剂或吸收延迟剂，诸如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、可生物降解的聚合物、脂质体、微球、单硬脂酸铝、明胶和蜡；(18)遮光剂；(19)辅助剂；(20)湿润剂；(21)乳化剂和助悬剂；(22)增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(具体地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯；(23)推进剂，诸如氯氟烃和挥发性的未被取代的烃，诸如丁烷和丙烷；(24)抗氧化剂；(25)使制剂与预期接受者的血液等渗的试剂，诸如糖和氯化钠；(26)增稠剂；(27)包衣材料，诸如卵磷脂；和(28)甜味剂、矫味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。每种这样的成分或物质必须是“可接受的”，其含义是，与制剂的其它成分相容且对受试者无害。适用于所选剂型和预期施用途径的成分和物质是本领域众所周知的，并且使用本领域的普通技术可以确定对于所选剂型和施用方法而言可接受的成分和物质。
适合用于口服施用的化合物、组合物或药物组合物可以呈以下形式：胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、粉剂、颗粒、在水性或非水性液体中的溶液或混悬液、水包油或油包水液体乳剂、酏剂或糖浆剂、软锭剂、大丸剂、药糖剂或糊剂。这些制剂可以通过本领域已知的方法制备，例如，借助于常规的锅包衣、混合、制粒或低压冻干方法。
用于口服施用的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、颗粒等)可以如下制备：例如，将活性成分与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂混合，并任选地与一种或多种填充剂、增量剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、溶液阻滞剂、吸收促进剂、润湿剂、吸收剂、润滑剂和/或着色剂混合。使用合适的赋形剂，可以采用类似类型的固体组合物作为在软和硬填充的明胶胶囊中的填充剂。通过任选地与一种或多种助剂一起压缩或模塑，可以制备片剂。使用合适的粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂、表面活性剂或分散剂，可以制备压制的片剂。通过在合适的机器中模塑，可以制备模塑片剂。片剂和其它固体剂型，诸如糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂，可以任选地划痕，或者用包衣剂和壳(诸如肠溶包衣和药物配制领域中众所周知的其它包衣剂)制备。还可以配制它们，从而提供其中的活性成分的缓慢释放或控制释放。它们可以如下灭菌：例如，穿过细菌截留过滤器过滤。这些组合物也可以任选地含有遮光剂，且可以是这样的组合物，使得它们仅或优先在胃肠道的特定部分中释放活性成分，任选地以延迟的方式。所述活性成分还可以呈微囊化形式。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬液、糖浆剂和酏剂。所述液体剂型可以含有本领域中常用的合适惰性稀释剂。除了惰性稀释剂以外，口服组合物还可以包括辅助剂，诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。混悬液可以含有助悬剂。
用于直肠或阴道施用的组合物可以作为栓剂存在，其可以如下制备：将一种或多种活性成分与一种或多种合适的无刺激性的载体混合，所述载体在室温为固体，但在体温为液体，并且因此将在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。适用于阴道施用的组合物还包括阴道栓、卫生栓、乳膏剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂，其含有本领域已知适当的这样的药学上可接受的载体。
用于局部或透皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂、滴剂和吸入剂。可以将活性剂/化合物在无菌条件下与合适的药学上可接受的载体或稀释剂混合。软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶可以含有赋形剂。粉剂和喷雾剂可以含有赋形剂和推进剂。
适合用于胃肠外施用的组合物包含与一种或多种药学上可接受的无菌的等渗的水性或非水性溶液、分散体、混悬液或乳剂组合的一种或多种试剂/化合物，或可以在即将使用前在无菌的可注射溶液或分散体中重构的无菌粉剂，所述溶液或分散体可以含有合适的抗氧化剂、缓冲剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、或助悬剂或增稠剂。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣材料，通过维持所需的颗粒尺寸(在分散体的情况下)，和通过使用表面活性剂。这些组合物还可以含有合适的辅助剂，诸如润湿剂、乳化剂和分散剂。也可能需要包括等渗剂。另外，通过包含延迟吸收的试剂，可以实现可注射药物形式的延长吸收。
在某些情况下，为了延长药物(例如药物制剂)的作用，需要减慢其从皮下或肌肉内注射的吸收。这可以通过使用具有差水溶性的结晶或无定形物的液体混悬液来完成。
活性剂/药物的吸收速率则取决于其溶解速率，而溶解速率又可能取决于晶体尺寸和晶体形式。可替换地，通过将活性剂/药物溶解或悬浮在油性媒介物中，可以实现胃肠外施用的试剂/药物的延迟吸收。通过在可生物降解的聚合物中形成活性成分的微胶囊基体，可以制备可注射的贮库形式。取决于活性成分与聚合物的比例以及所采用的特定聚合物的性质，可以控制活性成分释放的速率。通过将药物包封在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中，也制备可注射的贮库制剂。可以将可注射的物质灭菌，例如，通过穿过截留细菌的过滤器过滤。
所述制剂可以存在于单位剂量或多次剂量密闭容器(例如，安瓿和小瓶)中，并且可以在低压冻干条件下储存，仅需要在即将使用之前添加无菌的液体载体或稀释剂，例如注射用水。即时注射溶液和混悬液可以由上述类型的无菌粉剂、颗粒和片剂制备。
提供以下实施例以进一步举例说明本公开内容的方法。这些实施例仅仅是示例性的，且无意以任何方式限制本公开内容的范围。
实施例
实施例1
GPX4抑制剂的适应症
出于几个原因，我们提议将肝细胞癌作为第一个适应症。首先，我们发现FDA批准的多靶点激酶抑制剂索拉非尼是极少数在细胞和动物模型中诱导铁死亡(图1)的激酶抑制剂之一(Lachaier等人.2014；Louandre等人.2013；Dixon等人.2014)；鉴于索拉非尼的主要适应症是肝细胞癌，这提示促铁死亡活性可能有助于索拉非尼的临床效力，特别是因为索拉非尼不会诱导细胞凋亡并抑制坏死性凋亡(Martens等人.2017；Feldmann等人.2017)。其次，我们最近发现，最近获批用于治疗HCC的靶向疗法乐伐替尼(Ielasi等人.2019)也诱导铁死亡，如ferrostatin-1和利普司他汀-1均能抑制SKHEP1 HCC细胞中的乐伐替尼致死性所证明的(图1)。
肝细胞癌(HCC)是一项重要的未满足的医疗需求，因为它是最具侵袭性的、异质性的和难以治疗的癌症之一(Medavaram和Zhang,2018)，每年在全球造成超过700,000人死亡(Singh等人.2018)。HCC影响所有年龄的儿童和成人，并且具有遗传和环境起源。此外，由于酪氨酸分解代谢途径的最后一步的失活而患有遗传性酪氨酸血症的患者经常发生HCC；这样的患者会积累4-富马酰乙酰乙酸盐(FAA)，它是一种消耗肝谷胱甘肽(铁死亡的中枢抑制剂)的亲电子迈克尔受体(Yang等人.2014)。外源性谷胱甘肽在细胞培养物中和疾病的遗传小鼠模型中抑制FAA的大部分毒性(Singh等人.2018)，从而提示，GSH耗竭可以驱动HCC，但对铁死亡也有附带敏感性(Yang等人.2014)。FAA被转化为抑制卟啉生物合成的琥珀酰丙酮，从而导致肝铁的积累并促成HCC发病机制(Singh等人.2018)，从而导致对铁死亡的附带敏感性(Dixon等人.2012)。因此，GSH耗竭和铁超载作为铁死亡敏感性的关键驱动因素(Stockwell等人.2017)，通过遗传性酪氨酸血症患者和小鼠模型与HCC存在遗传联系。此外，如上面所指出的，在2007年批准用于晚期HCC的第一种靶向疗法是多靶点激酶抑制剂索拉非尼(Medavaram和Zhang,2018)，它通过抑制系统xc -诱导铁死亡(Dixon等人.2014)。已经在HCC中探索了许多不诱导铁死亡的其它疗法，但几乎没有积极的临床结果(Medavaram和Zhang,2018)。这表明铁死亡可能是一种独特有效的HCC治疗方案。
除了在家族性酪氨酸血症驱动的HCC中观察到的GSH耗竭和铁积累之外，其它易患HCC的因素也会导致对铁死亡的敏感性：肝脏中过量的酒精代谢会耗尽GSH(Zhou等人.2019)，以及据报道NASH患者的脂肪肝会引发铁死亡(Tsurusaki等人.2019)。这些观察结果提示，HCC肿瘤可能携带对铁死亡诱导剂的内在敏感性，我们发现在HCC细胞系中就是这种情况(图1)。如上面所指出的，铁死亡诱导通常具有肿瘤抑制作用，因为铁死亡抑制剂维生素E可以在许多小鼠模型中和癌症患者中抑制脂质过氧化并加速肿瘤发生(Sayin等人.2014)。几种癌基因和肿瘤抑制因子似乎通过调节脂质过氧化和铁死亡敏感性部分地发挥作用(例如，NRF2、KEAP1、BAP1、P53和HIF1a)(Cao等人.2019；Sun等人.2015；Jung等人.2013；Jiang等人.2015；Speer等人.2013)。由于所有这些原因，我们怀疑HCC将是GPX4抑制剂的良好首个适应症。
有证据表明对GPX4抑制剂和/或铁死亡敏感的其它适应症包括肉瘤、神经胶质瘤、肾细胞癌、卵巢癌、DLBCL(淋巴瘤)、肺癌和乳腺癌、以及来自其它谱系的耐药性的转移性和EMT癌症(Hangauer等人.2017)。
我们鉴定了几种预测对一般铁死亡诱导剂和特别是GPX4抑制剂的敏感性的生物标志物，包括NADPH丰度(Shimad等人.2015)、GCH1表达(Kraft等人.2020)、NF2-YAP活性(Wu等人.2019)、EMT识别标志(Viswanathan等人.2017)和GPX4表达本身(未发表)。我们将检查这些生物标志物中的每一种，并确定哪种生物标志物组合是我们为HCC和其它目标适应症创建的对GPX4抑制剂敏感性的最佳预测指标。
实施例2
新颖的GPX4抑制剂的发现
从破译概念验证GPX4抑制剂的纳摩尔效能开始，我们解析了GPX4与其共价抑制剂RSL3和ML162的共晶结构，其揭示RSL3结合另一个变构位点，而不是像ML162那样预期的活性位点(图3和4)。虽然我们的MALDI MS数据证实RSL3与GPX4结合，而ML162与GPX4突变体结合，在GPX4突变体中除活性位点外的所有其它半胱氨酸都突变为丝氨酸或丙氨酸，但RSL3不能与该突变体结合，证明RSL3不结合在GPX4的活性位点(图5A-5C)。这些x-射线结构能够进一步优化当前的抑制剂和设计靶向GPX4上的各种结合位点的新型抑制剂。因此，我们应用了基于MD模拟(Desmond)和Glide对接(
Figure BDA0003936150330000472
Suite)的计算机辅助设计策略，以及对10,000种化合物的先导优化的化合物库的实验性高通量筛选(图6A-6E)。首先通过热变性测定和微量热电泳(MST)评价所有候选物以验证与GPX4的结合(表1)。然后应用表面等离子体共振(SPR)和等温滴定量热法(ITC)来精确测量它们的结合动力学和亲和力，而1H-15N异核单量子相干(HSQC)NMR光谱法告诉我们结合位点。我们优化了两种GPX4特异性活性测定以检查命中化合物的酶抑制作用--基于LC-MS的底物/产物监测和NADPH偶联测定。值得注意的是，我们的数据提示，命中化合物之一LOC1886非共价地结合RSL3结合位点，诱导GPX4的整体构象变化并造成其酶活性的抑制(图7A-7B)。总之，这些数据提示，我们鉴定了GPX4上的可药用变构位点，以及在这些位点结合的化合物(表1)。还合成并试验了一些LOC880类似物(表2)。
表1.经验证结合GPX4的片段/先导物。这些化合物已在生物物理学和生化测定中进行了试验，但未在基于细胞的测定中进行试验。
Figure BDA0003936150330000471
Figure BDA0003936150330000481
Figure BDA0003936150330000491
表2.合成并试验的一些LOC880类似物.
Figure BDA0003936150330000492
Figure BDA0003936150330000501
实施例3
在GPX4的RSL3结合位点结合的新型化合物的大规模筛选
强效GPX4抑制剂RSL3的x-射线结构显示，该化合物结合不同于活性位点的变构位点。因此，在使用经过验证的结合剂进行上述努力的同时，我们将开发一种针对RSL3结合位点的筛选测定。
我们将针对可以竞争荧光标记的RSL3探针与其在GFP-GPX4上的变构结合位点的结合的化合物从我们的约10,000种先导样化合物(选自330万种具有良好先导样性能的化合物)的库中进行化合物的高通量筛选；将通过探针和融合至GPX4的GFP之间的FRET来测量活性。我们的假设是，该库包含与RSL3结合位点的额外结合剂，但在我们为我们先前的GPX4筛选使用的热迁移测定中未检测到这些化合物—这种测定不那么敏感并可能漏掉许多化合物。将通过上述漏斗(funnel)来处理阳性以获得经过验证的命中。作为额外的备份，我们还将筛选一个8,000种化合物的共价片段库和370,000种片段化合物的Sigma DyNAbindDNA编码的库。这将提供一组多样化的可能能够靶向RSL3结合位点的额外化合物。
实施例4
GPX4的变构抑制
介绍
作为癌症患者死亡的主要原因，转移性和耐药性癌症是肿瘤学中最紧迫的问题之一(Dillekas等人.2019；Wang等人.2019)。作为转移的关键步骤，已经报道上皮至间质转化(EMT)(其增加肿瘤细胞的运动性并使原发性肿瘤能够侵入远处部位)使癌细胞对细胞凋亡和化学疗法产生抗性(Fischer等人.2015)。在转化过程中，升高的含多不饱和脂肪酸-(PUFA)的磷脂(PUFA-PL)的水平是增加细胞膜流动性的主要因素，因为PUFA-PL中双键的顺式构象阻碍脂肪酰基尾部的有效堆积(Agmon和Stockwell,2017)。但是，由于PUFA-PL固有地在双烯丙基位点易受过氧化作用，经历过EMT的癌细胞不可避免地变得更加依赖关键蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)，它是在哺乳动物中能够还原细胞膜内的磷脂氢过氧化物的唯一过氧化物酶(Thomas等人.1990；Kuhn和Borchert,2002；Zou等人.2020)。当GPX4活性受损时，脂质过氧化可以导致铁死亡，这是肿瘤抑制性细胞死亡的一种新形式(Dixon等人.2012；Yang等人.2014)。事实上，随着癌症演变成具有间质或其它识别标志的侵袭性和耐药性形式，它们同时获得对GPX4抑制的极高敏感性，这指示通过使用GPX4抑制剂可以治疗最具侵袭性的赘生性疾病的诱人可能性(Viswanathan等人.2017；Hangauer等人.2017；Zou等人.2019)。
小分子对GPX4的抑制已经受限于在其活性位点周围的特征性平坦表面和已知变构调节位点的缺乏(Borchert等人.2018；Sakamoto等人.2017)。迄今为止，所有已知的GPX4抑制剂都被假定为与GPX4的活性位点硒代半胱氨酸反应的共价抑制剂(Yang和Stockwell,2008；Yang等人.2014；Weiwer等人.2012；Yang等人.2016；Eaton等人.2019；Eaton等人.2020；Eaton等人.2020)。顶级抑制剂(1S,3R)-RSL3(在下文中被称作“RSL3”)和ML162具有诱导癌细胞铁死亡的纳摩尔效力，但它们受限于与其氯乙酰胺弹头(warhead)有关的差药物样性能(Yang和Stockwell,2008；Yang等人.2014；Weiwer等人.2012；Yang等人.2016；Allimuthu和Adams,2017)。此外，开发相对于GPX家族中其它谷胱甘肽过氧化物酶的硒代半胱氨酸选择性地结合GPX4的平坦活性位点的药物样化合物可能具有挑战性。尽管对目前的抑制剂已经进行了广泛的药物化学研究，但效力并未得到进一步提高(Eaton等人.2019；Eaton等人.2020；Eaton等人.2020)。这表明在采用基于结构的方案开发改进的GPX4抑制剂之前，有必要更深入地理解当前抑制剂的纳摩尔效能或寻找替代结合位点。
除了它的过氧化物酶功能外，作为特定条件下的兼职蛋白，GPX4可以聚合为成熟精子的中段的线粒体鞘的无酶活性的、氧化交联的、不溶性的结构元件(Ursini等人.1999；Conrad等人.2005)。这种不寻常的特征可能源于对谷胱甘肽作为还原底物的更少限制依赖性以及多种非保守表面半胱氨酸的表达，这与GPX家族的其它成员不同(Conrad等人.2005；Scheerer等人.2007)。这种双重功能的结构和机制基础以及它是否参与GPX4对铁死亡的调节尚未得到明确证明。我们假设无酶活性的双重功能的进一步机制研究将有利于GPX4特异性抑制的新颖方案的发现。
在这里，通过破译已知GPX4抑制剂的纳摩尔效能，我们鉴定了在GPX4上的一个变构结合位点，该位点允许GPX4失活而不靶向活性位点硒代半胱氨酸。然后我们发现这个位点参与GPX4的双重功能，在此基础上我们提出了替代GPX4催化循环。在确认这种变构结合位点与多种概念验证抑制剂的药用性后，我们筛选了先导优化的化合物库，并发现在变构位点结合的命中化合物抑制GPX4，这为靶向GPX4的治疗策略提供了一种新颖方案。
结果
半胱氨酸66是RSL3和ML162在GPX4上的结合位点
从破译概念验证GPX4抑制剂的纳摩尔效能开始，我们解析了GPX4U46C与其共价抑制剂RSL3和ML162的共晶结构，这表明RSL3和ML162都结合cys66，这是一个替代位点，而不是预期的活性位点(图8A和8B)。因为含硒代半胱氨酸的蛋白在重组系统中的大规模表达由于无效的硒代半胱氨酸掺入机制而具有挑战性，我们将硒代半胱氨酸应用于GPX4的半胱氨酸(U至C，插入硫醇基团代替硒醇基团)突变体进行结构研究，其与野生型GPX4的结构的叠加仅显示出细微差异(Scheerer等人.2007；Borchert等人.2018)。尽管观察到的共价抑制剂与cys66的结合可能由于在活性位点处的U至C突变而脱靶，但最近对ML162与野生型GPX4的共晶所做出的努力也报道了ML162与cys66的结合，即使在sec46的存在下(Eaton等人.2018)。为了在细胞背景下进一步验证在野生型GPX4上的这种结合位点，我们在HT-1080纤维肉瘤细胞(其中GPX4起作用以保护细胞免于铁死亡)中稳定地过表达GFP-标记的GPX4WT或GFP-标记的GPX4C66S(一种潜在的结合缺陷突变体)(Yang等人.2014)。使用用空载体(pBabe-puro)转染的HT-1080细胞作为对照，我们发现缺乏cys66结合位点的GFP-标记的GPX4C66S的过表达比GFP-标记的GPX4WT的过表达更大程度地保护HT-1080细胞免于RSL3和ML162诱导的铁死亡，表明RSL3和ML162与GPX4的cys66结合和随后在细胞背景下的抑制(图8C)。
此外，无标签GPX4C66S的过表达也比无标签GPX4WT的过表达更大程度地保护HT-1080细胞免于RSL3和ML162诱导的铁死亡，从而排除了GFP标签干扰的可能性(图8D)。除了GPX4抑制剂外，我们还检查了抑制剂结合缺陷突变是否影响其它类别的铁死亡诱导剂：FIN56，它消耗GPX4蛋白并同时导致CoQ10的消耗；以及FINO2，它氧化铁以驱动脂质过氧化和GPX4的间接失活(Feng和Stockwell,2018；Shimada等人.2016；Gaschler等人.2018)。实际上，GFP-标记的GPX4C66S的过表达提供了与GFP-标记的GPX4WT等效的针对FIN56和FINO2的保护，从而证实GPX4C66S针对RSL3和ML162的特异性保护可能是由于在cys66处的共价结合位点的丢失(图8E)。
GPX4含有一个在活性位点处的硒代半胱氨酸和七个其它半胱氨酸，它们都可能与亲电体反应(图8F)。在我们先前的试图定位RSL3结合位点的工作中，我们用Ala或Ser替换了所有亲电子残基(C2A、C10A、C37S、Sec46A、C66A、C75S、C107A和C148A)并在G401肾癌细胞中表达了突变体GPX4蛋白(其称为全Cys(-))作为GFP融合体(Yang等人.2016)(图8F)。然后将GFP-全Cys(-)-GPX4上的每个突变残基分别恢复为原始的硒醇-半胱氨酸或半胱氨酸(Yang等人.2016)。为了直接验证在细胞背景下RSL3与cys66结合的假设，我们检查了全Cys(-)和全Cys(-)A66C细胞(其中在全Cys(-)GPX4中的Ala66恢复为cys66(图8F))的铁死亡敏感性。因此，我们发现与全Cys(-)GPX4相比，无酶活性的全Cys(-)A66C GPX4的过表达提供了针对RSL3和ML162的显著保护，表明在无活性蛋白上的cys66与RSL3和ML162结合并因此屏蔽了G401细胞中内源性活性的GPX4免受抑制剂的影响(图8G)。如预期的，与全Cys(-)GPX4相比，无酶活性的全Cys(-)A66C GPX4的过表达对FIN56和FINO2致死性没有表现出影响，证实了针对RSL3和ML162的特异性保护来自于共价抑制剂与全Cys(-)A66C GPX4上的cys66的结合(图8H)。
在我们先前的工作中，与抗-荧光素抗体偶联的琼脂糖珠不能从用RSL3-荧光素处理的G401全Cys(-)A66C细胞中沉降可检测量的全Cys(-)A66C GPX4(Yang等人.2016)。我们假设这可能是因为RSL3与GPX4的cys66结合并随后在细胞背景下诱导全Cys(-)A66C GPX4的降解(Shimada等人.2016)。根据这一假设，我们发现，虽然全Cys(-)GPX4不能被RSL3共价修饰并因此对用天然WT GPX4观察到的RSL3诱导的降解具有抗性，但具有cys66结合位点的全Cys(-)A66CGPX4易于发生RSL3诱导的降解，这基于在用RSL3处理后过表达全Cys(-)或全Cys(-)A66C GPX4的G401的蛋白质印迹(图8I)。观察到的由RSL3诱导的全Cys(-)A66C GPX4的剂量依赖性降解也指示cys66结合位点在RSL3诱导的GPX4抑制机制中的潜在作用。
RSL3和ML162选择性地结合GPX4的sec46和cys66
除了cys66外，GPX4的其它表面半胱氨酸(cys10、cys107和cys148)也可能受到RSL3和ML162的亲电子攻击。此外，预计在活性位点处的sec46对亲电体更具反应性，因为它的pKa值低于半胱氨酸(Yang等人.2016)。为了试验在GPX4上的sec46和其它表面半胱氨酸残基是否也有助于RSL3结合，我们应用了稳定表达全Cys(-)GPX4的相应回复突变体的G401细胞系(Yang等人.2016)。因此，在试验中包括了五种这样的G401细胞系(A10C、A46C、A46U、A107C和A148C)，以及过表达WT、全Cys(-)或全Cys(-)A66C GPX4的G401，用于RSL3和ML162敏感性(图9A)。A46C，其中全Cys(-)中的A46被半胱氨酸替代，在这里也被包括在内，以进一步评价在GPX4的活性位点处的硒醇-半胱氨酸与RSL3的共价结合的需求，正如在共晶结构中我们没有观察到RSL3与GPX4U46C蛋白上的cys46的结合一样(Yang等人.2016)。我们发现与全Cys(-)相比，WT、全Cys(-)A46U或全Cys(-)A66C GPX4的过表达显著保护G401细胞免于RSL3和ML162，而具有其它半胱氨酸的GPX4的过表达却没有，表明RSL3和ML162在细胞背景下选择性地结合GPX4的sec46和cys66(图9B和9C)。此外，根据活力分析，我们发现只有WT和全Cys(-)A46U GPX4易于发生RSL3诱导的降解，达到使用全Cys(-)A66C GPX4观察到的程度，而具有其它半胱氨酸的全Cys(-)GPX4却没有，证实了对硒代半胱氨酸46和半胱氨酸66的选择性(图9D)。
值得注意的是，全Cys(-)A46C GPX4的过表达针对RSL3没有表现出显著的保护，且仅观察到轻微的降解。这进一步证实了报道的硒代半胱氨酸对于RSL3与GPX4活性位点的结合的重要性，并解释了在GPX4U46C共晶结构的活性位点处的抑制剂的缺失(Yang等人.2016；Gao等人.2018)。此外，全Cys(-)A46U GPX4显示出最显著的保护和降解，这表明抑制剂与sec46结合的偏好，可能是由于其对亲电体的更高活性，并解释了为什么标记的RSL3拉低了更大量的全Cys(-)A46U(与具有任何其它恢复的半胱氨酸的全Cys(-)相比)(Yang等人.2016；Gao等人.2018)。
为了在细胞背景下验证硒代半胱氨酸46和半胱氨酸66作为抑制剂在GPX4上的结合位点，我们在HT-1080细胞中稳定过表达GFP-标记的GPX4U46C_C66S(一种缺乏两个结合位点的双重突变体)或GFP-标记的GPX4U46C(作为对照)。使用用空载体(pBabe-puro)转染的HT-1080细胞作为对照，我们发现GPX4U46C和GPX4U46C_C66S(它们二者具有比WT低得多的酶活性)对FIN56或FINO2处理没有表现出效果(图9E)。但是，如预期的，完全缺乏两个结合位点的GPX4U46C_C66S的过表达显著保护HT1080细胞免于RSL3和ML162诱导的铁死亡，而具有cys66结合位点的GPX4U46C却没有(图9F)。总之，我们的数据表明RSL3和ML162在细胞背景下特异性地结合GPX4的sec46和cys66。
Cys66和cys10调节GPX4的活性
除了我们已经试验过的三类铁死亡诱导剂外，咪唑酮爱拉斯汀(IKE)(胱氨酸/谷氨酸反向转运体系统xc -的一种抑制剂)代表了另一类铁死亡抑制剂(Feng和Stockwell,2018)。IKE阻止胱氨酸输入，这将导致GPX4辅因子GSH的消耗和此后GPX4活性的丧失，从而诱导铁死亡(Zhang等人.2019)。当我们试验过表达WT、全Cys(-)或全Cys(-)GPX4的单个回复突变体(A10C、A46C、A46U、A66C、A107C和A148C)的G401细胞的IKE敏感性时，我们发现无酶活性的全Cys(-)A66C GPX4的过表达显著保护G401细胞免于IKE，其保护效果甚至与酶活性的WT GPX4和全Cys(-)A46U GPX4的过表达相当(图10A)。此外，在全Cys(-)GPX4的所有回复突变体中，无酶活性的全Cys(-)A10C GPX4的过表达特征性地使G401细胞对不仅由IKE诱导的铁死亡敏感，而且对由RSL3和ML162诱导的铁死亡敏感(图9B、9C和10A)。这些观察结果表明cys66和cys10在调节GPX4活性中的潜在内在作用，这与GPX4抑制剂结合无关。
先前的研究显示，在低GSH浓度，GPX4充当蛋白硫醇过氧化物酶以利用特定的蛋白硫醇作为其催化循环中的还原剂并在结构上交联蛋白，这也被称为GPX4的双重功能(Ursini等人.1999；Conrad等人.2005)。报道的低GSH条件恰好与在我们的实验中IKE处理的细胞条件相匹配(Ursini等人.1999)。
因此，我们提出，除了GPX4的典型谷胱甘肽依赖性催化循环(I)外，GPX4还可以利用第二个GPX4蛋白上的cys10的硫醇作为还原剂以形成二聚体中间体，然后将其用在第三个GPX4蛋白上的cys66的硫醇再生以完成催化循环(II，图10B)。在这种情况下，鉴于据报道氧化交联的GPX4是无酶活性的，如果还原剂(GSH或cys66-SH)不容易得到，则大量具有Cys10的无活性GPX4可能将含有硒代半胱氨酸的活性GPX4锁定在无活性状态(Ursini等人.1999)。相反，虽然也是无酶活性的，但具有cys66的GPX4可以通过将氧化的GPX4(GPX4-Se-S-G或GPX4-Se-S-cys10)推入再生活性状态来加速催化循环(Ingold等人.2018)。先前的诱变研究也支持该模型，所述研究表明了U46、C10和C66在GPX4聚合中的作用(Scheerer等人.2007)。
根据该模型，我们发现无酶活性的全Cys(-)A66C GPX4在G401细胞中的过表达增强了内源性WT GPX4的酶活性，而全Cys(-)A10CGPX4显著抑制了该活性(图15C)。相比之下，全Cys(-)或全Cys(-)A148C GPX4的过表达对内源性GPX4的酶活性没有表现出显著影响。从另一个方面来看，在我们在不同空间群(P3121、P21和P1)中解析的多个无配体GPX4U46C晶体的堆积模式中，以及先前报道的GPX4结构中，C10、C46和C66始终紧密接近彼此，表明所提出的模型的结构基础(Scheerer等人.2007)(图15D)。
为了进一步验证cys66和cys10在调节GPX4活性中的潜在作用，特别是在有限的GSH水平下，我们在HT-1080细胞中稳定地过表达缺乏cys66和cys10交联位点的GFP-标记的GPX4C10S_C66S，并然后针对IKE试验所述细胞。使用过表达GFP-标记的GPX4WT的HT-1080细胞或用空载体(pBabe-puro)转染的HT-1080细胞(作为对照)，我们发现缺乏连接位点的GPX4C10S _C66S的过表达仍然保护HT1080细胞免于IKE诱导的铁死亡，但在程度上显著低于GPX4WT的过表达，表明cys10和cys66在低GSH浓度下调节GPX4功能的作用(图15E)。另外，如预期的，GPX4C10S_C66S的过表达保护HT1080细胞免于其它类别的铁死亡诱导剂的影响，与GPX4WT的过表达相比在程度上更大(ML162，可能是由于cys66结合位点的丢失)或不能辨别(FIN56和FINO2)(图15F)。为了进一步剖析观察到的不同IKE敏感性的起源，我们在体外在不同的GSH浓度试验了三种细胞系的GPX4活性。尽管GPX4C10S_C66S和GPX4WT在3mM GSH下表现出相当的活性，但在0.1mM GSH下GPX4WT在还原磷脂氢过氧化物方面比GPX4C10S_C66S更有活性(图15G)。总之，我们的观察结果支持cys66和cys10在调节GPX4的活性中的作用，尤其是在较低GSH浓度下。
Cys66是RSL3在GPX4上的变构结合位点
正如我们的结果证实的，RSL3(具有纳摩尔效能的概念验证GPX4抑制剂)不仅阻断在活性位点处的sec46，而且还特异性地结合cys66(GPX4活性的正调节剂)，并随后在细胞背景下诱导GPX4的降解，表明了利用cys66结合位点设计靶向GPX4的新颖药物的潜力。为了具体检查cys66作为抑制剂结合位点的效能，应用了体外纯化的GPX4U46C蛋白，因为我们的细胞数据和共晶结构指示RSL3仅结合GPX4U46C的cys66。为了进一步验证这种与cys66的选择性结合，我们对与过量的RSL3一起预温育的GPX4U46C进行了完整蛋白MALDI MS分析，其表明RSL3与GPX4U46C的1:1共价结合(图11A)。
为了证明RSL3的单一共价修饰不是在cys46上，我们表达并纯化了无标签GPX4全Cys(-)A46C蛋白，其中在全Cys(-)GPX4中的ala46恢复为cys46(图9A)。虽然对照化合物ML162被证明能够修饰cys46并改变GPX4全Cys(-)A46C的质量，这与当用ML162处理时G401全Cys(-)A46C相对于G401全Cys(-)增加的活力一致，但是我们没有平行地观察到由RSL3诱导的质量变化，证实在cys46上没有RSL3修饰(图9C和11B)。还考虑到我们的GPX4U46C-RSL3的共晶结构，我们证实当GPX4U46C中的硒代半胱氨酸46突变为半胱氨酸时，RSL3仅结合cys66(图8A)。
为了评价在RSL3与cys66结合后对GPX4的影响，我们在与RSL3或DMSO一起温育后测量了GPX4U46C的酶活性，这表明RSL3与cys66的结合抑制了GPX4的还原磷脂氢过氧化物的能力(图11C)。为了获得对溶液中抑制的更多结构见解，我们先前报道了在有和没有RSL3存在下GPX4的1H,15N-异核单量子相干(HSQC)NMR谱，但受限于在当时归属于每个GPX4氨基酸残基的HSQC共振谱的缺乏，我们只可以探测结合，而不具体知道其在GPX4上的结构结合模式(Gaschler等人.2018)。为了解决先前的限制和有益于GPX4抑制剂的未来研究，我们最近解析了15N同位素标记的GPX4U46C的1H,15N-HSQC-NMR谱的主链共振归属，这使得能够快速研究GPX4抑制剂在溶液中的特异性结合模式(图11D)。对于谱归属，用单独的15N-GPX4U46C及其与RSL3的复合物的1H,15N-HSQC-NMR谱的重叠证实了RSL3在溶液中在cys66位点处的结合模式(图11E)。如在2D-相互作用简图中所示在GPX4U46C-RSL3的共晶结构中与RSL3相互作用的残基(Y63、C66和H168等)在HSQC-NMR谱中始终表现出化学位移(图11F)。此外，远离cys66结合位点的S44、T54和K127的显著化学位移提示由RSL3与cys66的结合诱导的整体构象变化。因此，我们总结说，cys66是RSL3在GPX4上的变构结合位点。此外，我们提出1H,15N-HSQC-NMR在GPX4抑制剂研究中的应用，特别是连同其光谱归属一起，将能够快速研究未来GPX4抑制剂的结合模式和潜在的变构效应。
先导优化的化合物库的筛选鉴定出与cys66变构位点结合的先导化合物
由于我们证实了cys66是RSL3在GPX4上的变构结合位点，然后我们开始寻找也与该位点结合的其它化合物以验证该位点的药用性并为未来设计靶向GPX4的新颖治疗剂提供基础。我们从ML162的两个片段(CDS9和TMT10,它们共享与RSL3和ML162相似的弹头和结构)开始。由于与CDS9和TMT10一起预温育的GPX4U46C的完整蛋白MALDI MS分析提示共价结合，我们着手解析GPX4U46C与每种化合物的共晶结构，这表明两种化合物都选择性地结合cys66位点(图12A和12B)。在我们进一步的研究中，我们发现蛋白半胱氨酸修饰剂MAC-5576(Blanchard等人.2004)能够共价修饰GPX4。我们的GPX4与MAC-5576的共晶结构揭示，它也与cys66变构位点结合(图12C)。
为了充分利用cys66位点显示的多功能性来适应在结构上不同的化合物，我们应用热迁移测定为GPX4U46C的体外结合剂筛选了先导优化的化合物(LOC)库中的9,719种化合物，其将改变GPX4U46C的熔化温度(|ΔTm|>2℃，图12D)(Kaplan等人.2015)。
通过关于具有期望的药物样性能的在结构上不同的化合物和对先导开发的适合性严格过滤3,372,615种商购可得的小分子的数据库而在内部组装LOC库(Kaplan等人.2015)。然后通过我们开发用于检查它们各自的结合模式的1H,15N-HSQC-NMR测定来试验来自筛选的热门命中。因此，我们发现LOC1886(一种热迁移筛选热门命中化合物(|ΔTm|＝3℃))与cys66结合位点强烈相互作用(基于在位点周围的残基的显著化学位移)，并导致GPX4U46C的总体构象变化(图12E和12F)。随后对与LOC1886一起预温育的GPX4U46C的完整蛋白MALDI MS分析显示，它共价结合GPX4U46C，这类似于RSL3和我们已经表征的其它概念验证GPX4抑制剂(图12G)。此外，LOC1886抑制HT1080细胞裂解物中的细胞GPX4还原磷脂氢过氧化物的能力(图12H)。此外，LOC1886能够诱导HT1080细胞的铁死亡，其可以被fer-1(一种铁死亡特异性的抑制剂)拯救(Dixon等人.2012)(图12I)。尽管LOC1886以及我们鉴定的其它GPX4结合剂表现出比RSL3更低的效力，但它们代表了有待进一步开发的新型GPX4抑制剂骨架。此外，与cys66位点结合的在结构上不同的概念验证化合物验证了该变构位点进一步开发用于未来设计靶向GPX4的新颖治疗剂的潜力。
总之，这些数据提示，我们鉴定了在GPX4上的一个可药用变构位点以及结合该位点的化合物。
讨论
我们对RSL3和ML162的结合模式的研究揭示，它们不仅与活性位点硒代半胱氨酸相互作用，而且选择性地结合GPX4的半胱氨酸66。对于U46C和全Cys(-)-A66C GPX4构建体(其排除了抑制剂与活性位点的结合)，我们特别证实抑制剂与cys66位点的结合导致GPX4的失活。具体地，以RSL3为例，我们证实了它与cys66的结合造成在细胞背景下的总体构象变化、活性丧失以及随后降解。其它概念验证化合物与该变构位点的结合进一步验证了其药用性。此外，由于半胱氨酸66在GPX异形体中不是保守的，并且与硒代半胱氨酸不同，它是GPX4独有的，所以我们预计为cys66变构位点设计的抑制剂对GPX4具有选择性(Scheerer等人.2007)。
与所有已知的GPX4抑制剂一样，我们在本研究中鉴定的概念验证抑制剂也与GPX4形成共价键。这种普遍性可能源于在GPX4的表面上缺乏深而明确定义的口袋，即使在共晶结构中也是如此(Eaton等人.2018)。尽管出于选择性考虑在药物开发过程中曾有意避免共价抑制剂，但多种共价抑制剂构成了重要的药物(诸如青霉素和阿司匹林)(Sutanto等人.2020；Baillie,2016)。随着更多的共价抑制剂最近进入临床试验，对应用共价抑制剂的功效的兴趣一直在增长，尤其是对于可逆抑制剂无法成药的靶标(Janes等人.2018；Bar-Peled等人.2017；Backus等人.2016)。在这里，我们报道了顶级GPX4抑制剂RSL3的第一个共晶结构，以及GPX4与另外四种在结构上不同的化合物的复合物的结构测定，这将为开发改进的抑制剂提供结构基础。此外，在MAC-5576(2-吡啶基酯)和LOC1886(N-酰基咪唑)中的新型弹头代表了混杂氯乙酰胺弹头的替代取代基。我们设想，更大规模的筛选以及随后基于结构的结合剂优化将导致第一种药物样变构的GPX4特异性抑制剂。
方法
细胞系
HT-1080细胞得自ATCC并在补充了10％FBS(Gibco)、1％非必需氨基酸(Invitrogen)和1％青霉素-链霉素混合物(Invitrogen)的含有谷氨酰胺和丙酮酸钠(Corning 10-013)的DMEM中培养。G401细胞得自ATCC并在补充了10％FBS和1％青霉素-链霉素混合物的McCoy氏5A培养基(Thermo Fisher,#16600108)中培养。
GPX4U46C蛋白的表达和纯化
在先前的工作中制备了细菌表达载体pET15b-His-标记的c-GPX4U46C和pET15b-His-标记的c-GPX4全Cys(-)-A46C(Yang等人.2016)。在大肠杆菌中表达His-标记的c-GPX4U46C蛋白，并根据公开的方案经过微小修改进行纯化(Scheerer等人.2007)。将具有每种质粒的BL21-Gold(DE3)感受态细胞(Agilent,#230132)的分离菌落单独转移至8mL的含有100μg/mL氨苄西林的LB培养基，并将接种的培养物在摇动(225rpm)下在37℃温育16h。将3mL的起子培养物加入到1L的含有100μg/mL氨苄西林的新鲜LB培养基中。将培养物在37℃和225rpm摇动下温育直到OD600达到0.9。然后使温度降低至15℃。将细胞与1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)一起在15℃和225rpm摇动下温育过夜。次日，通过在4℃以4000g离心20分钟收获细菌，并将得到的沉淀物准备好用于纯化或在-20℃储存。将沉淀物重新悬浮在25mL的冷的裂解缓冲液(100mM Tris pH 8.0,300mM NaCl,20mM咪唑,3mM TCEP,和蛋白酶抑制剂混合液(Roche-Sigma,#11836170001))中。通过在冰上声处理6分钟来裂解细菌，并将裂解物在4℃以10000rpm离心20分钟以除去细胞碎片。将澄清的裂解物与Ni Sepharose6Fast Flow珠子(GE Life Sciences,via Cytiva#17-5318-01)一起在转子上在4℃温育至少1h。将珠子用洗涤缓冲液(100mM Tris pH 8.0,300mM NaCl,50mM咪唑,和3mM TCEP)洗涤以除去非特异性结合。将蛋白用100mM Tris pH 8.0、300mM NaCl、100mM咪唑和3mM TCEP洗脱。将蛋白在含有100mM Tris pH 8.0、300mM NaCl和3mM TCEP的FPLC缓冲液中使用凝胶过滤Superdex 200柱进一步纯化。将含有GPX4的级分合并到一起并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。
完整蛋白MALDI MS分析
在MALDI MS分析之前将GPX4U46C或GPX4全Cys(-)-A46C蛋白与DMSO对照或要试验的抑制剂一起预温育：将50μM GPX4蛋白与500μM抑制剂一起在含有5％DMSO的FPLC缓冲液(100mM Tris pH 8.0,300mM NaCl,和3mM TCEP)中在室温温育1小时，然后转移至4℃过夜。
将1μl的无配体蛋白(与DMSO一起预温育)或蛋白-抑制剂复合物(与要试验的抑制剂一起预温育)与9μl的在基质溶液(70:30水/乙腈，含有0.1％TFA)中的10mg/ml芥子酸混合。将1.0μl最终混合物沉积在靶载体上并使其风干。使用Bruker ultrafleXtreme MALDI-TOF仪器记录MALDI光谱。调整m/z检测和抑制的范围以适应靶蛋白的分子量。为激光设置应用了2000Hz和50％强度。对于每个样品，收集五个累积光谱并记录总和用于分析。将蛋白-抑制剂复合物的所有MALDI光谱与无配体蛋白进行对比以确定质量变化。将质量变化与每种抑制剂的潜在停留基团的质量比对以得出共价结合的结论。
蛋白晶体学
将GPX4U46C与共价抑制剂一起预温育，然后使用下述特别优化的条件结晶。
RSL3和ML162条件：将50μM GPX4U46C与150μM RSL3或ML162一起在反应缓冲液(20mM Tris pH 9.0,100mM NaCl,3mM TCEP,1.5％DMSO)中在15℃温育1小时，然后转移至4℃过夜。CDS9条件：将25μM GPX4U46C与2mM CDS9一起在反应缓冲液(100mM Tris pH 9.0,300mM NaCl,1mM TCEP,2％DMSO)中在37℃温育2小时，然后转移至4℃过夜。TMT10条件：将25μM GPX4U46C与2mM TMT10一起在反应缓冲液(100mM Tris pH 9.0,300mM NaCl,2％甘油,2％DMSO)中在37℃温育4小时，然后转移至4℃过夜。MAC-5576条件：将50μM GPX4U46C蛋白与500μM MAC-5576一起在反应缓冲液(100mM Tris pH 9.0,300mM NaCl,和3mM TCEP,5％DMSO)中在室温温育1小时然后转移至4℃过夜。
在使用完整蛋白MALDI MS分析确认共价结合后，将蛋白-抑制剂复合物交换到结晶缓冲液(10mM Tris pH 8.0,5mM TCEP)中并浓缩至5mg/ml。
使用Maestro(Schrodinger,suite 2020-3)产生共晶结构的分子表面图和2D抑制剂-受体相互作用简图，而使用Pymol制备具有蛋白主链和抑制剂电子密度的放大图。
表达外源GPX4的细胞的制备
在先前的工作中制备了掺入GFP-标记的cyto-GPX4WT、无标签-cyto-GPX4WT或GFP-标记的cyto-GPX4U46C的cDNA的pBabe-puro载体(Yang等人.2014)。用所述载体作为模板，使用Agilent QuikChange Primer Design应用程序设计下述诱变引物:C10S(5'-GGA GCGCGC ACT GCG CCA GTC G-3'(SEQ ID NO:1),5'-ACG ACT GGC GCA GTG CGC GCT C-3'(SEQID NO:2))和C66S(5'-CCC GAT ACG CTG AGA GTG GTT TGC GGA TC-3'(SEQ ID NO:3),5'-GAT CCG CAA ACC ACT CTC AGC GTA TCG GG-3'(SEQ ID NO:4))。引物购自IntegratedDNA Technologies。然后使用定点诱变试剂盒(QuickChange II,Agilent 200521)获取pBP-GFP-cGPX4C66S、pBP-GFP-cGPX4U46C_C66S和pBP-GFP-cGPX4C10S_C66S。通过在GENEWIZ测序确认所有突变和得到的质粒。
在脂转染前夜将HT-1080细胞以300,000个细胞/孔的密度接种进6孔皿中。将2.5μg DNA(分别是空pBabe-puro载体和以上表达GPX4的pBabe-puro载体)、7.5μLLipofectamine 3000(Invitrogen,L3000015)和250μL Opti-MEM在室温温育5分钟，然后加给HT-1080细胞。在转染后，将细胞在补充了1.5mg/mL嘌呤霉素的HT1080培养基中传代几次，并在该培养基中培养以进行所有实验。用荧光显微镜和用GFP和GPX4抗体进行的蛋白质印迹确认外源GFP-标记的GPX4的表达。
在先前的工作中报告了过表达WT、全Cys(-)、全Cys(-)A10C、全Cys(-)A46C、全Cys(-)A46U、全Cys(-)A66C、全Cys(-)A107C或全Cys(-)A148C GPX4的G401细胞(Yang等人.2016)。将G401细胞在补充了1.5mg/mL嘌呤霉素的G401培养基中培养。
细胞活力测定
在第1天，将每个HT-1080或G401细胞系的1000个细胞以36μL/孔铺板在384孔板中。立即对剩余细胞进行蛋白质印迹试验(以监测GPX4蛋白过表达水平)。对于剂量响应曲线，将化合物溶解在DMSO中并制备12点2倍稀释系列。然后将化合物在培养基中1:50稀释，并在第2天将4μL添加到板的每个孔中。在384孔板上的化合物的最终浓度从2μM(对于RSL3/ML162)和20μM(对于IKE/FIN56/FINO2)开始。对于单点铁死亡试验，将HT1080细胞用12.5μMRSL3或125μMLOC1886处理，添加或不添加2μM Fer-1。处理48小时后，使用CellTiter-Glo发光试剂(Promega G7573)与培养基的1:1稀释液来测量细胞活力，将其在第4天在室温摇动10分钟后在Victor 5平板读数器上读出。将发光强度归一化为DMSO对照的强度。使用GraphPad Prism 9对结果进行量化。基于活力的剂量-响应曲线，使用GraphPad Prism 9计算曲线下面积并以条形图格式与标准误差一起报告。
蛋白质印迹测定
对于GPX4降解研究，将G-401细胞以每孔800,000个接种在60-mm板中并使其附着过夜。然后用10μM Fer-1和0(媒介物)、2或4μM RSL3处理细胞10小时。将细胞用胰蛋白酶(Invitrogen,25200-114)收获，沉淀，并用RIPA缓冲液裂解。
对于关于细胞活力的GPX4蛋白水平的量化和GPX4特异性活性测定，通过蛋白质印迹在技术副本中试验了受到细胞活力和GPX4特异性活性的每个细胞系。具体而言，将细胞用胰蛋白酶(Invitrogen,25200-114)收获，沉淀，并用LCW裂解缓冲液(0.5％TritonX-100,0.5％脱氧胆酸钠盐,150mM NaCl,20mM Tris-HCl pH 7.5,10mM EDTA,30mM焦磷酸钠,和完整蛋白酶抑制剂混合液)裂解。虽然部分细胞裂解物被印迹用于蛋白定量，但另一部分裂解物用于GPX4特异性活性测定。对于两个实验，将细胞裂解物如前所述进行印迹和成像(Yang等人.2014)。使用的抗体是GPX4(Abcam,ab125066,1:250稀释)和肌动蛋白(CellSignaling,D18C11,1:3,000稀释)。使用LI-COR Odyssey CLx IR扫描仪、ImageJ和GraphPad Prism 9对结果进行量化。
细胞的GPX4特异性活性的确定
我们应用了经过微小修改的如先前报道的NADPH偶联的细胞的GPX4酶活性测定(Roveri等人.1994)。由GPX4在还原其特异性磷脂氢过氧化物底物期间产生的氧化型谷胱甘肽被谷胱甘肽还原酶以NADPH为代价还原，其在340nm处的特征吸光度的降低被监测并量化为GPX4活性。通过IV型大豆脂肪氧化酶对磷脂酰胆碱的酶促氢过氧化制备GPX4特异性底物PCOOH：将22mL含有3mM脱氧胆酸钠和0.3mM磷脂酰胆碱的0.2M Tris-HCl(pH 8.8)与0.7mg的IV型大豆脂肪氧化酶一起在连续搅拌下在室温温育30分钟。将混合物加载到用甲醇洗涤并用水平衡的Sep-Pak Cl8筒(Waters-Millipore)上。用10体积的水洗涤后，将磷脂酰胆碱氢过氧化物在2mL甲醇中洗脱。将5千万特定G401或HT-1080细胞收获并用LCW裂解缓冲液(0.5％TritonX-100,0.5％脱氧胆酸钠盐,150mM NaCl,20mM Tris-HCl pH 7.5,10mMEDTA,30mM焦磷酸钠,和完整蛋白酶抑制剂混合液)裂解。使用BCA测定试剂盒，使用BSA作为标准，测定裂解物中蛋白的浓度。然后，在96孔板上，将250μL 1.5μg/μL细胞裂解物在GPX4活性测定缓冲液(0.1％Triton X-100,100mM Tris-HCl pH 7.4,10mM NaN3,5mM EDTA,0.6IU/mL谷胱甘肽还原酶,0.5mM NADPH,和3mM GSH，除非另外指出)中在37℃温育10分钟。为了评价GPX4抑制剂，将DMSO、50μM RSL3或500μM LOC1886添加到在GPX4活性测定缓冲液中的250μL细胞裂解物中，然后温育10分钟。然后将PCOOH添加到混合物中以引发GPX4反应。在20分钟时间内以1分钟间隔动态测定NADPH在340nm处的吸光度。还进行了使用裂解缓冲液代替细胞裂解物和不添加PCOOH的对照的实验，以测量GPX4的还原磷脂氢过氧化物的特定活性。基于蛋白质印迹将每个样品的总GPX4活性归一化为它们的特异性GPX4水平，用于单位GPX4酶活性对比。使用GraphPad Prism 9对结果进行量化。
纯化的GPX4U46C蛋白的活性的抑制
与细胞的GPX4特异性活性的测定类似，通过偶联在有谷胱甘肽还原酶存在下由GPX4产生的氧化型谷胱甘肽将NADPH氧化为NADP+，通过测量NADPH的减少(在340nm处的吸光度)来评估GPX4U46C活性。通过将0.05U/mL谷胱甘肽还原酶、210μM GSH、250μM NADPH、50μM枯烯-OOH加入到50mM Tris HCl(pH 8.0)、0.5mM EDTA中制备GPX4反应缓冲液。将与DMSO(媒介物)或20μM RSL3一起预温育的15μM His-标记的GPX4U46C加入到GPX4反应缓冲液中，并在接下来的10分钟内监测在340nm处的吸光度。使用GraphPad Prism 9对结果进行量化。
热迁移测定
由于小分子的结合可能改变蛋白的热稳定性，我们应用热迁移测定来筛选LOC库，其从在有配体存在下获得的解折叠转变温度相对于在没有配体存在下获得的值的变化(ΔTm)确定配体的结合(Kaplan等人.2015；Lo等人.2004)。为了更高的通量目的，我们调整了在384孔PCR板上的测定。在Biomek自动液体处理器(Beckman)的辅助下，将每种化合物的2μl 10mM储备溶液(在100％DMSO中)从384孔库板转移到38μl FPLC缓冲液(100mM Tris pH8.0,300mM NaCl,3mM TCEP)，并在384孔母板的每个孔中混合。然后将化合物溶液以每孔12μl分配到三个384孔PCR板中。将GPX4U46C蛋白和Sypro橙手动添加到板中，最终浓度分别为5μM和5x，以刚好在特定板的热迁移分析之前产生每孔20μl的体积。在ViiA 7实时PCR系统(Thermo Fisher)上进行热迁移测定，热方案为：在25°保持15秒，以0.05°/秒的速率将温度升高至99°，在99°保持15秒。通过Protein Thermal ShiftTM软件记录和分析荧光。计算一式三份生物样品的平均|ΔTm|值并用于命中鉴定。
15N同位素标记的GPX4U46C的1H,15N-HSQC-NMR谱
制备了具有N-端His6标签的均匀地15N-标记的GPX4U46C蛋白。在大肠杆菌BL21-Gold(DE3)细胞(Stratagene)中表达GPX4U46C构建体，所述细胞在补充了100mg/mL氨苄西林、2mM MgSO4、100mM CaCl2、1X痕量金属、1X RPMI 1640维生素储备物(Sigma-Aldrich,#R7256)、10mg/mL生物素、10mg/mL盐酸硫胺素、4g/L葡萄糖和3g/L 15NH4Cl(作为唯一氮源)的M9基本培养基中在37℃生长。除了在FPLC纯化之前通过添加5U/mg凝血酶除去N-端His6标签以外，以下诱导、裂解和蛋白纯化与上述非同位素标记的His-标记的GPX4U46C相同。凝血酶反应是在缓冲液交换后以除去咪唑，否则所述咪唑会抑制凝血酶，并允许在4℃进行过夜。
对于GPX4与RSL3的HSQC，由于RSL3在水溶液中的溶解度较低，因此将10μM 15N-标记的GPX4与100μM RSL3一起在缓冲液(100mM MES,5mM TCEP,pH 6.5)中在4℃预温育12小时。然后在试验前将蛋白溶液浓缩至50μM。对于GPX4与其它抑制剂的HSQC，将50μM 15N-标记的GPX4与800μM抑制剂一起预温育以在室温在缓冲液(100mM MES,5mM TCEP,pH 6.5)中试验6小时。然后添加D2O(10％)用于场频锁定。在Bruker Avance III 500Ascend(500MHz)光谱仪(哥伦比亚大学)上在298K收集1H-15N HSQC光谱。1H载波频率位于水共振。15N载波频率位于115ppm。1H维的谱宽为7,500Hz，且15N维的谱宽为1,824.6Hz。使用WATERGATE序列完成水信号的抑制。使用GARP去耦方案完成异核去耦。
13C,15N同位素标记的GPX4U46C的3D蛋白NMR实验
制备了具有N-端His6标签的均匀地13C,15N-标记的GPX4U46C蛋白。在大肠杆菌BL21-Gold(DE3)细胞(Stratagene)中表达GPX4U46C构建体，所述细胞在37℃在补充了100mg/mL氨苄西林、2mM MgSO4、100mM CaCl2、1X痕量金属、1X RPMI 1640维生素储备物(Sigma-Aldrich,#R7256)、10mg/mL生物素、10mg/mL盐酸硫胺素、4g/L U-13C6-葡萄糖(作为唯一碳源)和3g/L 15NH4Cl(作为唯一氮源)的M9基本培养基中生长。以下诱导、裂解、蛋白纯化和标签除去与均匀地15N-标记的GPX4U46C蛋白相同。
在NYSBC在700MHz Avance III/TS 3.5.6上收集在含有5mM TCEP和5％D2O的100mM MES pH 6.5中的50μM均匀地13C,15N-标记的GPX4U46C蛋白的HNCACB和CBCA(CO)NH NMR谱，并应用于HSQC主链共振归属。我们基于蛋白NMR实用指南(https://www.protein-nmr.org.uk)中的标准三重共振主链归属(Cα和Cβ)进行了归属，并使用了CCCPNmr分析软件(v3)。为了验证归属，我们还收集了HNCO、HN(CA)CO、HNCA和HN(CO)CA NMR谱，并平行地执行基于Cα和C’(羰基碳)的归属作为交叉检查。在我们的GPX4U46C构建体的预期的168个氨基酸残基中(175个总残基，不包括7个脯氨酸，其N上没有附着H，并因此在HSQC中不给出信号)，归属了147个残基的主链共振。未归属的残基包括一个10-残基N-端接头序列，这在GPX4(PDB:2OBI)的晶体结构中也未见到(Scheerer等人.2007)。在我们的构建体与人GPX4的D6-F170(NCBI参照序列:NP_001354761.1)对应的序列DDWRC ARSMHEFSAK DIDGHMVNLD KYRGFVCIVT NVASQCGKTE VNYTQLVDLH ARYAECGLRI LAFPCNQFGK QEPGSNEEIK EFAAGYNVKF DMFSKICVNG DDAHPLWKWM KIQPKGKGIL GNAIKWNFTK FLIDKNGCVV KRYGPMEEPL VIEKDLPHYF(SEQ ID NO:5)中，归属的残基带有下划线(154/165)。不能检测和/或归属剩余的主链峰可能反映了由于在溶液中的GPX4固有的构象动力学和移动性导致的交换展宽，其尤其包括在活性位点处的半胱氨酸46和其周围环上的其它残基(Vadrevu等人.2003)。
实施例5
患者衍生的GPX4的变体揭示其催化活性和降解机制的结构基础
介绍
脊椎干骺端发育异常(SMD)于1967年由Kozlowski首次描述，被定义为先天性骨发育异常的一种形式，包括各种类型的软骨营养不良(Nural等人.2006)。Sedaghatian-型脊椎干骺端发育异常(SSMD)是一种罕见的新生儿致死性障碍，其特征是严重的干骺端软骨发育异常，伴有轻度肢体缩短、扁椎骨、心肺功能缺陷和中枢神经系统异常(Elcioglu和Hall,1998)。大多数患有SSMD的婴儿在出生后几天内因呼吸窘迫而死亡(
Figure BDA0003936150330000701
和Akin,2016)。到目前为止，已经描述了四种SSMD相关的GPX4变体：在一位患者中的两个双等位基因剪接位点变体(c.587+5G>A和c.588-8_588-4del)，在第二位患者中的双等位基因纯合的p.Tyr127*，和在第三位患者中的双等位基因纯合变体c.153_160del(Smith等人.2014；Fedida等人.2020)。迄今为止，已经报道只有GPX4基因中的隐性遗传的截短突变诱导SSMD。GPX4功能的双等位基因截短突变的严重程度可能是由于酶功能的显著丧失，但缺乏确切的生理学验证。此外，是否存在较少涉及的疾病以及可能的基因型-表型相关性是未知的。理解GPX4机制可以通过阐明较少涉及的疾病状态来扩展实际的整体表型。
在这项研究中，我们鉴定了来自2个无关家族的三个个体，所述个体通过全外显子组测序被发现在GPX4基因中具有复发性纯合点突变c.647G>A(p.R216H)。一名儿童(患者1，家族1)除听神经病、视神经发育不全、张力过低和重度运动迟缓外还具有SSMD的典型骨骼特征。第二个家族(患者2和3，家族2)通过罕见疾病组织(Curegpx4.org)而鉴定，具有相似的神经学特征，但具有SSMD的非典型骨骼表现，因为他们缺乏扁椎骨和rhizomelia。这些发现提出了GPX4中的错义突变是否是病理性的问题。因此，我们试图进一步检查这种变体的潜在影响。
GPX4是一种硒蛋白并且是谷胱甘肽过氧化物酶家族酶的一个成员，该家族酶通过使用共同底物谷胱甘肽共享还原过氧化物的抗氧化功能(Brigelius-Flohe和Maiorino,2013)。尽管这些酶之间的结构和功能相似，但GPX4与其它GPx酶不同，它是哺乳动物中唯一能够在细胞膜范围内还原酯化的磷脂氢过氧化物和胆固醇氢过氧化物的酶(Brigelius-Flohe和Maiorino,2013)。尽管氧合脂质可以充当调节炎症性过程的信号分子，但它们会破坏膜结构并容易分解成反应性物质，这可以损伤生物分子诸如蛋白和核酸(Imai和Nakagawa,2003)。因此，当GPX4活性受损时，脂质过氧化产物可以积聚，通过铁死亡(一种铁依赖性的非凋亡性细胞死亡形式)导致细胞死亡(Yang等人.2014)。因此，GPX4在胚胎发生和早期发育过程中的重要作用已经通过GPX4纯合基因敲除小鼠未能在妊娠早期存活以及小鼠中神经元特异性的GPX4敲除的新生儿致死性得到证实(Seiler等人.2008；Yant等人.2003)。
在这里，我们试图研究人GPX4变体错义突变对GPX4蛋白的结构和功能的影响以确定该变体的潜在病理特征，并指导SSMD患者尽早进行精准治疗。此外，已经报道GPX4是耐药性和转移性癌症的有前途的治疗靶标，这基于这些癌症在上皮至间质转化(EMT)过程中以及在耐药性持久性和上皮至间质转化细胞状态中对GPX4脂质过氧化物修复途径的依赖性增加(Viswanathan等人.2017；Hangauer等人.2017；Liu等人.2018)。我们假设对GPX4的基本生化机制的更深入了解可能来自研究患者衍生的变体，为我们提供了在临床环境中调节GPX4以获得治疗益处的机会。
由于无效的硒代半胱氨酸掺入机制，在重组系统中含硒代半胱氨酸的蛋白的大规模表达具有挑战性；因此，GPX4的硒代半胱氨酸至半胱氨酸(U至C，插入一个硫醇基团代替硒醇基团)突变体被广泛用于结构研究，尽管与野生型蛋白相比其酶活性较低(Scheerer等人.2007；Sakamoto等人.2017；Janowski等人.2016；Li等人.2019)。由于最近对含硒代半胱氨酸的GPX4的研究证实了在U至C突变体的背景下发现的催化三联体和其它结构性能的相关性，我们使用GPX4U46C构建体进行体外结构研究和基于结构的计算分析，并同时通过酶测定和细胞测定检查了在人细胞中含有硒代半胱氨酸的细胞溶质GPX4(Borchert等人.2018；Ingold等人.2018；Yu等人.2014)。在我们用于体外和基于细胞的研究的成熟短形式GPX4构建体中，患者衍生的变体在GPX4蛋白上表示为R152H(Arai等人.1996；Liang等人.2009)。
考虑到gpx4在小鼠早期发育中的重要作用，我们发现错义R152H变体导致蛋白结构的变化，造成酶功能的大量丧失，并因此可能是患者中的病理特征的基础。功能分析在患者成纤维细胞中得到验证。除了先前报道的催化三联体(Sec46/Gln81/Trp136)和Asn137(Tosatto等人.2008)之外，我们对酶活性降低的起源的进一步结构检查揭示，K48在调节GPX4功能方面具有重要作用。我们还发现R152H变体改变了GPX4的降解，从而首次揭示了GPX4蛋白的降解机制。
结果
患者衍生的GPX4中的R152H变体造成严重功能丧失
为了研究R152H变体对GPX4结构和功能的影响，我们从GPX4R152H蛋白结构的计算建模开始(图13)。用His置换GPX4(PDB:2OBI)的晶体结构中的Arg152残基，然后在隐式溶剂中全局最小化整个结构以产生GPX4R152H结构模型。作为对照，也通过使用相同的算法和最小化方法将Arg152同义突变为Arg而产生GPX4R152R。
对比GPX4R152H和GPX4R152R，我们发现R152H变体显著改变了残基152周围的表面，这通过野生型蛋白中以Arg152为中心的疏水袋的丧失来证明(图13A)。表面特征的变化主要源于Gln123和Thr139之间环的显著构象变化，其中Arg152的侧链在野生型蛋白中形成了多个氢键，但在His152变体中没有，后者具有更紧凑的侧链和更少的H键供体(图13B)。GPX4R152H和GPX4R152R的分子动力学(MD)模拟预测该环在突变体的背景下具有异常的移动性(图13C)。除了局部构象变化外，这些MD模拟提示，与野生型蛋白相比，GPX4R152H在其活性位点表现出额外的灵活性(图13C)。
因此，活性位点催化残基Cys46与其催化配偶体Gln81/Trp136之间的平均距离在GPX4R152H中显著增加，并且在整个模拟动力学的时间尺度上呈现出相当广泛的分布，这指示预测的催化三联体之间的更弱相互作用(图13D)。
根据计算建模的结果，我们通过在HT-1080纤维肉瘤细胞中稳定地过表达GFP-标记的GPX4WT或GFP-标记的GPX4R152H建立了R152H突变的细胞模型，其中GPX4起到保护细胞免于铁死亡的作用，以通过实验确定这种变体在人细胞环境中的影响。如先前报道的(Roveri等人.1994)，使用用空载体(pBabe-puro)转染的HT-1080细胞作为对照，我们通过其在NADPH偶联测定中还原磷脂氢过氧化物的能力测量了转染的GFP-GPX4蛋白的酶活性。通过将酶活性归一化为蛋白水平，如通过蛋白质印迹测量的，我们发现一个单位的GPX4R152H表现出GPX4WT的活性的36％(图14A)。为了进一步证实突变诱导的活性丧失并排除来自内源性WTGPX4的干扰，我们在Gpx4-敲除的HT1080和Pfa-1细胞中过表达外源性GPX4WT或GPX4R152H。正如我们发现的，仅表达GPX4R152H的Gpx4-敲除的细胞需要α-生育酚才能正常生长，我们测量了在有或没有α-生育酚的培养基中培养的Gpx4-敲除的细胞的GPX4酶活性，其中我们发现在每对WT/R152H对比中始终部分丧失活性，尤其是在不受α-生育酚保护干扰的情况下(图14B-14D)。
然后，我们预测R152H中酶活性的降低会导致对铁死亡的抗性受损：作为能够还原磷脂氢过氧化物的主要酶，GPX4的过表达会保护细胞免于铁死亡(Yang等人.2014)。
因此，我们试验了过表达相当水平的GFP-GPX4WT或GFP-GPX4R152H的HT-1080细胞的铁死亡敏感性。虽然与用空载体转染的细胞系相比，两种细胞系对GPX4抑制剂RSL3、ML162和系统xc -抑制剂IKE诱导的铁死亡具有更强的抗性，但GPX4R152H的过表达针对铁死亡诱导剂的保护性低于GPX4WT，这与突变蛋白的更低还原脂质氢过氧化物的活性相一致(图14E)。总之，这些数据提示，患者衍生的GPX4的R152H变体造成其磷脂过氧化物酶活性的功能的部分丧失，且因此可能是携带该变体的患者中的病理特征的基础。
GPX4R152H变体的结构分析揭示显著的构象变化
为了进一步理解为什么远离活性位点的单个氨基酸残基的改变造成GPX4中酶功能的显著丧失，我们表达、纯化His-标记的GPX4U46C和GPX4U46C_R152H蛋白并以
Figure BDA0003936150330000741
分辨率解析其x-射线晶体结构。我们解析的GPX4U46C的结构与先前报道的结构(PDB:2OBI)一致。虽然GPX4U46C_R152H的主链与GPX4U46C很好地对齐，但最显著的变化是在Pro125和Ala132之间的环中，这在GPX4R152H中本质上是无序的，如与这些残基相对应的电子密度的损失所证明的；这表明在蛋白的该部分中固定或有序三维结构的缺乏(图15A)。如建模所示，这种变化可能是由于Arg152与Gly126、Asn132和Ala133的主链羰基形成的多个氢键的丢失，因此Gln123和Thr139之间的环变得异常灵活，这解释了缺失的电子密度(图13B和13C)。
此外，由于Trp136也在这个无序的环上，因此对活性位点处的催化三联体的检查显示，每对催化三联体残基之间的距离增加，正如从建模所预期的那样(图13D和15B)。虽然这一观察结果可能部分地解释催化活性的降低，但我们还在x-射线结构中注意到Lys48的侧链远离活性位点的显著且意外迁移(图15A和15C)。在GPX4R152H的MD模拟中也预测了Lys48的异常移动性(图13C)。由于带正电荷的Lys48与GPX4WT结构中的活性位点硒/硫阴离子具有强烈的相互作用以及我们对GPX4U46C的MD模拟，我们推断Lys48可能在GPX4的酶功能中具有重要且以前未知的作用，并且它从活性位点的偏离因此也可能会损害酶活性(Borchert等人.2018)。
点突变揭示Lys48在调节GPX4的催化活性中具有重要作用
为了进一步研究Lys48在GPX4的酶功能中的作用，我们产生了稳定地过表达GFP-GPX4K48A的HT-1080细胞。使用用GFP-GPX4WT或空载体(pBabe-puro)转染的HT-1080细胞作为对照，我们测量了GFP-GPX4K48A的酶活性。惊人的是，我们发现GPX4K48A几乎完全丧失了还原磷脂氢过氧化物的活性(图16A)。相应地，与对照线相比，GFP-GPX4K48A的过表达对RSL3、ML162或IKE诱导的铁死亡完全没有保护作用(图16B)。这些结果提出了意外的和惊人的假设，即Lys48在调节GPX4的酶活性中具有重要作用。
为了阐明这一基本功能的机制，我们表达、纯化His-标记的GPX4U46C_K48A蛋白并解析了其晶体结构。
虽然GPX4U46C_K48A蛋白是稳定的并且很好地叠加在GPX4U46C的结构上(图16C)，但是两种结构的MD模拟提示，GPX4U46C_K48A在其活性位点表现出额外的灵活性。因此，活性位点催化残基Cys46和它的催化配偶体Trp136之间的平均距离在GPX4K48A中显著增加，这指示更弱的相互作用(图16D)。这提示Lys48和(硒代-)Cys46之间的相互作用通常会使活性位点稳定在更紧凑和功能性更强的状态，并且当Lys48突变为Ala时，该特征就会丢失。
为了进一步研究Lys48在GPX4酶反应的典型催化循环(其中第一步是GPX4被其氢过氧化物底物氧化)的背景中的作用，我们解析了完全氧化的GPX4U46C的晶体结构，其中Cys46的硫被氧化成磺酸(SO3H)。我们发现Lys48与氧化的Cys46非常接近(
Figure BDA0003936150330000761
距离)，甚至比还原的GPX4U46C的晶体结构中还原的Cys46(
Figure BDA0003936150330000762
距离)更近(图16E)。在含氧化的硒代半胱氨酸的GPX4的结构中也观察到了这种紧密接近(Borchert等人.2018)。这提示Lys48在GPX4的氧化状态中在活性位点的调节中的作用。为了进一步研究这种相互作用，我们对完全氧化的GPX4U46C和GPX4U46C_K48A进行了MD模拟，并令人惊讶地发现，氧化的GPX4U46C在活性位点表现出额外的灵活性，但氧化的GPX4U46C_K48A具有极高的稳定性。因此，Cys46和它的催化配偶体Gln81/Trp136之间的平均距离在氧化的GPX4U46C中显著增加并呈现出相当宽的分布，这提示氧化的活性位点处于开放状态(图16F)。由于GPX4的SeO3 -/SO3 -状态被认为是无活性的且不可逆地过度氧化，特别是对于硫变体，所以K48A突变体在这种状态下的稳定性可能导致其活性丧失(Ingold等人.2018)。
GPX4的典型催化循环的第二步是通过Se-S键的形成掺入其辅因子GSH，这为氧化的GPX4再生为还原形式做准备。因此，我们使用Maestro在计算机环境中将GSH共价对接到GPX4U46C和GPX4U46C_K48A的晶体结构中，并获得了与GPX4U46C更好的共价对接亲和力(Zhu等人.2014)。这与先前报道的建模工作一致，该工作提出了Lys48在与GSH相互作用中的作用(Mauri等人.2003)。此外，与GPX4U46C_K48A相比，氧化的GPX4U46C的柔性和开放活性位点(如其MD模拟所示)也可能更容易让GSH掺入并还原氧化的GPX4。
总之，这些数据描绘了Lys48调节GPX4酶活性的多管齐下的机制：将活性位点稳定在更紧凑和更有功能性的状态，调节氧化的活性位点进行循环，并促进辅因子GSH的掺入。总之，这为当该残基突变为Ala时活性的丧失提供了解释。
为了进一步分析Lys48与活性位点残基之间的相互作用，我们制备了GPX4U46C_K48L蛋白并解析了其晶体结构，与野生型相比，其突变仅除去了侧链上带正电荷的ε-氨基基团。虽然这个突变体是稳定的并且与GPX4U46C的结构很好地重叠(图16G)，但是两种结构的MD模拟表明GPX4U46C_K48L意外地在其活性位点表现出增强的稳定性。因此，Cys46和它的催化配偶体Trp136之间的平均距离甚至低于在GPX4U46C中，这指示更强的相互作用(图16D)。这与先前的观察结果一致，即GPX4的重组K48L突变体具有比野生型更高的催化活性(Borchert等人.2018)。但是，在K48L突变体中带正电荷的ε-氨基基团的丢失可能对其与带负电荷的氧化的活性位点和GSH辅因子的相互作用产生显著影响。事实上，我们确实观察到GSH在K48L变体上的较差对接亲和力，这一点与K48A突变体无法区分。氧化的GPX4U46C_K48L的MD模拟也提示适度稳定的氧化状态，这一点与K48A变体相当并且与野生型可区分(图16F)。这提示K48L对过氧化的敏感性升高，尽管其初始活性较高。为了进一步验证我们对Lys48的分析，我们制备了稳定地过表达GFP-GPX4K48L的HT-1080细胞，使用用GFP-GPX4WT或空载体(pBabe-puro)转染的HT-1080细胞作为对照，我们测量了GFP-GPX4K48L的酶活性。正如预测的，我们发现GPX4K48L具有增强的酶活性以还原磷脂氢过氧化物(图16H)。相应地，GFP-GPX4K48L的过表达针对GPX4抑制剂RSL3具有更强的保护作用(图16I)。但是，GFP-GPX4K48L的过表达针对IKE完全没有保护作用，所述IKE耗尽细胞的GSH，并因此可能导致GPX4的过氧化(图16J)。
野生型K48L(不带正电荷的突变体)和K48A GPX4(不带电荷和侧链的突变体)的不同催化活性和结构特征强调了正电荷和长柔性侧链都参与了Lys48的功能。因此，我们得出的结论是，Lys48通过在其整个催化循环中与活性位点的多重相互作用在调节GPX4的酶活性方面具有意外的且重要的作用。此外，我们发现在K48A和K48L的两种晶体结构中，与野生型相比，124-133环的构象发生了变化(图16C和16G)。这表明所述环与在活性位点处的K48之间的变构联系，这在患者衍生的R152H变体中也是如此(图15A)。因此，Lys48以及124-133环将充当针对GPX4的治疗策略的一个深刻且通用的靶标。
R152H突变体对降解的抗性与泛素-蛋白酶体系统有关
当我们试验过表达GFP-GPX4R152H或GFP-GPX4WT的HT-1080细胞的铁死亡敏感性时，我们惊讶地发现GPX4R152H对铁死亡诱导剂FIN56提供了与GPX4WT相当的保护，尽管针对RSL3、ML162和IKE的保护不足(图17A)。由于据报道FIN56通过促进GPX4的降解以及消耗辅酶Q10来诱导铁死亡，我们推测R152H可能改变GPX4对降解的敏感性(Shimada等人.2016)。因此，我们用各种铁死亡诱导剂处理过表达GFP-GPX4R152H或GFP-GPX4WT的HT-1080细胞，并使用先前报道的方法(Gaschler等人.2018)通过蛋白质印迹测量了处理以后残留的GPX4蛋白水平。内源性GPX4蛋白作为内部对照，并证实RSL3、ML162和FIN56在这些处理条件下显著促进GPX4的降解(图17B)。同时，正如预期的那样，RSL3、ML162和FIN56诱导转染的GFP-GPX4WT的显著降解，这排除了GFP标签对降解机制的任何干扰(图17C)。我们观察到，与GFP-GPX4WT相比，GFP-GPX4R152H对RSL3、ML162和FIN56诱导的降解具有更强的抗性；该结果证实了GPX4的降解敏感性的变化是由R152H突变引起(图17C)。
RSL3和FIN56诱导GPX4降解的机制尚不清楚，尽管为了理解该现象做出了一些努力(Shimada等人.2016；Wu等人.2019)。
基于我们发现包含Lys125和Lys127的在Pro125和Ala132之间的环在GPX4R152H的背景下本质上变得无序，我们提出了一个假设，即RSL3诱导的或FIN56诱导的GPX4降解参与蛋白酶体依赖性机制，其中Lys125和Lys127作为在GPX4上的潜在泛素化位点；在这个模型中，高度移动的赖氨酸阻碍泛素化并防止降解。我们通过检查稳定地过表达GFP-GPX4K125R_K127R的HT-1080细胞中的GPX4降解来验证这一假设，其中所提出的泛素连接位点通过点突变除去。虽然内源性GPX4在用RSL3、ML162或FIN56处理后被降解，但我们发现GFP-GPX4K125R_K127R对降解具有抗性，甚至比在R152H突变的情况下更多地如此(图17D)。此外，我们发现，蛋白酶体抑制剂MG132抑制了HT1080中RSL3诱导的野生型GPX4降解，而对RSL3引起的GPX4活性降低没有影响(图17E和17F)。这意味着在共价抑制剂与GPX4的活性沉默结合后降解的诱导。MG132对RSL3诱导的GPX4降解的抑制也在A673细胞中重现，所述细胞具有不同的GPX4表达水平(图17G)。总之，这些数据提示，RSL3和FIN56诱导的GPX4的降解涉及蛋白酶体依赖性机制，并且GPX4的Lys125和Lys127是泛素缀合位点。
试验了硒补充作为概念验证处理
上述结果证实，患者衍生的GPX4的R152H变体造成其在磷脂过氧化物酶活性方面的功能的部分丧失，并因此是病理性的。但是，数据还显示，有部分活性的但抗降解的GPX4R152H的过表达确实部分地保护细胞免于脂质过氧化诱导的铁死亡，尽管不如野生型GPX4有效。因此，我们提出了一个假设，即通过硒补充提高硒蛋白GPX4的R152H变体的表达水平应该能够弥补部分功能丧失并对患者有帮助。这也是基于以下观察结果：亚毒性硒补充可以显著增加人细胞中GPX4的表达水平(至多48倍)以及另一种抗氧化硒蛋白GPX1的表达水平(至多40倍)(Romanowska等人.2007)。此外，硒容易从饮食来源或作为OTC补充片剂获得(Bodnar等人.2016)。
我们在HT-1080OE GFP-GPX4R152H细胞模型上试验了该假设，该细胞模型被转染以过表达GFP-GPX4R152H并在长时间选择后仅产生相对可忽略的量的内源性GPX4WT。亚硒酸钠、硒代蛋氨酸和(甲基-)硒代半胱氨酸作为硒的来源进行了试验，而N-乙酰基-半胱氨酸作为对照被包括在内，这也可能作为GPX4辅因子GSH的代谢前体使患者受益(Yang和Stockwell,2016)。在以滴定浓度预先补充含硒化合物或半胱氨酸24小时后，然后将HT-1080OE GFP-GPX4R152H细胞在IC10用RSL3均匀处理48小时以模拟患者相关的情景，其特点是GPX4活性受到抑制以及对磷脂过氧化和铁死亡的易感性(图18A)。随后的细胞活力数据显示N-乙酰基-半胱氨酸补充的有限保护作用，这表明当GPX4被RSL3压倒性地抑制时，细胞中GSH水平的升高可能不会直接有助于增强GPX4变体的活性。硒代蛋氨酸和(甲基-)硒代半胱氨酸表现出中等的拯救作用，在微摩尔水平具有完全的保护作用。硒代半胱氨酸和半胱氨酸的结果表明硒补充的贡献。此外，亚硒酸钠被证明是最有效的处理，在纳摩尔浓度观察到完全保护，这可能是由于其较小的尺寸和较大的细胞渗透性。
我们还试验了含硒化合物和半胱氨酸针对其它类别的铁死亡诱导剂的保护作用，它们通过多种途径间接抑制GPX4的活性(图18B-18D)。我们发现N-乙酰基-半胱氨酸仅轻微保护细胞免于IKE的影响，IKE是胱氨酸/谷氨酸反向转运体系统xc -的抑制剂(图18B)。尽管如此，所有三种含硒化合物都能够从所有试验过的铁死亡诱导剂中完全拯救HT-1080OEGFP-GPX4R152H，其中亚硒酸钠是最有效的(图18B-18D)。
我们在扩展的浓度范围重复了上述亚硒酸钠分析，并确定了其对RSL3(19nM)、IKE(66nM)、FIN56(34nM)和FINO2(12nM、图18E)的拯救作用的EC50值。虽然在所试验的补充化合物中只有亚硒酸钠在纳摩尔浓度提供了显著的保护，但是它也是在其浓度达到5μM时表现出细胞毒性的唯一一种(图18F)。但是，我们观察到一个意想不到的结果，即亚硒酸钠的毒性被IKE显著抑制，而其它铁死亡诱导剂没有表现出这种作用(图18E)。虽然单独的亚硒酸钠在细胞模型中的IC50为5μM，但1.2μM IKE的添加将其IC50变为85μM，引起17倍变化。换句话说，细胞在1.2μM IKE和50μM亚硒酸钠的组合下仍然存活，而它们单独会杀死细胞。我们还观察到对亲本HT-1080细胞具有相同的毒性抑制作用(图18G)。由于胱氨酸/谷氨酸反向转运体系统xc–的抑制可以抑制硒的毒性，这表明该系统或半胱氨酸/胱氨酸参与了硒剂量过量的毒性机制。此外，这也指示，为了减轻或避免硒补充的毒性，除了严格控制硒剂量外，我们可以限制半胱氨酸的摄取。
总之，硒补充作为一种概念验证处理在患者衍生的GPX4变体的细胞模型中被证实在纳摩尔浓度是有效的，并因此可能使这些患者受益。
在患者成纤维细胞中的概念验证处理
为了在分子和细胞模型上验证这些观察结果，关于GPX4蛋白水平和酶活性试验了从具有纯合突变(RAG01,GPX4R152H/R152H)的患者及其具有杂合突变(RAG02,GPX4R152H/WT)的作为健康对照的父亲/母亲发育而来的成纤维细胞。尽管基于蛋白质印迹分析，两种人成纤维细胞系表达同等水平的GPX4蛋白，但RAG01表现出的GPX4酶活性水平显著低于RAG02，从而证实患者衍生的GPX4中的R152H变体导致严重功能丧失(图19A和19B)。如预期的，具有GPX4活性的部分丧失的RAG01被证实比RAG02对RSL3、ML162、IKE和FIN56诱导的脂质过氧化和铁死亡更敏感(图19C)。然后我们进一步试验了GPX4蛋白在两种成纤维细胞中的降解易感性，并发现该突变改变了GPX4的降解，使得GPX4R152H比GPX4WT更能抵抗由RSL3和ML162诱导的降解，这与我们在HT-1080细胞模型中的观察结果一致，并进一步表明泛素-蛋白酶体系统在GPX4降解中的参与(图19D)。此外，在共聚焦显微镜下用GPX4免疫荧光和DAPI染色对成纤维细胞的成像显示RAG01和RAG02中不能辨别的细胞GPX4强度水平(图19E)。此外，在RAG01和RAG02中，细胞质GPX4相对于核GPX4的比率是相当的，表明对于这种患者衍生的突变，未观察到GPX4亚细胞定位的改变(图19F和19G)。
由于成纤维细胞数据验证了HT-1080细胞模型上的病理学分析，我们进一步在成纤维细胞上试验了硒补充和其它概念验证治疗性处理。与HT-1080细胞模型相比，由于患者成纤维细胞在常规培养基中已经表现出受损的GPX4活性和差活力，因此我们在这些拯救实验中没有向成纤维细胞添加铁死亡诱导剂，而是替代性地我们直接用各种浓度的硒补充或抗氧化剂处理成纤维细胞，并然后监测细胞数目相对于用单独DMSO处理的对照成纤维细胞的增加作为读数。因此，我们发现用亚硒酸钠、硒代蛋氨酸和甲基-硒代-半胱氨酸补充硒可以将RAG01的活力提高到138.0％、137.9％和136.3％，EC50值分别为0.8nM、0.5nM和0.8nM(图20A-20C)。虽然三种硒代化合物的活力增加程度的相似性表明硒补充作为一种有益处理的一致性，但共同的低EC50值表明它们作为治疗的高效力和对患者的GPX4变体的精确影响。由于亚硒酸钠毒性的IC50(12μM)是比其EC50高15,000倍，因此其毒性的避免应该是可控的，而硒代蛋氨酸和甲基-硒代-半胱氨酸可能是优选的。还值得注意的是，硒的拯救作用对RAG01具有高度特异性，对对照RAG02系的影响相对较小，这可能来自其GPX4的部分突变。此外，我们发现N-乙酰基-半胱氨酸和N-乙酰基-半胱氨酸-酰胺也可以将RAG01的活力提高到118％和136.3％，其不如硒醇-半胱氨酸有效，并且在超过1μM时无效(图20D和20E)。同样，这表明硒对于GPX4活性受损的患者的效用。
此外，我们发现抗氧化剂α-生育酚、CoQ10和艾地苯醌(CoQ10的可溶性类似物)也可以将RAG01的活力提高到250％、197％和245％，EC50值分别为115nM、5μM和228nM(图20F-20H)。我们还发现富马酸二甲酯(一种促进抗氧化应答的Nrf2活化剂)将RAG01的活力提高到127％(Wang等人.2015)(图20I)。此外，我们发现氘加强的亚油酸(RT-001)(一种在其双烯丙基位点具有氘的多不饱和脂肪酸(PUFA)，以抑制脂质自氧化)对RAG01提供了最显著的拯救效果(Hatami等人.2018)(440％,图20J)。相反，常规亚油酸仅在高浓度时对RAG01表现出毒性作用，这清楚地证明了脂质过氧化在患者的病理学中的参与(图20K)。
为了进一步评价概念验证处理的效能并将对GPX4R152H的效果与仅表达野生型GPX4(而不是表达两种变体的RAG02)的模拟对照进行对比，我们在Gpx4-敲除的Pfa-1细胞上试验了所有处理，所述细胞被转染以过表达人/鼠GPX4WT或GPX4R152H(图21)。Fer-1(一种铁死亡的特异性抑制剂)也被包括在试验中；其对仅表达GPX4R152H的细胞的显著的和选择性的拯救作用在细胞水平证明了铁死亡在R152H病理学中的参与(图21)。一般而言，对患者成纤维细胞有效的概念验证处理对Pfa-1细胞也表现出一致的拯救效果，尤其是对α-生育酚、CoQ10、艾地苯醌和D-亚油酸。与它们对成纤维细胞的影响相比它们对Gpx4-敲除的Pfa-1的更高表观拯救指数可能是由于在从培养基除去α-生育酚以后7天在特定干预时间点Pfa-1的更低活力。当在该时间点没有干预时，表达人GPX4R152H的Gpx4-敲除的Pfa-1表现出低于5％的活力，而对于表达鼠GPX4R152H的Pfa-1而言，它为大约10％的活力。这与抗氧化剂对前一种细胞表现出的表观拯救指数高于后者的观察结果一致。另一方面，与抗氧化剂不同，所有硒补充对在干预前具有相对更高活力的细胞的更好效果表明，硒补充在早期干预时间点会有更好效果(图21)。
总之，硒补充、铁死亡抑制剂和抗氧化剂可以增加患者成纤维细胞和我们的R152H细胞模型的细胞数目和活力的观察结果进一步证实了我们的病理机制分析，由此GPX4中的部分功能丧失突变使患者的细胞对脂质过氧化和铁死亡敏化。因此，我们预计硒补充(用于提高GPX4水平)和抗氧化剂(用于抑制脂质过氧化，α-生育酚和CoQ10)的组合处理可能是最有效的处理，它们都可作为OTC补充剂广泛得到。
成纤维细胞的免疫荧光成像的一个突出现象可能进一步支持这些原理验证治疗性处理对患者的效力，因为我们发现经历有丝分裂的细胞表现出比非有丝分裂细胞高得多的GPX4荧光强度(图19G)。这指示，在增殖过程中，成纤维细胞表达高水平的GPX4蛋白以保护自身免于脂质过氧化。GPX4中的活性丧失突变可能抑制有丝分裂，如通过在同等接种时RAG01细胞比RAG02更低的数目以及硒补充剂和抗氧化剂的患者选择性活力增强作用所证实的。因此，总而言之，我们提出硒补充和一般抗氧化剂的组合处理对在GPX4中具有R152H变体的患者具有治疗益处。
讨论
在这项研究之前，只有3名先前报告的具有SSMD的婴儿基于在计算机中数据被鉴定为具有预测的功能丧失变体，尽管这些变体没有在体外进行研究(Smith等人.2014；Fedida等人.2020)。我们对来自具有SSMD的典型发现的不相关家族的、具有双等位基因错义变体的患者的报告，结合R152H错义变体的功能表征，提供了GPX4中的双等位基因变体与SSMD的关联的进一步证据。此外，该报告将GPX4中与双等位基因变体相关的表型扩展到SSMD之外，以包括在婴儿期之后的长期存活以及其它骨骼和神经学发现。
这项研究首先检查了R152H错义突变对GPX4的影响，它不利地改变了蛋白结构并导致其抗氧化活性的部分丧失。作为一个亚效等位基因，我们因此假设有足够的酶功能以允许生存超越婴儿期，但会导致对铁死亡的易感性增加，最终导致细胞死亡、组织损伤和神经变性。这一发现与成年条件Gpx4敲除小鼠的观察结果一致，该小鼠发生癫痫发作、共济失调和进行性神经元损失(Yoo等人.2012)。
令人感兴趣的是，我们还报告了具有一致的神经学表型的、在纯合状态下携带R152H错义变体的第二个家族，但受影响的个体(患者2和3)具有SSMD的非典型骨骼发现。尽管基因型相同，但骨骼表型不同的原因尚不清楚。我们推测家族2中的个体可能携带其它遗传变体，所述遗传变体保护免于GPX4变异对发育中的软骨细胞的影响。无论骨骼表型如何，具有在GPX4中的双等位基因变体的其它个体的鉴定和研究，以及其它报告的具有典型SSMD的个体的基因分型，可能会提高我们对GPX4相关疾病的表型谱的理解。
通过沿我们的研究时间线与患者进行实时交流，具有已识别突变的活患者已经开始施用硒补充和抗氧化治疗，包括维生素E、N-乙酰基-半胱氨酸和CoQ10。施用每天2次50mgCoQ10、每天100mcg硒和每天2次150mg N-乙酰基-半胱氨酸，患者1已经发展出足够的力量从俯卧位抬起头保持短时间，并且他的骨骼X-射线指示他的骨骼在正常化。
在此分析期间，我们使用基于结构的计算建模方案来在计算机环境中研究所述变体对蛋白结构的影响，通过蛋白晶体结构和细胞测定证实了由此的预测。这些实验提示，变体蛋白结构的基于结构建模是分析患者衍生的变体的影响的重要且可靠的方案。计算建模的低成本和高通量可能使更多患有罕见疾病或关键基因变异的患者受益。
这种变体出人意料地揭示了GPX4的酶活性的结构基础及其降解的调节：发现Lys48调节GPX4酶活性，且揭示Lys125/Lys127为泛素连接位点。此外，这也表明Arg152作为间接调节GPX4活性的变构位点。由于最近的研究强调GPX4蛋白是耐药性和转移性癌症的致命弱点(Achilles’s heel)，这些癌症特别依赖于GPX4脂质过氧化物修复途径，因此我们期望靶向必需残基Lys48和变构位点Arg152或利用其降解机制的生化治疗策略将被作为高优先级开发并使额外患者受益(Viswanathan等人.2017；Hangauer等人.2017)。
方法
细胞系
HT-1080细胞得自ATCC并在补充了10％FBS、1％非必需氨基酸(Invitrogen)和1％青霉素-链霉素混合物(Invitrogen)的、含有谷氨酰胺和丙酮酸钠(Corning 10-013)的DMEM中生长。从具有纯合R152H变体的患者和其具有杂合R152H变体的父亲/母亲开发出人成纤维细胞系RAG01和RAG02。在补充了15％FBS、1％非必需氨基酸(Invitrogen)和1％青霉素-链霉素混合物(Invitrogen)的、含有谷氨酰胺和丙酮酸钠(Corning 10-013)的DMEM中生长RAG01和RAG02。RAG01和RAG02细胞系可以通过CureGPX4.org得到用于商业和学术用途，CureGPX4.org是一个致力于寻找SSMD疾病的治疗的患者组织。将细胞在组织培养箱中保持在37℃和5％CO2的控湿环境中。
计算建模和分子动力学(MD)模拟
在Maestro(
Figure BDA0003936150330000851
Suite)中进行计算机环境残基突变分析和分子动力学(MD)模拟。
将GPX4U46C(PDB:2OBI)的晶体结构输入Maestro，进行预处理以除去水和添加氢，在pH 7优化H-键分配，并使用蛋白制备向导(Protein Preparation Wizard)在OPLS3e力场中最小化。用His置换结构中的Arg152残基，然后在隐式溶剂中将整个结构全局最小化以产生GPX4R152H模型。作为对照，也使用相同的算法和最小化方法通过Arg152至Arg的同义突变而产生GPX4R152R。然后在默认设置下运行SiteMap。之后进行了GPX4R152H和GPX4R152R之间的结构对比。
对于MD模拟，将每个上述结构都设置在正交盒中，所述正交盒具有在SPC溶剂中的0.15M NaCl和OPLS3e力场。在Desmond Molecular Dynamics中使用随机播种在300K和1.01325巴以每步4.8ps对系统进行100ns的MD模拟。模拟质量和事件分析也由Desmond完成。输出代表性模拟过程的视频。
表达标记的GPX4的细胞的产生
在先前的工作中制备了一种pBabe-puro载体，其掺入了GFP-标记的cyto-GPX4WT的cDNA(Yang等人.2014)。用所述载体作为模板，使用Agilent QuikChange Primer Design应用程序设计下述诱变引物:R152H(5'-CTG CGT GGT GAA GCA CTA CGG ACC CAT GG-3'(SEQID NO:6),5'-CCA TGG GTC CGT AGT GCT TCA CCA CGC AG-3'(SEQ ID NO:7)),K48A(5'-GGC CTC CCA GTG AGG CGC GAC CGA AGT AAA CTA C-3'(SEQ ID NO:8),5'-GTA GTT TACTTC GGT CGC GCC TCA CTG GGA GGC C-3'(SEQ ID NO:9)),K125R_K127R(5'-TGG ATG AAGATC CAA CCC AGG GGC AGG GGC ATC CTG-3'(SEQ ID NO:10),5'-CAG GAT GCC CCT GCCCCT GGG TTG GAT CTT CAT CCA-3'(SEQ ID NO:11))。引物购自Integrated DNATechnologies。然后使用定点诱变试剂盒(QuickChange II,Agilent 200521)获取pBP-GFP-cGPX4R152H、pBP-GFP-cGPX4K48A和pBP-GFP-cGPX4K125R_K127R。通过在GENEWIZ测序确认所有突变和得到的质粒。
在脂转染前夜将HT-1080细胞以300,000个细胞/孔的密度接种进6孔皿中。将2.5μg DNA(分别是空pBabe-puro载体和以上四种表达GFP-GPX4的pBabe-puro载体)、7.5μLLipofectamine 3000(Invitrogen,L3000015)和250μL Opti-MEM在室温温育5分钟，然后加给HT-1080细胞。在转染后，将细胞在含有1.5mg/mL嘌呤霉素的培养基中传代几次，并在该培养基中生长以进行所有实验。用荧光显微镜和用GFP和GPX4抗体进行的蛋白质印迹确认外源GFP-标记的GPX4的表达。
蛋白质印迹
为了定量GPX4蛋白水平，通过蛋白质印迹在技术副本中试验了受到GPX4特异性活性的每个转染的HT-1080细胞系的生物学副本，所述技术副本制作每个细胞系的共4个样品。具体而言，将细胞用胰蛋白酶(Invitrogen,25200-114)收获，沉淀，并用LCW裂解缓冲液(0.5％TritonX-100,0.5％脱氧胆酸钠盐,150mM NaCl,20mM Tris-HCl pH 7.5,10mMEDTA,30mM焦磷酸钠,和完整蛋白酶抑制剂混合液)裂解。虽然部分细胞裂解物被印迹用于蛋白定量，但另一部分裂解物用于GPX4特异性活性测定。
对于GPX4降解研究，将HT-1080细胞以每孔800,000个接种在60-mm板中并使其附着过夜。然后用100μMα-生育酚和1μM RSL3、1μM ML162、10μM IKE、10μM FIN56或媒介物处理细胞10小时。将细胞用胰蛋白酶(Invitrogen,25200-114)收获，沉淀，并用RIPA缓冲液裂解。
对于两个实验，将细胞裂解物如前所述进行印迹和成像(Yang等人.2014)。使用的抗体是GPX4(Abcam,ab125066,1:250稀释)、肌动蛋白(Cell Signaling,D18C11,1:3,000稀释)和GAPDH(Santa Cruz,sc-47724,1:10,000稀释)。使用LI-COR Odyssey CLx IR扫描仪和GraphPad Prism 7对结果进行量化。
免疫荧光研究和定量
将人成纤维细胞RAG01和RAG02分别接种在24孔板中的聚赖氨酸包被的盖玻片(Sigma Aldrich P4832)上(每个盖玻片100,000个，且每个细胞系三个盖玻片)，并使其生长过夜。除去培养基并将细胞用PBS2+(含有1mM CaCl2和0.5mM MgCl2的PBS)轻轻洗涤两次。将细胞固定并通过加入200μL/孔的在含有0.1％Triton X-100的PBS(PBS-T)中的4％多聚甲醛(PFA)渗透化处理，并在室温温育20分钟。然后将细胞用PBS-T洗涤3次。然后将细胞用在PBS-T中的5％山羊血清(ThermoFisher 50197Z)在室温封闭1小时。然后将细胞与在含有1％BSA和5％山羊血清的PBS-T中的单克隆小鼠GPX4抗体(Santa Cruz,sc-166570,1:500稀释)一起在4℃温育过夜。将细胞用PBT洗涤5分钟3次。将细胞与山羊抗-小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二级抗体(Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody)Alexa Fluor594(Thermo Fisher Scientific目录号A-11032,RRID:AB_2534091,1:200稀释)一起在室温温育1小时。将细胞用PBS-T洗涤5分钟3次。加入含有DAPI(ThermoFisher P36962)的ProLongDiamond抗褪色封固剂对细胞核进行染色。所有图像均在Zeiss LSM 800共聚焦显微镜上在Plan-Apochromat 63x/1.40油DIC物镜捕获，对于所有样品用恒定激光强度。当适用时，使用Zeiss LSM软件对代表性的共焦显微术图像进行线扫描分析，以定性地观察荧光重叠。
使用CellProfiler 3.1.8分析抗体强度的量化(Carpenter等人.2006)(CellProfiler Image Analysis Software,RRID:SCR_007358)。基于DAPI荧光信号，首先使用全局最小交叉熵策略将细胞核鉴定为主要对象。然后，基于GPX4荧光(Alexa Fluor594)信号，通过使用全局最小交叉熵策略进行传播，将全细胞鉴定为基于主要对象的次要对象。然后将细胞质鉴定为第三对象，作为每个不包括细胞核的细胞的部分。然后测量并报告细胞核、细胞质和全细胞的GPX4荧光的平均强度。在Prism 8中创建图。
GPX4特异性活性的确定
如先前报道的(Roveri等人.1994)，我们应用了NADPH偶联的细胞GPX4酶活性测定。由GPX4在还原其特异性磷脂氢过氧化物底物期间产生的氧化型谷胱甘肽被谷胱甘肽还原酶以NADPH为代价还原，其在340nm处的特征吸光度的降低被监测并量化为GPX4活性。通过IV型大豆脂肪氧化酶对磷脂酰胆碱的酶促氢过氧化制备GPX4特异性底物PCOOH：将22mL含有3mM脱氧胆酸钠和0.3mM磷脂酰胆碱的0.2M Tris-HCl(pH 8.8)与0.7mg的IV型大豆脂肪氧化酶一起在连续搅拌下在室温温育30分钟。将混合物加载到用甲醇洗涤并用水平衡的Sep-Pak Cl8筒(Waters-Millipore)上。用10体积的水洗涤后，将磷脂酰胆碱氢过氧化物在2mL甲醇中洗脱。将4800万个HT-1080细胞收获并用LCW裂解缓冲液(0.5％TritonX-100,0.5％脱氧胆酸钠盐,150mM NaCl,20mM Tris-HCl pH 7.5,10mM EDTA,30mM焦磷酸钠,和完整蛋白酶抑制剂混合液)裂解。使用BCA测定试剂盒，使用BSA作为标准，测定裂解物中蛋白的浓度。然后，在96孔板上，将250μL 1.5μg/μL细胞裂解物在GPX4活性测定缓冲液(0.1％Triton X-100,100mM Tris-HCl pH 7.4,10mM NaN3,5mM EDTA,0.6IU/mL谷胱甘肽还原酶,0.5mM NADPH)中在37℃温育10分钟。然后将PCOOH添加到混合物中以引发GPX4反应。在20分钟时间内以1分钟间隔动态测定NADPH在340nm处的吸光度。还进行了使用裂解缓冲液代替细胞裂解物和不添加PCOOH的对照的实验，以测量GPX4的还原磷脂氢过氧化物的特定活性。基于蛋白质印迹将每个样品的总GPX4活性归一化为它们的特异性GPX4水平，用于单位GPX4酶活性对比。使用GraphPad Prism 7对结果进行量化。
细胞活力测定
对于剂量响应曲线，在第1天将受到GPX4特异性活性影响的每个转染的HT-1080细胞系的1000个细胞以36μL/孔铺板在384孔板中。立即对剩余的细胞进行蛋白质印迹和活性测定。将化合物溶解在DMSO中并制备12点、2倍稀释系列。然后将化合物在培养基中按1:50稀释，并在第2天将4μL添加到平板的每个孔中。在384孔板上的化合物的终浓度从2μM(对于RSL3/ML162)和20μM(对于IKE/IN56)开始。处理48小时后，使用CellTiter-Glo发光试剂(Promega G7573)与培养基1:1稀释来测量细胞活力，其在第4天在室温摇动10分钟后在Victor 5平板读数器上读出。将发光强度归一化为DMSO对照的强度。使用GraphPad Prism7对结果进行量化。
蛋白纯化
在先前的工作中描述了细菌表达载体pOE30-His-标记的c-GPX4U46C(Yang等人.2016)。用所述载体作为模板，使用Agilent QuikChange Primer Design应用程序设计下述诱变引物:R152H(F:5'-CTG CGT GGT GAA GCA CTA CGG ACC CAT GG-3'(SEQ ID NO:12),R:5'-CCA TGG GTC CGT AGT GCT TCA CCA CGC AG-3'(SEQ ID NO:13)),K48A(F:5'-GGC CTC CCA GTG TGG CGC GAC CGA AGT AAA CTA C-3'(SEQ ID NO:14),R:5'-GTA GTTTAC TTC GGT CGC GCC ACA CTG GGA GGC C-3'(SEQ ID NO:15)),K48L(F:5'-CGT GGC CTCCCA GTG TGG CCT AAC CGA AGT AAA CTA CAC TC-3'(SEQ ID NO:16),5'-GAG TGT AGTTTA CTT CGG TTA GGC CAC ACT GGG AGG CCA CG-3'(SEQ ID NO:17))。引物购自Integrated DNA Technologies。然后使用定点诱变试剂盒(QuickChange II,Agilent200521)获取pOE30-c-GPX4U46C_R152H、pOE30-c-GPX4U46C_K48A和pOE30-c-GPX4U46C_K48L。通过在GENEWIZ测序确认所有突变和得到的质粒。
将具有每种质粒的分离菌落单独转移至8mL的含有100μg/mL氨苄西林的LB培养基，并将接种的培养物在摇动(225rpm)下在37℃温育16h。将3mL的起子培养物加入到1L的含有100μg/mL氨苄西林的新鲜LB培养基中。将培养物在37℃和225rpm摇动下温育直到OD600达到0.9。然后使温度降低至15℃。将细胞与1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)一起在15℃和225rpm摇动下温育过夜。次日，通过在4℃在4000g离心20分钟收获细菌，并将得到的沉淀物准备好用于纯化或在-20℃储存。将沉淀物重新悬浮在25mL的冷的裂解缓冲液(100mM Tris pH 8.0,300mM NaCl,20mM咪唑,3mM TCEP,和Roche蛋白酶抑制剂混合液)中。通过在冰上声处理6分钟来裂解细菌，并将裂解物在4℃在10000rpm离心20分钟以除去细胞碎片。将澄清的裂解物与Ni Sepharose 6Fast Flow珠子(GE Life Sciences)一起在转子上在4℃温育至少1h。将珠子用洗涤缓冲液(100mM Tris pH 8.0,300mM NaCl,50mM咪唑,和3mM TCEP)洗涤以除去非特异性结合。将蛋白用100mM Tris pH 8.0、300mMNaCl、100mM咪唑和3mM TCEP洗脱。将蛋白在含有100mM Tris pH 8.0、300mM NaCl和3mMTCEP的FPLC缓冲液中使用凝胶过滤Superdex 200柱进一步纯化。将含有GPX4的级分合并到一起并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。
结晶和结构确定
最初在Hauptman-Woodward医学研究所(Hauptman-Woodward Medical ResearchInstitute，HWI)的高通量结晶筛选中心(Luft等人.2003)筛选GPX4U46C的蛋白样品(https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-center/)。在23℃在COY厌氧手套箱中使用油下微批量法(under oil micro batch method)再现最有前途的晶体命中。使用包含0.056M磷酸二氢钠一水合物pH 8.2和1.344M磷酸钾的结晶试剂生长GPX4U46C的板状晶体，蛋白与结晶试剂的比例为2:1μl。随后将所有晶体转移进补充了20％(v/v)甘油的类似结晶试剂中，并在手套箱中在液氮中快速冷冻。在Lemont,IL的AdvancedPhoton Source的NE-CAT24-ID-C光束线收集关于GPX4U46C晶体的原生数据集。GPX4U46C晶体随后被用作在手套箱外生长GPX4U46C-R152H、GPX4U46C-K48L、GPX4U46C-K48A和GPX4U46C-砜的晶体的种子，尽管使用不同的结晶条件来生长这些晶体。使GPX4U46C-R152H的晶体在包含0.2M硫氰酸钠pH 6.9和20％(w/v)PEG 8000的结晶条件下生长，而K48L和K48A的晶体在由0.1M氯化钠、0.1M MES、pH 6和40％(w/v)PEG 8000组成的条件下生长。使完全氧化的GPX4U46C-砜的晶体在0.1M硫氰酸钾、0.1M醋酸钠、pH 5和20％(w/v)PEG 8000中生长，并在一个月后收获。在每种情况下，将晶体转移进各自的补充了20％(v/v)乙二醇的结晶试剂中。
GPX4U46C、GPX4U46C-R152H、GPX4U46C-K48L、GPX4U46C-K48A和GPX4U46C-砜的晶体在NE-CAT24-ID-C光束线处衍射X射线，分辨率分别为
Figure BDA0003936150330000911
和
Figure BDA0003936150330000912
使用XDS(Kabsch,2010)分别在空间群P21、P21、P21、P212121和P21中处理和缩放图像。使用MOLREP(Vagin和Teplyakov,2010)程序通过分子置换法确定每种蛋白的结构，并使用GPX4U46C(PDB id:2OBI)的晶体结构作为GPX4U46C的结构确定的搜索模型。后一种结构用作其它晶体结构的后续结构确定的搜索模型。将每个晶体结构的几何形状使用程序XtalView(McRee,1999)和COOT(Emsley等人.2010)固定，并通过Phenix(Adams等人.2010)细化。在具有空间群P21的晶体的不对称单元(ASU)中存在GPX4的一个原聚体。而具有空间群P212121的GPX4-U46C-K48A的ASU包含两个原聚体。晶体学统计数据如表3所示。
表3.晶体学数据收集和细化统计.
Figure BDA0003936150330000921
*最高分辨率壳层显示在括号中。
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在本申请中引用的所有文件特此通过引用并入，如同在本文中全文引用一样。
尽管本文已经描述了本公开内容的示例性实施方案，但应当理解，本公开内容不限于所描述的那些，并且本领域技术人员可以做出各种其它变化或修改而不背离本公开内容的范围或精神。
序列表
<110> 纽约市哥伦比亚大学理事会
<120> GPX4化合物和组合物以及使用它们的治疗方法
<130> 1035795.000703
<150> 63/122,143
<151> 2020-12-07
<150> 62/989,425
<151> 2020-03-13
<160> 17
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
ggagcgcgca ctgcgccagt cg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
acgactggcg cagtgcgcgc tc 22
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
cccgatacgc tgagagtggt ttgcggatc 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
gatccgcaaa ccactctcag cgtatcggg 29
<210> 5
<211> 165
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Asp Asp Trp Arg Cys Ala Arg Ser Met His Glu Phe Ser Ala Lys Asp
1 5 10 15
Ile Asp Gly His Met Val Asn Leu Asp Lys Tyr Arg Gly Phe Val Cys
20 25 30
Ile Val Thr Asn Val Ala Ser Gln Cys Gly Lys Thr Glu Val Asn Tyr
35 40 45
Thr Gln Leu Val Asp Leu His Ala Arg Tyr Ala Glu Cys Gly Leu Arg
50 55 60
Ile Leu Ala Phe Pro Cys Asn Gln Phe Gly Lys Gln Glu Pro Gly Ser
65 70 75 80
Asn Glu Glu Ile Lys Glu Phe Ala Ala Gly Tyr Asn Val Lys Phe Asp
85 90 95
Met Phe Ser Lys Ile Cys Val Asn Gly Asp Asp Ala His Pro Leu Trp
100 105 110
Lys Trp Met Lys Ile Gln Pro Lys Gly Lys Gly Ile Leu Gly Asn Ala
115 120 125
Ile Lys Trp Asn Phe Thr Lys Phe Leu Ile Asp Lys Asn Gly Cys Val
130 135 140
Val Lys Arg Tyr Gly Pro Met Glu Glu Pro Leu Val Ile Glu Lys Asp
145 150 155 160
Leu Pro His Tyr Phe
165
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
ctgcgtggtg aagcactacg gacccatgg 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
ccatgggtcc gtagtgcttc accacgcag 29
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
ggcctcccag tgaggcgcga ccgaagtaaa ctac 34
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
gtagtttact tcggtcgcgc ctcactggga ggcc 34
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
tggatgaaga tccaacccag gggcaggggc atcctg 36
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
caggatgccc ctgcccctgg gttggatctt catcca 36
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
ctgcgtggtg aagcactacg gacccatgg 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
ccatgggtcc gtagtgcttc accacgcag 29
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
ggcctcccag tgtggcgcga ccgaagtaaa ctac 34
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
gtagtttact tcggtcgcgc cacactggga ggcc 34
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
cgtggcctcc cagtgtggcc taaccgaagt aaactacact c 41
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
gagtgtagtt tacttcggtt aggccacact gggaggccac g 41

Claims (54)

1.根据式(1)的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure FDA0003936150320000011
其中：
R1、R2和R3独立地选自H、D、O、N、卤素、醚、酯、酰胺、C(O)、(O)C(R)、C(O)O、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基，其中所述醚、酯、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
其中R选自H、D、O、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
前提条件是，所述化合物不是
Figure FDA0003936150320000012
2.根据式(2)的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure FDA0003936150320000021
其中：
虚线指示任选的双键的存在；
X和Y独立地选自C、N、S和O；
R1、R2、R3和R4独立地选自无原子、H、D、O、N、卤素、醚、酯、酰胺、C(O)、(O)C(R)、C(O)O、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基，其中所述醚、酯、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自N、O、Sn、卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
其中R选自H、D、O、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
前提条件是，所述化合物不是
Figure FDA0003936150320000022
3.具有选自以下的结构的根据权利要求2所述的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure FDA0003936150320000031
4.根据式(3)的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure FDA0003936150320000041
其中：
虚线指示任选的双键的存在；
X1、X2、X3和Y独立地选自C、N、S和O；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自无原子、H、D、O、N、卤素、醚、酯、酰胺、C(O)、(O)C(R)、C(O)O、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基，其中所述醚、酯、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
其中R选自H、D、O、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
前提条件是，所述化合物不是
Figure FDA0003936150320000042
5.根据式(4)的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure FDA0003936150320000051
其中：
虚线指示任选的双键的存在；
X1、X2和X3独立地选自C、N、S和O；
Y是C或N；
R1和R2独立地选自无原子、H、D、-OH、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C2-6烯基、C2-6烯基-芳基和C2-6烯基-杂芳基，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C2-6烯基、C2-6烯基-芳基和C2-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自N、环氧、-OH、卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，或者R1和R2可以一起形成C3-12碳环，所述碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自O、N、卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合；
R3选自H、D、O、N、卤素、醚、酯、酰胺、氨基、C(O)、(O)C(R)、C(O)O、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基，其中所述醚、酯、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
R4和R5独立地选自无原子、H、D、-OH、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C2-6烯基、C2-6烯基-芳基和C2-6烯基-杂芳基，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C2-6烯基、C2-6烯基-芳基和C2-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自N、环氧、-OH、卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，或者R4和R5可以一起形成C3-12碳环，所述碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自O、N、卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合；
R6选自H、D、O、N、卤素、醚、酯、酰胺、氨基、C(O)、(O)C(R)、C(O)O、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基，其中所述醚、酯、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基和C1-6烯基-杂芳基可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
其中R选自H、D、O、N、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环，其中所述C1-6烷基、C1-6烷基-芳基、C1-6烷基-杂芳基、C1-6烯基、C1-6烯基-芳基、C1-6烯基-杂芳基和C3-12碳环可以任选地被原子或基团取代，所述原子或基团选自卤素、C1-4烷基、CF3和它们的组合，
前提条件是，所述化合物不是
Figure FDA0003936150320000061
6.一种组合物，其包含一种或多种根据权利要求1-5中的任一项所述的化合物和药学上可接受的载体、辅助剂或媒介物。
7.一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)相关疾病的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的一种或多种根据权利要求1-5中的任一项所述的化合物或根据权利要求6所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述GPX4相关疾病选自癌症、神经症性障碍、神经变性障碍、脊椎干骺端发育异常、混合型脑瘫、脑桥小脑发育不全和男性不育。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述GPX4相关疾病是癌症。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述癌症选自肝细胞癌、肉瘤、神经胶质瘤、肾细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤、结肠癌、弥散性大B细胞淋巴瘤、白血病、肺癌、透明细胞癌和非小细胞肺癌。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述癌症是肝细胞癌。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述哺乳动物选自人类、兽医动物和农业动物。
14.根据权利要求7所述的方法，其中所述受试者是人。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述癌症是转移性的。
16.根据权利要求9所述的方法，其中所述癌症处于上皮至间质(EMT)转化下。
17.根据权利要求9所述的方法，其中所述癌症是对铁死亡超敏性的。
18.根据权利要求9所述的方法，其中所述癌症是对标准癌症治疗难治的。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述标准癌症治疗包含化学疗法、辐射疗法、靶向疗法、免疫疗法和它们的组合。
20.一种用于在有此需要的受试者中调节谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的活性的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的一种或多种根据权利要求1-45中的任一项所述的化合物或根据权利要求6所述的组合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述调节包含抑制GPX4活性。
22.一种用于在有此需要的受试者中增加过氧化物的水平的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的一种或多种根据权利要求1-5中的任一项所述的化合物或根据权利要求6所述的组合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述过氧化物选自过氧化氢、有机氢过氧化物、脂质过氧化物和它们的组合。
24.一种用于在细胞中诱导铁死亡的方法，所述方法包含使所述细胞与有效量的一种或多种根据权利要求1-5中的任一项所述的化合物或根据权利要求6所述的组合物接触。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述细胞具有异常脂质积累。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述癌症选自肝细胞癌、肉瘤、神经胶质瘤、肾细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤、结肠癌、弥散性大B细胞淋巴瘤、白血病、肺癌、透明细胞癌和非小细胞肺癌。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述癌症是肝细胞癌。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述癌细胞是转移性的。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述癌细胞处于上皮至间质(EMT)转化下。
32.根据权利要求26所述的方法，其中所述癌细胞是对铁死亡超敏性的。
33.根据权利要求26所述的方法，其中所述癌细胞是对标准癌症治疗难治的。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述标准癌症治疗包含化学疗法、辐射疗法、靶向疗法、免疫疗法和它们的组合。
35.一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用i)有效量的第一抗癌剂，其为一种或多种根据权利要求1-5中的任一项所述的化合物或根据权利要求6所述的组合物，和ii)有效量的第二抗癌剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述第二抗癌剂选自化学疗法、辐射疗法、靶向疗法、免疫疗法和它们的组合。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述第二抗癌剂是免疫疗法。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述免疫疗法选自伊匹木单抗、帕博利珠单抗、纳武单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、西米普利单抗、奥法木单抗、博纳吐单抗、达雷木单抗、埃罗妥珠单抗、阿托珠单抗、talimogenelaherparepvec、耐昔妥珠单抗、来那度胺、地努妥昔单抗和它们的组合。
39.根据权利要求35所述的方法，其中所述受试者是人。
40.根据权利要求35所述的方法，其中所述癌症是转移性的。
41.根据权利要求35所述的方法，其中所述癌症处于上皮至间质(EMT)转化下。
42.根据权利要求35所述的方法，其中所述癌症是对铁死亡超敏性的。
43.根据权利要求42所述的方法，其中通过NADPH丰度、GCH1表达、NF2-YAP活性、EMT识别标志和GPX4表达来鉴定对铁死亡的超敏反应。
44.根据权利要求35所述的方法，其中所述癌症是对标准癌症治疗难治的。
45.根据权利要求35所述的方法，其中所述癌症选自肝细胞癌、肉瘤、神经胶质瘤、肾细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤、结肠癌、弥散性大B细胞淋巴瘤、白血病、肺癌、透明细胞癌和非小细胞肺癌。
46.根据权利要求35所述的方法，其中所述癌症是肝细胞癌。
47.根据权利要求35所述的方法，其中在所述第二抗癌剂之前、同时地或之后将所述第一抗癌剂施用给所述受试者。
48.用于在有此需要的受试者中治疗或改善谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)相关疾病的影响的试剂盒，所述试剂盒包含与其使用说明书一起包装的有效量的一种或多种根据权利要求1-5中的任一项所述的化合物或根据权利要求6所述的组合物。
49.一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)相关疾病的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的一种或多种具有选自以下的结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure FDA0003936150320000111
Figure FDA0003936150320000121
Figure FDA0003936150320000122
和它们的组合。
50.一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)相关疾病的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的具有以下结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure FDA0003936150320000131
51.一种用于在有此需要的受试者中增加过氧化物的水平的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的一种或多种具有选自以下的结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure FDA0003936150320000132
Figure FDA0003936150320000141
Figure FDA0003936150320000142
和它们的组合。
52.一种用于在细胞中诱导铁死亡的方法，所述方法包含使所述细胞与有效量的一种或多种具有选自以下的结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐接触：
Figure FDA0003936150320000151
Figure FDA0003936150320000161
Figure FDA0003936150320000162
和它们的组合。
53.一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用i)有效量的第一抗癌剂，和ii)有效量的第二抗癌剂，
其中所述第一抗癌剂是一种或多种具有选自以下的结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure FDA0003936150320000163
Figure FDA0003936150320000171
Figure FDA0003936150320000172
和它们的组合。
54.一种用于在有此需要的受试者中治疗或改善癌症的影响的方法，所述方法包含给所述受试者施用i)有效量的第一抗癌剂，和ii)有效量的第二抗癌剂，
其中所述第一抗癌剂是具有以下结构的化合物或其N-氧化物、结晶形式、水合物或药学上可接受的盐：
Figure FDA0003936150320000181
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