NO300690B1

NO300690B1 - Benzimidazol-fosfono-aminosyrer og anvendelse derav

Info

Publication number: NO300690B1
Application number: NO923940A
Authority: NO
Inventors: Reinhardt Bernhard Baudy; III Horace FLETCHER; John Patrick Yardley
Original assignee: American Home Prod
Priority date: 1991-10-11
Filing date: 1992-10-09
Publication date: 1997-07-07
Also published as: NO923940D0; HU211942A9; JPH05222077A; EP0539057A1; AU2626992A; ATE155473T1; MX9205816A; HU9203203D0; IL103330A; NZ244587A; SK308392A3; DK0539057T3; DE69220879D1; NO923940L; RU2073004C1; KR930007961A; IL103330A0; SK279381B6; CZ308392A3; FI924570A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører kjemiske forbindelser og anvendelse derav. L-glutamat og L-asparginat, de endogene, sure aminosyrer, er blitt fastslått som viktige eksitatoriske neuro-transmittere. Virkningen av disse eksitatoriske aminosyrer blir formidlet av flere klare reseptorundertyper, hvorav en av de mest studerte er N-metyl-D-asparginat(NMDA)reseptoren. For kraftig aktivering av NMDA-reseptorkomplekset kan forårsake neuronal overstimulering med patologiske konsekvenser. Eksperimentell evidens antyder at en forlenget agonistfremkalt ledeevne i en NMDA-gated ionekanal vil tillate en unormal økning av kalsiuminngangen, og det resulterende økte intra-cellulære kalsiumnivå spiller en avgjørende skadelig rolle ved eksitotoksisk neuronskade, neurodegenerering og forsinket neuromdød.

Eksitatoriske aminosyrer settes i sammenheng med neuro-patologi av traumatisk, endogent, genetisk og miljømessig opprinnelse. Hjerneskade i forbindelse med anoxia hypo-glycemia, traumatisk skade, slag, epilepsi, spesifikke metaboliske defekter og noen kroniske neurodegenerative syk-dommer er i stor utstrekning frembragt ved eksitotoksiske mekanismer.

Flere studier har vist at en blokkering av NMDA-under-gruppe reseptoren signifikant vil redusere en neuronskade og

-tap som foregår i dyremodeller som etterligner flere forskjellige neuropatologiske situasjoner. Disse observasjoner viser klart at NMDA antagonister tilbyr effektiv neurobeskytt-else i flere kliniske miljø. Midler som motvirker de eksitotoksiske effekter mediert av NMDA reseptoren er således fordelaktige ved behandling av ischemiske tilstander, slag, skader i hjernen eller ryggmargen, og generelt hos pasienter med økende nivå av eksitatoriske transmittere. Spesifikke anvendelser omfatter også terapi ved senil demens av Alzheimertypen, demenskompleks av Parkinsontypen, Huntingtons chorea, og andre dominante eller recessive spino-cerebellare degenerasjoner hvor NMDA antagonister forebygger eller

retarderer utviklingen av sykdommen.

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelse er konkurrerende NMDA antagonister som har følgende formel:

hvor

R er hydrogen, lavere alkyl, benzyl eller pivaloyloksymetyl;R<1>ogR<2>uavhengig er hydrogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, trifluormetyl, trifluormetoksy, metansulfonylamino, acetylamino eller halogen, eller når R<1>og R<2>tilsammen representerer en metylendioksygruppering,

og de farmakologisk akseptable salter derav.

Betegnelsen "lavere alkyl" og "lavere alkoksy" refererer til grupper som har 1 til 4 karbonatomer i karbonkjeden. Betegnelsen "halogen" refererer til fluor, klor, brom og iod.

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelse er chirale, og følgelig omfatter forbindelsene ifølge denne oppfinnelse ikke bare de racemiske blandinger, men også de enkelte enantio-merer. Enantiomerene betegnes ifølge R/S-systemet ved anvendelse av sekvensregelen.

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelse kan fremstilles ved flere synteseveier. Ifølge et foretrukket skjema, blir en beskyttet benzimidazolyl-D-alanin-forløper omsatt med en alkyl-fosfonatester etterfulgt av avbeskyttelse, for å gi de ønskede sluttprodukter:

hvoriR<3>ogR<4>i sekvensen ovenfor representerer konvensjonelle aminosyrebeskyttende grupper, såsom lavere alkyl og benzyl for R<3>og t-butyloksykarbonyl eller benzyloksy-karbonyl for R<4>. De fosfonsyrebeskyttende grupper R<5>kan være lavere alkyl, benzyl eller 4-nitrobenzyl. Den utgående X-gruppe i alkylfosfonsyrereaktanten kan være halogen, metylsulfonyl, tolylsylfonyl eller trifluorsulfonyl, hvorav trifluorsulfonyl blir spesielt foretrukket. Den beskyttede benzimidazolyl-alanin-forløper kan oppnås i optisk ren form ved enantio-selektiv syntese ut ifra et R eller S, N-beskyttet asparaginsyre esterderivat ved fremgangsmåten til Nestor et al., J. Med. Chem. 27. 320 (1984). Avbeskyttelsen av det alkylfos-fonylerte mellomprodukt kan utføres ved anvendelse av sur eller basisk hydrolyse, hydrogenolyse, og/eller trimetylsilyl-bromidbehandling, avhengig av den beskyttelsesgruppe som skal fjernes. Disse trinn kan permuteres eller kombineres som nødvendig og passende. Når R<3>er benzyl, R<4>er benzyloksy-karbonyl, ogR<5>er 4-nitrobenzyl, kan det utføres en samlet hydrogenolyttisk avbeskyttelse i e'tt trinn.

I en alternativ sekvens kan o-fenylendiamin omsettes med alkylfosfonatester-reaktanten til å gi et diaminomellomprodukt som deretter videre omsettes ifølge metoden til Nestor et al., sitert ovenfor, til å gi et beskyttet mellomprodukt som deretter underkastes avbeskyttelse som skissert ovenfor:

I de tilfeller hvor substitusjonsmønsteret for R<1>og R<2>på benzimidazolringen er asymetrisk, hvorved alkylering med alkylfosfonatester-reaktanten i reaksjonssekvensene ovenfor ville gi en diastereomer blanding av produkter, ville det være nødvendig med fraksjonert krystallisasjon eller kromotografi for å skille produktene fra hverandre. Dette kan unngås ved anvendelse av egnede utgangsmaterialer som gir de ønskede for-løpermaterialer. Et hensiktsmessig substituert o-nitroanilin eller o-halogen-nitrobenzen blir således omsatt med henholds-vis en alkylfosfonatester-reaktant eller en aminofosfonat-esterreaktant, for å gi det hensiktsmessige mellomprodukt som deretter, omsettes videre ved metoden til Nestor et al. etterfulgt av avbeskyttelse for å gi de ønskede sluttprodukter:

Utgangsmaterialene i sekvensene ovenfor er alle enten kommersielt tilgjengelige eller kan fremstilles ved konvensjonelle metoder som er kjent og rapportert i den kjemiske litteratur.

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelse kan danne farmakologisk akseptable salter av farmakologisk akseptable organiske eller uorganiske syrer såsom saltsyre, hydrogen-bromid-syre, sulfonsyre, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre, maleinsyre, fumarsyre, benzosyre, askorbinsyre, 4,4 '-metylen-bis[3-hydroksy-2-naftalenkarboksylsyre], ravsyre, metansulfon-syre, eddiksyre, propionsyre, vinsyre, sitronsyre, melkesyre, eplesyre, mandelsyre, kanelsyre, palminitsyre, itakonsyre og benzensulfonsyre. Forbindelsene ifølge denne oppfinnelse som fosfonokarboksylsyrene, er istand til å danne alkalimetall- og jordalkalimetall-karboksylater og karboksylater av farmakologisk akseptable kationer avledet av ammoniakk eller et basisk amin. Eksempler på sistnevnte omfatter, men er ikke begrenset til, kationer såsom ammonium, mono-,di- og trimetylammonium, mono-, di- og trietylammonium, mono-, di- og tripropylammonium (iso og normal), etyldimetyl-ammonium, benzyldimetylammonium, cykloheksylammonium, benzyl-ammonium, dibenzylammonium, piper-idinium, morfolinium, pyrrolidinium, piperazinium, 1-metyl-piperidinium, 4-etyl-morfolinium, l-isopropylpyrrolidinium, 1,4-dimetylpipera-zinium, 1-n-butylpiperidinium, 2-metyl-piperidinium, l-etyl-2-metyl-piperidinium, mono-, di- og tri-etanolammonium, etyl-dietanolammonium, n-butylmonoetanol-ammonium, tris(hydroksymetyl)metylammonium, fenylmonoetanol-ammonium og lignende.

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelse er konkurrerende NMDA antagonister som kan anvendes ved behandling av konvulsjoner, cerebral ischemia, slag, hjerne- eller ryggmargs-skade, CNS forstyrrelser såsom senil demens, Alzheimers sykdom, Huntingtons chorea, og andre dominante eller recessive spino-cerebellare degenerasjoner. De nevnte forbindelser kan være spesielt nyttige som pre-anesthetika og neurobeskyttel-sesmidler under høyrisikokirurgi, såsom hjernekirurgi og rygg-margskirurgi, eller som resultat av trauma, hvor risikoen for hjerte- eller lungestans kan forårsake delvis, midlertidig eller fullstendig tap av blodstrømmen til hjernen. Ytter-ligere fordeler ved anvendelse av forbindelsene ifølge denne oppfinnelse som pre-anesthetika beror på deres milde aksiolyttiske/sedative egenskaper, deres korttidshukommelses-svekkende egenskap (korttids amnesi) og på deres evne til å forsterke virkningen av anesthetika slik at disse kan anvendes i lavere dose..

Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av en NMDA antagonist med formelen

hvori R er hydrogen, lavere alkyl, benzyl eller pivaloyloksymetyl; R<1>og R2 er, uavhengig hydrogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, trifluormetyl, trifluormetoksy, metansulfonylamino, acetylamino eller halogen, eller R<1>og R<2>tilsammen representerer en metylendioksygruppe; og de farmakologisk akseptable salter derav, til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling og forebyggelse av nevropatologiskek forstyrrelser indusert ved overstimulering av eksitatoriske aminosyrereseptorer.

Som sådanne kan forbindelsene ifølge denne oppfinnelse administreres rene eller sammen med en farmasøytisk bærer, og således kan de formuleres til orale doseringsformer såsom tabletter, kapsler o.l. Forbindelsene kan administeres ved å kombinere dem med konvensjonelle bærere, såsom magnesium-karbonat, magnesiumstearat, talk, sukker, laktose, pektin, dekstrin, stivelse, chelatin, tragakant, metylcellulose, natriumkarboksybutylcellulose, lavtsmeltende voks, kakaosmør o.l. Fortynningsmidler, smaksmidler, solubilisatorer, smøre-midler, oppslemmingsmidler, bindemidler, tablettsprengnings-midler o.l. kan anvendes. Forbindelsene kan også injiseres parenteralt, i hvilket tilfelle de anvendes i form av en steril løsning inneholdende andre løste stoffer, f.eks. tilstrekkelig saltløsning eller glukose til å gjøre løsningen isotonisk.

Doseringskravene vil variere med de spesielle blandinger som anvendes, administrasjonsmåten, graden av de gitte symptomer og det spesielle individ som behandles. Generelt vil man begynne behandlingen med små doser, mindre enn den optimale dosen av forbindelsen. Deretter blir doseringen øket inntil den optimale effekt under de gitte omstendigheter blir oppnådd. Vanligvis vil forbindelsene ifølge denne oppfinnelse helst bli administrert i en konsentrasjon som vanligvis vil gi effektive resultater uten å forårsake noen skadelige side-virkninger, og kan administreres enten som en enkeltdose, eller om ønsket kan doseringen oppdeles i beleilige under-enheter som administreres på hensiktsmessige tidspunkter i løpet av dagen. Den konkurrerende NMDA antagonistaktivitet av forbindelsene ifølge denne oppfinnelse kan demonstreres ved standard farmakologiske fremgangsmåter som illustrerer deres in vitro inhibering av [<3>H]CCP bindingen i rottehjernevev og deres in vivo antagonisme av NMDA induserte konvulsjoner hos mus.

Følgende eksempler viser fremstillingen og farmakologisk testing av forbindelser ifølge denne oppfinnelse.

Eksempler

Enantiomer renhet av eksemplene ifølge denne oppfinnelse blir bestemt ved en modifikasjon av metoden til Tapuh, Y., Miller, N., Karger, B.L., Journal of Chromatography 1981, 205, 325-337.

Fremstilling av trifluormetansulfonsyre fbis-( 4- nitrofenylmetoksv) fosfinvllmetylester

En løsning av di-4-nitrobenzyl hydroksymetylfosfonat (3,82 g, 10,0 mmol) [Hoffmann, M. Synthesis 1988 62] og pyridin (0,87 g, 11,0 mmol) i diklormetan (50 ml) blir behandlet ved -10°C til -20°C med trifluormetansulfonsyre-anhydrid (3,1 g, 11,0 mmol) og omrørt ved -10°C i 1 time. Løsningen vaskes med kald IN HCL (2 x 50 ml), kaldt vann (3 x

50 ml) og tørkes over MgS04. Løsningen filtreres, løsnings-midlet fordampes, og restoljen størkner ved henstand. Utbytte 4,18 g(80%). Materialet er tilstrekkelig rent til å anvendes for videre omsetninger. En analytisk prøve oppnås ved tørr-kolonnekromatografi på silikagel av kvalitet II-III med etyl-acetal som elueringsmiddel. Produktfraksjonene inndampes og resten krystalliseres fra diklormetan/heksan og tørkes: smp 73-75°C;<1>HMR (400 MHz, CDCI3): 5 8,2 (d, 4H), 7,5 (d, 4H), 5,2 (m, 4H), 4,8 (d, 2H); MS (+FAB)515 (M+H) +

Elementær analyse for C1gH14<N>2<0>1QPSF3

Beregnet: C, 37,36; H, 2,74; N, 5,45

Funnet: C, 37,27; H, 3,03; B, 5,52.

Eksempel 1

R-a-amino-1-(fosfonometyl)-1H-benz imidasol- 2- propansyre

Benzyl N-(benzyloksykarbonyl)-3-(2-bezimidazoyl)-D-alaninat (30 g, 0,07 mol) (fremstilt ifølge fremgangsmåten til Nestor et al., J. Med. Chem., 1984, 27, 320), trifluormatan-sulfonsyre [dietoksyfosfinyl]metylester (23,04 g, 0,076 mol) og pulverisert vannfritt kaliumkarbonat (37 g, 0,268 mol) omrøres i acetonitril (5 00 ml) ved romtemperatur i 20 timer.Blandingen filtreres, filtratet inndampes, og resten løses i diklormetan. Diklormetanløsningen vaskes med vann, (500 ml), 5% NaHC03(2 x 300 ml), vann (300 ml), og tørkes over MgS04.Løsningen filtreres, og filtratet inndampes til en gummi. Utbyttet 43 g. Denne gummi løses i diklormetan (3 00 ml) og renses ved kromatografi på en tørr silikagelkolonne med gradienteluering (metylenklorid til etylacetat). Produktfraksjonen [Rf (metylenklorid/etylacetat 4:1) 0,17] blir slått sammen og inndampet til en gummi. Utbytte 10,6 g (26%).<X>H NMR (400MHz, CDCI3): 6 7,7 (d, 1H), 7,35 (s, 5H),7,3 (s, 5H), 7,2 (s, 2H), 6,9 (d, 1H), 5,2-5,0 (m, 5H), 4,4-4,2 (m, 2H), 4,1 (m, 1H), 3,9 (m, 4H), 3,6 (dd, 1H), 3,4 (dd, 1H) , 1,2 (t, 2H) , 1,1 (t, 3H) ; MS (+FAB) 580 (M+H)<+>. Dette materialet (10,6 g, 0,0183 mol) løses i eddiksyre (300 ml) og ristes med 10% Pd/C (1 g) under 1 atm. H2ved romtemperatur inntil H2opptaket slutter, filtratet inndampes og resten inndampes sammen med dioksan; (4 x 100 ml). IR, NMR, og Mass Spectra av resten (8 g) viser fjerning av de benzylbeskyttende grupper. 7,5 g av resten og trimetylsilylbromid (15 g, 0,1 mol) blir oppvarmet med tilbakeløp med N2i diklormetan (110 ml) i 1,5 timer. Løsningsmidlet fordampes og resten omrøres i vann (50 ml) og eter (50 ml). Det danner seg et faststoff som frafiltreres og beholdes. Filtratet separeres, det vandige sjikt fortynnes med etanol (50 ml) og behandles med propylenoksyd (10 ml) under omrøring i 0,5 timer. Løsningen inndampes for å fjerne etanol, og det faste stoff som dannes blir slått sammen med det faste stoff som er oppnådd tidligere. Produktet løses i IN HC1 (100 ml) og den filtrerte løsning inndampes til tørrhet. Utbytte er 4g (65%) basert på fullstendig beskyttende mellomprodukt. Produktet krystalliseres fra varmt vann (50 ml) og etanol (100 ml) og tørkes i vakuum. Utbytte 2,27 g (37%). Forbindelsen smeltes ikke under 310°C. ^-H NMR (400 MHz, DMSO-d6) : 6 7,5 (t,2H), 7,3 (m, 2H), 4,35 (d, 2H), 4,25 (t, 1H), 3,5 (m, 2H); MS (-FAB) 298 (M-H)";. [a]25D = -49,5° (c = 1,01 IN HCl) ; HPLC analyse: enantiomerisk renhet: 1S:99R.

Elementæranalyse av C1:LH14N305P*2 H20:

Beregnet: C,38,88; H,5,41; N,12,37

Funnet: C,38,95, H,5,13; N,12,52

Dihydroklorid-dihydratet fremstilles ved å løse den frie syre i 2N NCl, inndamping til tørrhet og tørking i vakuum. ^-H NMR (400 MHz, DMSO-dg): 6 9,2-8,2 (m, 2H), 7,9 (d, 1H), 7,7 (d, 1H), 7,5 (m, 2H), 4,8 (m, 3H), 3,8 (d, 2H); [a]<25>D= - 41,6° (c = 1,0, IN HCl).

Elementæranalyse av C11H14<N>305P'2 HCl:

Beregnet: C,32,37; H,4,93; N,10,29

Funnet: C,32,57; H,4,87; N,10,53

Eksempel 2

R-Q;-Amino-5, 6-diklor-l- (f osf onometyl) -

lH- benzimidazol- 2- propansyre

På en måte i likhet med eksempel 1, men ved anvendelse av benzyl N-(benzyloksykarbonyl)-3-[(5,6-diklor)-2-benzimidazol]-D-alaninat (fremstilt ifølge metoden til Nestor et al., J. med. Chem., 1984, 27, 230), fremstilles tittelforbindelsen (utbytte 15,3%). Sm.p. ubestemt.<X>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 6 8,55 (s, 3H), 8,95 (s, 1H), 4,6 (d, 2H), 4,55 (t, 1H), 3,8 (m, 2H); MS (-FAB) 366 (M-H)"; [a]<25>D= -50,0° (c = 1,01; IN HCl); HPLC analyse: (fri syre) enantiomerisk renhet: 2,6S:97,4R

Elementæranalyse av<C>11H12<n>305PCl2'2 HCl:

Beregnet: C,29,96; H,3,20; N,9,53

Funnet. C,29,78; H,3,31; N,9,65.

Eksempel 3

R-a-Amino-5,6-dimetyl-l-(fosfono-metyl)- 1- H- benzimidazol- 2- propansyre

Benzyl N(benzyloksykarbonyl)-3-[(5,6-dimetyl)-2-benzmidiazoyl]-D-alaninat (se Nestor et al., J. Med. Chem., 1984, 27, 320) (3,7 g, 0,8 mmol), trifluormetansulfonsyre [bis-(4-nitrofenylmetoksy)fosfinyl]metylester (5,5 g 10 mmol) og pulverisert vannfritt K2CO3(5,5 g, 40 mmol) omrøres i acetonitril (100 ml) ved romtemperatur under N2(20 timer). Acetonitrilen fordampes, og resten ristes med diklormetan (100 ml) og H20 (2 x 100 ml). Diklormetansjiktet vaskes med 5% NaHC03(2 x 100 ml), saltløsning (100 ml), og tørkes over MgS04. Den filtrerte løsning inndampes, og restgummien løses i eddiksyre (100 ml) og ristes på et Parr hydrogeneringsapparat med 10% Pd/C (1 g) og H2(260 kPa initialt) inntil H2opptaket stanser (3 timer). Den filtrerte løsning inndampes, og inndampes sammen med dioksan (3 x 50 ml), og resten fortynnes med vann.(50 ml). Blandingen justeres til pH 3 med 6N HCl, avkjøles og filtreres. Det lufttørkede faste stoff (2,8 g) løses i vann (50 ml) med IN NCl (1 ml) og felles ut igjen ved tilsetning av IN NaOH (1 ml). Produktet vaskes med vann, etanol og eter. IR, NMR og Mass spectra er konsistente for fosfonometylaminosyren. Materialet løses i IN HCl (20 ml) behandles med aktivert karbon og avkjøles. Dihydrokloridsaltet filtreres og vaskes med isvann og tørkes i vakuum. Utbytte<1,23>g (<37,4%>).<1>R lmR (400 MHz, DMSO-d6+ 20% DC1/D20 (2 dråper)): 5 7,75 (s, 1H), 5,7 (s, 1H), 5,7 (s,lH), 5-4,75 (m,3H), 3,85 (m,1H), 2,35 (s, 3H) ; MS (-FAB) 326 (M-H)"; [a]25D = -54,4° "(c = 1,01, IN HCl) ;

HPLC analyse; enantiomeris renhet 1S:99R.

Elementæranalyse av C13H18N305P* 2 HCl

Beregnet: C,39,02; H,5,04; N,10,50

Funnet: C,3 8,62; H,5,27; N,10,32

Eksempel 4

R-(-)-a-Amino-l-(fosfonometyl) - lH- benzimidazol- 2- propansyre

Ved å følge fremgangsmåten i eksempel 3 og anvende benzyl-N-(benzyloksykarbonyl)-3-(2-benzimidazoyl)-D-alaninat, fremstilles tittelforbindelsen. Krystallisering av varmt vann og forlenget tørking i vakuum fører til et hydrat med 3,5 mol vann, utbytte (61%). ^-H NMR (400 Hz, DMS0-d6+ DCl) : 6 7,95 (q, 1H), 7,8 (q, 1H), 7,55 (2H), 4,8 (m, 3H), 3,8 (d, 2H); [a]<25>D= -53,1° (c = 1,03 IN HCl);

HPLC analyse av enantiomerisk renhet: 1,3S:98,7R.

Elementæranalyse av C11<H>14<N>305P•3,5 H20

Beregnet: C,36,46; H,5,84; N,ll,59

Funnet: C,36,67; H,5,64; N,ll,74

Dihydrokloridet fremstilles ved oppløsning i 2N' HCl (5 ml) og vann (15 ml) og inndamping til tørrhet. [a]<25>D=-40,2°

(c = 1,0, IN HCl).

Elementæranalyse av C11H14<N>305P•2 HC1*H20

Beregnet: C,33,86; H,4,65; N,10,77

Funnet; C,33,77; H,4,59; N,10,67

Eksempel 5

. R-a-Amino-l-(fosfonometyl)-lH-benzomidazol-2-propansyre, 2- amino- 2-( hydroksvmetyl)- 1, 3- propandiol ( 1:2)

Den frie syreforbindelse i eksempel 4 (1,86 g, 5 mmol) og trometaminbase (1,33 g, 11 mmol) oppvarmes i vann (10 ml) og felles ut med etanol (100 ml). Materialet frafiltrers, vaskes med etanol, deretter i eter og lufttørkes over natten. Produktet omkrystalliseres fra varmt vann (30 ml) og etanol (200 ml), frafiltrers, vaskes med etanol og tørkes i vakuum over P205. Utbytte 2,58 g (86,6%).

Elementæranalyse av C11H14<N>305P•3 H20

Beregnet: C,38,35; H,7,ll; N,ll,77

Funnet; C,38,39; H,6,76; N,ll,86

Eksempel 6

S-a-Amino-l- (f osf onometyl) -1H-benzimidazol- 2- propansyre

Benzyl N-(benzyloksykarbonyl)-3-(2-benzmidazoyl)-L-alaninat (2,85 g, 6,3 mmol), trifluormetansulfonsyre [bis-(4-nitrofenylmetoksy)fosfinyl]-metylester (3,67 g, 8,9 mmol), og pulverisert vannfritt kaliumkarbonat (4 g, 28,9 mmol) blir omrørt i acetonitril (100 ml) ved romtemperatur over natten. Deretter fortsetter fremgangsmåten i eksempel 1 og det oppnås et tetrabenzylderivat. Det rå produkt (4,3 g) renses på et Waters preparativ 500 HPLC ved anvendelse av gradienteluering med heksan (100%) til etylacetat (100%). Utbytte 1,0 g. Produktet løses i eddiksyre med 10% Pd/C (0,5 g) og hydrogeneres ved 1 atmosfære. Blandingen filtreres, inndampes på en Rotorvapor, skylles to ganger med dioksan og omrøres i vann (10 ml). Produktet frafiltreres og tørkes. Utbytte 0,35 g (17,6%); NMR identisk med produktet fra eksempel 1 MS(+FAB) 300 (M+H)<+>[a]<25>D= +32,8° (c = 1,45, metanol + HCl); HPLC analyse enantiomer renhet: 98,2S/l,8R.

Elementæranalyse av C-j^H-^N-^C^P *H20

Beregnet: C,41,65; H,5,08; N,13,25

Funnet: C,41,60; H,5,04; N,13,09

Eksempel 7

R-a-Ammino-6-klor-l-(fosfonometyl)-lH- benzimidazol- 2- propansyre

A) Under tørr nitrogen løses N-Boc-D-asparaginsyre o;-benzylester (13,4 mmol, 4,34 g) i tørr tetrahydrofuran (67 ml) og avkjøles til -10°C. I rekkefølge tilsettes trietylamin (13,4 mmol, 1,86 ml) og etylklorformiat (13,4 mmol, 1,28 ml)

og reaksjonsblandingen omrøres i 10 minutter ved -10°C, hvoretter det tilsettes langsomt en løsning av kommersiell 4-klor-1,2-fenylendiamin (14,7 mmol, 2,1 g) i tørr tetrahydrofuran (27 ml).Blandingen får varme seg opp langsomt til omgivende temperatur. Den hentes deretter over i iskald saltløsning (150 ml), ekstraheres med etylacetat (2 x 100 ml). Det samlede organiske sjikt vaskes i rekkefølge med iskald mettet NaHC03(100 ml), deretter saltløsning (100 ml) og tørkes deretter over MgS04, filtreres og inndampes til tørrhet i vakuum. Resten kromatograferes. Eluering med etylacetat/heksan gir 2,9 g N<4->(2-amino-5-klorfenyl)-N<2->[(di-metyletoksy)karbonyl]-D-asparagin fenylmetylester. B) En løsning av oljen ovenfor (4,8 mmol, 2,15 g i iseddiksyre (70 ml) oppvarmes til 70°C i 5 timer under utelukkelse av fuktighet. Blandingen inndampes deretter i vakuum, og resten flash kromatograferes på silikagel (60 g). Eluering med 20% etylacetat/heksan gir 1,6 g 6-klor-a[(1,1-dimetyletoksy)karbonyl]amino]-lH-benzimidazol-2-propansyre fenylmetylester som en olje. C) En løsning av oljen i trinn B (3,7 mmol, 1,6 g) i acetonitril (50 ml) behandles ved 25°C under tørr nitrogen med trifluormetansulfonsyre[dimetyloksyfosfinyl]metylester (4,1 mmol, 1,115 g) og vannfritt pulverisert kaliumkarbonat (10 mmol, 1,38 g). Reaksjonsblandingen omrøres ved 25°C over natten, filtreres, vaskes med metylenklorid (20 ml), det samlede filtrat inndampes i vakuum, og resten fordeles mellom metylenklorid og vann. Det organiske sjikt fraskilles, tørkes over MgS04, filtreres og inndampes i vakuum. Resten flash kromatograferes på silikagel (60 g). Eluering med kloroform/etylacetat gir 1,4 g 6-klor-l-[(dimetylfosfinyl)metyl]- a-[[(1,1-dimetyletoksy)karbonyl]-amino]-lH-benzimidazol-2-propansyrefenylmetylester som en olje. D) En løsning av oljen fra trinn C (2,5 mmol, 1,4 g) i iseddiksyre (20 ml) behandles med10% palladium på trekull (140 mg) og hydrogeneres i ca 3 timer ved 25°C. Reaksjonsblandingen gjennomspyles med nitrogen, filtreres gjennom Solka-floc, kaken vaskes med eddiksyre (10 ml) og filtratet inndampes til tørrhet i vakuum. Resten avdrives med toluen (2 x 10 ml) og inndampes i høyvakuum slik at det oppnås et 1,15 g 6-klor-l-[(dimetoksyfosfinyl)metyl-a[[1,1-dimetyletoksy)karbonyl]-amino]]-lH-benzimidazol-2-propansyre som en olje.

E) Oljen fra trinn D (1,9 mmol, 0,9 g) oppvarmes med tilbakeløp i 6N HCl (20 ml) i 45 minutter. Reaksjonsblandingen inndampes deretter til tørrhet i vakuum, resten drives av med toluen (2 x 20 ml) og krystalliseres deretter fra varmt vann/acetonitril slik at det oppnås 33 0 mg av

tittelforbindelsen; Sm.p. 198-200°C.<1>H NMR (DMSO-dg = 1 dråpe DC1, 400 MHz): 6 3,87 (dd, J±= 5,5 Hz; J2= 7,2 Hz, 2H, CH-CH2), 4,86 (t, J = 7,2 Hz, 1H, CH-CH2), 4,96 (dd, J-l = 12 Hz,<J>2= 32,7Hz, 2H, CH2-P), 7,59 (dd, JQ= 8,7 Hz, Jm= 2 Hz, 1H, H-5), 7,83 (d, JQ= 8,8 Hz, 1H, H-4), 8,13 (d, Jm= 1,9 Hz, 1H, H-7).

Elementæranalyse av C11H13C1N305<P>•0,8 HC1*H20

Beregnet: C,36,62; H,4,47; N,ll,64

Funnet: C,36,32; H,4,55; N,11,35

Eksempel 8

R-a-Amino-5-klor-l- (f osf onometyl) -1H-benz imidazol- 2- propansyre

A) Fremgangsmåte som eksempel 7A), den oppnådde rest blir imidlertid ikke renset, men heller anvendt som den er i neste trinn. B) Fremgangsmåte som i eksempel 7B), den oppnådde rest blir imidlertid ikke renset, men heller anvendt som den er i neste trinn. C) Oljen oppnådd i trinn B (21,8 mmol, 9,4 g, blanding av 5-, og 6-klorregioisomer i acetonitril (250 ml) behandles straks under tørr nitrogen og omrøring med

difluormetansulfonsyre [dimetoksyfosfinyl]metylester (24 mmol, 6,528 g) og vannfritt pulverisert K2C03(65 mmol, 8,97 g). Reaksjonsblandingen omrøres ved 25°C over natten, filtreres og vaskes med acetonitril. Filtratet inndampes, og resten

fordeles mellom vann-metylenklorid. Det fraskilte organiske sjikt tørkes, og inndampes deretter i vakuum til tørrhet. Resten kromatograferes (HPLC), ved eluering med etylacetat/heksan som gir 4 g. 5-klor-l-[(dimetoksy-fosfinyl)metyl]-alfa-[[(1,1-dimetyloksy)karbonyl]amino-1H-benzimidazol-2-propansyre fenylmetylester som en olje. D) En løsning av oljen fra trinn C (7,25 mmol, 4 g) iseddiksyre (60 ml) behandles med10% palladium/trekull (400 mg) og hydrogeneres ved 25°C ved atmosfæretrykk i 4 timer. Blandingen gjennomspyles deretter med nitrogen, filtrers gjennom Solka-floc, vaskes med eddiksyre (20 ml) og filtratet inndampes til tørrhet i vakuum. Resten drives av med toluen (2 x 20 ml) og inndampes til slutt i høyvakuum, og gir 3,43 g 5-klor-1-[(dimetyoksyfosfinyl)metyl]- a-[[(1,1-dimetyloksy)-karbonyl]amino]-lH-benzimidazol-2-propansyre som en olje. E) Oljen fra trinn D (7,2 mmol, 3,43 g) oppvarmes under tilbakeløp i 6N saltsyre (60 ml) i 50 minutter. Blandingen inndampes deretter til tørrhet i vakuum, og resten inndampes en gang til med vann (15 ml). Resten tørkes i høyvakuum, og krystalliseres deretter fra varmt, vann/acetonitril. Forbindelsen frafiltreres vaskes med eter (10 ml) og tørkes ved 1 Torr, 60°C (over P2Os) og gir 1/4 g av det ønskede produkt; Sm.p. 113 - 116°C (Dekomp.). ^-H NMR (DMS0-d6+ 1 dråpe DCl, 400 MHz): 6 3,86 (t, J = 6,4 Hz, 2H, CH-CH2), 4,83 (t, J = 6,8 Hz, 1H, CH-CH2), 4,95 (m, 2H, CH2-P), 7,61 (dd, JQ= 8,9 Hz, Jm= 1,9 Hz, 1H, H-6), 7,91 (d, Jm=<1,>7 Hz, 1H, H-4), 7,96 (d, J0= 8,9 Hz, 1H, H-7).

Elementæranalyse av C11H13C1N305P*HC1

Beregnet: C,35,69; H,3,81; N,ll,35

Funnet: C,35,87; H,3,94; N,ll,26

Eksempel 9

S-a-Amino-5,6-diklor-l-(fosfonometyl)-lH- benzimidazol- 2- propansyre

Forbindelsen fremstilles ifølge fremgangsmåten i eksempel 7; Sm.p. 230 (Decomp.).<1>H NMR (DMS0-d6+ dråpe DCl): 6 3,78

(d, J 7 Hz, 2H, CH2-CH) , 4,72 (t, J = 7 Hz, 1H, CH-CH2), 4,86 (m, 2H, CH2-P), 8,06 (s, 1H, Ar-H), 8,23 (s, 1H, Ar-H); MS: (-FAB) m/e: 366 (M-H); [a]<25>D+ 58.8°C (IN HCl):

Elementæranalyse for C1:LH12C12N305P• 2H20

Beregnet: C,32,69; H,3,99; H,10,39

Funnet: C,32,66; H,4,13; N,10,34.

Eksempel 10

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelse blir testet for sin konkurrerende NMDA antagonistaktivitet ved sin evne til å erstatte tritsiert 3-(2-karboksypiperazin-4-yl)propyl-l-fosfonsyre (CPP), en kjent konkurrerende NMDA antagonist, i homogenater av frontal kortex hos rotte i in vitro [<3>H]CPP bindingsundersøkelser.

Denne undersøkelse utføres som følger:

Rottene halshugges og deres hjerner fjernes umiddelbart, veies og plasseres i ca 15 volumer av iskald 10% sukrose. Hver hjerne homogeniseres ved anvendelse av en Potter Elvehjem glass homogenisator (12 slag ved 84 0 opm) utstyrt med en Teflon pistill. Homogenatet sentrifugeres deretter 1,000 x g i 10 minutter. Den resulterende pellet blir kastet, og supernatanten sentrifugeres ved 20,000 x g i 20 minutter. Den rå mitokondrial pellet slemmes opp igjen i iskaldt destillert vann og dispergeres ved anvendelse av en Brinkmann Polytron (PT-10 ved en skalaverdi på 6 i 30 sekunder). Oppslemmingen sentrifugeres ved 8,000 ganger g i 20 minutter. Den resulterende supernatant og "buffy coat" sentrifugeres ved 48,000 x g i 20 minutter. Den endelige rå synapse membran pellet slemmes opp igjen i iskaldt destillert vann og sentrifugeres ved 48,000 g i 20 minutter.

For å lette fjerningen av endogent glutamat, blir membranene slemmet opp igjen i 15 volumer av iskald 50 mMolar TRIS (pH 7,6) inneholdende 0,04% Triton X-100. Suspensjonen inkuberes ved 37°C i 15 minutter, og sentrifugeres deretter ved 20,000 x g i 20 minutter. Pelleten vaskes (det vil si slemmes opp igjen i iskald TRIS buffer og sentrifugeres ved 20,000 x g i 20 minutter) to ganger. Membranpelleten slemmes til slutt opp igjen i 15 volumer i iskald 50 mMolar TRIS, fordeles til flere sentrifuger-rør og sentrifugeres ved 20,000 x g i 20 minutter og pelletene fryses (-70°C) for påfølgende anvendelse i bindingsundersøkelser.

For bindingsundersøkelsen blir membranpelletene opptint og slemmet opp igjen i 15 volumer iskald 50 mMolar TRIS (pH 7,6) buffer. Triplikatprøver (1000/il) av membransuspensjonen inneholdende 0,2 og 0,4 mg protein/ml inkuberes ved 23°C i 15 minutter med 8 nM[<3>H]CPP (New England Nuclear), en av de forskjellige testløsninger, og buffer i et sluttkuberingsvolum på 2 ml ved anvendelse av plast miniampuller (Skatron). Prøvene, sentrifugeres deretter ved 48,000 x g i 20 minutter, og supernatantene kastes. Pelletene oppløses med vevssolubilisator (NCS, Amersham; 500/xl/pr. prøve) i en time. Saltsyre (100/il av 4N) tilsettes til hver prøve for å redusere kjemiluminisens under påfølgende telling. Skintillasjons cocktail (Aqasol, DuPont; 3,2 ml) tilsettes til hver av miniampullene som deretter lukkes og ristes i 15 minutter før tellingen. Ampullene plasseres i en Packard 460 CD teller (eller tilsvarende) for bestemmelse av radioaktiviteten.

Total spesifikk binding defineres som total binding - bindingen i nærvær av 1 mMolar NMDA. Spesifikk binding i nærvær av et testmedikament uttrykkes som en prosent av total spesifikk binding når intet medikament er tilstede. Når testforbindelsene undersøkes for et doseresponsforhold, blir resultatene avsatt som logit til %-binding mot log til testmedikamentkonsentrasjonen. Lineær regresjonsanalyse gir så en rett linje hvori fra det kan beregnes en IC50med 95% konfidens grense.

STANDARDFORBINDELSER:

Når de ble testet i denne undersøkelse, gav forbindelsene ifølge denne oppfinnelse følgende resultater.

Eksempel 11

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelse blir dessuten testet for deres in vivo evne til å antagonisere en NMDA i den murine NMDA-induserte konvulsjonsundersøkelse.

Denne undersøkelse utføres som følger:

Sveitsiske albinohannmus (CD-1 mus, Charles River) 18-22 g, etter en sulteperiode på 18 timer, blir vant til et observasjonskammer i 3 0 minutter forbehandles med den representative testforbindelse etterfulgt 30 minutter senere med en NMDA, 195 mg/kg i.p., som er en dose som vanligvis forårsaker 90% mortalitet som fraskriver seg motoranfall omfattende ukontrollerbar bakbenkloring eller rykking i lemmene og/eller i torsomuskelen med tap av opprettingsrefleks etterfulgt av død innenfor observasjonsperioden på 30 minutter etter en NMDA administrasjon. Ut i fra sistnevnte bestemmes E<D>50for overleving.

Data ble analysert ved anvendelse av probit analyseprogrammet PS-NONLIN (Natural Response Rate Version). Resultatet av dette program inneholder den statistiske signifikans av helningen for doseresponsen og ED 50% og 95% konfidensgrensene for overleving.

<*>Alle rapporterte verdier passer inn i probitmodellen, (ved anvendelse av Pearson Chi Square), og har en signifikant doserespons (helningen signifikant ved 0 < 0,05, to-halet test). Forbindelser som har aktivitet i denne testfremgangsmåte blir vanligvis anerkjent i den vitenskapelige litteratur som brett anvendbare anti-konvulsanter.

Når de testes i denne undersøkelse gav forbindelsene ifølge oppfinnelsen følgende resultater:

Claims

1. Forbindelse,karakterisert vedformelen

hvori R er hydrogen, lavere alkyl, benzyl eller pivaloyloksymetyl; R<1>ogR<2>uavhengig er hydrogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, trifluormetyl, trifluormetoksy, metansulfonylamino, acetylamino eller halogen, eller R<1>og R<2>tilsammen representerer en metylendioksygruppe; og de farmakologiske akseptable salter derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedat den er R-a-amino-1-(fosfonometyl)-lH-benzimidazol-2-propansyre.

3. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedat den er R-a-amino-5,6-diklor-1-(fosfonometyl)-lH-benzimidazol-2-propansyre.

4. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedat den er R-a-amino-5,6-dimetyl-1-(fosfonometyl)-lH-benzimidazol-2-propansyre.

5. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedat den er R-a-amino-6-klor- 1-(fosfonometyl)-lH-benzimidazol-2-propansyre.

6. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedat den er R-a-amino-5-klor-1-(fosfonometyl)-lH-benzimidazol-2-propansyre.

7. Anvendelse av en NMDA antagonist med formelen

hvori R er hydrogen, lavere alkyl, benzyl eller pivaloyloksymetyl; R<1>ogR<2>uavhengig er hydrogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, trifluormetyl, trifluormetoksy, metansulfonylamino, acetylamino eller halogen, eller R<1>og R<2>til sammen representerer en metylendioksygruppe; og de farmakologisk akseptable salter derav, til fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling og forebyggelse av nevropatologiske forstyrrelser indusert ved overstimulering av eksitatoriske aminosyrereseptorer.