MXPA99001912A

MXPA99001912A - Proteinas del lingando de la p-selectina.

Info

Publication number: MXPA99001912A
Application number: MXPA99001912A
Authority: MX
Inventors: R Larsen Glenn
Original assignee: Genetics Institute Llc; Inst Genetics Llc
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-08-29
Publication date: 2003-07-21
Also published as: JP2008099695A; JP4145356B2; US20030018181A1; US20080280327A1; US8232252B2; CA2263889A1; US7563760B2; WO1998008949A1; CA2263889C; AU4149297A; US20090104180A1; US7927835B2; US20090028883A1; JP2001500370A; EP0929670A1; US6277975B1; JP2009060914A; JP2012110338A

Abstract

La presente invención se refiere a una nueva glicoproteína del ligando P-selectina, comprendiendo la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID No. 2 o por la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID No. 4. También se describen secuencias de ADN que codifican para la proteína del ligando de la P-selectina, conjuntamente con vectores, células hospederas y métodos para preparar la proteína del ligando de la P-selectina. También se describen composiciones farmacéuticas que contienen proteína del ligando de la P-selectina y métodos para el tratamiento de estados de enfermedades inflamatorias caracterizados por la adhesión intercelular mediada por P-selectina y E-selecti

Description

PROTEÍNAS DEL LIGANDO DE LA P-SELECTINA Campo de ia Invención La presente invención se refiere al campo de las substancias antiinflamatorias que actúan mediante la inhibición de la adhesión de leucocitos a células endoteliales. Más particularmente, la presente invención está dirigida a novedosos ligandos para las proteínas mamíferas de adhesión que se conocen como selectinas.

Antecedentes de la Invención Durante la inflamación los leucocitos se adhieren al endotelio vascular y penetran el tejido endotelial, una interacción que es mediada por la unión específica de la selectina o la clase LEC-CAM de proteínas a ligandos en células objetivo. Dicha adhesión celular mediada por la selectina también ocurre en desordenes trombóticos y en enfermedades parasíticas y puede estar implicada en la dispersión metastática de células tumorales. Las proteínas selectinas están caracterizadas por un dominio similar al de la lectina con terminación N, un dominio similar al del factor de crecimiento epidermal , y regiones de homología para complementar proteínas dé unión. Hasta ahora han sido identificados tres proteínas selectinas humanas, E-Selectina (anteriormente ELAM-1 ), L-selectina (anteriormente LAM-1 ) y P-Selectina (anteriormente 'PADGEM o GMP-140). La E-selectina es inducida en células endoteliales varias horas ' después de la activación por citocinas, mediando la interacción dependiente de calcio entre neutrófilos y el endotelio. La L-selectina es el receptor guía del linfocito, y la P-selectina rápidamente aparece en la.superficie celular de las plaquetas cuando éstas son activadas, mediando la adhesión dependiente del calcio de los neutrófilos o monocitos a las plaquetas. La P-selectina también es encontrada en los cuerpos de Weibel-Palade de las células endoteliales; en su liberación de estas vesículas la P-selectina media la unión temprana de los neutrófilos a endotelio estimulado por histamina o trombina.

Se cree que las selectinas median la adhesión a través de interacciones específicas con ligandos presentes sobre la superficie de células objetivo. Generalmente los ligandos de las selectinas están compuestos cuando menos en parte de una fracción de carbohidrato. Por ejemplo, La E-se!ectina se une a carbohidratos que tiene la estructura terminal NeuAccc(2,3) Gaip(l ,4) GlcNAc — R Fuca( l ,3) y también a carbohidratos que tienen la estructura terminal NeuAcot(2,3) Gaip(l ,3) GlcNAcP( l ,3) — R Fuca(l ,4) en donde R = el resto de la cadena carbohidrato.. Estos carbohidratos son conocidos como antígenos de grupo sanguíneo y comúnmente son referidos como sialilo Lewisx y sialilo Lcwis\ respectivamente. La presencia del antígeno sialilo Lewis* solo sobre la superficie de una célula endotelial puede ser suficiente para promover la unión a una célula que expresa E-selectina. La E-selectina también se une a carbohidratos que tienen las estructuras terminales HS03 Galp( l ,4) GlcNAc— R HSO3-- Galp( l ,3) GlcNAc— R I y I Fuca(l ,3) Fuca(l ,4) Como con la E-selectina, cada selectina parece unirse a un intervalo de carbohidratos con afinidades variables. La fortaleza del evento de adhesión mediado por selectina (afinidad de unión) también puede depender de la densidad del carbohidrato y de la densidad de la selectina sobre la superficie de la célula. Las uniones de la P-selectina a carbohidratos conteniendo la forma no sialada del antígeno del grupo sanguíneo Lewisx y con elevada afinidad al sialilo Lewisx. La P-selectina también puede reconocer sulfátidos, los cuales son ceramidas heterogéneas de galactosilo sulfatado en 3, aisladas de células mieloides y células tumorales mediante extracción de lípidos. Sin embargo, la unión de células portando P-selectina a células portando ligandos de la P-selectina es anulada cuando las células que portan ligandos son tratadas con proteasas, indicando que el ligando de la P-selectina puede ser una glicoproteína. Dos ligandos de glicoproteínas putativas para la P-selectina han sido recientemente identificados, uno de los cuales ha sido parcialmente purificado, (Moore et al., J. Cell Biol. 1 1 8, 445-456 ( 1992)). Sin embargo, ni la composición de aminoácidos ni la secuencia de aminoácidos de estas glicoproteínas han sido descritas.

Objetivos de la Invención En una modalidad, la presente invención provee una composición que comprende un ADN aislado que codifica para una proteína del ligando de la P-selectina, dicha proteína comprendiendo la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 402. También se provee una composición que comprende un ADN aislado que codifica para una proteína del ligando de la P-selectina soluble, dicha proteína comprendiendo la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 310. La invención además provee una composición que comprende un ADN aislado que codifica para una proteína del ligando de la P-selectina madura, dicha proteína comprendiendo la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 402. En otra modalidad, la invención proporciona una composición que comprende un ADN aislado que codifica para una proteína del ligando de la P-selectina madura y soluble, dicha proteína comprendiendo la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 31 0. En otra modalidad, la invención proporciona una composición que comprende un ADN aislado que codifica para una proteína del ligando de la P-selectina, dicha proteína comprendiendo la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID No: 4. La invención además provee una composición que comprende un vector de expresión que comprende uno cualquiera de los ADN aislados de la invención, dicho ADN estando operativamente unido a una secuencia de control de expresión; una célula hospedera transformada con el vector de expresión conteniendo uno cualquiera de los ADN descritos anteriormente; y un proceso para producir la proteína del ligando de la P-selectina, el cual comprende: (a) cultivar una célula hospedera transformada con un vector de expresión conteniendo uno cualquiera de los ADN de la invención en un medio de cultivo apropiado; y (b) purificar dicha proteína del ligando de la P-selectina, de dicho medio de cultivo. En otra modalidad, la invención provee una composición que comprende una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 21 hasta el aminoácido 402, dicha proteína estando substancialmente libre de otras proteínas de mamífero. La invención además comprende una proteína soluble del ligando de la P-selectina que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 21 hasta el aminoácido 3 10, dicha proteína estando substancialmente libre de otras proteínas de mamífero. En otra modalidad, la invención comprende una proteína del ligando de la P-selectina que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 402, dicha proteína estando substancialmente libre de otras proteínas de mamífero. La invención también proporciona una composición que comprende una proteína del ligando de la P-selectina madura que comprenden la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 402, dicha proteína estando substancialmente libre de otras proteínas de mamífero. Adicionalmente se provee una composición que comprende una proteína madura y soluble del ligando de la P-selectina que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 3 10, dicha proteína estando substancialmente libre de otras proteínas de mamífero. En otra modalidad, la invención provee una composición que comprende una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No: 4. En todavía otra modalidad, la invención provee composiciones que comprenden anticuerpos específicos para proteínas del ligando de la P-selectína. En otra modalidad, la invención provee un método para la identificación de un inhibidor de la adhesión intercelular mediado por la P-selectina, el cual comprende: (a) combinar una proteína de la P-selectina con una proteína del ligando de la P-selectina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 402, la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 402, la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 310, y la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No: 4, dicha combinación formando una primera mezcla de unión; (b) medir el grado de unión entre la proteína de la P-selectina y la proteína del ligando de la P-selectina en la primer mezcla de unión; (c) combinar un compuesto con la proteína de la P-selectina y la proteína del ligando de la P-selectina para formar una segunda mezcla de unión; (d) medir el grado de unión en la segunda mezcla de unión; y (e) comparar los grados de unión en la primer mezcla de unión con el grado de unión en la segunda mezcla de unión. En donde el compuesto es capaz de inhibir la adhesión intercelular mediada por P-selectina cuando ocurre una disminución en el grado de unión de la segunda mezcla de unión. En otra modalidad, la invención provee un método para la identificación de un inhibidor de la adhesión intercelular mediada por la E-selectina, el cual comprende: (a) combinar una proteína de la E-selectina con una proteína del ligando de la E-selectina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 402, la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 402, la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 3 10, y la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No: 4, dicha combinación formando una primera mezcla de unión; (b) medir el grado de unión entre la proteína de la E-selectina y la proteína del ligando de la P-selectina en la primer mezcla de unión; (c) combinar un compuesto con la proteína de la E-selectina y la proteína del ligando de la P-selectina para formar una segunda mezcla de unión; (d) medir el grado de unión en la segunda mezcla de unión; y (e) comparar los grados de unión en la primer mezcla de unión con el grado de unión en la segunda mezcla de unión. En donde el compuesto es capaz de inhibir la adhesión intercelular mediada por E-selectina cuando ocurre una disminución en el grado de unión de la segunda mezcla de unión. Estos métodos también pueden ser usados para buscar inhibidores de la L-selectina mediante la substitución de la L-selectina por la E-selecüna. La invención también abarca procesos para la producción de proteínas del ligando de la P-selectina, los cuales comprenden (a)co-transformación de una célula hospedera con ADN que codifica para una proteína del ligando de la P-selectina y un ADN que codifica para una fucosiltransferasa capaz de sintetizar sialil Lewis X (sLe ) o sialil Lewis A (sLea) (tal como una fucosiltransferasa (alfal ,3/alfa 1 ,4) o una fucosiltransferasa (alfal ,3)), cada uno de los ADN estando operativamente ligado a una secuencia de control de expresión; (b)cultivar la célula hospedera en un medio de cultivo adecuado; y (c) purificar la proteína del ligando de la P-selectina del medio de cultivo. En ciertas otras modalidades, la célula hospedera es también co-transfectada con un ADN que codifica para una enzima de conversión de aminoácido básica emparejada y/o un ADN que codifica para una transferasa GlcNAc (preferiblemente una "transferasa core2"). En modalidades preferidas, la proteína del ligando de la P-selectina está en una forma de longitud completa o soluble. En otras modalidades, la presente invención incluye una proteína del ligando de la P-selectina que tiene actividad de proteína del ligando de la P-selectina. En modalidades preferidas, la proteína del ligando es una proteína que comprende la secuencia desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 60 de la SEQ ID No: 2, consistente esencialmente de la secuencia desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 60 de la SEQ ID No: 2, comprendiendo la secuencia desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 88 de la SEQ ID No: 2, consistente esencialmente en la secuencia desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 88 de la SEQ ID No: 2, consistente esencialmente en la secuencia desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 1 18 de la sea 2, o consistente esencialmente en la secuencia desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 189 de la SEQ ID No: 2. En otras modalidades preferidas, cuando menos uno de los residuos de asparragina en las posiciones 65, 1 1 1 y 292 de la SEQ ID No: 2 han sido eliminados o reemplazados. Ciertas modalidades preferidas de la proteína del ligando comprenden cuando menos uno de los residuos de tirosina en las posiciones 46, 48 y 51 de la SEQ ID No: 2. También son abarcados por la presente invención ADNs que codifican para estas proteínas del ligando de la P-selectina. células hospederas transformadas con dichos ADNs. procesos para la producción de proteína mediante el cultivo de tales células hospederas, composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas, métodos para la identificación de inhibidores de unión de selectina empleando las proteínas, anticuerpos para las proteínas y métodos para la inhibición de la unión mediada por selectina usando las proteínas. En todavía otras modalidades la invención proporciona un ADN aislado que codifica para una proteína de fusión que comprende (a) una primer secuencia de aminoácidos comprendiendo el aminoácido 42 hasta el aminoácido 60 de la SEQ ID No: 2, y (b)una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de una proteína distinta al ligando de la P-selectina. Preferiblemente, una secuencia de control de expresión está operativamente ligada a la secuencia de nucleótidos. También se proveen las células hospederas transformadas con dichos ADNs. La invención también provee un proceso para la producción de una proteína de fusión, el cual comprende: (a) cultivar la célula hospedera bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión; y (b) purificar la proteína de fusión del medio de cultivo. Las proteínas de fusión producidas de conformidad con tal proceso también son proveídas. En ciertas modalidades preferidas, la primer secuencia de aminoácidos de dicha proteína de fusión comprende del aminoácido 42 al aminoácido 402 de la SEQ ID No: 2, del aminoácido 42 al aminoácido 31 0 de la SEQ ID No: 2, del aminoácido 42 al aminoácido 88 de la SEQ ID No: 2, del aminoácido 42 al aminoácido 1 18 de la SEQ ID No: 2, o del aminoácido 42 al aminoácido 1 89 de la SEQ ID No: 2. En otras modalidades preferidas, el ADN comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No: 35 desde el nucleótido 123 hasta el nucleótido 939, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No: 35, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No: 37 desde el nucleótido 123 hasta el nucleótido 807, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No: 37, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No: 39 desde el nucleótido 123 hasta el nucleótido 131 1 , la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No: 39, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No: 41 desde el nucleótido 123 hasta el nucleótido 792, o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No: 41 . La presente invención también provee una proteína de fusión que comprende: (a) una primer secuencia de aminoácidos comprendiendo el aminoácido 42 hasta el aminoácido 60 de la SEQ ID No: 2, y (b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de una proteína distinta a la del ligando de la P-selectina. Preferiblemente, la primer secuencia de aminoácidos comprende desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 402 de la SEQ ID No: 2, la secuencia de aminoácidos que comprende desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 310 de la SEQ ID No: 2. desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 88 de la SEQ ID No: 2, aminoácido 42 al aminoácido 1 1 8 de la SEQ ID No: 2, o aminoácido 42 al aminoácido 189 de la SEQ ID No: 2. En ciertas modalidades particularmente preferidas, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 36 desde al aminoácido 42 hasta el aminoácido 3 1 3, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 36, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 38 desde el aminoácidos 42 hasta el aminoácido 269, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 38, la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No: 40 desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 437, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 40, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 42 desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 264, o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 42. En otras modalidades preferidas, la segunda secuencia de aminoácidos está unida a la terminación C o la terminación N de la primer secuencia de aminoácidos, con o sin estar unida mediante una secuencia de unión. En todavía otras modalidades, la segunda secuencia de aminoácidos es derivada de una proteína seleccionada del grupo consistente en un anticuerpo, una citocina, un factor de crecimiento, un factor de diferenciación, una hormona, una enzima, un receptor o un fragmento de ello y un ligando. Preferiblemente, la segunda secuencia de aminoácidos es derivada de la secuencia de un anticuerpo, procedente de la porción Fe de un anticuerpo, o es una mutación de una secuencia derivada de un anticuerpo. En todavía otras modalidades, la presente invención provee una composición que comprende (a) un primer péptido que comprende del aminoácido 42 al aminoácido 60 de la seq2, y (b) un segundo péptido derivado de la secuencia de una proteína distinta al ligando de la P-selectina, en donde el primer péptido y el segundo péptido están químicamente unidos por una fracción distinta a un enlace péptido. Cualquier proteína del ligando de la P-selectina de la invención puede ser usada en dicha composición.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una gráfica que compara la unión de proteínas del ligando de la P-selectina expresadas con y sin core2. La Figura 2 es una autoradiografía de inmunoprecipitaciones de proteína del ligando de la P-selectina expresada con y sin core2. La Figura 3 describe los resultados del análisis de citometría de flujo del enlace de proteína del ligando de la P-selectina (expresada con y sin core2) para P-selectina/quimera de IgG (LEC-?? ) y anticuerpo monoclonal de proteína del ligando de anti-P-selectina (Mab 275).

La Figura 4 es una autoradiografía de proteínas, incluyendo proteína del ligando de la P-selectina, la cual se unió a P- y E-selectina/IgG quimeras. La Figura 5 es una representación esquemática de características estructurales de la proteína del ligando de la P-selectina de longitud completa de la SEQ ID No: 2. La Figura 6 es una representación esquemática de varios fragmentos de proteína del ligando de la P-selectina construidos con el propósito de examinar el papel de los sitios de glicosilación con enlace N en la unión de las proteínas del ligando de la P-selectina a selectinas. La Figura 7 describe los resultados de experimentos para determinar el papel de los sitios de glicosilación con enlace N en la unión de las proteínas del ligando de la P-selectina a selectinas. La Figura 8 es una representación esquemática de varios fragmentos de proteína del ligando de la P-selectina construidos con el propósito de examinar el papel de residuos de tirosina sulfatados en la unión de las proteínas del ligando de la P-selectina a selectinas. Las Figuras 9- 1 1 describen los resultados de experimentos para determinar el papel de residuos de tirosina sulfatados en la unión de proteínas del ligando de la P-selectina a selectinas. La Figura 12 es una representación esquemática de varios fragmentos de proteína del ligando de la P-selectina construidos con el propósito de examinar los efectos de varias deleciones en la unión de las proteínas del ligando de la P-selectina a selectinas. La Figura 13 es una descripción esquemática del ensayo de unión de placa cuantitativa del Ejemplo 4(c), Las Figuras 14-17 describen los resultados de experimentos que comparan la unión de varias proteínas del ligando de la P-selectina suprimidas y alteradas, a selectinas. La Figura 1 8 es una representación esquemática de varios fragmentos de proteína del ligando de la P-selectina construidos con el propósito de examinar los efectos de la alteración de residuos de tirosina en la región aniónica de las proteínas del ligando de la P-selectina en la unión de selectina. Las Figuras 19-21 describen los resultados de experimentos que comparan la unión de varias proteínas del ligando de la P-selectina suprimidas y alteradas, a selectinas. La Figura 22 describe un modelo propuesto para la unión de proteínas del ligando de la P-selectina a P- E-selectina. Las Figuras 23 y 24 describen los resultados de experimentos que comparan la unión de varias proteínas del ligando de la P-selectina suprimidas y alteradas, a selectinas. Algunas de las figuras precedentes emplean una numeración convencional de aminoácidos dentro de las construcciones descritas que son diferentes a aquel de la numeración del residuo que se emplea en la SEQ ID No: 2. En las figuras, los residuos están numerados usando el primer aminoácido del ligando de la P-selectina maduro y soluble como punto de inicio. De aquí, los números del residuo usados en las figuras son 41 menos que aquellos de la SEQ ID No: 2. Por ejemplo, el residuo 1 en las figuras corresponde al residuo 60 en la SEQ ID No: 2. La Figura 25 es un análisis de los productos de expresión de células CHO, ya expresando fucosiltransferasa 3/4 y transferasa Core2, que fueron transfectadas con psPSL.T7, ???, 13 16 o psPSL.QC y amplificadas usando metotrexato. Medio de cultivo acondicionado fue ya sea analizado directamente o primeramente precipitado con LEC-?? y posteriormente analizado mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras y reductoras. La Figura 26, Ilustra la separación SDS-PAGE de afinidad de proteínas de membrana de células mieloides capturada mediante P- y E-selectina. Se prepararon lisatos de membrana a partir de células U937 metabólicamente marcadas con 3H-glucosamina y sometidas a precipitación de afinidad con P- y E-selectina inmovilizadas e IgGi humano de control. Proteínas eludadas fueron tratadas con DTT ("reducido") o sin DTT ("no reducido") antes de la electroforesia en gel. Sendas: 1 , captura de afinidad mediante IgG | humano; 2, captura de afinidad mediante P-selectina; 3, captura de afinidad mediante E-selectina. La Figura 27. Ilustra experimentos de captura de afinidad secuencial. Especies de lisato U937 marcadas con 3H fueron capturadas por afinidad mediante P-selectina o E-selectina. eludadas y posteriormente sometidas a inmunoprecipitación con antisuero Rb3443 de anti-PSGL- 1 . Sendas: 1 y 22, inmunoprecipitaciones de control de lisatos de membrana de célula mieloide fresca usando suero de conejo pre-inmune (senda 1 ) y Rb3443 (senda 2); 3-5, inmunoprecipitación con Rb3443 de lisatos de membrana de célula mieloide previamente capturados por afinidad y dudados de P-selectina (senda 3), E-selectina (senda 4) e Igd humano (senda 5). La Figura 28 ilustra una comparación del contenido de CD43 y PSGL-1 de extractos de membrana de célula mieloide. Extractos de célula U937 marcados fueron inmunoprecipitados con anticuerpo Rb3443 policlonal de conejo anti-PSGL- 1 o un Mab de ratón anti-CD43 y posteriormente sometido a SDS-PAGE/autoradiografía. Sendas: 1 , inmunoprecipitación con suero de conejo pre-inmune de control; 2, inmunoprecipitación con Rb3443; 3, inmunoprecipitación con anticuerpo de ratón de control emparejado con isotipo; 4, inmunoprecipitación con anticuerpo de anti-CD43. La Figura 29 ilustra experimentos de transfección de COS. Células M6 de COS transféctadas con plásmidos que codifican para PSGL- 1 o CD43 así como también Fuc-TIlI o Fuc-TVII fueron metabólicamente marcadas con 35S-metionina, y se prepararon membranas mediante experimentos de captura por afinidad como se describe en Materiales y Métodos. Los ADNcs empleados en las transfecciones son indicados anteriormente como sendas. Se realizaron precipitaciones usando Mab de anti-CD43 y antisuero Rb3443 (A) E-selectina, (B) P-selectina y (C) anti-PSGL- 1 . La Figura 30 resume los resultados del tamizaje de varias proteínas del ligando de la P-selectina para la inhibición de la unión de P- y E-selectina (ver Ejemplo 13).

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas de la Invención Los presentes inventores han identificado por vez primera y aislado un nuevo ADN que fica para una proteína que actúa como un ligando para P-selectina en plaquetas y células endoteliales humanas. La secuencia de ADN es representada en SEQ ID No: 1 . La secuencia completa de aminoácidos de la proteína del ligando de la P-selectina (esto es, el péptido maduro más la secuencia líder) está caracterizada por la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID No: 2, desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 402. El análisis de hidrofobicidad y la comparación con patrones de división conocidos pronostican una secuencia señal de 20 a 22 aminoácidos, esto es, aminoácido 1 a 20 o aminoácidos 1 a 22 de la SEQ ID No: 2. La proteína del ligando de la P-selectina contiene un sitio de división PACE (enzima de conversión de aminoácido básica emparejada) (-Arg-Asp-Arg-Arg-) en los aminoácidos 38-41 de la SEQ ID No: 2. La proteína madura del l igando de la P-selectina de la presente invención está caracterizada por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No: 2 desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 402. Una forma soluble de la proteína del ligando de la P-selectina está caracterizada por contener los aminoácidos 21 a 310 de la SEQ ID No: 2. Otra forma soluble de la proteína del ligando de la P-selectina madura está caracterizada por la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No: 2 desde el aminoácido 42 al aminoácido 310. La forma soluble de la proteína del ligando de la P-selectina está además caracterizada por ser soluble en solución acuosa a temperatura ambiente. Por supuesto, las correspondientes secuencias de ADN como se representa en la SEQ ID No: 1 que codifican para estas proteínas también están incluidas en la presente invención. El ligando de la P-selectina de la invención es una glicoproteína que puede contener uno o más de los siguientes carbohidratos terminales.

NeuAca(2,3) Gal ß(1 ,4) GlcNAc— R l a( l ,3) Fue NeuAca(2,3) Gal ß(1 ,3) GlcNAc— R | a( l ,4) Fue Gal ß( 1 ,4) GlcNAc— R | a(? ,3) Fue Gal ß(1 ,3) GlcNAc — R ? (1 ,4) Fue en donde R = al resto de la cadena carbohidrato, que está covalentemente unida ya sea directamente a la proteína del ligando de la P-selectina o a una fracción de lípido que está covalentemente unida a la proteína del ligando de la P-selectina. La glicoproteína del ligando de la P-selectina de la invención puede adicionalmente estar sulfatada o de alguna otra manera modificada en forma post-traducción. Como está expresada en células CHO y COS, la proteína del ligando de la P-selectina de longitud completa (aminoácidos 1 a 402 de la SEQ ID No: 2 o aminoácidos 42 al 402 de la SEQ ID No: 2 es una proteína heterodimérica que tiene un peso molecular aparente de 220 kD como se muestra por SDS-electroforesia en gel de poliacrilamida no reductor. La estructura de la proteína del ligando de la P-selectina de longitud completa es esquemáticamente representado en la Figura 5. Tres regiones de la proteína del ligando de la P-selectina de la SEQ ID No: 2 son: un dominio extracelular (desde aproximadamente el aminoácido 21 al 3 10 de la SEQ ID No: 2), un dominio transmembranoso (desde aproximadamente el aminoácido 3 1 1 al 332 de la SEQ ID No: 2) y un dominio citoplásmico, intracelular (desde aproximadamente el aminoácido 333 al 402 de la SEQ ID No: 2). El dominio extracelular contiene tres sitios tripéptido de consenso (Asn-X-Ser/Thr) de glicosilación potencial con enlace N, comenzando en los residuos Asn 65, 1 1 1 y 292. El dominio extracelular además contiene tres sitios potenciales de sulfatación de tirosina en los residuos 46. 48 y 51 . La región comprendida de los residuos 55-267 contiene un elevado porcentaje de prolina, serina y treonina incluyendo un subdominio de quince repeticiones decaméricas de la secuencia de consenso de diez aminoácidos Ala-Thr/Met-Glu-Ala-Gln-Thr-Thr-X-Pro/Leu-Ala/Thr, en donde X puede ser ya sea Pro, Ala, Gln, Glu o Arg. Las regiones tales como estas son características de proteínas altamente O-glicosiladas. Células COS o CHO co-transfectadas con un gene que codifica la proteína del ligando de la P-selectina y un gene que codifica para la fucosiltransferasa (de aquí en adelante FT), preferiblemente una fucosiltransferasa (alfal ,3/alfal ,4) ("3/4FT") son capaces de unirse a células CHO que expresan P-selectina sobre sus superficies, pero no son capaces de unirse a células CHO que no expresan P-selectina sobre sus superficies. Con el objeto de unirse a P-selectina, ya sea en forma purificada o expresadas sobre la superficie de las células CHO, el gene que codifica para la proteína del ligando de la P-selectina debe ser co-transfectada con el gene que codifica para una FT, puesto que la transfección de cualquier gene en la ausencia del otro ya sea elimina o reduce substancialmente la actividad de unión de la P-selectina. La unión de la proteína del ligando de la P-selectina de la invención a P-selectina puede ser inhibida por EDTA o mediante un anticuerpo monoclonal de neutralización específico para la P-selectina. La unión de la proteína del ligando de la P-selectina de la invención a la P-selectina no es inhibida por un anticuerpo monoclonal de no neutralización, específico para P-selectina o por un control de isotipo. Estos resultados caracterizan la especificidad de unión de la proteína del ligando de la P-selectina de la invención. Para los propósitos de la presente invención, una proteína es definida como que tiene "actividad de proteína del ligando de la P-selectina", esto es, variablemente referido aquí como una "proteína del ligando de la P-selectina". o como una "glicoproteína del ligando de la P-sclectina" o simplemente como un "ligando de la P-selectina", cuando se une en una forma dependiente de calcio a P-selectina que está presente sobre la superficie de las células como en el ensayo de unión de P-selectina de CHO del Ejemplo 4, o a P-selectina que está fija a otra superficie, por ejemplo, como la proteína quimérica de P-selectina-IgGyl del Ejemplo 4 está fija a cajas de Petri. El estado de glicosilación de la proteína del ligando de la P-selectina de la invención fue estudiado usando una forma quimérica soluble de la proteína del ligando de la P-selectina, descrita con detalle en el Ejemplo 5(C) y designada sPSL.T7. La proteína sPSL.T7 producida a partir de células COS co-transfectadas con 3/4FT es extensamente modificada por glicosilación post-traducción, como se describe con detalle en el Ejemplo 6(C). Por lo tanto, se cree que ambas cadenas de oligosacárido con enlace N- y con enlace O, cuando menos alguna de las cuales están sialadas, están presentes en la proteína del ligando de la P-selectina de la invención. La proteína del ligando de la P-selectina de la invención también puede estar unida a E-selectina y L-selectina. Medio de cultivo acondicionado procedente de células COS que han sido co-transfectadas con ADN que codifica para sPSL.T7 o fusiones del ligando de la P- selectina-Ig y con ADN que codifica para 3/4FT, cuando están recubiertas sobre pozos de placas de microtitulación de plástico, hace que células CHO que expresan E-selectina se unan a las placas; sin embargo, las células CHO que no expresan E-selectina no se unen a dicha placas. La unión de las células CHO que expresan E-selectina a placas de microtitulación recubiertas con medio de cultivo acondicionado procedente de células COS que han sido co-transíecladas con ADN que codi fica para sPSL.T7 y con el ADN que codifica para 3/4 FT es anulada en la presencia de EDTA o un anticuerpo de neutralización específico para E-selectina. Medio de cultivo acondicionado de células COS transfectadas solamente con el ADN de sPSL.T7 no causa la unión de células CHO que expresan E-selectina cuando es recubierto sobre pozos de placas de microtitulación. Por estas razones, se cree que la proteína del ligando de la P-selectina de la invención es útil como un inhibidor de la adhesión intercelular mediada por E-selectina en adición a la adhesión intercelular mediada por P-selectina. Anticuerpos creados contra proteína del li gando de la P-selectina, soluble y producida en células COS, son inmunoreactivos con la mayor glicoproteína HL-60 que específicamente se une a P-selectina como se determinó por captura por afinidad usando una quimera Fe inmovilizada de P-selectina. Las células U937 ostentan un ligando de glicoproteína inmunoreactiva similar, Así, una sola especie de glicoproteína es observada en elución con EDTA de P-selectina inmovilizada previamente incubada con extractos detergentes de células U937 marcadas con 3H-glucosamina, Esta especie mayor presenta un peso molecular aparente por SDS-PAGE de 220 kD bajo condiciones no reductoras y de 100 kD bajo condiciones reductoras. Como con la especie comparable aislada de células HL-60, este ligando de U937 es inmunoreactivo con un anticuerpo policlonal producido contra proteína del ligando de la P-selectina recombinante de COS. Además,, la captura por afinidad de ligandos de E-selectina de células U937 y preparaciones de membrana de célula, usando una quimera Fe inmobilizada de E-selectina, produjeron una sola especie mayor con masa idéntica y comportamiento electroforético como el ligando de la P-selectina de U937 mayor. Así, la E- y P-selectina reconocen el mismo ligando de glicoproteína mayor en células U937, un ligando de glicoproteína inmunoreactiva con un anticuerpo de proteína del ligando de anti-P-selectina y poseyendo la misma masa aparente y comportamiento electroforético que la proteína del ligando de la P-selectina recombinante y de longitud completa. Fragmentos de la proteína del ligando de la P-selectina que son capaces de interactuar con la P-selectina o los cuales son capaces de inhibir la adhesión intercelular mediada por la P-selectina también son abarcados por la presente invención. Dichos fragmentos comprenden los aminoácidos 21 a 54 de la SEQ ID No. 2, una región de la proteína del ligando de la P-selectina que tiene una baja frecuencia de residuos de serina y treonina; aminoácidos 55 a 127 de la SEQ ID No. 2, teniendo una alta frecuencia de prolina, serina y treonina además de dos secuencias de consenso para glicosilación con enlace a asparragina (Asn-X-Ser/Thr); otro fragmento más grande, aminoácidos 1 28 a 267 de la SEQ ID No. 2, teniendo tanto una elevada frecuencia de prolina, serina y treonina, como conteniendo quince repeticiones de la siguiente secuencia de consenso de diez aminoácidos: Ala-(Thr/Met)-Glu-Ala-Gln-Thr-Thr-(Pro/Arg/Gln/Ala/Glu)-(Leu/Pro)-(Ala< hr) (fragmentos más pequeños dentro de este fragmento grande también pueden retener la capacidad de interactuar con la P-selectina o actuar como inhibidores de la adhesión intercelular mediada por P-selectina); la región conteniendo una secuencia de consenso para glucosilación con enlace a asparragina y comprendiendo los aminoácidos 268 a 308 de la SEQ ID No. 2; la región hidrofóbica de la proteína representada por los aminoácidos 309 a 333 de la SEQ ID No. 2; y la región anfofílica de la proteína del ligando de la P-selectina desde el aminoácido 334 al 402 de la SEQ ID No. 2. Fragmentos adicionales pueden comprender del aminoácidos 43 al aminoácido 56 de la SEQ ID No. 2 o del aminoácido 42 al aminoácido 60 de la SEQ ID No. 2, con una o más tirosinas sulfatadas o fosforiladas (Domcheck et al., Biochemistry 31 :9865-9870 ( 1992)) en el aminoácido 46, aminoácido 48 y/o aminoácido 5 1 . Fragmentos de la proteína del ligando de la P-selectina pueden estar en la forma lineal o pueden ser ciclizados usando métodos conocidos, por ejemplo, como se describe en H. U, Saragovi, et al. Bio/Technology 10, 773-778 ( 1992) y en R.S. McDo elh et al., J. Amer. Chem. Soc.JJ 4, 9245-9253 (1992), ambos de los cuales se incorporan aquí como referencia. Para los propósitos de la presente invención, todas las referencias a "proteína del ligando de la P-selectina" aquí incluye fragmentos capaces de unirse a P-selectina.

Tales fragmentos pueden ser fusionados a moléculas portadoras tales como las inmunoglobulinas, para incrementar la valencia de los sitios de unión del ligando de la P-selectina. Por ejemplo, formas solubles de la proteína del ligando de la P-selectina tales como los fragmentos desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 295 o desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 88 de la SEQ ID No. 2 pueden ser fusionados a través de secuencias "ligadoras" a la porción Fe de una inmunoglobulina (secuencia nativa o secuencias mutadas para conferir cualidades deseable (tales como vida media más larga o inmunogenicidad reducida) a la quimera resultante). Para una forma bivalente de la proteína del ligando de la P-selectina , dicha fusión podría ser a la porción Fe de una molécula IgG como en el Ejemplo 5(D) y en la SEQ ID No. 6. Otros isotipos de inmunoglobulina también pueden ser usados para generar tales fusiones. Por ejemplo, una fusión proteína del ligando de la P-selectina-IgM generaría una forma decavalente de la proteína del ligando de la P-selectina de la invención. También pueden ser construidas fusiones de cualquiera de las proteínas del ligando de la P-seleclina de la presente invención a secuencias de aminoácidos derivadas de otras proteínas. Las proteínas del ligando de la P-selectina preferidas para tales propósitos incluyen los fragmentos desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 295 o desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 88 de la SEQ ID No. 2. Las proteínas de fusión deseable pueden incorporar una secuencia de aminoácidos procedente de proteínas que tienen una actividad biológica diferente de aquella del ligando de la P-selectina , tal como, por ejemplo, las citocinas, factores de crecimiento y diferenciación (tales como proteínas morfogenéticas de hueso (por ejemplo, BMPs), hormonas, enzimas, componentes o fragmentos de receptores y otros ligandos. También, la proteína del ligando de la P-selectina puede ser químicamente acoplada a otras proteínas o agentes farmacéuticos. En dicha utilización, la proteína del ligando de la P-selectina , en virtud de la habilidad de interactuar con moléculas de selectina, altera las farmacocinética y/o biodistribución del agente fusionado o acoplado, mejorando de esta forma su eficacia terapéutica. Por ejemplo, la fusión de una secuencia de la proteína del ligando de la P-selectina a una secuencia de citocina puede dirigir la actividad de la citocina a una área de inflamación. En dicha circunstancia, la porción de la proteína del ligando de la P-selectina de la proteína de fusión se unirá a selectinas expresadas en el sitio de inflamación. Esta unión causará que la porción de citocina de la proteína de fusión sea localizada y esté disponible para unirse a su receptor análogo o cualquier superficie celular próxima. Otros ligandos podrían ser usados de manera similar en dichas proteínas de fusión para atraer células que expresen sus correspondientes receptores a un sitio de expresión de P-selectina . En el Ejemplo 15 se describen ejemplos preferidos de tales fusiones. En cualquier proteína de fusión que incorpora una proteína del ligando de la P-selectina, la secuencia de aminoácidos derivada de una proteína o proteínas distintas a la del ligando de la P-selectina puede ser unida ya sea a la terminación C o a la terminación N de la secuencia derivada del ligando de la P-selectina. El enlace puede se directo (esto es, sin una secuencia de unión que intervenga y no derivada de ninguna proteína) o a través de una secuencia de unión. También son contemplados por la presente invención métodos de tratamiento de un sujeto mamífero empleando dichas proteínas de fusión. En tales instancias, la proteína de fusión es utilizada para tratar una condición que es afectada por la proteína a la cual se fusiona la proteína del ligando de la P-selectina. Por ejemplo, una fusión de una proteína del ligando de la P-selectina a una IL- 1 1 podría ser usada para localizar la actividad de la IL- 1 1 para células endoteliales de médula ósea que expresan selectinas sobre sus superficies. Una vez localizada, la porción de IL- 1 1 de la proteína de fusión estimulará progenitoras de megacariocito. De manera similar, una fusión de una proteína del ligando de la P-selectina a una BMP podría ser usada para estimular la formación de hueso o cartílago en una área de daño. Los tejidos dañados expresan P-selectina que se unirá a la proteína de fusión. Una vez localizada, la porción de BMP de la proteína de fusión estimulará la producción de hueso o cartílago en el área de daño. Como se detalla en los Ejemplos de más adelante, la proteína del ligando de la P-selectina de la invención fue obtenida inicialmente usando un planteamiento de clonación por expresión (Clark et al., patente de los E.U.A. No. 4,675,285). Una biblioteca de ADNc fue construida a partir de la línea celular promielocítica humana HL-60 (S.J. Collins, et al., Nature 270, 347-349 ( 1997), ATCC No. CCL 240). Esta biblioteca fue cotransfectada en células COS con un ADN que codifica un 3/4 FT, y los cotransfectantes fueron tamizados para unirse a una molécula quimérica consistente en la porción extracelular de la P-selectina y la porción Fe de un anticuerpo monoclonal de IgGy l humano. Los cotransfectantes que se unieron a la P-selectina quimérica fueron enriquecidos para ADNc que codificaba para la proteína del ligando de la P-selectina. Este proceso de tamizaje fue repetido varias veces para enriquecer la población de plásmido adicionalmente para ADNcs que codificaban para la proteína del ligando de la P-selectina . En una segunda etapa de clonación, la población de plásmido enriquecida fue otra vez cotransfectada en células COS con gene 3/4FT y se tamizó para la unión a una línea celular CHO marcada fluroescentemente y que expresaba P-selectina sobre la superficie de la célula. Una sola clona de ADNc se obtuvo a partir de este planteamiento y se designó como pMT21 :PL85. El plásmido pMT21 :PL85 fue depositado en la American Type Culture Collection el 16 de octubre de 1 92 y se le dio en número de acceso ATCC 69096. Un nuevo ADN de la presente invención se presenta en la SEQ ID No. 1. El ADN de la presente invención puede codificar para una variedad de formas de la proteína del ligando de la P-selectina. Por ejemplo, en una modalidad, el ADN de la invención codifica la proteína del ligando de la P-selectina completa y teniendo la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID No. 2 desde al aminoácido 1 al aminoácido 402. En otra modalidad, el ADN de la invención codifica para una forma de la proteína del ligando de la P-selectina que carece de la secuencia señal y la cual está caracterizada por la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID No. 2 desde al aminoácido 21 al amino¿ícido 402. En todavía otra modalidad, el ADN de la invención codifica la proteína madura del ligando de la P-selectina caracterizada por la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID No. 2 desde al aminoácido 42 al aminoácido 402. Otra modalidad, el ADN de la invención codifica para una forma soluble de la proteína del ligando de la P-selectina caracterizada por la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID No. 2 desde al aminoácido 1 al aminoácido 310. El ADN de la invención también se materializa en un ADN que codifica para una forma soluble de la proteíria madura del ligando de la P-selectina, dicha proteína estando caracterizada por la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID No. 2 desde al aminoácido 42 al aminoácido 310. El ADN de la invención es además materializado en un ADN que codifica para una forma soluble de la proteína del ligando de la P-selectina que carece de la secuencia señal, dicha proteína estando caracterizada por la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID No. 2 desde al aminoácido 21 al aminoácido 310. El ADN de la invención está libre de asociación con otros ADNs humanos y así se caracteriza como un ADN aislado. Como se detalló anteriormente, los ADNs que codifican para fragmentos del ligando de la P-selectina que interactúan con la P-selectina también están incluidos en la presente invención. Se ha observado la expresión de transcriptos de AR m de proteína del ligando de la P-selectina en una variedad de líneas celulares humanas (HL-60, THP-1 , U937) y en monocitos humanos y leucocitos polimorfonucleares mediante análisis Northern usando una sonda de ADNc de proteína del ligando de la P-selectina . En todas estas líneas celulares, se ha observado un transcripto mayor de 2.5 kb. Una especie menor de aproximadamente 4 kb se observó en las líneas celulares HL60 y U937 y en leucocitos polimorfonucleares. En contraste, no se detecto expresión de ARNm del ligando de la P-selectina en la línea celular HepG2 de hepatoblastoma humana. La proteína del ligando de la P-selectina de la invención es codificada por un solo gene y no es parte de una familia de genes múltiples, según se determinó por al análisis Southern blot. La forma genómica de la proteína del ligando de la P-selectina de la invención contiene un intrón grande de aproximadamente 9 kb localizado en el nucleótido 54 en la región 5' no traducida. En monocitos y leucocitos polimorfonucleares, la proteína del ligando de la P-selectina de la invención es codificada por la secuencia de ADN representada en la SEQ ID No. 3. En esta modalidad, la proteína del ligando de la P-selectina contiene dieciséis regiones repetidas. El ADN aislado de la invención es correspondientemente materializada también en la secuencia de ADN representada en la SEQ ID No. 3 y está contenida en el plásmido pPL85R16, que fue depositado en la American Type Culture Collection el 22 de octubre de 1993 y se le dio en número de acceso ATCC 75577. La invención también abarca variantes alélicas del ADN aislado como se representa en la SEQ ID No. 1 o del ADN aislado como se representa en la SEQ ID No. 3, esto es, formas alternativas que ocurren en forma natural del ADN aislado de la SEQ ID No. 1 o la SEQ ID No. 3 ; las cuales también codifican para proteínas que tienen actividad del ligando de la P-selectina . También están incluidas en la invención ADNs que hibridizan al ADN representado en la SEQ ID No. 1 o al ADN representado en la SEQ ID No. 3 bajo condiciones astringentes (por ejemplo 4xSSC a 65 °C o 50% de formamida y 4xSSC a 42 °C), o relajadas (4xSSC a 50 °C o 30-40% de formamida a 42 °C), y los cuales tienen actividad de la proteína del ligando de la P-selectina. Las secuencias de ADN aislado que codifican para la proteína del ligando de la P-selectina pero que difieren del ADN representado en la SEQ ID No. 1 o del ADN representado en la SEQ ID No. 3 en virtud de la degeneración del código genético y las cuales tienen actividad de proteína del ligando de la P-selectina también son abarcadas por la presente invención. También están incluidas en la invención las variaciones en el ADN como se representa en la SEQ ID No. 1 o el ADN como se representa en la SEQ ID No. 3, las cuales son causadas por mutaciones puntuales o mediante modificaciones inducidas que mejoran la actividad de proteína del ligando de la P-selectina , vida media o nivel de producción. Para los propósitos de la presente invención, todas las referencias hechas aquí al "ADN de la SEQ ID No. 1 " incluyen, además de ADNs comprendiendo la secuencia de ADN específica representada en la SEQ ID No. 1 , ADNs que codifican para la proteína madura del ligando de la P-selectina de la SEQ ID No. 2; ADNs que codifican para fragmentos de la proteína del ligando de la P-selectina de la SEQ ID No. 2 que son capaces de unirse a P-selectina ; ADNs que codifican para formas solubles de la proteína del ligando de la P-selectina de la SEQ ID No. 2, variantes alélicas de la secuencia de ADN de la SEQ ID No. 1 ; ADNs que hibridizan a la secuencia de ADN de la SEQ ID No. 1 y los cuales codifican proteínas que tienen actividad del ligando de la P-selectina; ADNs que difieren del ADN de la SEQ ID No. 1 en virtud de la degeneración del código genético; y las variaciones de la secuencia de ADN de la SEQ ID No. 1 representada anteriormente. De manera similar, todas las referencias al "ADN de la SEQ ID No. 3" incluyen, además de la secuencia específica representada en la SEQ ID No. 3, ADNs que codifican para la proteína madura del ligando de la P-selectina de la SEQ ID No. 4; ADNs que codifican para fragmentos de la proteína del ligando de la P-selectina de la SEQ ID No. 4 que son capaces de unirse a P-selectina; ADNs que codifican para formas solubles de la proteína del ligando de la P-selectina de la SEQ ID No. 4, variantes alél icas del ADN de la SEQ ID No. 3 ; ADNs que hibridizan a la secuencia de ADN de la SEQ ID No. 3 y los cuales codifican proteínas que tienen actividad del ligando de la P-selectina; ADNs que difieren del ADN de la SEQ ID No. 3 en virtud de la degeneración del código genético; y las variaciones del ADN de la SEQ ID No. 3 representada anteriormente. Un ADN que codifica para una forma soluble de la proteína del ligando de la P-selectina puede ser preparado mediante expresión de un ADN modificado en el que las regiones de codificación de los dominios de transmembrana y citoplásmico de la proteína del ligando de la P-selectina son suprimidos y/o un codón tope es introducido en 3 ' al codón para el aminoácido en el término carboxi del dominio extracelular. Por ejemplo, el análisis de hidrofobicidad pronostica que la proteína del ligando de la P-selectina representada en la SEQ ID No. 2 tiene un dominio de transmembrana compuesto de los aminoácidos 31 1 a 332 de la SEQ ID No. 2 y un dominio citoplásmico compuesto de los aminoácidos 333 al 402 de la SEQ ID No. 2. Un ADN modificado como se describió anteriormente puede prepararse mediante técnicas estándar de biología molecular, incluyendo métodos de mutagénesis directa del sitio, los cuales son conocidos en la técnica, o mediante la reacción en cadena de polimerasa usando primarios de oligonucleótido apropiados. Los métodos para producir varios ADNs que codifican diversas proteínas solubles del ligando de la P-selectina se presentan en el Ejemplo 5. Un ADN que codifica para otros fragmentos y forma alteradas de proteína del ligando de la P-selectina pueden prepararse mediante expresión de ADNs modificados en las que han sido suprimidas o alteradas porciones de la secuencia de longitud completa. Pueden efectuarse deleciones importantes de la secuencia de la proteína del ligando de la P-selectina en tanto que se mantenga la actividad de proteína del ligando de la P-selectina. Por ejemplo, proteínas del ligando de la P-selectina comprendiendo la secuencia del aminoácido 42 al aminoácido 189 de la SEQ ID No. 2, la secuencia del aminoácido 42 al aminoácido 1 18 de la SEQ ID No. 2, o la secuencia del aminoácido 42 al aminoácido 89 de la SEQ ID No. 2 retienen la actividad de unión de proteína de la P-selectina y la capacidad de unirse a E-selectina. Las proteínas del ligando de la P-selectina en las que uno o más sitios de glucosilación con enlace N (tales como aquellos en los aminoácidos 65, 1 1 1 y 292 de la SEQ ID No. 2) han sido cambiados a otros aminoácidos o suprimidos también retienen la actividad de unión a proteína de la P-selectina, así como la capacidad de unirse a E-selectina. Las proteínas del ligando de la P-selectina que comprenden del aminoácido 42 al aminoácido 60 de la SEQ ID No. 2 (la cual incluye una región altamente aniónica de la proteína desde el aminoácido 45 hasta el aminoácido 58 de la SEQ ID No. 2) también conserva actividad de protema del ligando de la P-selectina, sin embargo, proteínas del ligando de la P-selectina limitadas a dicha secuencia no se unen a E-selectina. Preferiblemente, una proteína del ligando de la P-selectina retiene cuando menos uno (más preferiblemente cuando menos dos y más preferiblemente cuando menos tres) de los residuos tirosina encontrados en los aminoácidos 46. 48 y 5 1 de la SEQ ID No. 2, sulfación que puede contribuir a la actividad de proteína del ligando de la P-selectina. La construcción de ADNs que codifiquen para estos y otros fragmentos activos o formas alteradas de la proteína del ligando de la P-selectina puede ser realizada de acuerdo con los métodos conocidos por aquellos capacitados en la técnica. El ADN aislado de la invención puede estar operativamente ligado a una secuencia de control de expresión tal como los vectores de expresión pMT2 o pED descritos en aufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991 ), con el objeto de producir el ligando de P-selectina recombinantemente. Muchas secuencias de control de expresión apropiadas se conocen en la técnica. Los métodos generales de expresión de proteínas recombinantes también se conocen y se ejemplifican en R. Kaufman. Methods in Enzymology 185, 537-566 ( 1990). Como se define aquí, "operativamente ligado" significa ligado enzimática o químicamente para formar un enlace covalente entre el ADN aislado de la invención y la secuencia de control de expresión, en vina forma tal que la proteína del ligando de la P-selectina es expresada por una célula hospedera que ha sido transformada (transfectada) con el ADN ligado/la secuencia de control de expresión. Se conocen varias enzimas endoproteolíticas que dividen péptidos precursores en el costado carboxilo de secuencias de aminoácidos emparejadas (por ejemplo, -Lys-Arg- y -Arg-Arg-) para producir proteínas maduras. Dichas enzimas son generalmente conocidas como enzimas de conversión de aminoácidos básicos apareados o PACE, y su uso en la producción recombinante de péptidos maduros es descrito extensamente en el documento WO 92/09698 y la solicitud de patente de los E.U.A. No. 07/885,972, ambos documentos se incorporan aquí como referencia. Se sabe que la familia PACE de enzimas incrementa la eficiencia de procesamiento proteolítico de polipéptidos precursores en células hospederas recombinantes. Como se mencionó anteriormente, la proteína del ligando de la P-selectina de la invención contiene dicho sitio de división por PACE. La proteína soluble del ligando de la P-selectina de la presente invención puede ser preparada en una célula hospedera que contenga una secuencia de ADN que codifique para cualquier proteína soluble del ligando de la P-selectina como se describe aquí y una secuencia de ADN que codifica para una PACE como se describe el WO 92/09698 y la solicitud de patente de los E.U.A. No. 07/885,972, incorporadas aquí como referencias, o usando la secuencia de ADN de la SEQ ID No. 5. Dicha célula hospedera puede contener los ADNs como resultado de la co-transformación o transformación secuencia! de vectores de expresión separados conteniendo el ADN de la proteína soluble del ligando de la P-selectina y el ADN de la PACE, respectivamente. Un tercer ADN que codifica para una 3/4FT también puede ser co-transformado con los ADNs que codifican para la proteína del ligando de la P-selectina y la PACE. Alternativamente, la célula hospedera puede contener los ADNs como el resultado de la transformación de un único vector de expresión conteniendo tanto el ADN de la proteína soluble del ligando de la P-selectina como el ADN de PACE. La construcción de tales vectores de expresión está dentro del nivel de conocimientos normales de la biología molecular. También son conocidos los métodos de co-transformación y transformación. Se conocen muchas secuencias de ADN que codifican para PACE. Por ejemplo, un ADN que codifica para una forma de PACE, conocida como furina, se describe en' A.M.W. van der Ouwcland et al., Nucí. Acids Res. 18, 664 ( 1 990), incorporado aquí como referencia. Un ADNc que codifica para una forma soluble de PACE, conocida como PACESOL, se representa en la SEQ ID No. 5. ADNs que codifican para otras formas de PACE también existen y cualquiera de tales ADNs que codifican para PACE puede ser usado para producir la proteína madura y soluble del ligando de la P-selectina de la invención, en tanto que la PACE sea capaz de dividir la proteína del ligando de la P-selectina en los aminoácidos 38-41. Preferiblemente, un ADN que codifica para una forma soluble de PACE es usada para producir la proteína madura y soluble del ligando de la P-selectina de la presente invención. Los ADNs que codifican para una forma soluble de la proteína del ligando de la P-selectina y PACE, separada o conjuntamente, pueden estar operativamente ligados a una secuencia de control de expresión tal como aquellas contenidas en los vectores de expresión pMT2 o pED descritos anteriormente, con el objeto de producir recombinantemente el ligando de P-selectina soluble y dividido por PACE. Se conocen en la técnica secuencias de control de expresión adicionales y adecuadas. Los Ejemplos 3(C) y 3(D) siguientes presentan métodos para la producción de la proteína madura y soluble del ligando de la P-selectina de la invención. Un número de tipos de células pueden actuar como células hospederas apropiadas para la expresión de la proteína del ligando de la P-selectina. Las células hospederas apropiadas son capaces de fijar cadenas laterales de carbohidratos características de la proteína del ligando de la P-selectina funcional. Dicha capacidad puede aumentar en virtud de la presencia de una enzima de glicosilación adecuada dentro de la célula hospedera, ya sea que ocurra en forma natural, inducida por mutagénesis química, o a través de transfección de la célula hospedera con un plásmido de expresión apropiado conteniendo una secuencia de ADN que codifica para la enzima de glicosilación. Las células hospederas incluyen, por ejemplo, células COS de mono, células de Ovario de Hámster Chino (CHO), células 293 de riñon humano, células epidérmicas humanas A431 , células humanas Colo205, células 3T3, células CV-1 , otras líneas celulares de primate transformadas, células diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivos in vitro de tejidos primarios, explantes primarios, células HeLa, células L de ratón, células BHK, HL-60, U937 o HaK. La proteína del ligando de la P-selectina también puede ser producida ligando operativamente el ADN aislado de la invención y uno o más ADNs que codifican para enzimas de glicosilación apropiadas a secuencias de control de expresión en uno o más vectores de expresión de insecto, y empleando un sistema de expresión de insecto. Los materiales y métodos para sistemas de expresión de baculovirus/célula de insecto están comercialmente disponibles en forma de equipo (kit) en, por ejemplo, Invitrogen, San Diego, Cali fornia, E.U.A. (the MaxBac© kil) y tales métodos son bastante conocidos en la técnica, como se describe en Summers and Smith, Texas Agricultural Experiments Station Bulletin No. 1535 (1987), incorporado aquí corno referencia. Las formas solubles de la proteína del ligando de la P-selectina también pueden ser producidas en células de insecto usando ADNs aislados y apropiados como se describió anteriormente. Un ADN que codifica para una forma de PACE además puede ser co-expresado en una célula hospedera de insecto para producir una forma dividida por PACE de la proteína del ligando de la P-selectina. Alternativamente, puede ser posible producir la proteína del ligando de la P-selectina en eucariotes inferiores tales como levaduras o en procariotes tales como bacterias. Las cepas de levaduras potencialmente apropiadas incluyen las cepas Saccharomyces cerevisiae, Scizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, Candida. O cualquier cepa de levadura capaz de expresar proteínas heterólogas. Las cepas de bacterias potencialmente adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium o cualquier cepa bacteriana capaz de expresar proteínas heterólogas. Si la proteína del ligando de la P-selectina es preparada en levadura o bacterias, es necesario fijar los carbohidratos apropiados a los sitios apropiados en la fracción de proteína covalentemente, con el objeto de obtener la proteína del ligando de la P- selectina glicosilada. Tales uniones covalentes pueden ser realizadas usando métodos químicos o enzímáticos conocidos. La proteína del ligando de la P-selectina de la invención también puede ser expresada como un producto de animales transgénicos, por ejemplo, como un componente de la leche de vacas, cabras, cerdos ti ovejas transgénicas que están caracterizadas por células germinales o somáticas que contienen una secuencia de ADN que codifica para la proteína del ligando de la P-selectina. La actividad de unión a P-selectina de una proteína de la P-selectina puede ser mejorada mediante co-transformación de una célula hospedera con una transferasa ClcNAc, preferiblemente transferasa UDP-GlcNAc:Gaip i -3GalNAc-R(GlcNAc a GalNAc)p l -6 GlcN Ac (EC 2.4.1 .102), también conocida como "transferasa core2." Se ha mostrado que Los glicanos con enlace O presentes en proteína del ligando de la P-selectina son importantes para la unión a P-selectina (D, Sako et al., Cell 75, 1 179-1 186 ( 1993)). Se ha reportado que sialilo Lex sobre glicanos con enlace O de células mieloides se presentan en estructuras ramificadas complejas ( aemura, . And Fukuda, . J. Biol. Chem. 267, 24379-24386 ( 1992)). La enzima responsable para la generación de tales estructuras de oligosacárido es "core2". La actividad de la enzima core2 es encontrada en niveles muy bajos en células COS y en niveles de trazas en células CHO. Las células hospederas co-transformadas con ADNs que codifican para una proteína del ligando de la P-selectina, una fucosiltransferasa (al ,3/al ,4) y core2 pueden producir proteína del ligando de la P-selectina que presenta unión multiplicada por 20-30 a P-selectina. En ciertas modalidades preferidas, la proteína del ligando de la P-selectina es producida mediante co-transfección de una célula hospedera con ADNs que codifican para proteína soluble del ligando de la P-selectina, 3/4FT, core2 y PACE. La proteína del ligando de la P-selectina de la invención puede ser preparada cultivando células hospederas transformadas bajo condiciones de cultivo necesarias para expresar una glicoproteína de unión a P-selectina. La glicoproteínas expresada que resulta puede entonces ser purificada del medio de cultivo o extractos celulares. Las formas solubles de la proteína del ligando de la P-selectina de la invención puede ser purificada mediante cromatografía de afinidad sobre Lentil lectina-Sepharose® y elución subsecuente con a-metil-manosido 0.5 M. La proteína soluble del ligando de la P-selectina eludada puede entonces ser purificada adicionalmente y concentrada mediante una etapa de precipitación con sulfato de amonio al 0-70%. La proteína es entonces recuperada, resuspendida y purificada adicionalmente mediante cromatografía por exclusión de tamaño sobre un TSK G4000SWX!,. Alternativamente, las formas de longitud completa de la proteína del ligando de la P-selectina de la invención pueden ser purificadas preparando una fracción de membrana total procedente de la célula de expresión y extrayendo las membranas con detergentes no iónicos tales como Tritón X- 100. El extracto detergente puede entonces ser hecho pasar sobre una columna de afinidad compuesta de P-selectina inmovilizada, y la proteína del ligando de la P-selectina puede ser eludada de la columna con EDTA 10 mM en un regulador conteniendo 0.1% de detergente. El material eludado de la columna de afinidad puede posteriormente ser dializado para eliminar el EDTA y purificado adicionalmente sobre una columna de afinidad de Lentil lectin-Sepharose®, dudando otra vez con a-metil-manosido 0.5 M. Alternativamente, la proteína del ligando de la P-selectina de la invención es concentrada usando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicón o Millipore Pel licon. En seguida a la etapa de concentración, el concentrado puede ser aplicado a una matriz de purificación tal como un medio de filtración de gel. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio amónico, por ejemplo, una matriz o substrato que tenga grupos dietilaminoetil (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acri lamida, agarosa. dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Alternativamente, puede ser empleada una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos apropiados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Los grupos sulfopropilo son los preferidos (por ejemplo, columnas de S-Sepharose®). La purificación de la proteína del ligando de la P-selectina desde el sobrenadante del cultivo también pude incluir una o más etapas de columna sobre resinas de afinidad tales como A-agarosa de concanavalina, heparina-toyopearl® oCibacrom blue 3GA Sepharose®; o mediante cromatografía de interacción hidrofóbica usando resinas tales como éter de fenilo, éter de butilo o éter de propilo; o mediante cromatografía de inmunoafinidad. Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de cromatografía líquida de alta definición y en fase inversa (RP-HPLC) usando medio RP-HPLC hidrofóbico, por ejemplo, gel de silicio teniendo pendientes grupos metilo u otros grupos alifáticos, para purificar adicionalmente la proteína del ligando de la P-selectina. También pueden emplearse algunas o la totalidad de las etapas de purificación precedentes, en varias combinaciones, para proveer una proteína substancial mente homogénea, aislada y recombinante. La proteína del ligando de la P-selectina así purificada está substancialmente libre de otras proteínas de mamífero y es definida de acuerdo con la presente invención como "proteína del ligando de la P-selectina, aislada." La proteína del ligando de la P-selectina, aislada puede ser útil en el tratamiento de condiciones caracterizadas por la adhesión intercelular mediada por P- E- o L-selectina. Tales condiciones incluyen, sin limitación infartación al miocardio, infección bacteriana o viral, condiciones metastásicas, desórdenes inflamatorios tales como artritis, gota, uveitis, síndrome de sufrimiento respiratorio agudo, asma, enfisema, reacción de hipersensibilidad de tipo retardada, lupus sistémico eritomatoso, daños por calor tales como quemaduras, congelamiento, tiroiditis autoinmune, encefalomielitis alérgica experimental, esclerosis múltiple, síndrome de daño orgánico múltiple secundario a trauma, diabetes, síndrome de Reynauds, dermatosis neutrofílica (síndrome de Sweet), enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Grave, glomerulonefritis, gingivitis, peridontitis, síndrome urémico hemolítico, colitis ulcerosa, enfermedad de Cronh, enterocolitis necrotizante, síndrome asociado a la transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citocinas, y similares. La proteína del ligando de la P-selectina aislada también pude ser útil en el transplante de órganos, tanto para preparar órganos para el transplante como para mitigar rechazos al trasplante de órganos. En consecuencia, la proteína del ligando de la P-selectina puede ser administrada a un donador de órganos vivo o no vivo, antes de que el órgano sea retirado. Además, la proteína del ligando de la P-selectina puede ser administrada "ex vivo " al órgano del donador concomitantemente con la solución de conservación del órgano, antes de y/o subsecuentemente a la anastomosis quirúrgica con el receptor. La proteína del ligando de la P-selectina aislada puede ser usada para tratar pacientes con hemodiálisis o leucoforesis. Adicionalmente, la proteína del ligando de la P-selectina aislada puede ser empleada como un agente antimetastático. La proteína del ligando de la P-selectina aislada pude ser usada por si misma como un inhibidor de la adhesión intercelular mediada por P-, E- o L-selectina o para diseñar inhibidores de la adhesión intercelular mediada por P-, E- o L-selectina. La presente invención abarca tanto las composiciones farmacéuticas que contienen proteína del ligando de la P-selectina aislada, como los métodos terapéuticos de tratamiento o uso que emplean proteína del ligando de la P-selectina aislada. La proteína del ligando de la P-selectina aislada, purificada a partir de células o producida recombinantemente puede ser usada como una como una composición farmacéutica cuando se combina con un portador farmacéuticamente aceptable. Dicha composición puede contener, además de la proteína del ligando de la P-selectina y el portador, diluyentes, rellenadores, sales, reguladores, estabilizadores, solubilizadores, y otros materiales que se conocen bien en la técnica. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del(los) ingrediente(s) activo(s). Las características del portador dependerán de la ruta de administración. La composición farmacéutica de la invención también puede contener citocinas, linfocinas, u otros factores hematopoiéticos tales como M-CSF, GM-CSF, IL-1 , IL-2, IL-3; IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9. IL- 1 0, IL- 1 1 , IL- 12, G-CSF, MegCSF. factor de células progenitoras y eritropoietina. La composición farmacéutica puede contener factores trombolíticos o anti-trombóticos tales como activador plasminógeno y Factor VIII. La composición farmacéutica puede además contener otros agentes anti-inflamatorios. Tales factores y/o agentes adicionales pueden ser incluidos en la composición farmacéutica para producir un efecto sinergístico con la proteína del ligando de la P-selectina aislada, o minimizar los efectos laterales causados por la proteína del ligando de la P-selectina aislada. A la inversa, la proteína del ligando de la P-selectina aislada puede ser incluida en formulaciones de la citocina particular, linfocina, otro factor hematopoiético, factor trombolítico o anti-trombótico, o agente anti-inflamatorio para minimizar efectos laterales de la citocina, linfocina, otro factor hematopoiético, factor trombolítico o anti-trombótico, o agente anti-inflamatorio. La composición farmacéutica de la invención puede estar en la forma de un liposoma en el que la proteína del ligando de la P-selectina aislada esté combinada, además de otros portadores farmacéuticamente aceptables, con agentes amfipáticos tales como lípidos que existan en forma agregada como miscelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, o capas laminares que estén en solución acuosa. Los lípidos adecuados para formulación liposomal incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponinas, ácidos biliares, y similares. La preparación de tales formulaciones liposomales está dentro de los conocimientos de la técnica, como se describe, por ejemplo, en la Patente de los E.U.A. No. 4,235,871 ; Patente de los E. U.A. No. 4,501 ,728; Patente de los E.U.A. No. 4,837,028 y Patente de los E.U.A. No. 4,737, 323; la totalidad de las cuales se incorpora aquí como referencia. Como se utiliza aquí, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad total de cada componente activo de la composición farmacéutica o método que es suficiente para mostrar un beneficio significativo al paciente, por ejemplo, sanación de condiciones crónicas caracterizadas por la adhesión celular mediada por P-selectina o E-selectina o el incremento en la velocidad de sanación de tales condiciones. Cuando se aplica ingrediente activo a un individuo, administrado solo, el término se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que resultan en el efecto terapéutico, sea que se administre en combinación, serialmente o simultáneamente. En la práctica del método de tratamiento o uso de la presente invención, una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína del ligando de la P-selectina aislada se administra a un mamífero que tiene un estado enfermizo mediado por la P-selectina. La proteína del ligando de la P-selectina aislada puede ser administrada de acuerdo con el método de la invención, ya sea sola o en combinación con otras terapias tales como tratamientos que empleen agonistas de receptores, agonistas de ligandos, citocinas, liiífocinas u otros factores hematopoiéticos. Cuando se co-administra con una o más citocinas, linfocinas u otros factores hematopoiéticos, la proteína del ligando de la P-selectina aislada puede ser administrada ya sea simultáneamente con la(s) citocina(s), linfocina(s), otro(s) factor(es) hematopoiético(s), factores trombolíticos o anti-trombóticos, o secuencialmente. Si se administra secuencialmente, el médico que atiende decidirá sobre la secuencia apropiada de administración de la proteína del ligando de la P-selectina aislada en combinación con citocina(s), linfocina(s), otro(s) factor(es) hematopoiético(s), factores trombolíticos o anti-trombóticos. La administración de la proteína del ligando de la P-selectina aislada usada en la composición farmacéutica o para llevar a la práctica el método de la presente invención puede ser llevada a cabo en una variedad de formas convencionales, tales como la ingestión oral, inhalación, inyección cutánea, subcutánea o intravenosa: La administración intravenosa al paciente es la que más se prefiere. Cuando una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína del ligando de la P-selectina aislada es administrada oralmente, la proteína del ligando de la P-selectina aislada estará en la forma de una tableta, cápsula, polvo, solución o elíxir. Cuando se administra en forma de tableta, la composición farmacéutica de la invención puede adicionalmente contener un portador sólido tal como gelatina o un adjutor. La tableta, cápsula y polvo contiene desde aproximadamente 5 a 95% de la proteína del ligando de la P-selectina aislada, y preferiblemente desde aproximadamente 25 a 90% de la proteína del ligando de la P-selectina aislada. Cuando se administra en forma líquida, puede agregarse un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites de origen animal o vegetal tal como aceite de cacahuate, aceite mineral, aceite de soja, aceite de sésamo, o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede además contener solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene de desde aproximadamente 0.5 a 90% en peso de la proteína del ligando de la P-selectina aislada, y preferiblemente de desde aproximadamente 1 a 50% de la proteína del ligando de la P-selectina aislada. Cuando una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína del ligando de la P-selectina aislada es administrada mediante inyección intravenosa, cutánea u subcutánea, la proteína del ligando de la P-selectina aislada estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable y libre de pirógenos. Está dentro de los conocimientos de la técnica la preparación de dichas soluciones de proteína parenteralmente aceptables, teniendo debida consideración respecto al pH, isotonicidad, estabilidad y similares. Una composición farmacéuticamente preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debe contener, además de la proteína del ligando de la P-selectina aislada, un vehículo isotónico tal como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa, Inyección de Dextrosa y Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer con Lactato, u otro vehículo como se conoce en la técnica. La composición farmacéutica de la presente invención también puede contener estabilizadores, conservadores, reguladores, antioxidantes, u otros aditivos conocidos por aquellos capacitados en la técnica.

La cantidad de la proteína del ligando de la P-selectina aislada en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que esté siendo tratada, y de la naturaleza de tratamientos previos que el paciente haya tenido. Finalmente, el medico que atiende decidirá la cantidad de la proteína del ligando de la P-selectina aislada con la que tratará a cada paciente individual. Inicialmente, el medico que atiende administrará dosis bajas de la proteína del ligando de la P-selectina aislada y observará la respuesta del paciente. Dosis mayores de la proteína del ligando de la P-selectina aislada pueden ser administradas hasta que el efecto terapéutico óptimo se obtenga para el paciente, y en ese punto generalmente la dosis no se incrementará más. Se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas utilizadas en la práctica del método de la presente invención deberá contener aproximadamente 0.1 µg a aproximadamente 100 mg de la proteína del ligando de la P-selectina aislada por kilogramo de peso corporal. La duración de la terapia intravenosa utilizando la composición farmacéutica de la presente invención variará dependiendo de la severidad de la enfermedad que está siendo tratada y la condición y respuesta idiosincrásica potencial de cada paciente individual. Se contempla que la duración de cada apl icación de la proteína del ligando de la P-selectina aislada estará en el intervalo de 12 a 24 horas de administración intravenosa continua. Finalmente el médico que atiende decidirá acerca de la duración apropiada de la terapia intravenosa usando la composición farmacéutica de la presente invención. La proteína del ligando de la P-selectina aislada de la invención pueden también se usada para inmunizar animales para obtener anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionen específicamente con la proteína del ligando de la P-selectina aislada y los cuales puedan inhibir la adhesión celular mediada por P-selectina. Dichos anticuerpos pueden ser obtenidos usando la proteína del ligando de la P-selectina completa como un inmunógeno, o usando fragmentos de la proteína del ligando de la P-selectina tal como la proteína del ligando de la P-selectina madura y soluble. Fragmentos más pequeños de la proteína del ligando de la P-selectina pueden también ser usados para inmunizar animales, tales como los fragmentos que se establecen más adelante: del aminoácido 42 al aminoácido 56 de la SEQ ID No. 2 y del aminoácido 127 al aminoácido 138 de la SEQ ID No. 2. Un inmunógeno péptido adicional comprende del aminoácido 238 al aminoácido 248 de la SEQ ID No. 2, con un residuo alanina agregado en la terminación amino del péptido. Otro inmunógeno de péptido comprenden del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEQ ID No. 2 teniendo una tirosina sulfatada en cualquiera de las posiciones 46, 48 o 5 1 . Los inmunógenos péptido adicionalmente pueden contener un residuo cisteina en la terminación carboxilo, y están conjugados a un hapteno tal como hemocianina de lapa keyhole ( LH). Inmunógenos peptídicos adicionales pueden ser generados reemplazando residuos de tirosina con residuos de tirosina sulfatados. Los métodos para sintetizar tales péptidos son conocidos en la técnica, por ejemplo, como en R.P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-21 4 ( 1963); J.L. Krstenansky, et al. FEBS Lett. 21 1 . 10 ( 1987). Los anticuerpos monoclonales que se unen a glicoproteína del ligando de la P-selectina o a fracciones de carbohidrato complejas características de la glicoproteína del ligando de la P-selectina pueden ser útiles como agentes de diagnóstico para la inmunodetección de enfermedades inflamatorias y algunas formas de cáncer. Algunas células cancerosas, tales como pequeños carcinomas de célula de pulmón, pueden expresar niveles detectables de la proteína del ligando de la P-selectina. Esta expresión anormal de la proteína del ligando de la P-selectina por células cancerosas puede jugar un papel en la met stasis de estas células. Los anticuerpos monoclonales de neutralización que se unen a glicoproteína del ligando de la P-selectina o a carbohidratos complejos característicos de glicoproteína del ligando de la P-selectina también pueden ser terapéuticos útiles tanto para enfermedades inflamatorias como también para el tratamiento de algunas formas de cáncer en donde la expresión anormal de la proteína del ligando de la P-selectina está involucrada. Estos anticuerpos neutralizantes monoclonales son capaces de bloquear la función de adherencia intercelular mediada por selectina de la proteína del ligando de la P-selectina. Mediante el bloqueo de la unión de la proteína del l igando de la P-selectina, la adherencia de leucocitos a sitios de inflamación inapropiados es ya sea abolida o marcadamente reducida. En el caso de células cancerosas o células leucémicas, los anticuerpos monoclonales de neutralización contra la proteína del ligando de la P-selectina pueden ser útiles en la detección y prevención de la dispersión metastática de las células cancerosas que pude ser mediada por la proteína del ligando de la P-selectina. Además, los anticuerpos monoclonales unidos a estas células pueden ser objeto de ataque a las células cancerosas por citotoxicidad medicada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), ayudando así a eliminar las células cancerosas. Los anticuerpos humanos que reaccionan con la proteína del ligando de la P-selectina pueden ser producidos en animales transgénicos que contengan genes que codifiquen para inmunoglobulina humana en sus líneas germinales. El Ejemplo 7 siguiente establece la producción de un anticuerpo policlonal de conejo específicos a fragmentos de proteína del ligando de la P-selectina. La proteína del ligando de la P-selectina de la invención también pude ser usada para el tamizaje de agentes que sea capaces de unirse a proteína del ligando de la P-selectina y de esta forma actuar como inhibidores de la adhesión intercelular mediada por la P-selectina o E-selectina. Los ensayos de unión usando una proteína de unión, inmobilizada o no, deseada, se conocen bien en la técnica y pueden ser empleados para este propósito utilizando la proteína del ligando de la P-selectina de la invención. Los ensayos de tamizaje apropiados pueden ser de base celular, como en los Ejemplos 3 y 9 siguientes. Alternativamente, los ensayos de tamizaje basados en proteína purificada pueden usarse para identificar tales agentes. Por ejemplo, la proteína del ligando de la P-selectina puede ser inmobilizada en forma purificada sobre un portador y la unión a P-selectina puede ser medida en la presencia y en la ausencia de agentes de unión potenciales. Un ensayo de unión apropiado puede emplear alternativamente P-selectina purificada e inmovilizada sobre un portador, con una forma soluble de la proteína del ligando de la P-selectina de la invención. Cualquier proteína del ligando de la P-selectina puede ser usada en los ensayos de tamizaje descritos anteriormente. Por ejemplo, la proteína del ligando de la P-selectina de longitud completa representada en la SEQ ID No. 2 desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 402 puede ser usada para el tamizaje de inhibidores; o la proteína madura del ligando de la P-selectina representada en la SEQ ID No. 2 desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido402 puede emplearse para el tamizaje de inhibidores, o la proteína madura y soluble del ligando de la P-selectina representada en la SEQ ID No. 2 desde al aminoácido 42 hasta el aminoácido 3 10 puede ser utilizada para el tamizaje de inhibidores. Alternativamente, la proteína del ligando de la P-selectina de la SEQ ID No. 4 desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 412, o una forma madura de la proteína del ligando de la P-selectina según se representa en la SEQ ID No. 4 desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 41 2. o una forma madura y soluble de la proteína del ligando de la P-selectina representada en la SEO ID No. 4 desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 320 puede ser empleada para tamizar inhibidores de adhesión intercelular de acuerdo con la presente invención. En dicho ensayo de tamizaje, se forma una primer mezcla de unión combinando P-selectina o E-selectina y proteína del ligando de la P-selectina, y se determina la cantidad de unión en la primer mezcla de unión (B0). Se forma también una segunda mezcla de unión combinando P-, E- o L-selectina, proteína del ligando de la P-selectina y el compuesto o agente a ser tamizado, y se determina la cantidad de unión en la segunda mezcla de unión (B). Se comparan los grados de unión en las mezclas de unión primera y segunda, por ejemplo, realizando un cálculo de B/B0. Se considera que un compuesto o agente es capaz de inhibir la adhesión intercelular mediada por P-, E- o L-selectina si se observa una disminución en la unión de la segunda mezcla de unión cuando se compara con la primera mezcla de unión. La formulación y optimización de las mezclas de unión está dentro del nivel de conocimientos de la técnica, dichas mezclas de unión también pueden contener reguladores y sales necesarias para mejorar u optimizar la unión, y se pueden incluir ensayos de control adicionales en el ensayo de tamizaje de la invención. Los compuestos que se encontraron que reducen en cuando menos 10%, preferiblemente más de aproximadamente 50% o más de la actividad de unión de la proteína del ligando de la P-selectina a P-, E- o L-selectina pueden por lo tanto ser identificados y posteriormente tamizados en forma secundaria en otros ensayos de unión a selectina, incluyendo ensayos de unión a L-selectina y ensayos in vivo. Por este medio pueden idetificarse los compuestos que tienen actividad inhibidora para la adhesión intercelular mediada por selectina y que pueden ser adecuados como agentes anti-inflamatorios.

EJEMPLO 1 CLONACIÓN DEL GENE DE LA PROTEÍNA DEL LIGANDO DE LA P-SELECTINA A. Construcción de la biblioteca de ADNc HL60 Se construyó una biblioteca de ADNc HL60 mediante clonación por expresión del ligando de la P-selectina. Se aisló AR.N PolyA+ a partir de ARN total procedente de la línea celular HL60 promielocítica humana (S.J. Collins, et al., supra) usando un equipo (kit) de aislamiento de ARNm (kit) Fast Track (Invitrogen; San Diego, CA). Se sintetizó ADNc de doble cadena a partir de la fracción de ARN PolyA+ y ligado con terminación despuntada con adaptadores de EcoRI (5'-AATTCCGTCGACTCTAGAG-3\ SEQ ID No. 7; 5'-CTCTAGAGTCG ACGG-3 ' , SEQ ID No. 8). El ADNc fue ligado dentro del vector de expresión pMT21 (R. aufman et al., J. Mol. Cel l . Biol . 9. 946-958 ( 1 989)) que había sido incubado secuencialmente con endonucleasa de EcoRI y osfatasa alcalina intestinal de ternera y purificado en gel. El producto de la acción de ligado fue electroforado en alícuotas de 2 µ? en células DH5ot de E. coli competentes y se hicieron crecer en 1 mi de medio SOB (J. Sambrook et al.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl.90 (1989)) que había sido complementado con MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM y 2% de glicerol durante una hora a 37 °C. Con el propósito de dividir la biblioteca en subgrupos más pequeños, una alícuota de cada mi de suspensión de bacteria fue colocado en placa sobre placas de agar en la presencia de ampicilina y se determinó el número de colonias por mi. Suponiendo que cada colonia representaba una clona de ADNc, se generaron 600,000 clonas y se dividieron en subgrupos de aproximadamente 16,000 clonas por polla. Cada una de las 38 pollas fueron hechas crecer durante toda la noche en caldo L en la presencia de ampicilina y los plásmidos fueron purificados en un gradiente de CsCI.

B. Tamizaje para el gene de la proteína del ligando de la P-selectina En esta primera etapa, el ensayo de unión LEC-?? del Ejemplo 4(A) se utilizó para separar la biblioteca HL60 de ADNc y de esta forma enriquecerla para el plásmido de interés. Seis µ de cada polla de la biblioteca HL60 del ADNc fueron transfectados con 2 ^ig del gene ot3/4FT (Ejemplo 2) en células COS. Aproximadamente 45 horas después de la transfección, las células COS fueron levantadas de las placas mediante incubando las células en EGTA 1 mM durante 15 minutos a 37 °C, seguida de raspado con levantadores de células. Las células fueron lavadas dos veces en una solución salina regulada de Hanks conteniendo calcio 1 mM (HBSS). Las células fueron resuspendidas en 4 mi de HBSS. Las células COS cotransfectadas y resuspendidas fueron tamizadas usando el ensayo de unión de LEC-?? descrito en el Ejemplo 4(A).

Los plásmidos procedentes de la células COS adherentes fueron recuperadas de un extracto de Hirts [B. Hirts, J. Mol. Biol. 26, 365-369 (1967)] y posteriormente electroforadas en células DH5a de E. coli para amplificación. La población enriquecida de plásmidos fue purificada sobre un gradiente de CsCI y re-transfectados conjuntamente con el gene 3/4FT (Ejemplo 2) en células COS. El proceso de transfección, tamizaje y amplificación de plásmido fue repetido por un total de tres veces antes de que se detectara visualmente una polla unida a las placas recubiertas con LEC-?? . La polla de plásmido positivo fue subsecuentemente separada en subgrupos. Esto involucró la electroforacíón del extracto de Hirts desde la polla positiva en células DH5a de E. coli y la cuantificación de colonias por mi como se describió anteriormente. Se produjeron varios tamaños de pollas colocando un número predeterminado de colonias en placas de agar en la presencia de ampicilina. Las placas duplicadas fueron preparadas ejecutando acciones de levantado de nitrocelulosa y almacenando los filtros sobre nuevas placas de agar. Las placas duplicadas sirvieron como placas de referencia para seleccionar colonias individuales o grupos de colonias procedentes de cualquier polla identificada como positiva. En la segunda etapa de clonación, fueron transfectadas células COS con las pollas de la sub-bibliotcca y el gene 3/4FT mediante el mismo procedimiento utilizado en la etapa inicial de tamizaje. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células transfectadas fueron tamizadas usando el ensayo de CHO:P-selectina del Ejemplo 4(B). Las pollas positivas fueron subdivididas adicionalmente, como se describió anteriormente, hasta que finalmente fueron tamizadas colonias individuales y se identificaron clonas positivas. Usando este método, se encontró que una sola clona positiva, pMT21 :PL85 codificaba para la proteína del ligando de la P-selectina. La secuencia de ADN del ligando de la P-selectina contenida en pMT21 :PL85 es representada en la SEQ ID No. 1 y las características de unión de la proteína del ligando de la P-selectina codificadas por pMT21 :PL85 se presentan en el Ejemplo 4(C) que más adelante se relata, EJEMPLO 2 CLONACIÓN DEL GENE DE LA al .3/1 ,4 FUCOSILTRANFERASA El gene de la l ,3/1 ,4 fucosiltransferasa fue clonado desde ADN genómico humano total (Clontech Laboratories) por medio de PCR. El primario de oligonucleótido de sentido contenía un sitio Xbal y la terminación 5' del gene (5'-TAGC ATACGCTCTAGAGC ATGGATCCCCTGGGTGC AGCC AAGC-3 ' , SEQ ID No. 9) y el primario de oligonucleótido de antisentido contenía un sitio EcoRI y la terminación 3' del gene (5,-CCGGAATTCTCAGGTGAACCAAGCCGC-3\ SEQ ID No. 10). El producto de PCR fue secuencialmente digerido con Xbal y EcoRI y se purificó mediante métodos de purificación en gel estándares. Este gene fue posteriormente ligado con el vector pMT3Sv2ADA (R. aufman, Methods in Enzymology, supra) que también había sido secuencialmente digerido con Xbal y EcoRI y purificado mediante métodos de purificación en gel estándares. Células HB 101 competentes (Biorad) fueron transformadas con este producto de ligado y posteriormente colocadas en placas de agar en la presencia de ampicilina. Alzados de filtro de nitrocelulosa de transformantes resistentes a ampicilina fueron probados con un oligonucleótido radioetiquetado (5'-AAGTATCTGTCCAGGGCTTCCAGGT-3 \ SEQ ID No. 1 1 ) complementario a la región de nucleótido5 506-530 en la parte media del gene (S. Sambrook et al, supra). Minipreparaciones de ADN de plásmido fueron preparadas a partir de doce clonas positivas. El ADN purificado fue entonces digerido con EcoRI y Xbal para identificar la clona correcta con el inserto del tamaño apropiado. Esta clona (pEA.3/4FT) fue entonces hecha crecer a gran escala y el ADN aislado mediante asociación por gradiente de densidad de CsCI (J. Sambrook et al., supra). La secuenciación de ADN confirmó la identidad del gene 3/4FT. La funcionalidad del gene fue evaluada en un ensayo de unión de célula-célula como sigue. Células de mono COS- 1 (clona M6; M. Horwitz et al .. Mol . Appl. Genet., 2: 147- 149, ( 1983)[ fueron transfectadas con 3/4FT usando dextrano de DEAE seguida por tratamiento de choque con DMSO e incubación con cloroquina [L. Sompeyrac and K. Dana, Proc. Nati. Acad. Sci., 78:7575-7578 ( 1981 ); M. Lopata et al., Nucleic Acids. Res., 1 2:5707-5717 (1984); H. Luthman and G. Magnuson. Nucleic Acids Res.. 1 1 : 1 295- 1 308 ( 1983)] . Las células COS transfectadas fueron suspendidas y cuantificadas en cuanto a unión a una línea celular CHO que expresaba E-selectina [G. Larsen et al., J. Biol. Chem. 267: 1 1 104- 1 1 1 10, ( 1992)]. Este ensayo confirmó que las células COS transfectadas con 3/4FT podían expresar el epitope siailado Lewisx sobre la superficie de la célula.

EJEMPLO 3 EXPRESIÓN DE LA PORTEÍNA DEL LIGANDO DE LA P-SELECTINA A. Expresión del ligando de la P-selectina en células LEC11 Ligando de la P-selectina funcional fue expresado en la línea celular LEC 1 1 de ovario de Hámster Chino (CHO) positiva al SLex (Campbell, C. and Stanley, P. Cell 35 :303-309 ( 1 83) como sigue: aproximadamente 8 ug de plásmido conteniendo el gene del ligando de la P-selectina (pMT21 :PL85, Ejemplo 1 ) fueron transfectados en células LEC 1 1. A las 68 horas después de la transfección, las células fueron tratadas con butirato de sodio 2.5 mM durante 4 horas. Se observó que las tres células inducían la adhesión de la P-selectina, según se determinó usando el ensayo de unión de célula de CHO:P-selectina con marcado de 6-CFD (descrito en el Ejemplo 4, sección B). En contraste, ni las células LEC 1 1 ni las células LEC 1 1 transfectadas con un plásmido de control indujeron adhesión de la P-selectina.

B. Expresión de Ligando de P-selectina Soluble, en Células COS Células COS fueron transfectadas con 8 ug de pED.sPSL.T7 (ver Ejemplo 5C) y 4 µ¾ de plásmido pEA.3/4FT del Ejemplo 2. 8 µ de pED.sPSL.T7 solo, o 8 µg de vector de plásmido (pMT21 ) y 4 µg de gene pEA.3/4FT. Cuarenta y cinco horas después de la transfección, las células fueron enjuagadas dos veces en PBS e incubadas toda la noche a 37 °C en rojo de fenol minus de DMEM libre de suero (JRH Biosciences) complementado con L-glutamina 2 mM. 100 U/ml de penicilina y 1 00 µ /??? de estreptomicina. Se agregaron fluoruro de fenilmetilsulfonilo, aprotinina y NaN3 en concentraciones finales de 1 mM, 2 µg/ml y 0.02% respectivamente, y el medio acondicionado fue centrifugado para eliminar todos los desechos. Para los experimentos de inmunoprecipitación, la proteína soluble del ligando de la P-selectina marcada fue producida co-transfectando células COS con pED.sPSL.T7 y pEA.3/4FT. A las cuarenta y cinco horas después de la transfección, las células COS fueron marcadas con 250 µ??/??? de 35S metionina (NEN) durante 5 horas y el medio fue recolectado. La expresión de la proteína de sPSL.T7 fue confirmada por inmunoprecipitación con anticuerpos de anti-T7.

C. Expresión del Ligando de P-selectina dividido por PACE en Células COS Células COS fueron co-trasnfectadas con el plásmido pED.sPSL.T7 del Ejemplo 5(C), el ADNc del pED.3/4FT del Ejemplo 2 y un plásmido conteniendo el ADNc de PACE representado en la SEQ ID No. 5. Se realizó una co-trasnfección de control paralelo usando solamente el plásmido pED.sPSL.T7 y el plásmido pEA.3/4FT. Después de 45 horas, medio acondicionado procedente de estas células COS transfectadas fue recubierto sobre discos de plástico y se determinó a unión a células CHO:P-selectina (Ejemplo 4). Se observó un incremento de aproximadamente dos veces en la unión de células CHO:P-selectina para discos recubiertos con el medio conteniendo el ligando de la P-selectina co-expresado con PACE, en comparación con el medio conteniendo ligando de P-selectina que no había sido co-expresado con PACE. La secuenciación de aminoácidos de la terminación N de proteína de sPSL.T7 puri ficada procedente de la co-transfección de PAC E mostró que la totalidad del ligando había sido dividida en el sitio de consenso de PACE (aminoácidos 38-41 de la SEQ ID No. 1 ). El radioetiquetado de células COS co-trasnfectadas con 35S-metionina y la subsecuente electroforesia en SDS-gel de poliacrilamida y autoradiografía mostraron que habían sido secretadas cantidades comparables del ligando de P-selectina en ambas co-transfecciones.

D. Expresión de la Proteína del Ligando de la P-selectina en Células CHO Una forma de longitud completa (aminoácidos 1 -402) de la proteína del ligando de la P-selectina fue expresada en la línea celular CHO(DU X) (Urlaub & Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980)) como sigue: aproximadamente 25 µg del plásmido pMT21 :PL85 y aproximadamente 8 µg del pED.3/4FT (producido mediante restricción del pEA.3/4FT con EcoRI y Xbal e inserción del fragmento resultante en el plásmido pED) fueron co-transfectados en células CHO(DUKX) usando el método del fosfato de calcio. Los transfectantes fueron seleccionados por resistencia al metotrexato. Después de dos semanas, colonias individuales fueron tamizadas por expresión de SLex usando un conjugado de un anticuerpo de anti SLe* (CSLEX-1 , U.S. 4,752,569) y células de glóbulos rojos de oveja (sRBC) preparadas mediante el método del cloruro crómico (Goding, J. W., J. Immunol . Methods J 0:61 -66 ( 1 976) como sigue: sRBC fueron lavadas con NaCl 0.15 M hasta que el lavado se tornó claro y entonces se preparó una suspensión al 50% de sRBC en NaCl 0. 15 M.

Un mi de una solución de cloruro crómico al 0.01 % fue agregada por goteo mientras se producía un vórtice a 0.2 mi de una suspensión de sRBC conteniendo 50 µ de CSLEX- 1 . Después de su incubación a 37 °C durante 30 minutos, se agregaron a la reacción 10 mi de solución salina (PBS) regulada con fosfato. El conjugado se lavó una vez antes de la resuspensión en 10 mi de PBS. Las placas conteniendo transfectantes fueron lavadas con PBS y posteriormente 3 mi de PBS y un mi del conjugado de sRBC/CSLEX-1 fue agregado a cada placa. Las colonias positivas eran rojas en un transiluminador y fueron recolectadas en medio alfa con 1 0% de suero de bovino fetal . Después de dos semanas, las colonias fueron sometidas a amplificación por pasos usando metotrexato en concentraciones de 2, 10, 25, 100, 250 nM. La línea celular estable que se obtuvo fue designada como CD-PSGL- 1 (R3.4). La expresión de la proteína del ligando de la P-selectina fue confirmada por estudios de inmunoprecipitación uti lizando el anticuerpo de proteína del ligando de anti-P-selectina policlonal del Ejemplo 7(A). La funcionalidad de la proteína del ligando de la P-selectina producida por la línea celular CD-PSGL- 1 (R3.4) fue probada ensayando los transfectantes por la unión a LEC-? ? como en el Ejemplo 4(A). La proteína del sPSL.T7 fue expresada en una línea CHO-PACE estable que ya expresaba el ADNc que codificaba para PACE como se representa en la SEQ ID No. 5 bajo selección de deaminasa de adenosina (Kaufman, et al., PNAS (USA) 83 :3 136-3140 (1986)). Los plásmidos psPSL.T7 (25 g) y pED.3/4FT (8 µ§,) fueron cotransfectados en células CHO-PACE usando el método del fosfato de calcio. Los transfectantes fueron seleccionados por resistencia al metotrexato, y se recolectaron colonias individuales que se unieron al conjugado sRBC/CSLEX-1 . Después de dos semanas en cultivo, las colonias fueron sometidas a ampl ificación en pasos como se describió anteriormente. La línea celular estable que se obtuvo fue designada como CP/PSL-T7 (R4.1 ). La expresión de la proteína del sPSL.T7 fue confirmada por métodos de inmunoprecipitación estándar usando ya sea un anticuerpo monoclonal específico de ?7 o la quimera de LEC-? ? del Ejemplo 4(A). En una forma similar, una línea celular estable que expresaba la forma madura de longitud completa (aminoácidos 42-402) de la proteína del ligando de la P-selectina se obtuvo mediante co-transfección de pMT21 :PL85 y pED.3/4FT en la línea celular CHO-PACE.

Líneas celulares estables que expresaban la proteína de sPSL.Q del Ejemplo 5(B) y la proteína de sPSL.Fc del Ejemplo 5(D) fueron construidas como sigue: los plásmidos pED.sPSL.Q (25 µg) o pED.sPSL.Fc (25 µ ) fueron cotransfectados con aproximadamente 25 µg del plásmido pED.3/4FT descrito anteriormente y aproximadamente 20 µg de un plásmido conteniendo el ADNc de PACE como se representa en la SEQ ID No. 5) así como el gene resistente a la neomicina en células CHO(DU X) usando el método del fosfato de calcio. Los transfectantes fueron seleccionados por resistencia al metotrexato y el antibiótico G 18. Aproximadamente dos semanas más tarde, se tamizaron colonias individuales para expresión de SLe usando unión del conjugado sRBC/CSLEX- 1. Las colonias positivas fueron recogidas en medio G418 en una concentración de 1 mg/ml. Después de 2-3 semanas en cultivo, las células fueron amplificadas con metotrexato en una selección por pasos. Las líneas celulares estables que se obtuvieron se designaron como CD-sPSL.Q (R8.2) y CD-sPSL.Fc (R8.1 ), respectivamente. La expresión de la proteína de sPSL.Q y sPSL.Fc fue confirmada mediante el método de inmunoprecipitación estándar usando el anticuerpo policlonal de la proteína del ligando de anti-P-selectina del Ejemplo 7(A).

EJEMPLO 4 ENSAYO DE LA ADHESIÓN INTERCELULAR MEDIADA POR LA P-SELECTINA A. Ensayo de Unión de LEC-yl Un ADN que codifica para una forma quimérica de P-selectina conjugada a la porción Fe de un IgGyl humano (LEC-?? ) fue construido usando métodos conocidos (Aruffo et al., Cell 67, 35-44 ( 1991 )), y transfectado en forma estable en células CHO dhfr (CHO DUKX) para producción de alto nivel de la proteína quimérica de LEC-?? , la cual fue purificada para usarse en el ensayo de unión que se presenta más adelante, Se recubrieron cajas de Petri primero con una anticuerpo IgGyl Fe anti-humano policlonal y posteriormente con LEC-yl . Este método orienta la construcción LEC-?? de tal forma que la porción de la P-selectina de la molécula quimérica es presentada sobre la superficies de las placas. La adhesión de las células HL60 a LEC-? ? orientado fue cuantificada en la presencia y la ausencia de calcio. La adhesión de H L60 mostró ser dependiente de calcio, confirmando que la molécula quimérica había retenido unión funcional de la P-selectina a su ligando en células HL60. La unión de las células HL60 a LEC-?? orientado también mostró ser bloqueada por un anticuerpo monoclonal de neutralización para P-selectina, demostrando la especificidad de la unión de la P-selectina .

B. Ensayo Fluorescente de la Unión CHO-P-selectina El ensayo empleó una línea celular de CHO:P-selectina marcada fluorescentemente (Larsen et al., J. Biol. Chem. 267, 1 1 104- 1 1 1 10 ( 1992) que puede unirse y formar racimos sobre la superficie de células COS que son co-transfectadas con el gene del ligando de la P-selectina y el gene de 3/4FT. Las células CHO-P-selectina fueron resuspendidas en 1.5 x 106 células/ml en suero de bovino fetal al 1 % en medio DML y marcadas agregando diacetato de 6-carboxifluoresceina (6-CFD) a una concentración final de 1 00 ug/ml. Después de la incubación a 37 °C durante 15 minutos, las células fueron lavadas en medio y resuspendidas en 1 x 1 ^ células/ml. Cinco mi de las células marcadas fueron agregadas a cada placa conteniendo transfectantes de COS lavada para ser ensayadas e incubadas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las células no adherentes fueron retiradas mediante cuatro lavados con medio. Las placas fueron entonces barridas mediante microscopía de fluorescencia para determinar rosetas de células CHO:P-selectina adherentes.

C. Ensayo cuantitativo de adhesión usando células CHO-P-selectina marcadas radioactivamente Se co-transfectaron células COS con el plásmido pMT21 :PL85 del Ejemplo 1 y el plásmido pEA.3/4FT del Ejemplo 2 mediante el mismo procedimiento utilizado en las etapas de tamizaje. Como controles, se transfectaron células COS con p T21 :PL85 solo, o con pEA.3/4FT solo, o con un plásmido similar que no contenía inserto ("simulado"). 24 horas después de la transfección, las células transfectadas fueron tripsinadas y distribuidas en placas de cultivo de tejido de 6 pozos Costar. Las células de CHO: P-selectina fueron marcadas durante 16 horas con H-timidina usando métodos conocidos y preincubadas a 0.5 x 106 células/ml durante 30 minutos a 4 °C en medio a conteniendo 1 % de BSA (control); medio a conteniendo 1% de BSA, EDTA 5 m y EGTA 5 mM; medio conteniendo 1% de BSA y 10 de un anticuerpo monoclonal de anti-P-selectina de neutralización; y medio conteniendo 1 % de BSA y un anticuerpo monoclonal de anti-P-selectina de no neutralización. Las células preincubadas fueron entonces agregadas a los pozos conteniendo las células COS transfectadas. Después de una incubación de 1 0 minutos, las células sin unir fueron retiradas mediante 4 cambios de medio. Las células CHO:P-selectina unidas fueron liberadas por tripsinización y se cuantificaron mediante conteo de centelleo. Células COS co-transfectadas con ligando de P-selectina y las 3/4FT indujeron aproximadamente 5.4 veces más unión de células CHO:P-selectina relativas a células simuladas COS; ensayo en la presencia de EGTA y EDTA redujeron la unión al nivel de la células COS transfectadas simuladas. De forma similar, la incubación con anticuerpo de anti-P-selectina de neutralización también eliminó unión específica, mientras que no tuvo efecto el anticuerpo de no neutralización. En contraste, la unión de Cí 10: -selectina a células COS transfectadas con ligando de P-selectina solo no fue substancialmente diferente que la unión a las COS transfectadas simuladas tanto en la presencia como en la ausencia de EDTA y EGTA, o anticuerpos de anti-P-selectina. La unión de células CHO:P-selectina a células COS transfectadas con 3/4FT solo fue aproximadamente 2 veces más grande que el de las COS transfectadas simuladas, pero no fue afectada por la presencia o ausencia de EDTA y EGTA.

EJEMPLO 5 CONSTRUCCIÓN DE LIGAN DOS DE P-SELECTF A SOLUBLES Los adaptadores de EcoRI usados para generar la biblioteca de ADNc de células HL60 en el Ejemplo 1 contienen un sitio de restricción Xbal (TCTAGA) justo 5' desde el comienzo de la Secuencia No. 1 como está localizado en el plásmido pMT21 :PL85. Con el propósito de generar formas solubles del PSL, el plásmido pMT21 :PL85 fue restringido con Xbal y con HincII (el cual divide después del nucleótido 944 de la Secuencia No. 1 ). El fragmento de aproximadamente 950 bp así generado, conteniendo todo el segmento extracelular codificado del ligando hasta e incluyendo el codon para la valina 295, fue aislado y utilizado para generar ADNs que codificaban formas solubles de la proteína del ligando de la P-selectina como se representa en las secciones A a D siguientes.

A. Construcción de psPSL.QC El fragmento fue purificado y ligado en el vector de expresión mamífero pED entre los sitios Xbal y EcoRI, conjuntamente con ADN de oligonucleótido sintético de doble cadena que recreaba los codones desde Asn 296 hasta Cys 3 1 0 e introducía un nuevo codón tope inmediatamente siguiendo a Cys 310. La secuencia de los oligos es como sigue: 5' AACTACCCAGTGGGAGCACCAGACCACATCTCTGTGAAGCAGTGCTAG (SEQ ID No; 12) 5'-AATTCTAGCACTGCTTCACAGAGATGTGGTCTGGTOCTCCCACTGGGTAGTT (SEQ ID No: 13) El plásmido resultante fue designado como pED.sPSL.QC y la proteína expresada a partir del plásmido fue designada como sPSL.QC.

B. Construcción del psPSL.Q El fragmento fue purificado y ligado dentro del plásmido pED ( aufman et al., 1991 ) entre los sitios Xbal y EcoRI, conjuntamente con ADN de oligonucleótido sintético de doble cadena que recreaba los codones desde Asn 296 hasta Gln 309 e inlroducía un nuevo codón tope inmediatamente siguiendo a Gln 309. La secuencia de los ol igos es como sigue: 5--AACTACCCAGTGGGAGCACCAGACCACATCTCTGTGAAGCAGTAG (SEQ ID No: 14) 5'-AATTCTACTGCTTCACAGAGATGTGGTCTGGTGCTCCCACTGGGTAGTT (SEQ ID No: 15) El plásmido resultante fue designado como pED.sPSL.Q y la proteína expresada a partir del plásmido fue designada como sPSL.Q.

C. Construcción de psPSL.T7 Oligonucleótidos que codificaban 14 aminoácidos incluyendo un epitope derivado de proteína capside mayor del fago T7, creando una fusión de terminación C del epitope ''bandera" con un aminoácido adicional 32 derivado de la secuencia del vector. Dos oligonucleótidos que tenían las secuencias. 5 '-CTAGACCCGGGATGGCATCCATGACAGGAGGACAACAAAT GGTAGGCCGTAG (SEQ ID No: 16) y 5 '-AATTCTACGGCCTACCCATTTGTTGTCCTCCTGTCATGGA TGCCATCCCGGGT (SEQ ID No: 1 7) fueron duplicados y ligados con el fragmento largo Xbal-EcoRI del plásmido pED de expresión de mamífero. El plásmido resultante pED.T7 fue restringido con Xbal y Smal y ligado al fragmento Xbal-HincII de 950 bp descrito anteriormente, resultando en el plásmido pED.sPSL.T7. La proteína resultante de la expresión de pED.sPSL.T7 fue designada como SPSL.T7.

D. Construcción de Ligando de P-selectina soluble-Quimera de IgGFc El ADN de plásmido que codificaba para una forma extracelular soluble de la proteína del l igando de la P-selectina fusionada a la porción FC de inmunoglobulina humana IgGl fue construido como sigue: el vector pED.FC de expresión mamífero conteniendo secuencias que codificaban la región Fe de una IgGl humana con una secuencia ligadora nueva que hacía posible la fusión de la terminación amino de secuencias de codificación a la región eje a través de un sitio de restricción Xbal único. Se realizó una liga de tres fragmentos: pED.Fc fue restringido con Xbal y purificado en gel en forma lineal. El fragmento de 950 bp procedente de pMT21 :PL85 descrito anteriormente comprendía el segundo fragmento. El tercer fragmento consistía en ADNs de oligonucleótido sintético recocido que tenía la siguiente secuencia: 5 '-CTGCGGCCGCAGT (SEQ ID No: 1 8) S '-CTAGACTGCGGCCGCAG (SEQ ID No: 1 9) Los productos de la liga fueron hechos crecer como ADNs de plásmido y clonas individuales que tenían la configuración correcta fueron identificadas por secuenciación de ADN. El plásmido fue designado como pED.PSL.Fc. El ADN que codificaba para la región del ligando de P-selectina/proteína de fusión de Fe soluble que resultó se muestra en la SEQ ID No: 6.

EJEMPLO 6 CARACTERIZACIÓN DE LIGANDOS DE P-SELECTINA EXPRESADOS A. Caracterización de la Unión de la Proteína del Ligando de la P-selectina de Longitud Completa Expresada en Células COS La co-transfección de células COS con el plásmido pEA.3/4FT del Ejemplo 2 y el plásmido pMT21 :PL85 del Ejemplo 1 produjeron células COS que específicamente se unían a células CHO:P-selectina. Se observó esta unión solamente a la co-transfección de pEA.3/4FT y pMT21 :PL85; el uso de cualquier plásmido solo generó células COS que no se unían a células CHO:P-selectina. No se observó ninguna unión entre la línea celular progenitora CHO(DUKX) que no expresaba P-selectina y células COS co-transfectadas con pEA.3/4FT y pMT21 :PL85. La unión entre las células COS co-transfectadas y las células CHO:P-selectina es sensible a queladores de iones divalentes tales como EDTA y EGTA, consistentes con dependencia a Ca-1" " de la adhesión celular mediada por P-selectina, Un anticuerpo monoclona! de anti-P-selectina de neutralización bloqueó la unión entre las células CHO:P-selectina y las células COS que habían sido co-transfectadas con pEA.3/4FT y pMT21 :PL85, en tanto que un anticuerpo monoclonal de anti-P-selectina no neutralizante no tenía efecto sobre la unión. Los resultados del anticuerpo indicaron que el(los) dominio(s) funcional(es) de la P-selectina es(son) requerido(s) para unirse a la proteína del ligando de la P-selectina expresada sobre la superficie de las células COS.

B. Caracterización Electroforética del Ligando de la P-selectina de Longitud Completa Expresado en Células COS Se prepararon extractos detergentes de células COS transfectadas como sigue: 45 horas después de la co-transfección. aproximadamente 1 .5 x 1 07 células fueron suspendidas en 5 mi de regulador lisis (ácido piperazin-N, "-bis[2-etanosul fónico] 10 mM (PIPES) pH 7.5, C1 100 mM, MgCl2 3 mM, benzamidina 1 mM, 0.5 µg ml de leupeptina, 0.75 µg/ml de pepstatina, etilmaleimida 1 mM y 1 µg/ml de aprotinina) y se Usaron mediante tratamiento sónico. Se eliminaron los desechos celulares mediante centri fugación de baja velocidad (500 x g. 1 0 minutos) y una fracción de membrana se recolectó por ukracentrifugación ( 1 00,000 x g. 60 minutos). El granulo de membrana de alta velocidad fue resuspendido en un regulador de extracción (ácido 3-[N-morfolino]propanosulfónieo 1 0 mM] (MOPS) pH 7.5, NaCl 0.1 M, 02% de NaN3, 1 % de Thesit® (Sigma), benzamidina 1 mM, 0.5 µ§/ ?1 de leupeptina, 0.5 µ£/??1 pepstatina, etilmaleimida 1 mM y 1 g/ml de aprotinina). Las muestras fueron sometidas a electroforesia SDS-gel de poliacrilamida y transferidas a manchas de nitrocelulosa como sigue: una alícuota del extracto detergente fue suspendida en 1 % de regulador de carga S DS y calentada durante 5 minutos a 1 00 °C antes de cargarla a gel de poliacrilamida al 8- 16% (reducido) o un gel al 6% (no reducido) y sometida a electroforesia en el sistema regulador de Laemmli. Se prepararon manchas usando membranas de transferencias Immobilon-P®. Las manchas fueron sumergidas en MOPS 10 mM, pH 7.5, NaCl 0.1 M, NaN3 al 0.02%, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM y leche descremada al 10%, durante toda la noche a 4 °C. Los manchones fueron enjuagados una vez en el regulador anterior, menos la leche, y se incubaron en regulador de manchones (MOPS 10 mM, pH 7.5, NaCl 0. 1 M, 1 % de albúmina de suero bovino, 0.05% de Thesit, MgCh 1 mM, CaCl2 1 mM) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los manchones fueron entonces probados para la determinación del ligando de P-selectina como sigue: 50 ng de una quimera de P-selectina/Fc fue pre-incubada con 3 µa de " I-Proteína A en regulador de manchones durante 30 minutos a temperatura ambiente. Excipientes adicionales (por ejemplo, EDTA, EGTA, anticuerpos monoclonales) pudieron ser agregados a la mezcla de pre-incubación en este punto para evaluar sus efectos sobre la unión de la quimera al ligando de la P-selectina. La mezcla pre-inctibada fue entonces incubada con los manchones (preparados como se indicó anteriormente) durante 60 minutos a temperatura ambiente, y los manchones fueron subsecuentemente lavados cuatro veces con el mismo regulador de manchones (sin albúmina de suero bovino), secados con aire y sometidos a autoradiografia a -70 °C. Bajo condiciones no reductoras, se observaron dos bandas con esta técnica para extractos de membrana preparados a partir de células COS co-transfectadas. La banda principal migró con un peso molecular estimado de aproximadamente 220 kD, en tanto que la banda menor migró con un peso molecular de aproximadamente 1 10 kD. Bajo condiciones reductoras, solamente una sola banda se observó con un peso molecular de aproximadamente 1 10 kD, indicando que bajo condiciones no reductoras el ligando de la P-selectina existía como un homodímero. El peso molecular aproximado del monómero reducido es mayor que aquel pronosticado a partir de la secuencia de aminoácidos deducida de la clona de ADNc (45 kD). indicando que la proteína expresada sufre una modi ficación post-traducción extensa (ver Ejemplo 6(C)). La especificidad de la P-selectina/quimera Fe fue confirmada por la observación de que una sonda IgGi no específica no producía bandas sobre los manchones. Adicionalmente, la unión de la P-selectina/ quimera Fe a los manchones fue eliminada mediante EDTA, EGTA y un anticuerpo monoclonal de anti-P-selectina de neutralización. Las bandas específicas sobre los manchones solamente fueron observados a partir de extractos de membrana de células COS co-transfectadas con los plásmidos pEA.3/4FT y pMT21 :PL85. Los extractos de membrana procedentes de transfecciones de control (pEA.3/4FT o pMT21 :PL85 solos) fallaron en producir bandas susceptibles de ser observadas sobre los manchones.

C. Glicosilación de la Proteína del Ligando de la P-selectina La presencia de carbohidrato covalentemente unido a ligando de la P-selectina recombinante y su papel en la unión a P-selectina fue determinada como sigue: células COS fueron co-transfectadas con pED.sPSL.T7 del Ejemplo 5(C) y el plásmido pEA.3/4FT del Ejemplo 2. Después de 48 horas, las células fueron pulsadas con ""S-metionina. 200 µ? de medio acondicionado de sPSL.T7 marcado con °S-metionina fue incubado con 5 ^ig de LEC-? ? en la presencia de CaC12 2 mM y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA). Después de rotación durante 2 horas a 4 °C, cuentas de Proteína A-Sepharose (Pharmacia) fueron agregadas durante 1 hora a 4 °C, granuladas mediante centrifugación y lavadas dos veces en solución salina regulada con Tris (Tris-HCl 20 mM, NaCl 1 50 mM pH 7.5, de aquí en adelante referida como TBS) conteniendo CaCl2 2 mM y 1 mg/ml de BSA. Los gránulos fueron entonces resuspendidos y tratados con neuraminidasa (Streptococcus pneumoniae), O-glicanasa y N-glicanasa (todas de Genzyme) como sigue. Todas las digestiones con glicosidasa fueron hechas a 37 °C durante toda la noche. Para la digestión con neuraminidasa, los gránulos fueron resuspendidos en 50 µ? de regulador de ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico (MES), pH 6.5 (Caalbiochem) y 0.1 % de SDS, se calentó a 95 °C durante 5 minutos, posteriormente se granuló. El sobrenadante fue modificado para contener 1 .4% de B-D-glucopiranosido de n-Octilo (OGP). acetato de calcio 1 0 mM, cacodilato de sodio 20 mM y PMSF 2.5 mM, pH final 7.0. Se agregaron 8 µ? de neuraminidasa para una concentración final de 1 unidad/ml. Para la digestión con neuraminidasa/O-glicanasa, la muestra fue preparada como se indicó anteriormente y conjuntamente con la neuraminidasa, la O-glicanasa fue agregada también para una concentración final de 0. 1 unidades/ml , Para la digestión con N-glicanasa, el gránulo fue resuspendido en 54 ul de regulador MES y 1 % de SDS, calentado a 95 °C durante 5 minutos y posteriormente se granuló. El sobrenadante fue modificado para contener fosfato de sodio 0.2 M, 3.5% de OGP y PMSF 2.5 mM, pH final 8.5. Se agregó N-glicanasa para una concentración final de 12 unidades/ml y se incubó como se indicó anteriormente. El efecto del tratamiento con glicosidasa en sPSL.T7 fue evaluado en dos formas. Para esto, cada muestra de proteína digerida fue dividida en dos fracciones iguales. Una fracción fue precipitada con el anticuerpo policlonal de P-selectina del Ejemplo 7(A), para mostrar el efecto de la digestión en la movilidad electroforética. La otra fracción fue precipitada con la quimera LEC-?? del Ejemplo 4(A) para evaluar la actividad de unión remanente del ligando de la P-selectina después de la digestión. Las muestras inmunoprecipitadas fueron analizadas mediante electro foresia SDS-gel de poliacri lamida bajo condiciones reductoras y autoradiografía. En la ausencia del tratamiento de glicosidasa, la autoradiografía reveló bandas comparables (con pesos moleculares de 1 10 kD) para cada precipitación. Cuando la proteína del ligando de la P-selectina fue tratada con neurominidasa, la precipitación del anticuerpo policlonal del ligando de anti-P-selectina reveló un ligero decremento en la movilidad, consistente con la eliminación de los residuos de ácido siálico. La cantidad de la proteína del ligando de la P-selectina precipitada mediante LEC-?? fue significativamente reducida después del tratamiento con la neuraminidasa, consistente con el papel de los residuos de ácido siálico en la interacción de P-selectina/ligando de la P-selectina. Cuando la proteína del ligando de la P-selectina fue tratada tanto con neuraminidasa como con O-glicanasa se observó un incremento substancial en la movilidad electroforética después de la precipitación con el anticuerpo policlonal del ligando de anti-P-selectina. indicando que el número de cadenas de ol igosacárido con enlace O habían sido el iminadas. Sin embargo, la remoción de oligosacáridos con enlace O de la proteína del ligando de la P-selectina puede que no haya sido completa, puesto que la movilidad electroforética no correspondía con una proteína con un peso molecular de 38 kD, como sería pronosticado a partir de la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID No: 1 . La proteína del ligando de la P-selectina digerida con neuraminidiasa/O-glicanasa se unió a LEC-y l muy pobremente, indicando el papel de los oligosacáridos en la interacción de P-selectina/ligando de la P-selectina. El tratamiento del ligando de P-selectina purificado con N-glicanasa resultó en un ligero incremento en la movilidad electroforética, demostrando que algunos de los sitios de consenso para la glicosilación con enlace N estaban ocupados. La cantidad de la proteína del ligando de la P-selectina precipitada por LEC-?? fue ligeramente reducida, indicando que la glicosilación con enlace N también contribuía a la interacción de P-selectina/ligando de la P-selectina, aunque no dramáticamente como la sialilación y la glicosilación con enlace O.

EJEMPLO 7 ANTICUERPOS POLICLONALES ESPECÍFICOS PARA LIGANDOS DE P-SELECTINA A. Proteína de Fusión de Proteína Policlonal del Ligando de anti-P-selectina de Conejo/Proteína de Unión de Maltosa El anticuerpo policlonal del ligando de anti-P-selectina fue generado por inmunización de conejos con una proteína de fusión generada en E. coli. La proteína de fusión consistía en un tercio de la terminación amino del ligando de la P-selectina (aminoácidos 1 a 10 de la SEQ ID No: 1) fusionado en marco a. la proteína de unión de maltosa (Maina, C.V. et al., Gene 74, 365-373 ( 1988); Riggs, P., en Current P otocols in Molecular Biolo v, F.M. Ausebel et al., Eds„ Grene Associates/Wiley Interscience (New York, 1 990) capítulo 16.6). Bajo las condiciones empleadas aquí, el anticuerpo de la proteína de fusión reconoce la proteína del ligando de la P-selectina.

B. Proteína Policlonal de Anti-sPSL.T/ de Conejo Una forma soluble de la invención (sPSL.T7; ver Ejemplo 5(C)) fue purificada hasta homogeneidad clara de acuerdo con el siguiente esquema: fueron transfectadas células COS con tres plásmidos, uno que codificaba cada uno de los siguientes sPSL.T7 (Ejemplo 5(C)), 3/4FT (Ejemplo 2) y una forma soluble de PACE (como se representa en la SEQ ID No: 5). Después de 72 horas, el medio acondicionado fue recolectado y el recombinante sPSL.T7 fue purificado como sigue. Medio acondicionado fue diluido dos veces con MOPS 50 mM, NaCl 150 mM, CaCb 0.5 mM y MnCL 0. 5 mM, pH 7.2 y se aplicó a una columna de lentil lectin-Sepharose 4B equilibrada en el mismo regulador. Después de la carga, la columna fue lavada con el mismo regulador hasta que la absorbancia óptica a 280 nm cayó hasta una línea de referencia estable. La columna fue entonces eludada con el mismo regulador que había sido ajustado a a-metil- manosido 0.5 M y NaCl 0.3 M. El sPSL.T7 recombinante fue recolectado sobre volúmenes de 5- 1 5 columnas de este regulador de elución. El eluato de lentil lectina fue entonces sometido a precipitación con sulfato de amonio al 0-70% agregando 472 g de sulfato de amonio por litro de eluato de columna a 4 °C. Después de agitación durante 30 minutos, el precipitado fue resuspendido en un volumen mínimo de TBS (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5) y se aplicó a una columna de filtración de gel TS G4000S WXL equilibrada en TBS. La velocidad de flujo en la columna era de 0.5 ml/min y se empleó una columna guardián. En alícuotas de <250 µ?, el granulo de sulfato de amonio resuspendido fue inyectado a la columna y se analizaron fracciones mediante SDS-PAGE con análisis Western. Las fracciones conteniendo sPLS,T7 fueron acumuladas en una polla y posteriormente se usaron para la inmunización de conejos. Se generaron anticuerpos para sPSL.T7 en la forma estándar mediante cebadura de antígeno y subsecuente incremento en un periodo de 3 meses. Específicamente, la inmunización primaria fue realizada mezclando 50 µg de sPSL.T7 (desnaturalizado mezclando en 0.1% de SDS y calentando durante 10 minutos a 100 °C) con adyuvante de Freund completo y la inyección en cinco sitios subcutáneamente. El segundo (y todos los demás subsecuentes) incrementos fue realizado mezclando 25 (.tg de sPSL.T7 (desnaturalizado mezclando en 0. 1 % de SDS y calentando durante 10 minutos a 100 °C) [12.5 µg para el tercero y subsecuentes incrementos] con adyuvante de Freund incompleto e inyectando en dos sitios subcutáneamente (o posteriormente, en forma intramuscular) cada dos semanas. Se ejecutaron diez pruebas de sangrado cada dos semanas para monitorear el título de anticuerpos. Cuando el título de anticuerpos alcanzó un nivel apropiado, se realizó un sangrado a gran escala y se preparó una fracción de suero total. Esta preparación de anticuerpo policlonal fue usada para inhibir el unión específica de células HL-60 a células CHO:P-selectina en una forma similar que para aquella descrita en el Ejemplo 4. Este ensayo empleó células HL60 marcadas fluorescentemente (marcadas con BCECFAM; 2',7'-bis-(2-carboximetil)-5-(y-6)-carboxifluoresceina, éster de acetoximetilo) uniendo a células CHO en placas sobre la parte inferior de placas de microtitulación. Las células HL60 marcadas fueron pre-incubadas ya sea con sueros conteniendo anticuerpo policlonal o con sueros pre-inmunes durante 30 minutos a 4 °C. Las células fueron posteriormente lavadas e incubadas con las células CHO.P-selectina durante 10 minutos. Las placas fueron posteriormente lavadas y la fluorescencia leída con un lector de placas de microtitulación de fluorescencia. Usando este ensayo, una dilución 1 : 1 5 del suero policlonal de anti-sPSL.T7 resultó en inhibición esencialmente completa de la unión de células HL60 a CHO:P-selectina. La inhibición demostrable de la unión de HL60 a CHO:P-selectina todavía fue observada en diluciones de antisuero de 1 : 1 50. El suero pre-inmune no tenía efecto en la unión de células HL60 a CHO:P-selectina.

EJEMPLO 8 COTRANSFORMACIÓN CON CORE2 A. Aislamiento del ANDc que codifica para la Transferasa GlcNAc de Core2 El ADNc que codifica para la transferasa GlcNAc de core 2 fue aislada mediante técnicas estándar de biología molecular. Dos oligos fueron diseñados en el 5' y 3 ' (incluyendo el codón de iniciación y terminación de traducción, respectivamente) en base a la secuencia core2 humana publicada (Bierhuizen, M.F.A.. Fukuda. M .. Proc. Nati. Acad. Sci. 89, 9236-9330 ( 1992)). Las pollas de una biblioteca de ADNc de HL60 (Sako, D. Cell 75, 1 179-1 1 86 (1993) fueron usadas como modelo para amplificar la secuencia de codificación de core2 mediante un protocolo de PCR estándar. El fragmento amplificado de PCR fue purificado y subclonado en el vector pED. Para aislar ADNc. las pollas que dieron una señal positiva en la reacción PCR fueron transformadas en E. coli y emplacadas. Los transformantes fueron transferidos sobre filtros de nitrocelulosa e hibridizados con un fragmento de PCR radioetiquetado con 32P de acuerdo con protocolos estándar. Las clonas positivas fueron recogidas y purificadas mediante re-empiacado. La secuencia de ADNc y la clona de PCR fueron confirmadas mediante secuenciamiento dideoxi.

B. Generación de Líneas Celulares Estables de Ovario de Hámster Chino PSGL-1 que Expresan Enzima de Core2 Una línea celular hecha de acuerdo con los métodos del Ejemplo 3 expresando la proteína del ligando de la P-selectina de longitud completa y 3/4fucosiltransferasa fue co-transfectada con ADNc de core2 y un gene resistente a neomicina (pMT4Neo) mediante métodos estándar de fosfato de calcio. Después de aproximadamente dos semanas, transfactantes estables y resistentes a G41 8 fueron recolectados ya sea como aislados sencillos o en una polla. Estos transfectantes fueron hechos crecer en 1 mg/ml de medio DMEM completo de G41 8 y se analizaron en cuanto a actividad de enzima de core2 (Higgins, E.A. et al., J. Biol. Chem, 266, 6280-6290 (1991 )). Las clonas positivas o pollas encontradas como positivas a actividad de core2 fueron analizadas para determinar la unión del ligando de la P-selectina a P-selectina mediante varios métodos. En una forma simi lar, las líneas celulares que expresaban ya sea la proteína del ligando de la P-selectina o proteína soluble del ligando de la P-selectina tanto con 3/4fucosiltransferasa como con enzimas de PACE (ver Ejemplo 3) fueron usadas para aislar cotransfectantes estables de core2 como se describió anteriormente.

C. Efectos de Core2 sobre la Actividad de Unión de la P-selectina Los efectos de core2 sobre la actividad de unión de la P-selectina fueron evaluados por tres diferentes métodos. 1 . Unión de los transfectantes mPGSL- 1 a P-selectina soluble inmobilizada o P- selectina Quimera IgG Se recubrieron placas de 48 pozos con 1 ^ig/ml de anticuerpo de Fe antihumano en Tris 50 mM, pH 9.5 a 4 °C durante cinco a seis horas. Después de lavar dos veces con regulador HBSS, P-selectina/quimera IgG (0.1 - 1 ng/ml de conc. del Ejemplo 5) fue colocada en placa en regulador HBSS durante toda la noche a 4 °C. Las placas fueron bloqueadas con BSA (3 mg/ml) a 4 °C durante de tres a cuatro horas. En el caso de la proteína del ligando de la P-selectina soluble, la proteína fue directamente recubierta directamente sobre placas en el mismo regulador. Las células CHO marcadas con 3H fueron levantadas con EGTA 2 mM, lavadas tres veces con PBS y resuspendidas hasta una densidad final de 106 células/ml. Una alícuota de 300 ul de esta suspensión fue agregada a cada pozo (300,000 células/pozo)). Después de incubación por 12 minutos a temperatura ambiente, los pozos fueron lavados cuatro veces con DMEM libre de suero para eliminar las células sin unir. Las células unidas fueron levantadas con EGTA 5 mM y contadas por conteo de centelleo. Células U937 empleadas como un control positivo para la unión de proteína del ligando de la P-selectina natural fueron pret atadas con gammaglobulina (5 mg/ml) para bloquear el receptor Fe endógeno antes de la unión con la quimera de P-selectina IgG. Los datos de unión comparativos se muestran en la Figura 1. 2. Inmunoprecipitación de PSGL- 1 con P-selectina/Quimera IgG Proteína del ligando de la P-selectina recombinante y de longitud completa o soluble, preparada a partir de transformantes, con y sin core2 adicional, fue marcada con 35S-metionina y subsecuentemente inmunoprecipitada ya sea con el anticuerpo policlonal de la proteína del ligando de la anti-P-selectina o con P-selectina/quimera IgG como se describió anteriormente en los Ejemplos 7 y 5; Sako, D. Cell 75, 1 1 79- 1 186 ( 1993), Datos descritos en la Figura 2. 3. Citometría de Flujo Transfectantes de la proteína del ligando de la P-selectina de murino (con y sin core2) fueron analizados mediante técnicas FACS estándar usando ya sea P-selectina/quimera IgG (LecY l ) (Ejemplo 5) o anticuerpo monoclonal de la proteína del ligando de anti-P-selectina (Mab 275, generado contra un péptido que tenía la secuencia del aminoácido 42 al aminoácido 56 de la SEQ ID No: 2). Ambos reactivos fueron preconjugados a Proteína A marcada con FITC. Las células fueron analizadas mediante FACS después de incubación con este conjugado durante 30 minutos a 4 °C en la presencia de CaCh 2 mM. Los datos se describen en la Figura 3.

EJEMPLO 9 UNION DE E-SELECTI A DE PROTEÍNA DE UNIÓN DE P-SELECTfNA Se preparó E-Selectina/quimera IgG como se describió en el Ejemplo 5 para la quimera de P-selectina/IgG usando un ADN que codificaba E-selectina incluyendo los aminoácidos -21 a 536 de la secuencia reportada en Bevilacqua et al., Science, 243 : 1 160 (1986). Células U937 (aproximadamente 6.5 x 1 07) fueron recuperadas de placas de cultivo de tejido y divididas igualmente en dos cultivos de 50 mL (concentración final de 1 .3 x 106 células/mL) conteniendo medio RPMI completo y nuevo e hidrocloruro de 3H-glucosamina (marcas el carbohidrato unido a proteína, de gl icoproteínas [Varki, FASEB 5 ;226-235 ( 1 991 )] . Después de 48 horas de incubación, las células procedentes de ambos cultivos fueron recuperadas por centrifugación y lavadas tres veces con PBS. Las células peletizadas fueron suspendidas en 2.5 mL cada una de un regulador de lisis conteniendo 1 % de Tritón X- 100 y fracturadas mediante tratamiento sónico por sonda durante dos minutos. Los lisatos de detergente fueron colocados sobre hielo durante tres horas y posteriormente se volvieron a someter a tratamiento sónico durante unos dos minutos adicionales. Los lisatos fueron centrifugados a 16.000 rpm durante 5 minutos, los sobrenadantes fueron recuperados y cada uno ajustado a 1 2 mL con regulador lisis que no contenía detergente. A uno de los dos lisatos de célula diluidos se le agregaron 100 uL de sefarosa de proteína A preacoplada con P-selectina/quimera IgG (ver Ejemplo 5) y al otro se le agregaron 100 uL de sefarosa de proteína A preacoplada con E-selectina/quimera IgG. Ambas proteínas quiméricas estuvieron presentes en una densidad de aproximadamente 1 mg de proteína'mL de resina. Se permitió que las reacciones de unión avanzaran durante toda la noche a 4 °C con mezclado de principio a fin. En ocasiones, membranas purificadas de células U937 sirvieron como el material de arranque para la extracción de detergente de proteínas marcadas. En estos casos, las etapas de extracción de detergente y de precipitación por afinidad fueron esencialmente idénticas a las anteriores. En seguida a la incubación, las dos mezclas de reacción paralelas fueron centrifugadas cada una a 2,000 rpm y los sobrenadantes fueron descartados. Los gránulos de resina fueron lavados cuatro veces con regulador (MOPS 10 niM, NaCl 100 mM, CaCb 1 mM, MgCl2 1 mM, 0.02% de NaN3< pH 7.5 con Tritón X- 1 00 [0.25% para los lavados primero y segundo, 0.1 % para el tercer lavado y 0.01 % para el cuarto lavado]. Un lavado final de 1 mL de cada gránulo de resina usando regulador conteniendo 0.01 % de Tritón X- 1 00 fue realizado y estos fueron mantenidos para cuantificación de cuentas por radioactividad mediante conteo por centelleo líquido (LSC). Las resinas fueron entonces dudadas durante toda la noche a 4 °C con mezclado de principio a fin en 1 mL cada una de un regulador conteniendo 0.01 de Tritón X-100 y EDTA 10 mM. Los sobrenadantes fueron recuperados por centrifugación y posteriormente cuantificados mediante LSC. La autoradiografía de los materiales liberados desde las resinas mediante EDTA fue realizada por electroforesia de muestras (se requirieron muestras de aproximadamente 10,000 cpm concentradas mediante 1 0 unidades Centricon) en 10% de geles de SDS-PAGE reticulados, y tratamiento subsecuente de los geles con EN3HANCE (Dupont) según las instrucciones del fabricante, seguido por secado durante dos horas en un secador de gel disponible cometcialmente (Bio-Rad). Se llevó a cabo una exposición de los geles secos a una película de rayos X durante un mínimo de tres días a -80 °C. La elución de E- o P-selectina inmovilizada, previamente expuesta a extractos de detergente de células U937 y lavadas exhaustivamente con EDTA produjo proteínas marcadas con 3H-glucosamina. liberadas. La cantidad de radiomarca recuperada de los eluatos de EDTA fue de cuando menos 10 veces mayor que las cuentas observadas en los lavados pre-EDTA, finales. Esta observación sugiere que la afinidad tanto de las quimeras de P- como de E-selectina capturaron Hgando(s) de lisatos de célula completa de U937 en una forma dependiente de EDTA y que los ligandos capturados eran subsecuentemente liberados con tratamiento de las resinas con EDTA. La evaluación de las proteínas liberadas por EDTA de las dos quimeras fue realizada por SDS-PAGE y autoradiografía bajo condiciones reductoras y no reductoras (se usaron estándares de peso molecular marcados con | C que son comercialmente disponibles). Como se muestra por la autoradiografía descrita en la Figura 4, las cuentas liberadas procedentes de lisatos de célula completa tratados con la quimera de P-selectina (sendas 2 y 10) y la quimera de E-selectina (sendas 4 y 8) se correlacionaban con una especie principal de peso molecular de 200 kD, no reducida (sendas 2 y 4), y de 1 00 kD reducida (sendas 8 y 10). En experimentos diferentes descritos en la Figura 4, en donde extractos de membrana purificada fueron usados como el material de arranque en lugar de células completas, tanto la quimera de E-selectina (senda 3. no reducida y senda 9, reducida) como la quimera de P-selectina (no mostrada) dieron resultados similares. Otros experimentos han demostrado que la glicoproteína U937 mayor que se une a P-selectina es inmunoreactiva con Rb3026, un anticuerpo policlonal generado contra sPSGL l .T7 recombinante. Por lo tanto, las P- y E-selectina reconocen específicamente una especie de glicoproteína mayor con propiedades idénticas en cada caso.

EJEMPLO 10 PRODUCCIÓN Y ANÁLISIS DE FORMAS SUPRIMIDAS O ALTERADAS DE LA PROTEÍNA SOLUBLE DEL LIGANDO DE LA P-SELECTINA A. Generación de Construcciones de ADN Se generaron formas truncadas de las quimeras de la proteína del ligando de la P-selectina/IgG como sigue. El plásmido pED.PSL.Fc fue restringido con PstI y Notl y el fragmento de 6 kb que comprendía la porción Fe y el vector, pEDFcókb, fue purificado en gel. Las construcciones pED.149.Fc, pED.47.Fc y pF.D.1 9Fc fueron creadas mediante técnica PCR estándar, usando los siguientes pares de primarios de oligonucleótidos. Primario "corriente arriba" para todas las construcciones: 5'-CCAGGTCCAACTGCAGGTCGACTCTAGAGGGCACTTCTTCTGGGCCCACG-3' (SEQ ID No: 20) Primario "Corriente abajo" para 148Fc: 5'-TATTATCTGTGCGGCCGCCCTCCAGAACCCATGGCTGCTGGTTGCAGTGG-3' (SEQ ID No: 21 ) Primario "Corriente abajo" para 47Fc: 5 '-TATTATCTGTGCGGCCGCGCAGC AGGCTCC AC AGTGGTAG-3 ' (SEQ ID No: 22) Primario "Corriente abajo" para 19Fc: 5 '-TATTATCTGTGCGGCCGCGGAGGCTCCGTTTCTGGC AG-3 ' (SEQ ID No: 23) El ADN modelo para la reacción PCR fue pED.PSL.Fc. Las condiciones PCR fueron 94 °C, 1 min, ; 42 °C, 1 min.; 72 °C, 3 min. ; 25 ciclos, usando un Termociclizador Perkin-Elemer. Después de completar el último ciclo, la reacción fue tratada con enzima de lenow a 25 °C durante 30 min., extraída con fenol cloroformo, acetato de sodio agregado a 0.3 M y el ADN producto de PCR fue precipitado con 2.5 volúmenes de etanol. Los granulos de ADN fueron enjuagados con 70% de etanol y se evaporó el etanol residual. El ADN resuspendido fue digerido con PstI y Notl, purificado en gel y ligado con el fragmento de pEDFcókb descrito anteriormente. Las construcciones correctas fueron identificadas mediante análisis de restricción y confirmadas por secuenciamiento de ADN. Los plásmidos pED.AY148.Fc y pED.H24.Q70.148.Fc fueron creados mediante mutagénesis dirigida de sitio (Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories) usando pED.148Fc como modelo y los siguientes oligonucleótidos de mutagénesis: para ?? 148: 5'-CGGAGACAGGCCACCGAATTCCTGCCAGAAACG-3 ' (SEQ ID No: 24) para H24: 5'-CCTCCAGAAATGCTGAGGCACAGCACTGACACCACTCCTC-3 ' (SEQ ID No: 25) para Q70: 5'-GAGCTGGCCAACATGGGGCAACTGTCCACGGATTCAGCAG-3 ' (SEQ ID No: 26) Las clonas positivas fueron identificadas por hibridización de colonia (Maniatis et al., supra).

El pED.FFFE.148.Fc fue construido restringiendo pED.AY 148.Fc con EcoRI y ligando los siguientes oligonucleótidos duplicados: 5 ' - A ATTCGAGTTCCT AG ATTTTG-3 ' (SEQ ID No: 27) y S ' -AATTCAAAATCTAGGAACTCG-S 1 (SEQ [D No: 28) Las construcciones de las series pED.FYYD, 19.Fc, pED.FFYD.1 .Fc y pED.FFFD.19.Fc fueron hechas por restricción de pED.AY148.Fc con EcoRI y Notl y ligando los siguientes oligonucleótidos duplicados: para pED.FYYD, 19.Fc: 5'-AATTCGAGTACCTAGATTATGATTTCCTGCCAGAAACTGAGCCTCCGC-3 ' (SEQ ID No: 29) y 5 "-DGCCGCGGAGGCTCAGTTTCTGGCAGGAAATCATAATCTA GTACTCG-3' (SEQ ID No: ) para pED.FFYD.19.Fc: 5'-AATTCGAGTTCCTAGATTATGATTTCCTGCCAGAAACTGAGCCTCCGC-3' (SEQ I D No: 3 ! ) y 5'-GGCCGCGGAGGCTCAGTTTCTGGCAGGAAATCATAATCTAGGAACTCG-3 ' (SEQ ID No: 32) para pED.FFFD. 19.Fc: 5 '-AATTCGAGTTCCTAGATTTCGATTTCCTGCCAGAAACTGAGCCTCCGC-3 ' (SEQ I D No: 33) y 5 "-GGCCGCGGAGGCTCAGTTTCTGGCAGGAAATCGAAATCTAGGAACTCG-3 ' (SEQ ID No: 34) B. Ensayo de Unión en Placa para Análisis de Formas Suprimidas o Alteradas de Proteína Soluble del Ligando de la P-Selectina Los A DNs de plásmido ind i vidual es que codi ficaban para las varias formas muladas de quimeras solubles de PSGL- l /Fc fueron co-transfectados con ADNc de PACE y pEA.3/4FT en células COS como se describió en el Ejemplo 3(C). 50 mi de medio libre suero, recolectado 40-64 horas después de la transfección de aproximadamente 107 células COS, fueron puri ficados en una columna de 0.25 mi de sefarosa de proteína A (Pharmacia) equilibrados con 'I BS complementado con CaCl2 2 mM, Después del lavado con 20 mi de TBS/CaCh el material unido se eluyó con 0.5 mi de ácido acético 0. 1 , NaCl 0.1 5M, CaCl2 2 mM. El material eludado fue neutralizado con l /20avo de volumen de Tris 3M pH 9.0. El material fue cuanti ficado por medición de la absorbancia a 280 mu y por manchado de azul de comassie de geles PAGE/SDS/Laemmli. Con el propósito de producir formas no sulfatadas de PSGL-1 soluble, transfecciones de células COS de las quimeras Fe relevantes fueron realizadas como se describió anteriormente excepto porque en seguida a la transfección las células fueron cultivadas en la presencia de Clorato 50 mM (Sigma). La adhesión cuantitativa de células que expresaban CHO:P-selectina, CHO:E-selectina y CHO:L-selectina fue realizada como se describió en el Ejemplo 4(C), con las siguientes modificaciones: células COS y anticuerpos fueron omitidos. En sustitución, placas de microtitulación de 48 pozos (Costar) fueron recubiertas durante 16 horas a 4 °C con cantidades variables de quimeras solubles de PSG/Fc purificadas de proteína A. El material sin unir fue retirado y los pozos recubiertos fueron tratados con solución salina regulada de Hank (HBS) con 1 mg/ml de BSA y CaCI2 2 mM durante 1 hora a 4 °C. Las células de expresión de CHO selectina, marcadas con tritio fueron agregadas y se cuantificó la unión como se describe en el Ejemplo 4(C).

C. Efectos de la Alteración de Sitios de Glicosilación con Enlace N Construcciones que expresaban tres quimeras de ligando de la P-selectina-IgG fueron construidas para examinar los efectos de los sitios de glicosilación con enlace N en la unión de selectina. Estas construcciones tenían las siguientes características: 148Fc aminoácidos 42- 1 89 de SEQ ID No: 2 Q70.148.Fc aminoácidos 42- 1 89 de la SEQ ID No: 2, con el residuo asparragina en la posición 1 1 1 de la SEQ ID No: 2 reemplazado con un residuo glutamina.

H24.Q70.148.Fc aminoácidos 42- 1 89 de la SEQ ID No: 2, con el residuo asparragina en la posición 65 de la SEQ ID No: 2 con un residuo histidina y el residuo asparragina en la posición 1 1 1 de la SEQ ID No: 2 reemplazado con residuo glutamina. Las construcciones son esquemáticamente representadas en la Figura 6. Se comparó la unión de estas construcciones a proteína A y P-selectina-quimera IgG (LEC-?? ). Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 7. La comparación de las sendas 4, 5 y 6 en la autoradiografía demuestra que la remoción de uno o ambos de los primeros dos sitios de glicosilación con enlace N en la proteína soluble del ligando de la P-selectina no afecta de manera importante su unión a P-selectina.

D. Efectos de Tirosinas Se realizaron construcciones para examinar el papel de la tirosina en la unión de la proteína del ligando de la P-selectina a selectinas mediante la alteración de la región aniónica de la proteína soluble. Las siguientes construcciones fueron hechas: AY148.Fc aminoácidos 42- 189 de la SEQ ID No: 2, con los aminoácidos 46- 52 suprimidos. FFFE.148.Fc aminoácidos 42- 189 de la SEQ ID No: 2, con los residuos tirosina en las posiciones 46, 48 y 51 reemplazados con residuos fenilalanina y el residuo de ácido aspártico en la posición 52 con un residuo de ácido glutámico. Estas construcciones son esquemáticamente representadas en la Figura 8. El grado y sitios de sulfatación de la proteína del ligando de la P-selectina fueron examinados expresando las construcciones relevantes en la presencia de sulfato marcado radiactivamente. El grado de sulfatación de 148. Fe y AY.148.Fc fueron comparados con aquel de una P-selectina-quimera IgG, la cual no estaba sulfatada. Los resultados son descritos en la Figura 9. Estos datos demuestran que la mayoría de la incorporación de sulfato es dentro de la región aniónica de la proteína del ligando de la P-selectina.

Se hicieron construcciones adicionales para determinar la sulfatación de la región aniónica ocurrida en los residuos tirosina. Las siguientes construcciones adicionales fueron hechas: FYYD.19.Fc aminoácidos 42-60 de la SEQ ID No: 2, con el residuo tirosina en la posición 46 de la SEQ ID No: 2 reemplazado con un residuo fenilalanina. FFYD.19.Fc aminoácidos 42-60 de la SEQ ID No: 2, con los residuos tirosina en las posiciones 46 y 48 de la SEQ ID No: 2 reemplazados con residuos fenilalanina. FFFD.19.Fc aminoácidos 42-60 de la SEQ ID No: 2, con los residuos tirosina en las posiciones 46, 48 y 51 de la SEQ ID No: 2 reemplazados con residuos fenilalanina. Las construcciones son esquemáticamente representadas en la Figura 9. Se comparó el grado de sulfatación de estas construcciones con 19.Fc("YYYD.19.Fc"). Los resultados se muestran en la Figura 1 0. 1 Y YD. 1 9. Fe mostró una sulfatación importante mientras que FFFD. 1 9,Fc estaba substancialmente menos sulfatada. Por lo tanto, los residuos tirosina de la región aniónica de las proteínas del ligando de la P-selectina son el mayor sitio de sulfatación. La remoción del sulfato de la proteína del ligando de la P-selectina reduce substancialmente su unión a P-selectina. La unión de 148. Fe tratado con clorato a P-selectina fue examinada. Como se muestra en la Figura 1 1 , la inhibición de la sulfatación por tratamiento con clorato redujo substancialmente la cantidad de unión de la proteína del ligando de la P-selectina a P-selectina.

E. Efectos sobre Deleciones con terminación C Se hicieron varias construcciones adicionales con la terminación C suprimida como sigue: 254,Fc aminoácidos 42-295 de la SEQ ID No: 2. 47,Fc aminoácidos 42-88 de la SEQ ID No: 2. 19.Fc aminoácidos 42-60 de la SEQ ID No: 2. Estas construcciones son esquemáticamente mostradas en la Figura 12. Se probó la unión de 452. Fe, 148. Fe, 47.Fc y 19.Fc a P-selectina, E-selectina y L-selectina Las Figuras 23-24 comparan la unión de estas quimeras de deleción a selectinas y controles. Los resultados también se resumen en la Figura 12.

F. Unión a Células que Expresan P-selectina y E-selectina Se comparó la unión de varias construcciones descritas anteriormente a células que expresaban P-selectina y E-selectina usando un ensayo de unión en placa cuantitativo del Ejemplo 4(C) (el cual es esquemáticamente descrito en la Figura 13). La Figura 14 compara la unión de 1 48. Fe, ??.148. Fe, FFFE.148.Fc e IgG humana a células CHO que expresan P-selectina. La deleción de todos los residuos tirosina en la región aniónica en AY.148.Fc eliminó la unión. El cambio de los residuos tirosina a residuos fenilalanina en FFFE.148.Fc redujo substancialmente la unión según se compara con 148. Fe. Por lo tanto, se demostró que la presencia de la región aniónica de longitud completa es esencial para la unión de P-selectina y que la unión de P-selectina es mejorada mediante la sulfatación de esta región. La Figura 14 también reporta experimentos de control que demuestran que 148. Fe, AY.148.Fc y FFFE.148.Fc no se unen a células CHO que no expresan selectina. La Figura 1 5 compara la unión de 1 48. Fe. AY.148.Fc, FFFE. 148.Fc e IgG humana con células CHO que expresan E-selectina. La unión de E-selectina no fue afectada por las deleciones o alteraciones de la secuencia natural, Por lo tanto, se demostró que la región aniónica no es requerida para la unión de E-selectina. La Figura 16 resume los resultados de las Figuras 14 y 15. La Figura 17 compara la unión de 47. Fe a células CHO que expresan P- y E-selectina. 47. Fe demostró unión substancial a ambas selectinas a pesar de la deleción de los sitios de glicosilación con enlace N en las posiciones 1 1 1 y 292 de la SEQ ID No: 2. La Figura 19 compara la unión de FYYD. 19.Fc, FFFD. 1 .Fc, H24.Q70.1 48.Fc, 148. Fe e IgG humana a células CHO que expresan P-selectina. El reemplazo de todos los residuos tirosina en la región aniónica en FFFD.1 9.Fc eliminó la unión. El cambio del residuo tirosina en la posición 46 a un residuo fenilalanina en FYYD. 1 9.Fc redujo substancialmente la unión cuando se comparó con 148. Fe. La alteración de los sitios de glicosilación con enlace N en H24.Q70.148,Fc no afectó la unión. Por lo tanto, se demostró que la unión de P-selectina es mejorada por la sulfatación en la región aniónica y que la glicosilación con enlace N no es requerida para la unión de P-selectina. La Figura 19 también reporta experimentos de control que demuestran que FYYD.19.Fc, FFFD.19.Fc, H24.Q70.148.Fc y 148. Fe no se unen a células CHO que no expresan selectina más que IgG l humana sola. La Figura 20 compara la unión de FYYD. ! 9.Fc, FFFD.19.Fc, H24.Q70.148.Fc, 148.Fc e IgGl humana a células CHO que expresan E-selectina. El truncado de la proteína del ligando al grado de FYYD.19.Fc y FFFD.19.Fc reduce substancialmente la unión de E-selectina. La alteración de los sitios de glicosilación con enlace N en H24.Q70.148.Fc no afectó de manera importante la unión de E-selectina. Así, se demostró que las proteínas del ligando de la P-selectina que comprenden los aminoácidos 42 a 60 de la SEQ ID No: 2 pueden selectivamente unirse a P-selectina, y, en un grado substancialmente menor a E-selectina. La Figura 21 resume los resultados de las Figuras 19 y 20.

G. Conclusiones Relativas a la Unión de P- y E-Selectina Si bien los solicitantes no desean estar ligados a ninguna teoría, estos datos permiten varias conclusiones relativas a las relaciones entre la unión de P-selectina y la unión de E-selectina por la proteínas del ligando de la P-selectina. Los carbohidratos con enlace N no son requeridos para la unión de una la proteína del ligando de la P-selectina ya sea a P- o E-selectina. Las proteínas del ligando de la P-selectina tan pequeñas como aquellas comprendiendo tan pocos aminoácidos como del 42-60 de la SEQ ID No: 2 son capaces de unirse a P-selectina y, en un grado substancialmente menor, a E-selectina. La Figura 22 describe un modelo esquemático propuesto para la unión de proteínas del ligando de la P-selectina a P- y E-selectina. Se ha demostrado que se requiere de carbohidrato SLex con enlace O para ambas uniones de P- y E-selectina. Los datos presentados aquí demuestran que los residuos tirosina sul fatados están implicados en la unión de P-selectina, pero no en la unión de E-selectina. Los datos de los solicitantes también sugieren que no se requiere de un sitio de unión de glicosilación con enlace N.

EJEMPLO 1 1 EXAMEN DE LOS FENÓM ENOS DE AGREGACIÓN Y FORMACIÓN DE DÍMERO EN FORMAS DE PSGL-1 Un panel de mutantes de PSGL-1 fue construido mediante mutagénesis dirigida de sitio y/o amplificación PCR con primarios que inducían un codón tope. El modelo para todos los experimentos de mutagénesis fue pPL85.R 16 (ATCC 75577, depositado por los solicitantes).

El primer grupo de mutantes (C310S y C327S) codifican PSGL- 1 . R16 de longitud completa con solo un cambio de aminoácido comparado con el PSGL-1 . Rl 6 de tipo salvaje (Cys a Ser en la posición 310 o 327, respectivamente) Células COS co-transfectadas con pEA.3/4FT y los mutantes C3 10S o C327S fueron marcadas con " S-metionina. Se prepararon lisatos de célula y las proteínas mutantes fueron inmunoprecipitadas con el anticuerpo policlonal del ligando de la P-selectina del Ejemplo 7(A) y analizados mediante electroforesia SDS-gel de poliacrilamida bajo condiciones no reductoras y condiciones reductoras. El mutante C327S así como el PSGL- 1 . R 1 6 de tipo salvaje migraron como un homodímero bajo condiciones no reductoras y como un monómero bajo condiciones reductoras. En contraste, el mutante C310S migró como un monómero tanto bajo condiciones no reductoras como con condiciones reductoras. indicando que la cisteina en la posición 3 10 era requerida para la formación del dímero de PSGL- 1 . Ambos mutantes fueron analizados también en cuanto a su capacidad de unirse a P-selectina. Extractos detergentes de células COS co-transfectadas fueron precipitados con quimera de LEC-?? del Ejemplo 4(A). Los precipitados fueron analizados mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras y condiciones reductoras y mediante autoradiografía. Tanto PSGL- 1 . R16 como C327S fueron eficientemente precipitados por LEC-?? , mientras que la unión de C3 10S a LEC-?? fue grandemente reducida, indicando que la forma dimérica de PSGL- 1 se unía a P-se!ectina más firmemente que la forma monomérica. El segundo grupo de mutantes codifica formas solubles de PSGL-1 . Rl 6 y se enlistan en la Tabla 1 . El mutante ??? se generó por mutagénesis de sitio dirigido y tenía una deleción del dominio de transmembrana (aminoácidos 3 1 3-333) seguida por RLSRKA. Los mutantes L3 1 1 , L312, A3 13, 13 14, L3 1 5, A31 8 y T322 se generaron por mutagénesis de sitio dirigido o amplifación PCR con primarios PCR que introducían un codón tope en la posición deseada. El nombre del mutante se refiere al aminoácido con terminación C de cada forma soluble truncada de PSGL- 1 .R 1 6. Los mutantes se analizaron de acuerdo con los siguientes criterios: 1 . Expresión y secreción a partir de células COS transfectadas. 2. Formación de dímero versus monómero. 3. Falta de formación de agregado 4. Unión de P-selectina (quimera LEC-? ? ). Los mutantes ??? y 1316 cumplieron con todos los criterios. Las formas solubles más cortas de PSGL-1 tales como sPSL.QC del Ejemplo 5(A), L31 1 , L312, A313, 1314 y L315 no formaron dímeros tampoco y las formas solubles más largas de PSGL-1 , tales como sPSL,T7 del Ejemplo 5(C), A3 1 8 y T322 formaron agregados de elevado peso molecular que eran menos deseables. Células CHO que ya expresaban fucosiltransferasa 3/4 y transferasa core2 fueron transfectadas con ps.PSL.T7, ???, 13 16 o psPSL.QC y se amplificaron usando metotrexato. Las clonas estables fueron aisladas y marcadas con 35S-metionina. Se analizó medio acondicionado ya sea directamente o primero se precipitó con LEC-?? y posteriormente se analizó mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras y condiciones reductoras (Figura 25 ). Los resultados indicaron que ?? e 13 1 6 fueron los más eficientes en formación de dímero y en la unión de P-selectina. Tabla I Mutante Formación de Agregados de Unión de Dímero Allo MW P-selectina PSL.QC + + L31 1 + - + · ¦ L312 - - - A313 - - - 1314 - - - L315 + - + 13 16 ++ - ++ A318 ++ + ++ T322 ++ + ++ ??? -H- - ++ EJEMPLO 12 ESPECIFICIDAD DE LA UNIÓN DE PSGL- 1 A P- v E-SELECTINAS Materiales. Una proteína quimérica comprendiendo el dominio extracelular de E-selectina humana y la porción Fe de IgGi humana fue construida análogamente a la quimera de P-selectina, LEC-?? , descrita anteriormente. La quimera de E-selectina soluble fue expresada en cinco células superiores Trichoplusia ni infectadas con baculovirus (Invitrogen) y purificadas hasta homogeneidad por cromatografía de Proteína A Sefarosa. Los vectores plásmidos pEA.3/4FT, pPL85, pFCD43 y pEA.sPACE, para expresión por COS de a(l , 3/1 ,4)-fucosiltransferasa (Fuc-TIII), PSGL-1 , CD43 (leucosialina) y enzima de conversión de aminoácido básica, apareada y soluble (PACE), respectivamente, han sido descritas aquí y en la literatura (Sako et al. ( 1993) Cell 75, 1 1 79- 1 1 86; Rehemtulla, A. aufman, R.J. ( 1992) Curr. Opin. Biotechnol 3, 560-565; Wasley et al. ( 1993) J. Biol. Chem. 268, 8458-8465). ADNc de Fuc-TVII (plásmido pMT.FT7) fue clonado a partir de una biblioteca de expresión de ADNc de HL60 usando sondas de oligonucleótido derivadas de la secuencia publicada (Natsuka et al. ( 1994) Journal of Biological Chemislry 269, 1 6789- 16794; Sasaki et al. ( 1994) J Biol Chem. 269, 14730-14737). Un anticuerpo de conejo de neutralización policlonal, Rb3443, fue generado contra un péptido comprendiendo los primeros 15 aminoácidos de la terminación N madura (dividida con PACE) de PSGL- 1 . Anticuerpos monoclonales de anti-CD43 procedentes ya sea de Becton Dickinson o Biodesign International y anticuerpos de control de isotipo fueron apareados a un soporte sólido consistente en Sefarosa TM-4B con un anticuerpo de cabra purificado por afinidad y unido covalentemente a IgG de ratón (Cappe, Organon Teknika Corporaction). Se l levó a cabo el acoplamiento por afinidad de quimeras de selectina y anticuerpos de murino a Protein A Spharose 4 Fast Flow (Pharmacia) y a la resina de IgG de anti-ratón, respectivamente, en una relación de 2 mg de proteína/ml de resina. Se acopló antisuero Rb3443 a Protein A Sepharose a 1 ml/ml de resina. Las eficiencias de acoplamiento, indicadas por ensayo micro-BCA (Pierce) de los sobrenadantes post-reacción. fueron cuando menos 95%. La aprotinina y la pepstatina fueron de Boehringer Mannheim y la benzamidtna, leupeptina y el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) fueron de Sigma. Marcado y Extracción de Membrana de Células Mieloides. Células U937 o HL60 hechas crecer en suspensión a una densidad de ~1 .3 x 1 06 células/ml fueron marcadas en 50 mi de medio RPMI1640 complementado con 10% de suero de bovino fetal y 2,5 mCi de 3H-glucosaminaHCl (Dupont/NEN) durante 48 horas. Actividades de más de 1 cpm/célula fueron rutinariamente obtenidas mediante esta técnica. Las células marcadas fueron lavadas con PBS, resuspendidas en regulador de lisis de célula (MOPS 10 mM. NaCl 150 mM, CaCl2 4 mM y MgCl2 4 mM, pH 7.5 conteniendo inhibidores de proteasa 20 mg/ml de aprotinina, benzamidina 10 mM, 20 mg/ml de leupeptina, 8 mg/ml de pepstatina y PMSF 10 mM) y sometidas a varios ciclos de tratamiento sónico con sonda sobre hielo. Los desechos celulares y núcleos fueron eliminados mediante centrifugación a baja velocidad y las membranas celulares recuperadas del sobrenadante mediante centrifugación a 100,000g RCF por 1 hora, lavadas mediante resuspensión y centrifugación a alta velocidad en regulador de lisis celular conteniendo NaCl 1 M, y finalmente resuspendidas en 3 mi de regulador de solubilización de membrana (regulador de lisis celular conteniendo 1 % de Tritón X-100). Se emplearon varios ciclos de tratamiento sónico e incubación en hielo para solubilizar la fracción de membrana. Finalmente, se empleó una etapa de centrifugación a baja velocidad para remover el residuo de membrana insoluble. Marcado y Extracción de Membrana de Células COS Transfectadas. Células M6 COS fueron transfectadas usando DEAE-dextrano y cloroquina (25) empleando 8 g de los plásmidos pPL85 o pFCD43 y 4 µg de pEA.sPACE, así como 4 µg de pEA.3/4FT o pMT.FT7. Después de 40-45 hr de recuperación las células transfectadas fueron privadas de fuerza en medio DME libre de suero y de metionina durante 30 minutos y posteriormente alimentadas con [35S]-metionina en DME libre de suero durante 5 hr. Las células marcadas fueron lavadas, incubadas con EGTA para aflojarlas de la superficie del plato, peladas del plato, granuladas y suspendidas en regulador PIPES frío 10 mM, pH 7.5 conteniendo KCI 1 00 mM, NaCl 3 mM, MgCl2 3.5 mM e inhibidores de proteasa (ver arriba). Se llevó a cabo posteriormente extracción de membrana mediante tratamiento sónico, centrifugación a baja velocidad, centrifugación a alta velocidad y solubilización en regulador de lisis de membrana como se indicó anteriormente, para células mieloides marcadas. Precipitaciones por Afinidad. Extractos de membrana fueron diluidos 1 :4 o 1 :5 con regulador de lisis de célula o con regulador TBSC (TrisHCl 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM, pH 7.5) complementado con 5 mg/ml de albúmina de suero bovino (aproximadamente 99%. Sigma). Extractos así diluidos a 0.2-0.25% de Tritón X-100 fueron incubados con IgG humana-Protein A Sepharose con mezclado de principio a fin a 4 °C durante toda la noche. Los sobrenadantes preliberados fueron hechos reaccionar posteriormente durante 6-12 horas a 4 °C con Protein A Sepharose preacoplada con quimeras de E- o P-selectina , IgGl humana de control, Rb3443 o con suero de conejo pre-inmune o con anticuerpo de anti-CD43 o control de isotipo preacoplado a IgG Sepharose de anti-ratón de cabra. Las resinas fueron lavadas 5 o más veces en regulador conteniendo 0.1-0.5% de Tritón X- 100 hasta que la radioactividad de los sobrenadantes lavados fue reducida a niveles de antecedentes. La elución de proteínas unidas específicamente a resinas de P- o E-selectina fue realizada con EDTA 10 mM o EDTA 5 mM/EGTA 5 mM a temperatura ambiente o mediante ebullición en regulador de muestra SDS-PAGE (Laemmli, U.K. ( 1970) Nature 227, 680-685), mientras que la elución de las proteínas unidas a resinas de anticuerpo fue alcanzada exclusivamente por los medios últimos. Para la resolución bajo condiciones reductoras, se agregó ditiotreitol al regulador de muestra hasta una concentración final de 100 mM. Las muestras así preparadas fueron resueltas mediante SDS-PAGE en 7.5% de geles, tratadas con En3Hance (Dupont), secadas y expuestas a película de autoradiografía. Para los experimentos de captura de afinidad secuencial, extractos de membrana fueron preliberados, precipitados por afinidad con P- o E-selectina o IgG] humana, y lavados como se indicó anteriormente. Las muestras fueron entonces eludadas dos veces desde las resinas con EDTA 5 mM en MOPS 10 mM, NaCl 1 50 mM, pH 7.5 por 1 hora a 4 °C con vuelcos. Los eludados primero y segundo fueron combinados y posteriormente inmunoprecipitados con Rb3443 inmobilizada de acuerdo con los protocolos señalados anteriormente. RESULTADOS: Se usaron quimeras solubles de E- y P-selectina. en paralelo con IgGi humana de control para probar extractos de membrana solubi lizados con detergente de células U937 marcadas con 3H-glucosamina como se describió en "Métodos," El examen de eludados procedentes de las selectinas inmovilizadas por SDS-PAGE/autoradiografía (Figura 26) reveló la presencia en ambos eludados de P- y E-selectina de una especie de proteína mayor con propiedades electroforéticas idénticas: Mr 200-kDa no reducida con conversión a una especie de Mr 120-kDa siguiente a la reducción (Figura 26, sendas 2 y 3, respectivamente). Ocasionalmente, se observaron bandas adicionales en ambos eludados de E- y P-selectina que correspondían presumiblemente a esta banda mayor y que reflejaban la presencia de material reducido naturalmente (la especie de 120-kDa en muestras no reducidas) y reducción incompleta (la especie de 200 k-Da en muestras reducidas). Adicionalmente, ocasionalmente se observó una banda rastro de Mr 150-kDa en el eludado de E-selectina que no era afectado por reducción con DTT. No se observaron bandas en los experimentos de control usando IgG| humana inmobilizada (Figura 26, senda 1 ) o en donde la elución de resinas de selectina se realizó en la ausencia de EDTA o SDS (datos no mostrados). Se obtuvieron resultados esencialmente idénticos usando células HL-60 (datos no mostrados). De aquí, la naturaleza de estos eventos de reconocimiento es interpretada como que son interacciones específicas dependientes de metal de estas proteínas con respecto a selectinas, presumiblemente vía los dominios de lectina (Lasky, L. A. (1992) Science 258, 964-969; Drickamer, . ( 1988) J. Biol. Chem. 263, 557). El comportamiento de reconocimiento dependiente de metal y electroforético del precipitado de banda mayor con E-selectina fue consistente con las propiedades del contrareceptor de P-selectina previamente identificado, ligando de glicoproteína de P-selectina o PSGL- 1 (Moore et a! ., ( 1 94) ,/. Biol. Chem. 269. 233 1 8-23327; Moore et al. ( 1 992) 7. Cell Biol. 1 18, 445-456; Sako et al.). Para evaluar si esta especie era realmente PSGL-1 , eludados de EDTA de ambos precipitados de E- y P-selectina fueron subsecuentemente hechos reaccionar con el antisuero Rb3443 de antisuero policlonal específico de PSGL- 1 . Corno se muestra en la Figura 27, la banda mayor aislada por captura de afinidad con cualquier selectina fue inmunoprecipitada usando este antisuero (sendas 3 y 4, respectivamente). No se detectó ninguna especie después de la inmunoprecipitación del Eludado de EDTA de IgG ¡ de control (Figura 27, senda 5). Las inmunoprecipitaciones directas usando extractos de membrana frescos de U937 marcados con H confirmaron la especificidad de Rb3443: precipitación con Rb3443 resultó en la recuperación de una sola banda con las propiedades electroforéticas de PSGL- 1 (Mr 200 k-Da no reducido, Mr 1 20 k-Da reducido; Figura 27, senda 2) mientras que la precipitación con antisuero pre-inmune falló en la captura de algún materia! (Figura 27, senda 1 ). Estos resultados indican que la especie de proteína principal capturada específicamente de las células mieloides por ambas E- y P-selectinas es PSGL- 1 .

Para evaluar adicionalmente la especificidad de la E-selectina para PSGL- 1 , lisatos de membrana de U937 fueron probados directamente para determinar la presencia de CD43 (o leucosialina), una sialoglicoproteína abundante en la superficie celular, que se conoce posee la mayor parte de residuos SLex de células mieloides ( aemura, . & Fukuda, M (1992) J. Biol. Chem. 267, 24379-24386). Por lo tanto, extractos de membrana de células U937 marcadas con 3H-glucosamina fueron probadas con un anticuerpo de anti-CD43 en paralelo con el antisuero Rb3443 específico de PSGL-1 y anticuerpos de control como se describió en "Métodos." De cantidades idénticas de lisato de membrana, el anticuerpo de CD43 precipitó en exceso de 30 veces cuentas radiactivas mayores que lo que lo hizo el antisuero de PSGL-1. La evaluación de los inmunoprecipitados por SDS-PAGE/autoradiografía (Figura 28) reveló una sola banda específica para cada anticuerpo. Rb3443 capturó una sola especie con las características electroforéticas de PSGL-1 (Figura 28, senda 2). En contraste, el anticuerpo de CD43 precipitó una especie con un Mr 120-kDa que era insensible a la reducción (Figura 28, senda 4), consistente con la ausencia de cisteina en CD43. Inmunoprecipitaciones con anticuerpos de control (Figura 28, sendas 1 y 3) probaron ser negativas como se esperaba. Parecen haber cantidades considerablemente mayores de CD43 que de PSGL-1 en células U397, consistente con la cuantificación de estas proteínas en células HL-60 (Ushimaya et al.,( 1993) J. Biol. Chem. 268 15229- 15237). Por lo tanto, la incapacidad de la E-selectina para precipitar CD43 de células mieloides no parece deberse a su ausencia en estas líneas celulares. Si bien nosotros no podemos excluir la posibilidad de que la E-selectina capture cantidades de trazas de CD43 (esto es, la banda de Mr 1 20-kDa de baja intensidad en la Figura 26. senda no reducida 3 que también es consistente con PSGL- 1 monomérico), el PSGL- 1 parece ser la proteína principal precipitada de los extractos de membrana mieloide. PSGL- 1 recombinante expresado en células COS es mejor logrado con co-transfección del ADNc de PSGL-1 con un ADNc que codi fica para una a(l ,3/1 ,4)fucosiltransferasa (Fuc-Tlll) para la unión de P-selectina (Sako et al.). De manera interesante, los esfuerzos iniciales para demostrar el reconocimiento de E-selectina de PSGL-1 recombinante fallaron: la E-selectina fue incapaz de capturar el contrareceptor de lisatos de membrana de célula COS cotransfectada bajo condiciones en donde la captura de P-sclectina era exitosa. Una interpretación de este resultado es que el Fuc-TIII era capaz de modificar PSGL- 1 recombinante para el reconocimiento por P- selectina, pero era incapaz de replicar la(s) modificación(es) apropiada(s) encontrada(s) en PSGL-1 mieloide necesario para el reconocimiento de E-selectina. La clonación reciente de una fucosiltransferasa mieloide, Fuc-TVII (Natsuka et al., ( 1994) Journal of Biological Chemistry 269, 16789-16794; sasaki et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 14730-14737), que también es capaz de generar estructuras de carbohidrato SLex, permitió la evaluación de esta interpretación. Células COS fueron cotransfectadas con ADNcs que codificaban ya sea para PSGL-1 o CD43 y ya sea Fuc-Tlll o Fuc-TVII. Se prepararon lisatos de membrana a partir de las células COS transfectadas y estos fueron precipitados ya sea con quimeras de E- o P-selectina inmovilizadas o con anticuerpos para ya sea PSGL-1 o para CD43. Los productos precipitados fueron evaluados por SDS-PAGE/autoradiografía en seguida a su liberación mediante EDTA/EGTA (para unión mediada por selectina) o mediante ebullición en SDS (para inmunoprecipitaciones). Los resultados se muestran en la Figura 29. Como se observa en la Figura 29A, la captura de E-selectina de PSGL- 1 expresado por COS fue dependiente de la naturaleza de la fucosiltransferasa usada en la transfección. En tres experimentos separados, Fuc-TVII, pero no Fuc-TIII, soportó la precipitación de PSGL- 1 por E-selectina. La incapacidad de Fuc-TIII para conferir reactividad de E-selectina a PSGL- 1 no puede ser atribuida a una falta de expresión de PSGL- 1 ya que el antisuero Rb3443 específico inmunoprecipitó cantidades importantes y comparables de PSGL- 1 de ambas transfecciones Fuc-TIII y Fuc-TVII (Figura 29). Además, la P-selectina fue capaz de precipitar cantidades equivalentes de PSGL- 1 con cualquier fucosiltransferasa (Figura 29B), demostrando que Fuc-TIII y Fuc-TVII son expresadas y activas en estas co-transfecciones. Dentro del sistema de expresión recombinante de COS como en células mieloides, el reconocimiento de E-selectina de alta afinidad también fue dependiente de la presencia de un polipéptido apropiado. Si bien la longitud del polipéptido, peso molecular aparente, y la alta frecuencia y tipos específicos de modificaciones post-traducción son similares en CD43 y PSGL-1 (Maemura. . & Fukuda. M. ( 1 992) J. Biol . Chem. 267. 24379-24386), ninguna fucosiltransferasa fue capaz de conferir reconocimiento de E-selectina (o P-selectina) de alta afinidad a leucosialina recombinante en células COS cotransfectadas (Figura 29A). Las inmunoprecipitaciones con anticuerpo de anti-CD43 indica que cantidades comparables de leucosialina eran expresadas en ambas cotransfecciones de Fuc-TIII y Fuc-TVII (Figura 29C), La falla de la E-selectina para capturar CD43 no se debió a la falta de actividad de fucosiltransferasa dentro de las células COS cotransfectadas. Análisis FACS de células COS cotransfectadas ya sea con PSGL- 1 o CD43 y ya sea Fuc-TIlI o Fuc-TVIl mostraron todos altos niveles de reactividad con anticuerpo CSLEX-1 específico de SLeX. Por lo tanto, estos resultados sugieren que el reconocimiento de E-selectina de alta afinidad requiere de la presencia de un(os) polipétido(s) específico(s) que se(an) apropiadamente modificado(s) por una fucosiltransferasa específica.

EJEMPLO 13 INHIBICIÓN DE LA UNIÓN DE P-SELECTI A/PSGL-1 POR PÉPTIDOS DERIVADOS DE PSGL- 1 Un número de péptidos derivados de la secuencia de PSGL- 1 (SEQ ID No. 2) fueron probados en cuanto a su habilidad para inhibir la unión de P-selectina/PGSL-1 . Los péptidos probados se enlistan en la Figura 30. La inhibición fue probada de acuerdo con el siguiente protocolo. Los pozos de una placa de 96 pozos fueron recubiertos toda la noche a 4 °C con PSGL- 1 en 50 µ? de MOPS 10 mM, NaCl 150 mM, CaCh 1 mM, MgCh 1 mM con un pH 7.5. Después de la remoción del líquido de los pozos se agregaron 150 µ? de MOPS 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, 0,05% de twen-20, 0.05% de gelatina, a un pH 7.5, por pozo para bloquear los sitios no ocupados. Después de ½ hora a 2 hr el regulador de bloqueo fue retirado de los pozos y 100 µ? de un complejo de Lec-?? (quimera de IgG Fe de P-selectina humana) (2 µg/ml), anticuerpo anti-humano de cabra biotinilado, y fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina (que se había dejado que sacudiendo a temperatura ambiente durante 30 minutos a 1 hora) más cualesquiera inhibidores potenciales se agregaron por pozo. Cada placa fue sacudida y raspada para retirar el bloqueo de la placa. La incubación continuó durante 1 hora a temperatura ambiente girando en la obscuridad. El complejo sin unir fue limpiado de la placa con dos porciones de 1 50 µ? de MOPS 1 0 mM. NaCl 1 50 mM, CaCL 1 mM, MgCl2 1 mM, 0.05% de tvveen-20 seguido de 1 50 µ? de dietanolamina 1 T MgCb 0.5 mM. El substrato cromogénico para la fosfatasa alcalina, PNPP, en DEA 10 mM/MgCl2 0.5 mM se agregó y la placa fue entonces leída a 405 nm.

Los resultados de estos ensayos son reportados en la Figura 30. Los péptidos comprendiendo los aminoácidos 48-51 (en los que los residuos tirosina han sido fosforilados) y los aminoácidos 42-56 de la SEQ ID No. 2 proveyeron resultados particularmente deseables.

EJEMPLO 14 PURIFICACIÓN DE UNA FORMA SOLUBLE DE PSGL- 1 La purificación substancial de una forma soluble de proteína del ligando de la P-selectina ha sido lograda de acuerdo con el protocolo descrito a continuación. Una proteína del ligando de la P-selectina soluble, 13 16 (aminoácido 42 a aminoácido 316 de la SEQ ID No. 2) fue expresada en células COS como se describe aquí mismo. Medio acondicionado de células CHO fue concentrado con una unidad de membrana de ultrafíltración Pellicon (Millipore) ya sea con corte de peso molecular (MWCO) de 10,000 o con MWCO de 30,000 a aproximadamente 10 veces la concentración original. El regulador fue entonces intercambiado en Tris 25 mM, CaCl2 1 mM, pH 7.4. El concentrado intercambiado con regulador fue cargado en una columna Toyopearl QAE 550C (TosoHaas). Alternativamente, la etapa de intercambio de regulador puede ser omitida y el concentrado puede ser diluido de una parte de concentrado a tres partes en Tris 25 mM, CaCl2 1 mM, pH 7.4, y posteriormente cargado en la columna. La columna fue lavada con 5- 10 volúmenes de columna (CV) de Tris 25 mM, CaCl2 1 mM, pH 7.4 a 4 °C. La proteína del ligando de la P-selectina eluyó desde la columna con un gradiente de NaCl lineal (NaCl 0 M a NaCl 1 .0 M) en regulador de Tris 25 mM, CaCl2 1 mM, pH 7.4 en aproximadamente cinco volúmenes de columna. Dos picos eluyeron de la columna. El segundo pico contenía la proteína del ligando de la P-selectina y se recolectó a granel. El pico de la columna QAE fue concentrado con una membrana de ultrafíltración de flujo tangencial (Millipore) con un MWCO de 30,000 y entonces se intercambió con regulador en Tris 25 mM, NaCl 1 0 mM, CaCl2 1 mM, pH 7.4 a 4 °C. El concentrado intercambiado fue cargado en una columna de Jacalina Agarosa durante toda la noche a 4 °C. La columna fue lavada con el regulador de diafiltración y la proteína del ligando de la P-selectina fue eludada con un gradiente de a-D-galactopiranosido de metilo (0-100 mM o) a-D-galactopiranosido de metilo 50 mM) a 20 °C. Fracciones procedentes de la columna de Jacalina fueron analizados mediante SDS-PAGE y las fracciones más puras fueron colocadas en pollas.

EJEMPLO 1 5 FUSIONES DE PROTEÍNA DEL LIGANDO DE LA P-SELECTÍNA Se construyeron cuatro fusiones de una proteína del ligando de la P-selectina con una secuencia de aminoácidos diferente: 47. Fe, 47. AGP, 47. BMP y 47.IL1 1 . 47.Fc: se construyó un ADNc que codifica para el péptido señal, sitio de división PACE y primeros 47 aminoácidos de la secuencia del ligando de P-selectina maduro fusionada a una región Fe mutada de IgG l humana en His224 de la secuencia de Fe nativa. La secuencia de la construcción de ADNc es reportada como la SEQ ID No. 35. El punto de fusión es un nuevo sitio Notl en el nucleótido 261 . La secuencia de aminoácidos codificada por la construcción de ADNc es reportada en la SEQ ID No. 36. La secuencia de aminoácidos madura de la proteína de fusión codificada comienza en el aminoácido 42 de la SEQ ID No. 36. Las mutaciones en la porción Fe fueron cambiadas de Leu 234 y Gly 237 de la secuencia Fe nativa a Ala. 47.AGP: se construyó un ADNc que codifica para el péptido señal, sitio de división PACE y primeros 47 aminoácidos de la secuencia del ligando de P-selectina madura, fusionada al primer residuo leucina de AGP humana madura. La secuencia de la construcción de ADNc es reportada como la SEQ ID No. 37. El punto de fusión es un nuevo sitio Notl en el nucleótido 261. La secuencia de aminoácidos codificada por la construcción de ADNc es reportada como la SEQ ID No. 38. La secuencia de aminoácidos madura de la proteína de fusión codificada comienza en el aminoácido 42 de la SEQ ID No. 38. 47. BMP: se construyó un ADNc que codifica para el péptido señal, sitio de división PACE y primeros 47 aminoácidos de la secuencia del ligando de P-selectina madura, fusionada a la secuencia de BMP-2 humana madura (con sus primeros 8 aminoácidos suprimidos). La secuencia de la construcción de ADNc es reportada como la SEQ ID No. 39. El punto de fusión es un nuevo sitio Notl en el nucleótido 261 . La secuencia de aminoácidos codificada por la construcción de ADNc es reportada como la SEQ ID No. 40. La secuencia de aminoácidos madura de la proteína de fusión codificada comienza en el aminoácido 42 de la SEQ ID No. 40. 47.IL 1 1 : se construyó un ADNc que codifica para el péptido señal, sitio de división PACE y primeros 47 aminoácidos de la secuencia del ligando de P-selectina madura, fusionada a IL- l l humana madura. La secuencia de la construcción de ADNc es reportada como la SEQ ID No. 41 . El punto de fusión es un nuevo sitio Notl en el nucleótido 261 . La secuencia de aminoácidos codificada por la construcción de ADNc es reportada como la SEQ ID No. 42. La secuencia de aminoácidos madura de la proteína de fusión codificada comienza en el aminoácido 42 de la SEQ ID No. 42. Las referencias de patentes y literatura citadas aquí se incorporan totalmente como han sido presentadas.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Larsen, Glenn Sako, Dianne Chang, Xiao Jia Veldman, Geertruida M. Cumming, Dale Kumar, Ravindra Shaw, Gray (Ü) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVA PROTEÍNA DEL LIGANDO DE LA P-SELECTINA. (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 42 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) REMITENTE: ASUNTOS LEGALES (B) CALLE: 81 CAMBRIDGEPARK DRIVE (C) CIUDAD: CAMBRIDGE (D) ESTADO: MA (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 02140 (v) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Floppy disk (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DCS (D) SOFTWARE: Patentln Relaase III. O, Versión #1.25 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vü) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: EUA 07/965,662 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-OCT-1992 (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: EUA 08/112,608 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 26-AGTO-1993 (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR; (A) NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US 93 / 10168 (B ) FECHA DE PRESENTACIÓN: 22-OCT-1993 (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: EUA 08/235,398 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-ABR-1994 (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIO : (A) NÚMERO DE SOLICITUD: EUA 08/316,305 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-SEP-1994 (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: EUA 08/428,734 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 25-ABR-1995 fviii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: BROWN, SCOTT A. (B) NÚMERO DE REGISTRO: 32,724 (C) NÚMERO DE REREFENCIA/EXPEDIENTE : GI (ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES: (A) TELÉFONO: (617) 498-8224 (B) TELEFAX: (617) 876-5851 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO . : 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1649 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (G) TIPO DE CÉLUL : Promielocito (H) LÍNEA CELULAR: HL60 (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLONA: PMT21:PL85 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : 5 ' UTR (B) LOCALIZACIÓN: 1..59 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 60..1268 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : 3 ' UTR (B) LOCALIZACIÓN: 1269..1649 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l: GCCACTTCTT CTGGGCCCAC GAGGCAGCTG TCCCATGCTC TGCTGAGCAC GGTGGTGCC 59 ATG CCT CTG CAA CTC CTC CTG TTG CTG ATC CTA CTG GGC CCT GGC AAC 107 Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu lie Leu Leu Gly Pro Gly Asn 1 5 10 15 AGC TTG CAG CTG TGG GAC ACC TGG GCA GAT GAA GCC GAG AAA GCC TTG 155 Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu 20 25 30 GGT CCC CTG CTT GCC CGG GAC CGG AGA CAG GCC ACC GAA TAT GAG TAC Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr 35 40 45 CTA GAT TAT GAT TTC CTG CCA GAA ACG GAG CCT CCA GAA ATG CTG AGG 251 Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg 50 55 60 AAC AGC ACT GAC ACC ACT CCT CTG ACT GGG CCT GGA ACC CCT GAG TCT 299 Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser 65 70 75 80 ACC ACT GTG GAG CCT GCT GCA AGG CGT TCT ACT GGC CTG GAT GCA GGA 347 Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly 85 90 95 GGG GCA GTC ACA GAG CTG ACC ACG GAG CTG GCC AAC ATG GGG AAC CTG 395 Gly Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu 100 105 110 TCC ACG GAT TCA GCA GCT ATG GAG ATA CAG ACC ACT CAA CCA GCA GCC 443 Ser Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu lie Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala 115 120 125 ACG GAG GCA CAG ACC ACT CCA CTG GCA GCC ACA GAG GCA CAG ACA ACT 491 Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr 130 135 140 CGA CTG ACG GCC ACG GAG GCA CAG ACC ACT CCA CTG GCA GCC ACA GAG 539 Arg Leu Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu 145 150 155 160 GCA CAG ACC ACT CCA CCA GCA GCC ACG GAA GCA CAG ACC ACT CAA CCC 587 Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro 165 170 175 ACA GGC CTG GAG GCA CAG ACC ACT GCA CCA GCA GCC ATG GAG GCA CAG 635 Thr Gly Leu Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln 180 185 190 ACC ACT GCA CCA GCA GCC ATG GAA. GCA CAG ACC ACT CCA CCA GCA GCC 683 Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala 195 200 205 ATG GAG GCA CAG ACC ACT CAA ACC ACA GCC ATG GAG GCA CAG ACC ACT 731 Met Glu Ala Gln Thr Thr Gln Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr 210 215 220 GCA CCA GAA GCC ACG GAG GCA CAG ACC ACT CAA CCC ACA GCC ACG GAG 779 Ala Pro Glu Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu 225 230 235 240 GCA CAG ACC ACT CCA CTG GCA GCC ATG GAG GCC CTG TCC ACA GAA CCC 82'7 Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala- Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro 245 250 255 AGT GCC ACA GAG GCC CTG TCC ATG GAA CCT ACT ACC AAA AGA GGT CTG 875 Ser Ala Thr Glu Ala Leu Ser Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu 260 265 270 TTC ATA CCC TTT TCT GTG TCC TCT GTT ACT CAC AAG GGC ATT CCC ATG 923 Phe lie Pro Phe Ser Val Ser Ser Val Thr His Lys Gly lie Pro Met 275 280 285 GCA GCC AGC AAT TTG TCC GTC AAC TAC CCA GTG GGG GCC CCA GAC CAC 971 Ala Ala Ser Asn Leu Ser Val Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp His 290 295 300 ATC TCT GTG AAG CAG TGC CTG CTG GCC ATC CTA ATC TTG GCG CTG GTG 1019 lie Ser Val Lys Gln Cys Leu Leu Ala lie Leu lie Leu Ala Leu Val 305 310 315 320 GCC ACT ATC TTC TTC GTG TGC ACT GTG GTG CTG GCG GTC CGC CTC TCC 1067 Ala Thr lie Phe Phe Val Cys Thr Val Val Leu Ala Val Arg Leu Ser 325 330 335 CGC AAG GGC CAC ATG TAC CCC GTG CGT AAT TAC TCC CCC ACC GAG ATG 1115 Arg Lys Gly His Met Tyr Pro Val Arg Asn Tyr Ser Pro Thr Glu Met 340 345 350 GTC TGC ATC TCA TCC CTG TTG CCT GAT GGG GGT GAG GGG CCC TCT GCC 1163 Val Cys lie Ser Ser Leu Leu Pro Asp Gly Gly Glu Gly Pro Ser Ala 355 360 365 ACA GCC AAT GGG GGC CTG TCC AAG GCC AAG AGC CCG GGC CTG ACG CCA 1211 Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser Lys Ala Lys Ser Pro Gly Leu Thr Pro 370 375 380 GAG CCC AGG GAG GAC CGT GAG GGG GAT GAC CTC ACC CTG CAC' AGC TTC 125 Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu Gly Asp Asp Leu Thr Leu His Ser Phe 385 390 395 400 CTC CCT TAGCTCACTC TGCCATCTGT TTTGGCAAGA CCCCACCTCC ACGGGCTCTC 1315 Leu Pro CTGGGCCACC CCTGAGTGCC CAGACCCCAA TCCACAGCTC TGGGCTTCCT CGGAGACCCC 1375 TGGGGATGGG GATCTTCAGG GAAGGAACTC TGGCCACCCA AACAGGACAA GAGCAGCCTG 1435 GGGCCAAGCA GACGGGCAAG TGGAGCCACC TCTTTC.CTCC CTCCGCGGAT GAAGCCCAGC 1495 CACATTTCAG CCGAGGTCCA AGGCAGGAGG CCATTTACTT GAGACAGATT CTCTCCTTTT 1555 TCCTGTCCCC CATCTTCTCT GGGTCCCTCT AACATCTCCC ATGGCTCTCC CCGCTTCTCC 1615 TGGTCACTGG AGTCTCCTCC CCATGTACCC AAGG 1649 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO . : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 402 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu He Leu Leu Gly Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu 20 25 30 Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr 35 40 45 Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg 50 55 60 Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser 65 70 75 80 Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly 85 ' 90 95 Gly Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu 100 105 110 Ser Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu He Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala 115 . 120 125 Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr 130 135 140 Arg Leu Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu 145 150 155 160 Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro 165 170 175 Thr Gly Leu Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln 180 185 190 Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala 195 200 205 Met Glu Ala Gln Thr Thr Gln Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr 210 215 220 Ala Pro Glu Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu 225 230 235 240 Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro 245 250 255 Ser Ala Thr Glu Ala Leu Ser Mee Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu 260 265 270 Phe lie Pro Phe Ser Val Ser Ser Val Thr His Lys Gly lie Pro Met 275 280 285 Ala Ala Ser Asn Leu Ser Val Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp His 290 295 300 lie Ser Val Lys Gln Cys Leu Leu Ala lie Leu lie Leu Ala Leu Val 305 310 315 320 Ala Thr lie Phe Phe Val Cys Thr Val Val Leu Ala Val Arg Leu Ser 325 330 335 Arg Lys Gly His Met Tyr Pro Val Arg Asn Tyr Ser Pro Thr Glu Met 340 345 350 Val Cys lie Ser Ser Leu Leu Pro Asp Gly Gly Glu Gly Pro Ser Ala 355 360 365 Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser Lvs Ala Lys Ser Pro Gly Leu Thr Pro 370 375 380 Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu Gly Asp Asp Leu Thr Leu His Ser Phe 385 390 395 400 Leu Pro (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:3; (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1239 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADNc (Sintético) (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (G) TIPO DE CÉLULA: placenta (ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1..1239 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3; ATG CCT CTG CAA CTC CTC CTG TTG CTG ATC CTA CTG GGC CCT GGC AAC 48 Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu lie Leu Leu Gly Pro Gly Asn 1 5 10 15 AGC TTG CAG CTG TGG GAC ACC TGG GCA GAT GAA GCC GAG AAA GCC TTG 96 Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu 20 25 30 GGT CCC CTG CTT GCC CGG GAC CGG AGA CAG GCC ACC GAA TAT GAG TAC 144 Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr 35 40 45 CTA GAT TAT GAT TTC CTG CCA GAA ACG GAG CCT CCA GAA ATG CTG AGG 192 Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr G.lu Pro Pro Glu Met Leu Arg 50 55 60 AAC AGC ACT GAC ACC ACT CCT CTG ACT GGG CCT GGA ACC CCT GAG TCT 240 Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser 65 70 75 80 ACC ACT GTG GAG CCT GCT GCA AGG CGT TCT ACT GGC CTG GAT GCA GGA 288 Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly 85 90 95 GGG GCA GTC ACA GAG CTG ACC ACG GAG CTG GCC AAC ATG GGG AAC CTG 336 Gly Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu 100 105 110 TCC ACG GAT TCA GCA GCT ATG GAG ATA CAG ACC ACT CAA CCA GCA GCC 384 Ser Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu lie Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala 115 120 125 ACG GAG GCA CAG ACC ACT CAA CCA GTG CCC ACG GAG GCA CAG ACC AC T432 Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Val Pro Thr Glu Ala Gln Thr Thr 130 135 140 CCA CTG GCA GCC ACA GAG GCA CAG ACA ACT CGA CTG ACG GCC ACG GAG 480 Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Arg Leu Thr Ala Thr Glu 145 150 155 160 GCA CAG ACC ACT CCA CTG GCA GCC ACA GAG GCA CAG ACC ACT CCA CCA 528 Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro 165 170 175 GCA GCC ACG GAA GCA CAG ACC ACT CAA CCC ACA GGC CTG GAG GCA CAG 576 Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Gly Leu Glu Ala Gln 180 185 190 ACC ACT GCA CCA GCA GCC ATG GAG GCA CAG ACC ACT GCA CCA GCA GCC 624 Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala 195 200 205 ATG GAA GCA CAG ACC ACT CCA CCA GCA GCC ATG GAG GCA CAG ACC ACT 672 Met Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr 210 215 220 CAA ACC ACA GCC ATG GAG GCA CAG ACC ACT GCA CCA GAA GCC ACG GAG 720 Gln Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Glu Ala Thr Glu 225 230 235 240 GCA CAG ACC ACT CAA CCC ACA GCC ACG GAG GCA CAG ACC ACT CCA CTG 768 Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu 245 250 255 GCA GCC ATG GAG GCC CTG TCC ACA GAA CCC AGT GCC ACA GAG GCC CTG 816 Ala Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro Ser Ala Thr Glu Ala Leu 260 265 270 TCC ATG GAA CCT ACT ACC AAA AGA GGT CTG TTC ATA CCC TTT TCT GTG 864 Ser Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu Phe lie Pro Phe Ser Val 275 280 285 TCC TCT GTT ACT CAC AAG GGC ATT CCC ATG GCA GCC AGC AAT TTG TCC 912 Ser Ser Val Thr His Lys Gly lie Pro Met Ala Ala Ser Asn Leu Ser 290 295 300 GTC AAC TAC CCA GTG GGG GCC CCA GAC CAC ATC TCT GTG AAG CAG TGC 960 Val Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp His lie Ser Val Lys Gln Cys 305 310 315 320 CTG CTG GCC ATC CTA ATC TTG GCG CTG GTG GCC ACT ATC TTC TTC GTG 1008 Leu Leu Ala lie Leu lie Leu Ala Leu Val Ala Thr lie Phe Phe Val 325 330 335 TGC ACT GTG GTG CTG GCG GTC CGC CTC TCC CGC AAG GGC CAC ATG TAC 1056 Cys Thr Val Val Leu Ala Val Arg Leu Ser Arg Lys Gly His Met Tyr 340 345 350 CCC GTG CGT AAT TAC TCC CCC ACC GAG ATG GTC TGC ATC TCA TCC CTG 1104 Pro Val Arg Asn Tyr Ser Pro Thr Glu Met Val Cys lie Ser Ser Leu 355 360 365 TTG CCT GAT GGG GGT GAG GGG CCC TCT GCC ACA GCC AAT GGG GGC CTG Leu Pro Asp Gly Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu 370 375 380 TCC AAG GCC AA.G AGC CCG GGC CTG ACG CCA GAG CCC AGG GAG GAC CGT 1200 Ser Lys Ala Lys Ser Pro Gly Leu Thr Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg 385 390 395 400 GAG GGG GAT GAC CTC ACC CTG CAC AGC TTC CTC CCT TAG 1239 Glu Gly Asp Asp Leu Thr Leu Hís Ser Phe Leu Pro 405 410 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 412 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO: : Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu lie Leu Leu Gly Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu 20 25 30 Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr 35 40 45 Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg 50 55 60 Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser 65 70 75 80 Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly 85 90 95 Gly Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu 100 105 110 Ser Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu lie Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala 115 120 125 Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Val Pro Thr Glu Ala Gln'Thr Thr 130 135 140 Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Arg Leu Thr Ala Thr Glu 145 150 155 160 Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Gly Leu Glu Ala Gln 180 185 190 Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala 195 200 205 Met Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr 210 215 220 Gln Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Glu Ala Thr Glu 225 230 235 240 Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu 245 250 255 Ala Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro Ser Ala Thr Glu Ala Leu 260 265 270 Ser Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu Phe lie Pro Phe Ser Val 275 280 285 Ser Ser Val Thr His Lys Gly lie Pro Met Ala Ala Ser Asn Leu Ser 290 295 300 Val Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp His lie Ser Val Lys Gln Cys 305 310 315 320 Leu Leu Ala lie Leu lie Leu Ala Leu Val Ala Thr lie Phe Phe Val 325 330 335 Cys Thr Va- Val Leu -a Val Arq Leu Ser Arg Lys Gly His Met Tyr 340 345 350 Pro Val Arg Asn Tyr Ser Pro Thr Glu Met Val Cys lie Ser Ser Leu 355 360 365 Leu Pro Asp Gly Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu 370 375 380 Ser Lys Ala Lys Ser Pro Gly Leu Thr Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg 385 390 395 400 Glu Gly Asp Asp Leu Thr Leu His Ser Phe Leu Pro 405 410 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2151 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (VÜ) FUENTE INMEDIATA: (B) CLONA: pacesol (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: ATGGAGCTGA GGCCCTGGTT GCTATGGGTG GTAGCAGCAA CAGGAACCTT GGTCCTGCTA 60 GCAGCTGATG CTCAGGGCCA GAAGGTCTTC ACCAACACGT GGGCTGTGCG CATCCCTGGA 120 GGCCCAGCGG TGGCCAACAG TGTGGCACGG AAGCATGGGT-TCCTCAACCT GGGCCAGATC 180 TTCGGGGACT ATTACCACTT CTGGCATCGA GGAGTGACGA AGCGGTCCCT GTCGCCTCAC 240 CGCCCGCGGC ACAGCCGGCT GCAGAGGGAG CCTCAAGTAC AGTGGCTGGA ACAGCAGGTG 300 GCAAAGCGAC GGACTAAACG GGACGTGTAC CAGGAGCCCA CAGACCCCAA GTTTCCTCAG 360 CAGTGGTACC TGTCTGGTGT CACTCAGCGG GACCTGAATG TGAAGGCGGC CTGGGCGCAG 420 GGCTACACAG GGCACGGCAT TGTGGTCTCC ATTCTGGACG ATGGCATCGA GAAGAACCAC 480 CCGGACTTGG CAGGCAATTA TGATCCTGGG GCCAGTTTTG ATGTCAATGA CCAGGACCCT 540 GACCCCCAGC CTCGGTACAC ACAGATGAAT GACAACAGGC ACGGCACACG GTGTGCGGGG 600 GAAGTGGCTG CGGTGGCCAA CAACGGTGTC TGTGGTGTAG GTGTGGCCTA CAACGCCCGC 660 ATTGGAGGGG TGCGCATGCT GGATGGCGAG GTGACAGATG CAGTGGAGGC ACGCTCGCTG 720 GGCCTGAACC CCAACCACAT CCACATCTAC AGTGCCAGCT GGGGCCCCGA GGATGACGGC 780 AAGACAGTGG ATGGGCCAGC CCGCCTCGCC GAGGAGGCCT TCTTCCGTGG GGTTAGCCAG 840 GGCCGAGGGG GGCTGGGCTC CATCTTTGTC TGGGCCTCGG GGAACGGGGG CCGGGAACAT 900 GACAGCTGCA ACTGCGACGG ' CTACACCAAC AGTATCTACA CGCTGTCCAT CAGCAGCGCC 960 ACGCAGTTTG GCAACGTGCC GTGGTACAGC GAGGCCTGCT CGTCCACACT GGCCACGACC 1020 TACAGCAGTG GCAACCAGAA TGAGAAGCAG ATCGTGACGA CTGACTTGCG GCAGAAGTGC 1080 ACGGAGTCTC ACACGGGCAC CTCAGCCTCT GCCCCCTTAG CAGCCGGCAT CATTGCTCTC 1140 ACCCTGGAGG CCAATAAGAA CCTCACATGG CGGGACATGC AACACCTGGT GGTACAGACC 1200 TCGAAGCCAG CCCACCTCAA TGCCAACGAC TGGGCCACCA ATGGTGTGGG CCGGAAAGTG 1260 AGCCACTCAT ATGGCTACGG GCTTTTGGAC GCAG.GCGCCA TGGTGGCCCT GGCCCAGAAT 1320 TGGACCACAG TGGCCCCCCA GCGGAAGTGC ATCATCGACA TCCTCACCGA GCCCAAAGAC 1380 ATCGGGAAAC GGCTCGAGGT GCGGAAGACC GTGACCGCGT GCCTGGGCGA GCCCAACCAC 1440 ATCACTCGGC TGGAGCACGC TCAGGCGCGG CTCACCCTGT CCTATAATCG CCGTGGCGAC 1500 CTGGCCATCC ACCTGGTCAG CCCCATGGGC ACCCGCTCCA CCCTGCTGGC AGCCAGGCCA 1560 CATGACTACT CCGCAGATGG GTTT.AATGAC TGGGCCTTCA TC-ACAACTCA TTCCTGGGAT 1620 GAGGATCCCT CTGGCGAGTG GGTCCTAGAG ATTGAAAACA CCAGCGAAGC CAACAACTAT 1680 GGGACGCTGA CCAAGTTCAC CCTCGTACTC TATGGCACCG CCCCTGAGGG GCTGCCCGTA 1740 CCTCCAGAAA GCAGTGGCTG CAAGACCCTC ACGTCCAGTC AGGCCTGTGT GGTGTGCGAG 1800 GAAGGCTTCT CCCTGCACCA GAAGAGCTGT GTCCAGCACT GCCCTCCAGG CTTCGCCCCC 1860 CAAGTCCTCG ATACGCACTA TAGCACCGAG AATGACGTGG AGACCATCCG GGCCAGCGTC 1920 TGCGCCCCCT GCCACGCCTC ATGTGCCACA TGCCAGGGGC CGGCCCTGAC AGACTGCCTC 1980 AGCTGCCCCA GCCACGCCTC CTTGGACCCT GTGGAGCAGA CTTGCTCCCG GCAAAGCCAG 2040 AGCAGCCGAG AGTCCCCGCC ACAGCAGCAG CCACCTCGGC TGCCCCCGGA GGTGGAGGCG 2100 GGGCAACGGC TGCGGGCAGG GCTGCTGCCC TCACACCTGC CTGAGTGATG A 2151 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. : 6; (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 1587 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLONA: sPSL.Fc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: ATGCCTCTGC AACTCCTCCT GTTGCTGATC CTACTGGGCC CTGGCAACAG CTTGCAGCTG 60 TGGGACACCT GGGCAGATGA AGCCGAGAAA GCCTTGGGTC CCCTGCTTGC CCGGGACCGG 120 AGACAGGCCA CCGAATATGA GTACCTAGAT TATGATTTCC TGCCAGAAAC GGAGCCTCCA 180 GAAATGCTGA GGAACAGCAC TGACACCACT CCTCTGACTG GGCCTGGAAC CCCTGAGTCT 240 ACCACTGTGG AGCCTGCTGC AAGGCGTTCT ACTGGCCTGG ATGCAGGAGG GGCAGTCACA 300 GAGCTGACCA CGGAGCTGGC CAACATGGGG AACCTGTCCA CGGATTCAGC AGCTATGGAG 360 ATACAGACCA CTCAACCAGC AGCCACGGAG GCACAGACCA CTCCACTGGC AGCCACAGAG 420 GCACAGACAA CTCGACTGAC GGCCACGGAG GCACAGACCA CTCCACTGGC AGCCACAGAG 480 GCACAGACCA CTCCACCAGC AGCCACGGAA GCACAGACCA CTCAACCCAC AGGCCTGGAG 540 GCACAGACCA CTGCACCAGC AGCCATGGAG GCACAGACCA CTGCACCAGC AGCCATGGAA 600 GCACAGACCA CTCCACCAGC AGCCATGGAG GCACAGACCA CTCAAACCAC AGCCATGGAG 660 GCACAGACCA CTGCACCAGA AGCCACGGAG GCACAGACCA CTCAACCCAC AGCCACGGAG 720 GCACAGACCA CTCCACTGGC AGCCATGGAG GCCCTGTCCA CAGAACCCAG TGCCACAGAG 780 GCCCTGTCCA TGGAACCTAC TACCAAAAGA GGTCTGTTCA TACCCTTTTC TGTGTCCTCT 840 GTTACTCACA AGGGCATTCC CATGGCAGCC AGCAATTTGT CCGTCCTGCG GCCGCAGTCT 900 AGAGACAAAA CTCACACATG CCCACCGTGC CCAGCACCTG AACTCCTGGG GGGACCGTCA 960 GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC 1020 ACATGCGTGG TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG TCAAGTTCAA CTGGTACGTG 1080 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA CAACAGCACG 1140 TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT GGCTGAATGG CAAGGAGTAC 1200 AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA GTCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC 1260 AAAGGGCAGC CCCGAGAACC ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA GGAGATGACC 1320 AAGAACCAGG TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ATCCCAGCGA CATCGCCGTG 1380 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC CGTGCTGGAC 1440 TCCGACGGCT CCTTCTTCCT' CTATAGCAAG CTCACCGTGG ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG 1500 GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG 1560 AGCCTCTCCC TGTCCCCGGG TAAATAG 1587 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: AATTCCGTCG ACTCTAGAG 19 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO . : 8 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: CTCTAGAGTC GACGG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO . : 9 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 43 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: TAGCATACGC TCTAGAGCAT GGATCCCCTG GGTGCAGCCA AGC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.: 10: (i) CARACTERÍSTICAS' DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10 CCGGAATTCT CAGGTGAACC AAGCCGC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO . : 11 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: AAGTATCTGT CCAGGGCTTC CAGGT 25 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: AACTACCCAG TGGGAGCACC AGACCACATC TCTGTGAAGC AGTGCTAG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 52 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: AATTCTAGCA CTGCTTCACA' GAGATGTGGT CTGGTGCTCC CACTGGGTAG TT 52 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 45 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: AACTACCCAG TGGGAGCACC AGACCACATC TCTGTGAAGC AGTAG 45 (2¡ INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO . 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 49 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA : simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc íxi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: AATTCTACTG CTTCACAGAG ATGTGGTCTG GTGCTCCCAC TGGGTAGTT (2) INFORMATION POR SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD; 52 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l CTAGACCCGG GATGGCATCC ATGACAGGAG GACAACAAAT GGTAGGCCGT (2) INFORMATION POR SEQ ID NO; 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 53 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 17 : AATTCTACGG CCTACCCATT TGTTGTCCTC CTGTCATGGA TGCCATCCCG GGT (2) INFORMATION POR SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: CTGCGGCCGC AGT (2) INFORMATION POR SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCI : (A) LONGITUD: 17 pares de bases (E) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: CTAGACTGCG GCCGCAG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 50 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20: CCAGGTCCAA CTGCAGGTCG ACTCTAGAGG GCACTTCTTC TGGGCCCACG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 50 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21: TATTATCTGT GCGGCCGCCC TCCAGAACCC ATGGCTGCTG GTTGCAGTGG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD; 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal ( i i) TTPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22 TATTATCTGT GCGGCCGCGC AGCAGGCTCC ACAGTGGTAG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23 TATTATCTGT GCGGCCGCGG AGGCTCCGTT TCTGGCAG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24 CGGAGACAGG CCACCGAATT CCTGCCAGAA ACG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NC:25 CCTCCAGAAA TGCTGAGGCA CAGCACTGAC ACCACTCCTC (2) I FORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal di) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc [xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID ??:2d GAGCTGGCCA ACATGGGGCA ACTGTCCACG GATTCAGCAG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27 AATTCGAGTT CCTAGATTTT G (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS' DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28 AATTCAAAAT CTAGGAACTC G (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID MO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29: AATTCGAGTA CCTAGATTAT GATTTCCTGC CAGAAACTGA GCCTCCGC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 30: ¡ i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 48 pares ck: bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30: DGCCGCGGAG GCTCAGTTTC TGGCAGGAAA TCATAATCTA GGTACTCG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31: AATTCGAGTT CCTAGATTAT GATTTCCTGC CAGAAACTGA GCCTCCGC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA; simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32: GGCCGCGGAG GCTCAGTTTC TGGCAGGAAA TCATAATCTA GGAACTCG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal !ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33: AATTCGAGTT CCTAGATTTC GATTTCCTGC CAGAAACTGA GCCTCCGC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:34: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34; GGCCGCGGAG GCTCAGTTTC TGGCAGGAAA TCGAAATCTA GGAACTCG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.;35: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 942 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA; doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE; CDS (B) LOCALIZACIÓN; 1..939 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35: ATGCCTCTGC AACTCCTCCT GTTGCTGATC CTACTGGGCC CTGGCAACAG CTTGCAGCTG 60 TGGGACACCT GGGCAGATGA AGCCGAGAAA GCCTTGGGTC CCCTGCTTGC CCGGGACCGG 120 AGACAGGCCA CCGAATATGA GTACCTAGAT TATGATTTCC TGCCAGAAAC GGAGCCTCCA 180 GAAATGCTGA GGAACAGCAC TGACACCACT CCTCTGACTG GGCCTGGAAC CCCTGAGTCT 240 ACCACTGTGG AGCCTGCTGC GCGGCCGCAC ACATGCCCAC CGTGCCCAGC ACCTGAAGCC 300 CTGGGGGCAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC 360 CGGACCCCTG AGGTCACATG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC ACGAAGACCC TGAGGTCAAG 420 TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG 480 CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TCCTGCACCA GGACTGGCTG 540 AATGGCAAGG AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGCCC TCCCAGTCCC CATCGAGAAA 600 ACCATCTCCA AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT GCCCCCATCC 660 CGGGAGGAGA TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC TGGTCAAAGG CTTCTATCCC 720 AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG 780 CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCCTTC TTCCTCTATA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG 840 AGCAGGTGGC AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC 900 CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCC CCGGGTAAAT GA 942 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 36: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 313 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA : (D) TOPOLOGÍA: lineal (íi) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36: Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu lie Leu Leu Gly Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu 20 25 30 Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr 35 40 45 Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg 50 55 60 Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser 65 70 75 80 Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 85 90 95 Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 100 105 110 09 Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 115 120 125 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 130 135 140 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 145 150 155 160 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 165 170 175 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 180 185 190 Ala Leu Pro Val Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln 195 200 205 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 210 215 220 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 225 230 235 240 Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 245 250 255 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 260 265 270 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 275 280 285 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 290 295 300 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 305 310 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:37. (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 810 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1..807 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37: ATGCCTCTGC AACTCCTCCT GTTGCTGATC CTACTGGGCC CTGGCAACAG CTTGCAGCTG 60 TGGGACACCT GGGCAGATGA AGCCGAGAAA GCCTTGGGTC CCCTGCTTGC CCGGGACCGG 120 AGACAGGCCA CCGAATATGA GTACCTAGAT TATGATTTCC TGCCAGAAAC GGAGCCTCCA 180 GAAATGCTGA GGAACAGCAC TGACACCACT CCTCTGACTG GGCCTGGAAC CCCTGAGTCT 240 ACCACTGTGG AGCCTGCTGC GCGGCCGCTG TGTGCCAACC TAGTACCGGT GCCCATCACC 300 AACGCCACCC TGGACCAGAT CACTGGCAAG TGGTTTTATA TCGCATCGGC CTTTCGAAAC 360 GAGGAGTACA ATAAGTCGGT TCAGGAGATC CAAGCAACCT TCTTTTACTT CACCCCCAAC 420 AAGACAGAGG ACACGATCTT TCTCAGAGAG TACCAGACCC GACAGGACCA GTGCATCTAT 480 AACACCACCT ACCTGAATGT CCAGCGGGAA AATGGGACCA TCTCCAGATA CGTGGGAGGC 540 CAAGAGCATT TCGCTCACTT GCTGATCCTC AGGGACACCA AGACCTACAT GCTTGCTTTT 600 GACGTGAACG ATGAGAAGAA CTGGGGGCTG TCTGTCTATG CTGACAAGCC AGAGACGACC 660 AAGGAGCAAC TGGGAGAGTT CTACGAAGCT CTCGACTGCT TGCGCATTCC CAAGTCAGAT 720 GTCGTGTACA CCGATTGGAA AAAGGATAAG TGTGAGCCAC TGGAGAAGCA GCACGAGAAG 780 GAGAGGAAAC AGGAGGAGGG GGAATCCTAG 810 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:38 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 269 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33: Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu lie Leu Leu Gly Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu 20 25 30 Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr 35 40 45 Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg 50 55 60 Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser 65 70 75 80 Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Pro Leu Cys Ala Asn Val Pro 85 90 95 Val Pro lie Thr Asn Ala Thr Leu Asp Gln lie Thr Gly Trp Phe 100 105 Tyr lie Ala Ser Ala Phe Arg Asn Glu Glu Tyr Asn Lys Ser Val Gln 115 120 125 Glu lie Gln Ala Thr Phe Phe Tyr Phe Thr Pro Asn Thr Glu Asp ¦130 135 140 Thr lie Phe Leu Arg Glu Tyr Gln Thr Arg Gln Asp Gln Cys lie Tyr 145 150 155 160 Asn Thr Thr Tyr Leu Asn Val Gln Arg Glu Asn Gly Thr lie Ser Arg 165 170 175 Tyr Val Gly Gly Gln Glu His Phe Ala His Leu Leu lie Leu Arg Asp 180 185 190 Thr Lys Thr Tyr Met Leu Ala Phe Asp Val Asn Asp Glu Lys Asn Trp 195 200 205 Gly Leu Ser Val Tyr Ala Asp Lys Pro Glu Thr Thr Lys Glu Gln Leu 210 215 220 Gly Glu Phe Tyr Glu Ala Leu Asp Cys Leu Arg lie Pro Lys Ser Asp 225 230 235 240 Val Val Tyr Thr Asp Trp Lys Lvs Asp Lys Glu Pro Leu Glu Lys 245 250 255 Gln His Glu Lys Glu Arg Lys Gln Glu Glu Glu Ser 260 265 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1314 pares de (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1..1311 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39: ATGGTGGCCG GGACCCGCTG TCTTCTAGCG TTGCTGCTTC CCCAGGTCCT CCTGGGCGGC 60 GCGGCTGGCC TCGTTCCGGA GCTGGGCCGC AGGAAGTTCG CGGCGGCGTC GTCGGGCCGC 120 CCCTCATCCC AGCCCTCTGA CGAGGTCCTG AGCGAGTTCG AGTTGCGGCT GCTCAGCATG 180 TTCGGCCTGA AACAGAGACC CACCCCCAGC AGGGACGCCG TGGTGCCCCC CTACATGCTA 240 GACCTGTATC GCAGGCACTC AGGTCAGCCG GGCTCACCCG CCCCAGACCA CCGGTTGGAG 300 AGGGCAGCCA GCCGAGCCAA CACTGTGCGC AGCTTCCACC ATGAAGAATC TTTGGAAGAA 360 CTACCAGAAA CGAGTGGGAA AACAACCCGG AGATTCTTCT TTAATTTAAG TTCTATCCCC 420 ACGGAGGAGT TTATCACCTC AGCAGAGCTT CAGGTTTTCC GAGAACAGAT GCAAGATGCT 480 TTAGGAAACA ATAGCAGTTT CCATCACCGA ATTAATATTT ATGAAATCAT AAAACCTGCA 540 ACAGCCAACT CGAAATTCCC CGTGACCAGA CTTTTGGACA CCAGGTTGGT GAATCAGAAT 600 GCAAGCAGGT GGGAAAGTTT TGATGTCACC CCCGCTGTGA TGCGGTGGAC TGCACAGGGA 660 CACGCCAA.CC ATGGATTCGT GGTGGAAGTG GCCCACTTGG AGGAGAAACA AGGTGTCTCC 720 AAGAGACATG TTAGGATAAG CAGGTCTTTG CACCAAGATG AACACAGCTG GTCACAGAT 780 AGGCCATTGC TAGTAACTTT TGGCCATGAT GGAAAAGGGC ATCCTCTCCA CAAAAGAGAA 840 AAACGTCAGG CCACCGAATA TGAGTACCTA GATTATGATT TCCTGCCAGA AACGGAGCCT 900 CCAGAAATGC TGAGGAACAG CACTGACACC ACTCCTCTGA CTGGGCCTGG AACCCCTGAG 960 TCTACCACTG TGGAGCCTGC TGCAAGGCGG AAACGCCTTA AGTCCAGCTG TAAGAGACAC 1020 CCTTTGTACG TGGACTTCAG TGACGTGGGG TGGAATGACT GGATTGTGGC TCCCCCGGGG 1080 TATCACGCCT TTTACTGCCA CGGAGAATGC CCTTTTCCTC TGGCTGATCA TCTGAACTCC 1140 ACTAATCATG CCATTGTTCA GACGTTGGTC AACTCTGTTA ACTCTAAGAT "TCCTAAGGCA 1200 TGCTGTGTCC CGACAGAACT CAGTGCTATC TCGATGCTGT ACCTTGACGA GAATGAAAAG 1260 GTTGTATTAA AGAACTATCA GGACATGGTT GTGGAGGGTT GTGGGTGTCG CTAG 1314 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 0: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 437 aminoácidos ÍB) TIPO: aminoácido (C! TIPO DE CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ 1D NO:40: Met Val Ala Gly Thr Arg Cys Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Gln Val 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Glu Leu Gly Arg Arg Lys 20 25 30 Phe Ala Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gln Pro Ser Asp Glu 35 40 45 Val Leu Ser Glu Phe Glu Leu Arg Leu Leu Ser Met Phe Gly Leu Lys 50 55 60 Gln Arg Pro Thr Pro Ser Arg Asp Ala Val Val Pro Pro Tyr Met Leu 65 70 75 80 Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly Gln Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp 85 90 95 His Arq Leu Glu Arg Ala Ala Ser Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe 100 105 110 His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Thr Ser Gly Lys Thr 115 120 125 Thr Arg Arg Phe ?he Phe Asn Leu Ser Ser lie Pro Thr Glu Glu Phe 130 135 140 lie Thr Ser Ala Glu Leu Gln Val Phe Arg Glu Gln Met Gln Asp Ala 145 150 155 160 Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His His Arg lie Asn lie Tyr Glu lie 165 170 175 lie Lys Pro Ala Thr Ala Asn Ser Lys Phe Pro Val Thr Arg Leu Leu 180 185 190 Asp Thr Arg Leu Val Asn Gln Asn Ala Ser Arg Trp Glu Ser Phe Asp 195 200 205 Val Thr Pro Ala Val Met Arg Trp Thr Ala Gln Gly His Ala Asn His 210 215 220 Gly Phe Val Val Glu Val Ala His Leu Glu Glu Lys Gln Gly Val Ser 225 230 235 240 Lys Arg His Val Arg lie Ser Arg Ser Leu His Gln Asp Glu His Ser 245 250 255 Trp Ser Gln lie Arg Pro Leu Leu Val Thr Phe Gly His Asp Gly Lys 260 265 270 Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu 275 280 * 285 Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu 290 295 300 Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu 305 310 315 320 Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser 325 330 335 Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn 340 345 350 Asp Trp lie Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly 355 360 365 Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala 370 375 380 lie Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys lie Pro Lys Ala 385 390 395 400 Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala lie Ser Met Leu Tyr Leu Asp 405 410 415 Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu 420 425 430 Gly Cys Gly Cys Arg 435 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 41: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 795 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA : doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1..792 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 : ATGCCTCTGC AACTCCTCCT GTTGCTGATC CTACTGGGCC CTGGCAACAG CTTGCAGCTG TGGGACACCT GGGCAGATGA AGCCGAGAAA GCCTTGGGTC CCCTGCTTGC CCGGGACCGG AGACAGGCCA CCGAATATGA GTACCTAGAT TATGATTTCC TGCCAGAAAC GGAGCCTCCA 180 GAAATGCTGA GGAACAGCAC TGACACCACT CCTCTGACTG GGCCTGGAAC CCCTGAGTCT 240 ACCACTGTGG AGCCTGCTGC GCGGCCGCCA CCTGGCCCCC CTCGAGTTTC CCCAGACCCT 300 CGGGCCGAGC TGGACAGCAC CGTGCTCCTG ACCCGCTCTC TCCTGGCGGA CACGCGGCAG 360 CTGGCTGCAC AGCTGAGGGA CAAATTCCCA GCTGACGGGG ACCACAACCT GGATTCCCTG 420 CCCACCCTGG CCATGAGTGC GGGGGCACTG GGAGCTCTAC AGCTCCCAGG TGTGCTGACA 480 AGGCTGCGAG CGGACCTACT GTCCTACCTG CGGCACGTGC AC-TGGCTGCG CCGGGCAGGT 540 GGCTCTTCCC TGAAGACCCT GGAGCCCGAG CTGGGCACCC TGCAGGCCCG ACTGGACCGG 600 CTGCTGCGCC GGCTGCAGCT CCTGATGTCC CGCCTGGCCC TGCCCCAGCC ACCCCCGGAC 660 CCGCCGGCGC CCCCGCTGGC GCCCCCCTCC TCAGCCTGGG GGGGCATCAG GGCCGCCCAC 720 GCCATCCTGG GGGGGCTGCA CCTGACACTT GACTGGGCCG TGAGGGGACT GCTGCTGCTG 780 AAGACTCGGC TGTGA 795 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 264 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido . (C) TIPO DE CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42: Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu lie Leu Leu Gly Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu 20 ^ 25 30 Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr 35 40 45 Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg 50 55 60 Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser 65 70 75 80 Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val 85 90 95 Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg 100 105 110 Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys 115 120 125 Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala 130 135 140 Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr 145 150 155 160 Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu 165 170 175 Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly 180 185 190 Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu 195 200 205 Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro 210 215 220 Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly lie Arg Ala Ala His 225 230 235 240 Ala lie Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly 245 250 255 Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu 260

Claims

Novedad de la Invención 1. Un ADN aislado que codifica apara un proteína de fusión que comprende (a) una primer secuencia de aminoácidos comprendiendo del aminoácido 42 al aminoácido 60 de la SEQ ID No. 2, y fb) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de una proteína distinta al ligando de la P-selectina.
2. El ADN de la reivindicación 1 , el cual además comprende una secuencia de control de expresión operativamente unida a dicha secuencia de nucleótidos.
3. Una célula hospedera transformada con el ADN de la reivindicación 2.
4. Un proceso para producir una proteína de fusión, el cual comprende: (a) cultivar la célula hospedera de la reivindicación 3 bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión; y (b) purificar la proteína de fusión del medio de cultivo.
5. El ADN de la reivindicación 1 , en donde dicha primer secuencia de aminoácidos comprende del aminoácido 42 al aminoácido 402 de la SEQ ID No. 2.
6. El ADN de la reivind icación 1 . en donde dicha primer secuencia de aminoácidos comprende del aminoácido 42 al aminoácido 3 1 0 de la SEQ ID No. 2.
7. El ADN de la reivindicación 1 , en donde dicha primer secuencia de aminoácidos comprende del aminoácido 42 al aminoácido 88 de la SEQ ID No. 2.
8. El ADN de la reivindicación 1 , en donde dicha primer secuencia de aminoácidos comprende del aminoácido 42 al aminoácido 1 18 de la SEQ ID No. 2.
9. El ADN de la reivindicación 1 , en donde dicha primer secuencia de aminoácidos comprende del aminoácido 42 al aminoácido 1 89 de la SEQ ID No. 2.
10. El ADN de la reivindicación en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos está unida a la terminación C de dicha primer secuencia de aminoácidos.
11. El ADN de la reivindicación 10. en donde dichas secuencias están unidas por una secuencia de enlace.
12. El ADN de la reivindicación 1 . en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos está unida a la terminación N de dicha primer secuencia de aminoácidos.
13. El ADN de la reivindicación 12, en donde dichas secuencias están unidas por una secuencia de enlace. ¡ 08
14. El ADN de la reivindicación 1 , en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos es derivada de una proteína seleccionada del grupo formado por un anticuerpo, una citocina, un factor de crecimiento, un factor de diferenciación, una hormona, una enzima, un receptor o fragmento de estos y un ligando.
15. El ADN de la reivindicación 14, en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos es derivada de la secuencia de un anticuerpo.
16. El ADN de la reivindicación 1 5. en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos es derivada de la porción Fe de un anticuerpo.
17. El ADN de la reivindicación 1 5, en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos es una mutación de una secuencia derivada de un anticuerpo.
18. El ADN de la reivindicaci n 1 4. en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos es derivada de la secuencia de una citocina.
19. El ADN de la reivindicación 14, en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos es derivada de la secuencia de un factor de crecimiento.
20. El ADN de la reivindicación 1 9. en donde dicho factor de crecimiento es una BMP.
21. El ADN de la reivindicación 7, comprendiendo la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 35 desde el nucleótido 1 23 hasta el nucleótido 939.
22. El ADN de la reivindicación 2 1 . comprendiendo la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 35.
23. El ADN de la reivindicación 7, comprendiendo la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 37 desde el nucleótido 1 23 hasta el nucleótido 807.
24. El ADN de la reivindicación 23. comprendiendo la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 37.
25. El ADN de la reivindicación 7, comprendiendo la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 39 desde el nucleótido 1 23 hasta el nucleótido 13 1 1 .
26. El ADN de la reivindicación 25. comprendiendo la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 39.
27. El ADN de la reivindicación 7. comprendiendo la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 41 desde el nucleótido 1 23 hasta el nucleótido 792.
28. El ADN de la reivindicación 27, comprendiendo la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 41 .
29. Una proteína de fusión comprendiendo (a) una primer secuencia de aminoácidos comprendiendo del aminoácido 42 al aminoácido 60 de la SEQ ID No. 2, y (b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de una proteína distinta al ligando de la P-selectina.
30. La proteína de fusión de la reivindicación 29, en donde dicha primer secuencia de aminoácidos comprende del aminoácido 42 al aminoácido 402 de la SEQ ID No. 2.
31. La proteína de fusión de la reivindicación 29, en donde dicha primer secuencia de aminoácidos comprende del aminoácido 42 al aminoácido 3 1 0 de la SEQ ID No. 2.
32. La proteína de fusión de la reivindicación 29, en donde dicha primer secuencia de aminoácidos comprende del aminoácido 42 al aminoácido 88 de la SEQ ID No. 2.
33. La proteína de fusión de la reivindicación 29, en donde dicha primer secuencia de aminoácidos comprende del aminoácido 42 al aminoácido 1 I 8 de la SEQ ID No. 2.
34. La proteína de fusión de la reivi ndicación 29, en donde dicha primer secuencia de aminoácidos comprende del aminoácido 42 al aminoácido 1 89 de la SEQ ID No. 2.
35. La proteína de fusión de la reivindicación 29, en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos está unida a la terminación C de dicha primer secuencia de aminoácidos.
36. La proteína de fusión de la reivindicación 35. en donde dichas secuencias están unidas por una secuencia de enlace.
37. La proteína de fusión de la reivindicación 29, en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos está unida a la terminación N de dicha primer secuencia de aminoácidos.
38. La proteína de fusión de la reivindicación 37, en donde dichas secuencias están unidas por una secuencia de enlace.
39. La proteína de fusión de la reivindicación 29, en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos es derivada de una proteína seleccionada del grupo formado por un anticuerpo, una citocina, un factor de crecimiento, un factor de diferenciación, una hormona, una enzima, un receptor o fragmento de estos y un ligando.
40. La proteína de fusión de la reivindicación 39, en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos es derivada de la secuencia de un anticuerpo.
41 . La proteína de fusión de la reivindicación 40, en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos es derivada de la porción Fe de un anticuerpo.
42. La proteína de fusión de la reivindicación 40, en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos es una mutación de una secuencia derivada de un anticuerpo.
43. La proteína de fusión de la reivindicación 39, en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos es derivada de la secuencia de una citocina.
44. La proteína de fusión de la reivindicación 39, en donde dicha segunda secuencia de aminoácidos es derivada de la secuencia de un factor de crecimiento.
45. La proteína de fusión de la reivindicación 44, en donde dicho factor de crecimiento es una BMP.
46. La proteína de fusión de la reivindicación 32, comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 36 desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 3 13.
47. La proteína de fusión de la reivindicación 46. comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 36.
48. La proteína de fusión de la reivindicación 32, comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 38 desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 269.
49. La proteina de fusión de la reivindicación 48. comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 38.
50. La proteína de fusión de la reivindicación 32, comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 40 desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 437.
51. La proteína de fusión de la reivi ndicación 50, comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 40.
52. La proteína de fusión de la reivindicación 32, comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 42 desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 264.
53. La proteina de fusión de la reivindicación 52. comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 42.
54. Una proteína de fusión hecha de conformidad con el proceso de la reivindicación 4.
55. Una composición que comprende (a) un primer péptido comprendiendo del aminoácido 42 al aminoácido 60 de la SEQ ID No. 2. y (b) un segundo péptido derivado de la secuencia de una proteína distinta al ligando de P-selectina, en donde dicho primer péptido y dicho segundo péptido están químicamente unidos por una fracción distinta a un enlace péptido.