NL193132C

NL193132C - Werkwijze voor de bereiding van een preparaat dat tryptofan en/of threonine omvat.

Info

Publication number: NL193132C
Application number: NL8701156A
Authority: NL
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 1986-06-20
Filing date: 1987-05-14
Publication date: 1998-12-04
Also published as: DK312287D0; NL193132B; DK167091B1; SE8702534D0; SE8702534L; FR2600235B1; DK312287A; BE1000940A3; NL8701156A; SE466184B; FR2600235A1; US4777051A

Description

> 1 193132 r ,j Werkwijze voor de bereiding van een preparaat dat tryptofan en/of threonine omvat

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van een preparaat voor diervoer, waarbij men een oplossing met, betrokken op de droge stof, 5-95 gew.% tryptofan en/of threonine 5 of een concentraat daarvan, sproeidroogt tot halfdroge korrels.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit het Amerikaanse octrooi 3.582.471. Daarin wordt de bereiding van threonine door middel van fermentatie beschreven. Volgens die bereidingsmethode kan het threonine volgens bekende manieren uit het fermentatiemedium worden afgescheiden. Zo kunnen de bacteriecellen door filtratie of centrifugeren worden verwijderd, waarna het threonine door kationwisselhars van het H-type 10 kan worden teruggewonnen, gevolgd door partiële verdamping van het eluaat onder verlaagde druk en precipitatie van het zuivere kristallijne product uit het concentraat.

Op een dergelijke wijze verkregen kristallen kunnen in een droogkegel, wervelbeddroger, enzovoorts worden gedroogd en in diervoer worden gebruikt.

Hoewel men eerder onderkende dat Trp en Thr niet in gezuiverde vorm aan een diervoer toegevoegd 15 hoefden te worden heeft men toch nooit gehoord van een werkwijze voor het bereiden van een diervoer waarbij men een oplossing met grote hoeveelheden onzuiverheden direct droogt zonder het Trp en/of het Thr te isoleren of te zuiveren.

Hoewel toevoegen van Trp en Thr in ruwe vorm (niet geïsoleerd of gezuiverd) geacht kan worden wenselijk te zijn, daar het preparaat waaraan Trp en/of Thr toegevoegd wordt zelf al uiterst vaag gedefini-20 eerd is, en Trp en/of Thr in combinatie met onzuiverheden zoals suikers, zouten, organische zuren, enzovoorts nog steeds hun voedingswaarde blijven vertonen evengoed als de gezuiverde stoffen, zijn er toch enige problemen bij het bereiden van een preparaat uit onzuiver Trp of Thr. Als een onzuivere oplossing van Trp en/of Thr in een gewone sproeidroger gedroogd wordt heeft men met hygroscopische onzuiverheden zoals suikers, zouten en organische uren te maken en blijft een groot deel van het Trp en/of 25 Thr en andere stoffen aan de wanden van het apparaat of van de afscheidende cycloon kleven. Onder die omstandigheden kan men dus niet normaal drogen. Indien onzuiver Trp en/of Thr op een trommeldroger gedroogd wordt treedt thermische ontleding op. Daar het watergehalte van het product dan hoger is, is bovendien de stabiliteit dan lager en treden nog andere problemen op zoals slechte mengbaarheid met diervoer, zulks op basis van fysische eigenschappen van het poeder zoals samenhang, enzovoorts. Aan de 30 andere kant hoewel er andere manieren van drogen bestaan die met onzuivere oplossingen van Trp en/of Thr niet verstoord raken, zoals vriesdrogen, vacuümdrogen, enzovoorts, waarbij er niet veel warmte ontwikkeld wordt, heeft men dan nog een economisch probleem daar de productiekosten van deze methoden behoorlijk hoog zijn.

In US 2.710.810 wordt een werkwijze beschreven waarbij biologische vloeistoffen, met name microbiële 35 vloeibare culturen, in twee stappen worden gedroogd. De betreffende, te drogen, cultuursamenstelling wordt in de eerste stap onder vacuüm bij een temperatuur van niet hoger dan ongeveer 10-65°C (50-150°F), ingedikt tot een concentraat met ongeveer 35-80% vaste stof. Bij voorkeur wordt er zo ver ingedikt dat er een nog net vloeibare vloeistof wordt verkregen. In de tweede stap wordt een dunne laag (ongeveer 3 mm) van het concentraat op een hete plaat gegoten, waarna er een vacuüm wordt aangelegd zodat de 40 resterende vloeistof kan verdampen. Om dit aanvaardbaar snel te kunnen laten verlopen wordt de plaat op een hoge temperatuur gehouden die initieel kan liggen boven de ontledingstemperatuur van de te drogen stof. Wanneer te lang wordt verhit, dat wil zeggen wanneer zolang wordt verhit dat vrijwel al het vocht is verdampt, zal er dus ontleding kunnen optreden. De temperatuur van de stof moet derhalve continu worden gemeten, zodat de plaat op tijd kan worden afgekoeld.

45 Daarom is naar een methode gezocht voor het bereiden van een preparaat voor diervoer door drogen van een Trp- en/of Thr-oplossing, die een product met uitstekende stabiliteit en fysische eigenschappen van een poeder kan geven, met minimale ontleding door de toegepaste warmte en tegen lage kostprijs. Dus blijft er behoefte aan nieuwe werkwijze voor het bereiden van preparaten voor diervoer op basis van het drogen van een oplossing van Trp en/of Thr die onzuiverheden bevat.

50 Deze uitvinding beoogt dan ook een werkwijze voor het maken van een preparaat voor diervoeding uit een onzuivere of ruwe oplossing van Trp en/of Thr. Verder beoogt deze uitvinding een werkwijze te verschaffen voor het maken van een preparaat voor diervoer uit een ruwe of onzuivere oplossing van Trp en/of Thr, die met een minimum aan ontleding leidt tot een product van uitstekende stabiliteit en met goede fysische poedereigenschappen. Ook beoogt deze uitvinding een werkwijze te verschaffen voor het bereiden 55 van een preparaat voor diervoeding dat Trp en/of Thr bevat dat door een lage kostprijs gekenmerkt wordt. Tenslotte beoogt deze uitvinding ook een werkwijze te verschaffen voor het maken van een preparaat voor diervoeding uit een onzuivere of ruwe oplossing van Trp en/of Thr, waarbij de oplossing van Trp en/of Thr i 193132 2 j een kweekmedium van het micro-organisme is dat het Trp en/of Thr gemaakt had, of het eluaat van een kolom hars of de moederloog van een kristallisatie, of een enzymatisch reactiemengsel.

Deze en andere doelstellingen van de uitvinding worden bereikt met een werkwijze als in de aanhef genoemd, en die wordt gekenmerkt doordat men de gesproeidroogde korrels in de vorm van een mat 5 uitspreidt en de korrels met hete lucht droogt tot een watergehalte van 4 gew.% of minder.

De uitvinders hebben intensief gestudeerd op diverse droogmethoden van diverse Trp- en/of Thr-oplossingen, zoals kweekmedia van micro-organismen, eluaten van harskolommen, enz., en als resultaat daarvan hebben zij gevonden dat men door een concentraat daarvan te sproeidrogen tot half-droge korrels, tegen lage kosten een product met uitstekende stabiliteit en goede poedereigenschappen krijgt. Aldus 10 werden de gestelde doeleinden bereikt.

De Trp- en/of Thr-oplossing waarvan men uitgaat kan iedere oplossing met, betrokken op de droge stof daarvan, 5-95% en bij voorkeur 20-60 gew.% Trp en/of Thr zijn. Tot die oplossingen behoren kweekmedia van micro-organismen, celvrije preparaten van zulke kweekmedia, eluaten van harskolommen, moederlogen van kristallisaties, enzymatische reactiemengsels, enz.

15 Met ’’kweekmedium van micro-organismen” wordt een vloeibaar medium bedoeld dat gebruikt was voor het kweken van welk micro-organisme dan ook dat voor zijn groei Trp en/of Thr gebruikt of tijdens zijn groei Trp of Thr uitscheidt. Het Thr of Trp kan vooraf of tijdens het kweken direct aan het medium toegevoegd worden, of het Thr of Trp kan door het micro-organisme zelf gemaakt worden zodat de concentratie van één van deze of beide aminozuren omhoog gaat. Voorbeelden van geschikte kweekmedia vindt men in de 20 uitvoeringsvoorbeelden. Het medium dat bij de werkwijze volgens deze uitvinding gebruikt kan worden kan de cellen der micro-organismen bevatten of een celvrij preparaat zijn waaruit de cellen met iedere in deze techniek bekende methode verwijderd zijn.

Met ’’eluaat van harskolommen” wordt een eluaat bedoeld dat het materiaal bevat dat aanvankelijk aan een hars geadsorbeerd zat, welk geadsorbeerde materiaal afkomstig was van een oplossing die Trp en/of 25 Thr bevatte, en waarbij het hars natuurlijk in staat was deze aminozuren te adsorberen. De oplossing van Thr en/of Trp die over het hars geleid wordt kent geen speciale beperkingen en kan in het algemeen iedere oplossing zijn die deze aminozuren bevat. Specifieke voorbeelden van eluaten van harskolommen vindt men in de nog komende voorbeelden.

Met ’’moederloog van kristallisatie” wordt een oplossing bedoeld die Thr of Trp bevat en waaruit één van 30 of deze beide aminozuren gekristalliseerd is. Van zo'n oplossing weet men dat die nog wat Thr en/of Trp bevat, samen met andere onzuiverheden.

Met "enzymatische reactiemengsels” wordt een vloeibaar medium bedoeld dat één of meer enzymen bevat samen met vrij Thr en/of Trp, waaraan geen bepaalde beperkingen gesteld worden. Die enzymen kunnen eventueel meer of minder gezuiverd zijn en een rol gespeeld hebben bij de biosynthese van Thr of 35 van Trp.

Indien de Trp- en/of Thr-oplossing een organisch zuur zoals melkzuur bevat, dat normaliter in kweek-vloeistoffen zit, dat bij het drogen niet verdampt, gaat de hygroscopiciteit van het product omhoog. In zo’n geval kan de hygroscopiciteit van het product verlaagd worden door calciumhydroxide toe te voegen zodat de pH van de oplossing tussen 8 en 10 en bij voorkeur tussen 8,5 en 9,5 komt, waarna men die oplossing 40 droogt.

Als de oplossing een gehalte aan Trp en/of Thr heeft van minder dan 5 gew.%, betrokken op droge stof, is de praktische waarde van die oplossing wegens de kosten laag, terwijl met een gehalte aan Thr of Trp van meer dan 95% de betekenis van deze uitvinding minder wordt.

De Trp- en/of Thr-oplossing kan zover geconcentreerd worden dat het droge stof-gehalte van de 45 oplossing 30-70 gew.%, bij voorkeur 40-60 gew.% wordt. Het concentreren gebeurt bij zo lage mogelijke temperatuur en druk om degeneratie en afbraak van Trp en/of Thr te vermijden.

Het drogen gebeurt in twee stappen. De eerste stap is een sproeidrogen waarbij de Trp- of Thr-oplossing, of een concentraat daarvan, in een sproeikamer gesproeidroogd wordt tot half-droge korrels.

Daarna voert men drogen met een stroom lucht uit, waartoe de gesproeide korrels in de vorm van een mat 50 van geëigende dikte uitgespreid worden, bijvoorbeeld op een lopende band van het gaas-type, en worden de korrels met hete lucht gedroogd totdat hun watergehalte ongeveer 4% of minder is. De aldus verkregen korrels worden dan afgekoeld en dat is dan het product.

Hoewel de werkomstandigheden afhankelijk van de concentraties van de oplossing en de hoeveelheid onzuiverheden kan variëren, heeft het de voorkeur dat de aangevoerde hoeveelheid uitgangsvloeistof en 55 temperatuur van de hete lucht zodanig worden ingesteld in de werkwijze volgens de uitvinding, dat de gesproeidroogde korrels uitgespreid worden tot een mat met een dikte van 5 tot 30 mm. Als de hoeveelheid voeding en de temperatuur van de hete lucht niet geëigend zijn en de op de band afgezette deeltjes geen L , 3 193132 ♦ λ geëigend watergehalte en/of viscositeit hebben zullen de deeltjes te dicht gepakt liggen en de afgifte van water aan de lucht belemmeren, terwijl met te veel water of een te hoge viscositeit de deeltjes aan elkaar gaan zitten, en dan de afgifte van water ook belemmeren. Het watergehalte van de gesproeide korrels moet dan ook tussen 5 en 15% en bij voorkeur tussen 7 en 9% ingesteld worden. Verder gebeurt het drogen van 5 de gesproeide korrels onder milde omstandigheden met hete lucht van zo lage mogelijke temperatuur. Het heeft de voorkeur in de werkwijze volgens de uitvinding dat het drogen van de korrels gebeurt met lucht met een temperatuur van 50-80°C.

Het apparaat voor het drogen is bij voorkeur een in de handel verkrijgbare filtermat-droger. Door een filtermat-droger te gebruiken kunnen het bovengenoemde sproeidrogen en drogen met een stroom hete 10 lucht continu uitgevoerd worden. Het is dan ook mogelijk de Trp- en/of Thr-oplossing met daarin onzuiverheden zoals hygroscopische suikers, zouten, organische zuren, enz. (uit kweekmedia van micro-organismen, harseluaten, moederlogen, enzymatische reactiemengsels, enz.) effectief te drogen. De filtermat-droger maakt een bijna momentaan drogen bij hoge temperatuur mogelijk, waarbij men in het begin met een constante waterafvoer droogt en daardoor water snel met hoge efficiëntie uit de behandelde oplossing 15 afvoert, waarna er een wat langer durend mild drogen bij lage temperatuur is, met een lager en afnemend droogtempo. Daardoor kunnen zelfs de meest voor hoge temperaturen gevoelige materialen, zoals Trp en Thr, gedroogd worden met een te verwaarlozen thermische afbraak.

De uitvinding wordt nu nader toegelicht door de volgende voorbeelden, die niet beperkend opgevat mogen worden.

20

Voorbeeld I

Van een entmedium met de in tabel A opgegeven samenstelling werd 3000 liter in een kiemtank gesteriliseerd; toen werd daaraan 3 liter voorkweek van ATCC 21269 toegevoegd en werd er 24 uur onder roeren 25 op 180 rpm (rotaties per minuut) en een beluchting van een half V Vm (volume lucht per volume kweekme-dium) bij 31,5°C geïncubeerd. Toen de celmassa in de kiemtank een vooraf gekozen waarde met een optische dichtheid van 0,2-0,3 26 x verdund bij 660 nm bereikt had, werd daarmee 57.000 liter vooraf gesteriliseerd hoofdmedium, waarvan de samenstelling in tabel A opgegeven is, beënt en werd er onder beluchting met een half V Vm en draaien op 82 rpm bij 31,5°C geïncubeerd. Voor het bijregelen van de pH 30 werd verdunde ammonia gebruikt. Na 24 uur werd continu glucose-oplossing (40 g/dl) toegevoegd, en er werd 70.000 liter fermentatievloeistof met 20 g/l threonine verkregen.

Deze 70.000 liter kweekvloeistof werd in een LTV-apparaat onder verlaagde druk en bij een temperatuur beneden 60°C 3,5 x geconcentreerd, waardoor men 20.000 liter concentraat verkreeg.

Dit concentraat werd in een filtermatdroger Model FMD-20 gedroogd tot een watergehalte van 2,5%. De 35 te drogen oplossing werd aangevoerd in een debiet van 450 l/uur en de temperatuur van de hete lucht was 115°C.

Het aldus verkregen korrelvormige threonine-preparaat bevatte meer of minder de oorspronkelijke hoeveelheid threonine van de fermentatievloeistof; er was praktisch geen afbraak opgetreden en er was ook nauwelijks enige kleuring waar te nemen.

40

TABEL A

Bestanddeel Ent-medium Hoofdmedium 45 Glucose 3 g/dl 13 g/dl

Ureum 0,3 g/dl 4,5 g/dl KH2P04 0,15 g/dl 0,15 g/dl

MgS04.7H20 0,04 g/dl 0,04 g/dl

FeS04.7H20 1 mg/dl 1 mg/dl 50 MnS04.4H20 1 mg/dl 1 mg/dl

Thiamine-hydrochloride 1000 μ§/\ 1000 ^g/l

Biotine 100 /jg/l 100 /ug/l

Met HCI gehydrolyseerde sojaboon-eiwitten 0,5 ml/dl 1,0 ml/dl

Antischuimmiddel - 20 mg/dl 55 pH (met KOH bijgesteld) 7,2 7,2 f 193132 4 ! «. ml

Voorbeeld II *

In 2000 liter bij voorbeeld I verkregen, threonine bevattende fermentatievloeistof werd de pH met zoutzuur op 1 ingesteld en toen werden de cellen door centrifugeren afgescheiden; de 1200 liter celvrije vloeistof werd in 1 uur gebracht op een kolom van 1200 liter kationenwisselaar. Er werd 1200 liter water doorge-5 spoeld en toen werd teruggewassen met 2400 liter water. Daarna werd er in 1 uur 2400 liter IN ammonia doorgeleid, wat 1800 liter threonine-eluaat gaf.

Dit eluaat werd onder verlaagde druk bij temperaturen van 60°C of lager 3 x geconcentreerd tot 600 liter.

Tenslotte werd dit concentraat op een zelfde wijze als in voorbeeld I gedroogd met een filtermatdroger Model FMD-20, tot een korrelproduct met een watergehalte van 2,0%. Er was geen warmte-afbraak.

10

Voorbeeld III

Van een ent-medium met de in tabel B opgegeven samenstelling werd 3000 liter gebracht in een fermentatievat en gesteriliseerd; hieraan werd 3 liter vooraf gekweekte FERM BP-202 (beschreven in de Japanse octrooipublicatie no. 094391/1983) toegevoegd en er werd 24 uur onder roeren op 180 rpm en 15 beluchting met een half V Vm bij 31,5°C geïncubeerd. Toen de celmassa in deze kiemtank een bepaalde waarde bereikt had werd 57.000 liter van het in tabel B genoemde hoofdmedium continu gesteriliseerd en in een hoofdfermentatieketel gebracht, werd er de kiemkweek aan toegevoegd en werd onder roeren op 82 rpm en beluchting met een half V Vm bij 31,5°C gekweekt. Tijdens dit kweken werd de pH met ammonia bijgeregeld. Toen de kweek halverwege gekomen was begon men continu suiker toe te voegen, zodat men 20 70.000 liter fermentatievloeistof met 20 g/l tryptofan kreeg.

TABEL B

Bestanddeel Entmedium Hoofdmedium 25 -

Glucose 3,0 g/dl 138 g/dl KH2P04 0,05 g/dl 0,1 g/dl

MgS04.7H20 0,04 g/dl 0,04 g/dl

MnS04.4H20 0,001 g/dl 0,001 g/dl 30 FeS04.7H20 0,001 g/dl 0,001 g/dl NH4CI 0,3 g/dl 1 g/dl RNA 0,25 g/dl (KCI) 0,2 g/dl

Met HCI gehydrolyseerde sojaboon-eiwitten 65 mg/dl 0,1 g/dl

Anti-schuimmiddel (sojabonen-olie) 0,001 g/dl 0,01 ml/dl 35 pH (met KOH bijgesteld) 7,0 7,0

In 5000 liter van deze tryptofan bevattende fermentatievloeistof werd de pH op 2 ingesteld en toen werden de cellen in een centrifuge verwijderd; van de celvrije vloeistof werd 1400 liter gebracht op een gepakte 40 kolom van 1400 liter kationenwisselaar. Toen werd er 1400 liter water doorgespoeld waarna met 2800 liter water teruggewassen werd. Nu werd er 1500 liter 0,2 N ammonia in een debiet van 1400 l/uur doorgeleid, waardoor men 1300 liter tryptofan-eluaat kreeg.

In dit eluaat werd de pH met zoutzuur op 5 ingesteld, en toen werd er geconcentreerd en gekristalliseerd, waardoor men 68 kg kristallijn tryptofan en 1200 liter moederloog kreeg.

45 Deze moederloog werd op een zelfde wijze als in voorbeeld I met een filtermatdroger Model FMD-20 zonder warmte-afbraak gedroogd tot een korrelproduct met 2,0% water.

Voorbeeld IV

Het concentraat van het in voorbeeld II verkregen threonine-eluaat werd gebruikt voor een droogproef met 50 een sproeidroger en een trommeldroger.

Toen het drogen in de sproeidroger gebeurde bleef het product aan de cycloon vastkleven en bleek normaal drogen onmogelijk. Anderszins bleek drogen op de trommeldroger wel enigszins mogelijk, maar het watergehalte van het product was wel 5,7% en er was ook hevige warmte-afbraak. Beide producten werden op warmte-afbraak geëlueerd, en de uitkomsten daarvan staan in tabel C.

£ 5 193132 " »«

, L TABEL C

Geëvalueerd product Ext.

5 Concentraat van het hars-eluaat 1,1

Op de filtermatdroger gedroogd product 1,3

Op de trommel gedroogd product 3,5 (Ext. = extinctie bij 420 nm van 5 g van de stof in 100 ml water.) 10

Men kan zien dat er op de filtermatdroger maar heel weinig warmte-afbraak optreedt.

Voorbeeld V

In 70.000 liter threonine bevattende fermentatievloeistof, verkregen volgens voorbeeld I, werd 350 kg 15 calciumhydroxide opgelost, waardoor de pH op 9 kwam. Deze oplossing werd onder dezelfde omstandigheden als die van voorbeeld I geconcentreerd, en daarna werd met de filtermatdroger gedroogd. De hygrosco-piciteit van het aldus verkregen threonine-preparaat werd vergeleken met die van het product van voorbeeld I. De uitkomsten staan in tabel D.

20 TABEL D

Monster Geadsorbeerd water (%) bij 40°C, 70% r.v.

25 Droog product van voorbeeld I 20%

Droog product van voorbeeld V 10%

Men ziet dat de hygroscopiciteit door het toevoegen van calciumhydroxide sterk verbeterd werd.

30

Voorbeeld VI

Een basis-diervoer met een ruw eiwitgehalte van 12%, verkregen door mineralen zoals calciumfosfaat, natriumchloride, enz., een vitaminemengsel, 0,3% L-lysine.HCI en 0,1% Dl-methionine toe te voegen aan een mengsel van 87,0% mais en 9,5% ontvette sojabonen, werd gemengd met het in voorbeeld II verkregen 35 product tot een toegevoegd gehalte van 0,1% L-threonine en met het in voorbeeld III verkregen product tot een toegevoegd gehalte van 0,04% L-tryptofan.

Dit mengsel werd bij de biggenteelt beproefd. Er waren drie groepen met elk 8 biggen (vier gecastreerde mannetjes en vier vrouwtjes) en gedurende 28 dagen werd de gemiddelde gewichtstoename per dag gemeten (uitgaande van 18 kg naar 35 kg).

40 De uitkomsten staan in tabel E.

TABEL E

Monster Niets Zuiver L-Trp Product volgens de 45 (0,04%) uitvinding

Zuiver L-Thr (0,1%)

Gewichtstoename per dag (g) 430 620 621 50 Voederverbruik per dag (kg) 1,20 1,50 1,50

Gewichtstoename 2,69 2,42 2,42

Het product volgens deze uitvinding gaf een uitstekende gewichtstoename per dag en bleek even goed te 55 zijn als zuiver tryptofan met zuiver threonine.

Effect van de uitvinding

Zoals uit de voorgaande beschrijving duidelijk is kan men de werkwijze volgens de uitvinding uit een

Claims

193132 6 tryptofan- of threonine-oplossing tegen lage kostprijs een preparaat voor diervoer met uitstekende stabiliteit J en goede poedereigenschappen maken. 5 Conclusies

1. Werkwijze voor de bereiding van een preparaat voor diervoer, waarbij men een oplossing met, betrokken op de droge stof, 5-95 gew.% tryptofan en/of threonine of een concentraat daarvan sproeidroogt tot halfdroge korrels, met het kenmerk, dat men die gesproeidroogde korrels in de vorm van een mat uitspreidt 10 en men die korrels met hete lucht droogt tot een watergehalte van 4 gew.% of minder.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de gesproeidroogde korrels uitgespreid worden tot een mat met een dikte van 5 tot 30 mm.

3. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het drogen van de korrels gebeurt met lucht met een temperatuur van 50-80°C.