NO315687B1 - Anvendelse av nebivolol for fremstilling av et anti-aterogent middel - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et a-a'-iminobis(metylen)bis[2-kroraanmetanol]-derivat for fremstilling av et medikament for terapeutisk eller profylaktisk behandling av degenerative sykdommer i vaskulær- og nervesystemet forbundet med oksidativt stress.

a, a'-iminobis(metylen)bis[2-kromanmetanol]-derivater er beskrevet i EP-0.145.067 som fi-1 -blokkerende midler med terapeutisk potensial for behandling av hypertensjon. Nebivolol, som består av en racemisk blanding av (RSSS)- og (SRRR)-a,a<»->iminobis(metylen)bis[6-fluor-2-kromanmetanol], beskrives generisk deri. Nebivolol er beskrevet spesielt i EP-0.334.429, og deri ble det vist at (SRRR)-enantiomeren er et kraftig og selektivt {3-1 -blokkerende middel, mens (RSSS)-enantiomeren viste seg å ikke være et kraftig p-1-blokkerende middel, men en potensiator for en serie antihy-pertensive midler, så som atenolol, propanolol, prazosin, hydralazin og, interessant nok, også sin egen (SRRR)-enan-tiomer. I mellomtiden har påfølgende undersøkelser vist

at flere velgjørende hemodynamiske virkninger av nebiovolol som atskiller dem fra andre p-l-blokkerende midler, for eksempel at det akutt senker blodtrykket i spontant nyperten-sive rotter, reduserer totalperifer vaskulær motstand og

øker slagvolumet i anesteserte hunder, til en stor grad kan tilskrives (RSSS)-enantiomeren.

Eksperimenter viser nå at a,a'-iminobis(metylen)bis[2-kro-manmetanol] -derivater har kraftig antioksidativ virkning både in vitro og in vivo. Sannsynligvis er dette bare den andre gruppe av (3-1-blokkerere etter karvedilol og dens metabolitter som oppviser antioksiderende egenskaper in vitro og in vivo, med den forskjell at a,a'-imino bis(mety-len) bis [2-kromanmetanol] -derivater synes å være mer poten-te. I lys av sine antioksidative egenskaper vil a,a'-imi-nobis (metylen) bis [2-kromanmetanol] -derivater kunne anvendes terapeutisk ved behandling av degenerative sykdommer i vaskulær- og nervesystemet, som skyldes oksidativt stress. Følgelig vedrører foreliggende oppfinnelse anvendelsen av a,a<1->iminobis(metylen)bis[2-kromanmetanol]-derivater de farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter, de stereokjem-isk isomere former og enhver blanding av nevnte derivater, salter og stereoisomerer, for fremstilling av et medikament for terapeutisk eller profylaktisk behandling av generative sykdommer i vaskulær- og nervesystemet som er forbundet med oksidativt stress, og disse derivater har formelen (I)

hvorR<1>ogR<3>hver uavhengig representerer fluor, hydroksy eller hydrogen,R<2>og R<4>hver uavhengig representerer hydrogen eller hydroksy, og hver stjerne indikerer et stereo-gent senter.

Pasienter som lider av degenerative sykdommer i vaskulær-og nervesystemet, hvilke er forbundet med oksidativt stress, kan administreres en mengde av et a,a<1->iminobis-(metylen)bis[2-kromanmetanol]-derivater som er virksomt når det gjelder å forbedre, stoppe, forsinke eller lindre for-løpet og/eller virkningene av og degenerative sykdommer.

Man mente tidligere at forbindelsene hvor R<1>ogR<3>representerer hydroksy, og R<2>og R<*>representerer hydrogen, var hovedmetabolittene som ble dannet fra de tilsvarende forbindelser hvor R<1>og R<3>representerer fluor, men meget ny-lige funn viser at det er det ikke. Ikke desto mindre har disse pseudo-metabolitter faktisk kraftig antioksiderende virkning.

Spesifikke forbindelser ifølge forbindelsen innbefatter: (RSSS) og (SRRR)-a,a"-iminobis(metylen)bis[6-fluor-2-kroman-metanol], hvis racemiske blanding generisk er kjent som nebivolol, dens enkelte enantiomerer, (RSSS)-og(SRRR)-a,a1 - iminobis (metylen)bis [6-hydroksy-2-kroman-metanol] :

[(RSSS)+(RSRR)+(SRSS)+(SRRR)]-a-[[[2-(kroman-2-yl)-2-hydroksyetyl] amino] -metyl] -6-hydroksy-2-kroman-metanol etan-diota (1:1);

[(SRSR)+(SRRS)-(RSSR)]-a,a'-iminobis(metylen)bis[6-hydroksy- 2-kromanmetanol] , og

[(RRSR)+(RRRS)+(SSSR)]-a-[[[2-(kroman-2-yl)-2-hydroksyetyl]amino]metyl]-6-hydroksy-2-kroman-metanol-etandioat-(1:1) .

Forbindelsene med formel (X) kan fremstilles ifølge fremgangsmåter beskrevet i EP-0,145,067 og EP-0,334,429. Siden de har basiske egenskaper, kan disse forbindelser omdannes til sine farmasøytisk akseptable syreaddisjonssaltformer ved behandling med en egnet syre. Egnede syrer omfatter for eksempel uorganiske syrer, så som hydrohalosyrer, for eksempel saltsyre eller hydrobromsyre; svovelsyre; salpe-tersyre; fosforsyre og lignende syrer; eller organiske syrer, så som for eksempel eddiksyre, propansyre, hydroksy-eddiksyre, melkesyre, pyrodruesyre, oksalsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, eplesyre, vinsyre, sitron-syre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, benzensulfonsyre, p-toluensulfonsyre, cyklaminsyre, salisylsyre, p-aminosali-cylsyre, pamoasyre og lignende syrer. Uttrykket addisjons-salt anvendt ovenfor, omfatter også solvatene som forbindelsene med formel (I) samt saltene derav, er i stand til å danne. Slike solvater er for eksempel hydrater, alkohol-ater og lignende. Det foretrukne syreaddisjonssalt av nebivolol er hydrokloridsaltet. Salter som ikke er farmasøy-tisk akseptable, kan være nyttige ved fremstillingen av forbindelsene med formel ((I) og sammensetninger omfattende slike forbindelser.

Oksidativt stress refererer til et fenomen relatert til virkningen, spesielt de skadelige virkninger, av endogene sterke oksidanter innen vev. Endogene sterke oksidanter er for eksempel (02-)', hydrogenperoksid (H202) og hydroksyl- radikalet (HO ) . Vevet kan være sentralt, perifert eller medulært og tilhører spesielt vaskulærsystemet, nervesystemet, nyrene, pankreas, paratyroidkjertlene og gonadene. Oksidativ skade på vevsceller tilskrives lipidperoksidasjon, som leder til forandringer i cellemembranintegriteten og funksjonen. Endotelial skade av frie radikaler avledet fra oksygen anses for tiden generelt å være nøkkeltrinnet i initieringen og progresjonen av aterosklerose og beslektede vaskulære sykdommer.

Terapeutisk behandling omfatter administrasjon av en forbindelse med formel (I) i en mengde som er effektiv når det gjelder å forbedre, stoppe, forsinke eller lindre forløpet og/eller virkningene av degenerative sykdommer i vaskulær-og nervesystemet. Profylaktisk behandling omfatter administrasjon av en sådan forbindelse i en mengde som er effektiv for å forhindre eller forsinke utbruddet og utvik-lingen av eller degenerative sykdommer i vaskulær- og nervesystemet .

Den antioksiderende aktivitet av a,a'-iminobis(metylen)bis-[2-kromanmetanol]-derivater kan vises in vitro ved deres evne til å fjerne frie radikaler (hydroksyl-, superoksid-og nitrogenoksidradikaler) og således forhindre radikal-mediert lipidperoksidasjon og cytotoksisitet. I kulturer med nevronalceller kan de effektivt erstatte det kjente endogene antiokdative vitamin E (a-tocoferol). Forbindelsene kan også etterligne virkningen av superoksiddismutase (SOD) ved at de fjerner superoksid (02~)". Den antioksiderende virkning av forskjellige stereoisomerer av forbindelsene med formel (I) er tilsvarende. Den antioksiderende virkning av forbindelsene med formel (I) er proporsjonal med antall nærværende hydroksygrupper.

Et spesielt interessant funn er at forbindelsene hvor i det minste en av R<1>"<4>representerer hydroksyl, doseavhengig hemmer dannelsen av oksidert humant lavdensitets lipoprotein (oks-LDL) i mikromolare mengder in vitro. Oksidert LDL er medvirkende i aterogenese, samt dannelsen av oksiderte membranlipider. Fig. 1 viser fasene som kan skjelnes ved dannelsen av oksidert LDL; Fig. 2 viser dannelsen av oksidert LDL in vitro under kontrollerte betingelser og i nærvær av aktive medisiner.

Siden hydroksylering er en viktig enzymatisk reaksjon i me-tabolismen av nebivolol, kan man forutse at i lys av den antioksidative virkning av dens hydroksyanaloger vil nebivolol ha viktige beskyttende virkninger mot oksidativ skade in vivo.

Dette stadfestes ved en ytterst uventet observasjon i en in vivo-test, nemlig at i testdyr som er behandlet kronisk med nebivolol, undertrykkes den normale aldring av det vaskulære system, hvilket kan iakttas i kontrolldyr, dvs. at ald-ringsprosessen i behandlede dyr tydelig forsinkes.

Sykdommer og tilstander i vaskulær- og nervesystemet som er forbundet med oksidativt stress, og som anses å være motta-gelig for behandling med forbindelsene med formel (I), er normal og patologisk degenerasjon av vaskulærsysternet, så som aterogenese, ateromatose (fett-degenerasjon i arteri-enes endothelium), arteriosklerose, aterosklerose, vaskulær hypertrofi forbundet med hypertensjon, hyperlipoproteinemi og normal vaskulær degenerasjon ved aldring; vaskulopatologi av gonadene og pankreas; paratyroid reaktiv hyperplasi; og kronisk renal sykdom; i neoplastiske sykdommer,- og i inflammatoriske sykdommer.

Videre kan forbindelsene med formel (I) også ha terapeutisk verdi når det gjelder å forhindre eller behandle nevronalt tap fra nervesystemet, spesielt det perifere nervesystem, hvilket er forbundet med oksidativ skade eller slitasje, for eksempel ved tromboembolisk slag, cerebralt slag, he-morragisk slag, cerebral ischemi, cerebral vasmospasme, ce rebral aldring, cerebralt eller spinalt trauma, hjerte-stans, arteriell hypotensjon, hjerte- eller pulmonar-kirur-gi, alvorlig hyperglykemi, anoksi, hypoksi, perinatal as-fyksi; og ved lindring av nevrogenerative forstyrrelser hvor oksidative metaboliske prosesser spiller en rolle, så som Huntingtons chorea, Alzheimers sykdom, senil demens, Picks sykdom, Korsakoffs sykdom, olivopontoscerebellar-atropi, amyotropisk bilateral sklerose, Parkinsons sykdom, Downs syndrom, glutarisk acidemid, epilepsi, konvulsive tilstander, multi-infarkt demens, viral-infeksjonsindusert nevrodegenerasjon, for eksempel nevro-AIDS omfattende demens, kognitive vanskeligheter, nevro- og myopatier forbundet med HIV-infeksjon, rabies, meslinger og tetanus.

Aterogenese er en kompleks prosess som kjennetegnes ved at det opphopes kolesterol i makrofagene som forekommer i ar-terieveggen. Makrofagene tar opp oksidert LDL via fjern-ereseptor som i motsetning til den normale LDL-reseptor ikke reguleres av det cellulære kolesterolinnhold. Mangelen på reguleringsmekanisme resulterer i cellulær koleste-roloppsamling og skumcelledannelse. Oksidert LDL er blitt oppdaget in vivo i områder nær den aterosklerotiske lesjon (for en oversikt, se Jackson, R.L. et al.(1993), Medicinal Research Reviews 13, 161-162). LDL-oksidasjon innbefatter lipidperoksidasjon, aldehyddannelse, protein-fragmentering og forbruk av LDL-partikkelforbundet vitamin E.

Auto-antistoffer mot oksidert LDL er blitt identifisert i mennesker. Deres titer er en uavhengig prediktor av progresjonen av karotid aterosklerose (Salonen, J.T. et al.

(1992), The Lancet 339. nr. 8798, 883-887). Videre er mot-tageligheten for LDL-oksidasjon forbundet med alvorlig ko-ronaraterosklerose (Regnstrøm, J. et al. (1992), The Lancet 339. nr. 8803, 1183-1186). Enhver antioksiderende egenskap som tilskrives en kardiova-skulærbeskyttende medisin i tillegg til dens andre farmako-logiske egenskaper, forsterker dens terapeutiske virkning når det gjelder å forhindre progresjonen av den ateroskle-

rotiske prosess.

Dataene i eksempel 1 i det følgende viser at hydroksyanalogene av nebivolol har en omfattende antioksiderende virkning på humant LDL. Konsentrasjonene anvendt in vi tro var høye (2uM) , men uten betydning for sammenligningen med in vivo-betingelsene. Faktisk er det slik at både vitamin E og det kjente antioksiderende og hipolipidemiske middel probucol har vist seg å være inkorporert i lipidfasen av LDL-partikkelen i et tidsintervall på flere uker (Reaven, P.D. et al. (1992), Artheriosclerosis and Thrombosis, 12, nr. 3.318.324; Kagan, V.E. et al. (1992), J. Lip. Res., 33, 385-397). Den korte varighet i eksperimentet i eksempel 1, stimulerte ikke denne in vivo-situasjonen. Fordelingen av medisinene mellom den vandige fase og lipidfasen av LDL-partiklene oppnådde sannsynligvis ikke ekvilibrium, slik at den antioksidative evne hos disse lipidløselige medisiner ble undervurdert, som bevist ved den meget høye konsentrasjon som var nødvendig av vitamin E, referanseforbindelsen (fig. 2).

Kvalitativt er virkningen av nebivolol-hydroksyanalogene og av vitamin E lik. Begge forsinker oksidasjonen av LDL, og oksidasjonen starter bare etter forbruket av anti-oksidant-ene som foreligger i undersøkelsessysternet.

Farmasøytiske sammensetninger av forbindelsene med formel (I) som er egnet som medikamenter ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter en eller flere eksipienser eller bærerstoffer som er kjent i faget. Ved egnet valg av en eller flere av disse eksipienser eller bærerstoffer tilpasses de farmasøytiske sammensetninger for oral, rektal, vaginal, topisk, parenteral (inklusive intramuskulær, subkutan og intravenøs) eller implanterende administrasjon eller i en form som er egnet for administrasjon ved inhalering eller insufflasjon. Formuleringene kan med fordel gis i avdelte doseringsenheter.

Fremgangsmåtene for å fremstille slike sammensetninger er velkjente i faget, og de kjennetegnes ved at den aktive ingrediens og eksipiensen blandes grundig med hverandre. Alle fremgangsmåter innbefatter trinnet å bringe den aktive forbindelse sammen med flytende eller finfordelte faste bærerstoffer eller begge deler og deretter, hvis nødvendig, forme produktet til den ønskede formulering.

For oral administrasjon kan de farmasøytiske sammensetninger ha form av en fast doseringsform, for eksempel tab-letter eller kapsler fremstilt med konvensjonelle midler med farmasøytisk akseptable eksipienser, så som bindemidler (for eksempel pre-gelatinisert stivelse, polyvinylpyrroli-don eller hydroksypropylmetylcellulose); fyllstoffer (for eksempel laktose, mikrokrystallinsk cellulose eller kal-siumfosfat); smøremidler (for eksempel magnesiumstearat, talkum eller kisel); desintegreringsmidler (for eksempel potetstivelse eller natriumstivelseglykolat); eller fukte-midler (for eksempel natriumlaurylsulfat). Tablettene kan være belagt ved fremgangsmåter som er kjent i faget.

Flytende preparater for oral administrasjon kan ha form av for eksempel oppløsninger, siruper eller suspensjoner, eller de kan foreligge som et tørt produkt for konstitusjon med vann eller et annet egnet vehikkel før anvendelsen. Slike flytende preparater kan fremstilles på konvensjonell måte med farmasøytisk akseptable additiver, så som suspensjonsmidler (for eksempel sorbitolsirup, metylcellulose eller hydrogenert spiselig fett); emulgeringsmidler (for eksempel lecitin eller akasia); ikke-vandige vehikkel (for eksempel mandelolje, oljeestere eller etyl-alkohol); og konserveringsmidler (for eksempel metyl eller propyl-p-hyd-roksybenzoater eller sorbinsyre).

For topisk administrasjon i munnen, kan de farmasøytiske sammensetninger ha form av bukkale eller sublinguale tab-letter, dråper eller sugetabletter formulert på konvensjonell måte.

For topisk administrasjon til epidermen kan forbindelsene formuleres som kremer, geler, salver eller lotioner eller som transdermale puter. Slike sammensetninger kan for eksempel formuleres med en vandig eller oljeaktig base med tilsetning av egnede fortykningsmidler, geleringsmidler, emulgeringsmidler, stabiliseringsmidler, dispergeringsmidler, suspensjonsmidler og/eller fargemidler.

Forbindelsene med formel (I) kan også formuleres som depot-preparater. Slike langtidsvirkende formuleringer kan administreres ved implantasjon (for eksempel subkutant eller intramuskulært) eller ved intramuskulær injeksjon. På denne måten kan for eksempel forbindelsene formuleres med egnede polymere eller hydrofobe materialer (for eksempel som en emulsjon i en akseptabel olje) eller en ionebytter-harpiks, eller som tungtoppløselige derivater, for eksempel som et tungtoppløselig salt.

Forbindelsene med formel (I) kan formuleres for parenteral administrasjon ved injeksjon, med fordel intravenøst, intramuskulær eller subkutaninjeksjon, for eksempel ved bo-lusinjeksjon eller kontinuerlig intravenøs infusjon. Formuleringer for injeksjon kan gis i enhetsdoseform, for eksempel i ampuller, eller i multidosebeholdere med et tilsatt konserveringsmiddel. Sammensetningene kan ha slike former som suspensjoner, oppløsninger eller emulsjoner i oljeaktige eller vandige vehikler, og de kan inneholde for-muler ingsmidler, så som suspensjonsmidler, stabiliseringsmidler og/eller dispergeringsmidler. Alternativt kan den aktive ingrediens være i pulverform for konstitusjon med et egnet vehikkel, for eksempel sterilt pyrogenfritt vann.

Forbindelsene med formel (I) kan også formuleres til rek-tale sammensetninger, så som suppositorier eller reten-sjonsenemaer, for eksempel inneholdende konvensjonelle sup-positoriebasiser, så som kakaosmør eller andre glyserider.

For intranasal administrasjon kan forbindelsene med formel (I) anvendes for eksempel som en flytende spray, som et pulver eller i form av dråper.

For administrasjon ved inhalering gis forbindelsene med formel (I) med fordel i form av en aerosolsprayformulering fra pakninger under trykk eller en forstøver, ved hjelp av et egnet drivstoff, for eksempel diklordifluormetan, tri-klorfluormetan, diklortetrafluoretan, 1,1,1,2-tetra-fluo-ret an, karbondioksid eller en annen egnet gass. Når det gjelder en aerosol under trykk, kan doseringsenheten be-stemmes ved å tilveiebringe en ventil for å levere en av-målt mengde. Kapsler og patroner av for eksempel gelatin for anvendelse i et inhaleringsapparat eller en insufflator kan formuleres inneholdende en pulverblanding av en forbindelse ifølge oppfinnelsen og en egnet pulverbasis så som laktose eller stivelse. Alle farmasøytiske sammensetninger beskrevet ovenfor kan gis på konvensjonell måte forbundet med kontrollerte frigivelsesformer.

For å øke biotilgjengeligheten av forbindelsene med formel (I) kan de med fordel formuleres med egnede syklodekstriner. Egnede syklodekstriner er a-,p-,y-syklodekstriner, eller etere, eller blandede etere derav hvor en eller flere av hydroksygruppene i anhydrogluseenhetene i syklodekstrinet er substituert med Ci-6alkyl, spesielt metyl, etyl eller isopropyl; hydroksyCi-6alkyl, spesielt hydroksyetyl, hydroksypropyl eller hydroksybutyl; karboksyCi-6alkyl, spesielt karboksymetyl eller karboksyetyl; d-6alkylkarbonyl, spesielt acetyl; Cxe-alkyloksykarbonyl-Ci-galkyl eller karboksy-Ci-6alkyloksyCi-6alkyl, spesielt karboksymetoksypropyl eller karboksyetoksypropyl; Ci-6alkylkarbonyloksyCi-6alkyl, spesielt 2-acetyloksypropyl.

Spesielt bemerkelsesverdig som kompleksdannere og/eller so-lubiliseringsmidler er p-CD, 2,6-dimetyl-p-CD, 2-hydroksyetyl-p-CDm 2-hydroksyetyl-y-CD, 2-hydroksypropyl-y-CD og (2-karboksy-metoksypropyl-p-CD, og spesielt 2-hydroksypropyl-p-CD, og spesielt 2-hydroksypropyl-p-CD <2-HP-p-CD). Det mest foretrukne syklodekstrinderivat for anvendelse i sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse er 2-hydroksypropyl-p-syklodekstrin med en gjennomsnittlig molar substitusjon (M.S.) i området fra 0,35 til 0,50 (bestemt ved massespektroskopi) og inneholdende mindre enn1,5 % usubstituert p-syklodekstrin. M.S.-verdiene bestemt ved NMR eller IR varierer fortrinnsvis fra 0,55 til 0,75.

De farmasøytiske sammensetninger kan bestå av bare forbindelsen med formel (I) og syklodekstrinet eller syklodeks-trinderivatet. Denne faste form kan med fordel fremstilles ved lyofilisering av en vandig oppløsning, eller også ved ko-presipitasjon. En slik form er spesielt nyttig for rekonstitusjon med vann, saltvann eller en vandig oppløs-ning av syklodekstrinet, eller for blanding med ikke-farma-søytiske faste stoffer, spesielt matvarer.

Fortrinnsvis er de farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen egnet for oral administrasjon.

Sammensetningene kan med fordel gis i avdelte doseenheter, spesielt i enhetsdoseformer. En bekvem enhetsdoseformuler-ing inneholder den aktive ingrediens i en mengde på fra 0,1-100 mg. Mengden av en forbindelse med formel (I) som er nødvendig som daglig dose ved behandling, vil variere ikke bare med den spesielle forbindelse som velges, men også med administrasjonsruten, den behandlede tilstands na-tur og pasientens alder, vekt og kondisjon, og den vil til sist avgjøres av den behandlende lege. Men generelt vil en egnet dose være i området på fra ca. 0,1 til ca. 20 mg pr. dag. En egnet daglig dose for anvendelse ved profylakse vil generelt være i samme område.

Den ønskede dose kan med fordel gis i en enkelt dose eller som oppdelte doser administrert ved passende intervaller, for eksempel som to, tre, fire eller flere underdoser pr. dag. Den daglige dose av nebivolol kan administreres i en enkelt dose (o.d.), fordi en slik kur gir effektive plasma- nivåer over en periode på 24 timer. På grunn av dannelsen av aktive metabolitter med økt antioksiderende effektivitet, vil den antiaterogene virkning av nebivolol øke ved gjentatt eller kronisk administrasjon inntil en stabil til-stand er oppnådd.

Forbindelsene med formel (I) kan også anvendes i kombinasjon med andre blodtrykksenkende midler, eller med andre terapeutiske midler, for eksempel hypolipemiske midler, hy-polipidemiske midler, kolesterolsenkende midler, ACAT-nem-mere eller antioksidanter. Kombinasjonen kan administreres separat, dvs. samtidig, parallelt eller påfølgende via alle ruter som er beskrevet ovenfor, eller kombinasjonen angis i form av en farmasøytisk formulering. På denne måten utgjør et farmasøytisk produkt omfattende (a) en forbindelse med formel (I) eller (b) et annet terapeutisk middel som definert ovenfor, som et kombinert preparat som simultan, separat eller frekvensiell anvendelse i terapeutisk eller profylaktisk behandling av degenerative sykdommer i vaskulær eller nervesystemet som er forbundet med oksidativt stress, et ytterligere aspekt. Et slikt produkt kan omfatte et sett som består av en beholder inneholdende en farmasøytisk sammensetning av en forbindelse med formel (I) og en annen beholder omfattende en farmasøytisk sammensetning av det andre terapeutiske midlet. Produktet med separate sammensetninger av de to aktive ingredienser har den fordel at egnede mengder av hver komponent og tidspunktet og sekven-sen for administrasjonen kan velges i samsvar med pasien-ten.

Egnede terapeutiske midler for anvendelse i sammensetningene definert ovenfor innbefatter for eksempel blodtrykksenkende midler, spesielt 0-1-blokkerende midler, så som for eksempel atenolol, celiprolol, propanolol; hypolipemiske midler, dvs. medisiner som er nyttige for å senke lavdensi-tetslipoprotein (LDL) eller kolesterol, slik som for eksempel HMG CoA-reduktasehemmere, for eksempel lovastatin, flu-vastatin, pravastatin, simvastatin og lignende; gemfibro- zil; zaragosisk syre; eller antioksidanter, for eksempel probucol, vitamin E (a-tokoferol), eller spesielt forbindelser som kombinerer flere av de ovennevnte fysiologiske egenskaper, for eksempel karvedilol, verapamil, dilitiazem, vitamin C (askorbinsyre eller et salt derav).

Når forbindelsene med formel (I) anvendes i kombinasjon med et annet terapeutisk middel, kan dosen av hver forbindelse være forskjellig fra dosen når forbindelsen anvendes alene. Når forbindelsene med formel (I) anvendes sammen med et annet terapeutisk middel, kan dosen av hver forbindelse være lik eller vanligvis lavere enn når forbindelsen anvendes alene. Egnede doser vil være lette å finne frem til for en fagkyndig person.

Eksempel 1: In vitro-oksidasjon av humantLDL

Humant venøst blod ble oppsamlet på EDTA (2,68 mM sluttkonsentrasjon). Plasma ble isolert ved sentrifugering. NaBr (37,3 mg/ml) ble tilsatt og oppløst (sluttetthet 1,036 g/ml). Sentrifugerørene ble først fylt til et nivå tilsvarende 2/3 av deres maksimale volum, deretter fylt med en NaBr-løsning på 1,036 g/ml og deretter sentrifugert i 18 timer ved 45000 rpm i en 50 Ti-rotor (Beckmann). Etter sentrifugering ble flytende lipoproteiner fjernet. Den gjenværende løsning ble innstilt til en tetthet på 1,055 g/ml. Fyllingen av sentrifugerørene og sentrifugeringen ble gjentatt som beskrevet ovenfor. Etter sentrifugeringen ble flytendeLDLdialysert mot en buffer inneholdende 127 mM NaCl, 8 mM Na2HP04.2H20, 2,7 mM KCl og 1,47 mM KH2P04ved pH 7,4. Etter dialysen ble LDL filtrert gjennom et Milli-pore-filter (0,45 uM), og proteininnholdet ble bestemt. En fortynning på 25 ug/ml ble fremstilt med en milliporet dia-lysebuffer. Oksidasjonen ble bestemt i et Pharmacia Ultraspec Ill-spektrofotometer. Konjugert dienformasjon ble registrert ved 2 34 nm. To ul av en medisin eller et løsningsmiddel (DMSO) ble tilsatt til Eppendorf-rør etter-fulgt av l ml LDL (25 ug/ml), og disse stoffer ble forsik- tig blandet og sentrifugert i 1 minutt ved 13000 g. Løs-ningen ble pipettert i en Quartz-kuvette som ble termosta-tisert i spektrofotometeret ved 37 °C. Etter ekvilibrering ble oksidasjonsreaksjonen påbegynt ved å tilsette CuS04(sluttkonsentrasjon 10 pm). Absorbansen ble målt hvert 3 minutt under eksperimentets tidsforløp. Absorbansen ved 234 nM ble inndelt i 3 faser: en forsinkelsesfase, en pro-pageringsfase og en dekomponeringsfase (fig. 1). Forsin-kelsesfasen ble definert som møtepunktet med baselinjen for tangenten for stigningen av absorbanskurven for propage-ringsfasen. Oksidasjonshastigheten ble definert som tangenten for stigningen. ble definert som tiden som var nødvendig for å oppnå maksimal absorbans mellom propage-rings- og dekomponeringsfasen. Absorbansen ved minus absorbansen ved t0ble tatt som indikator på den totale mengde av dannede diener.

For å verifisere reproduserbarheten i undersøkelsen, ble en referanse LDL-prøve fremstilt og holdt i mørke under nitrogen ved 4 °C. Denne referanseprøven ble medtatt i hvert oksidasjonseksperiment.

LDL ble isolert fra 23 personer. Plasmakolesterol varierte fra 156 til 278 mg/dl (gjennomsnittlig 213 mg/dl), trigly-serider varierte fra 47 til 328 mg/dl (gjennomsnittlig 191 mg/dl) og fosforlipider varierte fra 178 til 327 mg/dl (gjennomsnittlig 231 mg/dl).

Fig. 2 viser den antioksidative virkning av to hydroksyanaloger av nebivolol: [ (RSSS) + (RSRR) + (SRRR)]-a-[[[2-(kroman-2-yl)-2-hydroksyetyl]amino]-metyl]-6-hydroksy-2-kroman- me - tanol-etadioat (1:1), og [(SRSR)+(SRRS)+(RSSR)]-a,a'-imino-bis (metylen) bis [6 -hydroksy-2 -kromanmetanol] . Tmaxog for-sinkelsestiden er begge øket, og oksidasjonshastigheten er redusert. In vitro har nebivolol ingen antioksidativ virkning. Vitamin E som referanseforbindelse viste ikke noen antioksiderende virkning ved en konsentrasjon lavere enn 10 uM (resultatene ikke vist) . Tmax-verdien ved 20 pM vitamin

E var nesten den samme som t,^-verdien for 2 uM hydroksymetabolittene av nebivolol under våre eksperimentelle betingelser. Oksidasjonshastigheten, den initielle absorbans og den totale mengde av diener ble ikke påvirket av vitamin E. Konklusjonen er at hydroksymetabolittene av nebivolol har en antioksiderende virkning på humant LDL in vitro. Nebivolol kan derfor ha viktige beskyttende virkninger mot oksidativ skade in vivo av den type som forekommer i aterosklerose, inflammasjon og kreft.

Eksempel 2: In vivo anti-ateromatisk virkning av nebivolol

For å verifisere hvorvidt nebivolol hadde noen virkninger på aldersforbundet vaskulær patologi, ble det til et antall rotter administrert nebivolol oralt ved doseringer på 0 (bare bærerstoff), 2,5, 10 og 40 mg/kg i løpet av 24 måne-der. Som bærerstoff ble det anvendt 2-hydroksy-propyl-B-syklodekstrin som forbedrer biotilgjengeligheten av nebivolol. Ved hver dose ble en hann- og hunn-gruppe på 50 medtatt i den 2 år lange studien. En hann og en hunn kon-trollgruppe på 50 som ikke fikk noe nebivolol, ble også medtatt i studien. Testdyrene ble autopsiert og iakttatt vedrørende histologiske ikke-neoplastiske forandringer. Følgende histologiske trekk som kan tilbakeføres til vaskulær degenerasjon eller aldring ble spesielt observert: vaskulopati i det abdominale mesotel, pankreas og

testiklene,

fokal og diffus hyperplasi i paratyroidkjertelen, og den renale histologi, spesielt antallet basofile tubili, påvisning av kronisk renal sykdom og minerali-sasjon.

De histopatologiske observasjoner fikk poeng fra 0 til 3 som følger:

0: ingen histologisk forandring

1: svak histologisk forandring

2: moderat histologisk forandring

3: alvorlig histologisk forandring.

For hver observasjon ble en middelverdi beregnet. De observerte verdier ble analysert med Mann-Whitney U-testen (to-halet sannsynlighet) for å påvise statistisk signifi-kante forskjeller mellom kontrollgruppene og de behandlede grupper. Disse tallverdier er oppsummert i tabellen neden-for. Signifikansen er beregnet med Mann-Whitney U-testen to-halet:<*>P<0,05<**>p<0,01 p<0,001

Eksempel 3

Primære embryoniske hippocampale kulturer ble fremstilt hovedsakelig som beskrevet tidligere (Pauwels et al. Van Aschouw, H.P.,Peeters, L.,Moeremans, M.,Leysen, J.E.

(1992). Kronisk behandling med sabeluzol beskytter dyrkede rottehjernenevroner for de nevrotoksiske virkninger av ek-sitatoriske aminosyrer. (Synapse, 12:271-280). Hippocampale dannelser av rotter ved den embryoniske dag 17 ble dissekert og dissosiert 0,05 % trypsin, 0,1 mg/ml DNase I i DMEM (Dulbecco modifisert ørnemedium). Varmeaktivert hes-te serum (HS) ble tilsatt til en konsentrasjon på 4 %, og cellene ble sentrifugert, vasket med DMEM og suspendert på nytt i DMEM/Ham<1>s F12 (3:1) inneholdende 10 % HS. Cellene ble utsådd på plater i en tetthet på 4x10<5>celler/cm<2>i plater med 24 brønner forhåndsbelagt med poly L-lysin (0,001 %). På dag 1 i kulturen ble mediet forandret til kjemisk definert (DMEM-HEPES/Ham's F12 (3:1) inneholdende 0,26 % bovint serumalbumin, 30 nM natriumselenitt, 3 nM 3,3<*>trijod-L-tyronin, 0,35 uM retinol, 0,3 uM retinolace-tat, 2,3 uM DL-a-tokoferol, 2,1 pM DL-a-tokoferol acetat, 3,6 uM linolensyre, 3,6 uM linolensyre, 0,125 % humant transferrin, 20 nM progesteron, 57,7 nM korticosteron, 49 U/l insulin, 0,4 uM biotin, 10 uM L-karnitin, 83 uM D(+)-galaktose,

3,3 uM glutation, 10 pM etanolamin, 0,1 mM putrescin; Romijn, H.J., van Huizen, F., Wolters, P.S. (1984). Mot et forbedret serumfritt kjemisk definert medium for 1angtids-dyrking av cerebralt cortex-vev. Neurosci. Behav. Rev., 8:301-334). Akutt og forlenget forhåndsbehandling av kulturene var hovedsakelig som beskrevet tidligere (Pauwels et al., 1992). Medisinene ble oppløst og fortynnet i 10 % eller 1 % hydroksypropyl-B-syklodekstrin slik at sluttkonsen-trasjonene i løsningsmidlet i de akutte og kroniske forsøk var henholdsvis 0,1 % og 0,01 %. Forbindelse A anvendt i de følgende eksempler er [ (RRSR) + (RRRS) + (SSSR) + (SSRS) ] -ct-[t[2-(kroman-2-yl)-2-hydroksy-etyl]amino]metyl]-6-hydroksy-2-kroman-metanoletandioat (1:1).

For akutt behandling ble medisin eller løsningsmiddel tilsatt til kulturene på dag 7. Etter 20 minutter ble mediet erstattet med 200 pl kjemisk definert DMEM-medium (den samme sammensetning av CDM-R12-mediet, men uten Ham's F12)

(kontroll), eller kjemisk definert DMEM-medium inneholdende den oksidative stressutløser. Oksidative stressutløsere som ble anvendt, var 1 mM natriumnitroprussid (SNP, en ni-trogenoksidradikalgenererende forbindelse), eller 7,5 - 10 mM dietylditiokarbamat (DDTC), en superoksiddismutaseinhi-bitor og testforbindelsen.

For forlengede forbehandlingseksperimenter ble medisinen (konsentrasjonsområdet 0,1 nM-10 pM) tilsatt til det serum-frie medium på dag 1 og 4 av dyrkingen. På dag 7 ble kulturene vasket en gang med DMEM og inkubert med 0,2 ml kjemisk definert DMEM-medium i 2 h ved 37 °C. Cellene ble vasket, og mediet ble erstattet med 0,2 ml kjemisk definert DMEM-medium (kontroll), eller kjemisk definert DMEM-medium inneholdende den oksidative stressutløser (se ovenfor).

Både for det akutte eksperiment og det forlengede forbe-handlingseksperiment ble de ekstracellulære og intracellulære LDH (laktat D-hydrogenase) aktiviteter målt spektrofo-tometrisk ved 340 nM med en EFOS-analysator 5060, i henhold til metoden beskrevet av Bergmeyer (Bergmeyer, H.U. (1974) Biochemical reagents. In: Methods of Enzymatic Analysis. H.U. Bergmeyer, eds. Academic Press, New York, 2nd Ed., pp. 480-242) . Ekstracellulær LDH-aktivitet i kulturmediet og cytoplasmisk LDH-aktivitet målt etter lyse av cellene i 1 ml H20 ble anvendt for å beregne den totale LDH-aktivitet og % frigitt LDH. % nevrobeskyttelse refererer til % hemming av LDH-frigivelsen, hvor oksidativ stressutløserindu-sert LDH-frigivelse er definert som 0 % beskyttelse, og ba-salt (kontroll) nivå av LDH-frigivelse er definert som 100 % beskyttelse.

For Vit E-uttømmingseksperimentene ble det anordnet primære kulturer som ovenfor, men på dag 1 i dyrkingen ble mediet forandret til kjemisk definert CDM-R12 medium med (kontroll) eller uten DL-a-tokoferol (VitE) og DL-a-tokoferol-acetat i nærvær eller fravær av testforbindelsen. Når Vit E var utelatt fra kulturmediet, observerte man alvorlig celledød ved 4 dager in vitro. Tilsetning av forbindelser kunne redde kulturene. KulturoverleveIsen ble målt ved hjelp av cytoplasmisk LDH-aktivitet. % Vit E komplementering refererer til % cytoplasmisk LDH, hvor LDH-nivåer så høye som de man observerte i Vit E-holdige kulturer, ble definert som 100 %, og LDH-nivåer så lave som de man observerte i de Vit E-uttømte kulturer ble definert som 0 %. EC50-verdiene for komplementeringen av Vit E refererer til konsentrasjonen av forbindelsen som er nødvendig for å gjenopprette kulturoverlevelsen med 50 % av den overlevelse som man observerte for kulturen dyrket i Vit E-supplementert medium. Syv konsentrasjoner av hver forbindelse ble testet i triplikat, antallet uavhengige eksperimenter er antydet i tabellen, og den midlere ECS0-verdi±SD ble beregnet.

Tabell 2: Vit E-komplementeringstest: virkning av

nebivololderivater, sorteringsdata

Tabell 3: Vit E-komplementeringstest: effektiviteten

av forbindelse A

Tabell 4: In vitro-nevrobeskyttelse av nebivolol, forbindelse A, og karvedilol mot nitrogenoksid-og superoksidradikaler.

Primære nevronale kulturer avhenger av nærværet av antiok-sidanten Vit E i kulturmediet for å kunne overleve in

vitro. Når Vit E-uttømt medium anvendes for å dyrke kulturene, synker overlevelsen til ±20 % av kontrollen. Forbindelser med antioksiderende egenskaper er i stand til å kom-plement ere mangelen på Vit E, og som slike kan de når de

tilsettes til kulturmediet, redde Vit E-manglende kulturer. Flere nebivololderivater ble testet vedIO"<7>M ogIO<*6>M i Vit E uttømningstesten på primære nevronale kulturer. Forbindelse A, nebivolol, 1-nebivolol og d-nebivolol var alle i stand til å redde overlevelsen av Vit E-uttømte kulturer til en viss grad (tabell 2).

Forbindelse A var den mest effektive forbindelse: fullsten- dig redning av primære nevronale kulturer dyrket i Vit E-uttømt medium ble iakttatt ved 10~<6>M (tabell 2). Konsentrasjonen av forbindelse A ved hvilken kulturen ble reddet med 50 % av kontrollen (kontrollen er en kultur dyrket i et medium inneholdende 4,4 uM Vit E), var 126±88 nM (tabell 3) .

Behandling av kulturer med superoksiddismutaseinhibitoren DDTC og nitrogenoksiddonoren SNP resulterer i radikalmediert (CV'og NO"respektive) nevrotoksisitet.

Forbindelser med antioksidative egenskaper er i stand til å beskytte kulturer fra radikalmediert nevrotoksisitet når de tilsettes kort tid før og under utløsningen (akutt behandling) , eller når de tilsettes i 6 dager før utløsningen (forlenget forbehandling). Fra tabell 3 fremgår det at nebivolol og forbindelse A kan gi nevrobeskyttelse til kulturene mot DDTC eller SNP i det ene eller andre behandlings-paradigma. Den underliggende mekanisme for behandlingsav-hengig nevrobeskyttelse er ukjent til dags dato- Den til-synelatende partielle beskyttelse iakttatt med nebivolol og forbindelse A mot SNP og DDTC observeres imidlertid ikke med karvedilol, og dette gjør nebivolol og forbindelse A

til overlegne medisiner i dette henseende.

Nevronale primære hippocampale kulturer ble dyrket i nærvær av overlevelsesfaktoren Vit E, hvilket resulterte i alvor lig celledød. Når nebivololderivater ble administrert under dyrkingen, kunne kulturene reddes til en viss grad. 10 % Vit E-komplementering refererer til overlevelsen av en cellekultur som er indifferent fra en VitE-holdig cellekultur.

Nevronale primære hippocampale kulturer ble dyrket i fravær av overlevelsesfaktoren VitE, og dette resulterte i alvorlig celledør. Når hydroksynebivolol ble administrert under dyrkingen, kunne kulturene reddes. EC50-verdiene refererer til konsentrasjonen ved hvilken kulturen reddes til 50%, målt ved cytoplasmisk LDH-aktivitet.

Nevronale primære hypocampale kulturer ble dyrket i CDM-R12 medium i 7 dager. Testforbindelsene ble enten administrert på dag 1 og 4 av dyrkingen (forlenget forbehandling) eller på dag 7 av dyrkingen (akutt behandling). Den oksidative stressutløser ble administrert på dag 7, og nevrobeskyttelsen ble beregnet basert på hemmingen av LDH-frigivelsen. NA betyr ikke-aktiv, dvs. scorer <25 % nevrobeskyttelsen.

Eksempel 4

Kompetitiv inhibisjon med glutamat av cystinopptak i visse celler leder til glutationmangel og oksidativt stress. Denne oksidative stressmodell er blitt beskrevet for gliale C6 glioma-celler (Kato et al., 1992. Mekanisme for glutamattoksisitet i C6 glioma-celler medførende inhibisjon av cystinopptak hvilket leder til glutationmangel. Neurosci. 48:903-914) og for den nøytrale cellelinje N18RE105 (Murphy et al., 1989. Glutamattoksisitet i en nevronal cellelinje innbefatter inhibisjon av cystintransport, hvilket leder til oksidativt stress. Neuron 2:1547-1558).

Cellekultur:

C6-gliomacellelinje (American Type Culture Colleetion, CCL 107) ble dyrket i DMEM supplementert med 2 eller 4 mM glu-tamin, 1 mM pyruvat og 5 eller 10 % varmeaktivert føtalt kalveserum. Kulturene ble holdt ved 37 °C i en luft/5-10 % C02lvannmettet atmosfære.

Glutationuttømming og vurdering av medisiner som antioksidanter : Det ble utført eksperimenter med kulturer som var utsådd med 30000-50000 celler/cm<2>i 24-brønnkulturplate (for må-ling og toksisitet og lipidperoksid) eller med 136000 celler pr. cm<2>i 96-brønnkulturplater (for GSH-bestemmelse. Etter 8-24 timer ble kulturene byttet over i kulturmedium med eller cystinopptaksinhibitoren glutamat i en sluttkonsentrasjon på 10 mM. For å teste medisiner for hemming av oksidativt stress ble medisinen tilsatt sammen med glutamat

{sluttkonsentrasjonen i løsningen var 0,01 % hydroksypropyl-B-cylodekstrin, 0,1 % DMSO. Intracellulære glutationnivåer ble målt etter 6-8 timer, lipidperoksider ble målt etter 14-20 timer og toksisitet og beskyttelse ble analysert etter 48 timer i en LDH-undersøkelse i henhold til metoden beskrevet av Bergmeyer og Bernt (UV-assay med pyruvat og NADH. I: "Methods of Enzymatic Analysis". 1974. H.U. Bergmeyer, ed. Acad. Press, New York, 2nd Ed., pp 574-579).

Bestemmelse av GSH- innhold i C6 - etl iomakul turer: GSH-nivåene ble analysert med en mikrometode, i alt vesent-lig som beskrevet av Vandeputte et al. ("A microtiterpla-teassay for total glutation og glutationdisulfidcontents in cultured/isolated cells: performance study of a new minia-turised protoeol". 1994. Cell Biol. Toxicol. 10:415-421), med en modifikasjon i vaske- og homogeniseringsprosedyrene. Celler (i 96-brønnsplater) ble vasket med PBS, ble homoge-nisert i 50 pl 10 mM HC1 inneholdende 1,3 % 5-sulfosalisyl-syre, og homogenatet ble sentrifugert ved 122 x g i 10 minutter ved 4 °C. 40 pl av supernatanten ble overført til en brønn i en 96-brønnsplate, og 200 pl reagens (1 mM 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzensyre), 0,34 mM NADPH og 6,3 mM EDTA i 143 mM fosfatbuffer pH 7,4) ble tilsatt. Etter 5 minutter ekvilibrering til værelsestemperatur, ble reaksjonen startet ved å tilsette 40 pl glutationreduktase (8,5 IU/ml 143 mM fosfatbuffer, 6,3 mM EDTA pH 7,4). NADPH-oksidasjonen ble fulgt ved 414 nM i 5 minutter med en Multiskan MCC/340 (Labsystems), og forandringen i absorbansen (DA) pr. minutt ble beregnet. Glutationinnholdet ble erholdt fra en standardkurve som varierte fra 0,2 til 2 nmol kom-mersielt GSH pr. test (DA/min. fremstilt grafisk som funk-sjon av konsentrasjonen).

Fluorescensmåling av intracellulære peroksider: Dannelsen av intracellulære peroksider ble påvist med 6-karboksy-2•,7 *-diklorhydrofluorescin-diacetat, di(acetoksymetyl-ester)(C-DCDHF, molekylær-prober). C-DCDHF ble oppløst i DMSO ved en konsentrasjon av 10 mM og lagret ved -70 °C under nitrogen. Etter at kulturen var utsatt for de gluta-tionuttømmende midler, ble cellene ladet med 10 uM C-DCDHF i en time ved 37 °C. Mediet ble sugd vekk, PBS ble tilsatt til cellene, og platene ble avlest i en Cytofluor II-mikro-plateleser (PerSeptive Biosystems).

Eksitasjons- og emisjonsbølgelengden ble valgt med et 485/530 nM filterpar. Resultatene ble uttrykt i relative fluorescensenheter/pg protein.

Resultater: Behandling av C6-gliomacellekulturer med 10 mM glutamat i 6 timer eller mer førte til skarp reduksjon i de intracellulære glutationnivåer (Tabell 5). Reduksjonen i glutation resulterte i oksidativt stress, som angitt ved en ±6-foldig økning av de toksiske intracellulære peroksider (Tabell 5). Til slutt opptrer celledød etter 16-48 timer. Eksitotoksisitet er ikke medvirkende i denne toksisitet, idet cytoplasmisk LDH-frigivelse (en indeks på cellulær toksisitet) ikke ble forhindret av NMDA-antagonisten MK801 (data ikke vist). Under våre kulturbetingelser var den ba-sale LDH-frigivelse i C6-gliomakulturene 2,7±0,3 % av det totale LDH (gjennomsnitt±SD, n=l2), og LDH-frigivelsen etter 48 timers behandling med 10 mM glutamat var 93,2±1,3 % av totalt LDH. Både nebivolol og forbindelse A beskyttet disse kulturer fra celledød med stor effektivitet (Tabell 6) . ic50-verdiene for beskyttelsen ble funnet å være ca. 9 nM både for nebivolol og forbindelse A. Denne beskyttelsen skyldtes ikke gjenopprettelse av glutationnivåene (Tabell 5), hvilke forble ca halvparten av nivåene som observeres i friske kontrollceller, og dette antyder at beskyttelsen med begge forbindelser var resultatet av en innvirkning med GSH-uttømmingsmediert oksidativt stress. Evaluering av intracellulære peroksider viste at både nebivolol og forbindelse A hemmer den glutamatmedierte økning i peroksidasjon (Tabell 5) .

Konklusjon: Dette er et klart in vitro-bevis på at begge forbindelser virker i cellekulturer som kraftige antioksidanter; de beskytter celler fra oksidativt stress-mediert celledød, idet de hemmer den oksidative stressmedierte økning av toksiske intracellulære peroksider.

Claims (6)

1. Anvendelse av a-a<1->iminobis(metylen)bis[2-kroman meta-nol] -derivater, de farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter, de stereokjemiske isomere former og enhver blanding av nevnte derivater, salter og stereoisomerer, for fremstilling av et medikament for terapeutisk eller profylaktisk behandling av degenerative sykdommer i vaskulær- og nervesystemet som er forbundet med oksidativt stress, idet derivatene har formelen (I):

hvorR<1>og R3 hver uavhengig representerer fluor, hydroksy eller hydrogen. R2 og R<4>hver uavhengig representerer hydrogen eller hydroksy, og hver stjerne indikerer et stereo-gent senter.

2. Anvendelse ifølge krav 1 hvor sykdommen som skal be-handles vedrører patologiske former av degenerasjon i det vaskulære system, så som aterogenese, ateromatose, arteriosklerose, ateroaterogenese, ateromatose, arteriosklerose, aterosklerose, vaskulær hypertrofi forbundet med hypertensjon, hyperlipoproteinemi eller normal vaskulær degenerasjon på grunn av aldring; vaskulopatologi av gonadene og pankreas,- paratyroid reaktiv hyperplasi; kronisk renal sykdom; neoplastiske sykdommer; og i inflammatoriske sykdommer .

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvor forbindelsen med formel (I) er nebivolol.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvor forbindelsen med formel (I) anvendes for å fremstille en farmasøytisk sammensetning tilpasset oral administrasjon.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvor den daglige dose av nebivolol varierer fra 0,1 til 20 mg.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor den daglige dose gis i en eneste administrasjon.