NO309036B1 - Bicykliske isotioureaderivater som er nyttige for terapi, farmasøøytisk preparat inneholdede slike derivater, anvendelse derav samt fremgangsmÕte for deres fremstilling - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye bicykliske isotioureaderivater, fremgangsmåter for deres fremstilling, preparater inneholdende forbindelsene og deres anvendelse som neuro-beskyttende midler.

Tiourea- og isotioureaderivater har tidligere blitt beskrevet for en rekke forskjellige terapeutiske anvendelser. WO 94/12165 (Wellcome) beskriver enkle isotioureaderivater for bruk i behandlingen av blant annet systemisk hypotensjon, septisk sjokk og inflammatoriske tilstander; WO 95/09619 (Wellcome) (publisert etter foreliggende søknads prioritetsdato) beskriver substituerte urea- og isotioureaderivater for anvendelse i behandlingen av cerebral iskemi, GB-patent 1.178.242 (Wellcome) beskriver bistioureaforbindelser med antiinflamatorisk aktivitet; EP-patentsøknad 411615 (Warner Lambert) beskriver tioureaderivater som har anvendelse i behandlingen av symtpomer på kognitivt forfall; EP-patentsøknad 392802 (Beecham) beskriver tioureaderivater for bruk i behandlingen av bronkiale, cerebrovaskulære eller neuronale forstyrrelser.

Isotioureaderivater er også kjent som kjemiske mellomprodukter i fremstillingen av guanidinderivater (se US patent 4.211.867 (McNeil Laboratories) og Synthesis (1988) 6, 460-466 (Rasmussen) som beskriver forbindelsen 4-dimetylaminofenylkarbamimido-tioinsyremetylester og US patent 5.223.498 (Boots).

N-alkoksyfenyl-N'-kinolinyltioureaderivater som er nyttige som tuberkolostatiske midler er beskrevet i DE-B-1157626 (Hoechst).

Int. patentsøknad WO 95/05363 (Fisons) (publisert etter foreliggende søknads prioritetsdato) beskriver N-fenylamidinderivater som er indikert for behandling av blant annet neurodegenerativ sykdom.

Det har nå i foreliggende sammenheng blitt oppdaget en ny og nyttig gruppe av isotioureaderivater.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes nye forbindelser som er kjennetegnet ved at de har formel I

hvor

D representerer alkyl Cl-6,

T representerer en C3.5 mettet alkylenkjede substituert med -(CH2)m-NXY eller -U-(CH2)a-N(X)-(CH2)b-;

U representerer CH2;

a og b, som kan være like eller forskjellige, representerer et helt tall fra 0 til 3; forutsatt at a +b er i området fra 1 til 3;

X og Y, som kan være like eller forskjellige, representerer hydrogen, alkyl Cl-6 eller en gruppe -(CH2)nQ,

Q representerer fenyl eventuelt substituentert med halogen;

m og n representerer uavhengig et helt tall fra 0 til 5;

og farmasøytisk akseptable salter derav.

Det er foretrukket at T representerer -U-(CH2)a-N(X)-(CH2)b-. Det foretrekkes spesielt at T representerer -U-(CH2)a-N(X)-(CH2)b- og U representerer CH2. Det er særlig foretrukket at T representerer -U-(CH2)a-N(X)-(CH2)b-, U representerer CH2 og a og b representerer hver 1.

Det er foretrukket at D representerer alkyl Cl-3, spesielt metyl eller etyl, spesielt etyl.

Når T representerer -U-(CH2)a-N(X)-(CH2)b- foretrekkes det at X representerer hydrogen, metyl eller gruppen -CH2Q.

Når T representerer en C3.5 mettet alkylenkjede substituert med -(CH2)m-NXY, så foretrekkes det at X og Y uavhengig representerer hydrogen, metyl eller gruppen -CH2Q skjønt det er ikke foretrukket at X og Y begge representerer gruppen -CH2Q. Det foretrekkes spesielt at en av X og Y representerer hydrogen eller metyl og den andre representerer gruppen -CH2Q.

Det foretrekkes at n representerer 1.

Spesielt foretrukne forbindelser av formel I er: N-(l,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-yl)karbamimidotioinsyreetylester; N-6-(2-(((3-Uorfenyl)metyl(metyl)aniino)indanyl)karbamimidotioinsyreetylester; N-(2-metyl-l,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-yl)karbamimidotioinsyreetylester; N-(2-metyl-l,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-yl)karbamimidotioinsyremetylester;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt av hver av disse.

Ifølge oppfinnelsen er det også tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser av formel I og farmasøytisk akseptable salter derav, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved: (a) fremstilling av en forbindelse av formel I hvor X eller minst én av X og Y representerer alkyl Cl-6 eller gruppen -(CH2)„Q, ved omsetning av en tilsvarende forbindelse av formel I hvor X eller en eller begge av X og Y representerer hydrogen, med en forbindelse av formel II hvor R<1> representerer alkyl Cl-6 eller gruppen -(CH2)nQ og L er en avspaltningsgruppe, eller (b) fremstilling av en forbindelse av formel I hvor T representerer en C3.5 mettet alkylenkjede substituert med -(CH2)m-NXY, ved omsetning av en tilsvarende forbindelse hvor T representerer en C3.5 mettet alkylenkjede substituert med -(CH2)m-L og L representerer en avspaltningsgruppe,

med en forbindelse av formel III

hvor X og Y er som definert ovenfor, eller (c) omsetning av en forbindelse av formel IV hvor T er som definert ovenfor, med en forbindelse av formel V

hvor D er som definert ovenfor og L er en avspaltningsgruppe,

og, om nødvendig eller ønsket, omdannelse av den resulterende forbindelsen til et farmasøytisk akseptabelt salt derav eller vice versa som beskrevet i det nedenstående.

I fremgangsmåter (a) og (b) vil reaksjonene finne sted under standardbetingelser, f.eks ved omsetning av de to materialene i et inert oppløsningsmiddel under basiske betingelser ved romtemperatur i en periode på opptil 12 timer. Det har ofte blitt funnet ønskelig å behandle aminet med NaH før omsetning med den andre forbindelsen. Egnede avspaltningsgrupper L inkluderer tioalkyl, sulfonsyre, trifluorkarbonsulfonsyre, halogenid, alkyl og arylalkoholer og tosylgrupper; andre er angitt i "Advanced Organic Chemistry", J. March (1985) 3dje utgave, McGraw-Hill på side 315 og er velkjent innen teknikken. Det er foretrukket at L representerer halogenid, fortrinnsvis bromid.

I fremgangsmåte (c) vil reaksjonen forløpe ved kombinasjon av de to reaktantene i et inert oppløsningsmiddel, f. eks aceton. Egnede avspaltningsgrupper som L kan representere inkluderer tioalkyl, sulfonsyre, trifluorkarbonsulfonsyre, halogen, alkyl og arylalkoholer og tosylgrupper; andre er angitt i "Advanced Organic Chemistry", J. March

(1985) 3dje utgave, McGraw-Hill på side 315 og er velkjent innen teknikken. Det er foretrukket å benytte iodid-, toluensulfonat- eller metansulfonatderivatet.

Forbindelser av formel IV kan fremstilles ved å følge fremgangsmåten til Rasmussen et al i Synthesis (1988) 456-459. Forbindelser av formel III kan således fremstilles ved omsetning av en forbindelse av formel VI

hvor T er som definert ovenfor, med benzoylisotiocyanat fulgt av vandig-alkalisk spalting av det resulterende benzoyltioureaderivatet.

Forbindelser av formel VI kan fremstilles ved reduksjon av en tilsvarende forbindelse av formel VII

hvor T er som definert ovenfor.

Reduksjonsreaksjonen kan utføres under en rekke forskjellige betingelser, f.eks de som

beskrevet i J. March "Advanced Organic Chemistry" 3dje utgave (1985) på sidene 1103-1104. Disse inkluderer katalytisk hydrogenering, anvendelse av Zn-, Sn- eller Fe-metall, AIH3-AICI3, sulfider og andre. Det er foretrukket å utføre reaksjonen ved hydrogenering ved atmosfæretrykk i nærvær av en palladium- og karbonkatalysator i typisk 1-4 timer, inntil reduksjon er fullstendig.

Forbindelser av formel VII hvor T er som definert ovenfor og X eller minst av X og Y representerer alkyl Cl-6 eller gruppen -(CH2)nQ, kan fremstilles ved omsetning av en tilsvarende forbindelse av formel VII hvor X og/eller Y representerer hydrogen, med en forbindelse av formel II.

Denne reaksjonen kan utføres under betingelser analoge med de beskrevet ovenfor i fremgangsmåte (a).

Forbindelser av formel VII hvor T representerer en C3.5 mettet alkylenkjede substituert med -(CH2)m-NXY, kan fremstilles ved omsetning av en tilsvarende forbindelse hvor T representerer en C3.5 mettet alkylenkjede substituert med -(CH2)m-L og L representerer en avspaltningsgruppe, med en forbindelse av formel HI.

Denne reaksjonen kan utføres under betingelser analoge med de beskrevne ovenfor i fremgangsmåte (b).

Forbindelser av formel VII hvor X representerer hydrogen er enten kjent eller kan fremstilles ved hjelp av kjente metoder. De kan f.eks fremstilles ved nitrering av det unitrerte derivatet. Denne nitreringsreaksjonen finner vanligvis sted ved omsetning av den unitrerte aromatiske forbindelsen med salpetersyre enten alene eller i vann, eddiksyre, eddiksyreanhydrid eller svovelsyre. Ytterligere detaljer når det gjelder disse reaksjonene og ytterligere alternative reagenser er angitt i J. March "Advanced Chemistry" 3dje utgave (1985) på sidene 468-470.

Forbindelser av formel II, III og V er enten kjente eller kan fremstilles ved hjelp av konvensjonelle i og for seg kjente metoder.

Forbindelser av formel I kan fremstilles som sådan, eller som syreaddisjonssalter av den type som er beskrevet ovenfor. De kan alternativt fremstilles som et ikke-farmasøytisk akseptabelt addisjonssalt, f.eks et salt av oksalsyre, og et hvilket som helst produkt derav kan deretter omdannes til et farmasøytisk akseptabelt salt ved hjelp av konvensjonelle metoder.

Salter av forbindelser av formel I kan dannes ved omsetning av den frie syren, basen eller et salt derav, med en eller flere ekvivalenter av den passende basen eller syren. Reaksjonen kan utføres i et oppløsningsmiddel eller medium hvori saltet er uoppløselig eller i et oppløsningsmiddel hvori saltet er oppløselig, f.eks vann, dioksan, etanol, tetra-hydrofuran eller dietyleter, eller en blanding av oppløsningsmidler, som kan fjernes i vakuum ved frysetørking. Reaksjonen kan være en metateseprosess eller den kan utføres på en ionevekslerharpiks.

Amin- eller andre reaktive grupper kan om nødvendig beskyttes ved bruk av en beskyttelsesgruppe som beskrevet i standardteksten "Protecting groups in Organic Synthesis", 2. utgave (1991) av Greene og Wuts. Aminbeskyttelsesgrupper som spesielt kan nevnes inkluderer alkyloksykarbonyl C2-7, f.eks t-butyloksykarbonyl, fenylalkyl-oksykarbonyl C8-13, f.eks benzyloksykarbonyl. Det er imidlertid foretrukket å beskytte amingrupper ved behandling med trifluoreddiksyreanhydrid i et egnet oppløsningsmiddel (f.eks metylenklorid, metanol) ved romtemperatur. Beskyttelsesfjerning kan oppnås ved hydrolyse i vann.

Foreliggende forbindelser og mellomprodukter kan isoleres fra deres reaksjonsblandinger ved hjelp av standard teknikker.

Betegnelsen "alkyl Cl-6" inkluderer rettkjedet, forgrenet, mettet, umettet, alifatisk og cyklisk alkyl inneholdende 1-6 karbonatomer. "Alkyl Cl-3" kan tolkes på lignende måte.

Forbindelsene av formel I kan eksistere i enantiomere former. De forskjellige optiske isomerene kan isoleres ved separering av en racemisk blanding av forbindelsene ved bruk av konvensjonelle teknikker, f.eks fraksjonert krystallisering, eller HPLC. De individuelle enantiomerene kan alternativt fremstilles ved omsetning av de passende optisk aktive utgangsmaterialene under reaksjonsbetingelser som ikke vil forårsake racemisering.

Mellomproduktforbindelser kan også eksistere i enantiomere former og kan benyttes som rensede enantiomerer, diastereomerer, racemater eller blandinger.

Forbindelsene av generell formel I er i besittelse av nyttig farmakologisk aktivitet i dyr. Spesielt er de i besittelse av nyttig nitrogenoksyd-syntetaseinhiberende aktivitet og forventes å være nyttige i behandlingen eller profylaksen av sykdommer hos mennesker eller tilstander hvor syntesen eller oversyntesen av nitrogenoksydformer er en medvirkende part; f.eks hypoksi, f.eks i tilfeller av hjertestopp, slag og neonatal hypoksi, neurodegenerative tilstander inkludert nervedegenerasjon og/eller nervenekrose i forstyrrelser slik som iskemi, hypoksi, hypoglykemi, epilepsi, og i eksterne sår (slik som skade på ryggmargen og hodet), hyperbare oksygenkonvulsjoner og toksisitet, demente f.eks presenil demente, Alzheimers sykdom og AIDS-relatert demente. Sydenham's chorea, Parkinson's sykdom, Huntington's sykdom, amyotrofisk lateral sclerose, KorsakofFs sykdom, imbesilitet i forbindelse med en cerebral karforstyrrelse, søvn-forstyrrelser, schizofreni, angst, depresjon, periodisk affektiv forstyrrelse, jetsyndrom, depresjon eller andre symptomer som er forbundet med premenstruelt syndrom (PMS), angst og septisk sjokk. Forbindelser av formel I kan også forventes å vise aktivitet med hensyn til forebyggelse og reversering av toleranse overfor opiater og diazepiner, behandling av legemiddelmisbruk, smertelindring og behandling av migrene og andre vaskulære hodepiner. Foreliggende forbindelser kan også vise nyttig immunosuppressiv aktivitet, være nyttige i behandlingen eller profylaksen av inflammasjon, i behandlingen av gastrointestinale motilitetsforstyrrelser, og i induksjon av arbeid. Forbindelsene kan også være nyttige i behandlingen av kreftformer som uttrykker nitrogenoksydsyntetase.

Forbindelser av formel I forventes å være særlig nyttige i behandling eller profylakse av neurodegenerative tilstander eller av migrene eller for forebyggelse og reversering av toleranse overfor opiater og diazepiner eller for behandling av legemiddelmisbruk og spesielt i behandling eller profylakse av neurodegenerative forstyrrelser. Av særlig interesse er tilstander valgt fra gruppen bestående av hypoksi, iskemi, slag og amyotrofisk lateral sclerose.

Ifølge et annet aspekt ved oppfinnelsen er det tilveiebragt en forbindelse for bruk som terapeutikum, og denne forbindelsen er kjennetegnet ved at den har formel I.

Videre er det ifølge oppfinnelsen tilveiebragt et farmasøytisk preparat, som er kjennetegnet ved at det omfatter en forbindelse som definert i hvilket som helst av de medfølgende krav 1-5 i blanding med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer.

Sluttelig er det ifølge oppfinnelsen tilveiebragt anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av de medfølgende krav 1-6 i fremstillingen av et legemiddel for behandling eller profylakse av neurodegenerative forstyrrelser, eller for forebyggelse og reversering av toleranse overfor opiater og diazepiner eller for behandling av legemiddelmisbruk.

For de ovennevnte terapeutiske indikasjoner vil den dosen som administreres naturligvis variere med den forbindelse som benyttes, administrasjonsmåten og den ønskede

behandling. Generelt oppnås tilfredsstillende resultater når forbindelsen administreres til et menneske ved en daglig dose av den faste formen på mellom 1 mg og 2000 mg pr dag.

Forbindelsene av formel I og farmasøytisk akseptable derivater derav kan benyttes alene eller i form av passende medisinske preparater for enteral eller parenteral administrasjon.

Foreliggende farmasøytiske preparat omfatter fortrinnsvis mindre enn 80 % og mer foretrukket mindre enn 50 % av en forbindelse av formel I, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, i blanding med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer.

Eksempler på slike fortynningsmidler og bærere er: for tabletter og drageer: laktose, stivelse, talk, stearinsyre; for kapsler: vinsyre eller laktose; for injiserbare oppløsninger: vann, alkoholer, glyserin, vegetabilske oljer; for suppositorier: naturlige eller herdede oljer eller vokser.

Preparater i en form som er egnet for oral, dvs øsofag administrasjon, innbefatter: tabletter, kapsler og drageer; preparater med langvarig frigivningsvirkning inkluderer de hvori den aktive bestanddel er bundet til en ionevekslerharpiks som eventuelt er belagt med en diffusjonsbarriere for å modifisere harpiksens frigivningsegenskaper.

Det er foretrukket at preparatet inneholder opptil 50 % og mer foretrukket opptil 25 vekt-% av forbindelsen av formel I, eller et farmasøytisk akseptabelt derivat derav. Enzymet nitrogenoksydsyntetase har en rekke forskjellige isoformer og forbindelser av formel I, og farmasøytisk akseptable salter derav, kan undersøkes med hensyn til nitrogenoksydsyntetase-inhiberende aktivitet ved hjelp av prosedyrer som er basert på de til Bredt og Snyder i Proe. Nati. Acad. Sei. (1990) 87, 682-685 og Forstermann et al, Eur. J. Pharm. (1992) 225, 161-165 som følger. Nitrogenoksydsyntetase omdanner <3>H-L-arginin til 3H-L-citrulin som kan separeres ved kationvekslerkromatografi og kvantifiseres ved scintillasjonstelling.

Undersøkelse A

(A) Undersøkelse for neuronal nitrogenoksydsyntetase-inhiberende aktivitet

Enzym ble isolert fra rottehippocampus eller -cerebellum. Cerebellum eller hippocampus

i en Sprague-Dawley-hannrotte (250-275 g) fjernes etter C02-anestesi av dyret og dekapitering. Cerebellar eller hippocampal supernatant prepareres ved homogenisering ved 50 raM tris-HCl med 1 mM EDTA-buffer (pH 7,2 ved 25°C) og sentrifugering i 15 minutter ved 20.000 g. Resterende L-arginin fjernes fra supernatanten ved kromatografi suksessivt gjennom kolonner av henholdsvis natriumformen og hydrogenformen av Dowex AG-50W-X8, og ytterligere sentrifugering ved 1000 g i 30 sekunder.

For analyse tilsettes 25 ul av sluttsupernatanten til hver av 96 brønner (i en 96 brønners filterplate) inneholdende 25 ul L-argininoppløsning (av konsentrasjon 18 um ^-L-arginin, 96 nM H-L-arginin) og enten 25 ul av en analysebuffer (50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1,5 mM CaCl2, pH 7,4) eller 25 ul av testforbindelsen i bufferen ved 22°C. Til hvert reagensrør tilsettes 25 ul komplett analysebuffer (50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1,5 mM CaCl2, 1 mM DTT, 100 uM NADPH, 10 ug/ml calmodulin, pH 7,4) for å initiere reaksjonen og reaksjonen stoppes etter 10 minutter ved tilsetning av 200 ul av en oppslemming av termineringsbuffer (20 mM HEPES, 2 mM EDTA, pH 5,5) og Dowex AG-50W-X8 200-400 mesh.

Merket L-citrullin separeres fra merket L-arginin ved filtrering av hver filterplate og 75 u, 1 av hver terminerte reaksjonsblanding tilsettes til 3 ml scintillasjonscocktail. Nevnte L-citrullin kvantifiseres deretter ved scintillasjonstelling.

I et typisk forsøk ved bruk av den cerebellare supernatanten økes basalaktiviteten med 20.000 dpm/ml prøve over en reagensblindprøve som har en aktivitet på 7.000 dpm/ml. En referansestandard, N-nitro-L-arginin, som gir 80 % inhibering av nitrogenoksydsyntetase ved en konsentrasjon på 1 um, testes i analysen for å verifisere prosedyren.

Undersøkelse B

(B) Undersøkelse for induserbar nitrogenoksydsyntetase-inhiberende aktivitet

Enzym prepareres, etter induksjon, fra den dyrkede humane colorektale carcinomcelle-linjen DLD-1, (oppnådd fra European Collection of Animal Cell Cultures). DLD-1 celler dyrkes i RPMI 1640 medium supplert med 10 % føtal bovinserum, 40 mM L-glutamin og antibiotika (100 enheter/penicillin G, 100 ug/ml streptomycin og 0,25 ug/ml amfotericin B) og 100 ug/ml kanamycin. Celler dyrkes rutinemessig i 225 cm kolber inneholdende 35 ml medium holdt ved 37°C og i en fuktet atmosfære inneholdende 5 % C02.

Nitrogenoksydsyntetase produseres av celler som respons på interferon -ca 250 U/ml EL-1, 1000 U/ml EFNy, 200 U/ml IL-6 og 200 U/ml TNF-alfa. Etter en periode på 17-20 timer i kultur oppnås høsting av celler ved skraping av cellebelegget fra kolbeoverflaten ned i kulturmediet. Celler oppsamles ved sentrifugering (1000 g i 10 minutter) og lysat prepareres ved tilsetning til cellepelleten av en oppløsning inneholdende 50 mM TRIS-Hcl (pH 7,5 ved 20°C), 10 % (v/v) glyserol, 0,1 % (v/v) Triton-X-100, 0,1 um ditio-treitol og en blanding av proteaseinhibitorer omfattende leupeptin (2 ug/ml), soyabønne-trypsininhibitor (10 ug/ml), aprotinin (5 ug/ml) og fenylmetylsulfonylfluorid (50 ug/ml).

For analysen blir 25 ul substratblanding (50 mM Tris-HCl (pH 7,5 ved 20°C), 400 um NADPH, 20 um flavindiadenindinukleotid, 20 um flavinmononukleotid, 4 mM tetrahydrobiopterin, 12 um L-arginin og 0,025 uCi L-[<3>H] arginin) tilsatt til brønner i en 96 brønners filterplate (0,45 um porestørrelse) inneholdende 25 ul av en oppløsning av testforbindelse i 50 mM Tris-HCl. Reaksjonen startes ved tilsetning av 50 ul cellelysat (fremstilt som angitt ovenfor) og etter inkubasjon i 1 time ved romtemperatur blir den stoppet ved tilsetning av 50 ul av en vandig oppløsning av 3 mM nitroarginin go 21 mM

EDTA.

Merket L-citrullin separeres fra merket L-arginin ved bruk av Dowex AG-50W. 150 ul av en 25 % vandig oppslemming av Dowex 50W (Na<+> form) tilsettes til analyse-blandingen hvoretter det hele filtreres ned i 96 brønners plater. 70 ul filtrat tas som prøve og tilsettes til brønner i 96 brønners plater inneholdende fast scintillasjonsmiddel. Etter å ha latt prøvene tørke blir nevnte L-citrullin kvantifisert ved scintillasjonstelling.

I et typisk forsøk er basalaktiviteten 300 dpm pr 70 ul prøve som økes til 1900 dpm i reagenskontrollene. Aminoguanidin, som gir en IC50-verdi (50 % inhiberende konsentrasjon) på 10 um, testes som en standard for å verifisere prosedyren.

Undersøkelse C

(C) Undersøkelse for nitrogenoksydsyntetase-inhiberende endotelaktivitet

Enzym kan isoleres fra humane umbilikalvene-endotelceller (HUVECer) ved en

prosedyre basert på den til Pollock et al (1991) Proe. Nati. Acad. Sei. 88, 10480-10484. HUVECer ble innkjøpt fra Clonetics Corp (San Diego, CA, USA) og dyrket til konfluens. Celler kan holdes til passasje 35-40 uten signifikant tap av utbytte av nitrogenoksydsyntetase. Når celler når konfluens blir de resuspendert i Dulbecco's fosfatbufret saltoppløsning, sentrifugert ved 800 omdr/min i 10 min, cellepelleten homogeniseres i iskald 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 10 % glyserol, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 2 um leupeptin ved pH 4,2. Etter sentrifugering ved 34.000 omdr/min i 60 min blir pelleten oppløseliggjort i homogeniseirngsbufferen som også inneholder 20 mM CHAPS. Etter en 30 minutters inkubasjon på is sentrifugeres suspensjonen ved 34.000 omdr/min i 30 min. Den resulterende supernatant lagres ved

-80°C inntil bruk.

For analysen blir 25 ul av sluttsupernatanten tilsatt til hver brønn i en 96 brønners filterplate inneholdende 25 ul L-argininoppløsning (av konsentrasjon 12 uM ^-L-arginin, 64 nM <3>H-L-arginin) og enten 25 ul av en analysebuffer (50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1,5 mM CaCl2, pH 7,4) eller 25 ul av testforbindelse i bufferen ved 22°C. Til hver brønn ble det tilsatt 25 ul komplett analysebuffer (50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1,5 mM CaCl2, 1 mM DTT, 100 uM NADPH, 10 ug/ml calmodulin, 12 um tetrahydrobiopterin, pH 7,4) for å initiere reaksjonen og reaksjonen stoppes etter 30 min ved tilsetning av 200 ul av en 50 % oppslemming av termineringsbuffer (20 mM HEPES, 2 mM EDTA, pH 5,5) og Dowes AG-50W X8 200-400 mesh.

Merket L-citrullin separeres fra merket L-arginin ved filtrering ned i en annen 96 brønners plate og 75 ul av hver terminerte reaksjonsblanding tilsettes til 3 ml scintillasjonscocktail. Nevnte L-citrullin blir deretter kvantifisert ved scintillasjonstelling. I et typisk forsøk økes basalaktivitet med 5.000 dpm/ml prøve over en reagenskontroll som har en aktivitet på 15.000 dpm/ml. En referansestandard, N-nitro-L-arginin, som gir 70-90 % inhibering av nitrogenoksydsyntetase ved en konsentrasjon på 1 um testes i analysen for å verifisere prosedyren.

Forbindelser kan også testes i en X-vivoanalyse for å bestemme graden av hjerne-penetrasjon.

Undersøkelse D

(D) Ex vivo-analyse for neuronal nitrogenoksydsyntetase-inhiberende aktivitet

Sprague-Dawley-hannrotter (250-275 g) ble dosert intravenøst ved 10 mg/kg med

testforbindelse oppløst i 0,9 % saltoppløsning eller med saltoppløsning alene som kontroll. Ved en forutbestemt tid (typisk 2-24 timer) etter behandlig ble dyrene avlivet, cerebellum fjernet og supernatanten preparert og analysert med henblikk på nitrogenoksydsyntetaseaktivitet som beskrevet i undersøkelse A.

Som en ytterligere påvisning ble en fraksjon av den cerebellare supernatanten påført på en 2'-5'-ADP Sepharose-kolonne (som binder nitrogenoksydsyntetase) og deretter eluert med NADPH. Elueringsmidlet ble testet for nitrogenoksydsyntetaseaktivitet etter prosedyren i undersøkelse A.

Forbindelser som penetrerer rottehjernen og inhiberer neuronal nitrogenoksydsyntetase resulterte i redusert nitrogenoksydsyntetaseaktivitet både i supernatantpreparatet og i elueringsmaterialet fra 2'-5'-ADP Sepharose-kolonnen.

I undersøkelsene for nitrogenoksydsyntetaseinhiberende aktivitet er forbindelsesaktivitet uttrykt som IC50 (konsentrasjonen av legemiddelsubstans som gir 50 % enzyminhibering i analysen). IC50-verdier for testforbindelser ble til og begynne med beregnet fra den inhiberende aktiviteten til 1, 10 og 100 um oppløsninger av forbindelsene. Forbindelser som inhiberte enzymet med minst 50 % ved 10 um ble testet på nytt ved bruk av mer passende konsentrasjoner slik at en IC50-verdi kunne bestemmes.

I undersøkelse A ovenfor (en undersøkelse for aktivitet mot den neuronale isoformen av nitrogensoksydsyntetase), ga forbindelsen i eksempel 1 nedenfor en IC50-verdi på mindre enn 10 um hvilket indikerer at den forventes å vise nyttig terapeutisk aktivitet. I undersøkelser B og C (undersøkelsene for aktivitet mot de makrofage og endotele isoformene av nitrogenoksydsyntetase) ga forbindelsen i eksempel 1 IC50-verdier som var mer enn 10 ganger større enn de oppnådd i undersøkelse av hvilket indikerer at den viser ønsket selektivitet.

Forbindelsene i eksempel 2 ble også testet i undersøkelse A og ga også en IC50-verdi på mindre enn 10 um. Denne forbindelsen forventes således å vise nyttig terapeutisk aktivitet.

Sammenlignet med forbindelser i den tidligere teknikk har forbindelsene av formel I, og farmasøytisk akseptable salter derav, den fordel at de kan være mindre toksiske, være mer effektive, ha lenger virkningsvarighet, ha et bredere aktivitetsområde, være mer potente, være mer selektive for den neuronale isoformen av nitrogensyntetaseenzym, gi færre bivirkninger, bli letter absorbert eller ha andre nyttige farmakologiske egenskaper.

Oppfinnelsen illustreres av følgende eksempler:

EKSEMPEL 1

N-(l,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-yl)karbamimidotioinsyreetylester

(a) 2-(7-amino-l,2,3,4-tetrahydrokinolin)2,2,2-trifluoracetamid

Til en oppløsning av 4,21 g (23,6 mmol) 7-nitro-l,2,3,4-tetrahydroisokinolin og 3,6 ml (926 mmol) trietylamin i 100 ml metylenklorid ved 0°C ble tilsatt 3,5 ml (25 mmol) trifluoreddiksyreanhydrid. Reaksjonsblandingen ble omrørt natten over. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med fortynnet saltsyre. Den vandige fasen ble gjort basisk og ekstrahert med metylenklorid. Den tørkede organiske fasen (magnesiumsulfat) ga N-(7-nitro-l,2,3,4-tetrahydroisokinolin)trifluoracetamid som et gult fast stoff. Denne forbindelsen ble umiddelbart opptatt i 200 ml etanol, 0,50 g 5 % palladium på karbon ble tilsatt, og blandingen ble hydrogenen på en Parr-hydrogenator ved 310 kPa i 1,5 timer. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og oppløsningsmidlet ble inndampet. Resten ble triturert med 100 ml petroleumeter og dette ga 5,45 g (95 %) av tittelforbindelsen som et grått fast stoff, smp 61-3°C.

(b) 1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-tiourea

Til en oppløsning av 1,3 ml (9,7 mmol) benzoylisotiocyanat i 13 ml aceton ved tilbakeløp ble det hurtig tilsatt 1,25 g (5,12 mmol) 2-(7-amino-1,2,3,4-tetrahydroiso-kinolin)trilfuoracetamid ved en slik hastighet at tilbakeløpskoking ble regulert. Etter at tilsetningen var fullført ble reaksjonsblandingen omrørt i 3 timer. Det faste stoffet ble oppsamlet ved avkjøling og vasket med 30 ml aceton og dette ga 1,74 g (83 %) av mellomproduktet l-benzoyl-3-[2-(2-2-2-trifluoracetamid)l,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-tiourea som et gråhvitt fast stoff. Denne forbindelsen ble umiddelbart tilsatt til 20 ml av en 5 % natriumhydroksydoppløsning og den resulterende oppløsning ble oppvarmet ved 80°C i 1 time. Etter avkjøling til omgivelsestemperatur ble oppløsningen filtrert og dette ga 0,78 g (74 %) av tittelforbindelsen, smp 198-203°C.

(c) N-(l,2,3,4-tetrahydroisokinoIin-7-yI)karbamimidotioinsyreetyIester

Til en suspensjon av 0,75 g (3,61 mmol) 1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-tiourea i 10 ml isopropanol ble det tilsatt 0,35 g (3,7 mmol) metansulfonsyre i 2 ml isopropanol. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 0,25 timer før 0,85 ml (8,4 mmol) etylmetansulfonat ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet ved tilbakeløp i 4 timer. Oppløsnings-midlet ble avdrevet i vakuum hvilket ga en olje som ble oppløst i 100 ml vann. Den vandige fasen ble gjort basisk med mettet natriumbikarbonat og den vandige fasen ble ekstrahert 8 ganger med 100 ml metylenklorid. De kombinerte ekstraktene ble tørket over magnesiumsulfat og konsentrert og dette ga 0,61 g av en olje som størknet ved henstand. Kolonnekromatografi på silisiumdioksydgel ved anvendelse av 10 % metanol i kloroform mettet med ammoniakk ga 0,45 g (53 %) av tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff, MS 236 (M+H).

EKSEMPEL 2

N-5-(2-(((3-klorfenyl)metyl(metyl)amino)indanyl)karbaniimidotioinsyreetylester (a) 2-((3-klorfenyl)karbonyl)amino-5-nitroindan

Til 2-amino-5-nitroindanhydroklorid (1,5 g, 7,0 mmol) i metylenklorid (50 ml) ved 0°C ble trietylamin (2,1 ml, 15,0 mmol) tilsatt fulgt av 3-klorbenzoylklorid (1,0 ml, 7,5 mmol). Blandingen ble umiddelbart dumpet i vann og lagene separert. Det vandige laget ble ekstrahert med metylenklorid (2 x 20 ml) og de kombinerte ekstraktene vasket med vann, tørket over MgSC>4, filtrert og konsentrert til en olje som var homogen ved TLC og ble umiddelbart benyttet i det neste trinnet: M.S. (M+H)<+> = 317.

(b) 2-((3-klorfenyl)metyl)amino-5-nitroindan

Til 2-((3-klorfenyl)karbonyl)amino-5-nitroindan (2,2 g, 7,0 mmol) i THF (75 ml) ble BH3»THF (10 M, 35 ml, 35 mmol) tilsatt dråpevis. Blandningen ble tilbakeløpskokt i 2 timer, avkjølt til 0°C, tilsatt 4 N HC1 (60 ml) og tilbakeløpskokt i 1 time. Den resulterende oppløsning ble inndampet til en olje, gjort basisk med 50 % NaOH, og ekstrahert med metylenklorid (3 x 20 ml). De kombinerte ekstraktene ble vasket med vann, tørket over MgS04, filtrert og konsentrert til en olje. Behandling med IPA/HC1 ga 2-((3-klorfenyl)metyl)amino-6-nitroindan: (2,1 g, 88 % to trinn); smp 234-237°C.

(c) 2-((3-klorfenyl)metyl)(metyl)amino-5-nitroindan

Til 2-((3-klorfenyl)metyl)amino-5-nitroindan (4,4 g, 14,5 mmol) i maursyre (5,5 ml) ble formaldehyd (12 ml) tilsatt. Blandingen ble oppvarmet til tilbakeløp i 30 minutter, avkjølt, nøytralisert med 2N NaOH og ekstrahert med etylacetat (3 x 70 ml). De kombienrte ekstraktene ble vasket med vann, tørket over MgS04, filtrert og konsentrert til en olje: (4,2 g, 91 %); M.S. (M+H)<+> = 317.

(d) 2-((3-klorfenyl)metyl(metyl)amino-5-aminobenzen

Til 2-((3-klorfenyl)metyl(metyl)amino-5-nitroindan (4,3 g, 13,6 mmol) i 85 % AcOH/ H20 (100 ml) ble det tilsatt sinkmetall (7,1 g, 109,0 mmol). Blandingen ble omrørt i 5 min, filtrert gjennom celitt og inndampet til en olje. Oljen ble dumpet i basisk vann og ekstrahert med etylacetat (3x10 ml). De kombinerte ekstraktene ble vasket med vann, tørket over MgS04, filtrert og konsentrert til en olje: (3,6 g, 92 %); M.S. (M+H)<+> = 287.

(e) 5-(2-(((3-klofenyl)metyl(metyl)amino)indanyl)-l-benzoyl-2-tiourea

Til en oppløsning av benzoylisotiocyanat (2,7 g, 16,5 mmol) i 15 ml tørr aceton, forvarmet til en meget forsiktig tilbakeløpskoking, ble det foretatt hurtig tilsetning ved en slik hastighet at sterk tilbakeløpskoking ble kontrollert, av 2-((3-klorfenyl)metyl (metyl)amino-5-aminobenzen (3,6 g, 12,4 mmol) oppløst i 10 ml tørr aceton. Reaksjonsblandingen ble tilbakeløpskokt i 30 minutter, helt på is under sterk omrøring, og ekstrahert med etylacetat (3 x 100 ml). De kombinerte ekstraktene ble vasket med vann, tørket over MgS04, filtrert og konsentrert til et fast stoff som ble omkrystallisert fra IPA: (3,12 g, 58 %); smp 128-120T.

(f) 5-(2-(((3-klorfenyl)metyl(metyl)amino)indanyl)-2-tiourea

En blanding av 5-(2-(((3-klorfenyl)metyl(metyl)amino)indanyl)-l-benzoyl-2-tiourea (3,1 g, 7,12 mmol) og 40 ml 25 N vandig natriumhydroksyd ble oppvarmet ved 90°C i 35 minutter under omrøring. Den varme reaksjonsblandingen ble helt i 6 ml vann under omrøring. Produktet ble ekstrahert i tre porsjoner av metylenklorid. De kombinerte ekstraktene ble vasket med vann, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert til tørrhet. Resten ble kromatografert over silisiumdioksydgel (8:1 etylacetat/heksan) og konsentrert til en olje (2,2 g, 93 %); M.S. (M+H)<+> = 246.

(g) N-5-(2-(((3-klorfenyl)metyl(metyl)amino)indanyl)karbamimidotioinsyreetyl

ester

5-(2-(((3-klorfenyl)metyl(metyl)amino)indanyl)-2-tiourea (2,2 g, 6,33 mmol) ble suspendert i 20 ml 200 etanol og blandingen ble behandlet med 0,41 ml metansulfonsyre, og deretter 1,35 ml etylmetansulfonat. Blandingen ble tilbakeløpskokt i 4 timer, inndampet, gjort basisk med mettet bikarbonat, og ekstrahert med metylenklorid (3 x 30 ml). De kombinerte ekstraktene ble vasket med vann, tørket over MgS04, filtrert og konsentrert til en olje som ble oppløst i etylacetat og behandlet med IPA/HC1. De faste stoffene ble filtrert og vasket med IPA: (2,40 g, 83 %); smp. dekomp. >150°C.

EKSEMPEL 3

N-(2-metyl-l,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-yl)karbamimidotioinsyreetylesterdi-hydroklorid

(a) 7-nitro-2-metyl-l,2,3,4-tetrahydroisokinolinhydroklorid

En oppløsning av 4,00 g (18,7 g mmol) 7-nitroisokinolin i 10 ml maursyre og 17 ml 38 % vandig formaldehyd ble oppvarmet ved tilbakeløp i 1 time. Reaksjonsblandingen ble avkjølt, helt på is og gjort basisk med vandig ammoniakk. Den gummiaktige resten som ble utfelt ble ekstrahert to ganger med metylenklorid. Den tørkede (magnesiumsulfat) organiske fasen ble konsentrert og dette ga uren 7-nitro-2-metyl-l,2,3,4-tetrahydroiso-kinolin som en tykk olje. Denn oljen ble umiddelbart opptatt i etanol (50 ml) og en oppløsning av saltsyre i etanol ble tilsatt inntil oppløsningen var klart sur til lakmus. Eter ble tilsatt for å indusere utfelling og det resulterende faste stoff ble oppsamlet og dette ga 3,99 g (93 %) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff, smp 236-8°C (dekomp.).

(b) 7-amino-2-metyl-l,2,3,4-tetrahydroisokinolinhydroklorid

En suspensjon av 3,98 g (17,5 mmol) 7-nitro-2-metyl-l,2,3,4-tetrahydroisokinolinhydro-klorid og 0,4 g 10 % palladium på karbon i 200 ml etanol ble hydrogenen ved 345 kPa i 2 timer. Katalysatoren ble filtrert og vasket med en liten mengde vann. Filtratet ble konsentrert hvilket ga en vandig oppløsning. Absolutt etanol ble tilsatt og inndampet under avdrivning av overskudd vann inntil et fast stoff ble dannet. Dette faste stoffet ble oppløst i varm etanol (60 ml) og eter ble langsomt tilsatt for å indusere krystallisering. Produktet ble oppsamlet og dette ga 3,38 g (97 %) av tittelforbindelsen som et gråhvitt fast stoff, smp 114-9°C.

(c) 2-metyl-l,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-tiourea

En oppløsning av 3,88 g (19,5 mmol) 7-amino-l,2,3,4-tetrahydroisokinolinhydroklorid i 100 ml vann ble gjort basisk med kaliumkarbonatoppløsning og ble ekstrahert to ganger med metylenklorid. Den tørkede (magnesiumsulfat) organiske fasen ble konsentrert og dette ga 3,13 g (99 %) av den frie basen som en olje. Denne oljen ble opptatt i aceton (75 ml) og 2,21 g (19,4 mmol) trifluoreddiksyre i 100 ml aceton ble tilsatt. Oppløsningen ble oppvarmet til tilbakeløp hvorved 5,2 ml (39 mmol) benzylisotiocyanat ble tilsatt dråpevis. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet i 1 time før avkjøling til omgivelsestemperatur. Oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum og den resulterende oljen ble opptatt i metanol (150 ml) og 2,5 M natriumhydroksyd (50 ml). Denne oppløsningen ble oppvarmet ved 65°C i 1 time før avkjøling til omgivelsestemperatur. Metanolen ble avdrevet i vakuum og den vandige oppløsningen ble avkjølt for å utfelle produktet. Det faste stoffet ble oppsamlet og dette ga 2,22 g av tittelforbindelsen som et lysegult fast stoff, smp 184-6°C. Et annet utbytte av tittelforbindelsen (0,79 g, totalt utbytte 69 %) ble også oppnådd.

(d) N-(2-metyl-l,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-yl)karbamimidotioinsyreetylester

dihydroklorid

Til en suspensjon av 0,88 g (4,0 mmol) 2-metyl-l,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-tiourea i 8 ml ispropanol ble 0,39 g (3,9 mmol) metansulfonsyre tilsatt. Oppløsningen ble oppvarmet ved tilbakeløp i 0,5 timer for å sikre dannelse av metansulfonatsaltet siden både saltet og den frie basen var uoppløselig i isopropanol. Til denne oppløsningen ble det tilsatt 1,5 ml (14 mmol) etylmetansulfonat og oppvarming ble fortsatt natten over og dette ga en klar oppløsning. Oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum og den resulterende oljen ble opptatt i vann, gjort basisk med kaliumkarbonat og ekstrahert to ganger med metylenklorid. Den tørkede (magnesiumsulfat) organiske fasen ble konsentrert og dette ga en olje. Denne oljen ble opptatt i etanol og surgjort med saltsyre i etanol inntil den var klart sur overfor lakmus. Eter ble tilsatt og saltet kom ut som en viskøs olje. Oppløsningsmidlet ble dekantert og oljen vasket flere ganger med eter. Oljen ble opptatt i vann (250 ml) og oppløsningen ble behandlet med avfargende karbon. Oppløsningen ble filtrert og filtratet fortynnet til 500 ml med vann. Denne oppløsningen ble frysetørket og dette ga 1,06 g (78 %) av tittelforbindelsen som et monohydrat. MS(CI) 250 (M+H); NMR (DMSO/D20) 7,33 (d, 1H), 7,21 (d, 1H), 7,17 (s, 1H), 4,36 (bred s, 2H), 3,0-3,6 (m, 6H), 3,17 (s, 3H), 1,30 (t, 3H).

EKSEMPEL 4

N-(2-metyl-l,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-yl)karbamimidotioinsyremetylester-dihydroklorid

Til en suspensjon av 1,00 g (4,52 mmol) 2-metyl-l,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-tiouera (eksempel 3, trinn (c)) i 10 ml isopropanol ble det tilsatt 0,44 g (4,5 mmol) metansulfonsyre. Oppløsningen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 2 timer for å sikre dannelse av metansulfonatsaltet siden både saltet og den frie basen var uoppløselig i isopropanol. Til denne oppløsning ble det tilsatt 6,7 g (47 mmol) metyliodid og reaksjonsblandingen ble omrørt natten over. Oppløsningsmidlet ble avdrevet i vakuum og resten ble oppløst i vann, behandlet med avfargingskarbon og filtrert og dette ga en klar, fargeløs, vandig oppløsning. Denne oppløsningen ble gjort basisk med kaliumkarbonat og ekstrahert to ganger med metylenklorid. De organiske fasene ble kombinert, tørket (magnesiumsulfat) og konsentrert i vakuum og dette ga 1,02 g (96 %) av produktet som en fri base. Denne oljen ble opptatt i etanol og gjort klart sur ved tilsetning av saltsyre i etanol. Tilsetning av overskudd eter forårsaket at saltet skilte seg ut som en olje. Oppløsningsmidlet ble dekanert og denne oljen ble vasket flere ganger med eter. Denne oljen ble opptatt i 250 ml vann og ble på nytt behandlet med avfargingskarbon. Oppløsningen ble filtrert og filtratet ble fortynnet til 500 ml med vann. Denne oppløsningen ble frysetørket og dette ga tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff. MS (CI) 236 (M+H). NMR (DMSO/D20)

11,6-11,9 (bred, 1H), 9,4-9,7 (bred, 1H), 7,36 (d, 1H), 7,24 (d, 1H), 7,18 (s, 1H), 4,2-4,6 (bred m, 2H), 3,0-3,7 (bred m, 4H), 2,87 (s, 3H), 2,70 (s, 3H).

Claims (9)

1. Forbindelse, karakterisert ved at den har formel (I) hvor D representerer alkyl Cl-6, T representerer en C3.5 mettet alkylenkjede substituert med -(CH2)m-NXY eller -U-(CH2)a-N(X)-(CH2)b-; U representerer CH2; a og b, som kan være like eller forskjellige, representerer et helt tall fra 0 til 3; forutsatt at a +b er i området fra 1 til 3; X og Y, som kan være like eller forskjellige, representerer hydrogen, alkyl Cl-6 eller en gruppe -(CH2)nQ, Q representerer fenyl eventuelt substituentert med halogen; m og n representerer uavhengig et helt tall fra 0 til 5; og farmasøytisk akseptable salter derav.

2. Forbindelse av formel I ifølge krav 1, karakterisert ved at T representerer-U-(CH2)a-N(X)-(CH2)b-.

3. Forbindelse av formel I ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at T representerer -U-(CH2)a-N(X)-(CH2)b-, U representerer CH2 og a og b representerer hver 1.

4. Forbindelse av formel I ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved atD representerer etyl.

5. Forbindelse av formel (I) ifølge krav 1, karakterisert v e d at den utgjøres av: N-( 1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-yl)karbamimidotioinsyreetylester; N-6-(2-(((3-ldorfenyl)metyl(metyl)armno)indanyl)karbamimidotioinsyreetylester; N-(2-metyl-l,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-yl)karbamimidotioinsyreetylester; N-(2-metyl-l,2,3,4-tetrahydroisokinolin-7-yl)karbarrdmidoitoinsyremetylester; eller et farmasøytisk akseptabelt salt av hver av disse.

6. Forbindelse for bruk som terapeutikum, karakterisert v e d at den har formel I.

7. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse som definert i hvilket som helst av kravene 1-5 i blanding med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer.

8. Anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-6 i fremstillingen av et legemiddel for behandling eller profylakse av neurodegenerative forstyrrelser, eller for forebyggelse og reversering av toleranse overfor opiater og diazepiner eller for behandlig av legemiddelmisbruk.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser av formel (I) som definert i hvilket som helst av kravene 1-5 og farmasøytisk akseptable salter derav, karakterisert ved(a) fremstilling av en forbindelse av formel (I) hvor X eller minst én av X og Y representerer alkyl Cl-6 gruppen -(CH2)nQ, ved omsetning av en tilsvarende forbindelse av formel (I) hvor X eller en eller både av X og Y representerer en forbindelse av formel (II) hvor R<1> representerer alkyl Cl-6 eller gruppen -(CH2)nQ og L er en avspaltningsgruppe; eller (b) fremstilling av en forbindelse av formel (I) hvor T representerer en C3.5 mettet alkylenkjede substituert med -(CH2)m-NXY, ved omsetning av en tilsvarende forbindelse hvor T representerer en C3-5 mettet alkylenkjede substituert med -(CH2)m-L hvor L representerer en avspaltningsgruppe, med en forbindelse av formel (Ul) hvor X og Y er som definert i krav 1; eller (c) omsetning av en forbindelse av formel (IV) hvor T er som definert i krav 1, med en forbindelse av formel (V) hvor D er som definert i krav 1 og L er en avspaltningsgruppe, og, om nødvendig eller ønsket, omdannelse av den resulterende forbindelsen til et farmasøytisk akseptabelt salt eller vice versa.