NO313756B1 - Syklopeptidforbindelser, fremgangsmåte for fremstilling derav, farmasöytiske preparater, fremgangsmåte for fremstillingderav, samt anvdendelse av forbindelsene til fremstilling avmedikamenter og immobiliserte ligander, og til rensing av integr - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører nye syklopeptider med formel I

hvor

B er Gly, Ala eller -HN-Q-CO-,

D er Phe, 4-Hal-Phe, Nal eller Phg,

E er Gly, Ala, Lys, Lys(Ac), Lys(AcNH2) eller Lys(AcSH),

Hal er F, Cl, Br eller I,

Q er alkylen med 1-6 C-atomer, og

Ac er alkanoyl med 1-10 C-atomer,

idet både D- og også L-formen er omfattet såfremt det dreier seg om rester av optisk aktive aminosyrer og aminosyrederivater, samt deres fysiologisk akseptable salter, med det forbehold at forbindelsen ikke er syklo-(Arg-Gly-Asp-Phe-Val) eller syklo-(Arg-Ala-Asp-Phe-Val) hvor optisk aktive aminosyrer kan være i enten D- eller L-formen.

Lignende forbindelser er kjent fra Pharmazie, 40 (8), 532-5 (1985).

Til grunn for oppfinnelsen lå den oppgave å finne frem til nye forbindelser med verdifulle egenskaper, særlig slike som kan anvendes til fremstilling av legemidler.

Det ble funnet at forbindelsene med formel I og deres salter har svært verdifulle egenskaper. Fremfor alt virker de som integrininhibitorer, idet de særlig hemmer vekselvirkningen mellom j33- eller ft-integrinreseptorene og ligander. Særlig aktivitet oppviser forbindelsene i tilfellet med integrinene av/33, av/35 og am,/^. Denne virkningen kan f.eks. påvises ved fremgangsmåten som er beskrevet av J.W. Smith et al. i J. Biol. Chem., 265, 12267-12271 (1990). I tillegg opptrer antiinflammatoriske effekter. Alle disse virkningene kan påvises ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent fra litteraturen.

Forbindelsene kan anvendes som aktive legemiddelforbindelser innen human- og veterinærmedisinen, særlig til profylakse og til behandling av sykdommer i blodomløpet, trombose, hjerteinfarkt, arteriosklerose, betennelser, apopleksi, angina pectoris, tumorsykdommer, osteolytiske sykdommer, særlig osteoporose, angiogenese og restenose etter angioplastikk. Videre kan forbindelsene anvendes til forbedring av sår-heling.

Forbindelsene egner seg dessuten som aktive antimikrobielle stoffer som forhindrer infeksjonene som f.eks. utløses av bakterier, sopper eller gjærsopper. Stoffene kan således fortrinnsvis gis som ledsagende antimikrobielle, aktive stoffer når det foretas inngrep i en organisme, hvor det anvendes kroppsfremmede stoffer, som f.eks. biomateri-aler, implantat, kateter eller pacemaker. De virker som antiseptika.

De ovenfor og nedenunder angitte forkortelser for aminosyrerester står for resten av de følgende aminosyrer:

Abu 4-aminosmørsyre

Aha 6-aminoheksansyre

Ala alanin Asn asparagin Asp asparaginsyre

Asp(Or) asparaginsyre(jS-ester) Arg arginin

Cha 3-sykloheksylalanin

Cit citrullin

Cys cystein

Dab 2,4-diaminosmørsyre Gin glutamin

Glu glutaminsyre

Gly glysin

His histidin

Ile isoleucin

Leu leucin

Lys lysin

Lys(Ac) Ne<->alkanoyllysin Lys(AcNH2) N<6->aminoalkanoyllysin Lys(AcSH) Nf<->merkaptoalkanoyllysin Met metionin

Nal 3-(2-naftyl)-alanin

Nie Norleucin

Orn ornitin

Phe fenylalanin

4-Hal-Phe 4-halogenfenylalanin Phg fenylglysin

Pro prolin

Pya 3-(2-pyridyl)-alanin

Ser serin

Tia 3-(2-tienyl)-alanin

Tic tetrahydroisokinolin-3 -karboksylsyre Thr treonin

Trp tryptofan

Tyr tyrosin

Val valin.

Videre; betyr nedenunder:

BOC tert.-butoksykarbonyl CBZ benzyloksykarbonyl DCCI disykloheksylkarbodiimid

DMF dimetylformamid

EDCI N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimidhydroklorid

Et etyl

Fmoc 9-fluorenylmetoksykarbonyl

HOBt 1-hydroksybenzotriazol

Me metyl

Mtr 4-metoksy-2,3,6-trimetylfenyl-sulfonyl

OBut tert.-butylester

OMe metylester

OEt etylester

POA fenoksyacetyl

TBTU 2-( 1 H-benzotriazol-1 -yl)-1,1,3,3-tetrametyluroniumtetrafluorborat

TFA trifluoreddiksyre.

Såfremt de ovenfor nevnte aminosyrer opptrer i flere enantiomere former, så er ovenfor og nedenunder, f.eks. som bestanddel i forbindelsene med formel I, alle disse formene og også deres blandinger omfattet (f.eks. DL-formene). Videre kan amino-syrene, f.eks. som bestanddel i forbindelsene med formel I, være forsynt med passende, i og for seg kjente beskyttelsesgrupper.

Gjenstand for oppfinnelsen er videre en fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel I ifølge krav 1 eller et av dens salter, kjennetegnet ved at man frisetter den fra et av dens funksjonelle derivater ved behandling med et solvolyserende eller hydrogenolyserende middel,

eller at man behandler et peptid med formel II

hvor

Z er -Arg-B-Asp-D-E-,

-B-Asp-D-E-Arg-,

-Asp-D-E-Arg-B-,

-D-E-Arg-B-Asp- eller

-E-Arg-B-Asp-D,

eller et reaksjonsdyktig derivat av et slikt peptid med et ringslutningsmiddel,

og/eller at man overfører en basisk eller sur forbindelse med formel I ved behandling med en syre eller base til et salt derav.

Ovenfor og nedenunder har restene B, D, E og Z de for formlene I og II angitte betydninger, såfremt ikke noe annet er uttrykkelig angitt.

I formlene ovenfor står alkyl fortrinnsvis for metyl, etyl, isopropyl eller tert.-butyl.

Gruppen B er fortrinnsvis Gly, men også -HN-(CH2)2- CO-, -HN-(CH2)3-CO-, -HN-(CH2)5-CO eller Ala. D er fortrinnsvis Phe, særlig D-Phe, men også 4-Hal-Phe, særlig 4-I-Phe samt Nal eller Phg, idet D-formen er særlig foretrukket.

I overensstemmelse dermed er oppfinnelsens gjenstand særlig de forbindelsene med formel I hvor minst én av de nevnte rester har en av de ovenfor angitte, foretrukne betydninger.

En foretrukket gruppe av forbindelser kan uttrykkes gjennom delformel Ia, som ellers tilsvarer formel I, men hvor imidlertid

B er Gly, -HN-(CH2)2-CO-, -HN-(CH2)3-CO-, -HN-(CH2)5-CO- eller Ala,

D er Phe, D-Nal, D-Phg eller 4-I-Phe, og

E er Lys, Gly, Ala eller Lys(Ac).

En ytterligere foretrukket gruppe av forbindelser kan uttrykkes gjennom delformel Ib, som ellers tilsvarer formel I, men hvor imidlertid

B er Gly,

D er D-Phe, og

E er Lys eller Gly.

Forbindelsene med formel I og også utgangsforbindelsene for deres fremstilling fremstilles for øvrig etter kjente fremgangsmåter, slik de er blitt beskrevet i litteraturen (f.eks. i standardverker som Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart), og da under reaksjonsbetingelser som er kjent og egnet for de nevnte omsetninger. Således kan man også gjøre bruk av kjente, her ikke nærmere belyste varianter.

Utgangsforbindelsene kan, om ønsket, også dannes in situ slik at man ikke isolerer dem fra reaksjonsblandingen, men omsetter dem straks til forbindelsene med formel I.

Forbindelsene med formel I kan fås ved at man setter dem fri fra deres funksjonelle derivater ved solvolyse, særlig hydrolyse, eller gjennom hydrogenolyse.

Foretruline utgangsforbindelser for solvolysen eller hydrogenolysen er slike som i stedet for én el ler flere frie amino- og/eller hydroksygrupper inneholder passende

beskyttede amino- og/eller hydroksygrupper, fortrinnsvis slike som i stedet for et H-atom som er forbundet med et N-atom, bærer en aminobeskyttelsesgruppe, f.eks. slike som tilsvarer formel I, men som i stedet for en NH2-gruppe inneholder en NHR-gruppe (hvor R' er en aminobeskyttelijesgruppe, f.eks. BOC eller CBZ).

Videre er det foretrukket med utgangsforbindelser som i stedet for H-atomet i en hydroksygruppe bærer en hydroksybeskyttelsesgruppe, f.eks. slike som tilsvarer formel I, men som i stedet for en hydroksyfenylgruppe inneholder en R"0-fenylgruppe (hvor R" er en hydroksybeskyttelsesgruppe).

Det kan også være til stede flere, like eller forskjellige, beskyttede amino-og/eller hydroksygrupper i molekylet. Dersom de tilstedeværende beskyttelsesgrupper er forskjellige fra hverandre, kan de i flere tilfeller avspaltes selektivt.

Uttrykket "aminobeskyttelsesgruppe" er generelt kjent og henviser til grupper som er egnet til å beskytte (blokkere) en aminogruppe mot kjemiske omsetninger, men som imidlertid er lett fjernbar etter at den ønskede kjemiske reaksjon er gjennomført på andre steder i molekylet. Typisk for slike grupper er særlig usubstituerte eller substituerte acyl-, aryl-, aralkoksymetyl- eller aralkylgrupper. Ettersom aminobeskyt-telsesgruppene fjernes etter den ønskede reaksjon (eller reaksjonsrekkefølge), er deres type og størrelse for øvrig ikke av avgjørende betydning; foretrukket er imidlertid slike med 1-20, særlig 1-8, C-atomer. Uttrykket "acylgruppe" skal i forbindelse med den fore-liggende fremgangsmåte oppfattes i sin videste betydning. Det omfatter acylgrupper som er avledet fra alifatiske, aralifatiske, aromatiske eller heterosykliske karboksylsyrer eller sulfonsyrer, så vel som særlig alkoksykarbonyl-, aryloksykarbonyl- og fremfor alt aral-koksykarbonylgrupper. Eksempler på slike acylgrupper er alkanoyl som acetyl, pro-pionyl, butyryl; aralkanoyl som fenylacetyl; aroyl som benzoyl eller tolyl; aryloksy-alkanoyl som POA; alkoksykarbonyl som metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, 2,2,2-trikloretoksykarbonyl, BOC, 2-jodetoksykarbonyl; aralkyloksykarbonyl som CBZ ("karbobenzoksy"), 4-metoksybenzyloksykarbonyl, FMOC; arylsulfonyl som Mtr. Foretrukne aminobeskyttelsesgrupper er BOC og Mtr, videre CBZ, Fmoc, benzyl og acetyl.

Uttrykket "hydroksybeskyttelsesgruppe" er like ens generelt kjent og henviser til grupper som er egnet til å beskytte en hydroksygruppe mot kjemiske omsetninger, men som er lett fjernbar etter at den ønskede kjemiske reaksjon er gjennom-føres på andre steder i molekylet. Typisk for slike grupper er de ovenfor nevnte, usubstituerte eller substituerte aryl-, aralkyl- eller acylgrupper, videre også alkylgrupper. Egenskapene til og størrelsen av hydroksybeskyttelsesgruppene er ikke av avgjørende betydning, da de igjen fjernes etter den ønskede kjemiske reaksjon eller reaksjons-rekkefølge; foretrukket er grupper med 1-20, særlig 1-10, C-atomer. Eksempler på hydroksybeskyttelsesgrupper er blant annet benzyl, p-nitrobenzoyl, p-toluensulfonyl, tert.-butyl og acetyl, samt benzyl og tert.-butyl er særlig foretrukket. COOH-gruppene i asparaginsyre og glutaminsyre er fortrinnsvis beskyttet i form av deres tert.-butylester (f.eks. Asp (OBut)).

De funksjonelle derivater av forbindelsene med formel I som skal anvendes som utgangsforbindelser, kan fremstilles etter vanlige fremgangsmåter innen aminosyre-og peptidsyntese, slik som f.eks. beskrevet i de nevnte standardverker og patentsøknader, f.eks. også etter fastfasemetoden ifølge Merrifield (B.F. Gysin og R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 94, 3102ff (1972)).

Frisettingen av forbindelsene med formel I fra deres funksjonelle derivater skjer alt etter den benyttede beskyttelsesgruppe, f.eks. med sterke syrer, hensiktsmessig med TFA eller perklorsyre, men også med andre sterke uorganiske syrer som saltsyre eller svovelsyre, sterke organiske karboksylsyrer som trikloreddiksyre eller sulfonsyrer som benzen- eller p-toluensulfonsyre. Tilstedeværelsen av et inert oppløsningsmiddel i tillegg er mulig, men imidlertid ikke nødvendig. Som inert oppløsningsmiddel egner seg fortrinnsvis organiske, f.eks. karboksylsyrer som eddiksyre, etere som tetrahydrofuran eller dioksan, amider som DMF, halogenerte hydrokarboner som diklormetan, videre også alkoholer som metanol, etanol eller isopropanol samt vann. Videre kommer det på tale med blandinger av de ovenfor nevnte oppløsningsmidler. TFA anvendes fortrinnsvis i overskudd uten tilsetning av et ytterligere oppløsningsmiddel, perklorsyre i form av en blanding av eddiksyre og 70 %-ig perklorsyre i forholdet 9:1. Reaksjonstemperaturene for spaltingen ligger hensiktsmessig mellom ca. 0 og ca. 50 °C, fortrinnsvis arbeider man mellom 15 og 30 °C (romtemperatur).

Gruppene BOC, OBut og Mtr kan f.eks. foretrukket avspaltes med TFA i diklormetan eller med ca. 3-5 N HC1 i dioksan ved 15-30 °C, Fmoc-gruppen med en ca. 5-50 %-ig oppløsning av dimetylamin, dietylamin eller piperidin i DMF ved 15-30 °C.

Hydrogenolytisk fjernbare beskyttelses grupper (f.eks. CBZ eller benzyl) kan f.eks. avspaltes ved behandling med hydrogen i nærvær av en katalysator (f.eks. en edelmetallkatalysator som palladium, hensiktsmessig på en bærer som karbon). Som oppløsningsmiddel egner seg da de ovenfor angitte, særlig f.eks. alkoholer som metanol eller etanol, eller amider som DMF. Hydrogenolysen gjennomføres som regel ved temperaturer mellom ca. 0 og 100 °C og trykk mellom ca. 1 og 200 bar, fortrinnsvis ved 20-30 °C og 1-10 bar. En hydrogenolyse av CBZ-gruppen skjer f.eks. godt på 5-10 %-ig Pd-C i metanol eller med ammoniumformiat (i stedet for H2) på Pd-C i metanol/DMF ved 20-30 °C.

Forbindelser med formel I kan også fås gjennom ringslutning av forbindelser med formel II under betingelsene for en peptidsynteser. Man arbeider da hensiktsmessig etter vanlige metoder innen peptidsyntese, som de som f.eks. er beskrevet i Houben-Weyl, l.c, bind 15/11, s. 1-806 (1974).

Reaksjonen skjer fortrinnsvis i nærvær av et dehydratiseringsmiddel, f.eks. et karbodiimid som DCCI eller EDCI, videre propanfosfonsyreanhydrid (jf. Angew. Chem. 92, 129 (1980)), difenylfosforylazid eller 2-etoksy-N-etoksykarbonyl-l,2-dihydrokinolin, i et inert oppløsningsmiddel, f.eks. et halogenert hydrokarbon som diklormetan, en eter som tetrahydrofuran eller dioksan, et amid som DMF eller dimetyl-acetamid, et nitril som acetonitril, eller en blanding av disse oppløsningsmidlene, ved temperaturer mellom ca. -10 og 40 °C, fortrinnsvis mellom 0 og 30 °C. For å befordre den intramolekylære ringslutning før den intermolekylære peptidbinding er det hensiktsmessig å arbeide i fortynnede oppløsninger (fortynningsprinsipp).

I stedet for II kan det også anvendes egnede reaksjonsdyktige derivater av disse forbindelsene i reaksjonen, f.eks. slike som er blokkert intermediært i sine reaktive grupper ved beskyttelsesgrupper. Aminosyrederivatet II kan f.eks. anvendes i form av dets aktiverte ester, som hensiktsmessig dannes in situ, f.eks. ved tilsetning av HOBt eller N-hydroksysuccinimid.

Utgangsforbindelsene med formel II er som regel nye. De kan fremstilles etter kjente fremgangsmåter, f.eks. de ovenfor angitte metoder fra peptidsyntese og avsp-altingen av beskyttelsesgrupper.

Som regel syntetiserer man først beskyttet pentapeptidester med formel R'-Z-OR", f.eks. BOC-Z-OMe eller BOC-Z-OEt, som deretter forsåpes til syrer med formel R-Z-OH, f.eks. BOC-Z-OH; fra disse avspaltes beskyttelsesgruppen R<1>, hvorved man får det frie peptid med formel H-Z-OH (II).

En base med formel I kan overføres med en syre til det tilhørende syreaddi-sjonssalt. For denne omsetningen kommer det særlig på tale med syrer som gir fysiologisk akseptable salter. Således kan det anvendes uorganiske syrer, f.eks. svovelsyre, salpetersyre, hydrogenhalogensyrer som saltsyre eller hydrogenbromsyre, fosforsyrer som ortofosforsyre, sulfaminsyre, videre organiske syrer, særlig alifatiske, alisykliske, aralifatiske, aromatiske eller heterosykliske en- eller flerbasiske karboksyl-, sulfon- eller svovelsyrer, f.eks. maursyre, eddiksyre, propionsyre, pivalinsyre, dietyleddiksyre, malon-syre, ravsyre, pimelinsyre, fumarsyre, maleinsyre, melkesyre, vinsyre, eplesyre, benzo-syre, salisylsyre, 2- eller 3-fenylpropionsyre, sitronsyre, glukonsyre, askorbinsyre, niko-tinsyre, isonikotinsyre, metan- eller etansulfonsyre, etandisulfonsyre, 2-hydroksyetan-sulfonsyre, benzensulfonsyre, p-toluensulfonsyre, naftalin-mono- og -disulfonsyrer eller laurylsvovelsyre. Salter med fysiologisk ikke akseptable syrer, f.eks. pikrater, kan anvendes til isolering og/eller rensing av forbindelsene med formel I.

På den annen side kan en syre med formel I overføres ved omsetning med en base til et av dens fysiologisk akseptable metall- eller ammoniumsalter. Som salter kommer det da særlig i betraktning natrium-, kalium-, magnesium-, kalsium- og ammoni-umsaltet, videre substituerte ammoniumsalter, f.eks. dimetyl-, dietyl- eller diisopropyl-ammoniumsaltet, monoetanol-, dietanol- eller trietanolammoniumsaltet, sykloheksyl-, di-sykloheksylammoniumsaltet, dibenzyletylendiammoniumsaltet, dessuten f.eks. salter med N-metyl-D-glukamin eller med arginin eller lysin.

De nye forbindelsene med formel I og deres fysiologisk akseptable salter kan anvendes til fremstilling av farmasøytiske preparater, idet man bringer dem sammen med minst ett bærer- eller hjelpestoff og, om ønsket, sammen med én eller flere ytterligere aktive forbindelser i en egnet doseringsform. De således erholdte preparater kan anvendes som legemidler innen human- eller veterinærmedisinen. Som bærerstoffer kommer det på tale med organiske eller uorganiske stoffer som egner seg for den enterale (f.eks. orale eller rektale), parenterale (f.eks. intravenøs injeksjon) eller lokale (f. eks. topiske, dermale, oftalmiske eller nasale) applikasjon, eller for en applikasjon i form av en inhalasjonsspray, og som ikke reagerer med de nye forbindelsene, f.eks. vann eller vandig, isoton koksa] toppløsning, lavere alkoholer, planteoljer, benzylalkoholer, poly-etylenglykoler, glyseroltriacetat og andre fettsyreglyserider, gelatin, soyalecitin, karbo-hydrater som laktose eller stivelse, magnesiumstearat, talkum, cellulose, vaselin. For oral anvendelse tjener særlig tabletter, drasjeer, kapsler, siruper, safter eller dråper; av inter-esse er spesielt lakktabletter og kapsler med magesaftresistente overtrekk eller kapsel-hylser. For rektal anvendelse tjener suppositorier, for parenteral applikasjon oppløsning-er, fortrinnsvis olje- eller vannoppløsninger, videre suspensjoner, emulsjoner eller im-plantater. For topisk anvendelse egner seg f.eks. oppløsninger som anvendes i form av øyedråper, videre f.eks. suspensjoner, emulsjoner, kremer, salver eller komprimater. For applikasjonen som inhalasjonsspray kan det anvendes spray som inneholder den aktive forbindelse enten oppløst eller oppslemmet i en drivgass eller drivgassblanding (f.eks. C02 eller klorfluorhydrokarboner). Hensiktsmessig anvender man den aktive forbindelse da i mikronisert form, idet ett eller flere ytterligere, fysiologisk forenlige oppløsnings-midler kan være tilsatt, f.eks. etanol. Inhalasjonsoppløsninger kan administreres ved hjelp av vanlige inhalatorer. De nye forbindelsene kan også lyofiliseres og de erholdte lyo-filisater anvendes f.eks. til fremstilling av injeksjonspreparater. Injeksjonene kan således gis som bolus eller som kontinuerlig infusjon (f.eks. intravenøs, intramuskulær, subkutan eller intratekal). De angitte preparater kan være sterilisert og/eller inneholde hjelpestoffer som konserverings-, stabiliserings- og/eller fuktemiddel, emulgatorer, salter for påvirk-ning av det osmotiske trykk, bufferstoffer, farge- og/eller aromastoffer. Om ønsket kan de også inneholde én eller flere ytterligere aktive forbindelser, f.eks. ett eller flere vitaminer.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan som regel administreres analogt med andre kjente peptider som befinner seg i handelen, særlig imidlertid analogt med forbindelsene som er beskrevet i US-A-4 472 305, fortrinnsvis i doseringer mellom ca. 0,05 og 500, særlig mellom 0,5 og 100 mg pr. doseringsenhet. Den daglige dosering ligger fortrinnsvis mellom c a. 0,01 og 2 mg/kg kroppsvekt. Den spesielle dose for hver bestemt pasient avhenger imidlertid av de forskjelligste faktorer, f.eks. av aktiviteten til den an-vendte spesielle forbindelse, av alderen, kroppsvekten, den generelle helsetilstand, arv, av kosten, av administreringstidspunkt og veien, av utskillingshastigheten, legemiddelkom-binasjonen og alvorligheten av den enkelte sykdom som terapien gjelder for. Den parenterale applikasjon er foretrukket.

Videre kan de nye forbindelsene med formel I anvendes som integrin-ligander for fremstilling av kolonner for affinitetskromatografi for renfremstilling av integriner.

Liganden, dvs. et peptidderivat med formel I, kobles derved kovalent over ankerfunksj onene til en polymer bærer.

Som polymere bærermaterialer egner seg de i og for seg innen peptid-kjemien kjente polymere, faste faser med fortrinnsvis hydrofile egenskaper, f.eks. kryssbundet polysukker, som cellulose, Sepharose eller Sephadex, akrylamider, polymer på polyetylenglykolbasis eller Tentakelpolymere.

Som ankerfunksjoner som er forbundet med de polymere bærerne, egner seg fortrinnsvis lineære alkylenkjeder med 2-12 C-atomer som er bundet direkte til polymeren med en ende, og som på den andre enden har en funksjonell gruppe, som f.eks. hydroksy, amino, merkapto, maleinimido eller -COOH, og som dertil er egnet til å bli forbundet med C- eller N-endeavsnittet i det enkelte peptid.

Derved er det mulig at peptidet er forbundet direkte eller eventuelt over en andre ankerfunksjon med ankeret til polymeren. Videre er det mulig at peptider som inneholder aminosyreresten med funksjonaliserte sidekjeder, bindes over disse til anker-funksjonen til polymeren.

Dessuten kan bestemte aminosyrerester som er en bestanddel av peptidet med formel I, modifiseres i sine sidekjeder slik at de står til rådighet for forankring over f.eks. SH-, OH-, NH2- eller COOH-grupper med ankeret til polymeren.

Det er derved mulig med uvanlige aminosyrer, f.eks. som fenylalanin-derivater, som bærer en merkapto-, hydroksy-, amino- eller karboksyalkylkjede i 4-stilling, idet den funksjonelle gruppe befinner seg på enden av kjeden.

Eksempler på aminosyrerester hvis sidekjede kan tjene direkte som ankerfunksjon, er f.eks. Lys, Orn, Arg, Dab, Asp, Asn, Glu, Gin, Ser, Thr, Cys, Cit eller Tyr.

Eksempler på N-terminalt anker er rester som f.eks. -CO-CnH2n-NH2, -CO-CnH2n-OH, -CO-CnH2n-SH eller -CO-CnH2n-COOH med n = 2-12, idet lengden til alkylenkjeden ikke er av avgjørende betydning og den eventuelt også f.eks. kan erstattes med tilsvarende aryl- eller alkylarylrest. C-terminale ankere kan f.eks. være -CO-CnH2n-SH, -0-CnH2n-OH, -O-CnH2n-NH2, -0-CnH2n-COOH, -NH-Cn<H>2n-SH, -NH-CnH2n-OH, -NH-CnH2n-NH2 eller - NH-CnH2n-COOH, idet det som allerede er sagt i det forutgående avsnitt gjelder for n samt alkylenkjeden.

De N- og C-terminale ankere kan også tjene som ankerbyggesten for en allerede funksjonalisert sidekjede i en aminosyrerest. Det kommer her f.eks. på tale med aminosyrerester som Lys(CO-C5Hi0-NH2), Asp(NH-C3H6-COOH) eller Cys(C3H6-NH2), idet ankeret alltid er bundet til den funksjonelle gruppen i sidekjeden.

Fremstillingen av materialene for affinitetskromatografien for integrinrens-ingen skjer under betingelser som er vanlige for kondensasjon av aminosyrer, og som er i og for seg kjent og allerede beskrevet i avsnittet vedrørende fremstilling av forbindelsene med formel I.

Ovenfor og nedenunder er alle temperaturer angitt i °C. I de etterfølgende eksempler betyr "vanlig opparbeidelse": Om nødvendig tilsettes vann, det nøytraliseres, ekstraheres med eter eller diklormetan, separeres, den organiske fase tørkes over natrium-sulfat, det filtreres, inn dampes og renses ved kromatografi på silikagel og/eller krystal-lisasjon. RZ = retensjonstid (minutter) ved HPLC på Lichrosorb RP "select B"-kolonne (250-4,7 fim), elueringsmiddel: 0,3 % TFA i vann; isopropanolgradient 0-80 vol% på 50 minutter ved 1 ml/minutt. Strømning og påvisning ved 215 nm. M<+> = molekyltopp i massespektrum, erholdt etter "Fast Atom Bombardment"-metoden (FAB).

Eksempel 1

En oppløsning av 0,2 g H-Arg-Gly-Asp-D-Pro-Val-ONa [som f.eks. lar seg erholde fra Fmoc-Arg- Gly-Asp-D-Pro-Val-O-Wang, idet -O-Wang er den rest av en 4-oksymetyl-fenoksymeiiyl-polystyrenharpiks som anvendes ved de modifiserte Merrifield-teknikker, under avspalting av Fmoc-gruppen med piperidin/DMF og avspalting av har-piksen med TFA/CH2CI2 (1:1)] i 15 ml DMF ble fortynnet med 85 ml diklormetan og tilsatt 50 mg NaHC03. Etter avkjøling i en blanding av tørris og aceton ble 40 fil difenylfosforylazid tilsatt. Etter 16 timers henstand ved romtemperatur ble oppløsningen inndampet. Konsentratet ble gelfiltrert (Sephadex G10-kolonne med isopropanol og vann i forholdet 8:2) og så renset som vanlig ved hjelp av HPLC. Det ble erholdt syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Pro-Val); RZ = 13,4; M<+> 525.

Analogt likk man ved ringslutning av de tilsvarende lineære peptider: syklo-(Ai g-Gly-Asp-D-Tic-Val); RZ = 18,4; M<+> 587;

syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Lys-Val); RZ = 6,8; M<+> 556;

syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys); RZ = 10, 9; M<+> 604;

syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Gly); RZ = 13,1; M<+> 533;

syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Ala); RZ = 14,3; M<+> 547;

syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Phe); RZ = 22,0; M<+> 623;

syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu); RZ = 21,2; M<+> 589;

syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Nal-Val); RZ = 24,7; M<+> 625;

syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phg-Val); RZ = 16,5; M<+> 561;

syklo-(Arg-Gly-Asp-Phe-Gly); RZ = 13,2; M<+> 533;

syklo-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Ala); RZ = 14,8; M<+> 547;

syklo-(Axg-Gly-Asp-Phe-D-Phe); RZ = 20,2; M<+> 623;

syklo-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Leu); RZ = 21,4; M<+> 589;

syklo-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-D-Phe-Lys); RZ = 23,4; M<+> 816;

syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(H3C-CO); RZ = 17,0; M<+> 646;

syklo-(Arg(Mtr)-i(3-Ala-Asp-Phe-D-Val); RZ = 28,2; M<+> 801;

syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Nle); RZ = 22,0; M<+> 589;

syklo-(Arg-Gly-D-Asp-D-Phe-D-Gly); RZ = 18,7; M<+> 575;

syklo-(Arg-Aha-Asp-D-Phe-Val); RZ = 20,8; M<+> 631;

syklo-(Arg-Abu-Asp-Phe-D-Val); RZ = 17,2; M<+> 603;

syklo-(Arg-Aha-Asp-Phe-D-Val); RZ = 19,8; M<+> 631;

syklo-(Arg-Abu-Asp-D-Phe-Val); RZ = 17,8; M<+> 603; og syklo-(Arg-Gly-Asp-D-(4-I-Phe)-Val); RZ = 23,3; M+ 701.

Eksempel 2

En oppløsning av 0,28 g syklo-(Arg(Mtr)-i3-Ala-AspPhe-D-Val) [som lar seg erholde ved ringslutning ifølge eksempel 1] i 8,4 ml TFA, 1,7 ml diklormetan og 0,9 ml tiofenol fikk stå i 4 timer ved romtemperatur, ble deretter inndampet og frysetørket etter fortynning med vann. Gelfiltrering på Sephadex G10 (eddiksyre/vann i forholdet 1:1) og påfølgende rensing med preparativ HPLC under de angitte betingelser gav syklo-(Arg-/3-Ala-Asp-Phe-D-Val); RZ = 17,0; M<+> 589.

Analogt fikk man:

fra syklo-( Arg(Mtr)-Gly-Asp-D-Phe-Lys):

syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys); RZ = 10,9; M<+> 604.

Eksempel 3

80 mg syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu) ble oppløst 5-6 ganger i 0,01 M HC1 og frysetørket etter hver oppløsning. Påfølgende rensing ved hjelp av HPLC gav syklo-(Arg-Gly-Asp-D- Phe-Leu) x HC1; RZ = 20,6; M<+> 589.

Analogt fikk man:

fra syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu) ved behandling med eddiksyre: syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu) x H3C-COOH; RZ = 19,2; M<+> 589;

fra syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu) ved behandling med salpetersyre:

syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu) x HN03; RZ = 20,4; M<+> 589.

Eksempel 4

For fremstilling av affinitetsfaser oppslemmer man 0,9 g N-maleinimido-(CH2)5-CO-NH-(CH2)3-polymer [som lar seg erholde ved kondensasjon av N-maleinimido-(CH2)5-COOH med H2N-(CH2)3-polymer] i 10 ml 0,1 M natriumfosfatbuffer ved pH 7 og tilfører 1 ekvivalent syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO(CH2)2SH) ved 4 °C. Det ble omrørt i 4 timer ved samtidig oppvarming av reaksjonsblandingen til romtemperatur, den faste resten ble frafiltrert og vasket to ganger med 10 ml bufferoppløsning (pH 7) hver gang og deretter tre ganger med 10 ml vann hver gang. Det ble erholdt syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO(CH2)2S3-(N-maleinimido-(CH2)5-CONH-(CH2)3-polymer)).

Eksempel 5

Analogt med eksempel 4 fikk man ved kondensasjon av polymer-0-(CH2)3--NH2 [kommersielt tilgjengelig] og syklo-(ArgGly-Asp-D-Pro-Lys(CO(CH2)COOH [som lar seg erholde ved kondensasjon av adipinsyre med syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Pro-Lys) under de nevnte betingelser] den følgende polymere fase: syklo-(ArgGly-Asp-D-Pro-Lys-(CO-(CH2)4-CO-NH-(CH2)3-0-polymer).

Analogt fikk man ved kondensasjon av

syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys-(CO-(CH2)5-NH2)) med HOOC-CH2-0-polymer: syklo-(Ar)?-Gly-Asp-D-Phe-Lys-(CO-(CH2)5-NH-CO-CH2-0-polymer.

De etterfølgende eksempler vedrører farmasøytiske preparater.

Eksempel A

Injeksjons glass

En oppløsning av 100 g av et syklopeptid med formel I og 5 g dinatrium-hydrogenfosfat i 3 1 to ganger destillert vann ble innstilt på pH 6,5 med 2 N saltsyre, sterilfiltrert, fylt i injeksjonsglass, lyofilisert under sterile betingelser og lukket sterilt. Hvert injeksjonsglass inneholdt 5 mg aktiv forbindelse.

Eksempel B

Suppositorier

En blanding av 20 g aktiv forbindelse med formel I smeltes med 100 g soyalecitin og 1400 g kakaosmør, det helles i former og får avkjøles. Hvert suppositorium inneholder 20 mg aktiv forbindelse.

Eksempel C

Oppløsning

Det fremstilles en oppløsning av 1 g aktiv forbindelse med formel I, 9,38 g NaH2P04 x 2 H20, 28,48 g Na2HP04 x 12 H20 og 0,1 g benzalkoniumklorid i 940 ml to ganger destillert vann. Det innstilles på pH 6,8, fylles opp til 1 1 og steriliseres ved be-stråling. Denne oppløsningen kan anvendes i form av øyedråper.

Eksempel D

Salve

500 mg av aktiv forbindelse med formel I blandes med 99,5 g vaselin under aseptiske betingelser.

Eksempel E

Tabletter

En blanding av 100 g av et syklopeptid med formel I, 1 kg laktose, 600 g mikrokrystallinsk cellulose, 600 g maisstivelse, 100 g polyvinylpyrrolidon, 80 g talkum og 10 g magnesiumstearat presses på vanlig måte til tabletter, slik at hver tablett inneholder 10 mg aktiv forbindelse.

Eksempel F

Drasjeer

Tabletter presses som angitt i eksempel E og deretter overtrekkes de på vanlig måte med et belegg av sakkarose, maisstivelse, talkum, tragant og fargestoff.

Eksempel G

Kapsler

Hardgelatinkapsler fylles på vanlig måte med en aktiv forbindelse med formel I, slik at hver kapsel inneholder 5 mg aktiv forbindelse.

Eksempel H

Inhalasj onsspray

14 g aktiv forbindelse med formel I oppløses i 101 isoton NaCl-oppløsning, og oppløsningen fylles i kommersielle spraybokser med pumpemekanisme. Oppløs-ningen kan sprayes i munn eller nese. Et spraystøt (ca. 0,1 ml) tilsvarer en dose på ca. 0,14 mg.

Claims (8)

1. Syklopeptidforbindelse, karakterisert ved at den har formel I hvor B er Gly, Ala eller -HN-Q-CO-, D er Phe, 4-Hal-Phe, Nal eller Phg, E er Gly, Ala, Lys, Lys(Ac), Lys(AcNH2) eller Lys(AcSH), Hal er F, Cl, Br eller I, Q er alkylen med 1-6 C-atomer, og Ac er alkanoyl med 1-10 C-atomer, idet både D- og også L-formen er omfattet såfremt det dreier seg om rester av optisk aktive aminosyrer og aminosyrederivater, samt deres fysiologisk akseptable salter, med det forbehold at forbindelsen ikke er syklo-(Arg-Gly-Asp-Phe-Val) eller syklo-(Arg-Ala-Asp-Phe-Val) hvor optisk aktive aminosyrer kan være i enten D- eller L-formen.

2. Syklopeptidforbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er (a) syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Gly) eller et fysiologisk akseptabelt salt derav, (b) syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) eller et fysiologisk akseptabelt salt derav, (c) syklo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Phe) eller et fysiologisk akseptabelt salt derav, eller (d) syklo-(Arg-Gly-Asp-Phe-Gly) eller et eller et fysiologisk akseptabelt salt derav.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel I ifølge krav 1 eller et av dens salter, karakterisert ved at man frisetter den fra et av dens funksjonelle derivater ved behandling med et solvolyserende eller hydrogenolyserende middel, eller at et peptid med formel II hvor Z er -Arg-Ei-Asp-D-E-, -B-Asp-D-E-Arg-, -Asp-D-E-Arg-B-, -D-E-Arg-B-Asp- eller -E-Arg-B-Asp-D, eller et reaksjonsdyktig derivat av et slikt peptid behandles med et ringslutningsmiddel, og/eller at en basisk eller sur forbindelse med formel I overføres ved behandling med en syre eller base i et av dens salter.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske preparater, karakterisert ved at en forbindelse med formel I ifølge krav 1 og/eller et av dens fysiologisk akseptable salter bringes sammen med minst ett fast, flytende eller halvflytende bærer- eller hjelpestoff i en egnet doseringsform.

5. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved et innhold av minst én forbindelse med den generelle formel I ifølge krav 1 og/eller et av dens fysiologisk akseptable salter.

6. Anvendelse av forbindelser med formel I ifølge krav 1 eller av deres fysiologisk akseptable salter til fremstilling av et medikament for kontroll av forstyrrelser i blodomløpet, trombose, hjerteinfarkt, arteriosklerose, betennelser, apopleksi, angina pectoris, tumorsykdommer, osteolytiske forstyrrelser, osteoporose, angiogenese, restenose etter angioplastikk, infeksjoner og for å forbedre helingen av sår.

7. Anvendelse av forbindelser med formel I ifølge krav 1 til fremstilling av immobiliserte ligander for affinitetskolonnekromatografi.

8. Anvendelse av forbindelser med formel I ifølge krav 1 til rensing av integriner ved affinitetskromatografi.