NO20101768A1 - Krystallformer av astaksantin - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen beskriver tidligere ubeskrevne krystallformer av astaksantin designert form I og II. Det har overraskende blitt funnet at de to krystallformene av astaksantin viser en forbedret biotilgjengelighet, en relativt høy løselighet i spesifikke organiske løsningsmidler og en økt langtidsstabilitet. For eksempel er de nye formene stabile i fast form i minst 90 dager ved en temperatur på 20°C - 40°C. Det ble videre funnet at de to krystallformene kan fremstilles fra hverandre. Derfor angår også oppfinnelsen fremgangsmåter for fremstilling av nevnte krystallformer, i tillegg angår oppfinnelsen administrasjonsformer (heretter også kalt "formuleringer") omfattende én av de to krystallformene ifølge oppfinnelsen eller blandinger derav oppløst eller suspendert i olje eller organisk løsningsmiddel.

Description

Oppfinnelsen angår nye krystallformer av astaksantin, fremgangsmåter for å fremstille nevnte krystallformer, sammensetninger og formuleringer omfattende disse former og anvendelsen av nevnte modifikasjoner.

I dyreforindustrien, spesielt i fiskeoppdrettssektoren, anvendes astaksantin for bl.a. farging av laks, ørret og reker.

Astaksantin er uløselig i vann og bare lite løselig i olje som betyr at løsninger av astaksantin for direkte anvendelser er utilgjengelig. Videre er astaksantin svært sensitiv for oksidasjon og varmebehandling. Derfor er levering av astaksantin med svært god oral biotilgjengelighet for forbedret plasmaopptak og kjøttavsetning i salmonid svært viktig for fiskematprodusenter og fiskeoppdrettere.

For å gjøre fargestoffet mer biotilgjengelig har flere fremgangsmåter blitt utviklet for fremstilling av partikkelformede astaksantinsammensetninger som er dispergerbare i vann for bearbeiding til dyreforpellets. De dispergerbare sammensetningene fremstilles ved oppløsning av krystallinsk astaksantin i løsningsmidler (US 6,863,914 og US 6,406,735) eller oljer (US 5,364,563) under høyt trykk og temperatur, umiddelbart fulgt av dispergering av den organiske løsningen i vandig hydrokolloid. Alternativt smeltes karotenoidet i en vandig eksipiens-matriks og emulgeres undertrykk uten å anvende løsningsmiddel eller olje (US 6,093,348). Alle disse fremgangsmåtene krever ytterligere bearbeiding for å fremstille pulver eller faste formuleringer fra de vandige dispersjonene.

Teknikkens stand sier ingenting om spesifikke krystallformer av astaksantin og deres potensielle bruksmulighet for fremstilling av astaksantinformuleringer. Oppfinnerne ifølge den foreliggende patentsøknaden har funnet at det er av stor viktighet i dyrefåradditivindustrier å velge den rette polymorfen (= krystallform) av astaksantin og at en spesifikk krystallinsk polymorf av molekylet kan være mer nyttig enn andre.

"Rett" betyr en polymorf av astaksantin som er i stand til å opprettholde beste fysikalsk-kjemiske egenskaper av sluttformuleringer som er et nøkkelemne for produktytelse, slik som oppløselighetshastighet, stabilitet, løselighet og biotilgjengelighet.

Kort beskrivelse av oppfinnelsen

Det har nå overraskende blitt funnet at to spesifikke krystallformer av astaksantin viser en forbedret biotilgjengelighet, en relativt høy løselighet i spesifikke organiske løsningsmidler og en økt langtidsstabilitet. For eksempel er de nye formene stabile i fast form i minst 90 dager ved en temperatur på 20°C-40°C.

Det ble videre funnet at de to krystallformene kan fremstilles fra hverandre. Derfor angår også oppfinnelsen fremgangsmåter for fremstilling av nevnte krystallformer.

I tillegg angår oppfinnelsen administreringsformer (heretter også kalt "formuleringer") omfattende en av de to krystallformene ifølge oppfinnelsen eller blandinger derav oppløst eller suspendert i olje eller organisk løsningsmiddel. Løsningene eller dispersjonene kan anvendes til å fremstille faste formuleringer omfattende astaksantin i hydrofiliske eller lipofiliske dispergensbærer.

Til slutt angår oppfinnelsen anvendelsen av formuleringer inneholdende en av de to krystallformene ifølge oppfinnelsen eller blandinger derav i fiskeoppdrett for forbedring av stabiliteten av administrasjonsformer og for forbedring av biotilgjengeligheten av astaksantin, dvs. for å tilveiebringe høyere oralt opptak av forbindelsen.

Særlig angår den foreliggende oppfinnelsen to krystallinske former av astaksantin designert krystallform I og II, hvor - krystallform I er kjennetegnet ved de følgende parametrene

i) Et XRPD (Røntgenpulverdiffraksjon) mønster omfattende en topp mellom 20° og 21°, og

ii) en DSC (Differensialscannekalorimeter) scanning som viser en faseovergang ved 225°C-235°C; og hvor

krystallform II er kjennetegnet ved de følgende parametrene

i) Et XRPD-mønster omfattende en topp på omtrent 11° og 18°, og ii) En DSC-scanning som viser en faseovergang ved 200°C-220°C.

I et foretrukket eksempel er krystallform I kjennetegnet ved at den viser en faseovergang ved 230.8°C ± 1. I et annet eksempel er krystallform I stabil i fast form i minst 5 måneder, fortrinnsvis i minst 90 dager ved 20°C-40°C.

I et annet foretrukket eksempel er krystallform II kjennetegnet ved at den viser en faseovergang ved 210°C ± 1. I et annet eksempel er krystallform II stabil i fast form i minst 90 dager ved 20°C.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen gjelder følgende definisjoner: "Astaksantinforbindelse" inkluderer astaksantinmolekyler oppnådd under syntese og krystallisering av astaksantin eller under ekstraksjonsprosessen av astaksantin fra naturlige kilder.

"Mol%" indikerer renheten av en krystallform med hensyn til totalt molart astaksantininnhold av astaksantinforbindelsen.

"Lipofilisk dispergeringsmiddel" er en fast substans med vannløselighet ved romtemperatur lavere enn eller lik 5 mg/ml som har egenskapen av å innarbeide en molekylær eller kolloidal dispersjon eller aggregater av astaksantin i en fast sammensetning.

"Hydrofilisk dispergeringsmiddel" er en fast substans med vannløselighet ved romtemperatur høyere enn 5 mg/ml som har egenskapen av å virke som et fuktemiddel til å øke suspensjonen av astaksantin i en vandig fase.

"Fast sammensetning" betyr at astaksantinet er fordelt i en fast matriks som er fremstilt ved oppløsning av karotenoidet og det lipofiliske eller hydrofiliske dispersjonsmidlet sammen i et felles løsningsmiddel eller kombinasjon av løsnings-midler, etterfulgt av fjerning av løsningsmidlet eller løsningsmiddelblandingen.

"Vannblandbart løsningsmiddel" betyr at løsningsmidlet kan blandes i ethvert forhold med vann uten faseseparasjon, for eksempel etanol.

"Vannublandbart løsningsmiddel" betyr at løsningsmidlet kan blandes bare delvis med vann uten faseseparasjon, for eksempel diklormetan.

"Krystallisasjonsvæske" er en væske som er blandbar med løsningsmidlet hvori all-trans-astaksantin er oppløst men har en lavere løselighet eller praktisk talt ingen løsningsmiddelegenskaper (for astaksantin) ved temperaturen som forårsaker krystallisering av den spesifikke krystallformen.

Krystaller av astaksantin ifølge oppfinnelsen stammer fra kjemisk syntese som er velkjent for fagfolk og er all-trans-astaksantin.

Mange teknikker er anvendt for å identifisere de polymorfe formene av et materiale og dets relative temperaturstabilitet. Disse teknikker omfatter røntgenpulver-diffraksjon (XRPD), termogravimetrisk analyse, differensialscannekalorimetri (DSC), RÅMAN spektroskopi, optisk og elektrisk mikroskopi og UV-VIS teknikker.

I fleste tilfeller er røntgendiffraktometri i stand til å reflektere forskjellene i krystallstruktur. Ideelt sett gir røntgendiffraksjon på en enkel krystall (typiske dimensjoner 100x100x100 pm<3>) et tredimensjonalt diffraksjonsmønster av, normalt sett, godt oppløste topper, som etter fasing kan tilbaketransformeres til elektrontetthet. En kjensgjerning er at det ofte er vanskelig, om ikke umulig, å oppnå enkeltkrystaller av påkrevd kvalitet og størrelse fra et gitt materiale. I pulverdiffraksjonsforsøk består prøven av et stort antall av krystallitter med typiske dimensjoner på 5x5x5 pm<3>. Pulveret oppnås normalt ved finmaling eller oppmaling. I tilfelle av krystallform I og II oppnås XRPD-mønstre ved pulverdiffraksjonsforsøk.

Termiske analysemetoder er definert som de teknikker hvori en egenskap av analytten er bestemt som en funksjon av en ekstern påført temperatur. I mange henseender er DSC en lett metode til å anvende rutinemessig på en kvantitativ basis, og på grunn av dette så har det blitt en vidt akseptert metode for identifisering og karakterisering. Området av termisk analyse og nivået av forståelse av polymorfisme har begge vokst raskt de senere årene.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendes en DSC (Netzsch Phoenix 204) til å undersøke det termodynamiske forholdet mellom forskjellige polymorfer. DSC-cellen er kalibrert med indium (Tm = 156.6°C, AHsme= 28.54 J/g). Astaksantin (normalt 3-6 mg) ble oppvarmet ved bestemt hastighet, fra 20°C-250°C i Al-panner mens de ble spylt med nitrogen.

Raman-spektroskopi er en type av vibrasjonen spektroskopi. Den er vanlig å anvende i kjemi, siden vibrasjonen informasjon er spesifikk for de kjemiske bindingene i molekyler. Det gir derfor et fingeravtrykk hvorved molekylet kan identifiseres. Ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendes Brucker FT-Raman spektroskopi RFS 100S. En startlaser innstiles på 1284 mm"<1>. Rustfri prøveholder er anvendt med mengde på flere mikrogram. Til slutt analyseres data ved programvaren til Origin og OPUS.

Ifølge oppfinnelsen er krystallform I kjennetegnet ved

i) Et XRPD-mønster omfattende en topp mellom 20° og 21°, og ii) En DSC-scanning som viser en faseovergang ved 225°C-235°C;

Videre viser krystallform I en løselighetsprofil i diklormetan på 0.1-0.2 g/ml ved 20°C-25°C.

Ifølge oppfinnelsen er krystallform II kjennetegnet ved

i) Et XRPD-mønster omfattende en topp på omtrent 11° og 18°, og ii) En DSC-scanning som viser en faseovergang ved 200°C-220°C.

Videre viser krystallform II en løselighetsprofil i diklormetan på 0.3-0.4 g/ml ved 20°C-25°C.

En foretrukket utførelsesform av en astaksantinforbindelse består i alt vesentlig av 50 vekt% til 100 vekt% av den krystallinske formen I eller II.

En annen foretrukket utførelsesform av en astaksantinforbindelse angår en blanding bestående av i alt vesentlig 95 vekt% til 5 vekt% av den krystallinske formen I og 5 vekt% til 95 vekt% av den krystallinske formen II.

Som nevnt ovenfor angår også oppfinnelsen en fremgangsmåte for transformasjonen av krystallform I av astaksantin til krystallform II av astaksantin og omvendt.

Med hensyn til transformasjonen av krystallform I av astaksantin til krystallform II er fremgangsmåten kjennetegnet ved at

a) krystallform I oppvarmes til under dets smeltepunkt og deretter bråkjøles til romtemperatur eller b) krystallform I oppløses i et løsningsmiddel kjennetegnet ved et damptrykk på > 20 kPa og deretter fordampes løsningsmidlet, eller c) transformasjonen utføres ved slurryomdanneise i et organisk løsningsmiddel som for eksempel kloroform.

Med hensyn til transformasjonen av krystallform II av astaksantin til krystallform I er fremgangsmåten kjennetegnet ved at transformasjonen utføres ved slurryomdannelse i et organisk løsningsmiddel som for eksempel diklormetan eller etylacetat.

En annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen er en administrasjonsform omfattende krystallform I eller II eller blandinger derav for anvendelse i livsvitenskaps-industrien, spesielt for anvendelse i fiskeoppdrettindustrien.

For dette formålet kan astaksantinkrystallformen I eller II eller blandinger derav være

oppløst i et organisk løsningsmiddel eller olje eller blandinger derav etterfulgt av ytterligere bearbeiding til nevnte administrasjonsform;

oppløst i et organisk løsningsmiddel eller olje eller blandinger derav etterfulgt av ytterligere bearbeiding til nevnte administrasjonsform som omfatter en lipofilisk dispergens;

oppløst direkte i en matolje og/eller fiskeolje ved temperaturer mellom 100°C og 230°C for direkte innarbeidelse i fiskeforpellets og andre bruksformer.

Spesielt er det beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av en stabil vanndispergerbar administrasjonsform av astaksantin for anvendelse i næringsmiddelindustrien. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved oppløsning av astaksantinkrystaller av form I eller II i et organisk løsningsmiddel, blanding av denne løsningen med en vandig løsning og omdannelse av dispersjonen som har blitt dannet til et vanndispergerbart tørrpulver ved fjerning av løsningsmidlet og vannet og ved tørking i nærværet av et beleggsmateriale uten endring av krystallformen.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser et røntgendiffraktogram av krystallform I og II av astaksantin.

Figur 2 viser et Raman-spekter av krystallform I og II av astaksantin.

Figur 3 viser et Raman-spekter av to formuleringer av krystall I og II i området fra 500 til 1000 cm"<1>sammenliknet med en kontroll.

Detaljert beskrivelse av figurene og eksemplene

Den foretrukne fremgangsmåten for oppnåelse av astaksantin er å benytte kjemisk syntese slik som beskrevet i US 5,654,488. Syntetisk astaksantin er en 1:2:1 blanding av diastereoisomerene (3S,3'S), (3R,3'S) og (3R,3'R). En ytterligere fremgangsmåte for oppnåelse av astaksantin er via fermentering, eller fra mikroalger som beskrevet for eksempel i WO 89/1997 og EP 329754 eller fra gjæren Phaffia rhodozyma.

Den kjente teknikken for å fremstille astaksantinformuleringer for fiskefor beskriver ikke muligheten til å fremstille spesifikke krystallformer klartkarakterisert vedXRPD og DSC i tillegg til minst en annen fysikalsk parameter slik som Raman-spektrum, løselighet i organiske løsningsmidler. Krystallformene har forskjellig løselighet i organiske løsningsmidler og oljer som muliggjør et bredere valg for håndtering og formulering av astaksantinsammensetninger. Videre påvirker krystallformene ifølge oppfinnelsen in vivo oppløselighetshastigheten og tillater høyere (supermettede) konsentrasjoner i administrasjonsformer som gir høyere opptak og biotilgjengelighet, etter oral administrering.

Røntgenpulverdiffraksjonsmønstrene som vist i figur 1 ble oppnådd ved oppsamling av intensitetsdata målt ved bruk av Bruker D4 diffraktometer. Systemet er utstyrt med en Cu-anode og en monokromator som tilveiebringer Cu-Kal stråling (A = 1.54056 Å). Målinger ble utført ved anvendelse av en trinnbredde på 0.005° og en ervervelsestid på 4 s per trinn.

Figur 1 viser mønstret av krystallformen II sammenliknet med formen I. Mønstret av krystallene viser forskjellige karakteristiske topper i scanningsområdet. Spesielt er høyintensitetstoppen observert ved 20.35° i form I fraværende i mønstret av form II. Også to topper observert ved 20 = 11.07° og 18.32° av formen II samsvarer ikke med mønstret av form I.

DSC ble anvendt til å undersøke de termodynamiske egenskapene av de to forskjellige polymorfene. DSC-cellen ble kalibrert med indium (Tm = 156.6°C, AHsme<=>28.54 J/g).

For å undersøke de forskjellige polymorfene ble hhv. 3-5 mg prøver av form I eller II oppvarmet fra 20°C til 250°C ved en oppvarmingshastighet på 5 K/min, mens de ble spylt med nitrogen (10 ml/min).

DSC-analysen viser ett endotermisk tilfelle mellom 220°C og 235°C for form I og et annet i området mellom 200°C og 220°C for form II, erkjent som smelting av prøvene. I tillegg er en annen liten endotermisk topp ved 216.6°C også observert på oppvarmingssporet av form I.

Videre ble resonans Raman-spektroskopi (FT-Raman-spektrometer RFS 100/S, Bruker) anvendt for å undersøke polymorfismen av astaksantin. Malingen ble utført på et FT Raman-spektrometer med Raman-mikroskopi og temperaturkontrollenhet. Laseren ble drevet ved 1024 nm med tilbakespredende optikk.

Resonans Raman-spektene av astaksantin form I og II er vist i figur 2 og tabell 1.

Det mest intense båndet ved 1510 cm"<1>er tilegnet C=C strekkvibrasjonene av polyen-kjedet. Det andre mest intense båndet ved 1155 cm"<1>, som representerer superposisjonen av de to modusene kan tilskrives C-H i-plan bøyevibrasjoner blandet med hhv. C-C strekking og C=C-C bøyevibrasjoner. Den tredje intense linjen ved 1004 cm"<1>kan tilskrives CH3i-plan rokkevibrasjoner.

En rekke faseforskyvninger og forskjeller av spektralbåndene kan ses som skiller polymorfene. I området for eksempel fra 950-1000 cm"<1>har form II bare ett skarpt bånd mens form I viser to bånd.

Krystallform I og II kan bli fremstilt fra en løsning med svært ren astaksantin (dvs. mer enn 95%) etterfulgt av behandling av løsningen med for eksempel varme og/eller lys til å forårsake dannelsen av en tilstrekkelig mengde av astaksantinforbindelse for å oppnå i alt vesentlig krystallform I og/eller form II etter slutt-krystallisasjon. Det skal forstås at de tidligere nevnte krystallisasjonsmetodene kan utføres fortrinnsvis etter syntese for fremstilling av enten form I eller form II krystaller. Alternativt kan de også utføres i rensnings- eller ekstraheringstrinnene for astaksantinkrystaller (som del av kjemisk syntese eller isolasjon av astaksantinforbindelsen fra naturlige produkter) hvor minst ett krystallisasjonstrinn for fremstilling av astaksantin krysta 11, eller en (re)krystallisasjonsprosedyre benyttende løsningsmidler anvendes.

Det er flere krysta I lisasjonsmetoder basert på liknende prinsipper som kan bli

vurdert for å fremstille krystallform I, form II eller blandinger omfattende form I og form II, ved å starte fra løsninger (generelt er egnede løsningsmidler til å fremstille løsningene er løsningsmidler som oppløser minst 1 mg/ml, fortrinnsvis opp til 10-50 mg/ml av astaksantin ved temperaturen når krystallisasjon startes) som er

forskjellige i forbindelsesprofil og konsentrasjon. Egnede krystallisasjonsmetoder som kan bli vurdert av fagfolk omfatter, men er ikke begrenset til, de følgende metodene.

Ved å starte fra en apolar aprotisk organisk løsning av astaksantin under kontrollerte temperaturbetingelser induseres krystallisasjon ved fjerning av løsningsmidlet fra løsningen, valgfritt ved samtidig utbytting med en blandbar polar krystallisasjonsvæske. Et foretrukket apolart aprotisk løsningsmiddel er diklormetan. Alternative klorerte apolare aprotiske løsningsmidler er for eksempel kloroform, trikloretan. Egnede ikke-klorerte alternativer er dimetoksymetan, dietoksyetan og dioksacyklopentan. En foretrukket polar krystallisasjonsvæske er metanol eller andre alkanoler slik som etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol og tert-butanol.

Krystaller omfattende form I eller form II kan også oppnås ved fjerning av løsningsmidlet fra en astaksantinløsning i et polart aprotisk eller polart protisk løsningsmiddel ved fordampning. Løsningsmidler som har en høy løselighet for astaksantin og et lavt kokepunkt er foretrukket.

En annen fremgangsmåte til å indusere krystallisasjon er kjøling av en (over)mettet løsning i et apolart aprotisk løsningsmiddel. Foretrukne apolare aprotiske løsningsmidler er diklormetan, toluen eller alternative klorerte apolare aprotiske løsningsmidler. Polare løsningsmidler slik som tetrahydrofuran (THF), N-metylpyrrolidon (NMP), N-etylpyrrolidon (NEP) og pyridin som har en høy løselighet for astaksantin kan også bli vurdert. Krystallisasjonshastigheten og utbyttet av den ønskede krystallformen kan økes ved tilsetning av kimer av den rene formen til krystallisasjonsløsningen. Krystaller omfattende form I eller II kan også oppnås ved fortynning av en løsning av astaksantin inneholdende de ønskede konsentrasjonene av all-trans-astaksantin i et apolart aprotisk, polart aprotisk eller polart protisk løsningsmiddel ved tilsetning av en blandbar polar krystallisasjonsvæske. Eksempler på apolare aprotiske løsningsmidler er diklormetan, toluen eller alternative klorerte løsningsmidler. Krystallisasjonsvæske er i det tilfellet en alkanol som metanol. Eksempler på egnede polare løsningsmidler er THF, NMP og pyridin. De resulterende krystallene høstes ved for eksempel filtrering, spontan sedimentering eller sentrifugeringsmetoder kjent innen fagområdet, valgfritt vasket med et egnet løsningsmiddel, fortrinnsvis med en kald alkanol (fortrinnsvis metanol) og tørkes, fortrinnsvis under vakuum. De resulterende krystallene kan oppmales for å oppnå den ønskede partikkelstørrelsen for ytterligere bearbeiding.

Blandinger av krystallform I og II kan inneholde 5 % til 95 % av form I og 95 % til 5 % av form II, eller fra 20 % til 80 % av form I og 80 % til 20 % av form II.

Krystallform I, form II og blandinger av de to formene er egnet for innarbeidelse som sådan i faste, halvfaste og flytende (oljeaktige) formuleringer egnet for administrering til en organisme. Foretrukne eksempler av faste former er granulater, pellets, pulvere, etc. Foretrukne eksempler på halvfaste former er suspensjoner. De omfatter spesielt partikkelformede mikron suspensjoner av krystallform I eller form II eller blandinger av form I og II i en oljeaktig vehikkel.

Foretrukne administrasjonsformer som kan fremstilles ved anvendelse av krystallform I og/eller II er oljedispergerbare sammensetninger som for eksempel beskrevet i WO 03/102116. Krystallform I eller form II eller blandinger derav kan også anvendes for fremstilling av vanndispergerbare sammensetninger som beskrevet i US 2,861,891, US 5,364,563 og US 6,296,877.

Den vanlige fremgangsmåten for å fremstille faste sammensetninger og formuleringer omfattende astaksantin er å oppløse krystallformen I, formen II eller blandinger derav i et organisk, vannblandbart eller vannublandbart løsningsmiddel eller blandinger derav i nærværet av egnede eksipienser, etterfulgt av fjerning av løsningsmidlet enten ved fortynning i vann eller fordampningsteknikker som det er beskrevet i WO 03/102116. Krystallform I eller II kan anvendes direkte som sådan og oppløses i oljeaktige løsninger av astaksantin ved påføring av energi.

Løsningsmidlene anvendt til å fremstille løsninger og for bearbeiding av astaksantinkrystallformen I eller II eller blandinger derav til tørre astaksantinsammensetninger kan være vannblandbare eller vannublandbare. Eksempler på vannblandbare og ublandbare løsningsmidler omfatter eksemplene på løsningsmidler anvendt for krystallisasjon av krystallformene som er opplistet ovenfor. Ved påføringen av varme/trykk kan en krystallisasjonsvæske anvendt under krystallisasjon under normale trykk og omgivelsestemperaturer anvendes som løsningsmiddel for astaksantin (for eksempel isopropanol/vann). Foretrukne eksempler på eksipienser er dispergenser, polymerer og syntetiske naturgummier og cellulosederivater som kan være enten hydrofiliske eller lipofiliske.

Den faste astaksantinsammensetningen omfatter mellom 2,5 vekt% til 25 vekt%, fortrinnsvis 5 vekt% til 15 vekt%, av total astaksantin. Mengden av dispergens anvendt i sammensetningen er fortrinnsvis mellom 50 vekt% til 97,5 vekt%. Varierende mengder av eksipienser kan anvendes som svellemidler til å utgjøre sluttformen.

Egnede lipofiliske dispergeringsmidler kan velges fra spesielle elementer av gruppen bestående av etylcelluloser, syntetiske og naturlige harpikser, kolofoniumer og gummier.

Egnede hydrofiliske dispergenser omfatter, men er ikke begrenset til, beskyttelseskolloider av lav- og høy-molekylvekt komponenter av for eksempel gelatin, fiskegelatin, stivelse, dekstrin, planteproteiner, pektin, gummiarabikum, kasein, kaseinat eller blandinger derav; de protein-inneholdende beskyttelseskolloidene, spesielt ikke-gelerende lav-molekylvekt proteinhydrolysater og høyere-molekylvekt gelerende gelatiner er foretrukket. Ytterligere hydrofiliske dispergenser kan velges fra elementer av gruppen bestående av PEG (polyetylenglykol), polyvinylpyrrolidon, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon-polyvinylacetat kopolymer, hydroksypropylmetylcellulose (HMPC), hydroksypropylcellulose (HPC), hydroksypropylmetylcellulose ftalat (HPMCP), polyakrylater og polymetakrylater.

En foretrukket form av en fast formulering av astaksantin omfatter

a) en matrikssubstans som danner en ytre (kontinuerlig) fase; og

b) indre (diskontinuerlig) fase innenfor nevnte matrikssubstans som omfatter

1) astaksantinformen I eller II som er innarbeidet i

2) en fysiologisk akseptabel innkapslende substans som er fast ved romtemperatur og, sammen med astaksantin, er homogent løselig i et organisk løsningsmiddel.

Uttrykket "innkapslende substans" betegner enhver spiselig substans, som er fast ved påføringstemperaturer, i stand til å innkapsle den aktive bestanddelen og løselig sammen med den aktive bestanddelen i ett felles løsningsmiddel. Det er fortrinnsvis anvendt substanser, som vanligvis er anvendt som beleggsmaterialer. Mer foretrukket er anvendt syntetiske eller naturlige vokser eller voksliknende substanser, eller naturlige eller syntetiske spiselige polymerer.

Voks- eller den voksliknende substansen velges fortrinnsvis fra blant for eksempel karnaubavoks, candelillavoks, bivoks, risklivoks, sukkerrørvoks, korkvoks, guarumavoks, ouricuryvoks, montanvoks, spermaceti, lanolin, parafinvoks, fettstoffer, hydrogenene fettstoffer, fettsyremonoglyserider, polypropylenglykol, polyetylenglykol og fettsyreestere.

Naturlige spiselige polymerer velges fortrinnsvis fra modifiserte (for eksempel alkylerte) karbohydrater (for eksempel stivelse, pektin, alginat, karragen, furcellaran, chitosan, maltodekstrin, dekstrinderivater), celluloserog cellulosederivater (for eksempel celluloseacetat, metylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose) og gummier eller modifiserte (f.eks. alkylerte) gummier (for eksempel gummiarabikum, xantangummi, guargummi, ghattigummi, karayagummi, tragantgummi, johannesbrødgummi, gellangummi). Modifikasjon av disse polymerer kan være nødvendig for å forbedre løselighet i organiske løsningsmidler.

Den syntetiske polymeren velges fortrinnsvis fra blant de syntetiske voksene slik som polyetylen- og polypropylenvokser, kumaren-inden harpikser, polymelkesyre (PLA) og poly(melke/glykol)syre (PLGA), akryliske polymerer (metakrylsyre-kopolymerer og ammoniometakrylatkopolymerer), polyortoestere, polyfosfazener, polyan hyd rider, polyglykolid (PGA), poly(e-kaprolakton), polydioksanon, tri-metylenkarbonat, poly(P-hydroksybutyrat)poly(Y-etylglutamat), poly(DTH iminokarbamat), poly(bisfenol A iminokarbonat) og polycyanoakrylat), spesielt de akryliske polymerene.

Matrikskomponenter velges fortrinnsvis fra blant karbohydrater (for eksempel cellulose, stivelse, modifisert stivelse, dekstrin, pektin, alginat, karragen, furcellaran, chitosan), gummier (for eksempel gummiarabikum, xantangummi, guargummi, ghattigummi, karayagummi, tragantgummi, johannesbrødgummi, gellangummi), proteiner (for eksempel fisk, fjærkre og mammalisk gelatin, soyaprotein, erteprotein, zein (fra mais) hvetegluten, lupinprotein, peanøttprotein, melkeproteiner eller hydrolysene eller modifiserte melkeproteiner, spesielt kasein eller myseproteiner, ligniner og ligninderivater (for eksempel lignosulfonater, kraftligniner), celluloser og cellulosederivater (for eksempel karboksymetylcellulose, karboksyetylcellulose, hydroksypropylcellulose).

Foretrukne matrikssubstanser er gelatin, lignosulfonater, melkeproteiner eller hydrolysene melkeproteiner, planteproteiner eller hydrolysene planteproteiner, eller modifisert stivelse, spesielt gelatin, kasein og kaseinhydrolysater, soyaprotein, hydrolysater derav, lignosulfonat, fysikalsk modifisert soyaprotein, stivelser og modifiserte stivelser, spesielt oktylsukkinylstivelse, pektiner og karboksymetylcellulose.

Spesielt foretrukket er matrikssubstanser som tilveiebringer kaldtvann løselige sammensetninger, slik som lignosulfonat, fiskegelatin, melkeprotein og hydrolysene planteproteiner.

Som løsningsmiddel kan ethvert organisk løsningsmiddel eller enhver løsnings-middelkombinasjon anvendes som er i stand til å oppløse astaksantinforbindelser. Flyktige løsningsmidler og løsningsmiddelkombinasjoner som er lette å fordampe fra emulsjonen er foretrukket. Eksempler på løsningsmidler er isopropanol, heksan, cykloheksan, aceton, metyletylketon, metylenklorid, kloroform, toluen, tetrahydrofuran, eddiksyreetylester.

Som det vil fremkomme av det foregående omfatter den foretrukne faste sammensetningen en matrikssubstans som en kontinuerlig fase hvori partikler (dråper) av en innkapslende substans er fordelt. Innenfor nevnte partikler (dråper) av den innkapslende substansen er astaksantin fordelt. Slike sammensetninger skiller seg fra sammensetninger hvori partikler av astaksantin er fordelt innenfor en matrikssubstans (jf. for eksempel EP 564 989) eller sammensetninger hvori astaksantin er belagt med et beleggsmateriale.

Eksempler

De følgende representative eksempler illustrerer metoder for å fremstille astaksantin krysta Uform er I og II og metoder for å innarbeide astaksantinkrystallform I og/eller krystallform II i administrasjonsformer. Eksemplene illustrerer også at de to formene har en relativt høy løselighet i spesifikke organiske løsningsmidler og en økt langtidsstabilitet som er fordelaktig i dyreforindustrien. Til slutt illustrerer også eksemplene anvendelsen av krystallform I eller krystallform II eller definerte blandinger derav i administrasjonsformer for forbedring av stabiliteten til formene og for forbedring av biotilgjengeligheten til astaksantin, dvs. for å tilveiebringe høyere oralt opptak av forbindelsen.

Eksempel 1: Fremstilling av krystallform I

For fremstilling av den ønskede krystallformen ifølge fremgangsmåten beskrevet ovenfor, kan astaksantin fra Sigma (naturlig astaksantin) og Dr. Ehrenstorfer (syntetisk astaksantin, analytisk kvalitet) anvendes. Renheten av forbindelsen kan bestemmes ved HPLC-målinger og karakteriseres ved røntgendiffraksjon og Raman-spektroskopi. Ultraren astaksantin kan også oppnås fra mindre ren astaksantin ved hjelp av preparativ HPLC.

Eksempel 2: Fremstilling av krystallform II fra krystallform I

Form II kan fremstilles ved varmebehandlingen eller fordampningen fra visse løsningsmidler, slik som aceton. På grunn av den lave løseligheten (omtrent 8 mg-1000 ml"<1>i acetone ved 20.5°C), kan bare en svært liten mengde av krystaller oppnås ved fordampning. Varmebehandling ble derfor anvendt som hovedmetoden for krystallfremstilling.

Form II ble produsert ved oppvarming av form I til like under dens smelte-temperatur og deretter bråkjøling. Oppvarming av form I ble utført i en DSC (Netzsch Phoenix 204) celle. Omtrent 6-7 mg astaksantin form I ble oppvarmet i Al-pannen ved en oppvarmingshastighet på 5 K-min"<1>, fra 20°C til 200°C, og deretter sakte oppvarmet til 224°C ved en oppvarmingshastighet på 2 K-min"<1>. Umiddelbart etter denne temperaturen ble nådd, ble prøven kjølt ned fra 224°C til 20°C ved 40 K-min"<1>. DSC-systemet ble spylt med nitrogen over det hele. XRPD- og DSC-kurver bekrefter den andre krystallformen av astaksantin.

Forskjellige analytiske teknikker ble anvendt for å undersøke polymorfene. XRPD beviste eksistensen av form II som angitt ovenfor.

Termisk analyse viste at form I smelter ved 230.4°C mens form II smelter ved 216.7°C. Til slutt tilveiebrakte Raman-spektre tilstrekkelig informasjon til å identifisere polymorfene. Forskjeller i topposisjon og faseforskyvning av Raman-bånd mellom form I og II gjør det mulig å skille mellom begge former ved omgivelsesbetingelser.

Eksempel 3: Løselighetsmålinqer

For de farmasøytiske forbindelsene og næringsmiddelforbindelsene har løselighet av forskjellige polymorfer i forskjellige løsningsmidler fått økt oppmerksomhet i de senere årene.

Løselighetene av astaksantin form I og II i forskjellige løsningsmidler ble sammenliknet. På grunn av den svært lave løseligheten i noen løsningsmidler

(isopropanol og maisolje) ble forsøk i disse to løsningsmidlene målt ved anvendelse av en UV-VIS måler. De mettede løsningene ble fremstilt ved forskjellig temperatur i et dobbeltmantlet kar og 1 ml av løsningen ble tatt ut og målt av UV-VIS måleren. For å beregne den virkelige konsentrasjonen i disse løsningsmidler, ble

kalibreringen først gjort ved å bygge opp korrelasjonen mellom absorbansenheten og løsningskonsentrasjonen.

Forsøkene viste at løseligheten er klart forskjellig avhengig av løsningsmidlet. For eksempel er løseligheten av form II i metylenklorid (DCM) over 280 mg-100 ml"<1>mens løseligheten i isopropanol bare er 3.4 mg-100 ml"<1>ved 30°C. En høyere løselighet av form II kan observeres i disse løsningsmidler.

Den ideelle løseligheten kan estimeres ved anvendelse av likningen med målte smeltepunkter og smeltevarme fra DSC-data. Resultater er oppsummert i tabell 2. Løselighetsforholdet synker typisk når temperaturen øker (med mindre det er en enantiotropisk overgang mellom temperaturene av løselighetsbestemmelse i den høyere temperaturen som er av interesse). Forholdet av bestemt løselighet mellom astaksantin form I og II er i området fra 1.5 til 1.8.

Eksempel 4: Løsninqsmiddel- formidlet transformasjon - slurrvomdannelsesforsøk

Løsningsmiddel-formidlet polymorf transformasjon er en effektiv teknikk til å studere fasestabiliteten av forskjellige krystallformer i forskjellige løsningsmidler. I denne teknikken er den mindre stabile formen suspendert i en mettet løsning av løsningsmidlet som er av interesse. Den mer stabile formen vil så krystallisere på bekostningen av den mindre stabile formen, fordi den åpenbare løseligheten av denne metastabile formen er høyere enn løseligheten av den mest stabile formen. Etter som transformasjonshastigheter i forskjellige løsningsmidler varierer fra minutt til år, bør et passende løsningsmiddel velges til enten å lette eller hemme transformasjonen.

For tiden er valget av et løsningsmiddel fortsatt gjort ved prøving og feiling, som er tidkrevende. Ifølge den foreliggende oppfinnelsen ble stabilitetstesten utført ved slurryomdannelsesforsøkene i seks forskjellige løsningsmidler. Form II (og i ett tilfelle form I) er suspendert som den innledningsvise formen og de resulterende krystallene ble analysert ved XRPD.

De to formene kan fremstilles via løsningsmiddel-formidlet transformasjon. Fra resultatene opplistet i tabell 3 kan det ses at transformasjonen av form II til form I bare detekteres i EtOAc (etylacetat) og DCM (metylenklorid) og at transformasjonen av form I til form II bare detekteres i kloroform.

Eksempel 5: Olieaktiq form av krystallform I eller II

10 g av astaksantin krysta Uform I eller form II blandes med 90 g soyabønneolje. Krystallene oppmales og den resulterende mikroniserte suspensjonen er egnet til fremstilling av pulverformuleringer eller kan direkte oppløses i olje ved anvendelse av en flashvarmeprosedyre etterfulgt av kjøling med et overskudd av en oljefase omfattende en emulgator.

Eksempel 6: Kolloidaldisperqert formulering av former I og II

I en oppvarmbar mottakskolbe suspenderes 4 g av astaksantinkrystallform I eller form II og 1.5 g av peanøttolje i en løsning av 1.2 g av Etoxyquin i 29 g av isopropanol/vann (88/12, w/w) ved 30°C. Denne suspensjonen blandes ved en blandetemperatur på 170[u] med 59 g av isopropanol/vann (88/12, w/w) med en oppholdstid på 0.2 sekunder. Den resulterende molekylære dispergerte astaksantinløsningen går umiddelbart deretter til et ytterligere blandekammer. 11.3 g av en vandig gelatinløsning, justert til pH 9 som, i tillegg til 8.4 g av gelatin A (100 Bloom, m.v. = 94000), inneholdende 4.2 g av Gelita Sol P (m.v. = 21000) og 9.2 g av sukrose, tilsettes til å bunnfelle astaksantinet, ved 45°C, i kolloidaIdispergert form.

Eksempel 7: En pulversammensetninq

Pulversammensetningen fremstilles ved oppløsning av 1 g av astaksantin krysta Uform en I, med 8 g etylcellulose N4 (The Dow Chemical Company) og 1 g alfa-tokoferol i 90 g diklormetan (Fluka), etterfulgt av fjerning av løsningsmidlet til å produsere et granulat, ved anvendelse av sprøytegranulering.

En annen pulversammensetning fremstilles ved oppløsning av 0.80 g av astaksantinkrystallformen II med 8.4 g etylcellulose N4 (The Dow Chemical Company) og 0.80 g alfa-tokoferol i 90 g diklormetan (Fluka), etterfulgt av fjerning av løsningsmidlet til å produsere et granulat, ved anvendelse av sprøytegranulering.

Eksempel 8: Astaksantinperle

15 g av en astaksantinforbindelse av form II og 15 g bivoks oppløses sammen med 3 g Etoxyquin i 600 ml kloroform. 75 g Na-lignosulfonat oppløses i 375 ml avmineralisert vann. Denne løsningens pH reguleres til 7.5 ± 0.5 ved anvendelse av en 20% w/w natriumhydroksidløsning. Oljefasen tilsettes sakte til den vandige fasen ved anvendelse av både en høy blandehastighet og en høy skjærkraftblander. Etter at tilsetningen er avsluttet, opprettholdes emulsjonstemperaturen ved 50°C, mens høy skjærkraftblanding fortsettes i 15 minutter. Temperaturen heves gradvis og blanding fortsettes inntil alt av kloroformen har blitt fordampet. Denne fordampningen avsluttes vanligvis når emulsjonens temperatur når ca. 75°C. Under fordampningsprosedyren tilsettes destillert vann til emulsjonen for å opprettholde en egnet viskositet.

Etter at alt av kloroformen har blitt fjernet, tilsettes destillert vann og blandes grundig med emulsjonen for å oppnå et emulsjonsfaststoffinnhold og en viskositet egnet for sprøyting. Emulsjonen sprøytes så inn i et sjikt av 1 kg fluidisert stivelse ved anvendelse av en lab sprøytepanne. Reststivelse fjernes ved sikting.

Eksempel 9: Stabilitet av former I og II

To faste formuleringer av krystallformene I og II ble fremstilt ifølge metodene nevnt ovenfor. Formuleringene har blitt analysert ved Raman-spektroskopi og - med hensyn til stabilitet - ved UV-retensjon, en vanlig anvendt metode for stabilitetsmålinger.

Prøvene anvendt i dette forsøket er:

Prøve A: krystallform I fremstilt med metylenklorid

Prøve B: krystallform II fremstilt med kloroform

For begge formuleringer har en matriks-sammensetning bestående av en H20-fase (Ca-lignosulfonat &Gul dekstrin) og en oljefase (CH2CI2) blitt anvendt.

Prøve C: Som en kontroll ble kommersielt produkt Carophyll Pink 10%-CWS fra DSM Nutritional Products Ltd anvendt.

I dette tilfellet ble den følgende matriks-sammensetningen anvendt: H20-fase: Ca-lignosulfonat &Gul dekstrin; Oljefase: CH2CI2, &

d,l-a-tokoferol, bivoks)

Figur 3 viser Raman-spektrene av de to formuleringene av krystallform I og II i området fra 500 til 1000 cm"<1>sammenliknet med kontrollen. Profilene viser klart at de to krystallformene som anvendt for fremstillingen av de faste formuleringsprøvene fortsatt er til stede i sluttformen.

Resultatene av stabilitetstesten er vist i tabeller 4 og 5. Resultatene indikerer at de formulerte krystallformene er stabile i fast form i minst 90 dager ved 20°C.

Eksempel 10: Eksperimentell design for bestemmelse av biotilqlenqeliqhet

Bestemmelse av biotilgjengeligheten av astaksantin fra forskjellige formuleringer kan gjøres ved beregning av de tilsynelatende fordøyelighetskoeffisientene (ADC).

For eksempel kan ADC av astaksantin beregnes som en fraksjonen nettoabsorpsjon av næringsmidler fra dietter basert på yttriumoksid (Y203) som en ikke-absorberbar indikator.

ADC kan beregnes ved anvendelse av den følgende formelen:

Fordøyelighetsdata kan deretter transformeres i arkussinus av kvadratrot av prosentverdier før de blir utsatt for enveis ANOVA-analyse. Til slutt kan StatBoxPro programvare (Grimmersoft, versjon 5.0) anvendes for å utføre statistiske beregninger.

Claims (15)

1. Krystallformer av astaksantin designert krystallform I og II, hvori krystallform I er kjennetegnet ved de følgende parametrene i) Et XRPD (Røntgenpulverdiffraksjon)mønster omfattende en topp mellom 20° og 21°, og ii) En DSC (Differensialscannekalorimeter)scanning som viser en faseovergang ved 225°C-235°C; og hvor krystallform II er kjennetegnet ved de følgende parametrene i) Et XRPD-mønster omfattende en topp på omtrent 11° og 18°, og ii) En DSC-scanning som viser en faseovergang ved 200°C-220°C.

2. Krystallform I ifølge krav 1, karakterisert vedat den viser en faseovergang ved 230.8°C ± 1.

3. Krystallform II ifølge krav 1, karakterisert vedat den viser en faseovergang ved 210°C ± 1.

4. Krystallform ifølge ethvert av krav 1-3, som er stabil i fast form i minst 90 dager ved 20°C.

5. Anvendelse av krystallform I eller II ifølge ethvert av krav 1-4 for fremstillingen av administrasjonsformer med forbedret stabilitets- og biotilgjengelighetsegenskaper.

6. Administrasjonsform omfattende krystallform I eller II eller blandinger derav for anvendelse i fiskeforindustrien.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av en administrasjonsform ifølge krav 6,karakterisert vedat astaksantinkrystallform I eller II eller en blanding derav er oppløst i et organisk løsningsmiddel eller olje eller blandinger derav etterfulgt av ytterligere bearbeiding til nevnte administrasjonsform; oppløst i et organisk løsningsmiddel eller olje eller blandinger derav etterfulgt av ytterligere bearbeiding til nevnte administrasjonsform som omfatter et lipofilisk dispergens; oppløst direkte i en matolje og/eller fiskeolje ved temperaturer mellom 100°C og 230°C for direkte innarbeidelse i fiskeforpellets og andre bruksformer.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av en stabil vanndispergerbar administrasjonsform av astaksantin ifølge krav 6 for anvendelse i næringsmiddelindustrien ved oppløsning av astaksantin krysta I le r av form I eller II i et organisk løsningsmiddel, blanding av denne løsningen med en vandig løsning og omdannelse av dispersjonen som har blitt dannet til et vanndispergerbart tørrpulver ved fjerning av løsningsmidlet og vannet og ved tørking i nærværet av et beleggsmaterialet uten endring av krystallformen.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, hvori løsningen er laget ved oppløsning av astaksantinkrystaller av form I eller II i et vannblandbart organisk løsningsmiddel eller en blanding av vann og et vannblandbart organisk løsningsmiddel.

10. Anvendelse av en administrasjonsform ifølge krav 6-9 i dyrefår for forbedring av biotilgjengeligheten til astaksantin.

11. Anvendelse av en administrasjonsform ifølge krav 6-9 for forbedring av stabiliteten til astaksantin i ferdig matprodukt eller -for.

12. Fremgangsmåte for transformasjon av krystallform I av astaksantin til krystallform II av astaksantin, hvori krystallform I er kjennetegnet ved de følgende parametrene i) Et XRPD (Røntgenpulverdiffraksjon)mønster omfattende en topp mellom 20° og 21°, og ii) En DSC (Differensialscannekalorimeter)scanning som viser en faseovergang ved 225°C-235°C; og hvor krystallform II er kjennetegnet ved de følgende parametrene i) Et XRPD-mønster omfattende en topp på omtrent 11° og 18°, og ii) En DSC-scanning som viser en faseovergang ved 200°C-220°C,karakterisert vedat (a) krystallform I oppvarmes til under dens smeltepunkt og deretter bråkjøles til romtemperatur eller (b) krystallform II oppløses i et løsningsmiddel og deretter fordampes løsningsmidlet, eller (c) transformasjonen utføres ved slurryomdannelse i et organisk løsningsmiddel.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvori krystallformen oppløses i et løsningsmiddel,karakterisert vedet damptrykk på > 20 kPa.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvori krystallform I oppvarmes til under dens smeltepunkt og deretter bråkjøles til romtemperatur,karakterisert vedat krystallformen I oppvarmes opp til mellom 205°C og 210°C.

15. Fremgangsmåte for transformasjon av krystallform II av astaksantin til krystallform I av astaksantin, hvori krystallform I er kjennetegnet ved de følgende parametrene i) Et XRPD (Røntgenpulverdiffraksjon)mønster omfattende en topp mellom 20° og 21°, og ii) En DSC (Differensialscannekalorimeter)scanning som viser en faseovergang ved 225°C-235°C; og hvor krystallform II er kjennetegnet ved de følgende parametrene i) Et XRPD-mønster omfattende en topp på omtrent 11° og 18°, og ii) En DSC-scanning som viser en faseovergang ved 200°C-220°C,karakterisert vedat transformasjonen utføres ved slurryomdannelse i et organisk løsningsmiddel som for eksempel diklormetan eller etylacetat.