CN1980579B - 益生素制品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能有益调节人体肠道菌群的含有阿糖基木聚糖的营养添加剂。此外，提供了一些含有这种添加剂的几种食品和饮品以及制备所述添加剂的方法。

Description

益生素制品
发明领域
本发明涉及用作益生素(prebiotic)营养添加剂的阿糖基木聚糖制品以及通过在膳食中添加所述添加剂来改善人类肠胃道健康的方法。在优选的实施方案中，所述阿糖基木聚糖制品衍生自天然来源，如植物材料，更优选来自谷物。
发明背景
本发明涉及具有给定的非淀粉多糖(NSP)的食物肠胃健康状况、更具体地说是肠道微生物群的有益效果。NSP包括具有不同物理化学性质的化合物。阿糖基木聚糖是一类重要的谷类NSP，它也称作戊聚糖，它由连接O-2和/或O-3 α-L-阿拉伯呋喃糖基单元的β-1，4-连接的D-吡喃木糖基单元的主链组成。在一种典型的阿糖基木聚糖中，会出现未取代的、一取代和二取代的木糖残基(参见图1)。阿糖基木聚糖是水可提取的或水不可提取的。后者在碱性条件下或使用酶的情况下会部分溶解并与大量水结合。水可提取的阿糖基木聚糖具有形成不寻常的粘度的趋势。通常，视来源和提取方法的不同，其分子量会非常高(最高达800,000道尔顿)。尽管它们仅是次要成分，但它们对于谷类在生物技术工艺过程中的功能如制造小麦淀粉、意大利面和啤酒、面包制造和其它食品应用来说是重要的。
衍生自阿糖基木聚糖或木聚糖(未取代的β-1，4-连接的D-吡喃木糖基单元的聚合物)的一些类型的寡糖已经显示出益生素特性。益生素是不被上胃肠道的酶消化但被大肠中某些类型的肠道细菌选择性发酵的化合物，通常是非糖苷寡糖(Gibson和Roberfroid，1995；Roberfroid，1988；Van Loo，2004)。饮食中存在益生素能改变肠道菌群的组成，通常表现为乳酸菌和双歧杆菌增加。肠道微生物的这种改变能提高总体健康状况、减少内脏感染、增加肠短链脂肪酸水平、更好地吸收矿物质以及抑制结肠癌的发生(Van Loo，2004)。
以聚合度(DP)为2-3的寡糖(木二糖(xylobiose)和木三糖(xylotriose))为主的木寡糖(xylo-oligosaccharide)(XOS，由β-1，4-连接的D-吡喃木糖基单元构成的寡糖)制品已显示可显著提高大鼠粪便和盲肠(EP 0265970B1；Campbell等，1997；Hsu等，2004)以及人结肠(Okazaki等，1990)内双歧杆菌的水平。这种富含木二糖的XOS制品还能抑制大鼠中化学物质诱导的结肠癌变的早期症状(Hsu等，2004)及提高钙的吸收(Toyoda等，1993)。主要由DP为3-5的阿糖基木寡糖(AXOS)(阿糖基木二糖、阿糖基木三糖、阿糖基木四糖(xylotetraose)和二阿糖基木四糖)构成的制品也显示可提高大鼠和小鼠肠道中双歧杆菌的水平(Yamada等，1993)。
严重限制现有XOS制品商业潜力的一个主要缺点是相比其它寡糖而言现有XOS制品价格过高，这说明目前的制造方法不够经济。已经描述过的制造主要由DP为2-3的XOS构成的益生素制品的方法包括，用NaClO溶液和高度浓缩的KOH溶液从植物基产品(硬木、玉米棒、棉籽皮、小麦麸皮或酿过酒的谷物)化学提取木聚糖，然后用木聚糖内切酶酶解提取的木聚糖(EP 0265970B1)。一种类似的用来制造AXOS益生素制品(DP为3-5的AXOS制品)的方法包括用浓碱溶液化学提取阿糖基木聚糖，然后除去盐，用木聚糖内切酶酶解，然后在碳柱上层析(Yamada等，1993)。这些方法的主要缺点是，化学提取木聚糖或阿糖基木聚糖对环境不利，并且需要通过大量透析或超滤这样的花费巨大的过程除去化学物质，然后才能进行酶解。制造XOS或AXOS的另一种方法涉及热水自动水解硬木或酿过酒的谷物。在这种方法中，植物材料的悬浮液在专用反应器中150-190℃下加热20-60分钟(EP 0265970Bl；Kabel等，2002；Carvalheiro等，2004)。这种方法的缺点在于，由于反应温度高，因此会产生食品中不受欢迎的副产物，如糠醛、羟甲基糠醛和乙酰丙酸(Carvalheiro等，2004)。
现有XOS和AXOS益生素制品的平均聚合度为2(EP 0265970B1)或4(Yamada等，1993)。当用于食品时这些制品有一些缺点。首先，这些制品富含木糖，木糖的甜度约为蔗糖的60％(Suntory，木寡糖说明书和产品单，2001)。一些用途可能需要甜味，但其它用途需要更加中性的味道。平均聚合度低的木寡糖的甜度为蔗糖的40％(Suntory，木寡糖说明书和产品单，2001)。其次，平均聚合度低的制品的能量水平无法满足低卡路里食品成分的要求。为计算木寡糖的能量值，认为每克木糖的可代谢能量值为4卡路里，每克木二糖和木三糖为2卡路里，每克DP＞4的木糖基-阿糖基-寡糖为0卡路里(Suntory，木寡糖说明书和产品单，2001)。
发明概述
本发明涉及能有益调节人体肠道菌群的含有阿糖基木聚糖的营养添加剂。此外，提供了一些含有这种添加剂的食品和饮品以及制备所述添加剂的方法。
发明详述
附图说明
图1：阿糖基木聚糖的结构元素。A：未取代的β-D-吡喃木糖基残基；B：在O-2位上被α-L-阿拉伯呋喃糖基部分取代的β-D-吡喃木糖基残基；C：在O-3位上被α-L-阿拉伯呋喃糖基部分取代的β-D-吡喃木糖基残基；D：在O-2和O-3位上被α-L-阿拉伯呋喃糖基部分取代的β-D-吡喃木糖基残基。结构C显示了阿魏酸与α-L-阿拉伯呋喃糖基残基的O-5位连接的情况。
图2：不同AXOS制品的HPSEC分子量分布。柱为Shodex SB-806 HQ(300×8mm，Showa，Denko K.K.，东京，日本)。分子量为78.8×104、40.4×104、21.2×104、11.2×104、4.73×104、2.28×104、1.18×104、0.59×104 Da的支链淀粉标准品和葡萄糖(180 Da)的洗脱体积从左到右用“x”符号指出。
图3：在100℃和pH 2、3、7和11下培育不同时间后AXOS-15-0.27(A)、Xylooligo-95P(B)和果寡糖(fructo-oligosaccharide)(C)的组成单糖的降解百分比。
图4：在100℃和pH 2、3和7下培育不同时间后AXOS-15-0.27(A)、Xylooligo-95P(B)和果寡糖(C)的水解百分比。
图5：在100℃和pH 2、3和7下培育不同时间后AXOS-15-0.27中木糖键(A)和阿拉伯糖键(B)的水解百分比。
图6：AXOS-15-0.27、Xylooligo-95P和蔗糖的甜度。曲线显示了评定员(n＝20)给出的累积甜味百分比与化合物浓度(克/升)的绘图。
图7：将木聚糖内切酶处理刮浆淀粉(或称刮浆，squeegee)WU-AX制得的AXOS超滤后获得的寡糖组分的HPSEC分子量分布。所用膜的MMCO为5 kDa(图A)、10kDa(图B)和30kDa(图C)。柱为Shodex SB-802.5 HQ(300×8mm，Showa，Denko K.K.，东京，日本)。分子量标记为分子量为11.2×104、4.73×104、2.28×104、1.18×104和0.59×104Da的Shodex标准P-82支链淀粉，分子量为810(DP6)、678(DP5)、546(DP4)、414(DP3)和282 Da(DP2)的木寡糖标准品，分子量为180 Da的葡萄糖，它们各自的洗脱体积从左到右用“x”符号指出。
图8：将木聚糖内切酶处理刮浆淀粉WU-AX制得的AXOS依次通过MMCO为10kDa和30kDa的膜超滤后获得的寡糖组分的HPSEC分子量分布。分析的组分是10kDa膜的保留物通过30kDa MMCO后的保留物(RET10kDa+30kDa)、10kDa膜的保留物通过30kDa MMCO后的通过物(PER10kDa+30kDa)、或是通过10kDa膜的通过物(PER10kDa)。柱为Shodex SB-802.5 HQ(300×8mm，Showa，Denko K.K.，东京，日本)。分子量标记为分子量为11.2×104、4.73×104、2.28×104、1.18×104和0.59×104 Da的Shodex标准P-82支链淀粉，分子量为810(DP6)、678(DP5)、546(DP4)、414(DP3)和282 Da(DP2)的木寡糖标准品，分子量为180 Da的葡萄糖，它们各自的洗脱体积从左到右用“x”符号指出。
图9：在鸡饲料中添加AXOS-7-0.34、AXOS-122-0.66或Xylooligo-95P对鸡盲肠中微生物群的影响。试验开始后分别在第1和2周通过肠杆菌科和双歧杆菌科平板计数确定盲肠微生物群的组成。柱表示测量平均值，误差棒表示标准差。根据Tukey检验可知，在给定的时间点上用不同字母表示的值相互之间显著不同(p＜0.05)。
图10：在鸡饲料中添加0.1％或0.25％AXOS-15-0.27、0.25％或1％果寡糖(FOS)或者木聚糖内切酶14天后对鸡盲肠中双歧杆菌数目的影响。通过定量PCR测定双歧杆菌属的细菌。根据最小显著性差异检验(least significance difference test)可知，用不同字母表示的值相互之间显著不同(p＜0.05；n＝3)。柱表示测量平均值，误差棒表示标准差。
图11：在大鼠饮食中添加0.25％AXOS-8-0.27、AXOS-15-0.27、AXOS-16-0.78或AXOS-122-0.66喂养13天后对大鼠粪便中乙酸(上图)、丙酸(中图)和丁酸(下图)水平的影响。根据最小显著性差异检验可知，用不同字母表示的值相互之间显著不同(p＜0.05；n＝4)。柱表示测量平均值，误差棒表示标准差。
图12：在大鼠饮食中添加4％AXOS-15-0.27或Xylooligo-95P喂养14天后对大鼠近侧结肠内乙酸(A)、末端结肠内乙酸(B)、末端结肠内丙酸(C)和末端结肠内丁酸(D)水平的影响。柱表示测量平均值，误差棒表示标准差。
图13：在大鼠饮食中添加4％AXOS-15-0.27或Xylooligo-95P喂养14天后对盲肠内双歧杆菌水平的影响。通过定量PCR测定双歧杆菌属的细菌。根据最小显著性差异检验可知，用不同字母表示的值相互之间显著不同(p＜0.05；n＝4)。柱表示测量平均值，误差棒表示标准差。
图14：14天内摄入4.88克/天AXOS-15-0.27或4.81克/天WPC对健康人类志愿者粪便内双歧杆菌数目的影响。通过定量PCR测定双歧杆菌属的细菌。柱表示测量平均值，误差棒表示标准差。根据Wilcoxon符号秩检验可知，用星号表示的柱与基础水平显著不同(p＜0.05；n＝5)。
图15：摄入一次AXOS-15-0.27(0.24、0.73、2.21或4.88g)对尿(A)和粪便(B)中氮排泄及对口-盲肠通过时间(C)的影响。氮排泄表示为摄入试验膳食后0-48小时和0-72小时内分别收集的尿或粪便样品中回收的所给予15N-标记的氮的百分比。口-盲肠通过时间表示为0-72小时内收集的粪便样品中所给予的3H-标记的PEG的百分比。柱表示测量平均值，误差棒表示标准差。根据Wilcoxon符号秩检验可知，用一个星号或两个星号表示的柱与对照处理显著不同，分别为p＜0.05(n＝9)和p＜0.01(n＝9)。
图16：摄入一次AXOS-15-0.27(0.24、0.73、2.21或4.88g)对尿中对甲酚(A)和苯酚(B)排泄的影响。对甲酚和苯酚排泄表示为摄入试验膳食后0-24小时内收集的尿样中回收的对甲酚和苯酚总量(毫克)。柱表示测量平均值，误差棒表示标准差。根据Wilcoxon符号秩检验可知，用一个星号或两个星号表示的柱与对照处理显著不同，分别为p＜0.05(n＝9)和p＜0.01(n＝9)。
描述
已经描述了在饲料或食品中添加特定阿糖基木聚糖制品的益生素效应。更具体地说，现有技术提供了平均聚合度(DP)低于4的木糖基-阿糖基-寡糖和含有天然形成的长链阿糖基木聚糖的阿糖基木聚糖制品产双歧杆菌(bifidogenic)效应的例子。市售的木糖基-阿糖基-寡糖制品是在剧烈且不受控的解聚条件下制得的，这导致存在相对高水平具有甜味的木糖和短的木寡糖。这些制品的甜味使它们不能用于特定食品。此外，DP低于4的木糖基-阿糖基-寡糖分子具有代谢能，这使得它们无法用于低卡路里食品。
天然形成的阿糖基木聚糖的理化性质如高粘性和高保水性使它们不适合广泛用于食品。天然阿糖基木聚糖的部分解聚改善了它们的理化性质，已经描述了含有平均DP约为58的阿糖基木聚糖分子的制品。然而，只在相对较高剂量时证实了这些部分解聚的阿糖基木聚糖在人类中的益生素作用(每天＞6克；Grasten等，2003)。
本发明基于以下发现，即含有平均DP在5和50之间的阿糖基木聚糖的阿糖基木聚糖制品当给予人类和作为人类模型的试验动物时是有效的益生素。此外，这种制品没有含天然阿糖基木聚糖或短链木糖基-阿糖基-寡糖的制品的理化或感官缺点。还发现，在人类、大鼠和鸡中，本发明的阿糖基木聚糖制品的产双歧杆菌效应强于含平均DP为58或更高的部分解聚的阿糖基木聚糖的制品。此外，发现本发明的阿糖基木聚糖制品主要在结肠末端发挥其益生素作用，而短链木寡糖在结肠近侧部分活性更强。这一发现非常重要，因为看上去末端结肠内的菌群组成与结肠疾病更具体是结肠癌之间有一定关系。除了益生素效应，使用本发明的阿糖基木聚糖制品还有其它有益效果，如减少尿氮排泄同时增加粪便氮排泄，以及减少尿中甲酚和苯酚的排泄。
因此，在本发明的第一个方面，提供了一种用作食品添加剂或作为营养补充品基础的阿糖基木聚糖制品。这种阿糖基木聚糖制品的特征在于，所述制品中所含阿糖基木聚糖分子的平均DP在5和50之间。在优选的实施方案中，所述阿糖基木聚糖制品含有至少15％所述阿糖基木聚糖分子。在更优选的实施方案中，该制品含有30％以上所述阿糖基木聚糖，例如60％以上。在更优选的实施方案中，本发明制品中所含阿糖基木聚糖的平均DP在7和40之间，更优选在7和20之间。通过高效尺寸排阻色谱(HPSEC)测得，本发明制品中所含阿糖基木聚糖的90％的DP优选在2和650之间，更优选在2和130之间。
在优选的实施方案中，本发明的阿糖基木聚糖制品获自天然来源，如植物材料，更优选来自谷物。它们可以是所述天然阿糖基木聚糖的选择组分，或者可通过所述天然阿糖基木聚糖降解或发酵获得，或者它们可以是通过化学、酶和/或物理方法制得的结构类似物。在优选的实施方案中，所述阿糖基木聚糖制品衍生自面筋-淀粉分离过程的侧流(side-stream)，如WPC(Pfeifer & Langen)。在另一优选实施方案中，所述阿糖基木聚糖制品衍生自谷物麸皮。
以每份0.25克的剂量通过食物给予本发明的阿糖基木聚糖制品时观察到了益生素效应。因此，在本发明的第二个方面，提供了一种含有本发明阿糖基木聚糖制品的食品或饮品。在优选的实施方案中，所述食品或饮品每份含有0.1-5克本发明的阿糖基木聚糖制品。在更优选的实施方案中，所述食品或饮品每份含有0.25-5克本发明的阿糖基木聚糖制品。在更优选的实施方案中，所述食品或饮品每份含有1-3克本发明的阿糖基木聚糖制品。在另一优选实施方案中，所述食品或饮品每份含有0.1-5克平均DP在5和50之间的阿糖基木聚糖。在更优选的实施方案中，所述食品或饮品每份含有0.25-5克平均DP在5和50之间的阿糖基木聚糖。在更优选的实施方案中，所述食品或饮品每份含有1-3克平均DP在5和50之间的阿糖基木聚糖。如上所述，本发明的阿糖基木聚糖制品特别适合作为低卡路里食品的有益添加剂。
在一具体实施方案中，所述食品是乳制品，如酸奶或新鲜奶酪。优选地，每100克所述乳制品(一份为125克)含有0.25-5克，更优选1-3克，平均DP在5和50之间的阿糖基木聚糖。所述乳制品任选含有能够发酵阿糖基木聚糖的双歧杆菌属或乳酸菌属的活细菌。在另一具体实施方案中，本发明的饮料也称为非酒精功能性软饮料。优选地，每100毫升这种功能性软饮料含有0.25-5克，更优选1-3克，平均DP在5和50之间的阿糖基木聚糖。或者，所述功能性软饮料在250毫升中含有所需量的这种阿糖基木聚糖。在一具体实施方案中，所述功能性软饮料含有能够发酵阿糖基木聚糖的双歧杆菌属或乳酸菌属的活细菌。
通常，含有谷物或谷物衍生的材料作为组分的食品含有阿糖基木聚糖。然而，这些食品中所含的阿糖基木聚糖要么是DP超过6000的长链天然阿糖基木聚糖，要么是DP为至少200-300的部分解聚的阿糖基木聚糖。因此，使所述食品富含本发明的阿糖基木聚糖还提高了它们的营养价值。优选地，这种富集是在含谷物食品的制造过程中添加给定量本发明的阿糖基木聚糖制品实现的。显然，这种富集导致含谷物食品除了含有DP为200或更高的阿糖基木聚糖外，还含有DP低于200的阿糖基木聚糖群体(以平均DP在5和50之间为特征)。精通本领域的技术人员将了解，可在这些食品的制造过程中在适当条件下采用木聚糖分解酶(xylanolitic enzyme)至少部分实现使含谷物食品富含所述DP低于200的阿糖基木聚糖群体。在一具体实施方案中，所述食品是烘烤制品，如面包。优选地，每100克所述面包富含0.25-5克，更优选1-3克，平均DP在5和50之间的阿糖基木聚糖。在另一实施方案中，所述食品是油酥皮(pastry)制品，如蛋糕。优选地，每100克所述油酥皮制品富含0.25-5克，更优选1-3克，平均DP在5和50之间的阿糖基木聚糖。再在另一实施方案中，所述食品是意大利面制品。优选地，每80克所述意大利面制品富含0.25-5克，更优选1-3克，平均DP在5和50之间的阿糖基木聚糖。再在另一实施方案中，所述食品是早餐谷物。优选地，每30克所述早餐谷物富含0.25-5克，更优选1-3克，平均DP在5和50之间的阿糖基木聚糖。再在另一实施方案中，所述食品是饼干，例如干早餐饼干。优选地，每125克所述饼干富含0.25-5克，更优选-3克，平均DP在5和50之间的阿糖基木聚糖。
本发明的阿糖基木聚糖制品也可有益地加入其它食品，例如但不限于，绞肉制品、巧克力、曲奇、面包棒和甜点如布丁。
在本发明的第三个方面，提供了一种含有本发明的阿糖基木聚糖制品的食品补充品。在优选的实施方案中，所述食品补充品是胶囊、药片、粉末等。在更优选的实施方案中，所述食品补充品被制成每日给予0.1-5克，更优选0.25-5克，例如1-3克平均DP在5和50之间的阿糖基木聚糖。
在本发明的第五个方面，提供了一种制造本发明的阿糖基木聚糖制品的方法。该方法的第一个实施方案包括以下步骤：
i.通过使富含阿糖基木聚糖的材料如麸皮、小麦面粉或小麦刮浆淀粉脱淀粉化(destarchification)和脱蛋白质化(deproteinisation)从富含阿糖基木聚糖的材料分离水不可提取的阿糖基木聚糖组分，优选分别采用淀粉分解酶和蛋白水解酶；
ii.用一种或多种木聚糖分解酶解聚水不可提取的阿糖基木聚糖组分。该方法的第二个实施方案包括以下步骤：
i.获得部分解聚的水可提取的含阿糖基木聚糖的制品，如获自淀粉-面筋分离过程测流的制品；
ii.需要的话从所述含阿糖基木聚糖的制品除去淀粉和蛋白质，优选分别采用淀粉分解酶和蛋白水解酶；
iii.用一种或多种木聚糖分解酶解聚所述制品中所含的阿糖基木聚糖。
在一具体实施方案中，用木聚糖分解酶处理之后将所述制品超滤以降低所述制品中单糖和DP为4或更低的寡糖的含量。
在本发明的最后一个方面，提供了一种分析含谷物食品中DP小于200的阿糖基木聚糖群体的浓度和平均DP的方法。所述方法包括以下步骤：
i.研磨含谷物食品的样品，优选在干燥或冻干所述样品之后进行研磨；
ii.用蒸馏水提取研磨过的样品；
iii.在适当条件下用淀粉分解酶处理提取物，以将所有淀粉转化成葡萄糖，例如在淀粉葡萄糖苷酶处理之后进行淀粉酶处理；
iv.除去(iii)所得样品中的葡萄糖，例如用酵母代谢葡萄糖；
v.确定(iv)所得样品中所含阿糖基木聚糖的分子量分布，优选采用高效液相色谱(HPLC)；
vi.计算DP＜200的阿糖基木聚糖组分的相对量和平均DP，例如通过分析HPLC曲线下的面积。
下面将参照下述实施方案来进一步描述本发明。
示例性实施方案
实施例
实施例1：制备平均DP＞4的XOS/AXOS
材料和方法
Xylooligo-95P。主要由木二糖、木三糖和木四糖构成的市售木寡糖制品Xylooligo-95P获自Suntory Ltd.(东京，日本)。
从小麦麸皮制备水不可提取的阿糖基木聚糖。为制备麸皮中水不可提取的阿糖基木聚糖(WU-AX)，将市售小麦麸皮(Meneba Meel BV，鹿特丹，荷兰)用作原料。按照Maes等(2004)描述的方法通过酶处理部分除去麸皮中的非阿糖基木聚糖。小麦麸皮与水(1∶7w/v)的悬浮液先用耐热α-淀粉酶(Termamyl 120LS，Novozymes，Bagsvaerd，丹麦；1μl/g小麦麸皮)在90℃处理90分钟以水解淀粉。冷却至50℃后用浓HCl将悬浮液的pH调至6.0并将悬浮液与蛋白酶（Neutrase 0.8L，Novozymes，Bagsvaerd，丹麦；150μl/g小麦麸皮)一起在50℃培育24小时以水解剩余蛋白质。之后将悬浮液煮沸，过滤并丢弃滤液。残余物被称为“麸皮WU-AX”，用水洗涤并空气干燥。
从小麦面粉或小麦刮浆淀粉(squeegee starch)制备水不可提取的阿糖基木聚糖。采用标准方法(McRitchie，1985)可将小麦面粉分成4种不同组分：A-淀粉(初淀粉(primestarch))、B-淀粉(刮浆淀粉或尾粉(tailing))、面筋和水溶性组分。WU-AX集中在刮浆淀粉组分中。通过酶处理从刮浆淀粉组分中部分除去非阿糖基木聚糖材料。首先，将刮浆淀粉与水的悬浮液(1∶6w/v)用耐热α-淀粉酶(Termamyl 120LS，Novozymes，Bagsvaerd，丹麦，30μl/g刮浆淀粉)在90℃处理60分钟，用淀粉葡萄糖苷酶(Megazyme，Bray，爱尔兰，20μl/g刮浆淀粉)在60℃处理16小时以水解淀粉。煮沸30分钟并离心，然后将残余物与蛋白酶(Neutrase 0.8L，Novozymes，Bagsvaerd，丹麦；20μl/g刮浆淀粉)一起在50℃培育20小时以水解剩余蛋白质。之后再次将悬浮液煮沸(30分钟)，过滤并丢弃滤液。残余物被称为“面粉WU-AX”，用水、乙醇(95％v/v)洗涤并空气干燥。除了可从小麦淀粉提取WU-AX，也可从小麦刮浆淀粉中直接分离WU-AX。此时将市售的工业上淀粉-面筋分离过程的测流产品Meritena233(Tate & LyIe，Aalst，比利时)用作原料。然后，将Meritena 233与水的悬浮液(1∶5w/v)用耐热α-淀粉酶(Termamyl 120LS，Novozymes，Bagsvaerd，丹麦，30μl/g Meritena233)在90℃处理60分钟，用淀粉葡萄糖苷酶(Megazyme，Bray，爱尔兰，20μl/gMeritena 233)在60℃处理16小时以水解淀粉。煮沸30分钟并离心，然后将残余物与蛋白酶(Neutrase 0.8L，Novozymes，Bagsvaerd，丹麦；20μl/g Meritena 233)一起在50℃培育20小时以水解剩余蛋白质。之后再次将悬浮液煮沸(30分钟)，过滤并丢弃滤液。残余物被称为“刮浆淀粉WU-AX”，用水、乙醇(95％v/v)洗涤并空气干燥。
小麦戊聚糖浓缩物(WPC)。小麦戊聚糖浓缩物(WPC，Pfeifer & Langen，Dormagen，德国)衍生自小麦面粉，Courtin和Delcour(1998)已经详细描述了其化学组成。WPC富含水可提取的阿糖基木聚糖(约43％)和蛋白质(约30％)。其余部分主要由阿糖基半乳聚糖肽(约14％)和较少量的聚合葡萄糖(6％)构成。
制备avDP为122、A/X比为0.66的AXOS(AXOS-122-0.66)。制备AXOS-122-0.66的原料为市售小麦戊聚糖浓缩物(WPC，Pfeifer & Langen，Dormagen，德国)。将WPC溶于去离子水(1∶10w/v)并加入二氧化硅的水悬液(20％w/v)直至二氧化硅/蛋白质比例为7∶1。用0.1M HCl将混合物的pH调至4.8以使蛋白质最大程度地吸附到二氧化硅上。将悬浮液搅拌30分钟后通过布氏漏斗过滤。丢弃含有二氧化硅/蛋白质的残余物，滤液用乙醇沉淀。边连续搅拌边加入乙醇(95％v/v)，直到最终浓度达到65％(v/v)，之后再搅拌30分钟，静置(24小时，4℃)并过滤，所得残余物用溶剂干燥(乙醇、丙酮和二乙醚)并空气干燥。将所得物质均质并通过250μm筛筛分。
制备avDP为16、A/X比为0.78的AXOS(AXOS-16-0.78)。从市售小麦戊聚糖浓缩物(WPC，Pfeifer & Langen，Dormagen，德国)制备AXOS-16-0.78。如制备AXOS-122-0.66所述用二氧化硅处理WPC以除去蛋白质。回收的滤液再与棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的木聚糖内切酶XAA(Shearzyme 500L，Novozymes，Bagsvaerd，丹麦)一起在30℃培育24小时，每克小麦戊聚糖浓缩物使用29单位酶。通过煮沸(30分钟)将酶灭活，之后将所得溶液冷却并乙醇沉淀。边连续搅拌边加入乙醇(95％v/v)，直到最终浓度达到80％(v/v)，之后再搅拌30分钟，静置(24小时，4℃)并过滤，将所得残余物溶于去离子水并再次乙醇沉淀。边连续搅拌边加入乙醇(95％v/v)，直到最终浓度达到65％(v/v)，之后再搅拌30分钟，静置(24小时，4℃)并过滤，除去沉淀的物质。将余下的上清旋转蒸发、除去乙醇、溶于去离子水并冻干。将所得物质均质并通过250μm筛筛分。
制备avDP为7、A/X比为0.34的AXOS(AXOS-7-0.34)。制备AXOS-7-0.34的原料是如上述分离的麸皮WU-AX。随后将麸皮WU-AX与木聚糖内切酶XBS(Grindamyl H640，Danisco，丹麦)一起在30℃培育24小时，每克干燥的分离的麸皮WU-AX使用80单位酶。过滤后，通过煮沸(30分钟)将酶灭活，之后将滤液冻干，将所得物质均质并通过250μm筛筛分。
制备avDP为15、A/X比为0.27的AXOS(AXOS-15-0.27)。市售小麦麸皮(DosscheMills & Bakery，Deinze，比利时)被用作制备AXOS-15-0.27的原料。小麦麸皮与水(1∶7w/v)的悬浮液先用耐热α-淀粉酶(Termamyl 120LS，Novozymes，Bagsvaerd，丹麦；1μl/g小麦麸皮)在90℃处理90分钟以水解淀粉。冷却至50℃后用浓HCl将悬浮液的pH调至6.0并将悬浮液与蛋白酶(Neutrase 0.8L，Novozymes，Bagsvaerd，丹麦；40μl/g小麦麸皮)一起在50℃培育4小时以水解剩余蛋白质。之后将悬浮液煮沸20分钟，过滤并丢弃滤液。残余物用水洗涤并重悬于去离子水(1∶14w/v)。边连续搅拌边将悬浮液与木聚糖内切酶XBS(Grindamyl H640，Danisco，丹麦)一起在50℃培育10小时，每克去淀粉和去蛋白质的小麦麸皮使用1.4单位酶，然后加入第二次剂量木聚糖内切酶XBS再在50℃培育10小时，每克去淀粉和去蛋白质的小麦麸皮使用1.1单位酶。通过煮沸(30分钟)将酶灭活，将溶液浓缩直到降膜蒸发器中留下20％干物质，最后在喷雾干燥器中干燥。
制备avDP为8、A/X比为0.27的AXOS(AXOS-8-0.27)。AXOS-8-0.27是将AXOS-15-0.27与来自棘孢曲霉的木聚糖内切酶XAA(Shearzyme 500L，Novozymes，Bagsvaerd，丹麦)的溶液(1∶10w/v)在30℃培育1小时制备的，每克AXOS-15-0.27使用125单位酶。通过煮沸(30分钟)将酶灭活，之后将溶液冻干，将所得物质均质并通过250μm筛筛分。
制备avDP为39、A/X比为0.22的AXOS(AXOS-39-0.22)。AXOS-39-0.22是从如上所述分离自Meritena 233 B-淀粉的小麦刮浆淀粉WU-AX制备的。将平均A/X比为0.63的刮浆淀粉WU-AX以3克/升悬浮于25mM乙酸钠缓冲液(pH4.7)，边连续搅拌边与木聚糖内切酶XBS(Grindamyl H640，Danisco，丹麦)一起在30℃下培育2小时，每克刮浆淀粉WU-AX使用3.3单位酶。离心(10,000g，15分钟，18℃)后将上清液煮沸30分钟以将酶灭活，并用上述乙酸钠缓冲液(最初体积的1/4)洗涤残余物。将洗下来的水灭活(30分钟，100℃)并与上清液合并。过滤后将所得溶液冻干以得到avDPGC为262、A/X比为0.50的AXOS。将酶溶解的物质再溶于去离子水(1∶20w/v)并加入HCl(1M)将溶液的pH调至2.8。将溶液在90℃培育24小时以除去大部分α-1，2-和α-1，3-连接的阿拉伯糖取代基，相比AXOS的β-1，4-连接的木糖亚基这两种取代基更易被酸水解。冷却至室温后加入1M NaOH中和溶液并离心(10,000g，20分钟，18℃)。边连续搅拌边在所得上清液中加入乙醇(95％v/v)，直到最终乙醇浓度达到80％(v/v)。将混合物再搅拌30分钟并于4℃过夜。通过离心(10,000g，20分钟，4℃)除去沉淀的AXOS化合物，将其溶于去离子水，冻干，将所得物质均质并通过250μm筛筛分。
制备avDP为31、A/X比为0.21的AXOS(AXOS-13-0.21)。AXOS-13-0.21是将AXOS-39-0.22(3克/升)与来自棘孢曲霉的木聚糖内切酶XAA(Shearzyme 500L，Novozymes，Bagsvaerd，丹麦)的溶液30℃培育2小时制备的，每克AXOS-39-0.22使用27.7单位酶。通过煮沸(30分钟)将酶灭活，之后将溶液冻干，将所得物质均质并通过250μm筛筛分。
分离制品的定性。
用不同技术来定性寡糖制品。
通过Courtin等(2000)所述的气液色谱分析确定总糖和还原端(reducing end)糖含量。样品的阿糖基木聚糖(AX)含量表示为0.88×(％阿拉伯糖+％木糖)。可将木糖和阿拉伯糖的总量除以还原端木糖的量以计算通过气液色谱法确定的AXOS的平均聚合度(avDPGC)。通过AOAC官方方法(1995)的改进方法--Dumas燃烧法来确定样品的蛋白质含量(N×5.7)。
采用装配有ED-40电化学检测器、GP-50梯度泵和AS-3500自动取样器的DionexDX-500色谱系统(Sunnyvale，CA，USA)，通过高效阴离子交换色谱和脉冲电流检测(HPAEC-PAD)分析制品的组成寡糖。将样品(10mg)溶于纯的去离子水(2ml，电阻率为18mΩ-cm)，过滤并注入(25μl)与Carbopac PA-100阴离子交换柱(4×250mm)相连的Carbopac PA-100保护柱(4×25mm)。洗脱(1.0毫升/分钟)采用30分钟100mM NaOH中从0到250mM乙酸钠的线性梯度，然后是15分钟100mM NaOH中从250到400mM乙酸钠的线性梯度。梯度洗脱之后柱用100mM NaOH洗脱5分钟。用采用以下电位和时限设置的脉冲电流检测模式的ED-40检测器监测洗脱：E1，+0,05V(t1＝400ms)；E2，+0,75V(t2＝200ms)；E3，-0,15V(t3＝400ms)。阿拉伯糖(A)、木糖(X1)、木二糖(X2)和DP为3-6的XOS(X3-X6)被用作参考。
高效尺寸排阻色谱(HPSEC)在装配有自动进样器的HPLC系统(KontronInstruments，325泵系统，Kontron，米兰，意大利)上进行。将所有制品溶于0.3％氯化钠(1.5ml)、过滤并注入(20μl)与Shodex SB-806 HQ HPSEC柱(300×8mm，分离范围：1×102-20×106Da)相连的Shodex SB-800P保护柱(Showa，Denko K.K.，东京，日本，50×6mm)。用0.3％氯化钠(0.5毫升/分钟；30℃)洗脱并用折射率检测器(VDSOptilab，柏林，德国)监测。分子量标记为分子量为78.8×104、40.4×104、21.2×104、11.2×104、4.73×104、2.28×104、1.18×104和0.59×104 Da的Shodex标准P-82支链淀粉和分子量为180Da的葡萄糖。寡糖的平均聚合度(avDP)通过高效尺寸排阻色谱确定(avDPHPSEC)，用MMHPSEC/132来计算。
确定木聚糖分解酶(xylanolytic enzyme)的活性。木聚糖分解酶的活性采用xylazyme(Megazyme，Bray，爱尔兰)作为不溶性底物按照制造商的测定方法进行比色测定。1单位定义为在测试条件下使590nm的消光改变1.0所需的酶的量。
结果和讨论
如材料和方法中所述，从小麦麸皮、小麦面粉或小麦刮浆淀粉制备不同类型的AXOS。不同制品的阿糖基木聚糖含量、平均取代度(阿拉伯糖与木糖的比值)和平均聚合度的性质示于表1，其中将它们与已知具有益生素特性的市售XOS制品Xylooligo-95P(Campbell等，1997；Hsu等，2004)的相应值进行了比较。根据表1及下文中使用的术语，AXOS制品表示为AXOS-x-y，其中x是通过气液色谱法确定的平均聚合度，y是阿拉伯糖与木糖的比值。不同制品的平均聚合度为7-122(Xylooligo-95P为2)，取代度为0.21-0.78(Xylooligo-95P为0.09)。衍生自小麦麸皮的制品(AXOS-7-0.34、AXOS-15-0.27、AXOS-8-0.27)的取代度低于衍生自小麦面粉的制品(AXOS-122-0.66、AXOS-16-0.78)。我们还显示，用酸处理可降低AXOS化合物的取代度。实际上，AXOS-39-0.22是通过包括酸处理在内的不同步骤(见材料和方法)从刮浆淀粉WU-AX制备的，这使平均取代度从刮浆淀粉WU-AX的0.63降至AXOS-39-0.22的0.22。
图2显示了通过HPSEC确定的不同AXOS制品的分子量分布。所有AXOS制品都是多分散的，并由具有位于通过气液色谱法确定的avDP附近的峰的分子实体构成。表1提供了不同AXOS制品中通过HPSEC洗脱分布确定的包含90％寡糖的聚合度范围。
实施例2：XOS/AXOS制品的理化和感官特性
材料和方法
寡糖制品。按实施例1材料和方法中的描述获得Xylooligo-95P、AXOS-15-0.27、AXOS-39-0.22和AXOS-13-0.21。果寡糖(FOS)制品是市售产品Raftilose(Orafti，Tienen，比利时)。首先将用于感官分析的AXOS-15-0.27溶于水(1∶25w/v)并用活性碳处理以除去制造过程中造成的可能的臭味。将AXOS-15-0.27和活性碳(0.75g/gAXOS-15-0.27)的悬浮液在18℃搅拌1小时，倾析后通过离心(10000g，30分钟，18℃)除去活性碳。
稳定性测量。对寡糖制品水可提取的部分进行稳定性测量，该部分是用以下方法制得的：将制品悬浮于去离子水(1∶10w/v)，然后振荡(2小时，18℃)、离心(10,000g，20分钟，18℃)和过滤。冻干滤液，然后将水可提取的样品溶于pH值为2、3、7和11的通用缓冲液以得到寡糖浓度为0.15％(w/v)的溶液。通用缓冲液从用水(1.0升)配制的含6.0克柠檬酸、3.9克磷酸二氢钾、1.8克硼酸和5.8克二乙巴比妥酸构成的储液制备(Britton和Welford，1937)。用2.0M HCl或2.0M NaOH将一份(20ml)该储液调至所需pH。各寡糖溶液在沸水中保持不同时间(0、5、10、15、20、30和60分钟)。之后将溶液冷却，并通过实施例1材料和方法中描述的气液色谱法测量总的单糖和还原端糖的量。用公式(1)计算FOS的降解百分比，Xylooligo-95P和AXOS-15-0.27的降解百分比用公式(2)计算。FOS以及Xylooligo-95P和AXOS-15-0.27的水解百分比分别用公式(3)和(4)计算。
Figure A20058002219300191
AXOS-15-0.27中水解的木糖和阿拉伯糖键的百分比分别用公式(5)和(6)计算。
感官分析。在一次最多容纳10名志愿者的安静会议室内进行感官分析。对象被要求在会议开始前禁止饮食和饮水至少1小时。首先使对象熟悉过程，然后让他们品尝用纯的去离子水(电阻率18mΩ-cm)制备的具有不同浓度Xylooligo-95P、AXOS-15-0.27、蔗糖(参考甜味刺激)、氯化钠(参考咸味刺激)和抗坏血酸(参考酸味刺激)的编号样品。各化合物的最高浓度溶液编号为8，最低浓度编号为1(表2)。要求对象按照浓度增加的顺序连续品尝一种化合物的所有浓度范围，但各个对象品尝不同化合物的次序是随机的。品尝化合物的浓度系列之前先用纯的去离子水(电阻率为18mΩ-cm)漱口两次，然后用一次性针筒在对象口中放入5毫升各测试溶液，含漱5秒钟再咽下。要求参与者指出可识别出化合物甜味、咸味或酸味的最低浓度(个体识别阈)。平均味道识别阈定义为一半对象正确识别特定化合物味道的浓度，它是用总共20人的个体识别阈数据计算的。
粘度测量。对获自寡糖制品水可提取部分进行粘度测量，该部分用以下方法获得：将制品悬浮于水(1∶10w/v)中，然后振荡(2小时，18℃)、离心(10,000g，20分钟，18℃)和过滤。冻干滤液，然后按照Vinkx等(1991)的方法用Ostwald型粘度计(毛细管粘度计，Schott Gerate，型号50904)在30℃测量5.0％(w/v)溶液的粘度。溶液粘度测量一式三份进行，表示为将各寡糖溶液的流动时间除以相同试验条件下去离子水的流动时间得到的相比去离子水的相对值(ηrel)。计算出比粘度(ηsp＝ηrel-1)之后，用公式(7)所示的Morris方程(Morris，1984)确定表观固有粘度([ηapp]，dl/g)，式中，c(单位为mg/ml)为寡糖浓度，假设只有寡糖会影响溶液的粘度性质。每次分析后，粘度计用去离子水冲洗两次、用95％乙醇冲洗两次、用丙酮冲洗一次并用二乙醚冲洗一次，随后用压缩空气干燥。
( 7 ) [ η app ] = 1 c × [ 2 [ η sp - ln ( η rel ) ] ] 0.5 × 1000
结果和讨论
将AXOS-15-0.27的pH稳定性与已知益生素果寡糖(FOS，市售产品Raftilose)和木寡糖(XOS，市售产品Xylooligo-95P)的pH稳定性比较。不同寡糖在不同pH值(pH2、3、7和11)于100℃下保持不同时间。通过测量组成单糖含量的降低确定降解百分比，通过测量还原性组成单糖含量的升高确定水解百分比。如图3所示，在低或中性pH(pH 2、3或7)时没有寡糖发生实质性降解。另一方面，在碱性pH(pH 11)下观察到所有三种测试寡糖都发生降解。这种效应对于Xylooligo-95P明显，60分钟后其有73％降解。碱性条件下最稳定的寡糖是AXOS-15-0.27(图3)。碱性pH下观察到的降解称为碱剥离(alkali peeling)，这是一种在升高的温度(60-100℃)下发生的、从寡糖还原端开始的一种反应(Whistler和BeMiller，1958；Santori等，2003)。
在三种测试寡糖中，显然FOS在低pH下对水解最敏感(图4)。在pH 2和3时，58％和53％的FOS在60分钟后被水解。Xylooligo-95P和AXOS-15-0.27在pH 2时显示出相同的水解水平。然而，在pH 3时AXOS-15-0.27比Xylooligo-95P更加稳定，只有2％的AXOS-15-0.27水解，而有6％的Xylooligo-95P水解(图4)。在低pH下对AXOS-15-0.27水解的进一步研究显示，相比木糖键而言，阿拉伯糖键更易于发生酸性水解。实际上，将AXOS-15-0.27在pH 2、100℃下培育60分钟会使所有阿拉伯糖键的54％水解，而在相同条件下只有4％的木糖键水解(图5)。
据报道，低DP木寡糖如Xylooligo-95P能品尝出甜味，其甜度约为蔗糖的40％(Suntory，木寡糖说明书和产品单，2001)。至今还不知道具有较高聚合度的阿糖基木寡糖的味道特性。我们采用由20人构成的鉴味组来确定AXOS-15-0.27和Xylooligo-95P的味道识别阈。测试样品还包括蔗糖、氯化钠和抗坏血酸，它们分别作为甜味、咸味和酸味的代表。要求对象指出对于各测试化合物一系列浓度所识别出的化合物甜味、咸味或酸味的浓度。只有15％的鉴味组成员认为AXOS-15-0.27在最高测试浓度(71.5克/升)时有甜味，没有人指出咸味或酸味。蔗糖和Xylooligo-95P的平均甜味识别阈分别为7和24克/升，而AXOS-15-0.27的该值高于71.5克/升。因此，AXOS-15-0.27的甜度比蔗糖低10倍以上，比Xylooligo-95P低3倍以上，而Xylooligo-95P本身的甜度比蔗糖低约3倍。
测定AXOS-15-27、AXOS-39-0.22和AXOS-13-0.21的粘度，并与果寡糖(FOS，市售产品Raftilose)和木寡糖(XOS，市售产品Xylooligo-95P)进行了比较。如表3所示，这些不同的AXOS制品具有较高表观固有粘度，比FOS和Xylooligo-95P高3-10倍。
实施例3：通过超滤分级AXOS制品
材料和方法
AXOS的制备。如实施例1材料和方法所述制备刮浆淀粉WU-AX。将刮浆淀粉WU-AX以3克/升悬浮于乙酸钠缓冲液(25mM，pH 4.7)，并与来自棘孢曲霉的木聚糖内切酶XAA(Shearzyme 500L，Novozymes，Bagsvaerd，丹麦)一起在30℃下培育4小时，每克刮浆淀粉WU-AX使用18.4单位酶。通过煮沸30分钟将酶灭活，之后过滤悬浮液，AXOS回收于滤液中。
通过超滤分离AXOS。在终端‘HP4750搅拌室’超滤装置(Sterlitech Corporation，Kent，USA)中对AXOS进行分级。所用超滤膜的截断分子量(MMCO)为5kDa(P005F，Celgard，Wiesbaden，德国)、10kDa(PES-10，Synder Filtration，Vacaville，CA，USA)或30kDa(PES-030H，Celgard)。通过置于室中央的搅拌速度为700rpm的涂有Teflon的磁力搅拌棒使膜表面的浓差极化最小化。压力源是压缩氮气气缸。通过压力调节器控制压力，所有过滤试验在4巴恒压下室温进行。在终端超滤室(dead-endultrafiltration cell)中加入300毫升待分级的溶液，当收集到总体积约200毫升的渗透液时停止超滤。
分离制品的表征。见实施例1的材料和方法。如实施例1材料和方法的描述进行高效尺寸排阻色谱(HPSEC)，但采用Shodex SB-802.5 HQ HPSEC柱(Showa，DenkoK.K.，东京，日本，300×8mm，分离范围：1×102-1×104Da)。分子量标记为分子量为11.2×104、4.73×104、2.28×104、1.18×104和0.59×104Da的Shodex标准P-82支链淀粉(2.0mg/ml)，分子量为810(DP6)、678(DP5)、546(DP4)、414(DP3)和282Da(DP2)的木寡糖标准品，以及分子量为180Da的葡萄糖。
结果和讨论
AXOS制品中有甜味且可代谢的低分子量寡糖的存在对于特定的用途如作为食品成分是不希望的，但是对于其它应用需要使用主要由低分子量寡糖构成的有甜味的AXOS制品。因此，开发能将AXOS制品分级从而将DP为2-3的AXOS/XOS与具有较高DP的AXOS分离的方法是有用的。以前总是通过用不同浓度的醇溶液沉淀将阿糖基木聚糖分级(Courtin和Delcour，1998)。然而，在工业规模采用醇沉淀在技术和经济上都不令人满意。因此研究了通过超滤进一步分级用酶法制造的AXOS的可行性。
一个例子是，用截断分子量(MMCO)为5kDa、10kDa或30kDa的膜对通过将刮浆淀粉WU-AX与XAA(18.4U/g)一起在30℃培育4小时制备的AXOS进行超滤。
当使用5kDa膜时，通过部分(PER5kDa)的HPSEC分布(图7a)主要显示大小与木二糖(DP2)和木三糖(DP3)相当的寡糖。保留部分(RET5kDa)含有AXOS储液中86％的可溶性阿糖基木聚糖(表4)，与超滤前的AXOS制品有基本相同的分子量分布，但DP2和DP3的寡糖的量降低了约一半(图7a)。由于高分子量组分的存在导致通过物的流量减少，因而RET5kDa部分中的低DP寡糖没有被全部除去。
用10kDa膜超滤可在通过部分中回收到34％阿糖基木聚糖组分，通过部分中保留了65％(表4)。通过部分(PER10kDa)主要含有DP 2-6的寡糖。保留部分(RET10kDa)含有低水平尺寸较小的DP 2-4的寡糖，主要由分子量从700到＞110,000Da(DP5到DP＞850)的寡糖构成(图7b)。与PER10kDa部分相比，用30kDa膜得到的通过物(PER30kDa)具有较高含量1000-10,000Da的寡糖。相应的，30kDa膜的保留部分(RET30kDa)相比RET10kDa具有较低含量1000-10,000Da的寡糖，但奇怪的是，RET30kDa中DP2和DP3寡糖的含量高于RET10kDa。
从表4可以清楚看出，超滤能影响所得AXOS部分的A/X比。通过部分(PER5kDa、PER10kDa和PER30kDa)富含A/X比相对较低的寡糖，而保留部分(RET5kDa、RET10kDa和RET30kDa)所含组分的A/X比较高。
为评价通过超滤进一步分级AXOS的可能性，采用MMCO为30KDa的膜对RET10kDa部分进行第二次超滤。RET10kDa部分通过MMCO为30kDa的膜超滤后得到的通过部分(PER10kDa+30kDa)和保留部分(RET10kDa+30kDa)以及PER10kDa部分的HPSEC分布示于图8。
RET10kDa+30kDa部分主要含有高分子量组分(＞20,000Da)，这种组分在ShodexSB-802.5HQ柱上以空体积出现。PER10kDa+30kDa部分代表AXOS储液中约25％的阿糖基木聚糖(表5)，主要由分子量为700-10,000Da(DP 5-75)的中等大小的寡糖构成(图8)。
这些结果说明，宜用MMCO为10kDa的膜进行超滤，这样可使AXOS制品有高含量DP 2-6的寡糖(超滤的通过物)，或有高含量DP＞4和低含量DP 2-4的寡糖(超滤的保留物)。连续超滤宜使10kDa膜的保留物通过30kDa膜，这样可得到富含DP5-75的AXOS的AXOS部分。
实施例4：AXOS制品对鸡肠的影响
材料和方法
寡糖制品。见实施例1的材料和方法。
通过平板计数进行微生物分析。将鸡盲肠内容物称重，以1∶10稀释于无菌蛋白胨生理盐水(PPSS；0.1％细菌用蛋白胨，0.85％NaCl)，在兜包(stomacher)中均质，再根据10倍稀释方案稀释于PPSS。然后用倾注平皿技术将适量稀释液平铺于Violet RedBile Blucose琼脂(VRBG；Oxoid CM0485B，Basingstoke，英国)以进行肠杆菌计数，和平铺于通过添加冰醋酸(1ml/l)和莫匹罗星(100mg/l)改进的Wilkins-Chalgren厌氧菌琼脂(Oxoid CM619)以进行双歧杆菌计数。后一种改进提高了Wilkins-Chalgren琼脂对双歧杆菌的选择性，改进的Wilkins-Chalgren琼脂特别适用于一步测定鸡盲肠中的双歧杆菌数(Rada等，1999；Rada和Petr，2000)。于37℃有氧培养肠杆菌1天后对菌落进行计数，于37℃厌氧培养(在带有Oxoid不产气菌系统AN0025A的厌氧罐中进行)双歧杆菌4天后对菌落进行计数。用每克盲肠内容物的数目表示。在制备样品时需注意以下几点以使双歧杆菌最小程度暴露于氧气：(i)在样品制备开始时才从盲肠取出盲肠内容物；(ii)稀释液和琼脂在使用前才经高压灭菌或煮沸以除去溶解氧；(iii)双歧杆菌计数平板从样品制备开始时在厌氧气氛下放置2小时。
通过定量PCR进行微生物分析。按Van de Wiele等(2004)的描述提取以1∶5稀释于PPSS的盲肠样品的DNA。使用添加有SYBR
Figure 200580022193X10000210003_0
Green PCR Core Reagents的缓冲液按照供应商(PE Applied Biosystems，Nieuwerkerk a/d Ijssel，荷兰)的描述在25μl反应混合物中进行扩增，扩增在具有光学帽(optical cap)的MicroAmp Optical 96孔反应平板(PE Applied Biosystems)中进行。正向和反向引物分别为BIF164f和BIF163r(Satokari等，2001)，以1μM的浓度使用以检测双歧杆菌属细菌16S核糖体RNA基因的拷贝。PCR温度程序如下：50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，然后40轮94℃ 1分钟、62℃ 1分钟和60℃ 1分钟循环。模板DNA在一式三份反应混合物中扩增，并用ABI Prism SDS7000设备(PE Applied Biosystems)监测。基于从短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)(LMG 11042株)培养物提取的DNA的四种不同稀释液一式四份反应的实时PCR扩增建立标准曲线。将试验样品的实时PCR数据对标准曲线绘图，并用具有最高DNA浓度的试验样品的DNA浓度除以各试验样品DNA浓度得到的因子校正DNA提取物的效率。
统计分析。用Analyse-it软件(版本1.71)通过1-因子方差分析以95％置信水平分析不同膳食对动物体重、饲料摄入或肠道微生物组成的影响。当对膳食因子观察到统计学显著效应时，通过最小显著差(LSD)检验或通过Tukey检验以95％置信水平分析膳食间的差异。
结果和讨论
测试了添加不同(阿糖基)木聚糖衍生制品对鸡下部肠道微生物组成的影响。
在第一个试验中，从商业孵化场(Avibel，Tielt，比利时)购买了64只1天大的公鸡(Ross公鸡)，分别养在4个圈中(每圈16只鸡)。每个圈中有饮水盆和1米长的饲料容器。鸡刚来时圈的温度稳定在35℃，然后每2天降低1℃。对动物保持23小时光照、1小时黑暗的光周期。饲料(每圈1份饲料)和饮水随意给予。试验期为14天。
测试以下试验饲料：
·对照饲料
·对照饲料+0.25％AXOS-7-0.34制品(0.17％纯AX)
·对照饲料+0.25％AXOS-122-0.66制品(0.18％纯AX)
·对照饲料+0.25％Xylooligo-95P(0.22％纯AX)
括号中的浓度是根据其AX含量计算的校正纯度。对照饲料由市售幼畜饲料(Krix 0，Hendrix UTD，Boxmeer，荷兰)构成，其中含有木聚糖酶和葡聚糖酶的混合物(Roxazyme)作为添加剂。
第7天时称重所有动物，每组随机选择8只动物断头处死。之后解剖动物以收集盲肠。将盲肠排空，每种处理收集两组内容物(每次4根盲肠)。当其余动物14天大时重复该过程，但每种处理收集3组内容物(各为3、3和2只动物)。
未观察到AXOS-7-0.34组动物的平均体重相比对照组有显著变化。AXOS-122-0.66和Xylooligo-95P组动物的体重在7天后相比对照组显著降低，但在14天后又上升，与对照的差异变得不显著。在AXOS-122-0.66组中，7天后体重相对较低可能是由于该组中的鸡在孵化时体重明显较轻。
对鸡盲肠微生物群的分析显示，饲养7天和14天后都有较高肠杆菌水平(约108-109/克盲肠内容物)，对任何处理都未观察到显著差异。7天后，所有处理组的双歧杆菌水平都较低(约102-103/克盲肠内容物)(图9)，但Xylooligo-95P组的动物除外，其双歧杆菌水平要高得多(约108/克盲肠内容物)。14天后，对照组盲肠中双歧杆菌数仍旧较低。相反，AXOS-7-0.34组盲肠内容物中观察到的双歧杆菌数目明显升高(约为105倍)。Xylooligo-95P组的双歧杆菌水平在7天后略低，但在14天后仍旧明显高于对照组。在AXOS-122-0.66组中，14天后盲肠内容物中双歧杆菌的数目适度升高，但这种升高相比对照组不显著。
在对鸡进行的第二个试验中，从商业孵化场(Avibel，Tielt，比利时)购买了54只1天大的公鸡(Ross公鸡)，分别养在6个圈中(每圈9只鸡)。圈的条件如第一个试验所述(见上文)。试验期为14天。
测试以下试验饲料：
·对照饲料
·对照饲料+0.141％AXOS-15-0.27制品(0.1％纯AX)
·对照饲料+0.352％AXOS-15-0.27制品(0.25％纯AX)
·对照饲料+0.263％FOS制品(0.25％纯FOS)
·对照饲料+1.053％FOS制品(1％纯FOS)
·对照饲料+0.01％木聚糖酶制品
括号中的浓度是根据其AX或FOS含量计算的校正纯度。FOS制品是市售产品Raftilose(Orafti，Tienen，比利时)。木聚糖酶制品为市售产品Belfeed(Beldem，Groot-Bijgaarden，比利时)。对照饲料的组成见表6。第14天时称重所有动物并断头处死。之后解剖动物以收集盲肠，每3只属于相同处理组的动物的盲肠内容物被收集在一起。集中在一起的盲肠样品中双歧杆菌的数目通过定量PCR测定。
用各种膳食试验两周后，未观察到不同处理之间体重有显著差异。就2周后鸡盲肠中双歧杆菌数而言，只有用含0.25％AXOS-15-0.27的膳食喂养的鸡与对照处理显著不同(图10)。用0.25％AXOS-15-0.27饲养的鸡的双歧杆菌数比用对照膳食饲养的鸡高22倍。注意，出于比较的目的，该试验包括了已知的益生素-果寡糖(FOS)，但即便以高于AXOS-15-0.27有效剂量4倍的剂量使用也未使鸡盲肠中的双歧杆菌数升高。这说明AXOS-15-0.27是异常有效的产双歧杆菌化合物。
已知双歧杆菌与动物和人类健康积极相关，并且是许多益生素的组成成分。除了直接摄入微生物制品，人们对于在肠胃道内选择性富集这些菌群以促进或维持动物和人的良好健康状态，包括抑制结肠直肠癌的兴趣越来越高(Van Loo等，2004)。鸡的饲养实验结果说明，所有含阿糖基木聚糖的饲料都能刺激双歧杆菌在鸡盲肠中的存在。具有高聚合度的AXOS制品AXOS-122-0.66只使鸡盲肠中的双歧杆菌菌群非显著地适度上升。另一方面，具有低至中等聚合度的制品Xylooligo-95P、AXOS-7-0.34和AXOS-15-0.27使双歧杆菌显著的升高，且没有使动物体重降低。在7天后就已经能看到对Xylooligo-95P的反应，而AXOS-7-0.34和AXOS-15-0.27在14天后才造成产双歧杆菌反应。这说明，相比具有较高平均聚合度和较高平均取代度的AXOS-7-0.34和AXOS-15-0.27制品，Xylooligo-95P更快被双歧杆菌发酵。对用于人类和其它肠道较长的动物的益生素而言，需要它们被所选有益菌慢发酵。被肠细菌慢发酵增加了通过结肠近侧部分后未被完全消耗的益生素的量，因此可作为结肠末端部分中适当细菌的发酵底物。在人类中，结肠末端和直肠部分的癌症发病率加在一起要高于结肠近侧部分的癌症发病率(http://www.state.ni.us/health/cancer/cr/subsites.htm)，因此，益生素能刺激末端结肠和直肠的有益微生物群是重要的。
实施例5：AXOS制品对大鼠肠的影响
材料和方法
XOS/AXOS制品。见实施例1的材料和方法。
通过定量PCR进行微生物分析。将实施例4的材料和方法。
短链脂肪酸分析。用5倍体积的水/磷酸/甲酸(98/1.8/0.2，v/v/v)提取肠样品并通过离心澄清(22,000g，10分钟)。短链脂肪酸(SCFA)通过气液色谱法(Shimadzu，GC14A)在用Chromosorb W(mesh size 60/30；Supelco，Bellefonte，USA)填装的柱子上分析，并通过火焰离子化检测。基于不同酸已知浓度的标准品计算SCFA浓度。己酸被用作内标。
统计分析。用Analyse-it软件(版本1.71)通过1-因子方差分析以95％置信水平分析不同膳食对动物体重、饲料摄入、SCFA或肠道微生物组成的影响。当对膳食因子观察到统计学显著效应时，通过最小显著差(LSD)检验以95％置信水平分析膳食间的差异。
结果和讨论
在大鼠的第一个试验中，从Elevage Janvier(Le Genest-St-lsle，法国)购买了40只6周龄的雄性大鼠(Wistar)，将它们关在以不锈钢丝作为底的笼子中(每个笼子2只大鼠)，笼子放在环境控制室(22℃)中，14-10小时光-暗循环。大鼠可以自由接触水和‘基础人膳食’丸7天。‘基础人膳食’的组成见表7。适应7天基础人膳食之后，将大鼠随机分配到5个不同处理组之一(每组8只大鼠)，各组可自由接触由以下膳食之一制成的丸子(10毫米)13天：
·基础人膳食
·基础人膳食+0.70％AXOS-122-0.66制品(0.5％纯AX)
·基础人膳食+0.69％AXOS-16-0.78制品(0.5％纯AX)
·基础人膳食+0.73％AXOS-15-0.27制品(0.5％纯AX)
·基础人膳食+0.72％AXOS-8-0.27制品(0.5％纯AX)
括号中的浓度是根据其AX含量计算的校正纯度。在含有AXOS的膳食中，基础人膳食中的淀粉被适量AXOS替代。
每周三次对动物进行称重和测量饲料摄入。处理13天后，将所有动物称重并用过量戊巴比妥实施安乐死。之后解剖动物以收集粪便。收集的粪便是从末端结肠到肛门的粪球。每2只属于相同处理组的动物的粪便被收集在一起并分析其SCFA含量。
处理期间的饲料摄入为18.9-27.7克/天，平均为22.7克/天。处理开始时大鼠的初始体重平均为262.0克，处理13天后最终体重平均为375.3克。未观察到体重或饲料摄入在不同处理组之间有显著差异。
由于肠SCFA水平升高是摄入益生素造成的微生物菌群改变的标志(Van Loo，2004)，我们测量了不同处理组粪便的SCFA含量。如图11所示，用AXOS-8-0.27、AXOS-15-0.27和AXOS-16-0.78饲养的大鼠粪便的丙酸水平显著高于对照组或AXOS-122-0.66组。AXOS-8-0.27、AXOS-15-0.27和AXOS-16-0.78组粪便中的乙酸和丁酸水平也有上升趋势。
SCFA如乙酸、丙酸和丁酸是由于肠道厌氧环境中的细菌呼吸吸收电子(electronsink)产生的。已知益生素能增加下肠胃道中SFCA的水平。高SCFA水平是需要的，因为它们能降低肠内容物的pH，从而限制潜在致病性腐败细菌生长。降低肠道pH还能增加矿物质钙和镁的溶解度和生物利用度(Teitelbaum和Walker，2002)。短链脂肪酸，尤其是丁酸，还能刺激结肠上皮细胞，从而提高上皮细胞的吸收力(Topping和Clifton，2001)。
未观察到用AXOS-15-0.27或AXOS-16-0.78(这两种制品有几乎相同的平均聚合物但A/X比不同)处理的大鼠之间有显著差异的事实说明，取代度对AXOS刺激结肠内细菌发酵的能力没有大的影响。另一方面，当比较AXOS-16-0.78和AXOS-122-0.66的功效时，这两种制品有几乎相同的取代度但有不同聚合度，显然具有高聚合度的AXOS制品如AXOS-122-0.66相比具有较低平均聚合度的制品是不太有效的益生素。因此，平均聚合度低于120的AXOS制品是优选的益生素化合物。为提高末端结肠和直肠中AXOS的利用度而需要慢发酵时，优选平均聚合度大于4的AXOS制品。
在对大鼠进行的第二个试验中，从Elevage Janvier(Le Genest-St-lsle，法国)购买了24只6周龄的雄性大鼠(Wistar)，将它们关在以不锈钢丝作为底的笼子中(每个笼子2只大鼠)，笼子放在环境控制室(22℃)中，14-10小时光-暗循环。大鼠可以自由接触水和‘基础人膳食’丸(10mm)6天。‘基础人膳食’的组成见表7。用基础人膳食饲养6天后，将大鼠随机分配到3个不同处理组之一(每组8只大鼠)，各组可自由接触由以下膳食之一制成的丸子(10毫米)：
·基础人膳食
·基础人膳食+5.87％AXOS-15-0.27制品(4％纯AX)
·基础人膳食+5.26％Xylooligo-95P(4％纯AX)
括号中的浓度是根据其AX含量计算的校正纯度。在含有AXOS-15-0.27或Xylooligo-95P的膳食中，基础人膳食中的淀粉被适量AXOS替代。
每周三次对动物进行称重和测量饲料摄入。处理14天后，将所有动物称重并用过量戊巴比妥实施安乐死，解剖动物以收集近侧结肠、盲肠和末端结肠。每2只属于相同处理组的动物的盲肠内容物被收集在一起并通过定量PCR分析双歧杆菌量。每2只属于相同处理组的动物的近侧结肠和末端结肠内容物被收集在一起并分析SCFA含量。
近侧结肠中的SCFA水平远低于末端结肠，且在近侧结肠样品中只有乙酸高出检测阈。因此，只能获得近侧结肠的乙酸数据和末端结肠中乙酸、丙酸和丁酸的数据。在95％概率水平时没有处理能显著影响SCFA水平。然而可以看出数据中有明显的趋势。如图12所示，AXOS-15-0.27和Xylooligo-95P组乙酸和丁酸水平高于对照组，但丙酸没有。对末端结肠中丁酸的影响最显著，相比对照组，AXOS-15-0.27组上升了58％，Xylooligo-95P组上升了34％。相比Xylooligo-95P，AXOS-15-0.27对末端结肠中所有SCFA都有较强影响。有趣的是，Xylooligo-95P使近侧结肠中乙酸增加最多，而AXOS-15-0.27使末端结肠中乙酸升高最多。
相比接受对照膳食的大鼠，用AXOS-15-0.27或Xylooligo-95P喂养的大鼠盲肠中双歧杆菌的量显著升高。在AXOS-15-0.27组中观察到最高盲肠双歧杆菌增加(比对照组升高1.08log单位或12倍，图13)。
这些结果说明，AXOS-15-0.27是比Xylooligo-95P更有效的益生素。这些数据还说明，相比Xylooligo-95P，AXOS-15-0.27被更慢发酵，这是由于Xylooligo-95P在近侧结肠产生较强SCFA效果，而AXOS-15-0.27在末端结肠产生较强效果。在实施例5所述的对鸡进行的试验中也观察到AXOS-15-0.27比Xylooligo-95P更慢的发酵。AXOS-15-0.27的慢发酵特性是需要的，因为这能使更多的益生素到达末端结肠，它们可在这里发挥其有益的假设的癌发生抑制作用。
实施例6：AXOS制品对人肠的影响
材料和方法
AXOS-15-0.27和WPC制品。见实施例1的材料和方法。
通过定量PCR进行微生物分析。见实施例4的材料和方法。
对象。没有志愿者有肠胃病或代谢疾病或外科手术史。对象在研究开始前至少3个月内未接受会影响消化道通过性或肠道菌群的抗生素或任何其它药物治疗。试验期间没有女性怀孕。未强迫志愿者采用标准膳食。但要求他们维持常规进食模式直到研究期结束，并要求他们避免过量摄入发酵乳制品和含有大量可发酵碳水化合物的食品。Leuven大学伦理委员会批准了该试验，并征得了所有对象的同意。
标记的底物。用获自Euriso-top(Saint-Aubin，法国)的[15N，15N]脲按照Hofmann(1931)改进的Schoorl法合成乳糖-[15N，15N]-酰脲。3H-标记的聚乙二醇(3H-PEG)获自New England Nuclear Life Science Products(Boston，MA，USA)。
测定尿和粪便的Ntot和15N。用与热导体检测器(TCD；PDZ)和稳定同位素比质谱仪(IRMS；PDZ)相连的元素分析仪(ANCA-SL；PDZ，Cheshire，UK)测定尿和粪便的总氮含量和15N丰度。在1000℃、存在氧气时将已知体积的尿(15μl)或已知质量的粪便(约5-7mg冻干的粪便)氧化。之后使燃烧产物通过600℃含有铜的第二个炉子，在这里过量的氧气被吸收同时氮氧化物也被还原成元素氮。用TCD检测器测量总氮含量，15N丰度通过与元素分析仪的燃烧单元相连的IRMS检测器测量。对照校准的实验室标准(即标准硫酸铵溶液)测量N2中15N与14N的同位素比例。如下计算回收的15N给药量的百分比(Evenepoel等，1999)：
Figure A20058002219300291
Figure A20058002219300301
式中，过量
Figure A20058002219300302
APt：测得的特定尿样品中15N的丰度，用原子百分比(AP)表示
APbas：基础尿样品中15N的丰度(用AP表示)
Ntot：特定尿样品的总氮含量
对于尿样品，将给予测试膳食后0-48小时内的15N给药量％累加起来，而对于粪便样品，将给予测试膳食后0-72小时内的15N给药量％累加起来。对粪便样品口-粪便通过时间个体间差异进行校正。方法是将72小时内回收的累加15N给药量％除以72小时内回收的累加3H-PEG给药量％。将3H-PEG氧化(Packard样品氧化剂，型号307)成3H-H2O之后通过液体闪烁计数器(Tricarb液体闪烁谱仪，型号3375；PackardInstruments，Downers Grove，IL，USA)测量粪便中3H-PEG的含量。
尿中酚类化合物的测定。通过气液色谱法-质谱(GC-MS)技术测量总对甲酚含量和苯酚含量。用浓硫酸将950ml尿的pH调至pH 1。该溶液在90℃热处理30分钟以去蛋白(deproteinise)并水解结合的酚类。冷却至室温后，加入50ml 2，6-二甲苯酚(20mg/100ml)作为内标。用1ml乙酸乙酯萃取酚类。乙酸乙酯层用Na2SO4干燥，取0.5ml该溶液在GC-MS(Trace GC-MS，Thermo Finnigan，San Jose，CA，USA)上分析。分析柱为30m×0.32mm内径，1μmAT5-MS(Alltech Associates，Deerfield，IL，USA)。用恒定流速为1.3毫升/分钟的GC级氦气作为载体。炉温程序设定为从75℃(等温5分钟)开始以10℃/分钟升至160℃并以20℃/分钟升至280℃。以电子碰撞全扫描模式从m/z 59到m/z 590进行质谱检测，每秒扫描两次。对甲酚和苯酚的结果表示为0-24小时收集物的总含量(mg)。
统计分析。用SPSS软件(12.0版本)进行统计分析。采用Wilcoxon符号秩检验以95％置信水平对数据进行统计评价。
结果和讨论
对10名健康志愿者(5名男性，5名女性，年龄23-37岁)进行第一次人体试验。将10名志愿者随机分成2组，每组5人。第一组接受2周每天7克(4.88克)悬浮在水中的AXOS-15-0.27，而第二组每天接受11.6克(4.82克)悬浮在水中的WPC。括号中的重量值是基于AX含量和制品水分含量的校正重量。
收集每名志愿者试验开始前的那天和第15天的粪便样品。每次收集当天排出的第一次粪便，称重并储存于-20℃直到通过定量PCR进行微生物分析。
如图14所示，接受14天每天4.88克AXOS-15-0.27的对象的粪便双歧杆菌水平比基础水平高1.55对数单位(＝35倍)(p＝0.043)。相反，接受每天4.82克WPC的对象的双歧杆菌水平在2周后轻微降低，但它与基础水平的差异不显著(p＝0.715)。
这些数据说明，具有中等平均聚合度的AXOS化合物如AXOS-15-0.27(avDP＝15，表1)相比具有高平均聚合度的化合物如WPC(avDP＝58，表1)显示出更强的益生素效应。已经从对鸡进行的产双歧杆菌作用试验(见实施例4)和对大鼠进行的SCFA增加试验(见实施例5)得出了相同的结论。
在第二个试验中，评价了不同一次(once-off)剂量的AXOS-15-0.27对人结肠中NH3、对甲酚和苯酚代谢的作用。NH3、苯酚和对甲酚有毒并且是潜在的致癌代谢物，它们是由结肠中的细菌发酵蛋白质产生的。用乳糖-[15N，15N]-酰脲作为生物标记评价NH3代谢。口服给予时，乳糖-酰脲未经修饰到达结肠，这是由于乳糖-酰脲中糖部分和脲之间的分子键阻止了人肠胃道的酶降解。当乳糖-[15N，15N]-酰脲到达结肠时，它被特定细菌降解成[15N，15N]-标记的脲。标记的脲快速水解产生15NH3(Wutzke等，1997)。标记的NH3与结肠中的氨混合，其结果是，15N-标记测量中观察到的变化反应了总结肠NH3的命运。除了监测结肠NH3代谢，还测量了尿中存在的苯酚和对甲酚，它们被作为结肠中细菌发酵蛋白质的标志。基于文献数据(Evenepoel等，1999)，假设在生理环境下约有3-6％摄入的蛋白质未被消化。但未消化的蛋白质到达结肠时，它们被结肠菌群发酵。细菌发酵酪氨酸导致产生苯酚和对甲酚。这些化合物被结肠大量吸收，在粘膜和肝脏中解毒(通过结合葡糖苷酸和硫酸盐)并最终在尿中排泄。由于苯酚和对甲酚主要由细菌代谢产生且不来自人体代谢，因此尿中苯酚和对甲酚的产量反应了结肠中细菌产生这些化合物的情况(Smith和Macfarlane，1996)。其结果是，益生素对结肠蛋白质发酵的任何影响将反应在苯酚和对甲酚的尿浓度中。
对9名(3名男性，6名女性，年龄19-26岁)健康的志愿者进行了第二次人体试验。各志愿者接受含有不同剂量AXOS-15-0.27的5种不同测试膳食，每次测试之间间隔1周。AXOS-15-0.27的不同日剂量为0、0.35g(0.24g)、1.05g(0.73g)、3.17g(2.21g)和7g(4.88g)，括号中的重量值是基于AX含量和制品水分含量校正的AXOS重量。志愿者接受不同测试膳食的顺序是随机的。测试膳食由薄煎饼(15,8克蛋白质，11,6克脂肪和21,1克碳水化合物；255千卡)构成，其中含有75毫克稳定同位素标记的底物乳糖-[15N，15N]-酰脲、185kBq氚-标记的聚乙二醇(3H-PEG)和适量AXOS-15-0.27。3H-PEG用作口-粪便通过时间的生物标记(Geboes等，2005)。
收集尿液，在其中加入1克新霉素以防止微生物生长。摄入测试膳食之前收集基础尿样品。收集摄入每种测试膳食后48小时内的尿液，分三个不同部分收集：0-6小时、6-24小时和24-48小时。测量尿液体积，然后将样品储存于-20℃直至分析。收集摄入测试膳食后72小时内的粪便。排泄后将粪便立即冷冻、称重并储存于-20℃。进一步分析之前将同一天收集的所有粪便合并并均质。取出已知重量的样品并冻干。再次称重干燥的物质，取等份以进行氮和放射性分析。
如图15A所示，注意到相比缺乏AXOS-15-0.27的对照膳食，摄入含AXOS-15-0.27的测试膳食后15N-标记的氮的尿排泄率始终较低。摄入对照膳食后，尿样品中15N给药量的44.5％被回收。摄入0.24、0.73、2.21和4.88克AXOS-15-0.27后该值分别降至40.4％(相比对照降低9％)、43.7％(相比对照降低2％)、33.1％(相比对照降低26％)和33.6％(相比对照降低25％)。对剂量为2.21和4.88克的AXOS-15-0.27来说，尿15N排泄的降低是显著的(p＜0.05)。
相反，在测试膳食中添加AXOS-15-0.27能使经粪便排泄的15N始终增加(图15B)。在对照测试膳食组中，粪便中15N给药量的15.1％被回收。摄入0.24、0.73、2.21和4.88克AXOS-15-0.27后该值分别升至16.4％(相比对照升高8％)、18.8％(相比对照升高24％)、25.3％(相比对照升高67％)和26.1％(相比对照升高72％)。对剂量为2.21和4.88克的AXOS-15-0.27来说，粪便15N排泄的增加是显著的(p＜0.05)。通过3H-PEG生物标记测量可知，任何测试剂量的AXOS-15-0.27对胃肠通过时间都没有影响(图15C)。
注意到相比缺乏AXOS-15-0.27的对照膳食，摄入含AXOS-15-0.27的测试膳食后对甲酚和苯酚的尿排泄率始终较低(图16)。摄入0.24、0.73、2.21和4.88克AXOS-15-0.27后通过尿排泄的对甲酚相比对照分别降低9％、21％、35％和41％(图16A)。摄入0.24、0.73、2.21和4.88克AXOS-15-0.27后通过尿排泄的苯酚相比对照分别降低45％、39％、33％和45％(图16B)。对剂量从0.24克到4.88克的所有AXOS-15-0.27来说，尿苯酚排泄的降低是显著的(p＜0.05)。因此证实AXOS-15-0.27是在极低剂量(低达每份0.24克)下有活性的人益生素。
在给予已知益生素如菊粉和乳果糖的人中已经观察到氮尿排泄的降低和粪便氮排泄的相应升高(De Preter等，2004；Geboes等，2005)。由于氨能缩短结肠上皮细胞的寿命、增加它们转变和使它们更加易于化学癌变，因此需要刺激通过粪便排泄氨(Visek，1978)。结肠腔中的氨主要来自未消化蛋白质的细菌发酵(Smith &Macfarlane，1996；Fooks等，1999)。慢发酵益生素碳水化合物，如具有中等聚合度的AXOS，能刺激存在于结肠内的糖解细菌和细菌的糖解途径。因此，这种化合物能抑制结肠中的蛋白水解发酵和刺激依赖碳水化合物作为主要碳源和能源的细菌重新利用氨作为氮源。同时，需要降低蛋白质发酵代谢物甲酚和苯酚的尿排泄，因为这些酚类化合物与肠癌有关(Bone等，1976)。已经观察到益生素乳果糖能降低酚类化合物的尿排泄(De Preter等，2004)。假设甲酚和苯酚的排泄降低是通过在益生素的刺激下提高结肠中糖解细菌的活性从而提高酪氨酸或蛋白质腐化代谢产物的利用率造成的。
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表
表1：不同(阿糖基)木聚糖制品的特性。AX：阿糖基木聚糖含量，表示为干物质％；
AIX：阿拉伯糖∶木糖比；avDPGC：通过气液色谱法确定的平均聚合度；avDPHPSEC：通过高效尺寸排阻色谱确定的平均聚合度。DP 90％范围：包括90％寡糖的聚合度范围。
aAX＝0.88×(％阿拉伯糖+％木糖)
bavDPHPSEC＝MMHPSEC/132
cN.D.＝未测定
dAXcor＝0.88×(％阿拉伯糖-0.7×％半乳糖+％木糖)
eA/Xcor＝(％阿拉伯糖-0.7×％半乳糖)/％木糖
表2：用于感官分析测试的不同化合物的浓度。
Figure G05822193X20070105D000342
表3.不同寡糖5％(w/v)溶液的表观固有粘度(dl/g)。
表4：通过MMCO为5kDa、10kDa或30kDa的单层膜超滤AXOS制品。回收率表示为原料中阿糖基木聚糖含量％。分析包括阿拉伯糖/木糖比(A/X)和通过气液色谱法确定的平均聚合度(avDPGC)。
Figure G05822193X20070105D000351
表5：连续通过10kDa和30kDa膜超滤AXOS制品。回收率表示为原料中阿糖基木聚糖含量％。分析包括阿拉伯糖/木糖比(A/X)和通过气液色谱法确定的平均聚合度(avDPGC)。
Figure G05822193X20070105D000352
表6：用于第二次鸡实验的鸡饲料膳食的营养成分和组成分析。
                                    营养成分                                         ％
                                    小麦                                         40.72
                                    黄玉米                                         17.00
                                    大豆粉-48                                         21.81
                                     HF大豆                                         10.00
                                     RA脂肪                                         6.54
                                     CaCO<sub>3</sub>                                         0.85
                                     D-Ca-磷酸盐                                         1.08
                                     NaCl                                         0.32
                                     R肌醇六磷酸酶                                         0.035
                                     Llys HCl                                         0.29
                                     DL甲硫氨酸                                         0.26
                                     L苏氨酸                                         0.10
                                     Vit.&Tr.el.预混物                                         1.00
                                     总计                                         100.005
                                    组成
                                    可代谢能量，MJ/kg                                         12.30
                                    粗蛋白，％                                         21.00
                                     d-lys，％                                         1.15
                                     d-SAA，％                                         0.80
                                     d-thr，％                                         0.75
                                     Ca，％                                         0.95
                                     Pav.，％                                         0.45
                                     Na+K-Cl，meq/kg                                         214
                                     C18：2，％                                         2.29
表7：用于大鼠实验的‘基础人膳食’的组成分析。

Claims (21)

1.一种调节人体肠道菌群的食品或饮品，每份所述食品或饮品含有0.25-5克阿糖基木聚糖，其中，所述阿糖基木聚糖的平均聚合度(DP)为5或7，或者当所述阿糖基木聚糖的A/X(阿拉伯糖∶木糖)比为0.40时，其平均DP为6，或者当所述阿糖基木聚糖的A/X比为0.50时，其平均DP为8。
2.如权利要求1所述的食品或饮品，其特征在于，每份所述食品或饮品含有1-3克所述阿糖基木聚糖。
3.如权利要求1或2所述的食品或饮品，其特征在于，所述食品是肉制品或乳制品。
4.如权利要求1或2所述的食品或饮品，其特征在于，所述饮品是非酒精饮料。
5.如权利要求4所述的食品或饮品，其特征在于，所述非酒精饮料是功能性软饮料。
6.如权利要求1或2所述的食品或饮品，其特征在于，所述食品含有双歧杆菌属或乳杆菌属的活细菌。
7.如权利要求1所述的食品或饮品，其特征在于，所述食品是含有谷物的食品，每份所述产品含0.25-5克DP低于200的阿糖基木聚糖，且其中所述阿糖基木聚糖的平均DP为5或7，或者当所述阿糖基木聚糖的A/X(阿拉伯糖∶木糖)比为0.40时，其平均DP为6，或者当所述阿糖基木聚糖的A/X比为0.50时，其平均DP为8。
8.如权利要求7所述的食品或饮品，其特征在于，所述食品含有1-3克所述阿糖基木聚糖。
9.如权利要求7所述的食品或饮品，其特征在于，所述食品是面包、蛋糕、早餐谷物、饼干或意大利面。
10.如权利要求1所述的食品或饮品，其特征在于，所述食品是工业制备的甜点。
11.如权利要求1所述的食品或饮品，其特征在于，所述食品或饮品是低卡路里制品。
12.一种制造营养添加剂的方法，该营养添加剂在制造如权利要求1所述的食品或饮品时用作添加剂，所述方法包括以下步骤：
i.通过使富含阿糖基木聚糖的材料脱淀粉化和脱蛋白质化从所述富含阿糖基木聚糖的材料分离水不可提取的阿糖基木聚糖组分，分别采用淀粉分解酶和蛋白水解酶；和
ii.用一种或多种木聚糖分解酶解聚水不可提取的阿糖基木聚糖组分。
13.一种制造营养添加剂的方法，该营养添加剂在制造如权利要求1所述的食品或饮品时用作添加剂，所述方法包括以下步骤：
i.自淀粉-面筋分离过程测流获得含部分解聚的水可提取的阿糖基木聚糖的制品；
ii.从所述含阿糖基木聚糖的制品除去淀粉和蛋白质，分别采用淀粉分解酶和蛋白水解酶；和
iii.用一种或多种木聚糖分解酶解聚所述制品中所含的阿糖基木聚糖。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述富含阿糖基木聚糖的材料是种子麸皮、或种子面粉，其中所述种子是小麦、大麦、黑麦、燕麦、玉米、高粱或稻米。
15.如权利要求12或13所述的方法，在木聚糖分解酶处理后进行超滤。
16.一种用于制造如权利要求1所述食品或饮品的营养添加剂，其特征在于，所述添加剂含有至少15％平均DP为5或7的阿糖基木聚糖，或者当所述阿糖基木聚糖的A/X(阿拉伯糖∶木糖)比为0.40时，其平均DP为6，或者当所述阿糖基木聚糖的A/X比为0.50时，其平均DP为8。
17.含有阿糖基木聚糖分子的阿糖基木聚糖制品在食品或饮品制造中作为食品添加剂的应用，所述阿糖基木聚糖分子的平均DP为5或7，或者当所述阿糖基木聚糖的A/X(阿拉伯糖∶木糖)比为0.40时，其平均DP为6，或者当所述阿糖基木聚糖的A/X比为0.50时，其平均DP为8，每份所述食品或饮品含0.25-5克这种阿糖基木聚糖。
18.如权利要求17所述的阿糖基木聚糖制品的应用，每份所述食品或饮品含1-3克所述阿糖基木聚糖。
19.如权利要求17所述的阿糖基木聚糖制品的应用，所述食品是面包、蛋糕、意大利面、饼干或早餐谷物。
20.如权利要求17所述的阿糖基木聚糖制品的应用，所述饮品是非酒精饮料。
21.如权利要求17所述的阿糖基木聚糖制品的应用，所述食品或饮品含有双歧杆菌属或乳杆菌属的活细菌。
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