NO324321B1

NO324321B1 - Fenothiazinium forbindelse, konjugat eller kompositt derav, sammensetning, nevnte forbindelse for medisinsk bruk, anvendelse av nevnte forbindelse for steriliseringsformal samt artikkel som omfatter nevnte forbindelse

Info

Publication number: NO324321B1
Application number: NO20035327A
Authority: NO
Inventors: Stanley Beames Brown; John Griffiths; Cassandra Claire O'grady; Kirste Joanne Mellish; Richard George Tunstall; David John Howard Roberts; David Ian Vernon
Original assignee: Photopharmica Ltd
Priority date: 2001-05-30
Filing date: 2003-11-28
Publication date: 2007-09-24
Also published as: EP1392666A1; KR20090061684A; US8188074B2; KR20040015723A; PT1392666E; US7371744B2; DE60218454T2; US20080275033A1; CA2448303C; US20040147508A1; DK1392666T3; GB0113121D0; EP1392666B1; JP2005500271A; GB0123945D0; US20080261960A1; CA2448303A1; CN100491362C; ES2280533T3; AU2002256784B2

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Denne oppfinnelsen er relatert til biologisk aktive fotosensitisere som er sterkt fotocy-toksiske og har anvendelse innenfor området fotodynamisk terapi (PDT), så vel som for diagnose og deteksjon av medisinske tilstander og relaterte anvendelser innen fotokjemisk internalisering, ved produksjon av cancervaksiner, ved behandling av mikrobielle infeksjoner og ved fotodesinfeksjon eller fotosterilisering.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Det er kjent at visse organiske forbindelser ("fotosensitisere") kan indusere celledød ved absorpsjon av lys ved tilstedeværelsen av oksygen. Den cytotoksiske effekten involverer type I og/eller type II fotooksidering. Slike fotosensitesere kan anvendes ved behandling av cancer og andre sykdommer eller infeksjoner med lys (fotodynamisk terapi) og ved sterilisering (inkludert desinfeksjon) av overflater og væsker ved lysindusert destruksjon av mikrober. I denne sammenhengen er begrepet sterilisering ment å bety reduksjon eller eliminering av mikrober i en spesiell situasjon.

Det er også kjent at visse fargede fenothiaziniumforbindeler (for eksempel metylenblått) kan ta del i type I- og type II- fotooksideringsprosesser, men forbindelser av denne typen har så langt seg vist seg å være uegnet eller ha lav effektivitet som sensitisere ved fotodynamisk terapi eller bare har lav fotokjemisk antimikrobiell aktivitet.

For anvendelse innen PDT må en god sensitiser ha minst noen og fortrinnsvis alle av de følgende egenskapene. Viktigst må den effektivt forårsake destruksjon av målceller (for eksempel tumorceller eller bakterier) ved eksponering for lys (fortrinnsvis bølgeleng-dene ca 600 - 800 nm). PDT-behandlingen hvor fotosensitiseren anvendes bør vise en høy grad av selektivitet mellom målvev og normalt vev. Sensitiseren bør ha relativt liten mørketoksisitet og den bør forårsake lite eller ingen hudfotosensitivitet hos pasienten.

Ved anvendelse til fotosteirlisering må en god sensitiser vise en kraftig fototoksisk effekt i en lang rekke av mikroorganismer, ideelt ved å bruke ambient lys, og bør ikke lett fotoblekes.

I onkologi har flere forskjellige typer av fotosensitisere blitt anvendt til å behandle både faste tumorer og tynne tumorer i hule organer, slik som oesophagus og blære. Anvendelsen av disse fotosensitiserne har imidlertid blitt begrenset delvis på grunn av mangel på selektivitet mellom tumor og friskt vev, og delvis på grunn av den langvarige hudfotosensitiviteten som kan forårsakes. Det er et behov for nye fotosensitisere som forårsaker lite eller ingen hudfotosensitivitet og som selektivt ødelegger tumorceller.

Selv om PDT tidligere har vært anvendt for behandlingen av kreftsvulster, så har det enda ikke blitt anvendt mot infeksjoner forårsaket av bakterier og andre mikroorganismer. Anvendelsen av antibiotika for behandling av bakterielle infeksjoner har blitt en utfordring på grunn av den økende resistensen til mange bakteriearter i forhold til tradisjonelt anvendte antibiotika, slik som tetracykliner og betalaktamer. Sykehuservervede antibiotikaresistente infeksjoner slik som MRSA er spesielt problematiske. Fotodynamisk antibakteriell behandling er et lovende alternativt til antibiotika for lokal behandling.

Ved utvikling av antibakterielle midler er opptaket av legemiddelet inn i bakteriecellen et stort problem som må løses. Gramnegative og grampositive bakterier har en forskjellig sammensetning av den ytre overflate og responderer forskjellig i forhold til antimikrobielle midler, spesielt med hensyn på opptak. På grunn av den høyt negativt ladede overflaten til gramnegative bakterier er de relativt impermeable for nøytrale eller anioniske legemidler, inkludert de mest anvendte fotosensitiserne. Utvikling av antimikrobielle fotosensitisere som er effektive mot gramnegative bakterier så vel som grampositive bakterier, ville være meget nyttige for å erstatte tradisjonelt anvendte antibiotika og legemidler som i stadig økende grad er ineffektive på grunn av resistens.

Flere forskjellige typer av fotosensitisere har blitt undersøkt i bakterier. Disse inkluderer fenothiazinium-forbindelser, phtalocyaniner, kloriner og naturlig forekommende fotosensitisere. For opptak i gramnegative bakterier er det anerkjent at de kanoniske derivatene er de mest effektive.

Fenothiazinium-forbindelser er blå fargestoffer med maksimum absorpsjon ved bølge-lengder mellom 600 - 700 nm. De har blitt studert for deres ikke-fotodynamiske antibakterielle egenskaper, men få bortsett fra metylenblått og toluidinblått, har blitt under-søkt fotodynamisk.

Wainwright m.fl. (1998) undersøkte virkningen av en serie med fenothiazinium-mety-lenblåttderivater i tumorcellelinjer og bakterier. Nytt metylenblått (NMB) og di-metyl-metylenblått (DMMB) inaktiverte effektivt MRSA og ble vist å være mer effektive fotosensitisere enn metylenblått når anvendt på pigmenterte melanomcellelinjer. Wagner m.fl. (1998) studerte disse fargestoffene og i tillegg et hydrofobisk derivat for inaktiveringen av enveloped virus.

Den presise antibakterielle virkningen av metylenblått er ukjent, men en hypotese er at på grunn av dets stereokjemi kan det interkalere med DNA og at fotodynamisk virkning forårsaker DNA-skade. Metylenblått i seg selv har vært vist å være ineffektivt som anti-tumormiddel. I tillegg er metylenblått kjent for å være mottagelig for fotobleking, som kan være en alvorlig ulempe ved hoen anvendelser. På grunn av de anerkjente begrens-ningene til metylenblått ville både antitumor PDT og antimikrobiell PDT ha nytte av utvikling av nye fenothiazinbaserte fotosensitisere.

FORKLARING AV OPPFINNELSEN

Et første aspekt ved oppfinnelsen vedrører en fenothiazinium-forbindelse med formel

(I):

hvor A og B er hver uavhengig

hvor Z er CH2, O, S, S02, NH, NCH3, NC2H5, NCH2CH2OH eller NCOCH3 og R<1> og R<2> er hver uavhengig lineær eller forgrenet CnH2nY, hvor n er 1 - 6, Y er H, F, Cl, Br, I, OH, OCH3, OC2H5, OC3H7, CN eller OCOCH3,

og hvor X" er et motanion og P er 1,2 eller 3,

men ikke inkluderer

en forbindelse hvor både A og B enten er -N(CH3)2 eller -N(CH2CH3)2, forbindelser hvor både A og B er -N(C4H 9) 2 og X" er bromid eller klorid; både A og B er

-N(C6Hi3)2 og X" er bromid; både A og B er N-(C3H7)2 og X" er klorid; A er -N(C2H5)2 eller -N(C2H5)(CH3) eller -N(C4H9)2 og B er -N(CH3)2 eller -N(C2H5)(CH3) og X" er klorid; og hvor A er -N(CH3)2 og B er

og Xp" er

jodid.

Fortrinnsvis velges motantionet fra et hvilket som helst av Cl", Br", I", F", N03", HSO4', CH3C02", eller et dianion, nemlig SO4<2>" eller HPO4<2>", eller et trianion, nemlig PO4<3>".

Fortrinnsvis er A og B de samme og både R<1> og R<2> er n-propyl, n-butyl eller n-pentyl.

Forbindelsen kan anvendes mot mikroorganismer. Fortrinnsvis anvendes forbindelsen mot bakterier. Mer foretrukket anvendes forbindelsen mot antibiotikaresistente bakterier.

I én utførelsesform av oppfinnelsen er forbindelsen for anvendelse som et PDT-middel eller som et fotodiagnostisk middel.

Videre frembringer den foreliggende oppfinnelsen et konjugat eller en kompositt dannet mellom en forbindelse ifølge det første aspekt av foreliggende oppfinnelse og en polymer valgt fra cellulose acetat, polyamider, polyakrylater, polyestere, polykarbonater og polyuretaner. Foretrukne polymerer inkluderer de som har anhydrid- og/eller estergrupper.

I tillegg frembringer den foreliggende oppfinnelsen en forbindelse dannet gjennom reaksjonen mellom en forbindelse ifølge det første aspekt av oppfinnelsen og et klortriazinderivat. Klortriazinderivatget kan være en polymer med klortriazingrupper påfestet.

I én utførelsesform er forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendt som et medikament.

Forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen er nyttige som fotosensitiviserende legemidler for PDT av tilstander hvor behandling krever fjerning av uønsket vev eller celler slik som cancer, precancerlidelser, øyesykdommer, vaskulære sykdommer, autoimmune sykdommer og proliferative tilstander av huden eller andre organer. Spesifikke og ufor-utsigelige fordeler av disse materialene er relatert til deres evne til å være fotoaktive mot mål vev ved forskjellige tider systemisk administrering (avhengig av den spesielle sensitiser anvendt), og derfor deres evne til å målrettes mot vaskulære eller tumorceller (for eksempel) direkte. De har også en lav tendens til å sensitivisere hud mot ambient lys når administrert systemisk og en lav tendens for farging av hud.

Forbindelsene kan også anvendes i PDT som fotoaktiverbare antimikrobielle behandlinger for hud og andre lokale infeksjoner, for sterilisering av brannsår og andre lesjoner, for sterilisering av både mottagervev og donert vev under organtransplantasjon inkludert hudtransplantasjon og for behandlingen av mikrobiell tannsykdom.

De nevnte forbindelsene er også nyttige som fotoaktiverbare antimikrobielle midler for generell sterilisering av overflater og væsker. Spesielle fordeler ved disse forbindelsene i forhold til eksisterende kjente antimikrobielle fotosensitisere, er deres høye fotocyto-toksisitet ved lave lysnivåer, kombinert med en lav tendens til å fotoblekes.

Videre har forbindelser ifølge den foreliggende forbindelsen fordelen, sammenlignet med andre fenothiazinium-fotosensitisere, at de ved utførelsen av deres celleødeleggende aktivitet ikke målretter kjernen til cellen slik at det er en langt lavere risiko for at cellene gjennomgår mutagene transformasjoner.

Den foreliggende oppfinnelsen frembringer også sammensetninger omfattende en forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen sammen med en fortynner eller et bindemiddel.

Eksempler på anvendelser av forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen er fotosensitiviserende legemidler for PDT for behandling av Barretts oesofagus og cervikal intra-epitaleal neoplasi (precancer lidelse), blærecancer og koloncancer, makuløs degenerering (en oftalmologisk lidelse), vaskulære problemer slik som kardiovaskulær sykdom, aterosklerose og restenose og autoimmunsykdommer slik som reumatoid artritt, hudsykdommer slik som psoriasis, akne og eksem og andre benigne tilstander slik som endometriose og menoragi. Forbindelsene kan også anvendes som antimikrobielle behandlinger for hud og sårinfeksjoner, andre lokale infeksjoner så vel som ved behandling av dental bakteriesykdom. Forbindelsene kan også anvendes ved fotokjemisk internalisering (anvendelsen av fotosensitisere for å assistere opptak og subcellulær lokalisering av legemidler) gjennom deres fotosensitiviserende egenskaper og ved ikke-terapeutiske anvendelser slik som ved fotodiagnose gjennom deres fluorescente egenskaper. Den siste tilnærmingen tar fordel av det faktum at fotosensitiseren konsentreres mer i tumorer enn i omkringliggende friskt vev og når indusert til fluorescens (ved anvendelse av blått lys), fluorescerer svulsten sterkere enn omkringliggende vev.

Forbindelsene kan anvendes som fotoaktiverte antimikrobielle midler for sterilisering av overflater og væsker.

I henhold til angår foreliggende oppfinnelse anvendelsen av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse for fremstilling av et preparat for behandling av cancer og andre humane eller animale sykdommer gjennom systemisk eller lokal administrering av fotosensitiseren, fulgt av anvendelse av lys i en egnet dose og bølgelengde eller bølgelengdeområde.

Fortrinnsvis er nevnte administrerte forbindelse en forbindelse der R<1> og R<2> er n-propyl, og fortrinnsvis gis nevnte lyseksponering opptil 10 minutter etter tidspunktet for legemiddeladministrering.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen gis lyseksponeringen innen 1 minutt etter legemiddeladministreringen.

Det er mest foretrukket at lyseksponderingen gis ved tidspunktet for legemiddeladministreringen.

Alternativt er forbindelsen som blir administrert en forbindelse ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen, der R<1> og R<2> er n-pentyl, og nevnte lyseksponering gis ved lengre tider fra tidspunktet for legemiddeladministrering.

Alternativt er forbindelsen som blir administrert en forbindelse ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen, der R<1> og R<2> er n-butyl.

Videre frembringer den foreliggende oppfinnelsen også anvendelsen av forbindelsene ifølge foreliggende søknad for sterilisering av en overflate eller en væske som omfatter applikasjon av forbindelsen ifølge den foreliggende oppfinnelsen til nevnte overflate eller væske og aktivering av nevnte forbindelse ved hjelp av lys.

Egnede forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan festes til polymeriske overflater, permanent ved kovalente bindinger eller reversibelt ved intérmolekylære interaksjoner, for derved å gi en overflate som kan steriliseres når påkrevd ved applikasjon av lys. Dette kan være nyttig for eksempel i forbindelse med intravenøse ledninger hos pasienter og i suturer og katetere og intravenøse ledninger, der oppretthol-deise av langsiktig sterilitet av de relevante overflatene er problematisk. Forbindelsenes motstand mot fotobleking er en fordel ved slike applikasjoner der forlenget stabilitet av kromoforen er påkrevd.

Den foreliggende oppfinnelsen frembringer også en artikkel med minst én overflate då-en forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen er festet.

Fortrinnsvis er artikkelen en medisinsk innretning slik som et venøst, urin- eller bal-longkateter, sutur, ortopedisk eller kunstig implantat, hjerteklaff, kirurgisk skrue eller spiker, pacemakerledning, mate- eller pustetube, vaskulær stent, intraokular linse eller små ledderstatninger. Artikkelen kan også være til anvendelse ved sårpleie og for pakking av materialer for medisinsk bruk, for eksempel materialer for medisinsk utstyr.

En forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelse kan anvendes på vegger, gulv og tak til sykehus, kliniske overflater slik som operasjonsbord, abbatoir og sterile rom i viten-skapelige laboratorier. Fibere kan konverteres til vevde, strikkede eller ikke-vevde tek-stilartikler slik som vaskekluter, tørk, kirurgiske dresser, sengetøy, sårbandasjer og for-binding.

Alternativt er artikkelen én for anvendelse i mat- og drikkeindustrien og kan være en artikkel for innpakking, en innpaknings- eller lagringskartong eller et stykke prosesse-ringsutstyr. Artikkelen kan være en kjøler, mat- eller drikkeautomat, ismaskin, en del av restaurantutstyr eller annet kjøkkenutstyr.

Den foreliggende oppfinnelsen er relatert til phenothiazium-sensitisere som viser en uventet og uttalt avhengighet av deres fotobiologiske egenskaper in vitro og in vivo i forhold til størrelsen og hydrofobisk karakter til substituentene på de terminale amino-gruppene. Ved nøye seleksjon av slike strukturelle trekk er fotosensitisere med distinkte fordeler i forhold til eksisterende materialer frembrakt. I henhold til dette overkommer forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen problemene til kjent teknikk ved å frembringe de følgende fordelene innen feltet onkologi og innen antimikrobielle virk-ninger:

Fordeler innen onkologi

• Ekstremt sterk fotoaktivitet sammenlignet med metylen og etylenblått.

• Lav absorpsjon av lys i UV/blå region. Dette resulterer i at forbindelsene har en lavere tilbøyelighet til hudfotosensitivitet.il*'- ;• Rask hudclearance ;• Høy selektivitet for tumorer ;• Lav mørk toksisitet ;• Lav potensial til DNA-skade sammenlignet med metylenblått ;• Meget kort legemiddel-til-lys-tidsintervall sammenlignet med eksisterende PDT-legemidler. ;Antimikrobielle fordeler ;• Meget effektiv i å deaktivere en bredde av en mikroorganisme, inkludert grampositive og gramnegative bakterier, MRSA og soppinnfeksjoner. ;• Aktiv mot quiescente bakterier. ;• Høy selektivitet for mikroorganismer med minimal skade av vertsvev. ;• Uventet lavt nivå av fotobleking. ;DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN ;Forbindelser undersøkt ;Fenothiazinium-forbindelsene som anvendes i denne studien ble syntetisert ved Leeds University Department of Colour Chemistry av J. Griffiths. De inkluderer de følgende: ;R<1> - R<4> = n-C3H7: tetra-n-propyl ;R<1> - R<4> = n- C4H9: tetra-n-butyl ;R<1> - R<4> = n- C5H11: tetra-n-pentyl ;R<1> - R<4> = n- C6Hi3: tetra-n-heksyl ;Metylenblått (R<1> - R<4> = n-CH3) og etylenblått (R<1> - R<4> = n-C2H5) ble også undersøkt for sammenligningsformål. ;Forrådsløsninger av fotosensitisere ble laget i vann og/eller DMSO og lagret i mørke inntil det ble behov for dem. Prøveløsninger ble laget i buffer eller løsemiddel eller biologisk medium etter behov. ;Spektrale og fysiske egenskaper til fenothiazmium-forbindelsene ;Spektraldata til fenothiazmium-forbindelsene i vann og metanol (tabell 1) viser at alle forbindelsene har absorpsjonstopper innen 650 - 700 nm-regionen, men at det er en vesentlig variasjon i toppens presise posisjon. Fenothiazinium-forbindelsene med lengre alkylkjeder har absorpsjonstopper ved lengre bølgelengder og topposisjonene er generelt ved lengre bølgelengder i vann sammenlignet med metanol. Disse forskjellene reflekterer sannsynligvis aggregasjonstilstanden til fotosensitiseme. ;Oktanol-vann-partisjonskoefifsientene ( logp) for de forskjellige fotosensitiseme er også vist i tabell 1, der ;;Oktanolbuffer-partisjonskoeffisienten ( logp) bestemmer lipofilisiteten til legemiddelet. Som antatt øker lipofilisiteten med økende R-verdi, men det bør anmerkes at selv for høyere verdier av R så forblir forbindelsene løselige i biologiske media. ;Fenothiazinium-derivater som PDT-midler for mammalske celler og tumorer ;Fenothiazimum-derivater ble evaluert for PDT-effektivitet i en serie mammalske celler i kultur. RIF-1 murine firbosarkomceller ble studert ved å bruke MTT-assay for å vurdere gjenværende celleviabilitet etter PDT. Data fra en serie av eksperimenter er oppsummert i tabell 2, som viser LD5o-verdiene (konsentrasjon av fotosensitiser nødvendig for å drepe halvparten av cellene under de anvendte betingelsene) for fire av fenothiazin-derivatene. For sammenligning er data for metylenblått og etylenblått også vist. Noen av disse forbindelsene er også i stand til å drepe celler i mørket og tabell 2 viser også forholdet til LD5o for "mørke" kontroller. Det kan ses fra tabell 2 at tetra-n-pentylderivatet, tetra-n-butylderivatet og tetra-n-propylderivatet alle er effektive PDT-midler under disse betingelsene og er mye mer aktive enn metylenblått eller etylenblått. Det mest effektive er tetra-n-propylderivatet. Det er også klart at mens det for metylenblått bare er et lite forhold mellom LD50 for mørke- og lystoksisitet, så er dette forholdet mye større for fenothiazinium-derivatene. ;Resultatene illustrerer den meget forøkede fotoaktivitet til disse forbindelsene, men også deres relative mangel på mørk toksisitet sammenlignet med metylenblått. Dette er en vesentlig fordel fra terapeutisk standpunkt. Tabell 2 viser også den relative aktiviteten til de forskjellige derivatene i sammenligning med metylenblått og etylenblått ved å bruke et mål på deres indre evne til å produsere singlet-oksygen. Det kan også ses at det er en meget liten forskjell mellom de forskjellige forbindelsene, noe som viser at den markerte forskjellen observert i celler nesten utelukkende skyldes biologiske faktorer hvis mekanisme fremdeles er ukjent. Tabell 2 viser også den initielle subcellulære lokaliseringen av de forskjellige fenothiazinium-forbindelsederivatene sammenlignet med de til metylenblått og etylenblått, så vel som enhver relokalisering som oppstår etter lys-administrering. Det er også verdt å legge merke til at mens derivatene initielt lokaliserer i lysosomer, så relokaliserer metylenblått til nukleus (med mulig ødeleggende eller mutagene effekter på DNA), mens tetra-n-propyl-, tetra-n-butyl-, tetra-n-pentyl- og tetra-n-heksylderivatene relokaliserer til mitokondria, som er et mye bedre PDT-mål. ;Tabell 3 viser LDso-verdier for noen av derivatene i en serie av forskjellige celler i kultur, som representerer forskjellige humane vev og cancere. Det er også klart at tetra-n-propyl-, tetra-n-butyl-, tetra-n-pentyl- og tetra-n-heksylderivatene igjen er høyt aktive sammenlignet med metylenblått og at de også er aktive i alle cellelinjene testet. ;Flere asymmetriske fenothiazinium-derivater (der R<1> = R<2> * R<3>=R<4>) har blitt fremstilt og testet i celler i kultur. Flere av disse har vist seg å være overlegne fotosensitisere i forhold til metylenblått, både i forhold til absolutt aktivitet og i forhold til lys- til mørk-toksisitetsforhold. Prøvedata på disse forbindelsene er vist i tabell 4.

Figur 1 viser antitumor fotodynamisk aktivitet (% tumornekrose) av symmetrisk substi-tuerte thiaziner av type (I). Hunn-CBA/Gy-mus med CaNT subkutane tumorer ble inji-sert med en løsning av legemiddelet ved en dose på 16,6 umol per kilogram. De ble be-handlet med optimal bølgelengde av lys (bestemt i separate eksperimenter) 1 time etter injeksjon. Lyskilden var en Patterson-lampe med egnede filtere som ga en båndbredde på 30 nm, og behandling var 60 J cm"<2> ved en rate på 50 mW cm"<2>. Det kan ses fra figur 1 at tumorrespons er meget avhengig av naturen til alkylgruppene, og tetra-n-pentyl- og tetra-butylderivatene var spesielt effektive sammenlignet med metylenblått. Figur 2 viser antitumor fotodynamisk effektivitet (% tumornekrose) for tetra-n-propyl-og tetra-n-pentylderivater som en funksjon av tidsintervallet mellom legemiddel og lys-administrering. Disse data viser en helt uventet forskjell mellom de to forbindelsene. Tetra-n-propylderivatet er meget aktivt ved meget korte legemiddel-lystidsintervaller (for eksempel ved å gi lys nesten umiddelbart etter legemiddeladministrering), mens tetra-n-pentylderivatet har en meget lav aktivitet ved meget korte tider, men meget høy aktivitet etter én time. Forklaringen på dette funnet er foreløpig ukjent, men disse forskjellige egenskapene kan klart utnyttes for forskjellige applikasjoner. For eksempel kan det rasktvirkende legemiddelet anvendes ved vaskulære behandlinger og det saktevir-kende legemiddelet anvendes ved tumorcellebehandilnger.

Figur 3 viser den relative hudfotosensitiviteten forårsaket av tetra-n-butyl- og tetra-n-pentylderivatene sammenlignet med polyhaematoprphyrin, PHP (ekvivalent med Photofrin). Photofrin er det nåværende ledende PDT-middelet for onkologi, men har den store ulempen at det forårsaker forlenget hudfotosensitivitet hos pasienter. I denne modellen er hudfotosensitivitet målt i forhold til økningen i øretykkelse 24 timer etter eksponering for legemiddel og lys. Figur 3 viser som forventet, at PHP viser et høyt nivå av hudfotosensitivitet, mens de to fenothiazinium-derivatene viser liten eller ingen hudfotosensitivitet. Disse to derivatene forårsaket også meget liten hudmisfarging etter administrering.

Foto-antimikrobiell aktivitet

Generelle metoder

Metodene gitt nedenfor er i forhold til E. coli, men disse er i det vesentlige de samme for andre bakterier studert, dvs. P. aeruginosa, S. aureus og MRSA.

Standard forberedelse av bakterier

Standardprotokollen forklart nedenfor ble modifisert som egnet i forhold til å studere variasjon av forskjellige eksperimentelle parametere.

100 ml næringsmedium (0,5% gjærekstrakt, 1,0% trypton vekt/volum) ble aseptisk inokulert med E. coli stamme DH5 og innkubert i en risteinkubator over natten ved 37°C. Inkubatoren ble satt på 250 omdreininger per minutt og en rotasjonsbevegelse på en 2,5 cm sirkel. Etter inkubering ble 10 ml av kulturen aseptisk overført til 200 ml næringsmedium og dyrket i en risteinkubator som beskrevet ovenfor til mid-log-fase. Cellene ble samlet ved sentrifugering (3000 omdreininger per minutt, 10 minutter) og

resuspendert i 0,1 M kaliumfosfatbuffer (pH 7,0) og sentrifugert igjen (3000 omdreininger per minutt, 10 minutter). Supernatanten ble kastet og pelleten resuspendert i 0,1M kaliumfosfatbuffer (pH 7,0) til en absorbans på 0,85 —0,90 ved 650 nm.

I eksperimentene som involverte bestrålning i næringsmedium ble bakteriecellene resuspendert i næringsmedium på dette punktet.

Bakteriell celleinaktiveringseksperimenter

25 ml av den preparerte cellesuspensjonen ble innkubert med 0,25 ml av en 0,1 mM for-rådsløsning av fotosensitiser i en 250 ml steril foliédekket konisk flaske. Suspensjonen ble innkubert i 30 minutter i mørket i en 37°C risteinkubator ved 250 omdreininger per minutt. Suspensjonen ble bestrålt av en 500 W halogenlampe med en distanse på 75 cm i 60 minutter, effekten av lampen var l,3mW/cm<2> som gir 4,68J/cm<2> per time belysning. 50 ml av de belyste og ikke-belyste prøvene av suspensjonen ble fjernet og fortynnet i 0,1M pH 7,0 kaliumfosfatbuffer. 50 ml av den fortynnede suspensjonen ble så platet på næringsagar (0,5% gjærekstrakt, 1,0% trypton, 2,0% agar vekt/volum) og innkubert over natten ved 37°C for å gi flere kolonidannende enheter mellom 30 og 300. Celleinaktivering ble så målt.

KontroUstudier som involverte plating av bakterier før og etter 30 minutters inkube-rings-trinnet uten noen fenothiazinium-forbindelser, men med 0,25 ml DMSO, viste ingen endring i CFU/ml. Belysning av bakteriekulturen alene uten noen fenothiazinium-forbindelser, men med 0,25 ml DMSO viste heller ingen endring i CFU. Ved belysning i næringsmedia viste kontrollforsøk en logio-økning i CFU/ml på 0,2 i løpet av timesbelysningen.

Noen bestrålinger ble utført med en laser når bakteriesuspensjonen ble belyst med en 665 nm Ceramoptec-diodearraylaser ved 0,1 W.

Fastsetting av virkningen av fenothiazinium- forbindelser på bakteriecellevekst

200 ml næringsmedium (0,5% gjærekstrakt, 1,0% trypton vekt/volum) i foliedekkede 250 ml koniske flasker ble aseptisk inokulert med 10 ml av en fullvokst bakteriekoloni. I tillegg inneholdt mediumet 1 ml av en 1 mM forrådsløsning av fenothiazinium-forbin-

deiser med en sluttkonsentrasjon på 10 uM, bortsett fra kontrollen som ikke inneholdt noen fenothiazinium-forbindelser, men 1,0 ml DMSO.

Suspensjonen ble innkubert ved 37°C og 250 omdreininger per minutt i en risteinkubator i mørket. 1 ml prøver ble tatt hver time i 6 timer og turbiditet basert på optisk tetthet ved 550 nm forårsaket av lysspredning ble målt. Kontrollstudier viser at denne bølgelengden er utenfor regionen for fotosensitiser-absorpsjon. Etter optisk tetmetsavlesninger ble 1 ml-prøvene spunnet i en MSE Micro-Centaur-sentrifuge (10000 g x 5 minutter) og absorbansspekteret til supernatanten ble lest spektrofotometrisk.

Lignende eksperimenter ble utført alene for tetra-n-butylderivatet, der bakterier ble til-latt å vokse uten fotosensitiser i 3 timer hvorpå fenothiazmium-forbindelsene ble lagt til. Påfølgende vekst ble monitorert som en funksjon av tid, både for eksponering til av lys og i mørket.

Fremstilling og lysindusert inaktivering av Candida albicans

For eksperimentene som involverte gjæret Candida albicans ble organismen dyrket i Sabouraud (oxoid) flytende medium til log-fase (cellene ble høstet etter 4 timers vekst). De ble så resuspendert til en optisk tetthet på 0,87 ved 650 nm, dette er ekvivalent med 7,0 log io CFU / ml sammenlignet med 8,5 log io CFU / ml anvendt for de andre orga-nismene. Belysningsprosedyren var den samme som den anvendt i de tidligere eksperimentene. Etter belysning ble gjæret platet ut på Sabouraud dextroseagar (oxoid) og innkubert i 24 timer ved 37°C for å måle kolonidannende enheter.

Fotobleking

0,25 ml av en 1 mM løsning av fotosensitiser, 0,25 ml av 10 mM tryptofan ble tilsatt 25 ml 60% metanol, 40% kaliumfosfatbuffer (pH 7,0). Eksperimentene ble også utført i fravær av tryptofan idet dette ble erstattet av 0,25 ml 60% metanol, 40% kaliumfosfatbuffer (pH 7,0).

Blandingen ble belyst som i celleinaktiveringseksperimentene ovenfor (l,3mW/cm<2>) i 60 minutter, prøver ble tatt hvert 15. minutt og spektra målt i et UV-synlig spektrofoto-meter mellom 500 nm og 700 nm. Ved høy lysdose var illumineringen 9mW/cm<2> i 60 minutter.

Resultater

Antibakterielle egenskaper til fenothiazinium- derivater

Figur 4 viser log-endring i kolonidannende enheter (CFTJ)/ml av E. coli innkubert i 30 minutter med 10 uM fenothiazinium-forbindelse og belyst i 60 minutter ved l,3mW/cm<2>. Data ble registrert i forhold til celleoverlevelse etter en 60 minutters belysning med en halogenlampe. Det kan ses at det er en vesentlig bakteriell inaktivering hvor trenden innen gruppen er en reduksjon fra metylenblått til etylenblått, fulgt av en økning på nesten 1000 ganger opptil tetra-n-butyl-fenothiazimum-derivatet. De lang-kjedede phenathiazinium-forbindelsene viser så redusert bakteriell celledrepeevne, slik at tetra-n-heksylderivatet er nesten inaktivt. Tetra-n-butyl-phenathiazin førte til den største endringen i kolonidannende enheter per ml 5,1 logio ekvivalent med en prosent-andel celleoverlevelse på 0,001%. Den laveste endring på 0,19 logio CFU ble oppnådd ved å bruke tetra-n-heksylderivatet som hadde en celleoverlevelse på 65,3%. Det var ingen celleinaktivering ved "bare lys"-kontrollen. Figur 5 viser log-endringen i CFU/ml av E. coli innkubert i 30 minutter med forskjellige konsentrasjoner av tetra-n-butyl-fenothiazinium-derivat og belysning i 15 minutter ved l,3mW/cm . 10 uM var den mest effektive konsentrasjonen testet for bakteriell inaktivering ved å bruke tetra-n-butyl-fenothiazinium-derivat. Log-endringen i CFU/ml ved denne konsentrasjonen var 4,59 Igoio enheter. Celledrepingsvirkninger ble oppnådd ved alle konsentrasjonene testet, men var redusert ved de lavere legemiddelkonsentrasjo-nene. Ved 50 uM er det en log-endring på 2,15 enheter som er redusert sammenlignet med 10 uM. Dette kan være forårsaket av fotosensitiseraggregeirng og derved lavere legemiddeldoser til cellene.

Mange antibiotika har en dårlig virkning på ikke-voksende eller stasjonære bakterier og det er viktig å vurdere evnen til fenothiazinium-forbindelsene til å inaktivere stasjonærfasebakterier. Under stasjonærperioden har cellen en tykkere peptidoglyan cellevegg og forskjeller i proteinmetabolisme og kan derfor være mindre mottagelig for den fotodynamiske effekten. Figur 6 viser log-endringen i CFU/ml for E. coli i stasjonær fase av vekst fulgt av inkubering i 30 minutter med 10 uM fenothiazinium-forbindelser og belyst i 60 minutter med l,3mW/cm<2>. Det kan ses at effektiviteten til tetra-n-propyl- og tetra-n-butylderivatene er bare svakt redusert i forhold til stasjonærfasebakterier, hvor igjen tetra-n-butylderivåtet er mest effektivt.

Inaktivering av bakterier kan være mer utfordrende i et terapeutisk miljø fordi sensitiseren kan binde fortrinnsvis til ekstracellulære proteiner snarere enn den bakterielle lipopolysakkaird-membranen. Dette ble testet ved å resuspendere bakteriene i nærings-mediet inneholdende mange faktorer som kan konkurrere med bakterieceller i forhold til fotosensitiserbinding. Figur 7 viser log-endring i CFU/ml for E. coli resuspendert i næringsmedium, der det kan ses at det er liten reduksjon i nivået på celledreping. Igjen har tetra-n-butyl-fenothiazinium-derivatet den høyeste antibakterielle aktiviteten.

Figur 8 viser log-endringen i CFU/ml til E. coli etter inkubering med 10 uM fenothiazinium-forbindelse i 30 minutter og belysning med laserlys (665 nm) i bare 4 minutter ved 0,1 W. Igjen ble det samme aktivitetsmønsteret blant fenothiazinium-derivatene sett og viste at virkningene er til stede med koherent laserlys. De potensielle fordelene med en laserkilde er økt nøyaktighet på lysdoser og kortere belysningstider.

Videre studier med laserlys viste at en log-endring på 5,69 CFU/ml kan oppnås med en 14 minutters belysning med 0,1 W med tetra-n-butyl-fenolhiazinium-derivatet og at etter en 20 minutters belysning er det en log-endring på nesten 8,5 enheter, selv om an-tallet CFU er for lite til å gjøre denne figuren statistisk pålitelig.

Opptak av fotosensitiseme inn i baktericellene er klart viktig for å bestemme fotoaktivitet. Figur 9 viser opptak av 10 uM fenothiazinium-forbindelser inn i E. co/i-celler etter en 30 minutters inkubering. Cellene ble vasket to ganger i 0,1M pH 7,0 kaliumfosfatbuffer for å fjerne ekstracellulær eller løst bundet sensitiser. Det kan ses at opptaket av fenothiazinium-forbindelsene er noe korrelert med fototoksisitet ved at tetra-n-butylderivatet er mest tatt opp av bakteriecellene. Korrelasjon mellom opptak og fotoaktivitet er imidlertid langt fra eksakt. For eksempel er forholdet mellom fotoaktiviteten og opptaket for tetra-n-butylderivatet mye større enn det for tetra-n-heksylderivatet. Disse for-holdene ville vært forventet å være de samme for alle derivatene hvis fotoaktiviteten kunne blitt forklart bare på basis av opptaket. Det er derfor klart at de ekstremt høye ak-tivitetene til tetra-n-butyl- og tetra-n-propylderivatene må skyldes andre tilleggsfaktorer som foreløpig er ukjent.

Data ikke vist har bevist at tetra-n-butylderivatet er opptatt meget raskt inn i E. coli: Det er ingen forskjeller i opptak mellom inkubasjonstider på 5 minutter og 30 minutter. Ved tilstedeværelsen av næringsmedium ble imidlertid opptaket funnet å være noe lavere og redusert i omfang.

Figur 10 viser log-endringen i CFU/ml til E. cø/i-celler innkubert med 10 uM tetra-n-butyl-fenothiazinium-derivat og så vasket med 0,1M pH 7,0 kaliumfosfatbuffer for å fjerne all ekstracellulær eller løst bundet fotosensitiser som kan ha en virkning på foto-toksisiteten. For belysning ble laserlys (665 nm) på 0,1 W brukt i 4 minutter. Resultatene viser at det er liten forskjell mellom log-endringen i CFU/ml mellom vaskede og uvaskede celler, noe som antyder at det er tett bundet fotosensitiser som forårsaker celledød. På det nåværende tidspunkt er den presise lokaliseringen av fotosensitiseren innen bakteriecellen ikke kjent, men den fotodynamiske virkningen er effektiv og ikke-overkommelig.

Data for virkningen av de forskjellige fenothiazinium-forbindelsene på veksten på en E. co/i-kultur i mørket sammenlignet med en kontroll er vist i figur 11. Inkubering ble utført i mørket ved 37°C i 6 timer og målingene var basert på turbiditet ved 550 nm som beskrevet tidligere. Alle kulturene som inneholder fenothiazinium-forbindelser viser redusert vekst sammenlignet med kontrollen der tetra-n-butyl-fenothiazinium-derivatet viste størst inhibering i antall celler i bakteriesuspensjonen. Det bør understrekes at denne mørkeinhiberingen er mange ganger mindre enn den observert for celler inaktivert i lys.

Videre arbeid ble utført med tetra-n-butylderivatet alene for å bestemme virkningen av fotosensitiser pluss lys på vekst av bakterier. Disse data, vist i figur 12, viser klart at for de voksende bakteriene med tillegg av fotosensitiser etter 3 timer er det fortsatt vekst i mørket, men fullstendig eliminering av vekst i lys. Dataene illustrerer igjen den meget kraftige fotobakteiredrepende virkningen av denne fotosensitiser. Figur 13 viser prosent celleoverlevelse av Pseudomonas aeruginosa etter inkubering med 10 uM tetra-n-butyl-fenotMazinium-derivat. Belysning var med laserlys (665 nm) med 0,1 W. P. aeruginosa er en gramnegativ organisme som vanligvis er assosiert med flere forskjellige hudtilstander, inkludert infeksjoner av sår og brannsår. Figuren viser at tetra-n-butyl-fenotWazinium-derivatet kan fotodynamisk inaktivere denne organismen ekstremt effektivt. En belysningstid på bare 2 minutter med laserlys (665 nm) med 0,1 W fører til mer enn 99% celledrap, mens økning av belysningstiden til 10 minutter gir nesten 4 logs celledrap. Kontrollstudier viste at det ikke er noen reduksjon i cellean-tall forårsaket av belysning alene i fraværet av fotosensitiser med 10 uM tetra-n-butyl-fenothiazinium-derivat. Figur 14 viser prosent celleoverlevelse av Staphylococcus aureus etter inkubering med 10 uM tetra-n-butyl-fenotMazinium. Belysning var med laserlys (665 nm) med 0,1 W. S. aurens er en grampositiv organisme som skiller seg fra gramnegative organismer i at den har et tykt ytre peptidoglykanlag og ingen ekstern lipopolysakkarid. Den bakterielle strukturen er den samme som i MRSA (Methicillinresistens S. aureus) som er resistent mot alle tradisjonelt anvendte antibiotika. Dataene viser at etter bare ett minutts belysning er nesten 99% av bakteriene inaktivert og at etter 10 minutter er det nesten 5 log celledrap, noe som illustrerer den meget høye fotoaktiviteten til tetra-n-butylderivat i forhold til den grampositive organismen.

Det er viktig å bestemme hvorvidt fotosensitiseren også ville være aktiv mot den antibiotikaresistente formen, MRSA, ettersom dette ville ha store helse- og industrielle applikasjoner. Figur 15 viser prosent celleoverlevelse av MRSA etter belysning med 665 nm laserlys med 0,1 W og inkubering med 10 uM tetra-n-butyl-fenothiazinium-derivat. Data viser klart at denne fotosensitiseren er meget fotoaktiv ved dreping av

MRSA.

Anti- fungale egenskaper til fenothiazinium- derivater

For å teste evnen til tetrabutylderivatene i å drepe soppceller i lys, så ble fotosensitiseren innkubert med Candida albicans- cellcr og kulturen ble underlagt laserlys som beskrevet ovenfor. Resultatene er vist i figur 16 der det er klart at denne organisme også lett ødelegges. Denne fotosensitiser er derfor meget fotoaktiv mot denne sopporganis-men som er ansvarlig for mange vanlige infeksjoner, for eksempel trøske.

Selektivitet for bakterieceller i forhold til mammalske vev

Det er klart viktig for terapeutiske formål at det er minimal skade på vertsvev mens mikroorganismer blir ødelagt. Dette ble testet ved å påføre en løsning av tetra-n-butyl-fenothiazinium-derivatet på ørene til forsøksmus og belysning under betingelser hvor den totale dosen var nesten 20 ganger den nødvendig for bakterie- eller soppelimine-ring. De mulige virkningene på vertsvevet ble vurdert ved å måle enhver økning i øretykkelse. Dette er en standardmodell for detektering av fotodynamiske reaksjoner i huden. Figur 17 viser data oppnådd sammenlignet med resultater fra intravenøs administrering av PHP, et legemiddel ekvivalent med Photofrin som er kjent å forårsake forlenget hudreaksjon. Det er klart ut fra figur 17 at, mens reaksjonen fra PHP er meget sterk, som forventet, så er det liten eller ingen reaksjon på tetra-n-butyl-fenothiazinium-derivatet, noe som antyder at mammalsk vev ikke vil bli ødelagt under antimikrobiell behandling.

Fotobleking

Fotobleking fjerner detekterbar farge fra fotosensitiseren og gjør den inaktiv og er resul-tatet av dens ustabilitet i forhold til lys og reduksjon eller oksidasjon. Slik fotobleking har mange fordeler og ulemper avhengig av den potensielle applikasjonen. For eksempel er fotobleking uønsket ved dekking av ledninger og katetere. To sett av eksperimenter ble utført, ett ved en høy lysdose (9,0mW/cm<2>) og ett ved en lav lysdose (l,3mW/- cm<2>) med og uten tryptofan som beskrevet ovenfor. Absorpsjonsspektra ved lav lysdose, med og uten tryptofan, viste ingen endringer for noen av fenothiazmium-forbindelsene, noe som viser at de er stabile ved denne dosen. Ved høy lysdose ble spektrale endringer observert for metylenblått, noe som indikerer fotobleking. Maksimum absorbans ble redusert og bølgelengdetoppen skiftet i løpet av 1 times-belysningen. Disse endringene oppsto i det samme omfang med og uten tryptofan. Ingen av de andre fenothiazinium-forbindelsene viste imidlertid denne degraderingen og forble stabile i forhold til fotobleking ved den høye lysdosen.

Fenothiazinium-forbindelser med struktur I egnet for inklusjon i polymerer eller festing til, eller adsorpsjon på polymeroverflater

(a) Inklusjon med polymerer

Eksempel

Til en klar løsning av cellulosetriacetat (0,5 g) i diklormetan (10 cm3) ble det tilsatt sensitiser (I, X = Y = n-Bu) og blandingen ble rørt til sensitiseren var fullstendig opp-løst. Løsningen ble så støpt på en glassplate og tørket sakte, noe som ga en klar, blå film. Filmen viste typiske singlet-oksygengenererende egenskaper ved eksponering for lys. Følgelig ble en luftet rød løsning med tetrafenylcyklopentadienon (en karakteristisk singlet-oksygendetektor) i toluen inneholdende filmen, raskt bleket ved eksponering for lys fra en 40W hingsten filamentlampe. En identisk løsning viste ingen bleking når den ble belyst i samme tidsperiode ved fravær av filmen.

(b) Adsorpsjon på polymerer

Fenothiazinium-forbindelse Ia og Ib ble laget i henhold til følgende reaksjonsskjema og ble isolert som mørk blå, faste stoffer. De ble karakterisert ved massespektrometri.

Forbindelsene (Ia og Ib) var ekstremt basiske og lett protonert i fortynnede syrer for å gi henholdsvis (Ila) og (Hb), som kunne adsorberes sterkt på polymeriske overflater, for eksempel polyamider, polyakrylater, polyestere, polykarbonater, polyuretaner og motsto sterkt fjerning med vann eller løsemidler. Alternativt kunne Ia eller Ib adsorberes direkte på sure overflater for å gi deres korresponderende kationiske salter direkte.

(c) Kovalent binding av fenothiazinium- sensitisere til polvmersubstrater Derivatene Ia og Ib

Forbindelsene Ia og Ib viste seg å være meget reaktive som nukleofiler i forskjellige substitusjonsreaksjoner som kunne frembringe et middel for festing av sensitiserenheten kovalent til polymerer.

Følgelig oppsto reaksjon med anhydrider, som eksemplifisert ved den følgende reaksjonen:

Eksempel:

Polyetylen-gra/f-malinsyreanhydrid (1,0 g) ble løst i toluen (25 cm<3>) ved varrning. Sensitiseren Ia (0,20 g) ble tilsatt til og reaksjonsblandingen oppvarmet med tilbakeløp i 1 time. Blandingen ble helt i metanol og presipitatet ble utfiltrert, vasket med metanol og tørket, noe som ga den sensitiserbundede kopolymeren i form av et mørkt blått pul-ver (1,1 g). Kovalent binding av sensitiseren til polymeren ble bekreftet ved oppløsning av pulveret i diklormetan og presipitering ved tillegg av metanol. Ingen blå farge forble i supernatantvæsken.

En lignende nukleofil substitusjonsreaksjon ville oppstå med polymerer inneholdende estergrupper, for eksempel:

Fenothiazinium-derivatene Ia og Ib er også meget reaktive i forhold til klortriazinderi-vater og deres binding til polymerer kan utføres ved hjelp av den følgende prosedyren:

der X = -NH-(polymer) i tilfellet polyamidpolymerer

X = -0-(polymer) i tilfellet cellulosepolymerer

Alternativt kan det gjenværende klor i det foregående eksemplet erstattes med en annen reaktiv gruppe, som i den følgende reaksjonen:

hvor X og Y = -NH-(polymer)

eller X og Y = -0-(polymer)

eller X kan være en amin-NHR eller -NRR', og Y = -NH-(polymer), eller -O-(polymer). Disse er ikke de eneste måtene å feste fenothiazinium-derivater til polymerer, og andre metoder kan anvendes basert på eksisterende polymer-"gratfing"-kjemi kjent for fagfolk innen feltet.

Eksempel:

Natriumkarbonat (0,20 g) og cyanurinklorid (0,30 g) ble tilsatt til en løsning av sensitiseren Ia (0,26 g) i tørr aceton (170 cm<3>) ved romtemperatur og blandingen ble rørt i 15 minutter. Et ark av transparent cellulosefilm (2,2 g) ble senket i en vandig løsning av natriumhydroksid (IM; 500 cm<3>) i 10 minutter og så vasket fri for natriurnhydroksid. Dette ble så introdusert inn i sensitiserløsningen og den rørte blandingen varmet ved 50°C i 15 minutter. Vann (200 ml) ble tilsatt og blandingen varmet ved 60°C i 30 minutter. Den blå cellulosefilmen ble så fjernet og vasket med vann og så varmet i natrium-karbonatløsning (6%) for å fjerne ufiksert fargestoff. Kovalent binding av cellulosen ble bekreftet ved vanning av filmen i kokende natriumkarbonatløsning eller kokende metanol, når det ikke ble fjernet noe blå farge. Filmen viste typisk singlet-oksygengenererende egenskaper ved eksponering for lys og når nedsenket i en luftmettet løsning av tetrafenylcyklopentadienon i toluen og eksponert for lys fra en 40W tungsten filamentlampe, den røde dienonen ble bleket raskere enn en identisk løsning som ikke inneholdt noen film.

REFERANSER

Wainwright M, Phoenix DA, Laycock SL, Wareing DRA, Wright PA. (1998). Photobactericidal activity of fenothiazinium dyes against methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters 160,177-181.

Wagner SJ, Skripchenko A, Robinette D, Foley JW, Cincotta L (1998). Factors affecting virus photoinactivation by a series of fenothiazine dyes. Photochemistry and Photobiology 67,343-349. Celler ble innkubert med fenothiazinet i 2 timer. For måling av fototoksisitet ble cellene belyst med 3J /cm2 lys (10mW /cm<2>) 665 nm lys. Mørketoksisitet ble målt parallelt. Celleoverlevelse ble bedømt etter 48 timer ved å bruke sulforhodarnin B (SRB)-assayet.

Claims

1. Fenolhiazinium-forbindelse ifølge formel (I): hvor A og B er hver uavhengig hvor Z er CH2,0, S, S02, NH, NCH3, NC2H5, NCH2CH2OH eller NCOCH3 og R<1> og R er hver uavhengig lineær eller forgrenet CnH2„Y, hvor n er 1 - 6, Y er H, F, Cl, Br, I, OH, OCH3, OC2H5, OC3H7, CN eller OCOCH3, og hvor X" er et motanion og P er 1,2 eller 3, men ikke inkluderer en forbindelse hvor både A og B enten er -N(CH3)2 eller -N(CH2CH3)2, forbindelser hvor både A og B er -N(C4H 9)2 og X" er bromid eller klorid; både A og B er -N(C6Hi3)2 og X" er bromid; både A og B er N-(C3H7)2 og X" er klorid; A er -N(C2H5)2 eller -N(C2H5)(CH3) eller -N(C4H9)2 og B er -N(CH3)2 eller -N(C2H5)(CH3) og X" er klorid; og hvor A er -N(CH3)2 og B er og X" er jodid.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at motanionet velges fra et hvilket som helst av Cl", Br", I", F", NO3", HSO4", CH3CCV, eller et dianion, nemlig SO4<2>" eller HPO4<2>", eller et trianion, nemlig PO4<3>".

3. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at A og B er de samme og både R<1> og R<2> er n-propyl, n-butyl eller n-pentyl.

4. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene til anvendelse mot mikroorganismer.

5. Forbindelse ifølge krav 4 for anvendelse mot bakterier.

6. Forbindelse ifølge krav 4 eller 5 til anvendelse mot antibiotikaresistente bakterier.

7. Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-3 for anvendelse som et PDT-middel eller et fotodiagnostisk middel.

8. Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 - 3 for anvendelse som et medikament.

9. Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 - 3 for anvendelse som en antimikrobiell behandling av hud- og andre lokale infeksjoner, for sterilisering av brannsår og andre lesjoner, og for behandlingen av dental bakteriesykdom.

10. Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 - 3 for anvendelse ved behandlingen av precancertilstander, cancer, oftalmologiske sykdommer inkludert makuløs degenerering, vaskulære problemer slik som kardiovaskulær sykdom, aterosklerose og restenose og autoimmune sykdommer slik som reumatoid artritt, hudsykdommer slik som psoriasis, akne og eksem og andre benigne tilstander slik som endometriose og menoragi.

11. Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 - 3 for anvendelse som et fotoaktivert antimikrobielt middel for sterilisering av overflater og væsker.

12. Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 - 3 for anvendelse ved fotokjemisk internalisering.

13. Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 - 3 for anvendelse ved fotodeteksjon og/eller fotodiagnose.

14. Konjugat eller kompositt omfattende en forbindelse med formel (I) som angitt i hvilket som helst av kravene 1-3 inkludert inn i, festet til eller absorbert på en polymer valgt fra cellulose acetat, polyamider, polyakrylater, polyestere, polykarbonater og polyuretaner.

15. Konjugat eller kompositt ifølge krav 14, karakterisert ved at polymeren inkluderer anhydrid-og/eller estergrupper.

16. Forbindelse dannet ved reaksjonen mellom en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 3 og et klortriazinderivat.

17. Forbindelse ifølge krav 16, karakterisert ved at klortrizinderivatet er en polymer med klortriazingrupper festet dertil.

18. Sammensetning omfattende en forbindelse, konjugat eller kompositt ifølge hvilket som helst av kravene 1-17 sammen med en fortynner eller bindemiddel.

19. Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-3 for anvendelse ved behandling av precancertilstander, cancer, oftalmologiske sykdommer inkludert makular degenerering, vaskulære problemer slik som kardiovaskulær sykdom, aterosklerose og restenose og autoimmune sykdommer slik som reumatoid artritt, hudsykdommer slik psoriasis, akne og eksem og andre benigne tilstander slik som endometriose og menarogi, hvor et individ blir administrert en terapeutisk effektiv mengde av nevnte forbindelse for deretter å bli eksponert for lys for aktivering av nevnte forbindelse.

20. Forbindelse ifølge krav 19, karakterisert ved at nevnte administrerte forbindelse er som definert i krav 3 hvor R<1> og R<2> er n-propyl og nevnte lyseksponering blir gitt opptil 10 minutter etter tidspunktet for legemiddeladministrering.

21. Forbindelse ifølge krav 20, karakterisert ved at lyseksponering gis innen ett minutt etter legemiddeladministeringen.

22. Forbindelse ifølge krav 20, karakterisert ved at lyseksponering gis ved tidspunktet for legemiddeladministrering.

23. Forbindelse ifølge krav 19, karakterisert ved at forbindelsen administrert er som definert i krav 4 hvor R<1> og R<2> er n-pentyl og nevnte lyseksponering er gitt opptil 1 time etter tidspunktet for legemiddeladministrering.

24. Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-3 for anvendelse ved behandling av mikrobielle infeksjoner, brannsår og andre lesjoner og for dental bakteriell sykdom, hvor en terapeutisk effektiv mengde av nevnte forbindelse blir applisert på det området som skal behandles med påfølgende lys eksponering av nevnte område for aktivering av nevnte forbindelse.

25. Forbindelse ifølge krav 24, karakterisert ved at den appliserte forbindelsen er som definert i krav 5 hvor R<1> og R<2> er n-butyl.

26. Anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-3 for sterilisering av overflater eller en væske omfattende applikasjon av nevnte forbindelse til nevnte overflate eller væske og aktivering av nevnte forbindelse ved hjelp av lys.

27. Artikkel med minst én overflate hvor det er festet en forbindelse, konjugat eller kompositt ifølge hvilket som helst av kravene 1-3.

28. Artikkel ifølge krav 27, karakterisert ved at festingen er ved kovalente bindinger eller ved interrnolekylære interaksjoner.

29. Artikkel ifølge krav 27 eller krav 28, karakterisert v e d at artikkelen er en medisinsk innretning valgt fra; venøst, urin- eller ballong-kateter, sutur, ortopedisk eller kunstig implantat, hjerteklaff, kirurgisk skrue eller spiker, pacemakerledning, mate- eller pustetube, vaskulær stent, intraokular linse eller små ledderstatninger, eller for anvendelse ved sårpleie og for pakking av materialer for medisinsk bruk.

30. Artikkel ifølge krav 27 eller 28 for anvendelse i mat- og drikkeindustrien valgt fra; en artikkel for innpakking, en innpaknings- eller lagringskartong eller et stykke prosesse-ringsutstyr, en kjøler, vareautomat, ismaskin, en del av restaurantutstyr eller annet kjøkkenutstyr.