MXPA97002204A - Tratamiento con ribozimas de enfermedades o condiciones relacionadas con niveles de lipoproteina (a) [lp(a)]en plasma, inhibiendo apolipoproteina (a) [apo(a)] - Google Patents
Tratamiento con ribozimas de enfermedades o condiciones relacionadas con niveles de lipoproteina (a) [lp(a)]en plasma, inhibiendo apolipoproteina (a) [apo(a)]Info
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Abstract
La presente invención se refiere a moléculas enzimáticas de ARN que cortan ARNm de apo(a);uso de estas moléculas catalíticas de ARN para el tratamiento de condiciones relacionadas con niveles de lipoproteína A, tales como aterosclerosis, infarto al miocardio, ataques:restenosis y enfermedades cardiacas.
Description
TRATAMIENTO CON RIBOZIMAS DE ENFERMEDADES O CONDICIONES RELñCIONñDflS CON NIVELES DE LIPOPROTEINñ Ca) CLp(a)] EN PLñSHñ INHIBIENDO flPOLIPOPROTEINñ (a) CñPO(a)3
CflMPO DE Lñ INVENCIÓN
a presente invención se refiere a composiciones terapéuticas y métodos para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades o condiciones relacionadas con niveles de L?(a), tales como ateroeclerosis, infarto al miocardio, ataque y restenosis.
ANTECEDENTES DE Lfí INVENCIÓN
La siguiente es una breve descripción del papel fisiológico cje Lp(a). La discusión no pretende ser completa y se provee sólo para comprender la invención que sigue. Esta breve descripeion no es un reconocimiento de que cualquiera de los trabajos descritos a continuación es técnica anterior a la invención reívi dicada. Las lipoproteinas de baja densidad (LDLs) se componen principalmente de colesterol, fosfolípidos y una sola proteína hidrofóbica, la apolipoproteína B [apoBU. Se consideran los principales transportado es de colesterol en plasma humano (para una reevisión ver Uterrnan, G. (1989) Science 246, 904-910). La UpoB, única s?bunidad de proteína de LDL, reconoce y se une con receptores de LDL en la superficie de las células, Esta i teraeción LDL-Receptor de LDL provoca que se interne la LDL y que fi nalmente se libere colesterol dentro de la célula. En 1963 se descubrió una forma modificada de LDL, denominada lipoproteína (a) [LptaH, [Berg, K. (1963) Reta
Pathol. Microbiol. Scand. 59, 3691. Un enlace covalente de una glicoproteína adicional, apota), con la LDL distingue a la Lp( a ) de L DL. Varios estudios han sugerido recientemente que niveles elevados de Lp(a) en plasma humano están ligados a enfermed Cardiaca (Gurakar, y otros, (1985) ñtheróselerosis
57, 293-301; Leren, y otros (19B8) fítherosclerosis 73, 135-141;
Uterrnan, precitado). Los niveles de Lp(a) varían sobre 1000 veces e ind viduos con cuartil superior de niveles de Lp(a) en plasma tienen de dos a cinco veces aumentada la probabilidad de desarrollar ateróselerosis . La aterosclerosis es una enfermedad asociada con endurecirniento y pérdida de elasticidad de las paredes de las arterias, Uno de los factores más importantes responsables de ateroscleros s son concentraciones altas de colesterol, en la forma de Lp a), en el plasma sanguíneo humano. El depósito de colesterol fn los Hacrófagos y células de músculo liso, asociado co las paredes de las arterias, ocasiona placas (lesiones ateromatosas) que provocan proliferación de células de músculo iso contiguas. Con el tiempo, estas placas crecen en tamaño caeionando endurecimiento de las paredes de las arterias y perdida de elasticidad, lo cual a su vez provoca la ruptura de 1as paredes de las arterias, coagulación sanguínea y obstrucción 'j flujo sanguíneo en la arteria (para detalles ver Textbook o f Medical Physiology, Guyton, ñ.C, (Saunders
Company, Phi.Ladelphia, 1991) pp. 761-764). Los niveles de Lp(a) y/o apo(a) están bien correlacionados con un riesgo incrementado de aterosclerosis y RUS manifestaciones subsecuentes tales co o infarto al miocardio, ataque y restenosis. La proteína apo(a) es única en humanos, primates del Viejo undo y erizos; su ausencia en animales comunes de laboratorio ha hecho difícil la exploración del papel fisiológico de los niveles de apota). Recientemente fue construido un ratón transgénico que expresa el gen humano que codifica apota) CLawn y otros, (1992) Nature 360, 670-6723. Los ratones transgénicos son más susceptibles que la progenie de control dar el desarrollo de regiones ricas en lípidos en la aorta, floemas, la expresión de a?o(a) humana se localiza junto a las regiones de depósito de grasa. De esta manera, la sobre-expresión de apo(a) conduce directamente a lesiones semejantes efe aterosclerosis en animales experimentales. Esta observación 1 leva a creer la hipótesis de que niveles elevados de apo(a) en humanos contribuyen a enfermedad aterosclerótica. La apolipoproteína (a) es una glicoproteína grande que varía en tamaño de 300-800 KDa. Se han caracterizado treinta y cuatro diferentes isoformas a partir de plasma humano. El único clon de ODNc humano actualmente disponible abarca un mensaje de 14 kilobases que codifica apota) CMcLean y apo(a) . El solicitante muestra ahora que estas mismas limitaciones son oportunidades para terapia con ribozirnas. La especificidad del sitio de corte de los ribozimas permite a uno identificar sitios blanco de ribozimas presentes en ñRNrn de apo(a) , pero completamente ausentes en el fiRNrn de plasminógeno. Por ejemplo, existen 13 sitios de corte de cabeza de martillo presentes en los kringles altamente conservados de a?o(a) que no están presentes en el kringle IV de plasminógeno. Asimismo, la última repetición de kringle, dominio de proteasa y región 3' no traducida de apota) contienen 21 sitios de corte de ribozirna de cabeza de martillo presentes en apota) que no están presentes en plasminógeno. ñsí, los ribozimas que hacen blanco en ñRNm de apota) representan herramientas terapéuticas y diagnósticas únicas para el tratamiento y diagnóstico de aquellos en alto riesgo de aterosclerosis.
BREVE DESCRIPCIÓN DE Lñ INVENCIÓN
Estd invención se refiere a ribozimas, o moléculas enzirnáticas <d:e ñRN, dirigidas para cortar especies de ñRNm que codifican ap o (a). En particular, el solicitante describe la selección y función de ribozimas capaces de cortar este ñRN y su uso para reducir niveles de apota) en diferentes tejidos para tratar as enfermedades discutidas en la presente. Tales ribozi as también son útiles para usos diagnósticos.
para ro per el ñRN blanco. De esta manera, el ácido nucleico enzimático primero reconoce y después se une al ñRN blanco mediante aparea iento de bases complementarias, y una vez unido en el sitio correcto, actúa enzimáticarnente para cortar ñRN blanco. El corte estratégico de dicho ñRN blanco destruye capacidad p>ara dirigir la síntesis de una proteína codificada.
Después de que un ácido nucleico enzimático se ha unido a, y cortado su, fiRN blanco, se libera de ese ñRN para buscar otro blanco y pue a unirse repetidamente y cortar nuevos blancos. La naturaleza enzimática de un ribozima es ventajosa sobre otras tecnologías, tales como tecnología de contrasentido (en donde una molécula de ácido nucleico simplemente se une a un ácido nucleico blanco para obstruir su procesamiento y traducción) ?a que la concentración de ribozima necesaria para efectuar un tratamiento terapéutico es menor a la de un oligonucleótido de contrasentido. Esta ventaja refleja la capacidad d€il ribozima para actuar enzirnáticamente. ñei , una sola molécula de ribozima es capaz de cortar muchas moléculas de ñRN blanco, ñdemás, el ribozima es un inhibidor altamente especifico, con la especificidad de inhibición dependiendo no solo del mecanismo de unión de apareamiento de bases al flRN blanco, sino también del mecanismo de corte del ñRN blanco, Apareamientos; desiguales o substituciones de bases sencillas, cerca del sitio de corte pueden eliminar completamente la actividad catalítica de un ribozima. Apareamientos desiguales similares en moléculas de contrasentido no evitan su acción (Uoolf, T. M , y otros, 1992, Proc. Nati, fícad. Sci., USA , 89, 7305-7309) . De esta manera, la especificidad de acción de un ribozima ee pjayor que la de un oligonucleótido de contrasentido que se une a mie o sitio de ñRN. En modalidades preferidas de esta invención, la molécula de ácido nucleico enzimático se forma en un motiva or de cabeza cíß martillo u horquilla, pero también puede ser formado en 1 rnotivador de un virus delta de hepatitis, intrón grupo I o ñRN de ñRNasaP (en asociación con una secuencia guia de ñRN) o ñRN de Neurospora. Ejemplos de tales motivadores de cabeza de rna rtillo son descritos por Rossi y otros, 1992, en fiids Researc and Human Retroviruses, 8, 183; de motivadores de horquilla per Harnpel y otros, "RNfi Catalyst for Cleaving Speci ic RNfi Sequences", presentada el 20 de septiembre de 1989, que es una continuación en parte de la U.S. Serie No. 07/247,100, presentada el 20 de septiembre de 1988; Hampel y Tritz, 1989, Biochemistry, 28, 4929; y Hampel y otros, 1990,
Nucleic ñcids Res . 18 , 299 ; y un ejemplo del rnotivador de vi rus delta de hepatitis es descrito por Perrotta y Been, 1992, Biochemistry, 31, 16; del motivador ñRNasaP por Guerrier-Takada y otros, 198 3, Cell, 35, 849; del motivador de ribozima de ñRN de Neurospo ra VS es descrito por Collins (Saville y Collins, 1990 Cell, 6 1, 685-696; Saville y Collins, 1991 Proc. Nati. ñcad. Sci. USñ, 88, 8826-8830; Collins y Olive, 1993
Biochemistry 32 , 2795- 2799 ) y del intron del Grupo I por Cech y otros, Patent e Norteamericana 4 , 987 , 071. Estos motivadores específicos no son limitantes de la invención y los expertos en la materia reconocerán que todo lo que es importante en una molécula enzirnática de ácido nucleico de esta invención es que tiene un sitio de unión de un substrato especifico, que es complementaria a una o más de las regiones de fiRN del gen blanco, y ue tiene secuencias de nucleótido dentro de, o rodeando a , ese sitio de unión de substrato que imparte una actividad de corte de flRN a la molécula. La invención provee un método para producir una clase de agentes <d:e corte enzimático que exhiben un alto grado de especificidad para el ñRN de un blanco deseado. La molécula de ácido nucleico enzimática hace blanco preferiblemente en una región de secuencia altamente conservada de un fiRNm blanco que codifica apo (a), de modo que puede proveerse tratamiento específico de una enfermedad o condición con uno o varios ácidos nucleieos enzi áticos. Tales moléculas de ácido nucleico enzi atico pueden liberarse a voluntad de forma exógena hacia células especificas. Alternativamente, los ribozimas pueden expresarse a partir de vectores de ñDN que son liberados hacia células especificas. La síntesis de ácidos nucleicos mayores de 100 nucleótidos de longitud es difícil usando métodos automatizados , y el costo terapéutico de tales moléculas es prohibitibo. En esta invención, se usan otivadoree pequeños de ácido nucleico enzimático (v.gr., de la estructura de cabeza de martillo o de horquilla) para liberación exogéna. La estructura de flRN también contienen dominios que catalizan el corte de ñRN. Las moléculas de ñRN son re eriblemente ribozirnas del motivador cabeza de martillo o horquilla, ñl unirse, los ribozimas cortan el fiRNrn blanco que codifica a?o(a), evitando traducción y acumulación de proteína. En ausencia de la expresión cdel gen blanco, puede observarse un efecto terapéutico. Por "inhibir" se entiende que se reduce la actividad o nivel de ñRNm que codifica apo(a) por debajo del que se observa en ausencia del ribozima, y preferiblemente está por debajo del nivel observado en presencia de una molécula de fiRN inactiva capaz de unirse al mismo sitio en el ñRNrn, pero incapaz de cortar ese ñRN. Tales ribozirnas son útiles para la prevención de las enfermedades y condiciones discutidas antes, y cualesquiera otras enfermedades o condiciones que están relacionadas con el nivel de actividad de apo(a) en una célula o tejido. Por "relacionado" significa que la inhibición de la traducción de ñRNrn de apot ), y por tanto la reducción en el nivel de apo(a), aliviará en alguna medida los síntomas de la enfermedad o condición. Los ribozirnas son agregados directamente, o pueden formar com l os con lípidos catiónicos, empacados con lipoeo as, o liberados de otra forma hacia las células blanco. El ñRN o los complejos de ñRN pueden administrarse localrnente a tejidos reíevantes mediante el uso de un catéter, bomba de i nfusión o fijador, con o sin su incorporación en biopolímeros. En modal i a des preferidas, los ribozimas tienen brazos de unión que son co pjlementarlos a las secuencias que se presentan en los cuadros II, IV, VI y VII. Ejemplos de tales ribozirnas se muest ran en los cuadros III, V, VI y VII. Ejemplos de tales ribozirnas consisten esencialmente de secuencias definidas en estos cuadros . Por "consiste esencialmente de " se entiende que el ri bozima activo contiene un centro enzimático equivalente al de los ejemplos, y brazos de unión capaces de unirse a ñRNrn de odo que ocurre corte en el sitio blanco. Pueden estar presentes ot ras secuencias que no interfieren con dicho corte. En otro aspecto de la invención, los ribozirnas que cortan rnoléculas blanco e inhiben actividad de a?o(a) son expresados a partir de unidades de transcripción insertadas en fiDN , ñRN , o vectores virales. Preferiblemente, los vectores re com i antes capaces de expresar los ribozimas son liberados localrnente corno se describe antes, y persisten pasajeramente en células bl .anco Una vez expresados, los ribozimas cortan el ñRNrn blanco Los vectores recombinantes son preferiblemente plásrni dos de ñDN o vectores de adenovirus. Sin embargo, pueden usarse para este propósito otros vectores de célula de mamífero que di ri gen 1 expresión de fiRN. Otr s caracterieticae y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las modalidades preferidas de la misma, y de las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUI30S
La figura 1 es una representación diagrarnática del dominio de ribozima de cabeza de martillo conocido en la técnica. El tronco II puede ser > 2 pares de basee de largo o puede ser una región de lazo sin apareamiento de bases, La figura 2a es una representación diagramática del dominio de ribozima de cabeza de martillo conocido en la técnica; la figura 2b es una representación diagramática del ribozima cabpza de martillo dividido por Uhlenbeck (1987, Nature, 327, 596-600) en un substrato y una porción de enzima; la figura 2c es un diagrama similar que muestra la cabeza de martillo dividida por Haseloff y Gerlach (1988, Nature, 334,
585-591) en dos porciones; y la figura 2d es un diagrama similar que muestra la cabeza de martillo dividida por 3effri.es y Syrnons ( 1 389, Nucí. flcids Res. 17, 1371-1371) en dos porciones. La figura 3 es una representación de la estructura general del dominio de ribozima de horquilla conocido en la técnica. H es ñ, U o C. Y es U o C. N es ?, U, G, o C. N' es la secuencia comple entaria de N. La hélice 4 puede ser > 2 pares de base de loigit?d. La figura 4 es una representación de la estructura general del qOminio de ribozima del virus delta de hepatitis conocido en 1 técnica. L figura 5 es una representación de la estructura
Sitios blanco Se pueden determinar blancos útiles para nbozimae, corno lo describen Draper y otros, precitados, Sul1ivan y otros, recitados, jasi como también Draper y otros, "Method and reagent for treatment of arthritic conditions U.S.S.N. 08/152,487, p resentada con fecha 11/12/93, e incorporada en su totalidad comí) referencia en la presente. En lugar de repetir aqui ía guía provista en esos documentos, a continuación se proveen ejernp os específicos de dichos métodos, no limitando a esos en la técnica. Los ribozimas para tales blancos están diseñados como se describe en esas solicitudes y son sintetizados ara ser probados in vitro e in vivo, como también se describe Dichos ribozimas pueden optimizarse también y liberarse como se describe ahí. ñunque se proveen ejemplos específicos lj>ara ñRN de mono y humano , los expertos en la materia reconocerián que los blancos de flRN humano equivalentes descritos pueden usarse co o se describe a continuación. De esta rnenera, puede usarse el mismo blanco, pero los brazos de unión adecúados para hacer blanco con secuencias de flRN humano están prese if?tes en el ribozima . Dichos blancos pueden seleccionarse también como se describe a continuación. Pueqen seleccionarse los sitios accesibles de la secuencia de ñRNm de apo(a) humano y de mono usando un algoritmo de doblarniento de computadora. Pueden identificarse regiones del ñRN que no forman estructuras de pliegue secundarias que contienen sitios potenciales de corte con ribozima de cabeza de martillo o de horquilla. Estos sitios se muestran en os cuadros II, IV, y VI -VII. (Todas las secuencias están 5' a ' en los cuadros) fiunque pueden seleccionarse las secuencias dé mono y humano y después diseñarse los ribozimas, las secuenc as de humano que forman el blanco son de mayor utilidad. Sin embargo, tal como lo exponen Stinchcomb y otros, "Method and Cornpoeition for Treatment of Restenosis and Cáncer Using Ribo ?rnes", U.S.S.N. 08/245,466, presentada con fecha 5/18/94, e ncoprporada en la presente corno referencia, los ribozimas d rígidos son útiles para probar la eficacia de acción del ibozima antes de probarlo en humanos. La posición de bases de nucleótido se observa en los cuadros co o aquel sitio que va a ser cortado por el tipo diseñado de ribozima. Lo sitios blanco de ribozima se eligieron de tal manera que los sitios de corte están presentes en flRNrn de apo(a) pero están completamente ausentes en el fiRNrn de plasrninógeno (Cuadros II, IV, VI y VID. Esto es porque existe extraordi ar a homología entre apota) y plasminógeno (ver antes) . Det|?e ser establecido que los sitios predichos por el algoritmo dé dobla iento de fiRN basado en la computadora corresponde a los sitios de corte potenciales. Se diseñan ribozimas de cabeza de martillo y horquilla que pueden unirse y se analizan individualmente por medio de doblarniento por computadora ( 3aeger y otros, 19B9 Proc. Nati, flcad. Sci. USfi,
86, 7706-7710 ) para determinar si las secuencias de ribozima se doblan en la estructura secundaria apropiada. Aquellos ribozimas con interacciones intramoleculares desfavorables entre los brazos de unión y el núcleo catalítico son eliminados de consideración. Puede elegirse la variación de las longitudes del brazo df unión para optimizar la actividad. Generalmente, por lo menos 5 bases en cada brazo son capaces de unirse al fiRN blanco o intéractuar con el de otra forma. Haciendo referencia a la figura 6, se seleccionan sitios de forte accesibles de ñRNrn con el método que se describe eh forma general en la Solicitud de Patente Norteamericana 07/883,849 de McSwiggen, presentada con fecha 5/1/92, titulada "flssay for ribozyrne target site", incorporada en la presente como referencia. Brevemente, se sintetizan oligonucleótidos de fiDN que representan potenciales sitios de corte para rpibozirna de cabeza de martillo o horquilla. Se usa una reacción en cadena de polimerasa para generar un substrato para transcripción de ñRN polimerasa T7 a partir de clones de fiDNc para apo(a) humano o de mono. Los transcritos de ñRN marcados se sintetizan in vitro a partir de los dos templados,
Los oligonucle?tidos y loe transcritos marcados se templan, se les agrega fiRNasa H y las mezclas se incuban por los tiempos designados á 37°C. Se detienen las reacciones y el ñRN se separa en secuencia en geles de poliacrila ida. Se determina el porcentaje el substrato cortado por medio de cuantificación autoradiográfica usando un sistema de imagen de fósforo, fi partir de estos datos, se eligen los ribozimas de cabeza de martillo o horquilla co o loe más accesibles. Se diseñaron los ribozimas del motivador cabeza de martillo u horquilla para templar a varios sitios en el mensaje de ftRNm. Los brazos de unión son complementarios a las secuencias del sitio blanco descritas con anterioridad. Los ribozimas se sintetizan químicamente. El método de síntesis usado sigue él procedimiento para síntesis normal de ñRN, como lo describen Usman y otros, 1987, 3. flm. Chem. Soc. 109, 7845-7854 y Scarihge y otros, 1990 Nucleic flcids Res., 18, 5433-5441, y hace uso de grupos de protección y copulación de ácido nucleico comunes, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5', y foefora i ita en el extremo 3'. Los rendimientos de copulación e$calonada promedio fueron >98%. Se sintetizan ribozimas inactivos substituyendo un U por Gs y un U por fi?¿ (numeración de Hertel y otros, 1992 Nucleic ñcids Res. , 20,
3252). Los ribozimas de horquilla se sintetizan en dos partes y se templan para reconstruir el ribozima activo (Chowrira y Burke, 1992, Nucleic flcids Res. , 20, 2835-2840). Todos los ribozimas son modificados para aumentar estabilidad por modificación de cinco ribonucleótidos en ambos extremos, 5' y 3' con grupos 2'-0-metilo. Los ribozimas se purifican mediante electroforesis en gel usando métodos generales o son purificados por cromatografía liquida de alta presión (CLflR; cer Us an y otros, Synthesis, deprotection, analysis and puri fication úf RNñ and ribozy es, presentada el 18 de ayo de 1994, U.S.S.N., 08/245,735, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia) y son resuspendidos en agua. Las secuencias de los ribozimas sintetizados químicamente útiles en este estudio se muestran en los cuadros III, V, VI, y VII. Los técnicos reconocerán que estas secuencias son representativas solamente de muchas más de tales secuencias en donde la porción enzimática del ribozima (toda excepto los brazos de unión) está alterada para afectar su actividad. Por ejemplo, la secuencia del tronco del lazo II de los ribozirnae de cabeza de martillo listados en los cuadros III y V (5'-GGCCGAAflGGCC-3' ) puede ser alterado (substitución, supresión y/o inserción) para contener cualquier secuencia para que pueda formarse una estructura mínima de tronco apareada de dos bases. De forma similar, la secuencia de tronco-lazo IV de los ribozimas de horquilla listados en los cuadros VI y VII (5 '-CACGUUGUG-3' ) puede ser alterada (substitución, supresión y/o inserción) para contener cualquier secuencia para que pueda formarse un mínimo de estructura de tronco apareada de dos bases. Las secuencias listadas en los cuadros III, V-VII pueden estar formadas de ribonucleótidos u otros nucleótidos o no-nucleótidos. Tales ribozimas son equivalentes a los ribozirnas descritoe eepecí icamente en loe cuadros.
Optimización de la Actividad del Ribozima La actividad del ribozima puede optimizarse corno lo describen Stinchcomb y otros, precitados. Los detalles no serán repetidos aqui, pero incluyen alterar la longitud de los brazos de unión de ribozimas (troncos I y III, ver figura 2c), o sintetizar químicamente los ribozimas con modificaciones que evitan su degradación por ribonucleasas del suero (ver, por ejemplo, Publicación Internacional No. UO 92/07065; Perrault y otros, 1990, Nature, 344, 565; Pieken y otros, 1991 Science 253, 314; Us an y Cedergren, 1992 Trends in Biochem. Sci. 17, 334; Usrnan y otros, Publicaciñon Internacional No. UO 93/15187; y Rossi y otros, Publicación Internacional No. UO 91/03162, asi. como Usnan, N., y otros, Solicitud de Patente Norteamericana 07/829,729, y Sproat, Solicitud de Patente Europea 92110298.4 y Patente Norteamericana 5,334,711 y 3ennings y otros, UO 94/13688, que describen diferentes modificaciones químicas que pueden hacerse a las porciones de azúcar de moléculas de flRN enzirnáticas. Todas estas publicaciones se incorporan en la presente como referencia.), modificaciones que aumentan su eficacia en células, y eliminación de las bases del tronco II para acortar los tiempos de síntesis de ñRN y reducir-requerimientos químicos. Sullivan y otros, precitados, describen los métodos generales para liberación de moléculas de flRN enzimáticas. Los ribozimas pueden administrarse a las células por medio de una variedad de métodos conocidos para los expertos en la materia, incluyendo, pero no limitándose a, encapsulación en liposomas, por iontoforesis, o por incorporación en otros vehículos, tales corno hidrogeles, ciclodextrinas, cápsulas nanométricas 00
biodegradables y microesferas bioadhesivas. La combinación fiRN/vehiculo se libera localmente por inyección directa o por medio del uso de un catéter, bomba de infusión o fijador. Rutas alternativas incluyen, pero no se limitan a, inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección subcutánea, inhalación de aerosol, liberación oral ttableta o forma de pildora), tópica, general, ocular, intraperitoneal y/o intratecal. Descripciones más detalladas de liberación y administración de ribozimas se proveen en Sullivan y otros, precitados, y Draper y otros, precitados, que han sido incorporadas en la presente como referencia. Otros medios de acumular altas concentraciones de untos) ribozima(s) dentro de las células es incorporar las secuencias que codifican ribozirna en un vector de expresión de ADN. Se maneja la transcripción de las secuencias del ribozirna a partir de un promotor para ñRN-polimerasa I (pol I), ARN--polimerasa II (pol II), o ñRN-polimerasa III (pol III) de eucariote. Los transcritos de los promotores para pol II o pol III se expresarán a altos niveles en todas las células; los niveles de un promotor de pol II dado en un tipo de célula dado depende de la naturaleza de las secuencias reguladoras del gen (aumenta ores, silenciadores, etc.) cercanas presentes. También se usan los promotores de fiRN-polimerasa procarióticos, siempre que se exprese la enzima ñRN-polimerasa procariótica en las células apropiadas (Elroy-Stein y Moss, 1990 Proc. Nati, flcad. Sci. USñ, 87, 6743-7; Gao y Huang 1993 Nucleic flcids Res. , 21, 2867-72; Lieber y otros, 1993, Methods Enzy ol ., 217, 47-66; Zhou y otros, 1990 Mol. Cell Biol., 10, 4529-37). Varios investigadores han demostrado que los ribozinae expresados a partir de tales promotores pueden funcionar en células de mamífero (v.gr., Kashani-Sabet y otros, 1992, flntisense Res. Dev. , 2, 3-15; Ojwang y otros, 1992, Proc. Nati, ñcad. Sci. USO, 89, 10802-6; Chen y otros, 1992 Nucleic flcids Res., 20, 4581-9; Yu y otros, 1993, Proc. Nati, flcad. Sci. USA, 90, 6340-4; L'Huillier y otros, 1992 EMBO 3., 11, 4411-8; Liszieuicz y otros, 1993, Proc. Nati, flcad. Sci. USA, 90, 8000-4). Las unidades de transcripción de ribozima anteriores pueden ser incorporadas en una variedad de vectores para introducción en células de mamífero, incluyendo pero sin restringi se a, vectores de ñDN de plásmido, vectores de ADN viral (tales corno vectores de adenovirus o virus adeno-asociado) , o vectores de ñRN viral (tales como vectores retrovirales, virus de Sindbis, virus de selva Semliki). En una modalidad preferida de la inveción, se inserta una unidad de transcripción que expresa un ribozima que corta ñRN de apo(a) en un vector de ñDN de plásmido, un vector viral de fiDN de retrovirus, y un vector viral de fiDN de adenovirus o un vector de virus adeno -asociado. Estos y otros vectores han sido usados para transferir genes a animales vivos (para una revisión ver Friednan, 1989 Science, 244, 1275-1281; Róemer y Friedman, 1992 Eur. 3. Biochem., 208, 211-225) y conducir a expresión genética pasajera o estable. Loe vectores se liberan corno partículas virales recornbínantes. El ODN puede liberarse solo o formando complejos con vehículos (como se describió antes para RRN). El ñDN, los complejos ADN/vehiculo, o las partículas de virus recombinantes se administran localmente en el sitio de tratamiento, por ejemplo, mediante el uso de un catéter, fijador, o bomba de infusión.
EJEMPLO 1 RIBOZIMAS DE CABEZA DE MARTILLO PARA apota)
Manejando rnotivadoree de ribozima los inventores han diseñado varios ribozimas dirigidos contra secuencias de ARNrn de ap>o(a). Estos han sido sintetizados con modificaciones que mejoran su resistencia a la nucleasa. Estos ribozimas cortan secuencias blanco de apo(a) in vitro. Se probará la función in vivo de loe ribozirnae mediante liberación exógena hacia células que expresan apo(a). Los ribozimas se liberan por incorporación en liposornae, formando complejos con lípidos catiónicos, por microinyección, o por expresión a partir de vectores de flDN. La expresión de apo(a) se sigue por medio de ELISA, por inmunofluorescencia indirecta, y/o por análisis FACS. Los niveles de ARNrn de apo(a) se determinan por medio de análisis Northern, protección de ñRNasa, por análisie de extensión de iniciador o por técnicas RT-PCR cuantitativas. Se identifican ribozimas que impiden la inducción de proteína ap>o(a) y ñRNm en más del 90%.
Usos Diagnósticos Los ribozimas de esta invención pueden usarse como herramientas diagnósticas para examinar tendencias y mutaciones genéticas dentro de células enfermas. La estrecha relación entre la actividad del ribozima y la estructura del ñRN blanco permite la detección de mutaciones en cualquier región de la molécula que altera el apareamiento de bases y la estructura tridimensional del flRN blanco. Usando ribozimas múltiples descritos en esta invención, se pueden trazar cambios de nucleótido que son importantes para la estructura y función de flRN in vitro, así como en células y tejidos. El corte de flRNs blancos con ribozimas puede usarse para inhibir la expresión del gen y definir el papel (esencialmente) de productos genéticos especificados en el progreso de la enfermedad. De esta manera, pueden definirse otros blancos genéticos corno mediadores importantes de la enfermedad. Estos experimentos conducirán a un mejor tratamiento del progreso de la enfermedad facilitando la posibilidad de terapias de combinación (v.gr., ribozimas múltiples dirigidos a diferentes genes, ribozimas copulados con conocidos inhibidores de molécula pequeña, o tratamiento intermitente con combinaciones de ribozimas y/o otras moléculas químicas o biológicas). Otros usos in vitro de los ribozimas de esta invención, son bien conocidos en la técnica, e incluyen detección de la presencia de RRNrn asociado con una condición relacionada con a?o(a). Tal ñRN se detecta determinando la presencia de un producto de corte después de tratamiento con un ribozima usando metodología normal. En un ejemplo específico, se usan para la prueba los ribozimas que pueden cortar solo formas silvestres o mutantes del flRN blanco. El primer ribozirna se usa para identificar el tipo de ñRN silvestre presente en la muestra y el segundo ribozima se usará para identificar ñRN utante en la muestra. Corno controles de reacción, los substratos sintéticos de ambos ñRN, tipo silvestre y mutante, serán cortados por ambos ribozimas para demostrar las eficiencias relativas del ribozirna en las reacciones y la ausencia de corte de las especies de fiRN "no hechas blanco". Los productos del corte de los substratos sintéticos también sirven para generar marcadores de tamaño para el análisis de ñRNs de tipo silvestre y mutante en la población de la muestra, flsí, cada análisis requiere de dos ribozirnas, dos substratos y una muestra desconocida que será combinada en seis reacciones. La presencia de productos de corte será determinada usando una prueba de p>rotección de ftRNasa de modo que puedan analizarse fragmentos de longitud completa y de corte de cada flRN en un carril de un gel de poliacrilarnida. No se requiere absolutamente cuantificar los resultados para poder comprender la expresión de ñRNs mutantes y riesgo putativo de los cambios fenotípicos deseados en las células blanco. La expresión de fiRNm cuyo producto de proteína está implicado en el desarrollo del fenotipo (es decir, apo(a)) es adecuada para establecer el riesgo. Si se usan sondas de actividad específica comparable para ambos transcritos, entonces será adecuada una comparación cualitativa de niveles de flRN y el costo del diagnóstico inicial disminuirá. Relaciones superiores forma mutante/tipo silvestre están correlacionadas con riesgo rnayor tanto si los niveles de ñRN se comparan cualitativa corno cuantitativamente. Otras modalidades se encuentran dentro de las siguientes reivindicaciones.
CUADRO 1 CARACTERÍSTICAS DE LOS RIBOZIMAS
Grupo I In roñes Tamaño: aprox. 200 a > 1000 nucleótidos. Requiere un U inmediatamente a la posición 5' del sitio de corte en la secuencia blanco. Une 4-6 nucleótidos en el lado 5' del sitio de corte. Sobre 75 miembros conocidos de esta clase. Se encuentra en fiRNr de Tetrahyrnena thermophila, mitocondria de hongos, cloroplastos, fago T4, algas verde-azul, y otras.
ARN de flRNasa P (ARN MI) Tamaño: aprox. 290 a 400 nucleótidos. Porción de ñRN de una enzima de ribonucleoproteina. Corta precursores de ARNt para formar flRNt maduro. Aproximadamente 10 miembros conocidos de este grupo son todos de origen bacteriano.
Ribozoma de Cabeza de Martillo Tamaño: aprox. 13 a 40 nucleótidoe. Requiere la secuencia blanco UH inmediatamente en la posición 5' del sitio de corte. Se une a un número variable de n?cleótidos en ambos lados del sitio de corte. Se conocen 14 miembros de esta clase. Encontrado en un número de patógenos vegetales (virusoidee) que usan ñRN corno el agente infeccioso (figuras 1 y 2).
Ribozima de Horquilla Tamaño: aprox. 50 nucleótidos. Requiere la secuencia blanco GUC inmediatamente en la posición
3' del sitio de corte. Se une a 4-6 nucleótidos en el lado 5' del sitio de corte y a un número variable en el lado 3' del sitio de corte. Se conocen sólo 3 miembros de esta clase. Encontrado en tres patógenos vegetales (ñRNs satélite del virus del punto de anillo del tabaco, virus de mosaico arabis y virus de ota amarilla de achicoria) que usan ñRN como el agente infeccioso
( figura 3) .
Ribozima del Virus Delta de Hepatitis (HDV) Tamaño: 50- 60 nucleótidos (hasta ahora). Corte de ñRNs blanco recientemente demostrado. Requerimientos de secuencia no determinados completamente. Sitios de unión y requerimientos estructurales no determinados completamente, aunque no se requieren secuencias en 5' del sitio de corte. Se conoce solo 1 miembro de esta clase. Encontrado en HDV humano (figura 4).
Ribozima de ARN de Neurospora VS Tamaño: aprox. 144 nucleótidos (hasta ahora). Corte de ARNs blanco recientemente demostrado. Requerimientos de secuencia no determinados completamente. Sitios de unión y requerimientos estructurales no determinados completamente. Se conoce solo 1 miembro de esta clase. Encontrado en ñRN de Neurospora VS (figura 5).
CUADRO II SECUENCIA BLANCO HH DE APOtA) HUMANA ÚNICA
Posición Secuencia Posición Secuencié. nt blanco HH nt blanco Hi
127 CCAGGAU U GCUACCA 11186 ACAGAAU A UUAÜCCA
151 ACAGAGU U AUCGAGG 11254 UUGGUGU U AUACCAU
154 GAGUUAU C GAGGCAC 11257 susuuAU A CCAUGGA
199 CCAAGCU U GSUCAUC 11266 CAUGGAU C CCAAUsU
362 CAAUGCU C AGACGCA 11305 ACAAUGU C CAGUGAC
400 GACUGUU A ccccssu 11347 GGCUGUU U CUGAACA
408 CCCCGGU U CCAAGCC 11348 GCUGUUU C UGAACAA
409 CCCGGUU C CAAGCCU 11423 CGAGGCÜ C AUUCsCC
417 CAAGCCU A GAGGCOC 11427 GCUCAUU C UCCACCA
481 CCAUGGU A AOGGACA 11429 UCAUUCU C CACCACU
571 GCAUAGU C GGACCCC 11440 CACUGUU A CAGGAAG
9031 CCACGGü A AUGGACA 11653 C?CAACU c ccAcssu
10207 UCCAGAU C CUGUGGC 11670 UCCCAGU U CCAAGCA
10222 AGCCCCs U AUUGUUA 11779 CACCACU A UCACAGG
10223 GCCCCUU A UUGUUAU 11797 AACAUGU C AGUCUUG
10225 CCCUUAU U GUÜAUAC 11824 ACCACAU U GGCAUCG
10345 GGCUCCU U CUGAACA 11988 GÜGUCCU C ACAACUC
10346 Gc?cc? c UGAACAA 12013 CCCGGUU C CAAGCAC
10532 AAGAACU A CÜGCCGA 12159 CUAUGAU A CCACACU
10543 CCGAAAU C CAGAUCC 12235 UCCAGAU u cussGAA
10564 AGCCCCU V GGUGUUA 12236 CCAGAUU C UGGGAAA
10570 UUGGUGU u AUACAAC 12320 ACAGAAU C AGGUsUC
10622 CGAUGCU C ?GAUGCA 12327 CAGGUGU C CUAGAGA
10677 CAAGCCU A GAGGCOU 12330 susuccu A GAGACUC
10687 GGCUUUU U UUGAACA 12337 AGAGACU C CCACUGU
10736 UGCUACU A CCAUUAU 12374 GCUCAUU C UGAAGCA
10741 OJACCAU U AIGGACA 12453 GCACAUr C UCCACCA
10742 ÜACCAUU A UGGACAG 12481 GACAUGU C AAUCUUG
10792 AAGAACU U GCCAAGC 12592 AGGCccu u Gsusuuu
10828 CCAGCAU A GUCGGAC 12650 CGAUGCU C AGACACA
10899 CUGAGAU ü CGCcspj 12974 GCADCCU C UsCAUUU
10900 UGAGAUU C GCCCUUG 12976 • AÜCCUCU U CAUUÜGA
10906 UCGCCCU U GGUGUUA 13119 GCACCUU ? AUAUCCC
10924 CAUGGAU C CCAGUGU 13226 CUCGAAU C UCAUGUa
10976 ACAGAAU C AAGUGÜC 13228 CGAAUCU C AUGUUCA
10983 a\AGOGU C CUUGCAA 13839 ussuAuu u UUGUGUA
10986 susuccu u GCAACUC 13848 UGUGUAU A AGCUUUU
11011 CCCAGAI7 C CAAGCAC 13930 ACÜUAUU U UGAUÜUG
11098 GAGUUAU C GAGGCUC 13931 CUUAUUU U GAUUÜGA
11170 CUGGCAU C AGAGGAC CUADRO III SECUENCIA DE RIBOZIMA HH DE APQ(A) HUMANA ÚNICA
Posición Secuencia de riboziira ffl de apo(a) humana nt
127 UGGUAGC CUGAUGAGsCCGAAAGGCCGAA AUCCUGG
151 CCUCGAU CUGAUGAjGGCaa?AGGCCGAA ACUCUGU
154 GUGCCUC CsGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AUAACUC
199 GAUGACC CUGAUGAGGCO?AAAGsCCGAA AGCCp8
362 UsCGUCU OIGA8AGGCCGAAAlSGCCG?A AGCAUUs
400 ACCGGGG CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AACAGUC
408 GGCUUGG CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA ACCGGGG
409 AGGCUUG CUGAUGAGG GAAAGGCCGAA AACCGGG 417 GAGCCUC CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AGGCUUG 481 UGUCCAU CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA ACCAUGG 571 GGGGUCC CUGAüGAGsCXXAAAGGCCCAA ACUAUGC
9031 UGUCCAU CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA ACOGUGG
10207 GCCACAG CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AUCUGGA
10222 UAACAAU CUGAUG?lSGCCGAAAGsCCGAA AGGGGCU
10223 AUAACAA CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AAGGGGC 10225 GUAUAAC CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AUAAGGG
10345 UGUUCAG CUGAUGAGsCCGAAAGGCCGAA AGGAGCC
10346 UUGUUCA CUGAUsAGGCCGAAAGGCCGAA AAGGAGC 10532 UCGGCAG CUsAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AGUUCUU 10543 GGAUCUG CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AUUUCGG 10564 UAACACC OK^UGAGGCCGAAAGGCCGAA AGGGGCU 10570 GUUGUAU CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA ACACCAA 10622 UGCAUCU CUGAUCAGGCCGAAAGGCCGAA AGCAUCG 10677 AAGCCUC CUGAUGAGsCCGAAAGGCCGAA AGGCUUG 10687 UsUUCAA CUGAUGAGGCCG?AAGGCCGAA AAAAGCC 10736 AUAAUGG CUsAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AGUAGCA
10741 UGUCCAU OTGAUGAGGCXGAAAGGCCGAA AUGGUAG
10742 CUGUCCA CUGAUGAGG<XGAAAGsCCGAA AAUGGUA 10792 GCUUGGC CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AGUUCUU 10828 GUCCGAC apSAUsAGGCtt?AAAGGCCGAA AUGCUGG
10899 AAGGGCG CUCAUsAsGCCGAAAGGCCGAA AUCUCAG
10900 CAAGGGC CUGAUGAGsCCsAAAGGCCGAA AUCUCA 10906 UAACACC CUGAUGAGsCCG?AAGGCCGAA AGGGCGA 10924 ACACUGG CUGAUGAGGCrGAAAGGCCGAA AUCC?UG 10976 GACACUU CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AUUCUGU 10983 UUGCAAG CUGAUGAGsCCGAAAGGCCGAA ACACUUG 10986 GAGUUGC CUGAUGAGGCCGAAAsGCCGAA AGGACAC non suscuus cuGAUGAGsccG?AAssccsAA AUCUGGG
11098 GAGCCUC CUGAUGAGXCGAAAGsCCsAA AUAACUC
11170 sUCCUCU CUGAUGAGGCCt-ft?AGGCCCAA AUGCCAG
11186 UGGAUAA sX-AUGAGGCCCAAAGGCCGAA AUUCUGU
11254 AUGGUAU CUsAUGAGGCCG?AAGsCCsAA ACACCAA
11257 UCCAUGG CUGAUGAGsCCGAAAGGCCGAA AUAACAC
11266 ACAUUss CUGAUGAGsCCGAAAGGCCGAA AUCCAUG 11305 sUCACUG CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA ÁCAUUGU
11347 UGUUCAG CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AACAGCC
11348 UUGUUCA CUG?UGAGGCCGAAAGGCCGA? AAACAGC 11423 GGAGAAU CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AGCCUCG 11427 UssUGGA CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA A?UGAGC 11429 AGUGGUG CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AGAAUGA 11440 CUUCCUG CUGAUGAGGCCGAAAGGCCG?? A?CAGUG 11653 ACCGUGG CUGAUGAGGCCGAAAGsCCGAA AGUUGUG 11670 UGCUUGG aJGAUGAGGCO-AAAGGCCGAA ACUGGGA 11779 CCUGUGA CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGA? AGUGGUG 11797 CAAGACU CUGAUGAGsCCGAAAGGCCGAA ACAUGUU 11824 CGAUGCC CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AUGUGGU 11988 GAGUUGU CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AGGACAC 12013 GUGCUÜG CUG?UG?GGCCGAAAGGCCGAA AACCGGG 12159 AGUuss CUGAUGAGGCXX_AAAr3GCCCAA AUCAUAG
12235 UUCCCAG CÜGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AUCUGGA
12236 UUUCCCA CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AAUCUGG 12320 GACACCU CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AUUCUGU 12327 UCUCUAG C_UGAUGAGGCCCAAAGGCCGAA AC?CCUG 12330 GAGUCUC CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AGGACAC 12337 ACAGUGG X?UsAGGCCGAAAGsCCGAA AGUCUCU 12374 UGCUUCA CÜGAUGAGGCCsAAAGsCCGAA AAUGAGC 12453 UGGUGGA CUsAUGAGsCCGAAAGsCCGAA AAUGUGC 12481 CAAGAUU CUGAUGAGGCCGAAAGsCCGAA ACAUGUC 12592 AAACACC CUGAUGAGsCCGAAAsGCCGAA AGGGCCU 12650 UGUGUCU CUGAUGAGsCCGAAAGGCCGAA AGCAUCG 12974 AAAUGAA CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AGGAUGC 12976 UCAAAUG sX?UCAGGCCGAAAGGCCGAA AGAGGAU 13119 GGGAUAU OX?UGAGGCCGAAAGGCCGAA AAGGUGC 13226 AACAUGA CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGA? AUUCGAG 13228 UGAACAU CUGAUGAGGCCG?AAGGCCGAA AGAUUCG 13839 UACACAA CUGAUGAGsCCGAAAGGCCGAA AAUACCA 13848 AAAAGCU CUGAUGAGsCCGAAAGGCCGAA AACACA
13930 CAAAUCA CUGAUGAGGC?aAAG£CCGA? AAUAAGU
13 31 UCAAAUC CUGAUGAGCiCO-AAArSGCCsAA AAAUAAG i
CUADRO IV SECUENCIA BLANCO HH DE APO tA) DE MONO ÚNICA
Posición Secuencia Fbsición Secuencia nt blanco HH nt . blanco rH
127 CUscCGU C "GCaCCUC 11170 ACAaUgU C UGGugAC
151 CUGCCGU C GCaCCUC 11186 ACAGAAU C AAGUGUC
154 CUGCCgU C GcaCCUC 11254 gCUUcUU c UgaAGAA
199 CCCCGGU U CCAAGCC 11257 GACUGCU A CC?UGGU
362 AGAGGCU C COUCCGA 11266 GAGUUAU C GAGGCUC
400 GGCUCCU U CCGAACA 11305 CGAGGCU C AUUCUCC
408 sacuccu u CCGAACA 11347 UCAUUCU C CACCACU
409 GGCUCCU U CCGAACA 11348 GACAUGU C AGUCUUG
417 GGCUCCU U CCGAACA 11423 UCUUGGU C CUCUAUG
481 GCUCCUU C CGAACAA 11427 UGGUCCU C UAUGACA
571 ACAGAGU U AUCGAGG 11429 ussuccu c UAUGACA
9031 GAGUUAU C CAGGCAc 11440 GUCCUCU A UGACACC
10207 CCACACU C UCAUAGU 11653 auAGAAU A CUACCCA
10222 CCACACU C UCAUAGU 11670 auAGAAU A CUACCCA
10223 AGAGGCU C CUUCUGA 11779 aUGgAaU c AaGUGUC
10225 AGAGGCU C CUUCUGA 11797 CAAGUGU C CUUGCaA
10345 GUGUUAU A CAACgGA 11824 UCCCAGU U CCAAGCA
10346 AACgGAU C CCAGUGU 11988 UcGGCAU C GGAGGAU
10532 AGaGGcU u UUCUuga 12013 UCCCAUU A cgCUAUC
10543 AGAGGCU U UUcUUGA 12159 GCUCCUU C UGAACAA
10564 GAGGCuU u UCuUgaA 12235 CCAGGAU U GCUACCA
10570 AGGCUUU U cUUGAAC 12236 CCAGGAU U GCUACCA
10622 UgCUACU a CcaUUAU 12320 gaACUGU c nGUcUuG
10677 GGCACAU A CUCCACC 12327 UCUUGGU C AUCUAUG
10687 CCACUGU u ACAGGAA 12330 UGGUCAU C UAUGAUA
10736 ecACUGU u ACAGGAA 12337 sUCAUCU A UGAUACC
10741 CCACUGU u ACAGGAA 12374 UssUGUU A CACgACu
10742 CCACUtTU u ACAGGA? 12453 AgagaCU c CCACUGU
10792 CACUGUU A CaGGaAg 12481 CUGUUGU U CCgGUÜC
10828 GCAUAGU C GGACCCC 12592 GCUCAUU C UGAAGCA
10899 GCAUAGU C GGACCCC 12650 ucAAucu u ssucAuc
10900 GCAUAGU C GGACCCC 12974 CCACAUU C CUGGCCC
10906 AaA&ACU a UCcaaAu 12976 CGCAAGU C AGUCUuA
10924 CAGGAAU C CAGAUGC 13119 AgGccuU e CUUCJAC
10976 CAGGAAU C CAGAUGC 13226 AGUGUCU ? GGUUGUU
10983 CAGGAAU C CAGAUGC 13228 aGuGUCU a GGuUGUu
10986 CAGGAAU C CAGAUGC 13839 ussuAUu a UUGUGUA
11011 CAGGAAU C CAGAUGC 13848 UAAGCUU U UcccGUC
11098 UcGcCCU U GGUGUUA CUADRO V SECUENCIA DE RIBOZIMA HH DE APOtA) DE MONO ÚNICA
Posición Secuencia de ribczíra HH de mero nt
127 GAGGUGC .CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA ACGGCAG
151 GAGGUGC CUGAUGAGGCCGA??GGCCGAA ACGGCAG
154 GAGGUGC CUGAUGAGGCCG??AGGCCGAA ACGGCAG
199 GGCUUGG CÜGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA ACCGGGG
362 UCGGAAG CUG?UGAGGCCG?A?GGCCGAA AGCCUCU
400 UsUUCGG CUGAUGAssCCGAAAssCCGAA ?GGAGCC
408 UsUUCGG CUGAUGAGGCCGAAAGsCCGAA AGGAGCC
409 UGUUCGG CUGAUGAssCCGAAAGGCCGAA AGGAGCC 417 UGUUCGG CUsAUGAGsCCGAAAGGCCGAA AGGAGCC 481 UUGUUCG CUG?UGAGGCCG??AGGCCGAA AACCAGC 571 CCUCGAU sxaUGAGsCCGAAAGGCCGAA ACUCUGU 9031 GUGCCUC CUGAÜGAGGCCGAAAGsCCGAA AUAACUC 10207 ACUAUGA CUGAUGAGGCCG?AAGGCCGA? AGUGUGG 10222 ACUAUGA CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AGUGUGG 10223 UCAGAAG CUGAUGAGsCCGAAAGGCCGAA AGCCUCU 10225 UC?GAAG CUGAUsAGGCCGAAAGGCCGAA AGCCUCU 10345 UCCGUUG CUG?UGAGGCCGAAAGGCCG?? AUAACAC 10346 AC?CUGG CUGAUGAGsCCGAAAGGCCGAA AUCCGUU 10532 UCAAGAA CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGA? AGCCUCU 10543 UCAAGAA CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AGCCUCU 10564 UUCAAGA CUGAUGAGGCCGAAAGsCCGAA AAGCCUC 10570 GUCAAG CUG?UG?Gs8G???GGCCG?? AAAGCCU 10622 AUAAUGG CUGAUGAGGCCCAAAGGCCGAA AGUAGCA 10677 GGUGGAG CUGAUGAGsCCGAAAGGCCGAA AUCUGCC 10687 UUeCUGU CUr^UGAGGCCG???GGCCGA? ACAGUGG 10736 UUCCUsU CUsAUGAssCCGAAAGGCCGAA ?CAGUGG 10741 UUCCUGU CUGAUsAGGCCGAAAGGCCGAA AC?GUGG 10742 UUCCUGU CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AC?GUGG 10792 CUUCCUG CUGAUGAGGCCGAAAGsCCGAA AACAGUG 10828 GGGGUCC CUGAUGAGsCCGAAAGGCCGAA ACUAUGC 10899 GGGGUCC CUGAUsAGGCCGAAAGGCCsAA ACUAUGC 10900 GGGGUCC CGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA ACUAUGC 10906 AUUUGGA sXSAUGAGsCCGAAAGGCCGAA AGUUUUU 10924 GC?UCUG CUsAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AUUCCUG 10976 ' GC?UCUG CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AUUC UÜ 10983 GC?UCUG CUs?UC?GsCCGAA?GGCCGAA AUUCCUG 10986 GC?UCUG CUGAUGAGsCCGAAAGGCCGAA AUUCCUG 11011 GC?UCUG CUG?UG?GGCCG???GGCCG?? AUUCCUG 11098 U??CACC CUGAUCAOXOSAAAssCCGAA AGOGCGA 11170 GUCACC? CUGAUGAGGCCGAAAC-3CCGAA ACAUÜGU 11186 O^C?CUU CUG?UGAGGCCGA??CGCCG?? AUUCUGU 11254 UUCUÜC? CUGAUGAGGCCGA??GGCCG?? A?GA?GC 11257 ?CCAUGG CUGAUGAssCCGAAAGsCCGAA AGCAGUC 11266 G?GCCUC COGAUG?GGCCG???GGCCG?? ?UA?CUC 11305 GGAGAAU CUGAUGAGGCCG?AAGGCCGAA AGCCUCG
11347 AGUGGUG CUGAUGAGGCCGAAAGsCCGA? AGAAUGA
11348 CAAG?CU CUGAUGAGGCCG?AAGGCCGAA ACAUGUC 11423 CAUAGAG CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA ACCAAG? 11427 UGUC?UA CI AUGAGGCCGAAAGGCCGAA AGGACCA 11429 UGUCAUA CUGAUGArSGCCGAA?GGCCGAA AGGACCA 11440 GGUGUCA CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AGAGGAC 11653 UGGGUAG CUGAUGAGGCCG?AAGGCCGAA AUUCUAU 11670 USGGUAG CUG?UGAGGCCGAAAGGCCGAA AUUCUAU 11779 GACACUU CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AUUCCAU 11797 UUGCAAG CUGAUGAGGCaUJ GGCCG?? AC?CUUG 11824 UGCUUss OTGAUG?GsCCCAAAGsCCGAA ACUGGGA 11988 AUCCUCC CUGAUG?GGCCGAA?GGCCGAA AUGCCGA 12013 G?UAGCG CUGAUGACXX:3??AGsCCGAA ??UGGG? 12159 UUGUUC? CÜGAUGAGGCCGAAAGsCCGAA AAGGAGC
12235 UGsUAGC CUG?UG?GGCCGAA?GGCCGAA AUCCUGG
12236 UGGUAGC CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AUCCUGG 12320 CAAGACU CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA ACAGUUC 12327 CAUAGAU CUG?UGAGGCCGAAAGGCCGAA ACCAAGA 12330 UAUC?U? CUG?UGAGGCTGAAAGGCCGAA AUGACC? 12337 GGU?UC? CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AGAUGAC 12374 AGUCGUG CUGAI^AGGCCGAAAGGCCGAA AACACCA 12453 ?CAGUGG CUG?UGAGGCCG???GGCCGAA AGUCUCU 12481 G??CCGG CUCAUGAGGCCGAAAGGCCaAA ACAACAG 12592 UGCUUCA CUGAUGAGGCCG?AAGGCCG?? AAUGAGC 12650 GAUGACC CUG?TX?AGGCCG?AAGGCCG?? AGAUUGA 12974 GGGCCAG CUGAUGAGGCCG???GGCCG?? A?UGUGG 12976 UAAGACU CUGADGAGGCCGA??GGCCCAA ACUUGCC 13119 GUAGAAG CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA AAGGCCU 13226 ??CAACC a^Ua?GGCCG?A?GGCCG?? AGACACU 13228 AACAACC CUG?UGAGGCaaUUUSGCCGA? AGACACU 13839 UACACAA CUGAUGAGsCCGAAAGsCCGAA AAUACCA 13848 GACGGGA CUGAUG?GCTCGAAAGGCCGAA AAGCUUA
CUADRO VI SECUENCIA DE RIBOZIMA DE HORQUILLA DE APOtA) DE HUMANO ÚNICA
Ftosición S Seeccuueenncia de ribozima de hora-illa Secuencia < nt de substrato
378 GGCGCGAC AGAA GUCC ACC-AGAGAAACACAaapX3UGGUA(»uUACCUGGUA GGACU GCC GUCGCGCC
381 GGAGGCGC AGAA GC?G ACCAGAGAAACACACGU?GUGGUACAüOACCUGsUA CUGCC GUC GCGCCUCC
440 UUUGCUCA AGAA GUGC ACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUÜ CCTJGGUA GCACC GAC UGAGCAA?
7964 UCUGCUCA AG?A GUGC ACC^GAGAAACACACGUUG?GGU?CAUU?CCUGGUA GCACC GAC UGAGCAGA
10215 CAAUAAGG AGAA GCCA ACCAGACíAAAC?CACGUUs?aWACAUUACCUssUA UGGCA GCC CCUUAUUG
10534 UGGAUUUC AGAA GUAG ACCAG?GAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA CUACU GCC GAAAUCCA
10557 CACCAAGG AGAA GCCA ACX-AGAGAAACAC?CGUUGUGGUAC?UUACCUGGU? UGGCA GCC CCUUGGUG
10638 GGGACGA? AGAA GUCC ACCAGACíAAACAC?C UWpx?p?CAUUACCUsGUA GGACU GCC UUCGUCCC
10700 UUUCCUCA GAA GUGC ACCAGAGAAAC?CACGU»?JGGUAaUUACCUGGU? GCACU GAC UGAGGAAA
11343 UGUUCAGA AGAA GCCG ACCAGAGAA?CACACGU?G?X3GUAC?U(mCCUGGUA CGGCU CUU UCOGAACA
11379 CAGUCCUG AGAA GUGG AC ?GAGAAACACACGUlXpXXWACAUl?CCUGGUA CCAC? GUC CAGGACUG
12342 - ACUGGAAC AGAA GUGG ACCAGAGAAACACACGUUGÜX3GUACAUUACCUGGUA CCACU GUU GUUCCAGU
12804 GGCUCCUG AGAA GCCC ACCAGAGAAACAC?CsUuGUGGuACA?U?CCUGGUA GGGCU GCC CAGG?GCC
12877 AGOGUUAC AGAA GUAA ACCAGAC?AACACACCUUsusCWACA?UACCUGGUA UUACU GCC GUAACCCU
13139 GAGCAGCA AGAA GCAC ACCAGAGAAAC?CACGUUGUGGUAaUU?CCUGGUA GUGCU GAC UGCUGCUC
13256 GCUCCAAG AGAA GCCU ACC?GACíAAACACACsUUCTX?pJACAUUACCllGsUA AGGCU GUU CUUGGAGC
13522 ACCCUGGC AGAA GUCA Acc?GAG ?A ^auxpp r^ xpi?CAUíi? p rjGU? UGACA GUU GCCAGGGU
13794 UAGCUGGG AGAA GUGU ACCAGAsAAACACACGU?sussUACAUUACCUGGUA ACACU GUU CCCAGCUA
CUADRO VII «ymF CTfl DE RIBOZIMA E HORQUILLA DE APO (A ) DE MONO ÚNICA
Posición S Seeccuueennccia de ribozi?B de horquilla Secuencia nt de substrato
57 GGUGGGAC AGAA GUCC ACCAGAGAAAC?CACGUUGUCGUACAUUACCUGGUA GGACU GCC GUCGCACC
60 GGAGGUGC AGAA GCAG ACCAGAGAAACACACX3UUGW?WACAUUACXpJGGUA CUGCC GUC GCACCUCC
119 UUUGCUCA AGAA GUGC ACCAGAGAAAC?CACCUUGU8UACAUUACCUGsUA GCACC GAC UGAGCAAA
318 CAAUAAGG AGAA GCCA ?CCAGAGA?ACACAs^JUGUGGUACAUUACC?GGUA TJGGCA GCC ccuuAu?s
660 CAAUAAGG AGAA GCCA ACCAGAGA?ACACACGUrx?GGUACAuUACCUGGUA UGGCA GCC CCUUAUUG
744 GGAGGUGC AGAA GCAG ACCAGAGAAACAC^CGUUGUGGUACAU??CCUGGUA CUGCA GUC GCACCUCC
803 UUUGCUCA AGAA GUGC ACCAGAGAAACACACX?UGUGGUACAUUACCUGGU? GCACC GAC UGAGCAAA
1002 CAAUAAGG AGAA GCCA ACC?GAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA UGGCA GCC CCUUAUUG
1083 GGUGCGAC AGAA GUCC ACCAGAGAAACACACGIUUGUGGUACAU?ACCUGGUA GGACU GCC GUCGCACC
1086 GGAGGUCC AGAA GCAG ACCAGAGAAACACACGUUGUGGU?CAUUACCUGGUA CUGCC GUC GCACCUCC
1321 UGOAUUUC AGAA GUAG ACX^G?GAAACACACGX?XJUSSU?CAUU?CCUGGUA CU?CU GCC GAAAUCCA
1344 CACCAAGG AGAA GCCA A -AGAGA?ACAC VCX?i?GUGGUACAUUACCUGGUA UGGCA scc ccuuGGus
2130 UGUUCAGA AGAA GCCA ACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA UGGCU GUU UCUG??C?
2500 GACCCCAG AGAA GUUU ACC-AGAG?MCACACCUUGÜXX?UACAUUACCUGGUA ??AC? GCC CUGGGGUC
3129 ACCGGAAC AGAA GUGG ACCAGAGAAAC^CACGu?GUGGUACAUUACCUGGUA CC?CU GUU GUUCCGGU
3683 AAGCAGCA AGAA GCAC ACCAGAGAAACACACGUUG?8UACAUUACCUGGUA GUGCU G?C UGCUGCUU
3890 AAUUUGGA AG?? GCAG ACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA CUGCC GUC UCCAA?UU
3912 UCAGUCCA AGAA GUGA ACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA UCACC GCC UGGACUGA
4365 UAGCUGGG AGAA GUGU ?CCAG?G??ACACACsu?GUGGUACAUUACCUGGUA ?CACU GUC CCCAGCUA
NOVEDAD DE LA INVENCIÓN
REIVINDICACIONES
1.- Una molécula enzimática de ARN que corta ARNrn de apot ) . 2.- Una molécula enzimática de ñRN, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque los brazos de unión de la misma contienen secuencias complementarias a cualquiera de las secuencias definidas en el cuadro II. 3.- La molécula enzimática de flRN, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque los brazos de unión de la misma contiene secuencias complementarias a las secuencias definidas en cualquiera de los cuadros IV, VI y VII. 4.- La molécula enzimática de flRN, de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, o 3, caracterizada además porque dicha molécula de flRN está en un motivador de cabeza de martillo. 5.- La molécula enzimática de ñRN, de conformidad con la reivindicación 1, 2, o 3, caracterizada además porque dicha molécula de ñRN está en un motivador de horquilla, virus delta de hepatitis, intron grupo 1, ñRN de Ne rospora VS o ñRN de ARNasa P. 6.- La molécula enzimática de flRN, de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicho ribozima comprende entre 12 y 100 bases complementarias a dicho ARNm.
Claims (1)
- 7.- La molécula enzimática de ñRN, de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicho ribozima comprende entre 14 y 24 bases complementarias a dicho flRNrn. 8.- Molécula enzimática de ñRN que consiste esencialmente de cualquier secuencia seleccionada del grupo de las que se mueetran en loe cuadros III, V, VI, y VII. 9.- Una célula de mamífero que incluye una molécula enzimática de ñRN de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, o 3. 10,.- La célula de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dicha célula es una célula de humano. 11.- Un vector de expresión que incluye ácido nucleico que codifica una molécula enzimática de ñRN o moléculas enzimáticas múltiples de conformidad con las reivindicaciones 1, 2 o 3, en una forma que permite la expresión de esa rnolécula(s) enzirnáticat s) de fiRN dentro de una célula de mamífero. 12.- Una célula de mamífero que incluye un vector de expresión, de conformidad con la reivindicación 11. 13»- La célula de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dicha célula es de humano. 14.- El uso de una molécula enzirnática de ácido nucleico de conformidad con la reivindicaciones 1, 2, o 3, en la preparación de un medicamento para tratamiento de una condición relacionada con niveles elevados de Lpta) en plasma en un paciente. 15.- El uso de un vector de expresión de conformidad con la reivindicacione 11, en la preparación de un medicamento para tratamiento de una condición relacionada con niveles elevados de Lpta) en plasma en ?n paciente. 16.- El uso de una molécula o vector de conformidad con las reivindicaciones 14 o 15, caracterizado además porque dicho paciente es un humano. 17.- El uso de un vector de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicha condición se selecciona del grupo que consiste de aterosclerosis, infarto al miocardio, ataque, restenosis y enfermedades cardiacas. 18.- El uso de un vector de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicha condición es restenosis.
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