Vynález se týká způsobu přípravy teohnlokého preparátu tryptofanu, zejména pro krmné účely, který je stabilní, nehygroskopioký a vhodný pro přípravu krmných premlxů.

Jak je známo, jsou zrniny, jako hlavní složka krmiv monogastriokých hospodářských zvířat, ve složení svýoh bílkovin defioientnl na L-tryptofan (vedle L-lysinu). Proto novéji vzrůstá potřeba doplňovat tuto aminokyselinu do krmných smšsí, a paralelně s tím i potřeba levného, avšak po stránce kvalitativní svému účelu plně vyhovujíoího technického preparátu.

Novější způsoby získávání L-tryptofanu vycházejí z biosyntézy. Vyfermentovaná půda po kultlvaol vhodného mikroorganismu se zpracovává v několika stupních až na preparát vysoké čistoty. Tyto postupy jsou složité a nákladné, získaný produkt je drahý a vhodný spíše pro léčebné použití.

Sále jsou známy způsoby přípravy čistého tryptofanu komblnaoí různýoh operaoí, např. srážení solí kovů, adsorpoe na iontoměničíoh, aktivním uhlí apod·, extrakce, molekulární flltraoe aj. Například v britském patentním spise č. 1145512 je uveden iontoměnný postup, kterým se získává ve výtěžku okolo 50 % z vyfermentovaná půdy 99,8 $ní produkt. Po adsorpol se eliminují doprovodné aminokyseliny částečnou eluoí roztoku solí, eluát se čistí, krystalizuje a rekrystaluje. Nejčastěji používanou adsorpoí na silně kyselé katexy nebo na kombinaci dvou různýoh lonexú se získávají eluáty na bázi směsí vody a alkoholem a amoniakem, ze kterýoh se po čištění získá krystalický produkt (francouzský patentní spis č. 2 000 641, čs. autorské osvědčení č. 154425J Μ. B. Beker se sp·, Prikl. Bioohim. Mikrobiol. 7, 103).

197 373

197 373

Ve snaze získat jednoduchým a levným postupem tryptofan ve formě technického preparátu, vhodného pro krmné úěely, byl vypracován podle vynálezu způsob přípravy takového preparátu, a to z vyfermentovaná živná půdy po ukončené kultivaci produkčního mikroorganismu. Podstata vynálezu spočívá v tem, že se půda ve fázi maxima produkce inaktivuje okyselením na pH 1,2 až 4,0, s výhodou 2,0, s přísadou neianegenního nebo kationaktivního smáčedla a zahřátím na teplotu 50 až 90 °C, s výhodou 55 až 65 °C, po dobu 3 až 10 minut, potom se ochladí na teplotu 0 až 10 °C, s výhodou 4 až 6 °C, zfiltruje, filtrát se uvádí ve styk s katexem na bázi sulfonovaného kopolyméru styrenu s divinylbenzenem v H-oyklu, se kterého ze tryptofaa eluuje vodným roztokem amoniaku v konoentraoi 0,5 až 1 N, při teplotě 35 ež 45 °C, eluát se zahustí při teplotě nejvýže 40 °0 na obsah sušiny 15 až 20 %, načež se koncentrát zbaví vody, například v rozprašovací sušárně.

K úvodnímu okyselení půdy lze používat účelně kyseliny sírová, fosforečná, šíavelové nebo triohlorootové, jednotlivě, nebo ve vhodné kombinaoi·

Popsaná speciální předběžná úprava vyfermentovaná živná půdy, tj. okyselení, působení smáčedla a krátkodobé zahřátí, usnadní a urychlí odstranění rozpustných vysokomolekulárních balastů, hlavně bílkovin, čímž se podstatně usnadní následujíol adsorpoe a eluoe tryptofanu z katexu. Získá se eluát kvalitativně vhodný k přímému usušení na rozprašovací sušárně, čímž vznikne preparát s poměrně vysokým obsahem účinná látky, velmi málo hygroskopický, při uohovávéní za běžných podmínek stabilní, vhodný ke zpracování do premixů pro krmná směsí. V opačném případě, bez speolální úpravy půdy, se získá produkt téměř nevyhovující, hygroskopický, lepivý, nestabilní, jak vyplývá ze srovnávacího příkladu provedení

4. K odstranění rozpustných balastníoh látek z vyfermentovaná půdy se z neionogenníoh smáčedel osvědčila smáčedla typu polyethylenglykolsorbitanmonooleátu a z kationaktivních smáčedla typu kvartérních solí na bázi alkylarylamoníumhalogenidů.

Bližší podrobnosti způsobu podle vynálezu jsou patrná z příkladů provedení, která tento způeob pouze ilustrují, ale nijak neomezují.

Příklad 1

K 10 litrům vyfermentovaná půdy s obsahem 10,7 g tryptofanu v 1 litru bylo ihned po dosažení maxima produkoe přidáno 1 % (hmotnost/objam) kyseliny šíavelové a kyselina sírová do hodnoty pH 2,1 a přidána 3 % (hmotnost/objem) nelntogenního smáčedla (polyethylenglykolsorbitanmonooleátu). Takto upravená půda byla rychle zahřáta na 55 °0 · prodlevou 5 min·, potom rychle ochlazena na 5 °C a zfiltrována přes křemelinu. Zbytek na filtru byl promyt 1 litrem vody. Bylo získáno 9,5 litru filtrátu s obsahem tryptofanu 9,2 g/litr, celkem 87,4 tryptofanu, tj. výtěžek 61,7 % teorie.

Filtrát byl okyselen kyselinou sírovou na pH 1,3 a veden při teplotě 20 °C na sloupec

0,5 litru katexu v H-oyklu (a 2 % hmot. divinylbenzenu) rychlostí 1 litr/hod. X průniku θ*4 g/litr tryptofanu došlo po průtoku 3*5 litru filtrátu, k nasyoeni po průtoku 9*5 litru.

Katex byl potom promyt 0,5 litru vody 50 °0 teplé a bylo získáno oelksm 6,0 litru efluentu o konoentraoi 4,7 g (tj. 26,2 g tryptofanu).

197 373

Katex byl eluován 1,5 litru 0,6 N amoniaku o teplotě 40 °C, ryohlostí 0,5 litr/hod.

Bylo získáno 650 ml bohatého eluátu (frakce s vyšším obsahem než 10 g/litr tryptofanu) o koncentraci 78 g/litr (tj. 50,8 g tryptofanu). Ve zbývajících chudých eluátech bylo obsaženo 4,2 g tryptofanu. Bylo dosaženo kapacity pryskyřice 110 g/litr, výtěžnosti eluce 92,4 % a výtěžnosti adsorpce 92,9 %.

Bluát byl zahuštěn při teplotě nejvýše 38 °C na obsah sušiny 17 % hmot., čímž byla získána zpět část použitého amoniaku· Koncentrát byl pak usušen na rozprašovací sušárně při teplotách 125/70 °C. Bylo získáno 74 g technického preparátu o obsahu 65,8 % tryptofanu (3 % vlhkosti), tj. 48,7 g čistého tryptofanu. Výtěžnost zahuštění a sušení byla 95,9 %· Stabilita preparátu po 6 měsících skladování v uzavřeném obalu za normálních podmínek byla lepší než 95 %· Preparát byl jen mírně hygroskoplcký, při relativní vlhkosti 87 % se ustavila rovnovážná vlhkost preparátu na hodnotě 6,8 %.

Toxicita preparátu LDjq 2,92 g/kg (meze 2,64 až 3,23 g/kg).

Toxicita standardu (99%ního) LD^q 3,47 g/kg (meze 2,73 až 4,41 g/kg).

fřikilSá ž

Bylo zpracováno 10 litrů vyfermentováné půdy s obsahem 8,1 g tryptofanu v 1 litru postupem podle příkladu 1 s tím rozdílem, že místo kyseliny sírové a neiontogenního smáčedla bylo použito kyseliny fosforečné a kationaktivního smáčedla. Po úpřavě byla půda odstředěna na sedimentační odstředivce, -fylo získáno 7,2 litru filtrátu o koncentraci 7,8 g tryptofanu v 1 litru. Dalším zpracováním podle příkladu 1 byl získán preparát v odpovídajícím výtěžku a kvalitě, tj. nehygroskopioký a stabilní, vhodný k přípravě krmných premixů.

smaO

Vyfermentováná půda z příkladu 2 byla zpracována tak, že po dosažení maxima produkce byla okyselena 1 % (hmotnost/objem) kyseliny triohlorootové, 1 % (hmotnost/objem) kyseliny šíavelové a kyselinou fosforečnou na pH 2. Další postup byl shodný s příkladem 1. Průnik ze sloupoe při adsorpoi nastal po průtoku 75 % tryptofanu praktické kapacity sloupce, nasyceni bylo dosaženo po průtoku 160 % tryptofanu. Dalším zpracováním jako v příkladu 1 byl získán preparát v odpovídajícím výtěžku a kvalitě, vhodný pro výrobu krmných premixů.

ř.říMLftft 1

Vyfermentováná půda podle příkladů 1 nebo 2 byla okyselena kyselinou sírovou nebo ohlorovodíkovou na pH 1,4 a ihned vedena zdola na sloupeo katexu stejný jako v příkladu 1. Při adsorpoi ve vznosu za podmínek příkladu 1 došlo k průniku již po průtoku 20 až 28 % praktické kapacity tryptofanu, k nasycení po průtoku 250 až 320 % kapacity sloupoe pro txyptofan, oož nedávalo dobrý předpoklad pro vypracování technologického postupu. Dalším zpracováním podle příkladu 1 bylo získáno 71 g preparátu o obsahu 52 % tryptofanu. Bří relativní vlhkosti 87 % se ustavila rovnovážná vlhkost preparátu 17,0 % a preparát se slepil. Tento postup poskytl proti příkladům 1 až 3 nepříznivý výsledek.