NO115583B

NO115583B -

Info

Publication number: NO115583B
Application number: NO15605464A
Authority: NO
Inventors: E Jucker; A Ebnoether; J Bastian; E Rissi; A Stoll
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1963-07-29
Filing date: 1964-12-18
Publication date: 1968-10-28
Also published as: NL6408529A; IL22639A; BR6461194D0; FI42575B; DE1225660B; FR4224M; GB1074745A; BE657365A; GB1084447A; NL126889C; FR3778M; DE1249879B; NL6414606A; BE651101A; GB1074744A; IL28825A; SE313819B

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av tetracyclin.

Nærværende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av tetracyclin ved dyrkning av en klortetracyclin-produserende stamme av Streptomyces under submerse aeorobe betingelser i en vandig kvelstoff- og kullhydratholdig næ-ringsoppløsning med minst 50 deler pr. million kloridion.

I de senere år er et antall produkter

som stammer fra bakteriers og mugg-soppers metabolisme blitt isolert og vist seg å være i besiddelse av verdifulle tera-peutiske egenskaper. Klortetracyclin, oxy-tetracyclin og tetracyclin har spesielt vist seg å være nyttige på grunn av deres bre-

de aktivitetsspektrum. Av disse tre er tetracyclin særlig anvendelig på grunn av at det gir høyere konsentrasjoner i blodet og færre sidereaksjoner, og fordi det er mere stabilt ved alkalisk reaksjon.

Den foretrukne fremgangsmåte ved fremstillingen av tetracyclin er aeorob, submers gjæring, men isoleringen og rens-ningen av produktet vanskeliggjøres og blir dyrere ved denne fremgangsmåte på grunn av at organismene samtidig danner klortetracyclin og tetracyclin. Ofte vil dannelsen av klortetracyclin være overveiende.

Således beskriver f. eks. norsk patent

nr. 90 077 en fremgangsmåte for fremstil-

ling av tetracyclin hvor den submerse, aeorobe dyrkning av mikroorganismer, fortrinnsvis streptomyces, utføres på slik måte at kloridioninnholdet i nærings-mediet elimineres eller undertrykkes slik at dannelsen av klortetracyclin elimineres

eller begrenses slik at det i stedet dannes tetracyclin som det fremherskende anti-bioticum. Videre beskrives i norsk patent nr. 94 569 fremstillingen av bromtetracyc-

lin under anvendelse av et næringsmedium hvis klorioninnhold er mindre enn 50 deler pr. million og fortrinnsvis mindre enn 10 deler pr. million, og samtidig bromion-innholdet er minst 50 deler pr. million og i det høyeste 1500 deler pr. million.

Formålet ved nærværende oppfinnel-

se er å fremskaffe en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av tetracyclin ved gjæring hvor utbyttet av tetracyclin forøkes på bekostning av klortetracyclin,

og det karakteristiske ved oppfinnelsen er at det som kloreringsinhibitor tilsettes bromidioner. Ifølge en foretrukken form for oppfinnelsen anvendes det som kloreringsinhibitor fra 0,01 til 5 vektsprosent av mediet av et alkalimetalibromid eller jordalkalimetallbromid, og etter en ytterligere foretrukken utførelsesform er klo-reringsinhibitoren kaliumbromid, natriumbromid, hydrogenbromid, calciumbromid eller ammoniumbromid som tilsettes i en mengde på 0,1 til 5 vektsprosent av me-

diet.

Det skal bemerkes at de forskjellige foretrukne fermenteringsmedier som anvendes ifølge oppfinnelsen normalt inneholder mere enn 50 deler pr. million kloridion. Denne kloridionmengde innføres f.

eks. ved anvendelse av sådanne bestanddeler som maisstøpevann som har en nor-

mal kloridionkonsentrasjon på mellom

3 000 og 4 000 deler pr. million, ytterligere mengder skyldes kjemisk behandlet, f. eks. klorbehandlet vann og forskjellige andre tilsetninger. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen muliggjør gjennom anvendelse av en kloreringsinhibitor anvendelse av sådanne fermenteringsmedier til fremstilling av tetracyclin uten forutgående fjerning av kloridioner.

Tetracyklin dannes ved dyrkning under særlige kontrollerte betingelser av mange arter av Streptomyces, bl. a. aureofaciens (NRRL 2209) og en hittil ukjent art mi-kroorganisme som det foreslås å kalle Streptomyces BL 567201, som er blitt isolert fra en jordprøve. Organismen beskrives i det følgende.

Organismen BL 567201 sp. nov., som frembringer tetracyklin, tilhører den slekt som alminnelig betegnes som Streptomyces. Organismens vekst er god på glycerin-asparagin-kjøttekstrakt-agar ved 30° C. Pådette medium dannes musegrå lufthy-fer, og der utskilles et gulgrønt farvestoff i agar-substratet. Myceliet er sammensatt av grenede hyfer, hvis yngre deler er gram-positive. Der dannes konidier på lufthyfene.

Andre klortetracyklin- og tetracyklindan-nende organismer som kan anvendes ifølge oppfinnelsen, er Streptomyces BL 456782, 567197, 567203, 567270, 567714, 567762, 678033, 678035, 678036, 678040, 678046, 678079, 678110, 678379, 678414 og 678650.

Det vil forstås at fremgangsmåten til fremstilling av tetracyklin ikke nødven-digvis er begrenset til anvendelsen av nett-opp disse organismer eller til organismer som fullstendig svarer til den ovenfor angitte beskrivelse, som bare må tas som et eksempel. Oppfinnelsen må særlig reg-nes å omfatte anvendelsen av organismer som er mutanter fremstillet av den beskrevne organisme ved mutasjonsfrem-bringende midler som f. eks. røntgenstrå-ling, ultrafiolett stråling, sennepsoljer osv.

I det følgende vil diffusjonsplateme-toden til bestemmelse av aktiviteten av tetracyklinet bli beskrevet.

Dyrkning smedium:

Streptomyces «Assay agar» (inneholdende gjærekstrakt) fra Baltimore Biolo-gical Laboratories, Baltimore, Maryland anvendtes som foreskrevet på etiketten. Et passende kulturmedium kan fremstilles ved i 1 liter destillert vann å suspen-dere en blanding av 1,5 g kjøttekstrakt, 3 g gjærekstrakt, 6,0 g pepton (f. eks. «Gely-sate») og 15 g agar, hvoretter pH-verdien innstilles på 6,2. Suspensjonen henstår 5 min., hvoretter den rystes inntil den er blitt godt blandet og varmes forsiktig under omrystning. Suspensjonen kokes 1—2 min., eller inntil oppløsning har funnet sted. Dyrkningsmediet fordeles deretter og steriliseres ved 121° C i 15 min.

Podemateriale:

Prøveorganismen er Bacillus subtilis A.T.C.C. 6633. Der tilsettes 2 pst. av en sporesuspensjon inneholdende 50 000 000 levedyktige sporer pr. ml til den smeltede prøveagar, etter at denne er kjølet til 53° C.

Fremstilling av prøveplater:

21 ml av steril «assay agar» anbringes i sterile petriskåler og henstår til stiv-ning. Der fordeles deretter 4 ml podet agar jevnt over overflaten av dette bunnlag. Etter at substratet er kjølet til stuetempe-ratur, anbringes sjabloner av rustfritt stål, forsynt med huller, på substratet, og i disse huller anbringes prøver.

Puffer:

Til fortynning anvendes en citrat-puffer med pH 6,2. Denne fremstilles ved blanding av 192,12 g vannfri citronsyre og 106,3 g natriumhydroksyd som oppløses i 1 liter destillert vann, hvoretter oppløsnin-gen fortynnes 1:10 med destillert vann. Oppløsningens pH-verdi må kontrolleres elektrometrisk og om nødvendig reguleres til 6,2 ved tilsetning av citronsyre eller natriumhydroksyd. Variasjoner i puffer-oppløsningens pH-verdi eller konsentra-sjon har en betydelig innflytelse på stør-relsen av hemningssonen. Det har vist seg å være unødvendig å sterilisere puffer-oppløsningen. Stamoppløsningen konser-veres med kloroform eller toluol, og friske fortynninger fremstilles daglig.

Prøve:

Ukjente prøver fortynnes om nød-vendig med citratpufferoppløsningen med pH-verdi 6,2. Tre huller på hver plate anvendes til hver enkelt fortynning av prø-ven. Etter henstand ved 32° C måles dia-meteren av hemningssonen for hvert enkelt hull, og der beregnes gjennomsnitts-verdier.

Streptomyceten som benevnes BL 567201, kan skjelnes fra en stamme av S. aureofaciens (NRRL 2209), fra Northers Regional Research Laboratory, Peoria, Il-linois, hvor den er blitt deponert som en aureomycinproduserende stamme, ved iakttagelse av egenskaper under veksten på glycerin-asparagin-kjøttekstrakt-agar og czapek-dox-agar, inneholdende 1 pst. dekstrin.

Glvcerin- a. W( owiin- kjøUekstritkt- aqar.

Egenskaper ved vekst av BL 567201 og Streptomyces aureofaciens.

Dekstrin- czapek- dox- agar.

NaNO., 0,2 % k2h<p>o,, o,i % MgSO,, 0,05 % KCL 0,05 % FeSO,, spor Agar 1,5 %

pH 7,2 Egenskaper ved vekst på dekstrin-czapek-dox-agar.

Streptomyces BL 567201 er ytterligere karakteristisk ved at den danner et in-tenst farvet, blågrønt pigment når den dyrkes submerst i et substrat som inneholder 1 pst. rørsukker, 1 pst. sojabønne-mel, 1 pst. sojapepton, 1,5 pst. KH.,P04 og 0,5 pst. (NH4)L)HPO,,. Streptomyces aureofaciens (NRRL 2209) danner ikke dette pigment.

Oppfinnelsen omfatter en fremgangs-

måte til dyrkning av klorotetracykllndan-nende stammer av Streptomyces ved ca. 24—30° C under submerse betingelser, under omrøring og luftning og på substrater som består av kullstoffkilder, kvelstoffkilder, vekststoffer, mineralsalter såsom ka-liumfosfat, magnesiumsulfat, natriumnitrat og, hvis det ønskes, en puffersubstans, såsom kalsiumkarbonat, idet der til substratet settes et metabolismehemmende stoff som hindrer klorering ved gjæring. Til hemning anvendes bromidioner, og det kan med godt resultat tilsettes natriumbromid, kaliumbromid, kalsiumbromid, ammoniumbromid eller hydrogenbromid. Uttrykt som natriumbromid har en passende tilsetning en størrelse på 0,01—5,0 vekt-prosent beregnet på næringssubstratets vekt, og det foretrekkes å anvende 0,1— 2 pst.

Det antas, selv om dette ikke kan betraktes som sikkert, at den hemning av klorering ved gjæring som er funnet ifølge oppfinnelsen, skyldes innvirkning på enzy-matiske prosesser og muligvis den prosess som i alminnelighet kalles «konkurrerende hemning». Oppfinnelsen må imidlertid ikke betraktes som avhengig av eller begrenset av denne teori.

Som kullstoffkilde i substratet kan anvendes et av de følgende stoffer:

Disse kullstoffkilder tilføres substrater i ren form eller i form av konsentrater. Den mengde av disse kullstoffkilder som frem-kaller den beste dannelse av det antibiotiske stoff i substratet varierer betydelig fra ca. i/, pst. til 5 pst., regnet som vektsprosent av næringssubstratet.

Passende kvelstoffkilder for dyrkningen omfatter et stort antall stoffer, hvori-blant noen dessuten inneholder vekststoffer som f. eks.:

Aminosyrer

Kasein, hydrolysert eller uhydrolysert Fiskemel

Sojabønnemel

Kjøttekstrakt

Leverpressekake

Urinstoff

Nitrater

Ammoniumforbindelser

Kornberme

Maisstøpevann

Hvetestøpevann

Valle eller vallekonsentrater Syrehydrolysert maisgluten Syrehydrolysert hvetegluten

Pepton

Slakteriavfall

Ølgjær

Bomullsfrømel

Laktalbumin

Trypton.

Disse kvelstoffholdige bestanddeler be-høver ikke å anvendes i særlig ren form, de mindre rensede produkter som inneholder spor av vekstfaktorer og betydelige mengder av mineralske næringsstoffer, er anvendelige. På grunn av den udefinerte karakter av mange av disse kvelstoffholdige stoffer er det ikke mulig å angi be-stemte tall for de mengder som skal tilsettes. En mengde på ca. 0,1 pst. — 5,0 pst. tørrstoff beregnet på vekten av substratet vil i de fleste tilfeller angi anvendelses-området for disse kvelstoffholdige stoffer.

Substratets pH-verdi ved begynnelesen av dyrkningen skal være 6,0—6,2. Den foretrukne temperatur er ca. 26—28° C. Dete maksimale utbytte oppnås som regel i løpet av 1—3 døgn, avhengig av dyrknings-måten for streptomyceten.

Eksempel 1.

Til fremstilling av tetracyklin fremstilles podemateriale ved å pode i et substrat som etter vekt har følgende sammen-setning:

1 pst. maisstøpevann

1 pst. rørsukker

0,5 pst. (NH4).,HP04

1,5 pst. KHnPd4

0,2 pst. MgS04, 7H.O

0,5 pst. NaBr

pH-verdien reguleres til 6,2—6,4, og 2500 ml anbringes i en flaske på 10,0 1. Substratet dampsteriliseres i 1 time ved 118—120°. Etter avkjøling podes substratet med ca. <1>/2 volumprosent av en uklar, vandig sporesuspensjon av Streptomyces fra en skrå-agar-kultur. Innholdet av flasken holdes deretter ved 26—28° i 48 timer i et frem- og tilbakegående rysteapparat, idet der blåses steril luft hen over væskens overflate. Fra flaskekulturen overføres substratet, som inneholder den angjeldende streptomyces, til en gjæringstank under iakttagelse av fullstendig aseptiske betingelser. Når det ønskes, kan væsken opparbeides som ne-

denfor beskrevet, hvorved tetracyklinet kan isoleres.

Tetracyklinet som dannes av Streptomyces BL 567201, Streptomyces aureofaciens (NRRL 2209) og andre tetracyklin-produserende arter av Streptomyces, kan fremstilles i stor skala under submerse betingelser. Faststående gjæringsbeholdere utstyrt med passende hjelpemidler til om-røring og luftning har vist seg å være anvendelige til dette formål. Et næringssubstrat, bestående av 56,8 1 maisstøpevann, 56,8 kg rørsukker, 28,4 kg (NH4)aHP04, 85,2 kg KH,P04, 11,3 kg MgS04, 711,0 og 28,4 kg NaBr fylt opp med vann til" 5700 1, er passende. Dette substrat kan fremstilles i en emaljert gjæringsbeholder på 7500 1 utstyrt med varmekappe av hensyn til temperaturregulueringen, en passende omrører av rustfritt stål og en passende luftningsanordning. Substratet steriliseres ved oppvarmning med damp under trykk og kjøles deretter. Etter sterilisering skal substratets pH-verdi være i nærheten av 6,2. Substratet podes med 15 volumprosent av en vegetativ kultur dyrket enten i en lignende gjæringsbeholder, som har vært podet med et podemateriale som tidligere beskrevet, eller med et podemateriale fremstillet i laboratorieskala. Kulturen i beholderen på 7500 1 holdes på en temperatur av 28° i ca. 44 timer. Under veksten drives omrøreren med en hastighet av 90 omdreininger pr. min., og det føres steril luft gjennom luftningsanordningen til mediet i en mengde av 2,8 m^ pr. min. Etter avslutning av veksten inneholder kul-turvæsken normalt en vesentlig mengde tetracyklin, som er større enn den tilstede-værende mengde av klortetracyklin. Tetracyklinet isoleres som beskrevet i det føl-gende; det faste materiale som fås før omkrystallisering inneholder i det minste 19 deler tetracyklin for hver del klortetracyklin.

Eksempel 2: Næringssubstrat inneholdende tetracyklin og ikke mer enn 1 del klortertra-cyklin pr. 2 deler tetracyklin, fremstilles etter den i eksempel 1 angitte metode, idet der anvendes det følgende substrat:

1 pst. hvetegluten

1 pst. glycerin 0,05 pst. tørret berme (fremstillet ved tørring av av de i vann oppløselige bestanddeler av berme)

0,1 pst. kalsiumkarbonat 0,5 pst. natriumbromid.

Eksempel 3.

Substrat inneholdende tetracyklin og ikke mer enn 1 del klortetracyklin pr. 2 deler tetracyklin, fremstilles etter den i eksempel 1 angitte metode under anvendelse av følgende substrat:

1 pst. bomullsfrømel

1 pst. glukose 0,05 pst. tørret berme (fremstillet ved tørring av de i vann oppløselige bestanddeler av berme)

0,1 pst. kalsiumkarbonat 0,5 pst. natriumbromid.

Eksempel 4.

1 % maisstøpevann

1 % cerelose

0,1 % kalsiumkarbonat 1,0 % natriumbromid.

Eksempel 5.

Substrat inneholdende tetracyklin og ikke mer enn 1 del klortetracyklin pr. 2 deler tetracyklin, fremstilles etter den i eksempel 1 angitte metode under anvendelse av følgende næringssubstrat:

1 pst. sojabønnemel

1 pst. cerelose

0,05 pst. gjærekstrakt 0,1 pst. kalsiumkarbonat.

0,1 pst. natriumbromid.

Eksempel 6.

3 pst. sojabønnemel

0,5 pst. maisstivelse 0,1 pst. N-Z-amin B (et enzymatisk

fordøyet kaseinprodukt)

0,3 pst. natriumnitrat 0,5 pst. kalsiumkarbonat 0,5 pst. kaliumbromid.

Eksempel 7.

1 pst. N-Z-amin B

1 pst. cerelose

0,5 pst. gjærekstrakt 0,1 pst. kalsiumkarbonat 0,5 pst. kalsiumbromid.

Eksempel 8.

1 pst. rørsukker

1 pst. sojabønnemel

1 pst. sojapepton

1,5 pst. KHPO,

0,5 pst. (NH,),HPO,

0,5 pst. natriumbromid.

Eksempel 9.

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 utførtes både med og uten 0,5 pst. natriumbromid under ellers samme betingelser, idet der anvendtes Streptomyces BL 567201, og mengdene av tetracyklin og klortetracyklin i de fremkomne substrater ble bestemt ved papirstrimmelkromatografi, idet der anvendtes det i det føl-gende beskrevne system D eller ved diffe-rensiell, biologisk prøve på agar ved pH-verdiene 6,2 og 8,0.

Substratet fra en beholder på ca. 4500 1, som inneholdt ca. 3000 1 substrat, her-under 0,5 pst. natriumbromid, inneholdt etter 20 og 44 timers gjæring i det minste 19 deler tetracyklin for hver del klortetracyklin. Ved biologisk prøve etter 20 timer inneholdt substratet 85 mikrogram tetracyklin pr. ml og 3 mikrogram klortetracyklin pr. ml.

Substratet fra en beholder på ca. 4500 1, inneholdende ca. 3000 1 substrat uten tilsetning av bromidion, inneholdt etter 44 timers gjæring ikke mer enn 1—2 deler tetracyklin for hver 8 deler klortetracyklin.

Substratet fra en beholder på ca. 2300 1, inneholdende ca. 1330 1 substrat uten tilsetning av bromidion, inneholdt etter 30 timers gjæring ikke mer enn 1 del tetracyklin for hver 9 deler klortetracyklin.

Eksempel 10.

De nedenfor nevnte substrater frem-stiltes i porsjoner på 200 ml, hvorav to porsjoner av hver ble anbragt i en konisk kolbe på 1 liter. Der ble autoklavert i 15 min. ved 121°, hvoretter der ble kjølt og podet med en 24 timer gammel vegetativ kultur av Streptomyces BL 567201 som var dyrket i et næringssubstrat med maisstø-pevann, idet der ble podet med 1 ml podemateriale for hver 200 ml substrat. De po-dede kolbene ble rystet i et rysteapparat ved frem- og tilbakegående bevegelse ved 28° C i 48 timer, hvoretter de ble anvendt til analytisk bestemmelse.

Substratene ble sentrifugert og prøvet ved papirstrimmelkromatografi, idet der ble anvendt system D.

Eksempel 11.

Natriumbromid i eksempel 10 ble er-stattet med henholdsvis kaliumbromid, kalsiumbromid, (mindre enn 0,5 pst.) eller ammoniumbromid, hvorved der ble på-vist den samme forøkede produksjon av tetracyklin på bekostning av klortetracyklin.

Eksempel 12.

Når der anvendes Streptomyces aureofaciens (NRRL 2209), har det vist seg at tilsetningen av bromidjoner til substratet på lignende måte som i eksempel 10 forøker dannelsen av tetracyklin på bekostning av klortetracyklin, spesielt når substratet endres for å passe til stammen og til å fremme den maksimale dannelse av antibiotiske stoffer (se f. eks. ameri-kansk patent nr. 2 482 055).

Etter at veksten har funnet sted, utvinnes tetracyklinet fra substratet ved å fjerne myseliet f. eks. ved filtrering, hvoretter substratvæsken fortrinsvis ved en pH-verdi omkring 8,5 røres med butanol eller metylisobutylketon. Laget av organisk oppløsningsmiddel som inneholder tetracyklin, konsentreres ved destillasjon til et lite volum, hvoretter det blandes med en lavere kullvannstoff, f. eks. «Skel-lysolve C» som er et teknisk produkt ho-vedsakelig bestående av heptaner, hvorved tetracyklinet utfelles i sin baseform, hvis det ekstraherte substrat anvendtes med alkalisk pH eller som hydroklorid, hvis substratet før uttrekningen var blitt gjort surt med saltsyre. Det faste tetracyklin, som fremstilles på denne måten, kan ytterligere renses ved utrøring i am-moniakkvann og også ved adsorpsjon fra en oppløsning av den fri base på et kro-matografisk adsorpsjonsmiddel, f. eks. et kiselsyrepreparat som «Florisil», fulgt av vaskning f. eks. med aceton eller metanol til fjernelse av urenheter og deretter eluering med en syre. De rensede, sure salter av tetracyklin i eluatet utvinnes deretter ved krystallisasjon, utfelling, fry-setørring eller på annen måte.

Av tetracyklinet kan det fremstilles forskjellige salter, enklest ved tilsetning av

den ønskede mineralsyre eller organisk

syre, til det antibiotiske stoff i berøring med vann, inntil det fremkommer en klar

oppløsning. De faste salter kan fremstilles ved regulering av pH-verdien av en slik oppløsning av et tetracyklinsalt til en verdi like under den hvorved det antibio-

tiske stoff begynner å utskilles. Oppløs-ningen kan deretter tørres, f. eks. ved at man underkaster den frosne oppløsning vakuum. Sure salter av tetracyklin fremkommer ved fordampning av en oppløs-ning av saltet i vann ved en lav pH-verdi. Av mineralsyrer kan anvendes saltsyre, svovelsyre og fosforsyre. Av organiske sy-rer kan anvendes sitronsyre, vinsyre, glu-konsyre, osv. Da tetracyklin er amfotert, kan der fremstilles salter av det med forskjellige metaller, og f. eks. kan alkali-metallsaltene av tetracyklin fremstilles ved behandling av en vandig suspensjon av det antibiotiske stoff med alkalihy-droksyd. De faste metallsalter av tetracyklin utvinnes ved fordampning i vakuum av en vandig oppløsning av det antibiotiske stoff ved en passende pH-verdi.

Tetracyklinet som er fremstillet ved hjelp av de ovenfor omtalte metoder, kan endelig karakteriseres, til og med når det foreligger forurenset med lignende organiske stoffer, ved dets aktivitetsspektrum (dvs. vandringshastighet eller Rrverdi), idet det anvendes en rekke oppløsnings-midler ved en fremgangsmåte som er kjent under navnet papirkromatografi. Denne teknikk er relativt ny, men er allerede en godt utarbeidet metode til identifikasjon av organiske forbindelser, likesom absor-beringen i det infrarøde område er R(-verdiene i en serie av oppløsningssystemer et sikkert og reproduserbart karakteristisk trekk for en gitt kjemisk forbindelse og kan således tjene som et sikkert iden-tif ikasj onsmiddel.

Rr-verdiene bestemmes på følgende måte: Strimler av askefritt, tett og relativt sterkt sugende filtrerpapir, som f. eks. kva-liteten 589, Blåt Bånd fra firmaet Carl Sleicher og Schiill Co., Keene, N. H., med en bredde på ca. 13 mm og en lengde på 58 cm opphenges ved konstant stuetempe-ratur i et beskyttet rum, f. eks. i et luk-ket kar, idet de henger ned fra kanten av et mindre kar. Den øverste enden av strimlene er i berøring med en porsjon av oppløsningsmiddel i det mindre kar, og den nederste enden av strimlene henger fritt, således at de ikke når en porsjon av oppløsningsmidlet eller dettes flyktige bestanddeler, som er anbragt under de opphengte strimler for å tilveiebringe metning av luften med det anvendte opp-løsningsmiddel. Denne del av prosessen kalles også fremkallelsesprosessen.

Produktet som skal undersøkes, og som f. eks. kan være et substrat hvori dyrkning har funnet sted, eller et isolert fast stoff, anbringes på et avmerket sted på den øverste del av den fritthengende del av en strimmel. Hvis stoffet som skal undersøkes er fast, må det først oppløses i et passende oppløsningsmiddel. Den mengde av stoffet som skal anvendes skal være slik at det fremkommer en passende so-nestørrelse ved den endelige prøve, og denne mengde bestemmes ved et simpelt forsøk. F. eks. er 5 mikroliter (0,005 ml) av en oppløsning, som inneholder 1 mg pr. ml av tetracyklin ifølge oppfinnelsen, en passende mengde når det som prøveorganisme anvendes B. subtilis. Strimlen tørres og anbringes deretter i stilling i karet som inneholder oppløs-ningsmidlet. Oppløsningsmidlet vil deretter vandre nedetter i strimlen, dvs. strimlen «fremkalles» inntil fronten, hvormed oppløsningsmidlet beveger seg, når den nederste kant av strimlen. Dette tar ca.

15 timer. Den omgitte atmosfære holdes

på konstant temperatur, fri for trekk og mettet med damper av oppløsningsmidlet fra beholdningen nedenfor strimlen.

Strimlen tas deretter ut, tørres i luften og anbringes på en agarplate som er inn-stillet på pH-verdien 6,2, og hvorpå der er podet med prøveorganismen, i dette tilfelle B. subtilis. Etter henstand i kjøleskap natten over fjernes strimlen, agarplaten merkes på passende måte og henstår deretter ved dyrkningstemperatur natten over, hvoretter den avleses eller eventuelt fotograferes, slik at man har et holdbart sammenligningsgrunnlag.

På agarplaten er omrissene av strimlen synlige, og tilstedeværelsen av hvert enkelt antibiotisk stoff, som har vært på strimlen, er synlig som en klar plett, i motsetning til det øvrige uklare areal, hvor organismen har kunnet vokse. Strimlen avmerkes i soner som representerer 5, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10 og 15 pst. av avstanden fra pletten hvor prøvemateria-let ble anbragt til strimlens nederste kant, og plasering i disse soner angis som sva-rende til R^verdiene 1 til 10. En liten plett midt på strimlen vil således ha Rf-verdien 6, mens en større plett f. eks. brer seg til de tilstøtende soner, hvorfor plettens plasering angis med R(-verdiene 5, 6 og 7, når det tas hensyn til hele pletten.

Ved anvendelse av denne teknikk er der for tetracyklinet funnet det følgende R^spektrum, idet der ble anvendt 5 mikroliter av en oppløsning med et innhold på 1 mg pr. ml, og idet der som prøve-organisme ble anvendt B-subtilis på agar med pH-verdi 6,2. Der ble anvendt de nevnte 12 oppløsningsmiddelsystemer.

Sammensetningen av oppløsningsmid-delsystemene var følgende:

A: vann

B: 10. pst. vandig natriumcitrat C: 40 pst. » »

D: butanol mettet med vann

E: tørr metylisobutylketon

P: en blanding av 100 deler 80 pst.

metanol og 10,5 deler piperidin regulert til en pH-verdi på 9,5 med eddiksyre.

G: en blanding av 80 volumdeler metanol, 5 rumfangsdeler iseddiksyre og 15 volumdeler vann,

H: butanol mettet med vann og inneholdende 2 pst. p-toluolsulfonsyre,

I: en blanding av 100 ml butanol mettet med vann og 5 ml iseddiksyre,

J: butanol mettet med vann og inneholdende 2 pst. p-toluolsulfonsyre og 2 pst. piperidin,

K: 100 deler butanol mettet med vann og inneholdende 2 g p-toluolsulfonsyre, 2 ml piperidin og 2 g la-urinsyre,

L: en blanding av to deler isoamylal-kohol og en del kullstofftetraklo-rid, mettet med 10 pst. vandig natriumcitrat. I dette tilfelle mettes strimlene, innen prøveoppløsnin-gen påføres, med 10 pst. vandig natriumcitrat regulert til en pH-verdi på 5,7 med sitronsyre. Strimlene tørres innen anvendelsen.

Tetracyklins egenskaper er beskrevet i Journal of the American Chemical Socie-ty, bind 75, s. 4621—4623, 1953. Tetracyklin, oksytetracyklin og klortetracyklin antas å ha den nedenfor stående formel:

idet symbolene R, og R, har følgende be-tydning: Tetracyklin: R, = H; R, = H, Oksytetracyklin: R, = H; R, = OH, Klortetracyklin: R, = Cl; R, = H.

En prøve av tetracyklin i form av den fri base ble således fremstillet ifølge an-givelser i litteraturen utfra klortetracyklin, og denne prøve viste seg å ha smelte-punkt 170—175° C og å inneholde 0,71 pst. klor, hvilket svarer til en forurensing på ca. 10 pst. ureagert klortetracyklin. Denne prøven viste seg å være identisk med en prøve av tetracyklin fremstillet ved gjæring. Alle forurensingene kunne kartleg-ges ved undersøkelse av de nevnte prøver og prøver av klortetracyklin og oksytetracyklin, både alene og i blanding ved hjelp av papirkromatografi, idet der særlig ble anvendt de tidligere omtalte oppløsnings-systemer D og L.

Tetracyklin mistet ca. 28 pst. av sin aktivitet i løpet av 48 timer i en puffer-oppløsning med pH-verdi 8,0 ved 37° C idet konsentrasjonen var ca. 0,7 mg pr. ml, klortetracyklin mistet ca. 50 pst. av sin aktivitet i løpet av 14 timer, og oksytetracyklin mistet ca. 50 pst. av sin aktivitet i løpet av 26 timer under de samme betingelser.

Tetracyklinet kan også klart skjelnes fra klortetracyklin og oksytetracyklin ved prøve på agar med pH-verdi 8,0, hvor klortetracyklin og oksytetracyklin er meget mindre aktive enn tetracyklin. Et lignende resultat ble funnet ved prøve på agar ved

pH-verdi 6,2.

Tetracyklin kan således renses fra

forurensninger av klortetracyklin eller oksytetracyklin ved å bli holdt i vandig opp-løsning ved en pH-verdi på ca. 8, inntil

hele mengden av klortetracyklin eller oksytetracyklin er blitt sønderdelt, hvoretter

det rensede tetracyklin isoleres. En slik

prosess lettes meget ved en fremgangsmåte som den som er anvendt ifølge oppfinnelsen, hvor mengden av klortetracyklin holdes på et minimum.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av

tetracyklin ved dyrking av en kultur av en klortetracyklin-produserende stamme av Streptomyces under submerse, aerobe be tingelser i en vandig kvelstoff- og kullhydratholdig næringsoppløsning med minst 50 deler pr. million kloridion, karakterisert ved at det som kloreringsinhibitor tilsettes bromidioner.

2. Fremgangsmåte som angitt i på-stand 1, karakterisert ved at det som kloreringsinhibitor tilsettes fra 0,01 til 5 vektsprosent av mediet av et alkallme-tallbromid eller et jordalkalimetallbromid.

3. Fremgangsmåte som angitt i på-stand 1, karakterisert ved at det som kloreringsinhibitor tilsettes fra 0,1 til 5 vektsprosent av mediet av kaliumbromid, natriumbromid, hydrogenbromid, kalsiumbromid eller ammoniumbromid.