NO314694B1 - Biotinderivater, farmasöytiske preparater som inneholder disse, og anvendelser av forbindelsene - Google Patents

Abstract

Biotinforbindelser med formel I. hvor Q mangler eller er -NH-(CH)„-CO- eller -NH-(CH)„-NH-, og Rer X-Arg- Gly-Asp- Y,. A-Cys(R)-B-U- eller syklo- (Arg-Gly-Asp-Z), idet Z i sidekjeden er bundet til Q eller, dersom Q mangler til biotin, og A, B, U, X, Y, Z og n har de i krav i angitte betydninger, samt deres salter, kan anvendes som integrininhibitorer, særlig til profylakse og behandling av sykdommer i kretsløpet, ved tromboser, hjerteinfarkt, koronare hjertesykdommer, arteriosklerose, angiogene sykdommer og innen tumorterapi.

Description

Oppfinnelsen vedrører de følgende biotinforbindelser:

og saltene derav.

Lignende forbindelser av biotinylerte peptider er f.eks. beskrevet i WO 9415956 (biotinylerte endotelinreseptorantagonister), i WO 9413313 (biotinylerte LHRH-antagonister) eller i WO 9418325 (biotinylert nekrosefaktor). Biotinyleringen av peptider under fastfasesyntesen på harpiks, av hensyn til den forbedrede rense-mulighet, er beskrevet av TJ. Lobl et al. i Anal. Biochem., 770, 502 (1988). Lignende forbindelser av sykliske og lineære peptider er kjent fra DE 43 10 643, DE 43 36 758, EP 0 406 428 og WO 89/05150.

Til grunn for oppfinnelsen lå den oppgave å finne frem til nye forbindelser med verdifulle egenskaper, særlig slike som kan anvendes til fremstilling av legemidler.

Det ble funnet at de ovenfor nevnte forbindelser og deres salter har svært verdifulle farmakologiske egenskaper ved god forenlighet. Fremfor alt virker de som integrininhibitorer, idet de særlig hemmer interaksjonen mellom o^-, ft- eller /?5-integrinreseptorer og ligander, som f.eks. bindingen av fibrinogen til ft-integirnresep-toren. Særlig aktivitet utviser forbindelsene i tilfellet med integrinene Oyft, 0^85, Gfobft samt o^, o^ fa og o^Ss. Denne virkningen kan f.eks. påvises etter fremgangsmåten som er beskrevet av J.W. Smith et al. i J. Biol. Chem., 265,12267-12271 (1990). Avhengigheten av at det oppstår angiogenese av interaksjonen mellom vaskulære integriner og ekstracellulære matriksproteiner, er beskrevet av P.C. Brooks, R.A. Clark og D.A. Cheresh i Science, 264, 569-71 (1994).

Muligheten for inhiberingen av denne interaksjonen og dermed til innledningen av apoptose (programmert celledød) i angiogene vaskulære celler ved hjelp av et syklisk peptid, er beskrevet av P.C. Brooks, A.M. Montgomery, M. Rosenfeld, R.A. Reisfeld, T.-Hu, G. Klier og D.A. Cheresh i Cell, 79, 1157-64 (1994).

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen som blokkerer interaksjonen mellom integrinreseptorer og ligander, som f.eks. av fibrinogen på fibrinogenreseptoren (glykoprotein Ilb/HIa), forhindrer som GPIIb/IIIa-antagonister utbredelsen av tumorceller gjennom metastase. Dette underbygges av de følgende observasjoner: Spredningen av tumorceller fra en lokal tumor i det vaskulære system skjer gjennom dannelsen av mikroaggregater (mikrotromber) gjennom interaksjon mellom tumorceller og blodplater. Tumorcellene avskjermes gjennom beskyttelsen i mikroaggregat-et og gjenkjennes ikke av cellene i immunsystemet.

Mikroaggregatene kan feste seg til karvegger, hvorved en ytterligere inntrengning av tumorceller i vevet lettes. Ettersom dannelsen av mikrotromber for-midles gjennom fibrinogenbinding til fibrinogenreseptorene på aktiverte blodplater, kan GPIIa/IIIb-antagonistene anses som aktive metastasehemmere.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan anvendes som aktive legemiddel-forbindelser innen human- og veterinærmedisinen, særlig til profylakse og/eller behandling av tromboser, myokardinfarkt, arteriosklerose, betennelser, apopleksi, angina pectoris, tumorsykdommer, osteolytiske sykdommer som osteoporose, patologiske angiogene sykdommer som f.eks. betennelser, oftalmologiske sykdommer, diabetisk retinopati, makular degenerasjon, myopi, okular histoplasmose, reumatisk artritt, osteoartritt, rubeotisk glaukom, ulcerøs kolitt, morbus Crohn, aterosklerose, psoriasis, restenose etter angioplasti, virusinfeksjon, bakteriell infeksjon, soppinfeksjon, ved akutt nyresvikt og sårhelingen til understøttelse av helbredelsesprosessen.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan anvendes som antimikrobielt aktive stoffer ved operasjoner hvor det anvendes biologiske materialer, implantater, katetre eller pacemaker. Virkningen av den antimikrobielle aktivitet kan påvises gjennom den av Valentin-Weigund et al., Infection and Immunity, 2851-2855 (1988), beskrevne fremgangsmåte.

Ettersom forbindelsene ifølge oppfinnelsen utgjør inhibitorer for fibrino-genbindingen og dermed ligander for fibrinogenreseptorer på blodplater, kan de anvendes som diagnostika til påvisning og lokalisering av tromber i vaskulært system in vivo, siden biotinylresten utgjør en UV-påvisbar rest.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan anvendes som inhibitorer for fibrinogenbinding også som aktive hjelpemidler til studium av metabolismen til blodplater i forskjellige aktiveringsstadier, eller av intracellulære signalmekanismer hos fibrinogenreseptoren. Den påvisbare enhet i "biotinmarkører" tillater, etter binding til reseptoren, undersøkelse av de nevnte mekanismer.

De ovenfor og nedenunder oppførte forkortelser for aminosyrerester står for resten av de følgende aminosyrer:

Såfremt de ovenfor nevnte aminosyrer kan opptre i flere enantiomere former, så er ovenfor og nedenunder, f.eks. som bestanddel i forbindelsene ifølge oppfinnelsen, alle disse formene og også deres blandinger (f.eks. DL-formene) om-fattet. Videre kan aminosyrene, f.eks. som bestanddel i forbindelser ifølge oppfinnelsen være forsynt med tilsvarende, i og for seg kjente beskyttelsesgrupper.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen og også utgangsforbindelsene for deres fremstilling fremstilles etter i og for seg kjente fremgangsmåter, slik som de er blitt beskrevet i litteraturen (f.eks. i standardverkene som Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart), og da under reaksjonsbetingelser som er kjent og egnet for de nevnte omsetninger. Således kan man også gjøre bruk av i og for seg kjente, her ikke nærmere belyste varianter.

Om ønsket kan utgangsforbindelsene også dannes in situ, slik at man ikke isolerer dem fra reaksjonsblandingen, men straks omsetter dem videre til forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan videre fås ved at man frisetter dem fra deres funksjonelle derivater ved solvolyse, særlig hydrolyse, eller ved hydrogenolyse.

Foretrukne utgangsforbindelser for solvolysen henholdsvis hydrogenolysen er slike som i stedet for én eller flere frie amino- og/eller hydroksygrupper inneholder tilsvarende beskyttede amino- og/eller hydroksygrupper, fortrinnsvis slike som i stedet for et H-atom som er bundet til et N-atom, bærer en aminobeskyttelsesgruppe, f.eks. slike som tilsvarer forbindelsene ifølge oppfinnelsen, men som i stedet for en NH2-gruppe inneholder en NHR-gruppe (hvor R' betyr en aminobeskyttelsesgruppe, f.eks. BOC eller CBZ).

Videre er det foretrukket med utgangsforbindelser som i stedet for H-atomet i en hydroksygruppe bærer en hydroksybeskyttelsesgruppe, f.eks. slike som tilsvarer forbindelsene ifølge oppfinenlsen, men som i stedet for en hydroksyfenyl-gruppe inneholder en R"0-fenylgruppe (hvor R" betyr en hydroksybeskyttelsesgruppe).

Det kan også være til stede flere, like eller forskjellige, beskyttede amino- og/eller hydroksygrupper i molekylet til utgangsforbindelsen. Dersom de tilstedeværende beskyttelsesgrupper er forskjellige fra hverandre, kan de i mange tilfeller avspaltes selektivt.

Uttrykket "aminobeskyttelsesgruppe" er generelt kjent og henviser til grupper som er egnet til å beskytte (å blokkere) en aminogruppe mot kjemiske omsetninger, men som imidlertid er lett fjernbar etter at den ønskede kjemiske reaksjon er gjennomført på andre steder i molekylet. Typisk for slike grupper er særlig usubstituerte eller substituerte acyl-, aryl-, aralkoksymetyl- eller aralkylgrupper. Ettersom aminobeskyttelsesgruppene fjernes etter den ønskede reaksjon (eller reaksjonsrekke), er deres type og størrelse for øvrig ikke av avgjørende betydning; foretrukket er det imidlertid med slike med 1-20, særlig 1-8, C-atomer. Uttrykket "acyl-gruppe" skal i sammenheng med den foreliggende fremgangsmåte oppfattes i sin videste betydning. Det omfatter acylgrupper som er avledet fra alifatiske, aralifatiske, aromatiske eller heterosykliske karboksylsyrer eller sulfonsyrer, samt som særlig alkoksykarbonyl-, aryloksykarbonyl- og fremfor alt aralkoksykarbonylgrupper. Eksempler på slike acylgrupper er alkanoyl som acetyl, propionyl, butyryl; aralkanoyl som fenylacetyl; aroyl som benzoyl eller toluoyl; aryloksyalkanoyl som POA; alkoksykarbonyl som metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, 2,2,2-trikloretoksykarbonyl, BOC, 2-jodetoksykarbonyl; aralkyloksykarbonyl som CBZ ("karbobenzoksy"), 4-metoksybenzyloksykarbonyl, FMOC; arylsulfonyl som Mtr. Foretrukne amino-beskyttelsesgrupper er BOC og Mtr, videre CBZ, Fmoc, benzyl og acetyl.

Uttrykket "hydroksybeskyttelsesgruppe" er likeledes generelt kjent og henviser til grupper som er egnet til å beskytte en hydroksygruppe mot kjemiske omsetninger, men som imidlertid er lett fjernbare etter at den ønskede kjemiske reaksjon er gjennomført på andre steder i molekylet. Typisk for slike grupper er de ovenfor nevnte, usubstituerte eller substituerte aryl-, aralkyl- eller acylgrupper, videre også alkylgrupper. Typen av og størrelsen til hydroksybeskyttelsesgruppene er ikke av avgjørende betydning, ettersom de igjen fjernes etter den ønskede kjemiske reaksjon eller reaksjonsrekke; det er imidlertid foretrukket med grupper med 1-20, særlig 1-10, C-atomer. Eksempler på hydroksybeskyttelsesgrupper er blant annet benzyl, p-nitro-benzoyl, p-toluensulfonyl, tert-butyl og acetyl, idet benzyl og tert.-butyl er særlig foretrukket. COOH-gruppene i asparaginsyre og glutaminsyre beskyttes fortrinnsvis i form av deres tert.-butylestere (f.eks. Asp (OBut)).

Frisettingen av forbindelsene ifølge oppfinnelsen fra deres funksjonelle derivater lykkes, alt etter den benyttede beskyttelsesgruppe, f.eks. med sterke syrer, hensiktsmessig med TFA eller perklorsyre, men også med andre sterke uorganiske syrer som saltsyre eller svovelsyre, sterke organiske karboksylsyrer som triklor-eddiksyre, eller sulfonsyrer som benzen- eller p-toluensulfonsyre. Tilstedeværelsen av et ytterligere inert oppløsningsmiddel er mulig, men imidlertid ikke nødvendig. Som inert oppløsningsmiddel egner seg fortrinnsvis organiske, f.eks. karboksylsyrer som eddiksyre, etere som tetrahydrofuran eller dioksan, amider som DMF, halogenerte hydrokarboner som diklormetan, videre også alkoholer som metanol, etanol eller iso-propanol, samt vann. Videre kommer det på tale med blandinger av de tidligere nevnte oppløsningsmidler. TFA anvendes fortrinnsvis i overskudd uten tilsetning av et ytterligere oppløsningsmiddel, perklorsyre i form av en blanding av eddiksyre og 70 %-ig perklorsyre i forholdet 9:1. Reaksjonstemperaturene for spaltingen ligger hensiktsmessig mellom ca. 0 og ca. 50 °C, fortrinnsvis arbeider man mellom 15 og

30 °C (romtemperatur).

Gruppene BOC, OBut og Mtr kan f.eks. fortrinnsvis avspaltes med TFA

i diklormetan eller med ca.' 3-5 N HC1 i dioksan ved 15-30 °C, Fmoc-gruppen med en ca. 5-50 %-ig oppløsning av dimetylamin, dietylamin eller piperidin i DMF ved 15-30 °C.

Tritylgruppen anvendes til beskyttelse av aminosyrene histidin, asparagin, glutamin og cystein. Avspaltingen skjer, alt etter ønsket sluttprodukt, med TFA/10 % tiofenol, idet tritylgruppen avspaltes fra alle de nevnte aminosyrer; ved anvendelse av TFA/anisol eller TFA/tioanisol avspaltes bare tritylgruppen fra His, Asn og Gin, mens den derimot forblir på Cys-sidekjeden.

Hydrogenolytisk fjernbare beskyttelsesgrupper (f.eks. CBZ eller benzyl) kan avspaltes f.eks. ved behandling med hydrogen i nærvær av en katalysator (f.eks. en edelmetallkatalysator som palladium, hensiktsmessig på en bærer som karbon). Som oppløsningsmiddel egner seg da de ovenfor angitte, særlig f.eks. alkoholer som metanol eller etanol, eller amider som DMF. Hydrogenolysen gjennomføres som regel ved temperaturer mellom ca. 0 og 100 °C og trykk mellom ca. 1 og 200 bar, foretrukket ved 20-30 °C og 1-10 bar. En hydrogenolyse av CBZ-gruppen skjer f.eks. godt på 5-10 %-ig Pd-C i metanol eller med ammoniumformiat (i stedet for hydrogen) på Pd-C i metanol/DMF ved 20-30 °C.

En base ifølge oppfinnelsen kan overføres med en syre til det tilhørende syreaddisjonssalt, f.eks. ved omsetning av ekvivalente mengder av basen og syren i et inert oppløsningsmiddel som etanol, og ved påfølgende inndamping. For denne omsetningen kommer det særlig på tale med syrer som gir de fysiologisk akseptable salter. Således kan det anvendes uorganiske syrer, f.eks. svovelsyre, salpetersyre, hydrogenhalogensyrer som saltsyre eller hydrogenbromsyre, fosforsyrer som orto-fosforsyre, sulfaminsyre, videre organiske syrer, særlig alifatiske, alisykliske, aralifatiske, aromatiske eller heterosykliske en- eller flerbasiske karboksyl-, sulfon- eller svovelsyrer, f.eks. maursyre, eddiksyre, propionsyre, pivalinsyre, dietyleddiksyre, malonsyre, ravsyre, pimelinsyre, fumarsyre, maleinsyre, melkesyre, vinsyre, eplesyre, sitronsyre, glukonsyre, askorbinsyre, nikotinsyre, isonikotinsyre, metan- eller etan-sulfonsyre, etandisulfonsyre, 2-hydroksyetansulfonsyre, benzensulfonsyre, p-toluensulfonsyre, naftalenmono- og -disulfonsyrer, og laurylsvovelsyre. Salter med fysiologisk ikke akseptable syrer, f.eks. pikrater, kan anvendes til isolering og/eller rensing av forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

På den annen side kan en syre ifølge oppfinnelsen overføres ved omsetning med en base til et av dens fysiologisk akseptable metall- eller ammoniumsalter. Som salter kommer det da særlig i betraktning natrium-, kalium-, magnesium-, kalsium- og ammoniumsalter, videre substituerte ammoniumsalter, f.eks. dimetyl-, dietyl- eller diisopropylammoniumsaltene, monoetanol-, dietanol- eller diisopropylammoniumsaltene, sykloheksyl- eller disykloheksylammoniumsaltene, dibenzyletylendiammoniumsaltet, dessuten f.eks. salter med arginin eller lysin.

Gjenstand for oppfinnelsen er videre anvendelsen av forbindelsene ifølge oppfinnelsen og/eller deres fysiologisk akseptable salter til fremstilling av farma-søytiske preparater, særlig på ikke-kjemisk måte. Herved kan de bringes sammen med minst ett fast, flytende og/eller halvflytende bærer- eller hjelpestoff, og eventuelt i kombinasjon med én eller flere ytterligere aktive forbindelser, i en egnet doserings-form.

Gjenstand for oppfinnelsen er videre farmasøytiske preparater som inneholder minst én forbindelse ifølge oppfinnelsen og/eller et av dens fysiologisk akseptable salter.

Disse preparatene kan anvendes som legemidler innen human- eller veterinærmedisinen. Som bærerstoffer kommer det på tale med organiske eller uorganiske stoffer som egner seg for enteral (f.eks. oral), parenteral, topisk applikasjon eller for en applikasjon i form av en inhalasjonsspray, og som ikke reagerer med de nye forbindelsene, f.eks. vann, planteoljer, benzylalkoholer, alkylenglykoler, polyetylenglykoler, glyseroltiracetat, gelatin, karbohydrater som laktose eller stivelse, magnesiumstearat, talkum eller vaselin. For oral anvendelse tjener særlig tabletter, piller, drasjeer, kapsler, pulver, granulater, siruper, safter eller dråper, til rektal anvendelse suppositorier, til parenteral anvendelse oppløsninger, fortrinnsvis olje- eller vannoppløsninger, videre suspensjoner, emulsjoner eller implantater, for topisk anvendelse salver, kremer eller pudder. De nye forbindelsene kan også lyofiliseres og de erholdte lyofilisater anvendes f.eks. til fremstilling av injeksjonspreparater. De angitte preparater kan være sterilisert og/eller inneholde hjelpestoffer som glide-, konserverings-, stabiliserings- og/eller fuktemidler, emul-gatorer, salter for påvirkning av det osmotiske trykk, bufferstoffer, farge-, smaks og/eller flere ytterligere aktive stoffer, f.eks. ett eller flere vitaminer. For applikasjon som inhalasjonsspray kan det anvendes sprayer som inneholder den aktive forbindelse enten oppløst eller oppslemmet i en drivgass eller drivgassblanding (f.eks. CO2 eller klorfluorhydrokarboner). Hensiktsmessig anvender man den aktive forbindelse da i mikronisert form, idet ett eller flere ytterligere fysiologisk forenlige oppløsnings-midler kan være tilsatt, f.eks. etanol. Inhalasjonsoppløsninger kan administreres ved hjelp av vanlige inhalatorer.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen og deres fysiologisk akseptable salter kan anvendes som integrininhibitorer ved bekjempelsen av sykdommer, særlig av patologiske angiogene sykdommer, tromboser, hjerteinfarkt, koronare hjertesykdommer, arteriosklerose, tumorer, osteoporose, betennelser og infeksjoner.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan da som regel administreres analogt med andre kjente peptider som befinner seg i handelen, særlig imidlertid analogt med de i US-A-4 472 305 beskrevne forbindelser, fortrinnsvis ved doseringer mellom ca. 0,05 og 500 mg, særlig mellom 0,5 og 100 mg pr. doseringsenhet. Den daglige dosering ligger fortrinnsvis mellom ca. 0,01 og 2 mg/kg kroppsvekt. Den spesielle dose for hver pasient avhenger imidlertid av de forskjelligste faktorer, f.eks. av aktiviteten til den anvendte spesielle forbindelse, av alderen, kroppsvekten, den generelle helsetilstand, arv, av kosten, av administreringstidspunktet og -veien, av ut-skillingshastigheten, legemiddelkombinasjonen og alvorligheten av den enkelte sykdom som behandlingen gjelder for. Den parenterale applikasjon er foretrukket.

Videre kan de nye forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes innen analytisk biologi og molekylærbiologi. Herved utnyttes evnen til kompleksdannelse mellom biotinylresten og glykoproteinet avidin. Anvendelse av biotin-avidinkom-plekser er kjent fra E.A. Bayer og W. Wilchek i Methods of Biochemical Analysis, 26,1-45(1980) (lit. 1).

De nye forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes som integrinligander til fremstilling av kolonner for affinitetskromatografi for renfremstilling av integriner. Komplekset av et avidindeirvatisert bærermateriale, f.eks. Sepharose, og de nye forbindelsene ifølge oppfinnelsen dannes etter i og for seg kjente fremgangsmåter, slik som disse er beskrevet f.eks. i litteratur 1. Av denne grunn gås det på dette sted ikke nærmere inn på denne fremgangsmåten, og det henvises til den relevante litteratur, f.eks. litteratur 1.

Som polymere bærermaterialer egner seg de i og for seg innen peptid-kjemien kjente polymere, faste faser med fortrinnsvis hydrofile egenskaper, f.eks. kryssbundne polysukkere som cellulose, Sepharose eller Sephadex, akrylamider, polymer på polyetylenglykolbasis eller tentakelpolymerer.

De nye forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes som diagnostisk markør for antibiotin-antistoffreaksjoner i analyser av ELISA-type, og ved FACS(fluorescensaktivert cellesorterer)-analyse. Anvendelsen av antibiotin-antistoff til påvisning av biotin er kjent fra M. Berger, Biochemistry, 14, 2338-2342 (1975). Anvendelsen av immunglobulin IgG, som er derivatisert med biotin, i en enzym-immunanalyse (ELISA), er beskrevet av U. Holmkov-Nielsen et al. i Journal of Chromatography, 297, 225-233 (1984).

IJ. Immunol. Methods, 181, 55-64 (1995), er det av J. Gao og S.J. Shattil beskrevet en ELISA-test som påviser stoffer som inhiberer integrin-Gfobftn-aktiveringen. Til påvisningen anvendes det her biotinylert fibrinogen.

Anvendelsen av gjennomstrømningscytometri i den kliniske celle-diagnostikk er beskrevet av G. Schmitz og G. Rothe i DG Klinische Chemie Mitteilungen 24 (1993), hefte 1, s. 1-14.

Dessuten kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes til måling av

styrken av ligand-reseptorinteraksjoner i kraftfeltmikroskopien (atomkraftmikroskopi, AFM). Ligand betyr fortrinnsvis et kompleks av avidin og de nye forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Reseptor betyr fortrinnsvis en integrinreseptor. Målinger av adhesjons-krefter mellom et avidinfunksjonalisert kraftfeltmikroskop og biotinylert agarose er beskrevet av E.-L. Florin et al. i Science, 264,415-417 (1994).

Farmakologisk rapport

Reseptorinhiberin<g>sanalvse

Rensede humanintegriner GPIIbllla (identisk med cillbfi3) fra blodplater og avP3 fra terminmorkake ble absorbert til mikrotiterbrønner og utfordret med biotinylerte komplementære ligander - vitronectin (VN) for avP3, og figrinogen (FGN) for ctllbp3 i nærvær av stigende mengder av testforbindelser.

Metode: 1 ^ig/ml biotinligand ble inkubert med 1 fig/ml belagt reseptor i nærvær av seriefortynnede peptider. Etter 3 timer ved 30 °C ble bundet ligand målt ved antibiotin-alkalisk fosfatase-påvisning.

Litteratur: Charo, I. F., Nannizzi, L., Smith, J.W. and Cheresh, D. A., J.Cell. Biol. 111,2795-2800(1990).

Forbindelsene som ble testet, utviste høyere inhibitoraktivitet på OvpVvitronectin-interaksjon og på cdIbp3-fibrinogeninteraksjon sammenliknet med sammenliknings-forbindelsene i begge analysesystemene.

Ovenfor og nedenunder er alle temperaturer angitt i °C. I de etterfølgende eksempler betyr "vanlig opparbeidelse": Om nødvendig tilsettes vann, om nødvendig innstilles på pH-verdi mellom 2 og 10, alt etter sluttproduktets konstitusjon, det ekstraheres med etylacetat eller diklormetan, separeres, den organiske fase tørkes over natriumsulfat, inndampes og renses ved kromatografi på silikagel, og/eller ved krystallisasjon. Rf-verdi på silikagel. Elueringsmiddel: etylacetat:metanol = 9:1. RZ = retensjonstid (minutter) ved HPLC i de følgende systemer:

[A]

Kolonne: Nucleosil 7C18,250 x 4 mm

Elueringsmiddel A: 0,1 % TFA i vann

Elueringsmiddel B: 0,1 % TFA i acetonitril

Strømningshastighet: 1 ml/minutt

Gradient: 20-50 % B/30 minutter.

[B]

50 minutters gradient av 0-80 % 2-propanol i vann med 0,3 % TFA ved 1 ml/minutt på en kolonne, Lichrosorb RP Select B (7 fim), 250 x 4 mm.

[C]

Kolonne: Lichrosorb (5 fim) 100RP8,125 x 4 mm Elueringsmiddel A: 0,01 M Na-fosfat, pH 7,0

Elueringsmiddel B: 0,005 M Na-fosfat, pH 7,0/60 vol% 2-propanol Strømningshastighet: 0,7 ml/minutt

Gradient: 1-99 % B/50 minutter.

Massespektrometri

(MS): EI (elektronstøtionisering) M<+>

FAB (hurtig atombombardement) (M+H)<+ >DMPP-harpiks står for 4-(2',4'-dimetoksyfenylhyo^oksymetyl)fenoksyharpiks5 en supersyrelabil harpiks som tillater syntesen av sidekjedebeskyttede peptider.

Eksempel 1

0,6 g Fmoc-Lys(Boc)-OH oppløses i 100 ml diklormetan, det tilsettes 1,2 ekvivalenter DMPP-harpiks, 1,4 ekvivalenter HOBt og 1,4 ekvivalenter DCC1, og det omrøres i 12 timer ved romtemperatur. Etter fjerning av oppløsningsmidlet får man Fmoc-Lys(Boc)-DMPP-harpiks. I peptidsynteseapparatet kondenserer man Fmoc-Pro-OH med H-Lys(Boc)-DMPP-harpiks [frisetting fra Fmoc-Lys(BOC)-DMPP-harpiks med piperidin/DMF (20 %-ig)], idet man anvender et tre gangers overskudd av beskyttet prolin. Sammenkoblingen gjennomføres med DCCl/HOBt ved romtemperatur. Det fås Fmoc-Pro-Lys(BOC)-DMPP-harpiks. Analogt får man ved påfølgende avspalting av Fmoc-beskyttelsesgruppen og på hverandre følgende sammenkoblinger med Fmoc-Ser(But)-OH, Fmoc-Asp(OBut)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Mtr)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH og Bit-OH under reaksjonsbetingelser som gjentas ved hver sammenkobling

-frisetting av o>aminogruppen med piperidin/DMF (20 %-ig)

vasking med dimetylacetamid

-omsetning med Fmoc-aminosyren henholdsvis Bit-OH Bit-Gly-Gly-Gly-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-Ser(But)-Pro-Lys(BOC)-DMPP-harpiks.

Harpiksen vaskes med CF3S03H/CH2Cl2/H20, og det fås Bit-Gly-Gly-Gly-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-Ser(But)-Pro-Lys(BOC)-OH. Etter avspalting av beskyttelsesgruppene med 2 N HC1 i dioksan, fjerning av oppløsningsmidlet, opptak av resten i TFA/CH2C12 og utfelling med Et20 renses det over RP-HPLC. Det fås Bit-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-OH x 2 TFA; RZ [B] =12,14; FAB 1056.

Eksempel 2

Analogt med eksempel 1 får man ved på hverandre følgende sammenkoblinger av DMPP-harpiks med Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OBut)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(But)-OH, Fmoc-Lys(BOC)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH og Bit-OH: Bit-Gly-Gly-Gly-Lys(BOC)-Thr(But)-Ala-Asp(OBut)-Cys(Trt)-Pro-DMPP-harpiks.

Gjennom avspalting av harpiks, avspalting av beskyttelsesgruppene og rensing får man Bit-Gly-Gly-Gly-Lys-Thr-Ala-Asp-Cys(Trt)-Pro-OH x 2 TFA; RZ [B] 27,6; FAB 1273.

Eksempel 3

Til en oppløsning av 3,05 g syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) [som lar seg erholde ved ringslutning av H-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Lys(BOC)-OH til syklo-(Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Lys(BOC)) og påfølgende avspalting av beskyttelsesgruppene] i 100 ml diklormetan tilsettes 1,7 g billig erholdbart (+)-biotinyl-N-succinimidylester og 0,5 g trietylamin. Det omrøres i 5 timer ved romtemperatur og fås etter vanlig opparbeidelse syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(N<£->Bit)) x TFA; RZ [B] 11,32; FAB 830.

Eksempel 4

Analogt med eksempel 3 får man av 3,05 g syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) og 2,3 g billig (+)-biotinyl-6-aminokapronsyre-N-succinimidylester ("A") og 0,5 g trietylamin syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(N<É->Bit-Aha)) x TFA; RZ [C] 23,67; FAB 943.

Eksempel 5

Til en oppløsning av 3,05 g syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) i 40 ml 5 %-ig vandig NaHC03 og 40 ml THF tilsettes 6 g Boc-Aha-N-succinimidylester. Det omrøres i 4 timer, opparbeides på vanlig måte og fås syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(BOC-Aha)); RZ [C] 27,7; FAB 817. Etter avspalting av BOC-gruppen i HCl/dioksan får man etter vanlig opparbeidelse syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(N<e->Aha)) x 2 TFA; RZ [C] 14,76; FAB 717.

Analogt med eksempel 1 får man ved påfølgende omsetning med (+)-biotinyl-N-succinimidylester syklo-CArg-Gly-Asp-D-Phe-LysQ^-Bit-Aha)) x TFA; RZ [C] 23,67; FAB 943.

Eksempel 6

Analogt med eksempel 4 får man av syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys-Gly) [som kan fås ved ringslutning av H-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Lys(BOC)-Gly-OH til syklo-(Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Lys(BOC)-Gly) og påfølgende avspalting av beskyttelsesgruppene] og (+)-biotinyl-6-aminokapronsyre-N-succinimidylester syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(N<e->Bit-Aha)-Gly) x TFA; RZ [A] 10,97; FAB 1000.

Analogt får man av syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Gly) [som kan fås ved ringslutning av H-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Val-Lys(BOC)-OH til syklo-(Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Val-Lys(BOC)) og påfølgende avspalting av beskyttelsesgruppene] og (+)-biotinyl-6-aminokapixmsyre-N-succinirnidylester syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Lys(N<e->Bit-Aha)) x TFA; RZ [A] 16,11; FAB 1042.

Analogt får man av syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Lys) og (+)-biotinyl-6-arninokapronsyre-N-succinimidylester syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Lys(N<*->Bit-Aha)).

Eksempel 7

Fremstillin<g> av et materiale som er egnet til integrinrensing for affinitetskromatografi

Aktiveringen av Sepharose skjer som beskrevet i litteratur 1, s. 14. Deretter tilsettes 20 mg avidin i 20 ml 0,1 M natriumbikarbonatoppløsning til 10 g aktivert Sepharose. Suspensjonen omrøres i 12 timer ved 4 °C og vaskes deretter. Materialet oppslemmes deretter i vann med noen krystaller natriumazid. Dannelsen av avidinkomplekset med de biotinylerte forbindelser ifølge oppfinnelsen, f.eks. syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(N<É->Bit)) x TFA, skjer idet man oppløser 1,1 ekvivalent i natriumacetatbuffer, tilsetter oppløsningen til suspensjonen av avidin-Sepharose og omrører i 10 timer ved 4 °C. Overskytende peptid fjernes ved vasking.

De etterfølgende eksempler vedrører farmasøytiske preparater.

Eksempel A

Injeksjonsglass

En oppløsning av 100 g av en aktiv forbindelse med formel I og 5 g dinatriumhydrogenfosfat i 3 1 dobbeltdestillert vann innstilles med 2 N saltsyre på pH 6,5, sterilfiltreres, fylles i injeksjonsglass, lyofiliseres under sterile betingelser og lukkes sterilt. Hvert injeksjonsglass inneholder 5 mg aktiv forbindelse.

Eksempel B

Suppositorier

Man smelter en blanding av 20 g av en aktiv forbindelse med formel I med 100 g soyalecitin og 1400 g kakaosmør, heller i former og lar avkjøles. Hvert suppositorium inneholder 20 mg aktiv forbindelse.

Eksempel C

O ppløsning

Det lages en oppløsning av 1 g av en aktiv forbindelse med formel 1,9,38 g NaH2P04-2 H20, 28,48 g Na2HP04-12 H20 og 0,1 g benzalkoniumklorid i 940 ml dobbeltdestillert vann. Det innstilles på pH 6,8, fylles opp til 11 og steriliseres ved bestråling. Denne oppløsningen kan anvendes i form av øyedråper.

Eksempel D

Salve

Man blander 500 mg av en aktiv forbindelse med formel I med 99,5 g vaselin under aseptiske betingelser.

Eksempel E

Tabletter

En blanding av 1 kg aktiv forbindelse med formel 1,4 kg laktose, 1,2 kg potetstivelse, 0,2 kg talkum og 0,1 kg magnesiumstearat presses på vanlig måte til

tabletter, slik at hver tablett inneholder 10 mg aktiv forbindelse.

Eksempel F

Drasjeer

Analogt med eksempel E presses tabletter som deretter belegges på vanlig måte med et belegg av sakkarose, potet-

stivelse, talkum, tragant og fargestoff.

Eksempel G

Kapsler

2 kg aktiv forbindelse med formel I fylles på vanlig måte i hardgela-tinkapsler, slik at hver kapsel inneholder 20 mg av den aktive forbindelse.

Eksempel H

Ampuller

En oppløsning av 1 kg aktiv forbindelse med formel I i 60 1 dobbeltdestillert vann sterilfiltreres, fylles i ampuller, lyofiliseres under sterile betingelser og lukkes sterilt. Hver ampulle inneholder 10 mg aktiv forbindelse.

Eksempel I

Inhalasionsspray

Man oppløser 14 g aktiv forbindelse med formel I i 101 isoton NaCl-oppløsning, og oppløsningen fylles i handelsvanlige sprøytebeholdere med pumpemekanisme. Oppløsningen kan sprøytes i munn eller nese. Et sprøytestøt (ca. 0,1 ml) tilsvarer en dose på ca. 0,14 mg.

Claims (7)

1. Forbindelser, karakterisert ved at de er valgt fra gruppen bestående av: og saltene derav.

2. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved et innhold av minst én forbindelse ifølge krav 1, og/eller et av dens fysiologisk akseptable salter.

3. Forbindelser ifølge krav 1 og deres fysiologisk akseptable salter, som integrininhibitorer for bekjempelse av patologiske angiogene sykdommer, tromboser, hjerteinfarkt, koronare hjertesykdommer, arteriosklerose, tumorer, osteoporose, betennelser og infeksjoner.

4. Anvendelse av forbindelser ifølge krav 1 og/eller deres fysiologisk akseptable salter til fremstilling av et legemiddel.

5. Anvendelse av forbindelser ifølge krav 1 til rensing av integriner ved affinitetskromatografi.

6. Anvendelse av forbindelser med ifølge krav 1 som diagnostisk markør for antibiotin-antistoffreaksjoner ved analyser av ELISA-type, og ved FACS-analysen.

7. Anvendelse av forbindelser ifølge krav 1 innen kraftfeltmikroskopi til måling av styrken av ligand-reseptoirnteraksjoner.