NO135362B - - Google Patents

Download PDF

Info

Publication number
NO135362B
NO135362B NO1791/73A NO179173A NO135362B NO 135362 B NO135362 B NO 135362B NO 1791/73 A NO1791/73 A NO 1791/73A NO 179173 A NO179173 A NO 179173A NO 135362 B NO135362 B NO 135362B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
mmol
arg
leu
pna
cbo
Prior art date
Application number
NO1791/73A
Other languages
English (en)
Other versions
NO135362C (no
Inventor
K G Claeson
B G Karlsson
L-G Svendsen
Original Assignee
Kabi Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabi Ab filed Critical Kabi Ab
Publication of NO135362B publication Critical patent/NO135362B/no
Publication of NO135362C publication Critical patent/NO135362C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0202—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-X-X-C(=0)-, X being an optionally substituted carbon atom or a heteroatom, e.g. beta-amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/10—Anilides
    • C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Peptider for anvendelse som diagnostiske substrater med høy spesifitet for trypsin og andre enzymer av typen peptidyl-peptidhydrolaser.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår peptider for anvend-
else som diagnostiske substrater med hoy spesifisitet for trypsin og andre enzymer av typen peptidyl-peptid-hydro-
laser, som f.eks. trypsin, plasmin, thrombin, "Reptilase",
"Arvin" og det hittil uklassifiserte enzym "Brinase".
Substratet ifolge oppfinnelsen er beregnet på kvantitativ bestemmelse av klassifiserte og hittil uklassifiserte enzymer av typen E.C.> spesielt slike som spalter peptider eller proteiner i peptidkjeden ved carboxylsiden av arginin eller lysin. Dessuten-kan substratene anvendes ved studium av reaksjoner hvor enzymer dannes, inhiberes eller forbrukes, og o:gså for bestemmelse av faktorer som innvirker på eller deltar i slike reaksjoner, f.eks. til bestemmelse av proenzymer, aktivatorer, antienzymer og enzyminhi-. bitorer.
Ved klassifisering av enzymene er anvendt den av The Inter-national Union of Biochemistry anbefalte Enzyme Nomenclature, Elsevier, Amsterdam, 1965.
I bl.a. Methoden der enzymatischen Analyse, Bind I, side 1023 (Ed. Bergmeyer, H.U. Verlag Chemie, 1970) finnes omtalt forbindelser som har vært anvendt til kvantitativ bestemmelse av de ovenfor nevnte enzymer. Prinsipielt kan disse syntetiske substrater inndeles i to hovedgrupper, estersubstrater og amidsubstrater, avhengig av hvilken av de proteolytiske enzymers katalytiske reaksjoner som finner sted, den esterolytiske eller den amidolytiske. Den storste gruppe av syntetiske substrater som hittil er blitt anvendt er estersubstrat-ene, hvilket beror på at disse omsettes meget hurtigere av peptidyl-peptid-hydrolaser enn de hittil fremstilte amidsubstrater. Den ves-entlige biologiske funksjon hos de enzymer som er klassifisert som peptidyl-peptid-hydrolaser, er imidlertid, som navnet sier, å spalte peptid- eller amidbindinger i naturlige substrater og ikke ester-bindinger. I litteraturen (Blood Clotting Enzymology, s. 36 og h2- hh, Ed.: Seegers, W.H. Academic Press, 19-67) angis at den esterolytiske. og den amidolytiske katalyse hos disse enzymer ikke står i et konstant forhold til hverandre under ulike reaksjonsbetingelser. Man har derfor efterstrebet syntetiske amidsubs"trater som har meget storre spesifisitet til de aktuelle enzymer og som dessuten ved den enzymatiske hydrolyse hurtigere kan spaltes til målbare produkter enn de hittil kjente. Særlig vel egnet til å studere og folge reaksjons-forlopet ved den enzymatiske hydrolyse er amidsubstrater, som gir kromofore.produkter, som er lett å måle spektrofotometrisk og har lys-absorbsjonsmaksima som ikke faller sammen med amidsubstratenes lys-absorpsjonsmaksima, eller fluoriserende produkter som er egnet til å ■måles ved hjelp av fluoricensspektrofotometri, og også produkter som efter kobling med passende reagenser,'gir koblingsprodukter som med hoy folsomhet kan måles fotometrisk. Noen syntetiske amidsubstrater med avspaltbare kromofore grupper har hittil vært anvendt. De er forst og fremst av typene Na<->usubstituerte og Na<->substituerte mono-aminosyre-p-nitro-anilidderivater og mono-aminosyre-B-nafthylamid-derivater. Blant disse forbindelser kan Na<->benzoyl-DL-arginin-p-nitro-anilidhydroklorid (BAPNA) nevnes som et reagens på trypsin (E.C. 3.1f.1+.) eller andre reaksjpner hvor trypsin deltar. Ved den enzymatiske hydrolyse av dette substrat dannes det kromofore produkt p-nitroanilin, som lett kan måles spektrofotometrisk.
Disse tidligere kjente amidsubstrater har imidlertid ikke onsket spesifisitet og folsomhet. Dette er en stor ulempe, som kan innebære en vanskeliggjort provetagning, da en stor mengde biologisk prove trenges. Selve enzymreaksjonen tar dessuten lang tid og nøyaktigheten ved enzymbestemmelsen kan bli utilfreds-stillende.
De nye substrater av .amidtypen,ifolge oppfinnelsen med en meget hoy susceptibilitet til trypsin og andre enzymer av typen peptidyl-peptidhydrolaser kjennetegnes ved folgende generelle
formel:
eller salter derav, hvor R-^ er hydrogen eller benzoyl,
R2 er hydrogen eller cyclohexyl,
X er methylen eller en enkelbinding,
R3 er rettkjedet, forgrenet eller cyclisk alkyl med 3-8 car-bonatomer,
R^ er forgrenet alkyl med 3 elleT h carbon-atomer,
n er 3 eller V,
R^ er hydrogen eller guanyl, og
Rg er nitrofenyl, nafthyl eller nitronafthyl.
De nye peptider kan fremstilles ved i prinsippet to forskjellige metoder.
1. Den ene metode er basert på at den kromofore gruppe Rg kobles til den aktuelle aminosyre og at derefter den onskede peptidstruktur bygges opp trinnvis ved suksessiv påkobling av ovrige aminosyrer. Den kromofore gruppe tjenestegjor derved som beskyttelsesgruppe for C-
ende-carboxylgruppen i den forste aminosyre.
2. Den annen metode er basert på trinnvis oppbygning av den onskede
peptidstruktur og forst derefter avspaltes anvendte beskyttelsesgrupper og den kromofore gruppe R^ påkobles.
Ved den trinnvise oppbygning av peptidderivatene anvendes vanligvis, i peptidkjemien lenge kjente og anvendte koblingsmetoder. Som a-amino-beskyttelsesgrupper kan anvendes de vanlige, i peptidkjemien kjente, beskyttelsesgrupper, som f.eks. Cbo (carbobenzoxy), MeOCbo (p-methoxycarbobenzoxy), NC^Cbo (p-nitrocarbobenzoxy), MCbo (p-methoxyfenylazo-carbobenzoxy), BOC (t-butyloxycarbbnyl), TFA (trifluoracetyl) eller formyl. a-carboxylgruppen kan aktiveres ved at den overfores til forskjellige aktiverte, i peptidkjemien kjente og ofte anvendte, derivater som enten kan isoleres eller genereres in situ, f.eks. p-nitrofenylester, triklorfenylester, pentaklorfenyl-ester, N-hydroxysuccinimidester, syreazid, syreanhydrid, som enten kan være symmetrisk eller usymmetrisk, eller også kan den aktiveres med et carbodiimid som N,N'-dicyclohexylcarbodiimid. C-ende-carboxylgruppen i aminopeptidderivatet. eller aminosyrederivatet kan beskyttes ved at den forestres til f.eks. methyl-, ethyl- eller iso-propylester-en, eller ved at den overfores til det kromofore aminderivat, som således virker som beskyttelsesgruppe under oppbygningen av peptidkjeden. Frie funksjonelle grupper som ikke deltar i reaksjonen, kan ved oppbygningen av peptidene eller peptidderivatene beskyttes på folgende måte: For blokkering av arginylrestens 8-guanidogruppe og lysyl-restens £-aminogruppe anvendes vanlige, i peptidkjemien brukte, amino-beskyttelsesgrupper f.eks. N02 Tos (p-toluensulfonyl) eller bare peptonisering som. beskyttelse for guanidogruppen og Cbo (carbobenzoxy) , BOC (t-butyloxycarbonyl) eller Tos for £.-aminogruppen. Som beskyttelse for hydroxylgruppen i tyrosin anvendes vanligvis i peptidkjemien brukte beskyttelsesgrupper som f.eks. benzyl- og t-butyl-.beskyttelsesgrupper.
Oppfinnelsen vil bli beskrevet mere detaljert i de folgende ut-forelseseksempler som viser fremstilling av forskjellige substrater ifolge oppfinnelsen ved trinnvis syntese.
Ved den tynnskiktskromatografiske analyse av eluat og produkter anvendes glassplater med "Kiselgel F2jif" (E.Merck) som absorbsjons-middel.
Til utvikling av tynnskiktskromatogrammene ble anvendt folgende opplbsningsmiddelsystemer:
Efter tynnskiktskromatograferingen fremkalles platene i UV-lys
(25^ nm), og derefter med klor/toluidinreaksjonen (litt: G. Pataki: Mnnschichtchromatografie in der Aminosåure- und Peptid-Chemie, ■ :>■■ Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1966, side 125) som fremkallings-metode.
Alle aminosyrer i forbindelsene har L-konfigurasjon hvor annet
ikke er angitt, og de nedenfor anvendte forkortelser har folgende betydning:
Andre forkortelser:
Ac = Acetyl
Ac20 = Eddiksyreanhydrid
AcOH = Eddiksyre
BOC = t-Butyloxycarbonyl
Bz = Benzoyl
Bzl = Benzyl
Bz20 = Benzoesyreanhydrid
Cbo = Carbobenzoxy
DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid
DCHA = Dicyclohexylamin
DCU = Dicyclohexylcarbamid
DMF = Dimethylformamid
Et^N = Triethylamin
HMPTA= N,N,N',N',N",N"-hexamethylfosforsyretriamid
MCbo = p-Methoxyfenylazocarbobenzoxy
MeOH = Methanol
NA = nafthylamin
OtBu = Ethyloxy
OMe = Methyloxy
OpNP = p-nitrofenoxy
OisoPr = iso-propyloxy
pNA = p-nitroanilid
TFA = Trifluoracetyl
Tos = p-toluensulfonyl
TLC = tynnskiktskromatografi
Eksempel I: H- Leu- Leu- Arg- pNA- 2HC1
Eksempel Ia: Cbo- Arg( NOo)- pNA
35,3 g (0,1 mol) tort Cbo-Arg(N02)-0H opploses i 200 ml tort nydestillert HMPTA ved værelsetemperatur, hvorefter 10,1 g (0,1 mol) Et^N og 2h, 6 g (0,15 mol) p-nitrofenylisocyanat tilsettes under omroring og under utelukkelse av fuktighet. Efter et dogns reaksjonstid ved værelsetemperatur helles reaksjonsopplosningen i 2 liter 2%- ig natriumbicarbonatopplosning under god omroring. Den dannede feining frafiltreres og vaskes tre ganger med 0,5 liter 2%-ig natriumbicarbonatopplosning, 2 ganger med 200 ml destillert vann, derefter 2'ganger med 500 ml 0,5N saltsyre og til slutt 5 ganger med 200 ml destillert vann. Det torrede råprodukt ekstraheres med varm methanol. Den i methanolen uoppløselige rest som utgjbres av N,N'-bis-p-nitro-fenylcarbamid frafiltreres og filtratet renses på en kolonne med "Sephadex" LH-20 bragt i likevekt med methanol.
Man fikk 29,8 g (63,0$) Ia med sm.p. 185-188°C, enhetlig ifolge TLC i P1 og C og [cc]^ = -1,3° (c = 1,1, AcOH).
■ Eksempel Ib: Cbo- Leu- Arg ( NO^ J- pNA
Syntesemetodé: 5 g (10,6 mmol) Ia opploses 1 21 ml AcOH og 22 ml KN HBr i AcOH under vannfrie betingelser. Reaksjonsopplosningen om-rores i 1 time og helles derefter langsomt ned i 200 ml ether under kraftig omroring, hvorved 1,5 HBr•H-Arg(N02)-pNA faller ut. Etherfasen fradekanteres og felningen vaskes ytterligere 3 ganger med 100 ml ether for å fjerne dannet benzylbromid og overskudd av HBr og AcOH. Efter torring i vakuum over fosforpentoxyd fåes hydrobromid-
saltet av aminosyrederivatet i kvantitativt utbytte (*+,87 g }.
V,87 g (10,6 mmol) 1,5 HBr-H-Arg(N02)-pNA opploses i 50 ml destillert DMF. Opplosningen avkjbles til -10°C og 1,6 g (15,9 mmol) Et^N tilsettes for å frigjbre H-Arg(N02)-pNA fra hydrobromidsaltet. Bland-, ingen får lov til å reagere 1 time under vannfrie betingelser. Dannet Et^N-HBr frafiltreres og filtratet avkjoles til -10°C. <i>+,9 g (12,7 mmol) Cbo-Leu-OpNP tilsettes og opplosningen får lov til langsomt å anta værelsetemperatur, hvorefter den efter ca. 3 timer avkjoles til -10°C og puffres med 0,55 g (5 mmol) Et^N. Puffringsprosessen gjentas ytterligere en gang efter ca. 2-3 timer. Efter ca. 2h timers reaksjonstid inndam.pT3S- opplosningen i vakuum ved kO°C til torrhet. Residuet digereres 3 ganger med 100 ml destillert vann og tbrres derefter i vakuum. Det torrede residuum opploses i methanol og renses på en kolonne med "Sephadex" LH-20 bragt i likevekt med methanol.
Man fikk 6,1 g (98%) amorf Ib, enhetlig ifolge TLC i P1 og [a]p<5>= -33,5° (c = 1,0 MeOH).
; Eksempel Ic: Cbo- Leu- Leu- Arg( N02)- pNA
Utgangsmateriale: 2,8 g (^,77 mmol) Ib og 2,22 g (5,72 mmol) Cbo-Leu-OpNP
Syntesmetoda Analogt med eksempel Ib
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol
Man fikk 2,5 g (80%) amorf Ic enhetlig ifolge TLC i P1 og [a]^ = -9,9° (c = 1,0 DMF).
I: H- Leu- Leu- Arg- pNA* 2 HC1
13^,2 mg (0,192 mmol) Ic anbringes i et ror i et Sakakibara-apparat. 5 ml tort hydrogenfluorid kondenseres i roret og får lov til å reagere 1 time ved 0°C under omrbring. Nitrogruppen som be-skytter guanidinofunksjonen i arginin samt Cbo-gruppen avspaltes derved. Hydrogenfluorid avdestilleres derefter under vakuum og det torre residuum opploses i DMF. For å overfore det erholdte hydro-fluoridderivat av peptidene til hydrokloridsaltet tilsettes 0,25 ml konsentrert HC1 til DMF-opplbsningen, hvorefter opplosningen inn-dampes til torrhet under vakuum. Overfbringsbehandlingen gjentas ytterligere en gang.
Rensning: Inndampningsresiduet opploses i 50%-ig eddiksyre og påfores på en kolonne med "Sephadex" G-25 bragt i likevekt med 50%-ig eddiksyre. Den fraksjon av eluatet som inneholder det rene tripeptid-dihydrokloridderivat frysetorres.
Man fikk 80,0 mg (71%) amorf I med Cl-innhold 11,8%, enhetlig ifolge TLC i A og [a]Jp = -29,9° (c = 0,59, 50% AcOH).
Aminosyreanalyse ga Leu: 2,0. Arg: 0,95.
Eksempel II: I^- Bz- Leu- Leu- Arg- pNA* HC1
Eksempel Ila: Na- Bz- Leu- Leu- Arg( N02)- pNA
Utgangsmateriale: 703 mg (1 mmol) Ic og 272 mg (1,2 mmol)
Bz20.
Syntesemetode: Decarbobenzoxylering av Ic utfores analogt med eksempel Ib. Det torre H-Leu-Leu-Arg(N02)-pNA'HBr opploses i 20 ml torr DMF og avkjoles til -10°C, hvorefter 0,21 ml (1,5 mmol) Et^N tilsettes og det dannede Et^N-HBr frafiltreres. Filtratet avkjoles til -10°C og 272 mg (1,2 mmol) Bz20 tilsettes. Efter ca. 3 timers reaksjonstid har opplosningen antatt værelsetemperatur hvorefter den påny avkjoles og puffres med 0,07 ml (0,5 mmol) Et^N. Puffringsprosessen gjentas ennu en gang efter ca. 3 timer. Opplosningen inn-dampes til torrhet i vakuum efter et dogns reaksjonstid. Residuet digereres og torres ifolge fremgangsmåten beskrevet under eksempel Ib.
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol.
■ Man fikk 550 mg (82%) amorf Ila, enhetlig ifolge TLC i Px og [a]p5 = -3,6° (c = 1,01, DMF9.
II: Na- Bz- Leu- Leu- Arg- pHA. HCl
Utgangsmateriale: 55<*>+,8 mg (0,828 mmol) Ila
Syntesemetode: Analogt med eksempel I.
Rensning: Gelf iltrering på "Sephadex" G-15. i 20%-ig ..eddiksyre og "Sephadex" LH-20 i methanol.
Man fikk V76 rag (87%) amorf, frysetorret II med Cl-innhold 5,30% enhetlig ifolge TLC i A og [a]^<3> = -73,0° (c = 0,66, 50% methanol).
Eksempel III: H- B- cyclohexyl- Ala- Val- Arg- pNA»2HC1
Eksempel Illa: Cbo- Val- Arg( N02)- pNA
Utgangsmateriale: 20,6 g C+3,5 mmol) Ia og 20,3 g ,3 mmol) Cbo-Val-OpNP.
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib.
Rensning: Omkrystallisasjon av råproduktet fra methanol. Mor-luten renses ved gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol.
Man fikk 23,2 g (93,3%) krystallinsk Illa med sm.p. 200-202°C, enhetlig ifolge TLC i PL og C og [a]j^ = +5",8° (c = 1,0, DMF).
Eksempel Illb: Cbo- B- cyclohexyl- Ala- Val- Arg( NOn)- pNA
Utgangsmateriale: 0,<!>+8 g (0,83 mmol) Illa og 0,53 g (1,2^
mmol) Cbo-B-cyclohexyl-Ala-OpNP med sm.p. 105-106°C og [a]^ = -28,8°
(c = 1,0, DMF).
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib.
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol.
Man fikk 531 mg (88%) amorf Illb, enhetlig ifolge.TLC i P1 og [<a>]p<3>= -7,3° (c = 2,0 DMF).
III: H- B- cyclohexyl- Ala- Val- Arg- pNA' 2HCl
Utgangsmateriale: 120, h mg (0,165 mmol) Illb
Syntesemetode: Analogt med eksempel Id.
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" G-15 i 20%-ig eddiksyre.
Man fikk 56,6 mg (55%) amorf, frysetorret III med Cl-innhold 11,32%, enhetli<g> ifol<g>e TLC i A og [a]jp = -36,8° (c = 0,62, 50%
AcOH).
Aminosyreanalyse ga "Val: 1,0, B-cyclohexyl-Ala:1,1, Arg:l,0
Eksempel IV: Na- Bz- B- cyclohexyl- Ala- Val- Arg- pNA' HCl
Eksempel IVa: Na- Bz- B- cyclohexyl- Ala- Val- Arg( NOp)- pNA
Utgangsmateriale: 2^3 mg (0,335 mmol) Illb og 93 mg (0,^1 mmol) Bz20.
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ila
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol
Man fikk 1^7 mg (63%) IVa med sm.p. l<1>+8-l52°C, enhetlig ifolge
TLC i Px og [a]p<3> = -6,33° (c = 0,8<*>+, DMF).
IV: Na- Bz- B- cyclohexyl- Ala- Val- Arg- pNA' HCl
Utgangsmateriale: 106,0 mg (0,152 mmol.) IVa. Syntesemetode: Analogt med eksempel Id.
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" G-15 i 20%-ig eddiksyre.
Man fikk 86,7 mg ( 8h%) amorf, frysetorret IV med Cl-innhold 5,10%, enhetlig ifolge TLC i A og [a]^<3> = -77,0° (c = 0,3, 50% methanol.
Aminosyreanalyse ga Val: 1,0, B-cyclohexyl-Ala: 1,2, Arg: 1,0
Eksempel V: N- Bz- N- cyclohexyl- B- Ala- Val- Arg- pNA' HCl
Eksempel Va: N- Cbo- N- cyclohexyl- B- Ala- Val- Arg ( NO Q- pNA
Utgangsmateriale: 2,86 mg (0,5 mmol) Illa og 300 mg (0,7 mmol) N-Cbo-N-cyclohexyl-B-Ala-QpNP.
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib.
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex"' LH-20 i methanol.
Man fikk 313 mg (86%) amorf Va, enhetlig ifolge TLC i P-L og [a]^= t 0 (c = 1,0, DMF).
Eksempel Vb: N- Bz- N- cyclohexyl- B- Ala- Val- Arg ( NOQ- pNA
Utgangsmateriale: 300 mg (0,^13 mmol) Va og 123 mg (0,5^ mmol) Bz20.
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ila.
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol Man fikk 2^9,5 mg (87%) amorf Vb,, enhetlig ifolge TLC i P1 og [a]g3 = -0,5° (c = 0,1*9, DMF).
V: N- Bz- N- cyclohexyl- B- Ala- Val- Arg- pNA- HCl
Utgangsmateriale: 170 mg (0,2^2 mmol) Vb.
Syntesemetode: Analogt med eksempel I. Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol.
126 mg (76%) amorf, frysetorret V med Cl-innhold, 11%, enhetlig ifolge TLC i A [a]|<3> = -38,5° (c = 0,69, 50% AcOH).
Aminosyreanalyse: Val: 1,0, N-cyclohexyl-B-Ala: 1,3, Arg: 0,9.
Eksempel VI: Na- Bz- Val- Val- Arg- pNA- HC1
Eksempel Via: Cbo- Val- Val^ Arg( N02)- pNA
Utgangsmateriale: 1,97 g (3,3^3 mmol) Illa og 1,6 g (>+,2 mmol)
Cbo-Val-OpNP
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib.
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol.
Man fikk 1,9 g (82,7%) amorf Via, enhetlig ifolge TLC i P1 og C1.
Eksempel Vlb: N^- Bz- Val- Val- Arg( NOp)- pNA"
Utgangsmateriale: 1,9 g (2,83 mmol) Via og 0,77 g (3A° mmol) Bz20.
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ila
Rensning: Gelf iltrering på "Sephadex." LH-20 i methanol
Man fikk 1,<1>+5 g (80%) amorf Vlb, enhetlig ifolge TLC i PL og [a]p3 = +5,6° (c = 1,01: DMF).
VI: Na- Bz- Val- Val- Arg- pNA* HC1
Utgangsmateriale: 362 mg (0,56<*>+ mmol) Vlb
Syntesemetode: Analogt med eksempel I
Rensnirxg.: Gelfiltrering på "Sephadex" G-15 1 33%-ig eddiksyre Man fikk 2^8 mg (69,7%) amorf, frysetorret VI med Cl-innhold 5,5^%, enhetlig ifolge TLC i A og [a]^= -57,0°' (c = 0,65, 50% AcOH).
Aminosyreanalyse ga Val: 2,0, Arg: 0,9.
Eksempel VII: Na- Bz- Leu- Val- Arg- pNA* HC1
Eksempel Vila: Cbo- Leu- Val- Arg( NO^- pNA
Utgangsmateriale: 1,97 g (3 ,^3 mmol) Illa og 1,7 g (^,2 mmol) Cbo-Leu-OpNP. Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol.
Man fikk 2,05 g (87%) amorf Vila, enhetlig ifolge TLC i P± og C.
Eksempel Vllb: Na- Bz- Leu- Val- Arg( N02)- pNA
Utgangsmateriale: 1,75 g (2,55 mmol) Vila og 695 mg (3,06.mmol) Bz20.
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ila
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol.
Man fikk 1,^9 g (91%) amorf Vllb, enhetlig ifolge TLC i P]_ og [a]p3 = +2,<l>f° (c = 1,01, DMF).
VII: Na- Bz- Leu- Val- Arg- pNA* HC1
Utgangsmateriale: 319 mg (0,^+86 mmol) Vllb
Syntesemetode: Analogt med eksempel I.
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" G-15 i 33%-ig eddiksyre.
Man fikk 276 mg (88%) amorf, frysetorret VII med Cl-innhold 5,^1%, enhetlig ifolge TLC i A og [a]^ = -52,0° (c = 0,65, 50% AcOH).
Aminosyreanalyse ga Val: 1,0, Leu: 1,1, Arg: 0,95»
Eksempel VIII: Na- Bz- Ile- Val- Arg- pNA- HCl
Eksempel Villa: Cbo- Ile- Val- Arg( NOQ- pNA-Utgangsmateriale: 1,97 g (3,^3: mmol) Illa og 1,7 g ( k,2 mmol) Cbo-Ile-OpNP
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib
Rensning: Gelfiltrering pa "Sephadex" LH-20 i methanol. Man fikk- 2,0 g (85%) amorf Villa, enhetlig ifolge TLC i Pr Eksempel VHIb: Na- Bz- Ile- Val- Arg ( N02)- pNA
Utgangsmateriale: 1,75 g (2,55 mmol) Villa og 695 mg (3,06 mmol) Bz^O.
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ila.
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol.
Man fikk l, k6 g (89%) amorf VHIb, enhetlig ifolge TLC i P1 og C1.
VIII: Na- Bz- Ile- Val- Arg- pNA' HCl
Utgangsmateriale: 319 mg (0,^86 mmol) VHIb Syntesemetode: Analogt med eksempel i»
Rensning: Gelf iltrering på "Sephadex" G-15 i 33%-ig eddiksyre-.
Man fikk 26<*>+ mg ( 8kf0) amorf, frysetorret VIII med Cl-innhold . 5,^3%, enhetlig ifolge TLC i A og [a]^= -57,3 (c = 0,6<>>+-, 50%-ig eddiksyre).
Aminosyreanalyse ga Val: 1,0, Ile: 0,9, Arg: 1,1
Eksempel IX: Na- Bz- Val- Ile- Arg- pNA«HC1
Eksempel IXa: Cbo- Ile- Arg ( N0,J- pNA
Utgangsmateriale: k, 9 g (10, h mmol) Ia og 6,2 g (16 mmol) <C>bo-Ile-OpNP
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol.
Man fikk ^,75 g (78,1%) delvis krystallinsk IXa, enhetlig ifolge TLC i P± og [a]^3 = +2,3° (c = 1,0, DMF).
Eksempel : IXb: Cbo- Val- Ile- Arg( N02)- pNA
Utgangsmateriale: 800 mg (1,37 mmol) IXa og 8l5 mg (1,65 mmol) Cbo-Val-OpNP
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol
Man fikk 833 mg (88,5%) amorf IXb, enhetlig ifolge. TLC i ^ og [a]^= -3,23° (c = 1,11, DMF)
Eksempel IXc: Na- Bz- Val- Ile- Arg ( NO^- pNA
Utgangsmateriale: 500 mg (0,73 mmol) IXb og 198 mg (0,876. mmol) Bz20.
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ila
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol
Man fikk 37^ mg (78%) amorf IXc, enhetlig ifolge TLC i P± og [cc]^<3> = 1,9° (c = 0,99, DMF).
IX: Na- Bz- Val- Ile- Arg- pNA- HCl
Utgangsmateriale: 200 mg (0,305 mmol) IXc
Syntesemetode: Analogt med eksempel I
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" G-15 i 33%-ig eddiksyre Man fikk 153 mg (77,5%) amorf, frysetorret IX med Cl-innhold 5,^0%, enhetlig ifolge TLC i A og [a]^<3> = -56,^° (c = 0,6<*>+, 50% AcOH).
Aminosyreanalyse ga Val: 1,0, Ile: 1,1, Arg: 1,1.
Eksempel X: Na- Bz- Val- Leu- Arg- pNA«HC1
Eksempel Xa: Cbo- Val- Leu- Arg( N02)- pNA
Utgangsmateriale: 880 mg (1,5 mmol) Ib og 670 mg (1,8 mmol) Cbo-Val-OpNP Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib
Rensning: Gelfiltrering. på "Sephadex" LH-20 i methanol
Man fikk 882 mg (86%) amorf Xa, enhetlig ifolge TLC i ?± og [a]^<3> = -6,6° (c = 1,01, DMF).
Eksempel Xb: ■ Na- Bz- Val- Leu- Arg( N02)- pNA
Utgangsmateriale: ^00 mg (0,583 mmol) Xa og. 160 mg (0,707 mmol) Bz-20.
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ila
Rensning: Gelf iltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol..
Man fikk 279 mg (73%) amorf Xb, enhetlig- ifolge TLC i Px og [a]<];>3 = -0,<*>f° (c = l., 0k, DMF).
X: Na- Bz- Val- Leu- Arg- pNA- HCl
Utgangsmateriale: 15Q_. mg (0,23 mmol) Xb
Syntesemetode: Analogt med eksempel I
Rensnings Gelfiltrering- på "Sephadex" G-15 i 33%-ig eddiksyre.
Man fikk 126 mg (84., 5%} amorf , frysetorret X med Cl-innhold: 5,*+5%, enhetlig ifolge TLC- i A og [a]|<3> = -5<1>+,0° (c = 0,6^, 50%-ig eddiksyre).
Aminosyreanalyse ga Val: 1,0, Leu: 1,1, Arg: 1,0
Eksempel XI: Na- Bz- Ile- Ile- Arg- pNA- HCl
Eksempel Xla: Cbo- Ile- Ile- Arg( N02)- pNA
Utgangsmateriale: 800 mg (1,37 mmol) IXa, og 6h0 mg (1,66 mmol): . Cbo-Ile-OpNP Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib
Rensning: Gelf iltrering på "Sephadex!' LH-20 i methanol
Man fikk 838 mg (87, 5%) delvis krystallinsk-Xla, enhetlig ifolge TLC i V± og [a]^<3> = -5,7° c.= 1,0^, DMF).
Eksempel Xlb: ^- Bz- Ile- Ile- Arg( N0> J- pNA
Utgangsmateriale: KkO. mg (0,63 mmol} Xla og 171 mg (0,76 mmol) Bz20.
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ila
Rensning: Gelf iltrering på "Sephadex"- LH-20 i methanol
Man fikk *+09 mg (97%) delvis krystallinsk Xlb, enhetlig ifolge TLC L 'Pr
XI: Na- Bz- IIe- Arg- pNA- HCI
Utgangsmateriale: 201 mg (0,3 mmol) Xlb
Syntesemetode: Analogt med eksempel I
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" G-15 i 33%-ig eddiksyre.
Man fikk 172 mg (87%) amorf, frysetorret XI med Cl-innhold 5,33%, enhetlig ifolge TLC i A og [a]^<3>= -57,0° (c = 0,67, 50%-ig eddiksyre)..
Aminosyreanalyse ga Ile: 2,0, Arg: 0,9
Eksempel XII: Na- Bz- Leu- Ile- Arg- pNA* HCl
Eksempel Xlia: Cbo- Leu- Ile- Arg ( NOQ- pNA
Utgangsmateriale: 800 mg (1,37 mmol) IXa og 6k0 mg (1,66 mmol) Cbo-Leu-OpNP
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib
Rensning: Gelf iltrering på "Sephadex"' LH-20- 1 methanol..
Man fikk. 772 mg (8l%) amorf Xlla, enhetlig ifolge TLC i P1 og [a]p3 = -7,3° (c = 1,02, DMF)..
Eksempel Xllb: Na- Bz- Leu- Ile- Arg( NO^)- pNA
Utgangsmateriale: 500 mg (0,72 mmol) Xlla og 205 mg (0,86 mmol) Bz20..
Syntesemetode: Analogt- med eksempel Ila Rensning:- Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol
Man fikk 482 mg (82%) amorf Xllb, enhetlig ifolge TLC. og.
[a}^<3>= +0,5° (c 1,03, DMF).
XII: Na- Bz- Leu- IIe- Arg- pNA- HCl
Utgangsmateriale: 193 mg (0,288 mmol) Xllb
Syntesemetode: Analogt med eksempel II
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" G-15 i 33%-ig eddiksyre.
Man fikk 166 mg (86%) amorf, frysetørret XII med Cl-innhold 5,34%, enhetlig ifolge TLC i A og [a]J3 = -51,4° (c = 0,67, 50%-ig eddiksyre).
Aminosyreanalyse ga Leu: 1,0 Ile: 1,2, Arg: 0,9
Eksempel XIII: Cbo- Ile- Leu- Arg( N02)- pNA
Utgangsmateriale: 880 mg (1,5 mmol)Ib og 696 mg (1,8 mmol) Cbo-Ile-OpNP
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib
Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol
Man fikk 750 mg (71%) amorf XHIa, enhetlig ifolge TLC i P-, og [<a>]D = -9,85° (° = DMF).
Eksempel Xlllb: Na- Bz- Ile- Leu- Arg ( N02)- pNA
Utgangsmateriale: 498 mg (0,71 mmol) XHIa og 193 mg (0,85 mmol) Bz20.
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ila
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol
Man fikk 345 mg (73%) delvis krystallinsk Xlllb, enhetlig ifol<g>e TLC i Px og [a]jp <=> -5,7° (c = 1,04, DMF).
XIII: Na- Bz- Ile- Leu- Arg- pNA«HCl
Utgangsmateriale: 170 mg (0,254 mmol) Xlllb
Syntesemetode: Analogt med eksempel I
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" G-15 i 33%-ig eddiksyre Man fikk 129 mg (77%) amorf, frysetorret XI.II med Cl-innhold 5,31%, enhetlig ifolge TLC i A og [a]^<3> = -49,9° (c = 0,68, 50%-ig eddiksyre).
Aminosyreanalyse ga Leu: 1,0, Ile: 1,1, Arg: 1,05
Eksempel XIV: Na- Bz- Leu- Leu- Arg- 2- NA* HC1
Eksempel XlVa: Cbo- Arg( N0^)- 2- NA
3,6 g (10 mmol) Cbo-Arg(N02)-0H (torret) ble opplost i 200 ml tetrahydrofuran. 1,01 g (10 mmol) triethylamin ble tilsatt hvorefter opplosningen ble nedkjolt til -10°C under vannfrie betingelser. Til den nedkjolte blanding ble i lopet av 10 minutter tildryppet 1,37 g (10 mmol) klormaursyre-isobutylester opplost i 10 ml tetrahydrofuran, og efter ytterligere 10 minutter ble der tilsatt 1,72 g (10 mmol) 2-nafthylamin. Reaksjonsopplosningen fikk lov til å anta værelsetemperatur og hensto ved denne temperatur i et dogn. Reaksjonsopp-■ losningen ble derefter inndampet til torrhet i vakuum, digerert 3-5 ganger hhv. med destillert vann, 5%-ig natriumbicarbonatopplosning og destillert.vann, hvorefter residuet ble torret i vakuum..
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol. Man fikk 4,05 g (84%) delvis krystallinsk XlVa, enhetlig ifolge TLC i P1 og C og [a]p<3> = +7,35° (c =1,0, DMF).
Eksempel XlVb: Cbo- Leu- Arg( N02)- 2- NA
Utgangsmateriale: 1,5 g (3,1 mmol) XlVa og 1,43 g (3,7 mmol) Cbo-Leu-OpNP
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol
Man fikk 1,6 g ( 86%) amorf XlVb, enhetlig ifolge TLC i P1 og [a]<22> = -9,1° (c = 1,0, DMF).
Eksempel XIVc: Cbo- Leu- Leu- Arg( N02)- 2- NA
Utgangsmateriale: 1,35 g (2,26 mmol) XlVb og 1,05 g (2,71 mmol) Cbo-Leu-OpNP
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol
Man fikk l,00g (62,4%) delvis krystallinsk XIVv, enhetlig
ifolge TLC i ?± og jjo]^ = -20,6° (c = r,0, DMF).
Eksempel XlVd: Na- Bz- Leu- Leu- Arg( N02)- 2- NA
Utgangsmateriale: 990 mg (1,4 mmol) XIVc og 407 mg (1,8 mmol) Bz20.
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ila
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol.
Man fikk 800 mg (84%) amorf XlVd, enhetlig ifolge TLC i P± og [a]<20> = -13,4° (c = 1,0, DMF).
XIV: Na- Bz- Leu- Leu- Arg- 2- NA- HCl
Utgangsmateriale: 350 mg (0,52 mmol) XlVd
Syntesemetode: Analogt med eksempel I
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" G-l5 i 35%-ig eddiksyre.
Man fikk 260 mg (75%) amorf, frysetorret XIV med Cl-innhold 5,30%, enhetlig ifolge TLC i A og [a]<20> = -51,8° (c = 0,57, 50%-ig AcOH).
Aminosyreanalyse ga Leu: 2,0, Arg: 0,95.
Eksempel XV Na- Bz- Leu- Leu- Arg- l- nitro- 2- NA- HC1
Eksempel XVa: Cbo- Arg( N02)- l- nitro- 2- NA
Utgangsmateriale: 3,6 g (10 mmol) Cbo-Arg(N02)-0H og 2,26 g
(12 mmol) l-nitro-2-nafthylamin.
Syntesemetode: Analogt med eksempel XlVa
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol
Man fikk 3,1 g (58,7%) amorf XVa, enhetlig ifolge TLC i P± og
C og [a]J<9> = -11,8° (c = 1,0, DMF).
Eksempel XVb: Cbo- Leu- Arg( NO Q- L- nitro- 2- NA
Utgangsmateriale: 950 mg (1,8 mmol) XVa og 850 mg (2,2 mmol) Cbo-Leu-OpNP
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol Man fikk 78%) amorf XVb, enhetlig ifolge TLC i P-[ og [a]<21 >= -10,2° (c = 1,02, DMF).
Eksempel XVc: Cbo- Leu- Arg( N02)- l- nitro- 2- NA
Utgangsmateriale: 900 mg (1,4 mmol) XVb og 650 mg (1,7 mmol) Cbo-Leu-OpNP
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol Man fikk 810 mg ( 77%) amorf XVc, enhetlig ifolge TLC i P-[ og [a]<2>^ = -18,2° (c = 1,01,.. DMF).
Eksempel XVd: I^- BZ- Leu- Leu- Arg ( NOO- l- nitro- 2- NA
Utgangsmateriale: 680 mg (0,88 mmol) XVc og 260 mg (1,15 mmol)
Bz20.
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ila
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol Man fikk 480 mg (73%) amorf XVd, enhetlig ifolge TLC i ?1 og [a]2lf = -31,4° (c = 0,9, DMF).
XV: Nq- Bz- Leu- Leu- Arg- l- nitro- 2- NAiHCl
Utgangsmateriale: 74 mg (0,1 mmol) XVd
Syntesemetode: Analogt med eksempel I
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" G-15 i 33%-ig eddiksyre Man fikk 47 mg (66%) amorf, frysetorret XV med Cl-innhold 4,94%, enhetlig ifolge TLC i A og med [a]<22> = -33,6° (c = 0,72, 50% AcOH).. Aminosyreanalyse ga Leu: 2,0, Arg: 0,9.
Eksempel XVI: Na- Bz- Leu- Leu- Arg- 4- nitro- l- NA' HCl
Eksempel XVIa: Cbo- Arg( N02)- 4- nitro- l- NA
Utgangsmateriale: 3,6 g (10 mmol) Cbo-Arg(N02)-0H og 2,26 g
(12 mmol) 4-nitro-l-nafthylamin..
Syntesemetode: Analogt med eksempel XlVa
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol
Man fikk 2,9 g ( 55%) amorf XVIa, enhetlig ifolge TLC i P1 og
C og [a]<22> = -11,4° (c = 1,01, DMF).
Eksempel XVIb: Cbo- Leu- Arg( NOQ- 4- nitro- lNA
Utgangsmateriale: 650 mg (1,23 mmol) XVIa og 560 mg (1,45 mmol) Cbo-Leu-OpNP
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol
Man fikk 520 mg (66%) amorf XVIb, enhetlig ifolge TLC i P1 og . [a]22 = -11,8° (c = 0,2, DMF).
Eksempel XVIc: Cbo- Leu- Leu- Arg( NOQ- 4- nitro- l- NA
Utgangsmateriale: 520 mg (0,81 mmol) XVIb og 375 mg (0,97 mmol)
Cbo-Leu-OpNP
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ib
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol
Man fikk 378 mg (62%) delvis krystallinsk XVIc, enhetlig ifolge TLC i-p og [a]<23> = -18,0° (c = 1,0, DMF).
Eksempel XVId: Na- Bz- Leu- Leu- Arg( N02)- 4- nitro- l- NA
Utgangsmateriale: 150 mg (0,2 mmol) XVIc og 57 mg (0,25 mmol)
Bz20..
Syntesemetode: Analogt med eksempel Ila
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i 33%-ig eddiksyre Man fikk 120 mg (83%) amorf XVId, enhetlig ifolge TLC i P-L og [a]<23> = -30,9° (c = 0,95, DMF).
XVI: Na- Bz- Leu- Leu- Arg- 4- nitro- I- NA- HCl
Utgangsmateriale: 120 mg (0,165 mmol) XVId,
Syntesemetode: Analogt med eksempel 1.
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" G-15 i 33%-ig eddiksyre Man fikk 48 mg (42%) amorf, frysetorret XVI med Cl-innhold 4,95%,
enhetlig ifolge TLC i A og [a]<22> = -36,0°' (c = 0,71, 50%-ig AcOH).
Aminosyreanalyse ga Leu: 2,0, Arg: 0,9
Eksempel XVII: Na- Bz- Leu- Leu- Lys- pNA- HCl
Eksempel XVIIa: Na- Boc- Lys-( €■ - Cbo)- pNA
6,3 g (11,2 mmol) l^-BOC-Lys(6-Cbo)-0H.DCHA ble opplost i 4o ml tort nydestillert HMPTA ved værelsetemperatur, hvorefter
5 g (30,5 mmol) p-nitro-fenylisocyanat ble tilsatt porsjonsvis under
omroring og vannfrie betingelser. Efter et dogn ved værelsetemperatur ble reaksjonsblandingen opparbeidet som beskrevet i eksempel Ia. Biprodukter ved reaksjonen utgjordes av N,N'-dicyclohexylcarbamid som var tungtopploselig i methanol. Den del av reaksjonsproduktet som var opploselig i methanol, ble renset ved gelfiltrering- på en kolonne med "Sephadex" LH-20 bragt i likevekt med methanol.
Man fikk 4,17 g (74,5%) delvis krystallinsk XVIIa, enhetlig ifolge TLC i P1 og [a]<21> = +1,7° (c = 1,0 DMF).
Eksempel XVIIb; Na- B0C- Leu- Lys( £- Cbo)- pNA
Til 2,20 g (4,4 mmol) XVIIa ble tilsatt"'10- ml nydestillert tri-fluoreddiksyre under vannfrie betingelser. Efter omroring i 60 minutter ved værelsetemperatur ble reaksjonsblandingen helt i 150 ml torr ether under kraftig omroring hvorved CF-^COOH-H-Lys ( £-Cbo) -pNA falt ut som en olje som storknet ved avkjoling. Etherfasen ble av-dekantert og felningen behandlet ytterligere tre ganger med 75 nil torr ether. Efter torring i vakuum over natriumhydroxydtabletter og fosforpentoxyd fikk man lysinderivatet trifluoracetatsalt i kvantitativt utbytte (2,2? g),
2,25 g (4,4 mmol) CF^COOH^H-Lys(g. -Cbo)-pNA ble opplost i 10 ml DMF og avkjolt til -10°C. 0,78 ml (5,5 mmol) Et^N ble tilsatt for å" fr-igjore aminosyrederivatet fra trifluoracetatsaltet, og derefter 2,4 g (6,5 mmol) B0C-Leu-0pWP. Da reaksjonsopplosningen hadde antatt værelsetemperatur efter noen timer., ble opplosningen avkjolt igjen og puffret med 0,31 ml (2,2 mmol) Et^N. Puffringen ble gjentatt nok en gang efter ca. 2 timer. Efter et dogns reaksjonstid ble opplosningen inndampet i vakuum ved ca. 40°C til torrhet. Inndampningsresten ble digerert tre ganger med 20 ml destillert vann og torret i vakuum.
Råproduktet ble opplost i methanol og renset ved gelfiltrering
, på enVkolonne med "Sephadex" LH-20 bragt i likevekt med methanol. Fra elutatet fikk man en fraksjon som ga 1,70 g (70%) XVIIb som var enhetlig ifolge TLC i P1 og C og med [a]<22> = -4,9° (c = 1,01* DMF).
Eksempel XVIIc: Na- B0C- Leu- Leu- Lys( £- Cbo)- pNA
Utgangsmateriale: 950 mg (1,55 mmol) XVIIb og 1,16 g (3,1 mmol)
B0C-Leu-0pNP..
Syntesemetode: Analogt med eksempel XVIIb.
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 i methanol.
Man fikk 985 mg (88%) amorf XVIIc, enhetlig ifolge TLC i P1
og [a]<20> - -22,0° (c = 1,0* DMF).
Eksemne! XVIId: Na- Bz- Leu- Leu- Lvs( £ - Cbo)- pNA
Utgangsmateriale: 1,25 g (1,4 mmol) XVIIc og 384 mg (1,7 mmol) Bz20.
Syntesemetode: Decarbobutyloxylering av XVIIc ble utfort analogt med fremgangsmåten i eksempel XVIIb.
Det torre CF^COOH.H-Leu-Leu-Lys(£-Cbo)-pNA ble opplost i 20 ml DMF og avkjolt til -10°C, hvorefter 200 ml (1,45 mmol) Et^N ble tilsatt for' å frigjore peptidamin fra saltet. 384 mg (1,7 mmol) Bz20 ble tilsatt til opplosningen ved -10°C hvorefter puffringen og opparbeid-ningen ble utfort analogt med eksempel XVIIb. Gelfiltrering av råproduktet på en kolonne med "Saphadex" LH-20 i methanol ga 920 mg <*>'.
(90%) delvis krystallinsk XVIId som var enhetlig ifolge TLC i P-^ og.
C, og med [a]20 = -5,95° (c = 1,02, DMF).
XVII: 1^- Bz- Leu- Leu- Lys- pNA' HCl
Utgangsmateriale: 300 mg (0,4l mmol) XVIId. Syntesemetode: Analogt med eksempel I.
Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex" G-15 i 33%-ig eddiksyre.
Man fikk 170 mg (66%) amorf, frysetorret XVII med Cl-innhold 5,51%, enhetlig ifolge TLC i A og [a]<22> -50,5° (c = 0,62, 50% AcOH).
Aminosyreanalyse ga Leu: 2,0; Lys: 0,95.
De ifolge eksemplene fremstilte substrater ble anvendt for å bestemme forskjellige enzymer som folger: ..
Prinsippet for bestemmelsen er basert på at det ved enzymatisk hydrolyse dannede spaltningsprodukt oppviser et UV-spektrum som er helt forskjellig fra substratets. Således har substratet ifolge eksempel Ilb, Na<->Bz-Leu-Leu-Arg-pNA-HCl, et absorbsjonsmaksimum ved 302
nm med den molare ekstinksjonskoeffisient 12920. Ved 405 nm er substratets absorbsjon nesten helt opphort. p-nitroahilin som dannes av substratet under den enzymatiske hydrolyse,har et absorbsjonsmaksimum ved 380 nm med en molar ekstinksjonskoeffisient 13200, som ved 405 nm bare har avtatt til 9620.
Ved spektrofotometrisk å måle ved 40 5 nm kan man derfor lett folge graden av den enzymatiske hydrolyse, som er proporsjonal med mengden av dannet p-nitroanilin. Det nærværende substratoverskudd forstyrrer ikke målingen ved denne bolgelengde. For de ovrige substrater ifolge oppfinnelsen hersker nærmest identiske frorhold, hvor-for de spektrofotometriske målinger gjennomgående er gjort ved '+05 nm.
Den enzymatiske reaksjon kan skjematisk skrives:
E = enzym
S = substrat
ES = enzym-substratkompleks
Pl og P2 = Produk"ter
k-|_, <k>2, k^ og k^ = hastighetskonstanter.
k
Dissosiasjonskonst. for ES = _ = K (Michaelis konst.)
kx m
Når (S)» (E) og k^<<k3 gjelder:
Hastigheten med hvilken kromofor P-^ dannes: v = k, (ES)
Lineweaver - Burk ligning:
Som det fremgår av ligning (2) bestemmer konstantene Kffl og k^ effektiviteten av enzymsubstratet overfor et gitt enzym. For bestemmelse av disse konstanter går man i prinsippet frem på folgende måte. Enzym og substrat blandes i en puffer, og reaksjonen folges spektrofotometrisk i 5 minutter. Konsentrasjonen av substratet (S) varieres, mens enzymkonsentrasjonen (E) for hvert substrat holdes konstant. Ekstinksjonen (OD) avsettes mot tiden og av den således erholdte kurves tangent (= forskjell i ekstinksjon pr. min, A OD/min, hvorav antallet jumol dannet p-NA/min (v) kan beregnes) fåes initial-hastigheten v. i avsettes mot^ og fra diagrammet fåes Kffi og vmaks (jfr. ligning ( k)). Km og k3 Z^£ } for trypsin og forskjellige enzymsubstrater er angitt i tabell 1 og for trombin i tabell 2. Hvor opplysninger om Km og k^ mangler, er disse verdier ikke bestemt eller har ikke kunnet beregnes på grunn av at man ikke har fått rettlinjet sammenheng mellom 1 og 1
v (S)
En grov anslåelse av enzym-substratrelasjonen for forskjellige substrater kan fåes ved å sammenligne mengden av dannet p-nitroanilin pr. tidsenhet og enzymenhet, ved samme molare substratmengde. I tabell 3 er dette samlet for trypsin, og i tabell h for trombin og i tabell 5 for plasmin.
Den i tabellene anvendte betegnelse NIH betyr enheter ifolge National Institute of Health.
En trypsinenhet er den mengde enzym som hydrolyserer 1 jumol TAME pr. minutt ved 25° C og pH 8,1 i nærvær av 0,001 M Ca<++->ioner.. Trypsinet var fra Worthington Biochemical Corporation, Freehold, N.J.. USA. Plasminet var fra AB Kabi, Stockholm, Sverige, og inneholdt 3 caseinenheter pr. mg.
Av tabellene 1-5 fremgår tydelig fordelene med enzymsubstrat-ene ifolge oppfinnelsen sammenlignet med det tidligere anvendte amid-substrat for trypsin (BAPNA). De nye substrater gir ved sin storre folsomhet mulighet for å bestemme små mengder enzym uten at man gir avkall på nøyaktigheten ved bestemmelsen. Klinisk har dette stor betydning da det innebærer at provetagningen kan forenkles.

Claims (1)

  1. Peptider for anvendelse som diagnostiske substrater med hoy spesifisitet for trypsin og andre enzymer av typen peptidyl-peptidhydrolaser,
    karakterisert ved at de har den generelle formel:
    eller salter derav, hvor R-^ er hydrogen eller benzoyl,
    R2 er hydrogen eller cyclohexyl,
    X er methylen eller en enkelbinding, R^ er rettkjedet, forgrenet eller cyclisk alkyl med 3-8 car-bonatomer, R^ er forgrenet alkyl med 3 eller h carbon-atomer,
    ner 3 eller 4, R^ er hydrogen eller guanyl, og R^ er nitrofenyl, nafthyl eller.nitronafthyl.
NO1791/73A 1972-05-02 1973-04-30 NO135362C (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE7205758A SE380258B (sv) 1972-05-02 1972-05-02 Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trypsin och andra enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO135362B true NO135362B (no) 1976-12-20
NO135362C NO135362C (no) 1977-03-30

Family

ID=20267173

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO1791/73A NO135362C (no) 1972-05-02 1973-04-30

Country Status (20)

Country Link
US (1) US3886136A (no)
AT (1) AT324558B (no)
AU (1) AU474908B2 (no)
BE (1) BE798917A (no)
CA (1) CA1019724A (no)
CH (1) CH590475A5 (no)
CS (1) CS172974B2 (no)
DD (1) DD108282A5 (no)
DE (1) DE2322115B2 (no)
ES (1) ES414251A1 (no)
FI (1) FI56829C (no)
FR (1) FR2183170B1 (no)
GB (1) GB1426385A (no)
IL (2) IL42124A (no)
IT (1) IT1051562B (no)
NL (1) NL7306088A (no)
NO (1) NO135362C (no)
PL (1) PL89227B1 (no)
SE (1) SE380258B (no)
ZA (1) ZA732975B (no)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2527932C2 (de) * 1974-07-02 1983-04-21 Pentapharm AG, 4052 Basel Säureadditionssalze von Tripeptidderivaten und deren Verwendung als Substrate zur Bestimmung von Plasmakallikrein
US4016259A (en) * 1974-07-26 1977-04-05 Research Corporation Contraceptive polypeptides
US4162941A (en) * 1974-12-05 1979-07-31 Ab Kabi Method for determining a proteolytic enzyme
CH622286A5 (no) * 1975-06-23 1981-03-31 Pentapharm Ag
SE407571B (sv) * 1975-07-11 1979-04-02 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
SE407405B (sv) * 1975-07-11 1979-03-26 Kabi Ab Nya kromogena trombinsubstrat
US4061625A (en) * 1975-07-11 1977-12-06 Ab Kabi Novel chromogenic thrombin substrates
US4169015A (en) * 1975-07-11 1979-09-25 Ab Kabi Novel chromogenic thrombin substrates
CH634662A5 (de) * 1976-05-28 1983-02-15 Pentapharm Ag Verwendung von tripeptidderivaten zur quantitativen bestimmung von plasminogen-aktivatoren.
US4147692A (en) * 1977-02-26 1979-04-03 Ajinomoto Co., Inc. Novel dipeptide derivatives, and method of measuring enzymatic activity
SE7801373L (sv) * 1978-02-07 1979-08-08 Kabi Ab Lett spjelkbara substrat for kvantifiering av proteaser
IL60888A (en) * 1978-06-16 1984-07-31 Yeda Res & Dev Substrates and process for the quantitative assay of enzymes
US4275153A (en) * 1978-08-03 1981-06-23 American Hospital Supply Corporation Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
US4336186A (en) * 1978-08-03 1982-06-22 Gargiulo Robert J Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
US4161488A (en) * 1978-08-17 1979-07-17 Abbott Laboratories Enzymatic substrates
US4166825A (en) * 1978-08-17 1979-09-04 Abbott Laboratories Chromogenic substrates
JPS5559150A (en) * 1978-10-30 1980-05-02 Torii Yakuhin Kk Aminoacid derivative
US4289498A (en) * 1979-01-08 1981-09-15 Ortho Diagnostics, Inc. One-stage prothrombin assay and compositions useful therein
US4219497A (en) 1979-04-06 1980-08-26 Abbott Laboratories Chromogenic substrates
US4409140A (en) * 1979-04-23 1983-10-11 Smith Robert E Substrates and method for determining enzymes
EP0018002B1 (de) * 1979-04-24 1983-02-09 Marcel Jozefonvicz Neues Bestimmungsverfahren für Proteasen und Antiproteasen
DE2936543A1 (de) * 1979-09-10 1981-04-09 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen
US4308202A (en) * 1979-10-25 1981-12-29 Torii & Co., Ltd. Prolylphenylalanylarginine derivatives, process for producing same and method for measuring activity of enzymes using same
CA1161432A (en) * 1980-02-12 1984-01-31 Lars G. Svendsen Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes
DE3164437D1 (en) * 1980-08-25 1984-08-02 Kabivitrum Ab Peptide substrates for determination of protease activity
JPS5753445A (en) * 1980-09-16 1982-03-30 Torii Yakuhin Kk Peptide compound
US4849353A (en) * 1980-09-30 1989-07-18 Cornell Research Foundation, Inc. Immunocapture of enzyme inhibitor, enzyme complexes and uses thereof
US4568636A (en) * 1981-03-25 1986-02-04 Pentapharm Ag Tripeptide derivatives
US4428874A (en) 1981-03-25 1984-01-31 Pentapharm A.G. Tripeptide derivatives
US4388233A (en) * 1981-05-15 1983-06-14 The Regents Of The University Of California Synthetic substrates for enzyme analysis
JPS5856695A (ja) * 1981-09-28 1983-04-04 Nitto Boseki Co Ltd 新規なトロンビン測定用基質
DE3139719A1 (de) * 1981-10-06 1983-04-21 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur bestimmung der aktivitaet von chymotrypsin oder trypsin im stuhl
JPS5863399A (ja) * 1981-10-14 1983-04-15 Nitto Boseki Co Ltd 新規なプラスミン測定用基質
US4448715A (en) * 1981-11-02 1984-05-15 University Of Miami Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein
ATE17262T1 (de) * 1981-11-02 1986-01-15 Pentapharm Ag Verfahren zur quantitativen bestimmung von blutgerinnungsfaktor xii in humanplasma.
DE3244030A1 (de) * 1982-11-27 1984-05-30 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
FR2546164B1 (fr) * 1983-05-16 1987-07-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives de peptides, leur preparation et leur application comme inhibiteurs de l'elastase
JPS6117956A (ja) * 1984-07-04 1986-01-25 Nitto Boseki Co Ltd 新規な尿中カリクレイン測定用基質
US4897444A (en) * 1985-05-31 1990-01-30 The Research Foundation Of The State University Of New York Immobilized fluorogenic substrates for enzymes; and processes for their preparation
JPS62126196A (ja) * 1985-11-26 1987-06-08 Nitto Boseki Co Ltd 新規なα１−アンチトリプシン測定用化合物
US5399487A (en) * 1993-03-04 1995-03-21 Haematologic Technologies, Inc. 6-peptidylamino-1-naphthalenesulfonamides useful as fluorogenic proteolytic enzyme substrates
US6297024B1 (en) 1998-10-15 2001-10-02 Cell Activation, Inc. Methods for assessing complement activation
US6235494B1 (en) 1999-02-08 2001-05-22 The Scripps Research Institute Substrates for assessing mannan-binding protein-associated serine protease activity and methods using the substrates
US6455734B1 (en) * 2000-08-09 2002-09-24 Magnesium Diagnostics, Inc. Antagonists of the magnesium binding defect as therapeutic agents and methods for treatment of abnormal physiological states

Also Published As

Publication number Publication date
PL89227B1 (no) 1976-11-30
BE798917A (fr) 1973-08-16
NL7306088A (no) 1973-11-06
DD108282A5 (no) 1974-09-12
FI56829C (fi) 1980-04-10
DE2322115B2 (de) 1980-01-10
IT1051562B (it) 1981-05-20
GB1426385A (en) 1976-02-25
NO135362C (no) 1977-03-30
IL42124A (en) 1977-02-28
SE380258B (sv) 1975-11-03
DE2322115A1 (de) 1973-11-22
AU474908B2 (en) 1976-08-05
US3886136A (en) 1975-05-27
ZA732975B (en) 1974-04-24
ES414251A1 (es) 1976-06-16
CA1019724A (en) 1977-10-25
AT324558B (de) 1975-09-10
FI56829B (fi) 1979-12-31
AU5503973A (en) 1974-11-07
FR2183170B1 (no) 1977-02-11
IL42124A0 (en) 1973-06-29
CS172974B2 (no) 1977-01-28
FR2183170A1 (no) 1973-12-14
CH590475A5 (no) 1977-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO135362B (no)
NO135245B (no)
EP0046742B1 (en) Peptide substrates for determination of protease activity
US4016042A (en) Substrate for the quantitative determination of enzymes
US4480030A (en) Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes
US4070245A (en) Substrate for the quantitative determination of proteolytic enzymes
SU1277904A3 (ru) Способ получени трипептидов
CA1152494A (en) Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
US4314936A (en) Substrates for the quantitative assay of enzymes and such assay
US4457866A (en) Chromogenic compounds and their use as enzyme substrates
US5035999A (en) Aminoluciferin derivatives, processes for the production thereof and their application in the determination of enzyme activities
US4190574A (en) Substrate for the quantitative determination of plasminogen activators
US4520100A (en) Method for measuring thrombin
US4563305A (en) Radiolabelled substrates for assaying mammalian enzymes
US4221706A (en) Chromogenic substrates
US4428874A (en) Tripeptide derivatives
HU176983B (hu) Sposob poluchenija specificheskikh khromogennykh novykh proizvodnykh tetrapeptida kak ehnzimnykh substratov
US4216142A (en) Chromogenic substrates for the proteolytic enzymes
US4568636A (en) Tripeptide derivatives
US4217269A (en) Dipeptide chromogenic substrates
Morgan et al. Kinetics of the action of thermolysin on peptide substrates
CS196314B2 (en) Process for preparing new chromogenous substrates specific especially for thrombine
US4169015A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
EP0224254B1 (en) a novel substrate for plasma kallikrein and a method for measuring biological components using the same
US4629695A (en) Peptide derivatives and use thereof as substrates for quantitatively assaying enzymes