MXPA06015211A

MXPA06015211A - Preparacion prebiotica.

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Publication number: MXPA06015211A
Application number: MXPA06015211A
Authority: MX
Inventors: Jan Delcour; Christophe Courtin; Willem Broekaert; Katrien Swennen; Kristin Verbeke; Paul Rutgeers
Original assignee: Leuven K U Res & Dev
Priority date: 2004-06-30
Filing date: 2005-06-30
Publication date: 2007-03-26
Also published as: AU2005259856A1; ATE402617T1; JP2008504038A; PL1758470T3; AU2005259856B2; US20080102162A1; BRPI0511391A; CA2569856A1; EP1758470B1; WO2006002495A1; RU2376889C2; ES2314676T3; DE602005008595D1; CN1980579B; GB0414655D0; RU2007103355A; CA2569856C; CN1980579A; EP1758470A1

Abstract

La presente invencion se refiere a un aditivo nutricional que comprende arabinoxilanos, que modula de manera benefica la flora intestinal humana. Ademas, se proporcionan varios productos de alimento y bebida que comprenden el aditivo, asi como metodos para preparar el aditivo.

Description

PREPARACIÓN PREBIOTICA Campo de la invención . La presente invención se refiere a preparaciones de arabinoxilano para uso como aditivos prebióticos nutricionales y a métodos para mejorar la salud gastrointestinal de seres humanos a través de la suplementación de sus dietas con esos aditivos. En una representación preferible, las preparaciones de arabinoxilano se derivan de fuentes naturales, tales como material de planta y más preferiblemente de cereales.

Entono de la invención . La invención se refiere al efecto positivo en la salud gastrointestinal, y más particularmente en la microbiota intestinal, de alimentos con polisacáridos no féculas (NSP) dados. LOs NSP incluyen una gama de compuestos que poseen ' diferentes propiedades fisicoquímicas. Los arabinoxilanos, también llamados pentosanos, son un grupo importante de NSP de cereal y consisten de una cadena principal de unidades de D-xilopiranosilo ß-1, - enlazado, a los cuales están enlazadas unidades de a-L-arabino-furanosilo de 0-2 y/u O- 3. En un arabinoxilano tipico, ocurren residuos no sustituidos, monosustituidos y disustituidos de xilosa (ver Figura 1) . Los arabinoxilanos son o bien extractables en agua o no extractables en agua. Estos últimos pueden ser parcialmente solubilizados bajo condiciones alcalinas o usando enzimas y aglutinando con grandes cantidades de agua. Los arabinoxilanos extractables en agua tienen un extraordinario potencial de formación de viscosidad. En general, sus masas moleculares son muy altas (de hasta 800,000 Dalton) dependiendo de la fuente y del método de extracción. A pesar del hecho de que son sólo constituyentes menores, son importantes para la funcionalidad de los cereales en procedimientos biotecnológicos tales como la producción de fécula de trigo, pasta y cerveza, panadería y otras aplicaciones en alimentos .

Se ha demostrado que algunos tipos de oligosacáridos derivados del arabinoxilano o del xilano (un polímero no sustituido de unidades de D-xilopiranosilo ß-1,4- enlazado) ejercen propiedades prebióticas. Los prebióticos son compuestos, usualmente oligosacáridos no glucosidicos, que no pueden ser digeridos por las enzimas del tracto gastrointestinal superior, pero que son fermentados selectivamente por algunos tipos de bacterias intestinales en el intestino grueso (Gibson y Roberfroid, 1995; Roberfroid, 1998; Van Loo, 2004). La presencia de prebióticos en la dieta causa un cambio en la composición de la población de bacterias intestinales, tipicamente caracterizado por un aumento relativo de las especies La ctobacill us y Bifidobacteri um . Este cambio en la microbiota del intestino se asocia con la mejora de la salud general, con las infecciones reducidas del intestino, con niveles aumentados de ácidos grasos de cadena corta intestinales, con mejor absorción de los minerales, y con supresión del inicio del cáncer de colon (Van Loo, 2004).

Se ha demostrado que las preparaciones de xilo-oligosacáridos (XOS, oligosacáridos que consisten de unidades de D-xilopiranosilo ß-1, - enlazado) con predominancia de oligosacáridos con un grado de polimerización (DP) de 2-3 (xilobiosa y xilotriosa), causan un aumento significativo en el nivel de Bifidobacterias en las heces y en el intestino ciego de las ratas (Patente EP 0265970B1; Campbell et al., 1997; Hsu et al., 2004), y en el colon de los humanos (Okazaki et al., 1990). Esas preparaciones de XOS ricas en xilobiosa también suprimen los síntomas tempranos de la carcinogénesis de colon químicamente inducida en ratas (Hsu et al., 2004) y mejoran la absorción del calcio (Toyoda et al., 1993). También se ha demostrado que una preparación que consiste predominantemente de oligosacáridos de arabinoxilo (AXOS) con un DP de 3-5 (arabinosilxilobiosa, arabinosilxilotriosa, arabinosilxilotetraosa, y diarabinosilxilotetraosa) , aumenta los niveles de Bifidobacterias en el intestino de ratas y ratones (Yamada et al. , 1993) .

Un inconveniente principal de las preparaciones de XOS actualmente en el mercado, que limita severamente su potencial comercial, es su nivel de precio muy alto comparado con el de otros oligosacáridos, lo que indica que los actuales procedimientos de fabricación no son efectivos en costos. Se ha descrito un método para la fabricación de preparaciones prebióticas con predominancia de XOS con DP de 2-3, que involucra la extracción química del xilano a partir de productos con base de plantas (madera dura, mazorcas de maiz, cascaras de semilla de algodón, salvado de trigo o grano de desperdicio de cervecería) usando soluciones de NaClO y soluciones altamente concentradas de KOH, seguido de hidrólisis enzimática del xilano extraído a través de enzimas de endoxilanasa (Patente EP 0265970B1). Se ha usado un método similar para hacer una preparación AXOS prebiótica (preparación de AXOS con DP de 3-5) que involucra la extracción química del arabinoxilano usando una solución alcalina concentrada seguida de la remoción de las sales, hidrólisis enzimática con endoxilanasa, y cromatografia en una columna de carbono (Yamada et al., 1993) . El principal inconveniente de estos métodos es que la extracción química del xilano o del arabinoxilano no es amigable con el ambiente, y requiere una costosa remoción de los químicos a través de diálisis o ultrafiltración antes de que pueda realizarse la hidrólisis enzimática. Otro método para producir XOS o AXOS involucra autohidrólisis hidrotérmica de la madera dura o del grano sobrante de cervecería. En este método se calienta una suspensión de material de planta en un reactor especial a 150-190°C durante 20-60 min (Patente EP 0265970B1); Kabel et al., 2002; Carvalheiro et al., 2004). El inconveniente de este método es que, debido a la alta temperatura de la reacción, los subproductos que se producen son indeseables para propósitos de alimento, tales como furfuralo, hidroximetilfurfuralo y ácido levulinico (Carvalheiro et al. , 2004) .

Las preparaciones prebióticas de XOS y AXOS actualmente descritas tienen un grado promedio de polimerización que es o bien de 2 (Patente EP 0265970B1) o bien de 4 (Yamada et al., 1993). Para las aplicaciones particulares en el sector de alimentos, estas preparaciones tienen algunos inconvenientes. Primero, las preparaciones son ricas en xilosa, que tiene un sabor dulce y que es cerca de 60% tan dulce como la sacarosa (Suntory, ' xylo-oligosaccharide' , folleto y hoja de producto, 2001). El dulzor puede ser deseable para algunas aplicaciones, pero para otras aplicaciones es más deseable un sabor neutral. Los xilo-oligosacáridos con un grado bajo de promedio de polimerización también tienen un sabor dulce que es cerca del 40% del de la sacarosa (Suntory, 'xylo-oligosaccharide1 , folleto y hoja de producto, 2001). En segundo lugar, las preparaciones con un grado bajo de promedio de polimerización tienen un nivel de energía que no es deseable en los ingredientes para alimentos bajos en calorías. Para el cálculo del valor de energía de los xilo-oligosacáridos, el valor de la energía metabolizable de la xilosa se considera de 4 calorías por' g, 2 calorías por g para la xilobiosa y la xilotriosa, y 0 calorías por gramo para los xilo-arabino-oligosacáridos con un DP > 4 (Suntory, ' xyls-oligosaccharide ' , folleto y hoja de producto, 2001) .

Descripción de la invención . La presente invención se refiere a aditivos nutricionales que comprenden arabinoxilanos, que modulan de manera benéfica la flora intestinal humana. Además, se proporcionan varios productos de alimento y de bebida que contienen los aditivos, asi como métodos para preparar los aditivos .

Descripción detallada. Lista de Figuras Figuras 1A-1D. Elementos estructurales de los arabinoxilanos. Fig.lA: residuo [beta] -D-xilopiranosilo no sustituido. Fig. IB: residuo [beta] -D-xilopiranosilo sustituido en 0-2 con una porción a-L-arabinofuranosilo. Fig.lC: residuo ß-D-xilopiranosilo sustituido en 0-3 con una porción a-L-arabinofuranosilo. Fig. ID: residuo ß-D-xilopiranosa sustituido en 0-2 y 0-3 con porciones a-L-arabinofuranosilo. La estructura C muestra el enlace de ácido ferúlico en 0-5 de un residuo a-L-arabinofuranosilo.

Figura 2: Perfiles HPSEC de masa molecular de diferentes preparaciones de AXOS. La columna fue una Shodex SB-806 HQ (300 x 8 mm, Showa, Denko K.K., Tokio, Japón). Los volúmenes de elusión de estándares de pululación con masa molecular de 78.8 x 104, 40.4 x l?\ 21.2 x l?\ 11.2 x 0.59 x 104 Da y de glucosa (180 Da) se indican con un símbolo "x" de izquierda a derecha.

Figuras 3A-3C: Porcentaje de degradación de los monosacáridos constituyentes de AXOS-15-0.27 (Fig.3A), Xylooligo-95P (Fig.3B), y fructo-oligosacáridos (Fig.3C) para diferentes tiempos de incubación a 100°C, a pH de 2, 3, 7 y 11.

Figuras 4A-4C. Porcentaje de hidrólisis de AXOS- 15-0.27 (Fig.4A), Xylooligo-95P (Fig.4B) y fructo-oligosacáridos (Fig.4C) para diferentes tiempos de incubación a 100°C, a pH de 2, 3 y 7. Figuras 5A y 5B. Porcentaje de hidrólisis de enlaces de xilosa (Fig.5A) y de enlaces de arabinosa (Fig.5B) en AXOS-15-0.27 para diferentes tiempos de incubación a 100°C, a pH de 2 , 3 y 7.

Figura 6. Dulzores de AXOS-15-0.27, xilooligo 95P y sacarosa. Las curvas muestran el porcentaje acumulativo de los sujetos (n = 20) que reconocieron el sabor dulce, graficado contra la concentración del compuesto en g/1.

Figuras 7A-7C. Perfiles de masa molecular de fracciones de oligosacárido obtenidas después de la ultrafiltración de AXOS producida por tratamiento con endoxilanasa del enjugado U-AX. Las membranas usadas tenían un MMCO de 5 kDa (panel A) , 10 kDa (panel B) y 30 kDa (panel C) . La columna era una Shodex SB-802.5 HQ (300 x 8 mm, Showa, Denjo K.K., Tokio, Japón). Los marcadores de masa molecular eran pululantes Shodex P-82 estándar con una masa molecular de 11.2 x 104, 4.73 x 104, 2.28 x 104, 1.18 x 104, y 0.59 x 104 Da, estándares de oligosacárido con una masa molecular de 810 (DP6), 678 (DP5), 546 (DP4), 414 (DP3) y 282 Da (DP2) y glucosa con una masa molecular de 180 Da, y su correspondiente volumen de elusión se indica con un símbolo "x" de izquierda a derecha.

Figura 8. Perfiles HPSEC de masa molecular de fracciones de oligosacárido obtenidos después de la ultrafiltración por pasado consecutivo a través de membranas con MMCO de 10 kDa y 30 kDa de AXOS producidos por tratamiento por endoxilanasa del enjugado U-AX. Las fracciones analizadas son o bien el retenido después de pasar a través de un MMCO de 30 kDa del retenido de una membrana de 10 kDa (RET?0kDa+3oDa) , o el permeado después de pasar a través de un MMCO de 30 kDa del retenido de una membrana de 10 kDa (PER?0kDa+3oDa) , o el permeado después de pasar a través de una membrana de 10 kDa (PERiokDa) • La columna era una Shodex SB-802.5 HQ (300 x 8 mm, Showa, Denko K.K., Tokio, Japón). Los marcadores de masa molecular eran pululantes Shodex P-82 estándar con una masa molecular de 11.2 x y 0.59 x 104 Da, estándares de oligosacárido con una masa molecular de 810 (DP6), 678 (DP5), 546 (DP4), 414 (DP3) y 282 Da (DP2) y glucosa con una masa molecular de 180 Da, y su correspondiente volumen de elusión se indica con un símbolo "x" de izquierda a derecha.

Figura 9. Efectos de la adición al alimento para pollos de AXOS-7-0.34, AXOS-122-0.66 o xilooligo 95P, en la microbiota y en el intestino ciego de los pollos. La composición de la microbiota del ciego se determinó a 1 y 2 semanas, respectivamente, después del inicio del experimento por conteo de placa para las enterobacteriáceas y las bifidobacteriáceas . Las barras representan los promedios de las mediciones y las barras de error indican la desviación estándar. Para un punto dado en el tiempo los valores marcados con una letra diferente son significativamente diferentes unos de otros de acuerdo con la prueba de Turkey a p < 0.05.

Figura 10. Efectos de la adición al alimento para pollos de AXOS-15-0.27 al 0.1% o al 0.25%, fructo-oligosacáridos (FOS) al 0.25% o al 1%, o endoxilanasa, en el número de bifidobacterias en el ciego de los pollos después de 14 dias. Las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium fueron medidas por PCR cuantitativo. Los valores marcados con una letra diferente son significativamente distintos uno del otro de acuerdo con la prueba de diferencia de la menor significancia (p < 0.05; n 3) . Las barras representan los promedios de las mediciones y las barras de error indican la desviación estándar.

Figura 11. Efectos de la adición a la dieta de ratas de AXOS-8-0.27, AXOS-15-0.27, AXOS-16-0.78 ó AXOS-122-0.66 en el nivel del acetato (panel superior), del propionato (panel intermedio) y del butirato (panel inferior) en las heces de las ratas después de 13 dias de alimentación. Los valores marcados con una letra diferente son significativamente distintos uno del otro de acuerdo con la prueba de diferencia de la menor significancia (p < 0.05; n = 4). Las barras representan los promedios de las mediciones y las barras de error indican la desviación estándar.

Figuras 12A-12D. Efectos de la adición a las dietas de ratas de 4% de AXOS-15-0.27 o de Xylooligo-95P en el nivel del acetato en el colon proximal (Fig.l2A), del acetato en el colon distal (Fig.l2B), del propionato en el colon distal (Fig.l2C) y del butirato en el colon distal (Fig.l2D) de las ratas, después de 14 dias de alimentación. Las barras representan los promedios de las mediciones y las barras de error indican la desviación estándar.

Figura 13. Efectos de la adición a las dietas de ratas de 4% de AXOS-15-0.27 o de Xylooligo-95P en el nivel de bifidobacterias en el ciego después de 14 dias de alimentación. Las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium fueron medidas por PCR cuantitativo. Los valores indicados con una letra diferente son significativamente distintos uno del otro de acuerdo con la prueba de diferencia de la menor significancia (p < 0.05; n = 4). Las barras representan los promedios de las mediciones y las barras de error indican la desviación estándar.

Figura 14. Efecto de la ingestión de 4.88 g/dia de AXOS-15-0.27 ó de 4.81 g/dia de WPC durante 14 dias, en el número de bifidobacterias en las heces de voluntarios humanos sanos. Las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium fueron medidas por PCR cuantitativo. Las barras representan los promedios de las mediciones y las barras de error indican la desviación estándar. Las barras con una estrella muestran una diferencia significativa del nivel basal de acuerdo con la prueba de los signos de Wilcoxon (p < 0.05; n = 5). Figuras 15A-15C. Efecto de la ingestión de dosis única de AXOS-15-0.27 (0.24, 0.73, 2.21 ó 4.88 g) en la excreción urinaria (Fig.l5A) y fecal (Fig.l5B) de nitrógeno, y en el tiempo de tránsito oro-cecal (Fig.l5C). La excreción de nitrógeno se expresa como el porcentaje del nitrógeno etiquetado como 15N administrado, recuperado en las muestras de orina o de heces colectadas durante 0-48h y 0-72 h después de la ingestión del alimento de prueba, respectivamente. El tiempo de tránsito oro-cecal se expresa como el porcentaje de PEG etiquetado con 3H en las muestras fecales colectadas durante 0-72h. Las barras representan los promedios de las mediciones y las barras de error indican la desviación estándar. Las barras con una estrella o con dos estrellas muestran una diferencia significativa del tratamiento de control de acuerdo con la prueba de los signos de Wilcoxon, a p< 0.05; (n = 9) y a p<0.01 (n = 9), respectivamente. Figuras 16A y 16B. Efecto de la ingestión de dosis única de AXOS-15-0.27 (0.24, 0.73, 2.21 ó 4.88 g) en la excreción urinaria de p-cresol (Fig.l6A) y de fenol (Fig.l6B). La excreción de p-cresol y de fenol se expresan como el contenido total de p-cresol y de fenol (mg) recuperado en las muestras de orina colectadas a lo largo de 0-24h después de la ingestión del alimento de prueba. Las barras representan los promedios de las mediciones y las barras de error indican la desviación estándar. Las barras con una estrella o con dos estrellas muestran una diferencia significativa del tratamiento de control de acuerdo con la prueba de los Signos de Wilcoxon, a p< 0.05; (n = 9) y a p<0.01 (n = 9) , respectivamente.

DESCRIPCIÓN. El efecto prebiótico de la alimentación suplementada o de productos de alimento con preparaciones particulares de arabinoxilano, ha sido descrito anteriormente. Más particularmente, la técnica anterior proporciona ejemplos de los efectos bifidogénicos de, por una parte, los xilo-arabino-oligosacáridos que tienen un grado promedio de polimerización (DP) menor a 4 y, por otra parte, de las preparaciones de arabinoxilano que comprenden arabinoxilanos de cadena larga naturalmente ocurrentes.

Las preparaciones de xilo-arabino-oligosacárido disponibles se producen bajo condiciones drásticas e incontroladas de despolimerización, dando como resultado la presencia de niveles relativamente altos de xilosa y de xilo-oligosacáridos cortos, que tienen un sabor dulce. El dulzor de estas preparaciones limita su uso a productos de alimento específicos. Además, las moléculas de xilo-arabino-oligosacáridos con un DP inferior a 4 tienen un contenido de energía metabólica, que es indeseable en los alimentos bajos en calorías.

Las características fisicoquímicas de los arabinoxilanos naturalmente ocurrentes, tales como alta viscosidad y alta retención de agua, los hacen inadecuados para usarse en una amplia gama de productos de alimento. La despolimerización parcial de los arabinoxilanos naturales mejora sus características fisicoquímicas y se han descrito preparaciones que contienen moléculas de arabinoxilano con un DP promedio de cerca de 58. Sin embargo, la acción prebiótica en los humanos de estos arabinoxílanos parcialmente despolimerizados sólo se ha demostrado a dosis relativamente altas (> 6 g por dia; Grasten et al., 2003).

La presente invención se basa en el descubrimiento de que las preparaciones de arabinoxilano que comprenden arabinoxilanos con un DP promedio de entre 5 y 50 son agentes prebióticos potentes cuando se administran a los seres humanos y en animales de prueba que sirven como modelos para los humanos. Además, esas preparaciones no tienen ninguno de los inconvenientes fisicoquimicos u organolépticos de las preparaciones que contienen ya sea arabinoxilanos naturales o xilo-arabino-oligosacáridos de cadena corta. También se encontró que tanto en humanos como en ratas y pollos, las preparaciones de arabinoxilano de la presente invención tenían un efecto bifidogénico más fuerte que las preparaciones que comprendían arabinoxilanos parcialmente despolimerizados con un DP promedio de 58 ó más. Además, se observó que las preparaciones de arabinoxilano de la presente invención ejercen su acción prebiótica principalmente en la parte distal del colon, mientras que los xilo-oligosacáridos de cadena corta eran más activos en la parte proximal del colon. Este descubrimiento es particularmente importante, porque parece haber una relación entre la composición de la flora en el colon distal y el desarrollo de la enfermedad del colon y más particularmente el cáncer del colon. Junto con el efecto prebiótico per se también se observaron otros efectos benéficos del uso de las preparaciones de arabinoxilano de la presente invención, tales como una reducción de la excreción de nitrógeno urinario y el aumento concomitante de excreción de N fecal, asi como una reducción de la excreción urinaria de cresol y fenol.

Por lo tanto, en un primer objetivo la presente invención proporciona preparaciones de arabinoxilano para ser usadas como un aditivo de alimento o como una base para un producto de suplemento nutricional. Las preparaciones de arabinoxilano se caracterizan en que las moléculas de arabinoxilano comprendidas en estas preparaciones tienen un DP promedio que varia entre 5 y 50. En una representación preferible, la preparación de arabinoxilano comprende al menos 15% de moléculas de arabinoxilano. En una representación más preferible, las preparaciones comprenden más del 30% de arabinoxilanos, por ejemplo más del 60%. En una representación aún más preferible, los arabinoxilanos comprendidos en las preparaciones de acuerdo con la presente invención tienen un DP promedio de entre 7 y 40 DP, aún más preferiblemente de entre 7 y 20 DP. Preferiblemente, el 90% de los arabinoxilanos comprendidos en las preparaciones de la presente invención tienen un DP de entre 2 y 650, determinado usando Cromatografía de Exclusión de Tamaño de Alto Rendimiento (HPSEC, siglas en inglés), más preferiblemente de entre 2 y 130.

En una representación preferible, las preparaciones de arabinoxilano de la presente invención se obtienen a partir de fuentes naturales, tales como material de planta y más preferiblemente de cereales. Pueden ser fracciones seleccionadas de los arabinoxilanos naturales o pueden obtenerse por despolimerización o fragmentación de los arabinoxilanos naturales o pueden ser análogos estructurales producidos por procedimientos químicos, enzimáticos y/o físicos. En una representación preferible las preparaciones de arabinoxilanos se derivan de una corriente lateral del procedimiento de separación gluten-fécula, tal como el WPC (Pfeifer & Langen) . En otra representación preferible, las preparaciones de arabinoxilano se derivan de salvado de cereal.

Los efectos prebióticos de las preparaciones de arabinoxilano de la presente invención, cuando se administran via el alimento, se observaron a una dosis de 0.25 g por ración. Asi, en un segundo objetivo, la presente invención proporciona un producto de alimento o bebida que comprende una preparación de arabinoxilano de acuerdo con la presente invención. En una representación preferible, el producto de alimento o de bebida comprende entre 0.1 y 5 g de una preparación de arabinoxilano de acuerdo con la presente invención, por ración. En una representación más preferible, el producto de alimento o bebida comprende entre 0.25 y 5 g de una preparación de arabinoxilano de acuerdo con la presente invención, por ración. En una representación aún más preferible, el producto de alimento o bebida comprende entre 1 y 3 g de una preparación de arabinoxilano de acuerdo con la presente invención, por ración. En otra representación preferible, el producto de alimento o bebida comprende entre 0.1 y 5 g de arabinoxilanos con un DP promedio de entre 5 y 50, por ración. En una representación más preferible, el producto de alimento o bebida comprende entre 0.25 y 5 g de arabinoxilanos con un DP promedio de entre 5 y 50, por ración. En una representación aún más preferible, el producto de alimento o bebida comprende entre 1 y 3 g de arabinoxilanos con un DP promedio de entre 5 y 50, por ración. Como se indicó arriba, las preparaciones de arabinoxilano de acuerdo con la presente invención son particularmente adecuadas como un aditivo benéfico para alimentos bajos en calorías.

En una representación particular, el producto de alimento es un producto lácteo tal como yogurt o queso fresco. Preferiblemente este producto lácteo comprende entre 0.25 y 5 g, más preferiblemente entre 1 y 3 g, de arabinoxilanos con un DP promedio de entre 5 y 50 por 100 g por ración de 125g. Opcionalmente el producto lácteo comprende bacterias vivas del género Bifidobacterium o Lactobacillus, que son capaces de fermentar los arabinoxilanos. En otra representación particular, las bebidas de la presente invención son bebidas de las llamadas funcionales suaves no alcohólicas. Preferiblemente estas bebidas funcionales suaves comprenden entre 0.25 y 5 g, más preferiblemente entre 1 y 3 g, de arabinoxilanos con un DP promedio de entre 5 y 50 por 100 ml . Alternativamente, la bebida funcional suave comprende la cantidad deseada de arabinoxilanos en 250 ml . En una representación particular, las bebidas suaves funcionales comprenden bacterias vivas del género Bifidobacterium o Lactobacillus, que son capaces de fermentar los arabinoxilanos .

En general, los productos de alimento que tienen cereales o material derivado de cereales como un ingrediente, contienen arabinoxilanos. Sin embargo, los arabinoxilanos comprendidos en estos productos de alimento son, o bien arabinoxilanos naturales de cadena larga con un DP de arriba de 6000, o bien son arabinoxilanos despolimerizados con un DP de al menos 200 a 300. Por lo tanto, el enriquecimiento de los productos de alimento con los arabinoxilanos de acuerdo con la presente invención también mejoran su valor nutricional. Preferiblemente, ese enriquecimiento se obtiene añadiendo una cantidad dada de una preparación de arabinoxilano de la presente invención como un ingrediente durante la preparación de los productos de alimento que contienen cereal. Es claro que ese enriquecimiento da como resultado un producto de alimento que contiene cereal que comprende arabinoxilanos con un DP de 200 y mayor junto con una población de arabinoxilanos con un DP por debajo de 200, caracterizándose esta población por un DP promedio de entre 5 y 50. La persona experimentada en la técnica comprenderá que el enriquecimiento de los productos de alimento que contienen cereal con la población de arabinoxilanos con un DP por debajo de 200, puede obtenerse al menos en parte usando enzimas xilanoliticas bajo las condiciones apropiadas durante la preparación de estos productos de alimento. En una representación particular, el producto de alimento es un producto de panadería tal como pan. Preferiblemente, este pan está enriquecido con entre 0.25 y 5 g, más preferiblemente entre 1 y 3 g, de arabinoxilanos con un DP promedio de entre 5 y 100 por 100 g. En otra representación, el producto de alimento es un producto de pastelería, tal como un pastel. Preferiblemente, este producto de pastelería está enriquecido con entre 0.25 y 5 g, más preferiblemente entre 1 y 3 g de arabinoxilanos con un DP promedio de entre 5 y 50 por 100 g. En otra representación más, el producto de alimento es un producto de pasta. Preferiblemente, este producto de pasta está enriquecido con entre 0.25 y 5 g, más preferiblemente entre 1 y 3 g, de arabinoxilanos con un DP promedio de entre 5 y 100 por 80 g. En otra representación más, el producto de alimento es un cereal para el desayuno. Preferiblemente, este cereal para el desayuno está enriquecido con entre 0.25 y 5 g, más preferiblemente entre 1 y 3 g de arabinoxilanos con un DP promedio de entre 5 y 50 por 30 g. En otra representación más, el producto de alimento es un bizcocho. Preferiblemente, este bizcocho está enriquecido con entre 0.25 y 5 g, más preferiblemente entre 1 y3 g de arabinoxilanos con un DP promedio de entre 5 y 50 por 125 g- Otros productos de alimento que pueden ser benéficamente suplementados con las preparaciones de arabinoxilano de la presente invención son, por ejemplo pero sin limitación, productos de carne molida, galletas, barras, y postres tales como postres de pudín.

En un tercer objetivo, la presente invención proporciona un producto de suplemento para el alimento que comprende una preparación de arabinoxilano de acuerdo con la presente invención. En una representación preferible, el producto de suplemento de alimento es una cápsula, una tableta, un polvo o similar. En una representación más preferible, el producto de suplemento de alimento está formulado de modo que permite una administración diaria de 0.1 y 5 g de arabinoxilanos con un DP promedio de entre 5 y 50, más preferiblemente de entre 0.25 y 5 g, por ejemplo de entre 1 y 3 g.

En un quinto objetivo, la presente invención proporciona un método para preparar una preparación de arabinoxilano de acuerdo con la presente invención. En una primera representación, el método comprende los pasos de: i. aislar la fracción de arabinoxilano no extractable en agua a partir de un material rico en arabinoxilano, tal como salvado, harina de trigo o enjugado de trigo por desfeculación y desproteinización del material rico en arabinoxilano, preferiblemente usando ácido amilolitico y enzimas proteoliticas, respectivamente. ii. despolimerizar la fracción de arabinoxilano no extractable en agua usando una o más enzimas xilanoliticas En una segunda representación, el método comprende los pasos de: i. obtener una preparación que contenga arabinoxilano extractable en agua parcialmente despolimerizado, tal como una preparación obtenida de una corriente lateral del procedimiento de separación fécula-gluten ii. Si es necesario, eliminar la fécula y las proteinas de la preparación que contiene arabinoxilano, preferiblemente usando enzimas amiloliticas y proteoliticas, respectivamente. iii. Despolimerizar los arabinoxilanos contenidos en la preparación, usando una o más enzimas xilanoliticas.

En una representación particular, la preparación se somete a ultrafiltración después del tratamiento con las enzimas xilanoliticas para reducir en la preparación la cantidad de monosacáridos y de oligosacáridos que tengan un DP de 4 o menor.

En un objetivo final, la presente invención proporciona un método para el análisis de la concentración y el DP promedio de una población de arabinoxilanos con un DP más pequeño que 200 en un producto de alimento que contiene cereal. Este método comprende los pasos de: i. moler una muestra del producto de alimento que contiene cereal, preferiblemente después de haber secado o secado por congelación la muestra; ii. Extractar la muestra molida en agua destilada; iii. tratar el extracto con enzimas amiloliticas en condiciones apropiadas para transformar toda la fécula en glucosa, por ejemplo, usando un tratamiento de amilasa seguido por un tratamiento de amiloglucosidasa; iv. eliminar la glucosa de la muestra obtenida en (iii) , por ejemplo a través de metabolizar la glucosa usando levadura; v. determinar el perfil de masa molecular de los arabinoxilanos comprendidos en la muestra obtenida en (iv) , preferiblemente usando Cromatografía Liquida de Alto Rendimiento (HPLC) ; vi. calcular la cantidad relativa y el DP promedio de la fracción de arabinoxilano menor a DP 200, por ejemplo a través del análisis de la superficie bajo la curva de HPLC.

La invención se ilustra mejor por medio de las representaciones ilustrativas que se describen abajo.

Representación Ilustrativa EJEMPLOS EJEMPLO 1. Preparación de XOS/AXOS con DP promedio >4 Materiales y métodos Xylooligo-95P. La preparación comercial Xylooligo-95P de xilo-oligosacárido, consistente predominantemente de xilobiosa, xilotriosa y xilotetraosa, se obtuvo en Suntory Ltd. (Tokio, Japón) .

Prepara ción de arabinoxilano no extra ctable en agua , a partir de salvado de trigo . Para la preparación del arabinoxilano no extractable en agua (WU-AX) , se usó como material de inicio salvado de trigo comercial (Meneba Meel BV, Rotterdam, Países Bajos) . El material distinto de arabinoxilano fue removido parcialmente del salvado por tratamiento enzimático de acuerdo con el método descrito en Maes et al. (2004). Una suspensión de salvado de trigo en agua (1:7 peso/vol) se trató primero con una a-amilasa termoestable (Termamyl 120LS, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 1 µl/g de salvado de trigo) durante 90 min a 90°C para hidrolizar la fécula. Después de enfriarlo a 50°C, se ajustó el pH de la suspensión hasta 6.0 usando HCl concentrado, y la suspensión fue incubada con una proteasa (Neutrase 0.8L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 150 µl/g de salvado de trigo) durante 24 h a 50°C para hidrolizar las proteinas residuales. Después de ello, la suspensión fue hervida y filtrada, y el filtrado se descartó. El residuo, llamado "salvado WU-AX", fue lavado con agua y secado al aire.

Preparación de arabinoxilano no extractable en agua a partir de harina de trigo o de fécula de trigo enj ugada . La harina de trigo puede ser fraccionada en 4 fracciones diferentes usando métodos estándar (McRitchie, 1985): fécula A (fécula primaria), fécula B (fécula enjugada o granzones) , gluten y una fracción soluble en agua. La WU-AX es concentrada en la fracción de fécula enjugada. El material distinto de arabinoxilano fue parcialmente removido de la fracción enjugada por tratamiento enzimático. Una suspensión de fécula enjugada en agua (1:6 p/v) fue tratada primero con una a-amilasa termoestable (Termamyl 120LS, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 30 µl/g de fécula enjugada) durante 60 min a 90°C y con amiloglucosidasa (Megazyme, Bray, Irlanda, 20 µl/g de fécula enjugada) durante 16 h a 60°C para hidrolizar la fécula. Después de hervir durante 30 minutos y de la centrifugación, el residuo fue incubado con una proteasa (Neutrase 0.8L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca, 20 µl/g de fécula enjugada) durante 20 h a 50°C para hidrolizar las proteinas residuales. Después de ello, la suspensión fue nuevamente hervida (30 min) , filtrada, y el filtrado fue desechado. El residuo, llamado "harina WU-AX", fue lavado con agua, etanol (95% v/v) y secado al aire. En vez de extractar el WU-AX de la fécula de trigo, el WU-AX también puede aislarse directamente de la fécula enjugada de trigo. En este caso, se usó como material de inicio Meritena 233 (Tate & Lyle, Aalst, Bélgica) , una corriente lateral comercialmente disponible del procedimiento industrial de separación fécula-gluten. Una suspensión de Meritena 233 en agua (1.5 p/v) fue tratada subsecuentemente con una a-amilasa termoestable (Termamyl 120LS, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 30 µl/g de Meritena 233) durante 60 min a 90°C y con amiloglucosidasa (Megazyme, Bray, Irlanda, 20 µl/g de Meritena 233) durante 16 h a 60°C para hidrolizar la fécula. Después de hervir durante 30 minutos y de la centrifugación, el residuo fue incubado con una proteasa (Neutrase 0.8L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca, 20 µl/g de Meritena 233) durante 20 h a 50°C para hidrolizar las proteinas residuales. Después de ello, la suspensión fue nuevamente hervida (30 min), filtrada, y el filtrado fue desechado. El residuo, llamado "enjugado WU-AX", fue lavado con agua, etanol (95% v/v) y secado al aire .

Concen trado de pentosano de trigo (WPC) . El Wheat Pentosan Concéntrate (Concentrado de Pentosano de Trigo) (WPC, Pfeifer & Langen, Dormagen, Alemania) se deriva de la harina de trigo y su composición química ha sido descrita al detalle por Courtin y Delcour (1998). El WPC es rico en arabinoxilano extractable en agua (ca. 43%) y material de proteina (ca. 30%). La parte restante consiste principalmente de péptido de arabinogalactano (ca. 14%) y hasta un menor grado, de glucosa polimérica (6%).

Preparación de AXOS con avDP de 122 y rela ción A/X de 0. 66 (AXOS-122-0. 66) . El material de inicio para la preparación de AXOS-122-0.66 fue el producto comercial Wheat Pentosan Concéntrate (WPC, Pfeifer & Langen, Dormagen, Alemania) . El WPC fue solubilizado en agua desionizada (1:10 p/v) y se añadió silice como una suspensión acuosa (20% p/v) hasta una proporción silice/proteina de 7:1. El pH de la mezcla se ajustó hasta 4.8 usando HCl 0.1 M para obtener una adsorción máxima de las proteinas al silice. Después de 30 min de agitación, la suspensión fue filtrada por filtrado de Büchner. Se desechó el residuo que comprendía al silice/proteina, mientras que el filtrado fue sometido a una precipitación de etanol. Se añadió etanol (95% v/v) bajo agitación continua hasta una concentración final de 65% (v/v) y después de la agitación durante 30 min adicionales, la decantación (24 h, 4°C) y la filtración, el residuo obtenido fue secado en solvente (etanol, acetona y éter dietilo) y secado al aire. El material obtenido fue homogeneizado y filtrado a través de un tamiz de 250 µm.

Preparación de AXOS con avDP de 1 6 y rela ción A/X de 0. 78 (AXOS-16-0. 78) . El AXOS-16-0.78 se preparó iniciando a partir del producto comercial Wheat Pentosan Concéntrate (WPC, Pfeifer & Langen, Dormagen, Alemania) . El WPC fue tratado con silice para remover las proteinas como se describió para el AXOS-122-0.66. El filtrado recuperado fue luego incubado a 30°C durante 24 h con una XAA, una endoxilanasa de Aspegillus aculea tus (Shearzyme 500L, Novozymes, Bagsvaerd, Alemania) a 29 unidades por gramo de Wheat Pentosan Concéntrate. Después de la inactivación de la enzima por ebullición (30 min), la solución obtenida fue enfriada y sometida a precipitación de etanol. El Etanol (95% v/v) se añadió bajo agitación continua hasta una concentración final de 80% (v/v) , y después de la agitación adicional (30 min), la decantación (24 h, 4°C) y la filtración, el residuo obtenido fue disuelto en agua desionizada y sometido de nuevo a precipitación de etanol. El etanol (95% v/v) se añadió bajo agitación continua hasta una concentración final de 65% (v/v) y después de la agitación adicional (30 min), la decantación (24 h, 4°C) y la filtración, se removió el material precipitado. El flotante remanente fue sometido a evaporación rotatoria para remover el etanol, disuelto en agua desionizada y liofilizado. El material obtenido se homogeneizó y e filtró a través de un tamiz de 250 µm.

Preparación de AXOS con avDP de 7 y una rela ción A/X de 0. 34 (AXOS- 7-0. 34) . El material de inicio para la preparación del AXOS-7-0.34 fue el salvado WU-AX que se aisló como se describió arriba. El salvado WU-AX fue subsecuentemente incubado a 30°C durante 24 h con una endoxilanasa XBS (Grindamyl H640, Daniso, Dinamarca) a 80 unidades por g del salvado WU-AX aislado seco. Después de la filtración y la inactivación de la enzima por ebullición (30 min), el filtrado fue liofilizado y el material obtenido se homogeneizó y se filtró a través de un tamiz de 250 µm .

Preparación de AXOS con avDP de 15 y una rela ción A/X de 0. 27 (AXOS-15-0. 27) . Se usó salvado de trigo comercial (Dossche Mills & Bakery, Deinza, Bélgica) como material de inicio para la preparación del AXOS-15-0.27. Una suspensión de salvado de trigo en agua (1.7 p/v) se trató primero con una a-amilasa termoestable (Termamyl 120LS, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 1 µl/g de salvado de trigo) durante 90 min a 90°C para hidrolizar la fécula. Después de enfriar a 50°C, el pH de la suspensión se ajustó a 6.0 usando HCl concentrado, y la suspensión se incubó con una proteasa (Neutrase 0.8L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca, 40 µl/g de salvado de trigo) durante 4 h a 50°C para hidrolizar las proteinas residuales. Después de ello, la suspensión fue hervida durante 20 min, filtrada, y el filtrado fue desechado. El residuo fue lavado con agua, y resuspendido en agua desionizada (1:14 p/v). La suspensión fue incubada bajo agitación continua durante 10 h a 50°C con endoxilanasa XBS (Grindamyl H640, Danisco, Dinamarca) a 1.4 unidades por g de salvado de trigo desfeculado y desproteinado, y durante otras 10 h a 50°C después de la adición de una segunda dosis de endoxilanasa a 1.1 unidades por g de salvado de trigo desfeculado y desproteinado. Después de la inactivación de la enzima por ebullición (30 min) , la solución se concentró hasta un 20% de materia seca en un evaporador de caida de película, y finalmente se secó en un secador por aspersión.

Preparación de AXOS con avDP de 8 y una relación A/X de 0. 27 (AXOS-8-0. 27) . El AXOS-8-0.27 se preparó incubando una solución (1:10 p/v) de AXOS-15-0.27 a 30°C durante 1 h con XAA, una endoxilasa de Aspergill us aculea tus (Shearzyme 500L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca) a 125 unidades por g de AXOS-15-0.27. Después de la inactivación de la enzima por ebullición (30 min) , la solución fue liofilizada y el material obtenido se homogeneizó y se filtró a través de un tamiz de 250 µm.

Preparación de AXOS con avDP de 39 y una relación A/X de 0. 22 (AXOS-39-0. 22) . El AXOS-39-0.22 se preparó a partir del WU-AX enjugado de trigo que fue aislado a partir de la fécula Meritena 233 B como se describió arriba. El WU-AX enjugado, que tenia una relación promedio de A/X de 0.63, fue suspendido a 3 g/1 en regulador de acetato de sodio 25 mM (pH 4.7) e incubado bajo agitación continua durante 2 h a 30°C con endoxilanasa XBS (Grindamyl H640, Danisco, Dinamarca) a 3.3 unidades por g de WU-AX enjugado. Después de la centrifugación (10,000 g, 15 min, 18°C) el flotante fue hervido durante 30 min para inactivar la enzima, mientras el residuo fue lavado con el regulador de acetato de sodio mencionado arriba (1/4 del volumen inicial). El agua del lavado fue inactivada (30 min, 100°C) y combinada con el flotante. Después de la filtración, la solución obtenida fue liofilizada para producir AXOS con avDPGC de 262 y una relación A/X de 0.50. El material solubilizado por enzima fue luego disuelto en agua desionizada (1:20 p/v) y el pH de la solución se llevó hasta 2.8 con la adición de HCl (1M). La solución fue incubada durante 24 h a 90°C para remover una fracción larga de los sustituyentes de arabinosa a-1,2- y a-1,3-enlazados, que parecen ser más proclives a la hidrólisis acida que las subunidades de xilosa ß-1, 4- enlazadas de AXOS. Después de enfriar a temperatura ambiente, la solución fue neutralizada con la adición de NaOH 1 M y centrifugada (10,000 g, 20 min, 18°C). Se añadió etanol (95% v/v) al flotante obtenido bajo agitación continua, hasta una concentración final de etanol de 80% (v/v) . La mezcla fue agitada por 30 min adicionales y se mantuvo a 4°C durante la noche. Los compuestos de AXOS precipitados fueron recuperados por centrifugación (10,000 g, 20 min, 4°C), disueltos en agua desionizada, liofilizados, y el material obtenido se homogeneizó y se filtró a través de un tamiz de 250 µm.

Preparación de AXOS con avDP de 13 y una relación A/X de 0. 21 (AXOS-13-0. 21 ) . El AXOS-13-0.21 se preparó incubando una solución de AXOS-39-0.22 (3 g/1) a 30°C durante 2 h con XAA, una endoxilanasa de Aspergill us a culea tus (Shearzyme 500L; Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca) a 27.7 unidades por g de AXOS-39-0.22. Después de la inactivación de la enzima por ebullición (30 min), la solución fue liofilizada y el material obtenido fue homogeneizado y filtrado a través de un tamiz de 250 µm.

Caracterización de las preparaciones aisladas . Se usaron diferentes técnicas para caracterizar las preparaciones de oligosacárido. El contenido total y de terminal reductora de azúcar se determinó por análisis cromatográfico como lo describió (Courtin et al. (2000) . El contenido de arabinoxilano (AX) de las muestras se expresó como 0.88 x (% de arabinosa + % de xilosa) . El grado promedio de polimerización del AXOS como se determinó por cromatografía liquida de gas (avDPGc) fue calculado como la suma del contenido total de xilosa y arabinosa dividido por el contenido de la terminal reductora de xilosa. El contenido de proteina (N x 5.7) de las muestras se determinó por el método de combustión de Dumas, una adaptación del Método Oficial AOAC (1995) .

El perfilado de los oligosacáridos constituyentes en las preparaciones se realizó por Cromatografía de Intercambio Aniónico de alto Rendimiento con Detección Amperométrica Pulsada (HPAEC-PAD) , usando un sistema cromatográfico Dionex DX-500 (Sunnyvale, CA, US) equipado con un detector electroquímico ED-40, una bomba GP-50 de gradiente y un automuestreador AS-3500. Las muestras (10 mg) fueron solubilizadas en agua desionizada purificada (2 ml, resistencia especifica de 18 mO-cm) , filtradas e inyectadas (25 µl) en una columna de guardia Carbopac PA-100 (4 x 25 mm) unida a una columna de intercambio aniónico Carbopac PA-100 (4 x 250 mm) . El lixiviado (1.0 ml/min) fue con un gradiente lineal de acetato de sodio de 0 a 250 mM en 100 mM de NaOH durante 30 minutos, seguido por un gradiente lineal de acetato de sodio de 250 a 400 mM en 100 mM de NaOH durante 15 minutos. Después del gradiente, la columna fue lixiviada durante 5 minutos con NaOH 100 mM. El lixiviado fue monitoreado usando el detector ED-40 en el modo de detección amperométrica pulsada con los siguientes ajustes para los potenciales y los periodos de tiempo: Ei, + 0.05 V (ti = 400 ms); E2, + 0.75 V (t2 = 200 ms); E3, -0.15 V (t3 = 400 ms) . Arabinosa (A), xilosa (Xi), xilobiosa (X2) y XOS con DP de 3 a 6 (X3 a X6) , se usaron como referencias .

La cromatografía de exclusión de tamaño de alto rendimiento (HPSEC) se realizó en un sistema HPLC (Kontron instruments, sistemas de bomba 325, Kontron, Milán, Italia) , equipado con autoinyección. Todas las preparaciones fueron disueltas en cloruro de sodio al 0.3% (1.5 ml), filtradas e inyectadas (20 µl) en una columna de guardia Shodex SB-800P (Showa, Denko K.K. Tokio, Japón, 50 x 6 mm) unida a una columna HPSEC Shodex SB-806 HQ (300 x 8 mm, escala de separación: 1 x 102 - 20 x 106 Da) . El lixiviado fue con cloruro de sodio al 0.3% (0.5 ml/min; 30°C) y monitoreado con un detector de Índice de refracción (VDS Optilab, Berlin, Alemania) . La masa molecular de los marcadores fueron pululantes Shodex estándar P-82 (2.0 mg/ml) con una masa molecular de 78.8 x 104, 40.4 x 104, 21.2 x 104, 11.2 x 104, 4.73 x l?\ 2.28 x 104, 1.18 x l?\ y 0.59 x 104 Da, y la glucosa con una masa molecular de 180 Da. El grado promedio de polimerización (avDP) de los oligosacáridos, como se determinó por cromatografía de exclusión de tamaño de alto rendimiento (avDPHPSEc) se calculó como MMhpsec/132.

Determinación de la actividad de las enzimas xilanoli ticas . La actividad de las enzimas xilanoliticas de midió colorimétricamente usando Xylazime (Megazyme, Bray, Irlanda) como un substrato insoluble, de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la prueba. Una unidad se definió como la cantidad de enzima requerida para producir un cambio en la extinción a 590 nm de 1.0 bajo las condiciones de la prueba.

Resultados y discusión Se prepararon diferentes tipos de AXOS a partir de cualquiera de salvado de trigo, harina de trigo o fécula enjugada de trigo, como se describió en la sección de materiales y métodos. Las propiedades de las diferentes preparaciones en términos de contenido de arabinoxilano, grado promedio de sustitución (relación de arabinosa a xilosa) , y grado promedio de polimerización, se muestran en la Tabla 1, donde se comparan con los del Xylooligo-95P, una preparación comercial de XOS con propiedades prebióticas conocidas (Campbell et al., 1997; Hsu et al., 2004). De acuerdo con la nomenclatura usada en la Tabla 1, y también de aqui en adelante, a las preparaciones AXOS se les denomina AXOS-x-y, donde x es el grado promedio de polimerización determinado por cromatografía liquida de gas e y es la relación de arabinosa a xilosa. Las diferentes preparaciones tuvieron grados promedio de polimerización en la escala de 7 a 122 (comparados con 2 del Xylooligo-95P) , y los grados de sustitución variaron desde 0.21 hasta 0.78 (comparados con 0.09 para el Xylooligo-95P) . Las preparaciones derivadas de salvado de trigo (AXOS-7-0.34, AXOS-15-0.27, AXOS-8-0.27) tuvieron un grado menor de sustitución que las preparaciones derivadas de harina de trigo (AXOS-122-0.66, AXOS-16-0.78 ) . También demostramos que el grado de sustitución de los compuestos de AXOS puede ser reducido por tratamiento ácido. El AXOS-39-0.22 se preparó a partir de WU-AX enjugado a través de pasos diferentes incluyendo tratamiento ácido (ver Materiales y Métodos) y esto reduce el grado promedio de sustitución, de 0.63 en el WU-AX enjugado, a 0.22 en el AXOS-39-0.22.

La Figura 2 muestra la distribución de masa molecular de las diferentes preparaciones de AXOS determinadas por HPSEC. Todas las preparaciones de AXOS fueron polidispersas y consistieron de entidades moleculares con un pico situado cerca del avDP determinado por cromatografía líquida de gas. La gama de grados de polimerización dentro de las cuales cae el 90% de los oligosacáridos, determinada a partir de perfiles de lixiviado HPSEC, se proporciona en la Tabla 1 para las diferentes preparaciones de AXOS.

EJEMPLO 2. Propiedades fisicoquímicas y sensoriales de las preparaciones de XOS/AXOS .

Materiales y métodos Preparaciones de oligosacárido . Los Xylooligo-95P, AXOS-15-0.27, AXOS-39-0.22, y AXOS-13-0.21 se obtuvieron como se describe en la sección de materiales y métodos del ejemplo 1. La preparación de fructooligosacárido (FOS) fue el producto comercial Raftilose (Orafti, Tienen, Bélgica). El AXOS-15-0.27 usado para el análisis sensorial fue primero disuelto en agua (1:25 p/v) y tratado con carbón activo para remover los posibles sabores desagradables resultantes del procedimiento de producción. La suspensión de AXOS-15-0.27 y carbón activo (0.75 g/g de AXOS-15-0.27 ) fue agitada durante 1 h a 18°C, y después de la decantación el carbón activo fue removido por centrifugación (10000 g, 30 min, 18°C) .

Medi ciones de la estabilidad. Las mediciones de estabilidad se realizaron en la parte extractable en agua de las preparaciones de oligosacáridos, que fue obtenida por suspensión de las preparaciones en agua desionizada (1:10 p/v) seguida por vibración (2h, 18°C), centrifugación (10,000 g, 20 min, 18°C) y filtración. Después de la liofilización del filtrado, las muestras extractables en agua fueron disueltas en un regulador universal con valores de pH de 2 , 3, 7 y 11 para obtener soluciones que tuvieran concentraciones de oligosacárido de 0.15% /p/v). El regulador universal se preparó a partir de una solución de materias primas de 6.0 g de ácido cítrico, 3.9 g de fosfato de dihidrógeno de potasio, 1.8 g de ácido bórico y 5.8 g de ácido dietilbarbitúrico en agua (1.0 1) (Britton and Welford, 1937) . Los alicuotas de esta solución de material fueron ajustados con cualquiera de HCl 2.0 M, o NaOH 2.0 M, para obtener el pH deseado. Cada una de las soluciones de oligosacárido fue mantenida en agua hirviendo durante diferentes periodos de tiempo (0, 5, 10, 15, 20, 30 y 60 min) . Después de ello, la solución fue enfriada y se midieron los contenidos de monosacárido total y de terminal reductora de azúcar a través de cromatografía liquida de gas, como se describe en métodos y materiales del ejemplo 1. El porcentaje de degradación del FOS se calculó con la fórmula (1), mientras que el porcentaje de degradación del Xylooligo-95P y del AXOS-15-0.27 se calcularon con la fórmula (2) . El porcentaje de hidrólisis del FOS y del Xylooligo-95P y del AXOS-15-0.27 se calcularon con las fórmulas (3) y (4), respectivamente. (1) : -degradación = (conc. total glucosa + mañosa a tiempo 0 y pH7)-(conc. total glucosa + mañosa) (conc total glucosa + mañosa a tiempo 0 y ph7) (2) : %degradac?ón = (conc. total xilosa+arab nosa a tiempo 0 y pH7)-( conc. total xilosa+arabmosa) (conc. total xilosa + arabinosa a tiempo 0 y pH7) (3) : %degra ac?ón =(copc. glucosa reductora+ anosa) - (conc. glucosa reductora+manosa tiempo 0 y ?H7) f G-??I" I riaíi pp m TTI? HP» VI !O<?? rprinrtnra + arshinn?a CJIIP nnprip ir f» «?nlnn?nl El porcentaje de enlaces de xilosa y arabinosa hidrolizadas en AXOS-15-0.27 se calculó con las fórmulas (5) y (6), respectivamente. (5) : % hidrólisis xilosa =(conc. xilosa reduct . ) - [conc. xilosa reductora a tiempo 0 y pH7) (cantidad máxima de xilosa reductora que puede ir en solución) % hidrólisis arabinosa =(conc. arabmosa reduct .)- (conc. arabinosa reductora a tiempo 0 y pH7) (cantidad máxima de arabinosa reductora que puede ir en solución) Análisis sensoriales . Los análisis sensoriales se condujeron en una habitación silenciosa en sesiones que involucraron a un máximo de 10 voluntarios a la vez. Se les pidió a los sujetos que no comieran ni bebieran durante al menos 1 hora antes de la sesión. Primero se familiarizó a los sujetos con los procedimientos, y luego se les pidió que probaran las muestras codificadas con diferentes concentraciones de Xylooligo-95P, AXOS-15-0.27, sacarosa (estimulo dulce de referencia) , cloruro de sodio (estimulo salado de referencia) y ácido ascórbico (estimulo ácido de referencia) , preparadas en agua desionizada purificada (resistencia especifica de 18 mO-cm) . La solución con el más alto grado de concentración de cada compuesto se numeró como 8 y la concentración más baja se numeró como 1 (Tabla 2). Se pidió a los sujetos que probaran consecutivamente toda la gama de concentraciones de un compuesto, en orden creciente de concentraciones, aunque el orden en el que se presentaron los diferentes compuestos a cada individuo fue un orden aleatorio. Antes de probar la serie de concentraciones de un compuesto, primero se enjuagaron la boca dos veces con agua desionizada purificada (resistencia especifica de 18 mO-cm) y luego se llevaron a la boca de cada sujeto 5 ml de cada solución de prueba por medio de una jeringa desechable, la hicieron recorrer por la boca durante 5 segundos y luego la tragaron. Se les pidió a los participantes que indicaran la menor concentración a la cual podía reconocerse como dulce, salado o ácido el sabor del compuesto (umbral de reconocimiento individual) . El umbral promedio de reconocimiento del sabor, determinado como la concentración a la cual la mitad de los sujetos reconocieron la calidad correcta del sabor de un compuesto en particular, se calculó con los datos de los umbrales de reconocimiento individuales obtenidos de 20 personas en total.

Medi ciones de viscosidad. Las mediciones de la viscosidad se realizaron en la parte extractable en agua de las preparaciones de oligosacárido, que se obtuvo por la suspensión de las preparaciones en agua (1:10 p/v) seguida por vibración (2 h, 18°C) , centrifugación (10,000 g, 20 min, 18°C) y filtración. Después de la liofilización del filtrado, se midió la viscosidad de una solución al 5.0% (p/v) con un viscómetro tipo Ostwald (Viscosimetro de Capilaridad, Schott Geráte, tipo 50904) a 30°C de acuerdo con Vinkx et al. (1991). Las mediciones de la viscosidad se hicieron por triplicado y se expresaron con relación (?re?) a la del agua desionizada, dividiendo los tiempos de flujo de cada una de las soluciones de oligosacárido entre los tiempos de flujo del agua desionizada bajo las mismas condiciones experimentales. Después de calcular la viscosidad específica (?sp = ?rei -1), se determinó la viscosidad intrínseca aparente ( [?app] , dl/g) usando la ecuación de Morris (Morris, 1984) como se indica en la fórmula (7), donde c (expresada como mg/ml) representa la concentración de oligosacárido, asumiendo que sólo los oligosacáridos contribuyen a las propiedades viscosas de las soluciones. Después de cada análisis, el viscosimetro se enjuagó dos veces con agua desionizada, dos veces con etanol al 95%, una vez con acetona y una vez con éter dietilo, y subsecuentemente se secó con aire comprimido. (7) [?apP] = -xN?,-kfa-JD" *180 Resultados y discusión La estabilidad del pH del AXOS-15-0.27 se comparó con la de compuestos prebióticos establecidos, con la de fructo-oligosacáridos (FOS, producto comercial Raftilose) y con la de xilooligosacáridos (XOS, producto comercial Xylooligo-95P) . Los diferentes oligosacáridos se mantuvieron a diferentes valores de pH (pH 2, 3, 7 y 11) a 100°C durante diferentes periodos de tiempo. El porcentaje de degradación se determinó midiendo la disminución en el contenido de los monosacáridos constituyentes, y el porcentaje de hidrólisis se determinó midiendo el aumento en la cantidad de los monosacáridos reductores constituyentes. Como se muestra en la Figura 3, ninguno de los oligosacáridos sufrió degradación sustancial a pH bajo o neutro (pH 2, 3 ó 7). Por otra parte, se observó degradación a pH alcalino (pH 11) para los tres oligosacáridos probados. Este efecto fue más notable para el Xylooligo-95P, 73% del cual se degradó después de 60 minutos. El oligosacárido más estable en el alcalino fue el AXOS-15-0.27 (Figura 3). La degradación observada a pH alcalino se conoce como peladura alcalina, una reacción que ocurre a temperaturas elevadas (60-100°C) y progresa a partir de la terminal reductora del oligosacárido (Whistler y BeMiller, 1958; Santori et al., 2003).

De los tres oligosacáridos probados, el FOS fue claramente el más sensible a la hidrólisis a pH bajo (Figura 4). A pH de 2 y 3, 58% y 53% del FOS fue hidrolizado después de 60 minutos. El Xylooligo-95P y el AXOS-15-0.27 mostraron un nivel igual de hidrólisis a pH 2. Sin embargo, el AXOS-15-0-27 fue más estable a pH 3 que el Xylooligo-95P con sólo 2% de hidrólisis para el AXOS-15-0.27 versus 6% para el Xylooligo-95P (Figura 4). La investigación posterior de la hidrólisis del AXOS-15-0.27 a pH bajo, reveló que los enlaces de arabinosa son más susceptibles a la hidrólisis acida que los enlaces de xilosa. De hecho, la incubación de AXOS-15-0.27 a pH 2, a 100°C durante 60 minutos, causó la hidrólisis del 54% de todos los enlaces de arabinosa, mientras que sólo el 4% de los enlaces de xilosa fueron hidrolizados bajo esas condiciones (Figura 5) .

Los xilooligosacáridos con DP bajo como el Xylooligo-95P han sido reportados con sabor dulce, con un dulzor que es de cerca del 40% del de la sacarosa (Suntory, 'Xylo-oligosaccharide' , folleto y hoja de producto, 2001). Hasta hora no se sabe nada acerca de las propiedades de sabor de los arabinoxilo-oligosacáridos con un grado mayor de polimerización. Con un panel de prueba consistente de 20 personas, nosotros determinamos el umbral de reconocimiento del sabor del AXOS-15-0.27 y del Xylooligo-95P. Las muestras de la prueba también incluían sacarosa, cloruro de sodio y ácido ascórbico como representantes de loa sabores dulce, salado y ácido, respectivamente. Se pidió a los sujetos que indicaran la concentración a la que reconocían un sabor como dulce, salado o ácido, para la serie de concentraciones de cada uno de los compuestos de la prueba. Sólo el 15% del panel de prueba notó un sabor dulce para el AXOS-15-0.27 a la concentración más alta probada (71.5 g/1), y ninguno de los sujetos indicó un sabor salado o ácido. El umbral promedio de reconocimiento del sabor para el dulzor de la sacarosa y del Xylooligo-95P fue de 7 y de 24 g/L, respectivamente, mientras que el del AXOS-15-0-27 es más alto que 71.5 g/L. Por lo tanto el AXOS-15-0.27 es más de 10 veces menos dulce que la sacarosa y 3 veces menos dulce que el Xylooligo-95P, que por si mismo es cerca de tres veces menos dulce que la sacarosa.

Se determinó la viscosidad para el AXOS-15-0.27, el AXOS-39-0.22 y el AXOS-13-0.21, y se compararon con la de los fructo-oligosacáridos (FOS, producto comercial Raftilose) y los xilo-oligosacáridos (XOS, producto comercial Xylooligo-95P) . Como se muestra en la Tabla 3, las diferentes preparaciones de AXOS tienen una viscosidad intrínseca aparente más alta que es de 3 a 10 veces mayor con relación al FOS y al Xylooligo-95P.

Ejemplo 3: Fraccionamiento de las preparaciones de AXOS por ultrafiltración.

Materiales y métodos Preparación de los AXOS. Se preparó WU-AX enjugado como se describe en materiales y métodos del ejemplo 1. El WU-AX enjugado fue suspendido en regulador de acetato de sodio (25 mM, pH 4.7) a 3 g/1 y se incubó con XAA, una endoxilanasa de Aspergi ll us a culea tus (Shearzyme 500L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca) a 18.4 U por g de WU-AX enjugado durante 4 h a 30°C. Después de la inactivación de las enzimas por ebullición durante 30 min y de la subsecuente filtración de la suspensión, se recuperó el AXOS en el filtrado.

Separa ción de los AXOS por ul trafil tra ción . Los AXOS fueron fraccionados en un dispositivo de ultrafiltración de 'celda HP4750 agitada' de extremo muerto (Sterlitech Corporation, Kent, US) . Las membranas de ultrafiltración usadas tenían un corte de masa molecular (MMCO) de cualquiera de 5 kDa (P005F, Celgard, Wiesbaden, Alemania), 10 kDa (PES-10, Synder Filtration, Vacaville, CA, US), ó 30 kDa (PES-030H, Celgard). La polarización de la concentración en la superficie de la membrana fue minimizada a través de un mecanismo de barra de agitación magnética recubierta con Teflón que estaba posicionada centralmente en la celda y que tenia una velocidad de agitación de 700 rpm. La fuente de presión era un cilindro de gas nitrógeno comprimido. La presión se controló a través de un regulador de presión y todos los experimentos de filtración se realizaron a una presión constante de 4 bar a temperatura ambiente. La celda de ultrafiltración de extremo muerto se llenó con 300 ml de la solución a fraccionar y la filtración se detuvo cuando se colectó un volumen total de aproximadamente 200 ml de permeado.

Caracterización de las preparaciones aisladas . Ver materiales y métodos del ejemplo 1. La cromatografía de exclusión de tamaño de alto rendimiento (HPSEC) se realizó como se describe en métodos y materiales del ejemplo 1, excepto en que se usó una columna de HPSEC Shodex SB-802.5 HQ (Showa, Denko K.K., Tokio, Japón, 300 x 8 mm, escala de separación: 1 x 102 - 1 x 104 Da) . Los marcadores de masa molecular fueron pululantes estándar Shodex P-82 (2.0 mg/ml) con una masa molecular de 11.2 x 104, 4.73 x 104, 2.28 x 104, 1.18 x 104, y 0.59 x 104 Da, estándares de xilo-oligosacáridos con una masa molecular de 810 (DP6) , 678 (DP5), 546 (DP4), 414 (DP3) y 282 Da (DP2) y glucosa con una masa molecular de 180 Da.

Resultados y discusión La presencia de oligosacáridos con sabor dulce y con masa molecular baja metabolizable en las preparaciones de AXOS pueden ser indeseables para aplicaciones particulares como componentes de alimento, mientras que para otras aplicaciones es deseable usar preparaciones de AXOS con sabor dulce que consisten principalmente de oligosacáridos de baja masa molecular. Por esta razón es útil desarrollar un método que permita fraccionar las preparaciones de AXOS tales que el AXOS/XOS con DP2-3 esté separado del AXOS con un DP más alto. Anteriormente el fraccionamiento de los arabinoxilanos siempre se ha realizado por precipitación con soluciones alcohólicas de diferentes concentraciones (Courtin y Delcour, 1998). Sin embargo, aplicar precipitación de alcohol a escala industrial es técnica y económicamente poco atractivo. Por ls tanto, se investigó la viabilidad para fraccionar por ultrafiltración los AXOS enzimáticamente producidos.

Como ejemplo, los AXOS preparados por incubación de WU-AX enjugado con XAA (18.4 U/g) durante 4 h a 30°C, se sometieron a ultrafiltración usando membranas con un corte de masa molecular (MMCO) de cualquiera de 5 kDa, 10 kDa ó 30 kDa.

Cuando se usa la membrana de 5 kDa, el perfil de HPSEC de la fracción permeada (PER5kDa) (Figura 7) muestra principalmente los oligosacáridos que corresponden en tamaño a la xilobiosa (DP2) y a la xilotriosa (DP3) . La fracción retenida (RET5kDa) , que contiene 86% del arabinoxilano soluble en la solución de material de inicio de AXOS (tabla 4), muestra básicamente el mismo perfil de masa molecular que la preparación de AXOS antes de la ultrafiltración, excepto en que la cantidad de oligosacáridos con DP2 y DP3 se reduce por cerca de la mitad (Figura 7a) . La remoción incompleta de oligosacáridos con DP bajo en la fracción RET5kDa podria ser el resultado de su retención como resultante de los flujos de permeado reducidos causados por la presencia de componentes de masa molecular alta.

A través de la ultrafiltración usando la membrana de 10 kDa, 34% del contenido de arabinoxilano se recuperó en la fracción permeada, mientras que el 65% fue retenido en la fracción permeada (Tabla 4). La fracción permeada (PER5)(Da) contenia principalmente oligosacáridos con DP2 a DP6. La fracción retenida (RET5kDa) tenia un nivel bajo de oligosacáridos de tamaño pequeño con DP 2-4, y consistía principalmente de oligosacáridos con una masa molecular en la escala de 700 a >110,000 Da (DP5 a DP>850) (Figura 7b). En comparación con la fracción (PER5kDa), el permeado obtenido con la membrana de 30 kDa (PER3ukDa) tenía un contenido más alto de oligosacáridos en la escala de 1000 a 10,000 Da. De modo correspondiente, la fracción retenida de la membrana de 30 kDa (RET30kDa) tenia un menor contenido de oligosacáridos en la escala de 1000 a 10,000 Da en comparación con el RET?0kDa/ aunque sorprendentemente el contenido de oligosacáridos DP2 y DP3 fue más alto en RET30kDa que en RET?0kDa- A partir de la Tabla 4 es claro que la ultrafiltración influencia la proporción de A/X de las fracciones de AXOS obtenidas. Las fracciones permeadas (PER5kDa, PER?okDa, PER30kDa) fueron enriquecidas para los oligosacáridos con una proporción A/X relativamente baja, mientras que las fracciones retenidas (RET5kDa, RET?0 Da RET30kDa) contenían componentes con una relación A/X más alta.

Para evaluar la posibilidad de más fraccionamiento de AXOS por ultrafiltración, la fracción RETiokDa fue sometida a un segundo procedimiento de ultrafiltración en el cual se usó una membrana de 30 kDa. En la Figura 8 se muestran los perfiles de HPSEC de la fracción permeada (PER10Da+30kDa) y la fracción retenida (RET?okDa+3?kDa) obtenidas después de la ultrafiltración de la fracción RET?0Da a través de una membrana con MMCO de 30 kDa, junto con la fracción PERiokDa- La fracción RET?okDa+3okD contiene principalmente componentes de masa molecular alta (> 20,000 Da) que aparecen en el volumen de espacio vacío de la columna Shodex SB-802.5 HQ. La fracción PER?okDa+3?Daf que representa aproximadamente el 25% de los arabinoxilanos en la solución de material AXOS (Tabla 5), consiste principalmente de oligosacáridos de tamaño medio con una masa molecular en la escala de 700 a 10,000 Da (DP 5 a 75) (Figura 8).

Estos resultados indican que la ultrafiltración, preferiblemente usando una membrana con un MMCO de 10 kDa, puede usarse como un método para hacer preparaciones de AXOS ya sea con un alto contenido de oligosacáridos con DP2-6, tomando el permeado de la ultrafiltración, o bien con un alto contenido de oligosacáridos con DP>4 y un bajo contenido de DP2-4, tomando el retenido de la ultrafiltración. La ultrafiltración consecutiva, preferiblemente usando el retenido de una membrana de 10 kDa y pasando este sobre una membrana de 30 kDa, puede ser usada para obtener una fracción de AXOS que esté enriquecida en AXOS en la escala de DP5-75.

Ejemplo 4: Efectos de las preparaciones de AXOS en los intestinos de pollos Materiales y métodos Preparaciones de ol igosa cárido . Ver materiales y métodos en el ejemplo 1.

Análisis microbi ológi co por conteo de charola . Se pesó el contenido cecal de los pollos, se diluyó en 1:10 en solución estéril de sal fisiológica de peptona (PPSS; 0.1% de bactopeptona, 0.85% de NaCl), se homogeneizó en un peto, y luego se diluyó de nuevo en PPSS de acuerdo con un esquema de dilución de diez dobleces. Luego las diluciones apropiadas fueron colocadas en charolas usando la técnica de charola de vaciado en agar de Glucosa Violeta Rojo Bilis (VRBG; Oxoid CM0485B, Basingstoke, Reino Unido) para el conteo de enterobacteriáceas, y en agar anaerobio de Wilkins-Chalgren (Oxoid CM619) modificado con adición de ácido acético glacial (1 ml/l) y mupirocina (100 mg/l) para las bifidobacterias . Las últimas modificaciones permiten la selectividad del agar de Wilkins-Chalgren para las bifidobacterias, y el agar modificado de Wilkins-Chalgren mostró ser particularmente adecuado para el paso uno de determinación de la cuenta bifidobacterial en el ciego de pollos (rada et al., 1999; Rada y Petr, 2000). Las colonias se contaron después de 1 dia de incubación aeróbica a 37 °C para las enterobacteriáceas, y después de 4 dias de incubación anaeróbica (en jarras anaeróbicas con el sistema Oxoid anaerógeno AN0025A) a 37°C para las bifidobacterias . Las cuentas se expresaron por g de contenido cecal. Se tomaron varias precauciones para minimizar la exposición de las bifidobacterias al oxigeno durante la preparación de la muestra: (i) el contenido cecal sólo se removió del ciego justo antes del inicio de la preparación de la muestra; (ii) los diluyentes y los agares fueron sometidos al autoclave o hervidos justo antes de usarlos para remover el oxigeno disuelto; (iii) las charolas para las cuentas bifidobacteriales se colocaron bajo atmósfera anaeróbica dentro de las 2 h a partir del inicio de la preparación de la muestra.

Análisis microbiológico por PCR cuanti ta tivo . La extracción del ADN se realizó como lo describe Van de Wiele et al (2004) en las muestras del ciego diluidas 1:5 en "PPSS. La amplificación se realizó en 25 µl de mezclas de reacción usando reguladores dotados con los Reactivos Verdes de Centro de PCR SYBR® como lo describe el proveedor (PE applied Biosystems, Nieuwerkerk a/d Ijsel, Países Bajos) en charolas MicroAmp Optical de 96 platinas con tapas ópticas (PE Applied Biosystems). Se usaron primarios adelantados e inversos, BIF164Í y BIF163r respectivamente (Satokari et al., 2001) a una concentración de 1 µM para la detección de las copias de los genes 16S ribosomales de ARN de bacterias del género Bif idobacteri um . La temperatura del programa de PCR fue como sigue: 50°C durante 2 min, 95°C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 94°C durante 1 min, 62°C durante 12 min, y 60°C durante 1 min. La plantilla de ADN fue amplificada en mezclas de reacción triplicadas y monitoreada con un instrumento ABI Prism SDS7000 (PE Applied Biosystems) . Se construyeron las curvas estándar con base en la amplificación de PCR en tiempo real en reacciones cuadruplicadas sobre cuatro diluciones diferentes de ADN extraído de un cultivo de Bif idoba cteri um breve (cepa LMG11042). Los datos de PCR en tiempo real de las muestras experimentales fueron graficados contra la curva estándar y corregidos para la eficiencia de la extracción del ADN usando un factor consistente de la concentración de ADN en la muestra experimental con la mayor concentración de ADN dividida entre la concentración de ADN de cada muestra experimental individual.

Análisis estadí stico . El efecto de diferentes dietas en la masa corporal, la ingesta de alimento o la composición microbial de los intestinos de los animales fue analizado por análisis de variancia de factor 1 a 95% de nivel de confianza usando el software Analyse-it, versión 1.71. En caso de que se observara un efecto estadísticamente significativo para la dieta del factor, se analizaron las diferencias entre las dietas por la prueba de diferencia menos significativa (LSD) o por prueba de Turkey, al 95% de nivel de confianza.

Resultados y discusión El efecto de la adición de diferentes preparaciones derivadas de (arabino) xilano se probó en la composición microbial de los intestinos inferiores de los pollos .

Para un primer experimento, se compraron 64 pollos machos de un dia de edad (Ross Roasters) en un criadero comercial (Avibel, Tielt, Bélgica) y se distribuyeron en 4 corrales (16 pollos por corral). En cada corral estaban presentes un bebedero y un contenedor de alimento. La temperatura del establo era de 35°C a la llegada de las aves y se disminuyó subsecuentemente con 1°C cada 2 dias. Los animales fueron mantenidos en un foto periodo de 23 horas de luz y 1 hora de oscuridad. Los alimentos (un alimento por corral) y el agua para beber se administraron ad libi tum . La duración del experimento fue de 14 dias.

Se probaron los siguientes alimentos experimentales : - Alimentación de control - Alimentación de control + 0.25% de preparación de AXOS-7-0.34 (0.17% de AX puro) - Alimentación de control + 0.25% de preparación de AXOS-122-0.66 (0.18% de AX puro) - Alimentación de control + 0.25% de Xylooligo-95P (0.22% de AX puro).

Las concentraciones que se indican entre paréntesis fueron corregidas para su pureza calculada por su contenido de AX. La alimentación de control consistió de un alimento iniciador comercial (Krix 0, Hendrix UTD, Boxmeer, Países Bajos) que contenia mezcla de enzimas xilanasa y glucanasa (Roxazyme) como un aditivo.

A la edad de 7 días todos los animales fueron pesados y 8 animales por grupo se seleccionaron aleatoriamente y se sacrificaron por decapitación. Después de ello, los animales fueron diseccionados para colectar el ciego. El ciego fue vaciado y los contenidos se reunieron en dos grupos por tratamiento (de cuatro ciegos cada uno) . Este protocolo se repitió cuando los animales restantes alcanzaron la edad de catorce dias, excepto que los ciegos fueron reunidos en tres grupos por tratamiento (de tres, tres, y dos animales cada uno) .

Para los animales del grupo de AXOS-7-0.34 no se observaron diferencias significativas en la media de masa corporal con relación al grupo de control. Los animales en los grupos AXOS-122-0.66 y Xylooligo-95P tuvieron un peso corporal significativamente menor que el grupo de control después de 7 dias, pero en los animales tomados después de 14 días y las diferencias con el control no fueron significativas. En el caso del grupo de AXOS-122-0.66, el peso corporal relativamente menor después de 7 dias debió deberse a una pérdida significativamente menor del peso de los pollos en este grupo en crianza.

El análisis de la microbiota cecal de los pollos indicó altos niveles de enterobacteriáceas (cerca de 108-109/g de contenido cecal), tanto después de 7 dias como de 14 dias de alimentación, y no se observaron diferencias significativas para ninguno de los tratamientos. Los niveles de bifidobacterias después de 7 dias fueron bajos en todos los grupos del tratamiento (cerca de 102-103/g de contenido cecal) (Figura 9), excepto para los animales en el grupo de Xylooligo-95P, para los cuales el nivel de bifidobacterias fue mucho más alto (cerca de 108/g de contenido cecal). Después de 14 dias el número de bifidobacterias en el ciego permaneció bajo para el grupo de control. En contraste, se observó un incremento claro en el número de bifidobacterias (por un factor de cerca de 105) en el contenido cecal del grupo de AXOS-7-0.34. En el grupo de Xylooligo-95P, el nivel de bifidobacterias fue un tanto bajo con relación al nivel después de 7 dias, aunque después de 14 días fue aún significativamente más alto que para el grupo de control. En el grupo de AXOS-122-0.66 ocurrió un aumento moderado en el número de bifidobacterias en el contenido cecal, después de 14 dias; sin embargo, este incremento no fue significativo con relación al grupo de control.

Para un segundo experimento en pollos, se compraron 54 pollos machos de un dia de edad en un criadero comercial (Avibel, Tielt, Bélgica) y se distribuyeron en 6 corrales (9 pollos por corral) . Las condiciones de los corrales eran como se describieron para el primer experimento (ver arriba) . La duración del experimento fue de 14 dias.

Se probaron las siguientes alimentaciones experimentales: Alimentación de control - Alimentación de control + 0.141% de preparación de AXOS-15-0.27 (0.1% de AX puro) - Alimentación de control + 0.352% de preparación de AXOS-15-0.27 (0.25% de AX puro) - Alimentación de control + 0.263% de preparación de FOS (0.25% de FOS puro). - Alimentación de control + 1.053% de preparación de FOS (1% de FOS puro) . - Alimentación de control + 0.01% de preparación de Xilanasa.

Las concentraciones indicadas entre paréntesis fueron corregidas para su pureza calculada por su contenido de AX o de FOS. La preparación de FOS fue el producto comercial Raftilose (Orafti, Tienen, Bélgica) . La preparación de xilanasa fue el producto comercial Belfeed (Beldem, Groot-Bijgaarden, Bélgica). La composición de la alimentación de control se da en la Tabla 6. A la edad de 14 dias todos los animales fueron pesados y sacrificados por decapitación. Después los animales fueron diseccionados para colectar el ciego, y los contenidos del ciego se reunieron por 3 animales pertenecientes al mismo grupo de tratamiento. El número de bifidobacterias en las muestras de ciego reunidas se midió por PCR cuantitativa.

Después de dos semanas de alimentación con las respectivas dietas, no se observaron diferencias significativas en el peso corporal entre los diferentes tratamientos. Con especto al número de bifidobacterias en el ciego de los pollos después de 2 semanas, sólo los pollos alimentados con la dieta que contenía 0.25% de AXOS-15-0.27 difirieron significativamente del tratamiento de control (Figura 10). El número de bifidobacterias en los pollos alimentados con 0.25% de AXOS-15-0.27 fue 22 dobleces mayor que en los pollos alimentados con la dieta de control. Deberla notarse que los fructo-oligosacáridos, un compuesto prebiótico bien documentado que fue incluido para propósitos de comparación, no causó un aumento en el número de bifidobacterias en el ciego de los pollos, aún a dosis 4 veces mayores a las que es efectivo el AXOS-15-0.27. Esto indica que el AXOS-15-0.27 es un compuesto bifidogénico sorprendentemente potente.

Las bifidobacterias se han asociado positivamente con la salud animal y humana y son componentes de muchos compuestos probióticos. Ha habido un interés creciente en el enriquecimiento selectivo de estas poblaciones de bacterias dentro del tracto gastrointestinal, además de para alimentar directamente con preparaciones microbiales, para promover o mantener un estado positivo de salud en animales y humanos, incluyendo un efecto supresor del cáncer colorrectal (Van Loo et al., 2004). Los resultados de las pruebas de alimentación con pollos indican que todos los alimentos que contenían arabinoxilano estimularon la presencia de bifidobacterias en el ciego de los pollos. La preparación de AXOS con alto grado de polimerización, el AXOS-122-0.66, causó solamente un aumento no significativo en la población de bifidobacterias en el ciego de los pollos. Por otra parte, las preparaciones con grado de polimerización de bajo a intermedio, las de Xylooligo-95P, AXOS-7-0.34 y AXOS-15-0.27 , dispararon un aumento fuerte y significativo en las bifidobacterias, sin causar una reducción del peso corporal de los animales. La respuesta al Xylooligo-95P pudo ser observada después de 7 dias, mientras que el AXOS-7-0.34 y el AXOS-15-0.27 sólo causaron una respuesta bifidogénica después de 14 días. Esto indica que el Xylooligo-95P es fermentado más rápidamente por las bifidobacterias que las preparaciones de AXOS-7-0.34 y de AXOS-15-0.27 que tienen un grado promedio alto de polimerización y un grado promedio de promedio alto de sustitución. La fermentación lenta por las bacterias benéficas seleccionadas es una propiedad deseada en un compuesto prebiótico para la aplicación en humanos y en otros animales con intestinos largos. La fermentación lenta por las bacterias intestinales aumenta la fracción del compuesto prebiótico que no es completamente consumida después del paso a través de las partes proximales del colon y por lo tanto puede usarse como un substrato para la fermentación a través de las bacterias adecuadas en las partes distales del colon. En los humanos, la incidencia de cáncer en las partes distal y rectal del colon, tomadas juntas, es más alta que la de las partes proximales del colon (http: //www. state.nj . us/health/cáncer/subsites .htm) , y por lo tanto es importante que los compuestos prebióticos puedan estimular la microbiota benéfica del colon distal y del recto.

EJEMPLO 5. Efecto de las preparaciones de AXOS en los intestinos de ratas Materiales y métodos Preparaciones de XOS/AXOS . Ver materiales y métodos en el ejemplo 1.

Análisis metodológico por PCR cuan ti ta tiva . Ver materiales y métodos en el ejemplo 4.

Análisis de ácidos grasos de cadena corta . Se extrajeron muestras intestinales con 5 volúmenes de agua/ácido fosfórico/ácido fórmico (98/1.8/0.2, v/v/v) y se clarificaron por centrifugación (22,000 g, 10 min). Los ácidos grasos de cadena corta (SCFA's) se analizaron por cromatografía liquida de gas (Shimadzu, GC 14A) en una columna empacada con Chromosorb W (tamaño de malla 60/30; Supelco, Bellefonte, US) y se detectaron por ionización de flama. Las concentraciones de SCFA's se calcularon con base en los estándares de las concentraciones conocidas de los diferentes ácidos. Se usó ácido caprónico como estándar internacional.

Análisis estadísti cos . El efecto de las diferentes dietas en la masa corporal, la ingesta de alimento, los SCFA o la composición microbial en los intestinos de los animales, se analizó por análisis de variancia de factor 1 a 95% de nivel de confianza usando el software Analyse-it, versión 17.1. En caso de que se observara un efecto significativo para el factor dieta, las diferencias entre las dietas se analizaron por la prueba de diferencia menos significativa (LSD) a 95% de nivel de confianza .

Resultados y discusión. Para un primer experimento en ratas, se compraron 40 ratas macho de 6 semanas de edad (Wistar) en Elevage Janvier (Le Genest-St-Isle, Francia) y se alojaron en jaulas con fondo de alambre de acero inoxidable (2 ratas por jaula) en una habitación de ambiente controlado (22°C) con un ciclo de luz y oscuridad de 14-10 h. A las ratas se les dio libre acceso al agua y a pildoras (10 mm) de una 'dieta básica humanizada' durante 7 dias. La composición de la 'dieta básica humanizada' se da en la Tabla 7. Después de 7 días de adaptación a la dieta básica humanizada, las ratas se asignaron aleatoriamente a uno de 5 grupos diferentes de tratamiento (8 ratas/grupo) , y a cada uno de los grupos se les dio acceso libre a las pildoras (10 mm) de una de las siguientes dietas, durante 13 dias: Dieta básica humanizada - Dieta básica humanizada + 0.70% de preparación AXOS-122-0.66 (0.5% de AX puro) - Dieta básica humanizada + 0.69% de preparación AXOS-16-0.78 (0.5% de AX puro) - Dieta básica humanizada + 0.73% de preparación AXOS-15-0.27 (0.5% de AX puro). - Dieta básica humanizada + 0.72% de preparación AXOS-8-0.27 (0.5% de AX puro).

Las concentraciones indicadas entre paréntesis se corrigieron para su pureza calculada por su contenido de AX. Para las dietas que contienen AXOS, la fécula en la dieta básica humanizada fue reemplazada con las cantidades apropiadas de AXOS.

Los animales fueron pesados y se midió la ingesta de alimento 3 veces por semana. Después de 13 dias de tratamiento, todos los animales fueron pesados y sacrificados con una sobredosis de Nembutal. Después, los animales fueron diseccionados para colectar las heces. Las heces se colectaron como pelotillas desde el colon distal hasta el ano. Las heces se reunieron por cada 2 animales pertenecientes al mismo grupo de tratamiento y se analizó el contenido de SCFA.

La ingesta de alimento durante el periodo de tratamiento varió desde 18.9 hasta 27.7 g/dia con un promedio de 22.7 g/d. Los pesos corporales iniciales de las ratas al principio del tratamiento fueron en promedio de 262.0 g, y los pesos corporales finales después de 13 dias de tratamiento estuvieron en el promedio de 375.3 g. No se observaron diferencias significativas en el peso corporal o en la ingesta de alimento entre los diferentes tratamientos .

Como los niveles aumentados de SCFA intestinal son el sello de los cambios en la microflora intestinal inducidos por la ingesta de productos prebióticos (Van Loo, 2004), medimos el contenido de SCFA de las heces para los diferentes grupos de tratamiento. Como se muestra en la Figura 11, el nivel de propionato en las heces de las ratas alimentadas con AXOS-8-0.27, AXOS-15-0.27 y AXOS-16-0.78 fue significativamente más alto que en el grupo de control o en el grupo de AXOS-122-0.66. También hubo una tendencia para los niveles incrementados de acetato y butirato en las heces de los grupos de AXOS-8-0.27, AXOS-15-0.27 y AXOS-16-0.78.

Los SCFA's tales como acetato, propionato y butirato se producen como depósitos de electrones de la respiración de las bacterias en el ambiente anaeróbico del intestino. Los compuestos prebióticos son conocidos por aumentar los niveles de SFCA en el tracto gastrointestinal.

Son deseables los altos niveles de SCFA's, porque estos reducen el pH del contenido del intestino y con ello limitan el desarrollo de bacterias putrefactoras potencialmente patógenas. La disminución del pH intestinal también ocasiona un aumento en la solubilidad y la biodisponibilidad de los minerales calcio y magnesio (Teitelbaum y Walker, 2002). Los ácidos grasos de cadena corta, especialmente el butirato, además estimulan las células epiteliales del colon, aumentando asi la capacidad de absorción del epitelio (Topping y Clifton, 2001).

El hecho de que no se observaran diferencias significativas entre las ratas tratadas con AXOS 12-0.27 o AXOS-16-0.78, dos preparaciones con aproximadamente el mismo grado promedio de polimerización pero con diferente relación A/X, indica que el grado de sustitución no tiene un gran impacto en la capacidad de los AXOS para estimular la fermentación bacterial en el colon. Por otra parte, cuando se comparan los efectos del AXOS-16-0.78 y del AXOS-122-0.66, dos preparaciones con aproximadamente el mismo grado de sustitución pero con diferente grado de polimerización, es claro que las preparaciones de AXOS con un alto grado de polimerización tales como AXOS-122-0.66 son compuestos prebióticos menos potentes que las preparaciones con un menor grado promedio de polimerización. Por lo tanto, las preparaciones AXOS con un grado promedio de polimerización por debajo de 120 son las composiciones prebióticas preferibles. En el caso de que sea preferible la fermentación lenta, para aumentar la disponibilidad de AXOS en el colon distal y en el recto, son preferibles las preparaciones de AXOS con un grado promedio de polimerización en la escala por arriba de 4.

Para un segundo experimento en ratas, se compraron 24 ratas macho de 6 semanas de edad (Wistar) en Elevage Janvier (Le Genest-St-Isle, Francia) y se alojaron en jaulas con fondo de alambre de acero inoxidable (2 ratas por jaula) en una habitación de ambiente controlado (22°C) con un ciclo de luz y oscuridad de 14-10 h. A las ratas se les dio libre acceso al agua y a pildoras (10 mm) de una 'dieta básica humanizada' durante 6 dias. La composición de la 'dieta básica humanizada' se da en la Tabla 7. Después de 6 dias con la dieta básica humanizada, las ratas se asignaron aleatoriamente a uno de 3 grupos diferentes de tratamiento (8 ratas/grupo), y a cada uno de los grupos se les dio acceso libre a las pildoras (10 mm) de una de las siguientes dietas: Dieta básica humanizada - Dieta básica humanizada + 5.87% de preparación AXOS-15-0.27 (4% de AX puro) - Dieta básica humanizada + 5.26% de Xylooligo-95P (4% de AX puro) Las concentraciones indicadas entre paréntesis se corrigieron para su pureza calculada por su contenido de AX. Para las dietas que contienen AXOS-15-0.27 o Xylooligo-95P, la fécula en la dieta básica humanizada fue reemplazada con las cantidades apropiadas de AXOS.

Los animales fueron pesados y se midió la ingesta de alimento 3 veces por semana. Después de 14 dias de tratamiento, todos los animales fueron pesados, sacrificados con una sobredosis de Nembutal y diseccionados para colectar el colon proximal, el ciego y el colon distal. Los contenidos del ciego se reunieron por cada 2 animales pertenecientes al mismo grupo de tratamiento y se analizaron para el contenido de bifidobacterias por PCR cuantitativa. Los contenidos del colon proximal y del colon distal se reunieron por cada 2 animales pertenecientes al mismo grupo de tratamiento y se analizaron para el contenido de SCFA.

En el colon proximal, los niveles de SCFA fueron mucho menores que en el colon distal, y sólo el acetato estaba por arriba del umbral de detección en las muestras del colon proximal. Por lo tanto, sólo pudieron obtenerse los datos para el acetato en el colon proximal y -para el acetato, el propionato y el butirato en el colon distal. Ninguno de los tratamientos dio como resultado un efecto significativo en los niveles de SCFA al 95% del nivel de probabilidad. Sin embargo, pudieron observarse tendencias claras en los datos. Como se muestra en la Figura 12, los grupos de AXOS-15-0.27 y el Xylooligo-95P tuvieron niveles más altos de acetato y butirato, pero no de propionato, comparados con el grupo de control. El efecto más impactante se observó para el butirato en el colon distal, para el cual el aumento con relación al grupo de control fue de 58% en el grupo de AXOS-15-0.27 y de 34% en el grupo de Xylooligo-95P. El mayor efecto del AXOS-15-0-27 con relación al Xylooligo-95P se observó para todos los SCFA's en el colon distal. De modo interesante, el Xylooligo-95P causó el mayor incremento de acetato en el colon proximal, mientras que el AXOS-15-0.27 dio como resultado el mayor fomento de acetato en el colon distal.

La cantidad de bifidobacterias aumentó significativamente en el ciego de las ratas alimentadas con cualquiera del AXOS-15-0.27 y el Xylooligo-95P en comparación con las ratas que recibieron la dieta de control. El mayor aumento en las bifidobacterias cecales se observó en el grupo de AXOS-15-0.27 (1.08 unidades log o 12 veces mayor versus el grupo de control, Figura 13) .

Estos resultados indican que el AXOS-15-0.27 es un compuesto prebiótico más potente que el Xylooligo 95P. Los datos también indican que el AXOS-15-0.27 se fermenta más lentamente que el Xylooligo-95P, ya que el Xylooligo-95P causa un efecto de SCFA en el colon proximal mientras que el AXOS-15-0.27 causó un efecto más fuerte en el colon distal. La fermentación más lenta del AXOS-15-0.27 versus el Xylooligo-95P también se observó en los experimentos en pollos presentados en el ejemplo 5. Las propiedades de fermentación lenta del AXOS-15-0.27 son deseables, dado que dan como resultado un compuesto más prebiótico que alcanza el colon distal, donde puede ejercer sus efectos benéficos y presumiblemente supresores de la carcenogénesis .

EJEMPLO 6. Efecto de las preparaciones de AXOS en los intestinos humanos .

Materiales y métodos Preparaciones AXOS-15-0. 27 y WPC. Ver materiales y métodos del ejemplo 1.

Análisis microbiológicos por PCR cuan ti ta tivo . Ver materiales y métodos del ejemplo 4.

Sujetos. Ninguno de los voluntarios participantes en el experimento tenia una historia de enfermedad gastrointestinal o metabólica ni cirugía anterior. Los sujetos estaban libres de antibióticos o de otro tratamiento médico que influenciara el tránsito del intestino o la flora intestinal, durante al menos 3 meses antes del inicio del estudio. Ninguna de las mujeres estaba embarazada durante el experimento. No se impusieron dietas estándar a los voluntarios. Sin embargo, se les pidió que mantuvieran un patrón regular de alimentación hasta el final del periodo del estudio y que evitaran la ingesta excesiva de productos de leche fermentada y los alimentos que contuvieran cantidades altas de carbohidratos fermentables. El Comité de Ética de la Universidad de Leuven aprobó los experimentos y todos los sujetos dieron su consentimiento informado.

Substra tos etiquetados . Se sintetizó lactosa- [15N, 15N] -ureido de acuerdo con el método de Schoorl modificado por Hofmann (1931) con [15N, 15N] urea obtenida en Euriso-op (Saint-Aubin, Francia) . El polietilenoglicol etiquetado con 3H (3H-PEG) se obtuvo en New England Nuclear Life Science Products (Boston, MA, US) .

Determinación de Ntot y 15N urinario y feca l . El contenido total de N y de enriquecimiento de 15N de la orina y las heces se midieron usando un analizador elemental (ANCA-SL; PDZ, Chesire, UK) acoplado con ambos de un detector de conductor térmico (TCD; PDZ) y un espectrómetro de masa de relación estable de isótopo (IRMS; PDZ). Un volumen conocido de orina (15 µl) o una masa conocida de heces (cerca de 5-7 mg de defecación secada congelada) se oxidaron en presencia de oxigeno a 1,000°C. Los productos de combustión pasaron después a través de un segundo horno que contenía cobre a 600°C donde se absorbió el exceso de oxígeno y los óxidos de nitrógeno se redujeron a nitrógeno elemental. El contenido total de nitrógeno se midió por medio de un detector TCD, mientras que el enriquecimiento de 15N se determinó por medio de un detector IRMS, acoplado a la unidad de combustión del analizador elemental. La relación de N2 del isótopo 15N al 14N se midió con referencia al estándar calibrado de laboratorio (i.e., una solución estándar de sulfato de amonio) . El porcentaje recuperado de la dosis administrada de 15N se calculó como sigue (Evenepoel et al . , 1999) dosis de 15N 100 x mg en exceso de 15» Nt mg de 15N administrado donde mg en exceso de 15Nt = APt - APbas x Ntot 100 y APt : el enriquecimiento medido de 15? de una muestra de orina especificada, expresado en por ciento de átomo (AP) APbas: el enriquecimiento medido de 15? de una muestra basal de orina (expresado en AP) ?tot: el contenido total de nitrógeno en una muestra de orina especificada.

Para las muestras de orina, el porcentaje de la dosis de 15? administrado se acumuló para el periodo de 0-48 h después de la comida de prueba, mientras que para las muestras fecales el porcentaje de la dosis de 15? administrado se acumuló para el periodo de 0-72 h después de la comida de prueba. Para las muestras fecales se realizó una corrección para las diferencias de tránsito oro-fecal interindividual. Esto se hizo dividiendo el porcentaje acumulativo de la dosis de 15? administrado, recuperado a lo largo de 72 h. El contenido de 3H-PEG en las defecaciones se midió por conteo de cintilación líquida (espectrómetro de cintilación liquida Tricarb modelo 3375; Packard Instruments, Downers Grove, IL, US) después de la oxidación a 3H-H20 (oxidante de muestra Packard, modelo 307) .

Determinación de compuestos fenóli cos urinarios .

El contenido total de p-cresol y de fenol fue medido por tecnología de espectrometría de masa de cromatografía líquida de gas (GC-MS) . El pH de 950 ml de orina se ajustó a pH 1 con H2S04 concentrado. La solución se calentó durante 30 min a 90°C para desproteinar e hidrolizar los fenoles conjugados. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, se añadieron 50 ml de 2 , 6-dimetilfenol (20 mg/100 ml) como un estándar interno. Los fenoles fueron extractados con 1 ml de acetato de etilo. La capa de acetato de etilo fue secada con Na2S04 y 5 ml de esta solución fueron analizados en un GC-MS (Trace GC-MS, Thermo Finnigan, San José, CA, US) . La columna analítica fue una de 30 m x 0.32 mm de diámetro interior, AT5-MS de lµm (Alltech Associates, Deerfield, IL, US) . Se usó gas de helio grado GC como un portador a proporción de flujo constante de 1.3 ml/min. La temperatura del horno se programó a partir de 75°C (isoterma durante 5 min) y se incrementó por 10°C/min hasta los 160°C y por 20°C/min hasta los 280°C. La detección espectrométrica de masa se realizó en modo de escaneo total de impacto de electrón desde m/z 59 hasta m/z 590 a dos escaneos/s. Los resultados para el p-cresol y el fenol se expresaron como contenido total (mg) recuperado en las recolecciones de 0-24 h.

Análisis estadí stico . El análisis estadístico se realizó con un software SPSS versión 12.0. La evaluación estadística de los datos se realizó aplicando una prueba de los signos de Wilcoxon al 95% de nivel de confianza.

Resultados y discusión Se realizó un primer experimento en humanos en 10 voluntarios sanos (5 hombres y 5 mujeres, con escala de edades de 23-37 años) . Los 10 voluntarios se ubicaron aleatoriamente en cualquiera de dos grupos de 5 personas. El primer grupo, recibió durante 2 semanas 7 g por dia (4.88 g) de AXOS-15-0.27 suspendido en agua, mientras que el segundo grupo recibió diariamente 11.6 g (4.82 g) de WPC suspendido en agua. Los valores del peso entre paréntesis son los pesos corregidos para AXOS sobre la base del contenido de AX y el contenido de humedad de la preparación .

Para cada uno de los voluntarios se colectaron las muestras fecales durante el dia anterior al inicio del experimento, y durante el dia 15°. Cada dia se colectó la primera evacuación del día, se pesó, y se almacenó a -20°C hasta el análisis microbial por PCR cuantitativo.

Como se muestra en la Figura 14, los sujetos que recibieron 4.88 g/dia de AXOS-15-0.27 durante 14 dias tenían un nivel de bifidobacteria fecal que era de 1.55 unidades log (= 35 veces) más alto con relación al nivel basal (p =0.043). En contraste, el nivel de bifidobacterias se redujo ligeramente después de 2 semanas en los sujetos a los que se administraron 4.82 g/dia de WPC, aunque la diferencia con relación al nivel basal no fue significativa (p=0.715) .

Estos datos indican que los compuestos de AXOS con un grado promedio intermedio de polimerización tal como el AXOS-15-0.27 (avDP = 15, Tabla 1) ejercen un efecto prebiótico más fuerte que los compuestos con un grado promedio alto de polimerización, tal como el WPC (avDP = 58, Tabla 1) . La misma conclusión podria extraerse fácilmente de las pruebas sobre efectos bifidogénicos en los pollos (ver ejemplo 4) y en el aumento de SCFA's en ratas (ver ejemplo 5) .

En un segundo experimento, se evaluó el efecto de diferentes dosis de una sola vez de AXOS-15-0.27 en el metabolismo de NH3, p-cresol y fenol en el colon humano. El NH3, el p-cresol y el fenol son metabolitos tóxicos y potencialmente cancerígenos que son producidos por las bacterias en el colon durante la fermentación de las proteinas. El metabolismo del NH3 se evaluó usando lactosa-[15N, 15N] -ureido como marcador. Con la administración oral, el lactosa-ureido alcanza el colon sin modificación, porque el enlace molecular entre la porción de carbohidrato y la urea en el lactosa-ureido resiste la degradación enzimática en el tracto gastrointestinal humano. Cuando el lactosa- [15N, 15N] -ureido llega al colon, es degradado a urea etiquetada con [15N,15N] a través de bacterias seleccionadas. La urea etiquetada sufre una hidrólisis rápida con producción de 15NH3 (Wutzke et al., 1997). El NH3 etiquetado se mezcla con el amoniaco presente en el colon, y como consecuencia, las variaciones observadas en la medición etiquetada con 15N reflejan el destino del NH3 colónico total.

Además de monitorear el metabolismo del NH3 colónico, se midió la presencia de fenol y de p-cresol en la orina como sellos de la fermentación bacterial de las proteinas en el colon. Con base en los datos de la literatura (Evenepoel et al., 1999=, se asume que en circunstancias fisiológicas cerca del 3 al 6% de las proteinas ingeridas permanecen sin digerir. Cuando las proteinas no diferidas llegan al colon, son fermentadas por la flora colónica. La fermentación bacterial del aminoácido tirosina da como resultado la producción de fenol y p-cresol. Estos compuestos son grandemente absorbidos desde el colon, destoxificados en la mucosa y en el higado (por conjugación de glucurónido- y sulfato-) y finalmente excretados en la orina. Dado que el fenol y el cresol se originan exclusivamente a partir del metabolismo bacterial y no del metabolismo humano, la salida urinaria de fenol y p-cresol refleja la producción bacterial de estos compuestos en el colon (Smith y Macfarlane, 1996) . Como consecuencia, cualquier influencia de los compuestos prebióticos en la fermentación colónica de la proteina deberla reflejarse en la concentración urinaria de fenol y p-cresol.

El segundo experimento en humanos se realizó en 9 voluntarios sanos (3 hombres y 3 mujeres, escala de edad de 19-26 años) . Cada voluntario recibió 5 diferentes comidas de prueba que contenían diferentes dosis de AXOS-15-0.27 con un intervalo de 1 semana entre cada comida de prueba. Las diferentes dosis de AXOS-15-0.27 por dia fueron cualquiera de 0, 0.35 g (0.24 g) , 1.05 g (0.73 g) , 3.17 g (2.21 g) y 7 g (4.88 g) , siendo los valores entre paréntesis los pesos corregidos para el AXOS con base en el contenido de AX y el contenido de humedad de la preparación. El orden en el que los voluntarios recibieron las comidas de prueba fue aleatorio. La comida de prueba consistía de un panqué (15.8 g de proteinas, 11.6 g de grasa y 21.1 g de carbohidratos; 225 kcal) que contenia 75 mg del substrato lactosa- [15N, 15N] -ureido etiquetado con el isótopo estable, 185 kBq de glicol polietileno etiquetado con tritio (3H-PEG) y AXOS-15-0.27 a la dosis apropiada, el 3H-PEG se usó como marcador para el tiempo de tránsito oro-fecal (Geboes et al., 2005).

Se colectó la orina en recipientes a los que se añadió 1 gramo de neomicina para prevenir el desarrollo bacterial. Se colectó una muestra de orina basal antes del consumo de la comida de prueba. Después de la ingesta de cada comida de prueba, se realizó una colecta de orina de 48 h en 3 diferentes fracciones: 0-6 h, 6-24 h, y 24-48 h. Después de medir el volumen de orina, se tomaron muestras y se almacenaron a -20°C hasta el análisis. Las defecaciones se colectaron 72 h después de la comida de prueba. Las defecaciones se congelaron inmediatamente después de la evacuación, y luego se almacenaron a -20°C. Todas las defecaciones colectadas en el mismo dia se combinaron y se homogeneizaron antes del siguiente análisis. Las muestras de peso conocido fueron removidas y secadas congeladas. El material secado se pesó de nuevo, y se tomaron alicuotas para el análisis de nitrógeno y radiactividad.

Como se muestra en la Figura 15A, se notó una proporción menor de excreción de orina del nitrógeno etiquetado con 15N después de la ingesta de la comida de prueba que contenia AXOS-15-0.27 en comparación con la comida de control que no tenia AXOS-15-0.27. Se recuperó en las muestras de orina el 44.5% de la dosis de 15N administrada después del consumo de la comida de control. Esta fracción disminuyó al 40.4% (-9% con relación al control), 43.7% (-2% con relación al control), 33.1% (-26% con relación al control) y 33.6% (-25% con relación al control) después de la ingestión de 0.24, 0.73, 2.21 y 4.88 g de AXOS-15-0.27, respectivamente. La disminución en la excreción urinaria de 15N fue significativa a p<0.05 para las dosis de 2.21 y 4.88 g de AXOS-15-0.27.

A la inversa, la suplementación con AXOS-15-0.27 de las comidas de prueba causó un aumento consistente en la excreción de 15N en las heces (Figura 15B) . En el grupo de control de comida de prueba, 15.1% de la dosis de 15N administrada se recuperó en las heces. Esta fracción aumentó a 16.4% (+8% con relación al control), 18.8% (+24% con relación al control), 25.3% (+67% con relación al control), y 26.1% (+72% con relación al control) después de la ingestión de 0.24, 0.73, 2.21 y 4.88 g, respectivamente. El incremento en la excreción fecal de 15N fue significativo a p<0.05 para las dosis de 2.21 y 4.88 g de AXOS-15-0.27. El AXOS-15-0.27 no tuvo efecto en el tiempo de tránsito gastrointestinal, medido por el biomarcador 3H-PEG, a cualquiera de las dosis probadas (Figura 15 C) .

Se notó una proporción consistentemente menor de excreción urinaria de p-cresol y de fenol después de la ingesta de las comidas de prueba que contenían AXOS-15-0.27 en comparación con la comida de control que no tenía AXOS-15-0.27 (Figura 16). La fracción de p-cresol excretada via la orina disminuyó por -9%, -21%, -35% y -41% con relación al control, después de la ingestión de 0.24, 0.73, 2.21 y 4.88 g de AXOS-15-0.27 , respectivamente (Figura 16A) . La fracción de fenol excretada via la orina disminuyó por -45%, -39%, -33% y -45% con relación al control, después de la ingestión de 0.24, 0.73, 2.21 y 4.88 g de AXOS-15-0.27, respectivamente (Figura 16B) . La disminución en la excreción urinaria de fenol fue significativa a p<0.05 para todas las dosis probadas de AXOS-15-0.27, variando desde 0.24 g hasta 4.88 g. Por lo tanto, se ha demostrado que el AXOS-15-0.27 es un compuesto prebiótico en los humanos que es activo a dosis sorprendentemente bajas, abajo de 0.24 g por ración.

La reducción de la excreción urinaria de nitrógeno y el aumento concomitante de la excreción de N fecal ha sido previamente observada en humanos a los que e administraron compuestos prebióticos conocidos tales como inulina y lactulosa (De Preter et al., 2004; Geboes et al., 2005) . La excreción estimulada de amoniaco via las heces es deseable, ya que se ha demostrado que el amoniaco reduce la duración de la vida de las células epiteliales del colon, para aumentar su rotación y hacerlas más susceptibles a la carcinogénesis química (Visek 1978). El amoniaco en el lumen del colon se deriva principalmente de la fermentación bacterial de las proteinas no digeridas (Smith y Macfarlane, 1996; Fooks et al., 1999). Los carbohidratos prebióticos de fermentación lenta, tales como el AXOS con grados intermedios de polimerización, estimulan las bacterias sacaroliticas y las vías sacarolíticas en las bacterias presentes en el colon. Estos compuestos reprimen por lo tanto la fermentación proteolitica en el colon y estimulan la reutilización del amoniaco como una fuente de nitrógeno a través de las bacterias que dependen de los carbohidratos como fuente principal de carbono y de energía. En la misma linea, la reducción de la excreción urinaria de los metabolitos de fermentación de la proteina cresol y fenol es deseable, dado que estos compuestos fenólicos han sido implicados en el cáncer de intestino (Bone et al., 1976). La excreción urinaria reducida de los compuestos fenólicos ha sido observada previamente para el compuesto prebiótico lactulosa (De Preter et al., 2004). Se asume que la excreción disminuida de cresol y fenol es causada por una utilización aumentada del aminoácido tirosina o de los productos metabólicos de la putrefacción de la proteina a través de la actividad bacterial sacarolitica incrementada en el colon, estimulada por los compuestos prebióticos.

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TABLAS Tabla 1. Propiedades de diferentes preparaciones de (arabino) xilano . AX: contenido de arabinoxilano expresado como % del material seco; A/X: relación de arabinosa a xilosa; avDPGc: grado promedio de polimerización, determinado por cromatografía líquida de gas; avDPHpsEc grado promedio de polimerización, determinado por cromatografía de exclusión de tamaño de alto rendimiento. Escala DP 90%: escala de grados de polimerización dentro de la cual cae el 90% de los oligosacáridos. 3 X = 0 . 88 ( % arabinosa + % xi losa ] DavDPHSEc = MMHPSEC/ 1 32 CN . D . = No Determinado dAXCOr = 0 . 88 x . arabinosa - 0.7 x % galactosa + % xilosa) "A/Xcor — (! arabinosa - 0.7 x % galactosa) /% xilosa Tabla 2. Concentraciones de diferentes compuestos usados para las pruebas de análisis sensorial .

Tabla 3. Viscosidad intrínseca aparente (dl/g) de una solución al 5% (p/v) de diferentes oligosacáridos Viscosidad intrínseca aparente (dl/g) FOS (Raftilose) 0.037 Xylooligo-95P 0.045 AXOS-15-0.27 0.515 AXOS-39-0.22 0.281 AXOS-13-0.21 0.130 Tabla 4 : Ultrafiltración de preparación de AXOS pasando a través de una única membrana con un MMCO de cualquiera de 5 kDa, 10 kDa, ó 30 kDa. La recuperación se expresa como % del contenido de arabinoxilano del material de inicio. Los análisis incluyen la relación de arabinosa a xilosa (A/X) , y el grado promedio de polimerización determinado por cromatografía líquida de gas (avDPGC) .

Fracción Recuperación A/X avDPGC AXOS antes de ultrafiltración 100% 0.50 8 AXOS en permeado de membrana 11.2% 0.24 3 de 5 kDa AXOS en retenido de membrana 86.1% 0.55 11 de 5 kDa AXOS en permeado de membrana 34.2% 0.33 5 de 10 kDa AXOS en retenido de membrana 64.8% 0.58 12 de 10 kDa AXOS en permeado de membrana 52.4% 0.40 6 de 30 kDa AXOS en retenido de membrana 45.7% 0.61 de 30 kDa 15 Tabla 5. Ultrafiltración de preparación AXOS pasando consecutivamente a través de membranas de 10 kDa y de 30 kDa. La recuperación se expresa como % del contenido de arabinoxilano del material de inicio. Los análisis incluyen la relación de arabinosa a xilosa (A/X) , y el grado promedio de polimerización determinado por cromatografía líquida de gas (avDPGc) • Tabla 6. Materiales del alimento y análisis de la composición de la dieta de alimentación de los pollos usada en el segundo experimento con pollos .

Tabla 7. Análisis de la composición de la ' dieta básica humanizada' usada en experimentos con ratas.

Claims

REIVINDICAC IONES

1. Producto de alimento o bebida que modula la flora intestinal, que comprende entre 0.25 y 5 g de arabinoxilanos por ración del producto de alimento o bebida, donde los arabinoxilanos tienen un grado promedio de polimerización (DP) de entre 5 y 50.

2. Producto de alimento o bebida de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende entre 1 y 3 g de los arabinoxilanos por ración del producto de alimento o bebida .

3. Producto de alimento o bebida de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, donde los arabinoxilanos tienen un DP promedio de entre 7 y 40.

4. Producto de alimento o bebida de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, donde los arabinoxilanos tienen un DP promedio de entre 7 y 20.

5. Producto de alimento o bebida de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, donde los arabinoxilanos se derivan de material de planta que contiene arabinoxilano.

6. Producto de alimento o bebida de acuerdo con la reivindicación 5, donde el material que contiene arabinoxilano es material derivado de cereal.

7. Producto de alimento o bebida de acuerdo con la reivindicación 6, donde el cereal se deriva del grupo consistente de trigo, cebada, centeno, avena, maíz, sorgo y arroz.

8. Producto de alimento o bebida de acuerdo con las reivindicaciones 6 6 7, donde el material de cereal es salvado, harina o enjugado.

9. Producto de alimento o bebida de acuerdo con las reivindicaciones 6 ó 7, donde los arabinoxilanos son derivados de una corriente lateral del procedimiento de separación gluten-fécula.

10. Producto de alimento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9, donde el producto de alimento es un producto de carne.

11. Producto de alimento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9, donde el producto de alimento es un producto lácteo.

12. Bebida de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9, donde la bebida es una bebida no alcohólica.

13. Bebida de acuerdo con la reivindicación 12, donde la bebida es una bebida suave funcional.

14. Producto de alimento o bebida de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13, donde el producto de alimento comprende bacterias vivas del género Bifidobacterium o Lactobacillus .

15. Producto de alimento o bebida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde el producto de alimento es un producto de alimento no basado en cereal.

16. Producto de alimento de acuerdo con la reivindicación 1, donde el producto de alimento es un producto de alimento con base de cereal que comprende entre 0.25 y 5 g de arabinoxilanos con un DP por debajo de 200 por ración del producto, y donde la población de arabinoxilanos tiene un DP promedio de entre 5 y 50.

17. Producto de alimento con base de cereal de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende entre 1 y 3 g de arabinoxilanos con un DP por debajo de 200 por ración del producto, y donde la población de arabinoxilanos tiene un DP promedio de entre 5 y 50.

18. Producto de alimento con base de cereal de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende entre 0.25 y 5 g de arabinoxilanos con un DP por debajo de 200 por ración del producto, y donde la población de arabinoxilanos tiene un DP promedio de entre 7 y 40.

19. Producto de alimento con base de cereal de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende entre 1 y 3 g de arabinoxilanos con un DP por debajo de 200 por ración del producto, y donde la población de arabinoxilanos tiene un DP promedio de entre 7 y 40. 20. Producto de alimento con base de cereal de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende entre 0.25 y 5 g de arabinoxilanos con un DP por debajo de 200 por ración del producto, y donde la población de arabinoxilanos tiene un DP promedio de entre 7 y

20.

21. Producto de alimento con base de cereal de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende entre 1 y 3 g de arabinoxilanos con un DP por debajo de 200 por ración del producto, y donde la población de arabinoxilanos tiene un DP promedio de entre 7 y 20.

22. Producto de alimento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, donde el producto de alimento es un producto de panadería.

23. Producto de alimento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, donde el producto de alimento es un producto de pastelería.

24. Producto de alimento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, donde el producto de alimento es un cereal para el desayuno.

25. Producto de alimento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, donde el producto de alimento es un bizcocho.

26. Producto de alimento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, donde el producto de alimento es un producto de pasta.

27. Producto de alimento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, donde el producto de alimento es un producto de postre preparado industrialmente .

28. Producto de alimento o bebida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, donde el producto de alimento o bebida es un producto bajo en calorías .

29. Método para la preparación de un aditivo nutricional para ser usado como un aditivo en la preparación de un producto de alimento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, que comprende los pasos de: (i) aislar la fracción no extractable en agua del arabinoxilano a partir de un material rico en arabinoxilano, tal como salvado, harina de semilla o enjugado de semilla, a través del desfeculado y el desproteinado del material rico en arabinoxilano, preferiblemente usando enzimas amiloliticas y proteolíticas, respectivamente; (ii) despolimerizar la fracción no extractable en agua del arabinoxilano usando una o más enzimas xilanoliticas.

30. Método para la preparación de un aditivo nutricional para ser usado como un aditivo en la preparación de un producto de alimento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, que comprende los pasos de: (i) obtener una preparación que contenga arabinoxilano extractable en agua parcialmente despolimerizado, tal como una preparación obtenida de una corriente lateral del procedimiento de separación fécula-gluten; (ii) si es necesario, eliminar la fécula y las proteinas de la preparación que contiene arabinoxilano, preferiblemente usando enzimas amiloliticas y proteoliticas, respectivamente; (iii) despolimerizar los arabinoxilanos contenidos en la preparación, usando una o más enzimas xilanoliticas.

31. Método de acuerdo con las reivindicaciones 30 ó 31, donde la preparación se somete a filtración por membrana, tal como ultrafiltración, después del tratamiento con las enzimas xilanoliticas, para remover los compuestos con bajo peso molecular.

32. Aditivo nutricional para ser usado como un aditivo en la preparación de un producto de alimento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, donde el aditivo comprende al menos 15% de arabinoxilanos con un DP promedio de entre 7 y 20.

33. Aditivo nutricional de acuerdo con la reivindicación 32, que comprende más del 30% de arabinoxilanos .

34. Aditivo nutricional de acuerdo con las reivindicaciones 32 ó 33, que comprende más del 60% de arabinoxilanos .

35. Aditivo nutricional de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, donde 90% de los arabinoxilanos tienen un DP de entre 2 y 650.

36. Aditivo nutricional de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, donde 90% de los arabinoxilanos tienen un DP de entre 2 y 130.

37. Uso de una preparación de arabinoxilano que comprende moléculas de arabinoxilano con un DP promedio que varia entre 5 y 50, como un aditivo de alimento en la producción de un alimento o bebida, que comprende entre 0.25 y 5 g de arabinoxilanos por ración del alimento o la bebida .

38. Uso de una preparación de arabinoxilano de acuerdo con la reivindicación 37, donde la preparación de arabinoxilano comprende al menos 15% (v/v) de moléculas de arabinoxilano.

39. Uso de la preparación de arabinoxilano de acuerdo con las reivindicaciones 37 ó 38, en la preparación de un alimento o bebida que comprende entre 1 y 3 g de arabinoxilanos por ración del alimento o de la bebida. 40. Uso de la preparación de arabinoxilano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, donde el aditivo de alimento comprende arabinoxilanos con un DP promedio que varia entre 7 y

40.

41. Uso de la preparación de arabinoxilano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, donde el aditivo de alimento comprende arabinoxilanos con un DP promedio que varia entre 7 y 20.

42. Uso de la preparación de arabinoxilano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41, donde el alimento es un producto de carne.

43. Uso de la preparación de arabinoxilano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41, donde el alimento es un producto lácteo.

44. Uso de la preparación de arabinoxilano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41, donde la bebida es una bebida no alcohólica.

45. Uso de la preparación de arabinoxilano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41, donde el alimento es un producto que contiene cereal, además de comprender una población de arabinoxilanos con un DP mayor a 200.

46. Uso de la preparación de arabinoxilano de acuerdo con la reivindicación 45, donde el producto de alimento es un producto de panadería o pastelería.

47. Uso de la preparación de arabinoxilano de acuerdo con la reivindicación 45, donde el producto de alimento es un producto de pasta, un bizcocho o un cereal para desayuno.

48. Uso de la preparación de arabinoxilano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43 ó 44, donde el producto de alimento o bebida comprende una bacteria viva del género Bifidobacterium o Lactobacillus.