ES2314676T3 - Preparacion prebiotica. - Google Patents
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Abstract
Producto alimentario o bebida que modula la flora intestinal humana, que comprende entre 0,25 y 5 g de arabinoxilanos por ración de dicho producto alimentario o bebida, en el que dichos arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio comprendido entre 5 y 50.
Description
Preparación prebiótica.
La presente invención se refiere a preparaciones
de arabinoxilano para utilizar como aditivos nutritivos
prebióticos y a método para mejorar la salud del tracto
gastrointestinal de seres humanos mediante el complemento de sus
dietas con dichos aditivos. En una forma de realización preferida,
las preparaciones de arabinoxilano se obtienen a partir de fuentes
naturales, tal como vegetales y más preferentemente cereales.
La presente invención se refiere a los efectos
positivos sobre la salud gastrointestinal, y más particularmente
sobre la flora intestinal, de alimentos con determinados
polisacáridos que no contienen almidón (NSP). Los NSP comprenden
una variedad de compuestos que presentan distintas propiedades
fisicoquímicas. Los arabinoxilanos, denominados también pentosanos,
constituyen un grupo importante de NSP de cereales y consisten en
una cadena principal de unidades de D-xilopiranosil
enlazadas \beta-1,4 a las que se enlazan unidades
de O-2 y/o O-3
\alpha-L-arabino-furanosil.
En un arabinoxilano normal, sin sustituir, monosustituido y
disustituido se encuentran residuos de xilosa (véase la figura 1).
Los arabinoxilanos puede ser tanto extraíbles con agua como no
extraíbles con agua. Estos últimos se pueden solubilizar
parcialmente en condiciones alcalinas o utilizando enzimas y
enlazar unas grandes cantidades de agua. Los arabinoxilanos
extraíbles con agua presentan extraordinario potencial de formación
de viscosidad. En general, sus masas moleculares son muy elevadas
(hasta 800.000 daltonios) en función de la fuente y del método de
extracción. A pesar del hecho de que son únicamente constituyentes
menores, resultan importantes para la funcionalidad de los cereales
en procesos biotecnológicos tales como la producción de almidón de
trigo, pasta y cerveza, la panificación y otras aplicaciones
alimentarias.
Se ha demostrado que algunos tipos de
oligosacáridos que se obtienen a partir del arabinoxilano o del
xilano (un polímero sin sustituir de unidades de
D-xilopiranosil enlazadas
\beta-1,4) presentan unas propiedades
prebióticas. Los prebióticos son unos compuestos, habitualmente
oligosacáridos no glucosídicos, que no se pueden digerir mediante
los enzimas del tracto gastrointestinal superior pero que se
fermentan selectivamente mediante algunos tipos de bacterias
intestinales del intestino grueso (Gibson & Roberfroid, 1995;
Roberfroid, 1988; Van Loo, 2004). La presencia de prebióticos en la
dieta provoca un cambio en la composición de la población
bacteriana intestinal, habitualmente caracterizada por un
incremento relativo en las especies de Lactobacillus y
Bifidobacterium. Dicho cambio en la flora intestinal se
asocia a una mejora de la salud general, una disminución de las
infecciones intestinales, un aumento de los niveles de ácidos
grasos de cadena corta intestinales, una mejor absorción de los
minerales y una inhibición del inicio del cáncer de colon (Van Loo,
2004).
Se ha demostrado que las preparaciones de
xilooligosacáridos (XOS, oligosacáridos que consisten en unidades
de D-xilopiranosil enlazadas
\beta-1,4) con predominancia de oligosacáridos
con un grado de polimerización (DP) de 2 a 3 (xilobiosa y
xilotriosa), provocan un incremento significativo en el nivel de
bifidobacterias en las heces y en el ciego de ratas (EP 0265970B1;
Campbell et al., 1997; Hsu et al., 2004), y en el
colon de seres humanos (Okazaki et al., 1990). Dichas
preparaciones de XOS ricas en xilobiosa inhiben asimismo los
síntomas iniciales de la carcinogenia de colon provocada por
productos químicos en ratas (Hsu et al., 2004) y mejoran la
absorción del calcio (Toyoda et al., 1993). Se ha demostrado
asimismo que una preparación que consiste predominantemente en
arabinoxil-oligosacáridos (AXOS) con un DP de 3 a 5
(arabinosilxilobiosa, arabinosilxilotriosa, arabinosilxilotetraosa
y diarabinosilxilotetraosa) incrementa los niveles de
bifidobacterias en los intestinos de ratas y ratones (Yamada et
al.,
1993).
1993).
Un inconveniente importante del que adolecen las
preparaciones comerciales de XOS actuales, que limitan seriamente
su potencial comercial, es su precio muy elevado en comparación con
otros oligosacáridos, lo que indica que los procesos de fabricación
actuales no son rentables. Se ha descrito un método para la
fabricación de preparaciones prebióticas con predominancia de unos
XOS con un DP de 2 a 3 que implican la extracción química del
xilano a partir de productos basados en vegetales (madera dura,
mazorcas, vainas de semilla de algodón, salvado de trigo, orujo de
cerveza) utilizando disoluciones de NaC1O y disoluciones de KOH muy
concentrado, y a continuación la hidrólisis enzimática del xilano
extraído mediante enzimas de endoxilanasa (EP 0265970B1). Se ha
utilizado un método similar para realizar una preparación
prebiótica de AXOS (preparación de AXOS con un DP de 3 a 5) que
implica la extracción química de arabinoxilano utilizando una
disolución alcalina concentrada y a continuación la eliminación de
las sales, la hidrólisis enzimática con endoxilanasa y
cromatografía en una columna de carbono (Yamada et al.,
1993). El principal inconveniente del que adolecen dichos métodos
es que la extracción química del xilano o del arabinoxilano no son
ecológicos y requieren una eliminación costosa de los productos
químicos mediante una diálisis exhaustiva o por ultrafiltración
antes de poder realizar la hidrólisis enzimática. Otro método para
producir XOS o AXOS implica la autohidrólisis hidrotérmica de
madera dura o de orujo de cerveza. En dicho método se calienta una
suspensión de materia vegetal en un reactor especial a 150 - 190ºC
durante 20 a 60 minutos (EP 0265970B1; Kabel et al., 2002;
Carvalheiro et al., 2004). El inconveniente de dicho método
es que, debido a la elevada temperatura de reacción, se producen
productos secundarios que no resultan aconsejables para propósitos
alimentarios, tales como el furfural, el hidroximetilfurfural y el
ácido levulínico (Carvalheiro et al., 2004).
Las preparaciones prebióticas de XOS y AXOS
descritas actualmente presentan un grado de polimerización medio
que es de 2 (EP 026597081) o de 4 (Yamada et al., 1993). En
el caso de aplicaciones particulares del sector alimentario, dichas
preparaciones adolecen de algunos inconvenientes. En primer lugar,
las preparaciones ricas en xilosa, que tiene un sabor dulce
aproximadamente de un 60% de la sacarosa (Suntory,
xiloologisacárido, guía informativa del producto, 2001). Se puede
pretender un sabor dulce en algunas aplicaciones, pero en otras
aplicaciones se pretende un sabor más neutro. Los
xilooligosacáridos con un grado medio bajo de polimerización
presentan asimismo un sabor dulce aproximadamente del 40% de la
sacarosa (Suntory, xiloologisacárido, guía informativa del producto,
2001). En segundo lugar, las preparaciones con un grado medio bajo
de polimerización presentan un nivel energético que no es
aconsejable en ingredientes para alimentos hipocalóricos. En el
cálculo del valor energético de los xilooligosacáridos, el valor de
la energía metabolizable de la xilosa se considera de 4 calorías
por g, 2 calorías por g en el caso de la xilobiosa y la xilotriosa,
y de 0 calorías por gramo en el caso de los
xilo-arabino-oligosacáridos con un
DP > 4 (Suntory, xiloologisacárido, guía informativa del
producto, 2001).
La patente US nº 2002/037331 describe
arabinoxilanos obtenidos a partir de salvado que se somete a
extrusión, hidrólisis enzimática, y el almidón se hidroliza. A
continuación se realiza una etapa de ultrafiltración con un valor
límite de 5.000 para purificar los oligosacáridos obtenidos de este
modo.
El documento
US-A-5.362.502 describe la
producción de pentosanos a partir de materiales harinosos que
pueden presentar un grado de polimerización aproximadamente de 50 ó
17. El documento WO 02/067698 describe métodos para el
fraccionamiento por vía húmeda de salvado de cereales en dos
fracciones ricas en proteínas, una que contiene aceites de germen y
otros componentes relacionados, una fracción de fibra, que retiene
asimismo la mayor parte de las proteínas de aleurona, y una
fracción de melaza.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se define mediante las
reivindicaciones. Se refiere a un aditivo nutritivo para utilizar
en la preparación de un producto alimentario o bebida que module
beneficiosamente la flora intestinal humana, comprendiendo dicho
aditivo arabinoxilanos que presentan un grado medio de
polimerización (DP) comprendido entre 5 y 50. Además, se
proporcionan diversos productos de alimentos y de bebidas que
comprenden el aditivo así como métodos para preparar dicho
aditivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Elementos estructurales de
arabinoxilanos. A: residuo de
\beta-D-xilopiranosil sin
sustituir. B: residuo de
\beta-D-xilopiranosil sustituido
en O-2 con una parte
\alpha-L-arabinofuranosil. C:
residuo de \beta-D-xilopiranosil
sustituido en O-3 con una parte
\alpha-L-arabinofuranosil. D:
residuo de \beta-D-xilopiranosil
sustituido en O-2 y en O-3 con unas partes
\alpha-L-arabinofuranosil. La
estructura C muestra el enlace del ácido ferúlico al O-5 de
un residuo
\alpha-L-arabinofuranosil.
Figura 2: Perfiles de masa molecular por HPSEC
de distintas preparaciones de AXOS. La columna era una Shodex
SB-806 HQ (300 x 8 mm, Showa, Denko K. K., Tokio,
Japón). Los volúmenes de elución estándares de pululano con una
masa molecular de 78,8 x 10^{4}, 40,4 X 10^{4}, 21,2 X
10^{4}, 11,2 X 10^{4}, 4,73 X 10^{4}, 2,28 X 10^{4}, 1,18 X
10^{4}, 0,59 X 10^{4} Da y de glucosa (180 Da) se indican
mediante un símbolo "x" de izquierda a derecha.
Figura 3: Porcentaje de degradación de
monosacáridos constituyentes de los
AXOS-15-0,27 (A),
xilooligo-95P (B) y fructooligosacáridos (C) para
distintos períodos de incubación a 100ºC a un pH de 2, 3, 7 y
11.
Figura 4: Porcentaje de hidrólisis de
AXOS-15-0,27 (A),
xilooligo-95P (B) y fructooligosacáridos (C) para
distintos períodos de incubación a 100ºC a un pH de 2, 3 y 7.
Figura 5: Porcentaje de hidrólisis de los
enlaces de xilosa (A) y los enlaces de arabinosa (B) en los
AXOS-15-0,27 para distintos períodos
de incubación a 100ºC a un pH de 2, 3 y 7.
Figura 6: Dulzura de los
AXOS-15-0,27,
xilooligo-95P (B) y sacarosa. Las curvas muestran
el porcentaje acumulativo de los individuos (n = 20) que reconocen
el sabor dulce trazadas con respecto a la concentración del
compuesto en g/l.
Figura 7: Perfiles de masa molecular por HPSEC
de fracciones de oligosacáridos obtenidas tras la ultrafiltración
de los AXOS producidos mediante tratamiento con endoxilanasa con
WU-AX secundario. Las membranas utilizadas
presentaron un MMCO de 5 kDa (panel A), 10 kDa (panel B) y 30 kDa
(panel C). La columna era una Shodex SB-802.5 HQ
(300 x 8 mm, Showa, Denko K. K., Tokio, Japón). Los marcadores de
masa molecular fueron pululanos estándar P-82 de
Shodex con una masa molecular de 11,2 x 10^{4}, 4,73 x 10^{4},
2,28 X 10^{4}, 1,18 X 10^{4} y 0,59 x 10^{4} Da,
xilooligosacáridos estándar con una masa molecular de 810 (DP6),
678 (DP5), 546 (DP4), 414 (DP3) y 282 Da (DP2) y glucosa con una
masa molecular de 180 Da, y su volumen de elución respectivo se
indica mediante un símbolo "x" de izquierda a derecha.
Figura 8: Perfiles de masa molecular por HPSEC
de fracciones de oligosacáridos obtenidas tras la ultrafiltración
por pases consecutivos a través de membranas con MMCO de 10 kDa y
30 kDa de AXOS producidos mediante tratamiento con endoxilanasa con
WU-AX secundario. Las fracciones analizadas son el
concentrado tras pasar a través de una MMCO de 30 kDa del
concentrado de una membrana de 10 kDa (RET_{10 \ kDa \ + \ 30 \
kDa}), el filtrado tras pasar a través de una MMCO de 30 kDa del
concentrado de una membrana de 10 kDa (PER_{10 \ kDa \ + \ 30 \
kDa}), o el filtrado tras pasar a través de una membrana de 10
kDa (PER_{10 \ kDa}). La columna era una Shodex
SB-802.5 HQ (300 x 8 mm, Showa, Denko K. K., Tokio,
Japón). Los marcadores de masa molecular fueron pululanos estándar
P-82 de Shodex con una masa molecular de 11,2 x
10^{4}, 4,73 x 10^{4}, 2,28 X 10^{4}, 1,18 X 10^{4} y 0,59
x 10^{4} Da, xilooligosacáridos estándar con una masa molecular
de 810 (DP6), 678 (DP5), 546 (DP4), 414 (DP3) y 282 Da (DP2) y
glucosa con una masa molecular de 180 Da, y su volumen de elución
respectivo se indica mediante un símbolo "x" de izquierda
a
derecha.
derecha.
Figura 9: Efectos de la adición al pienso para
pollos de los AXOS-7-0,34,
AXOS-122-0,66 o
xilooligo-95P en la flora del ciego de pollos. La
composición de la flora cecal se determinó al cabo de 1 y 2
semanas, respectivamente, tras el inicio del experimento mediante
recuento de placas para enterobacterias y bifidobacterias. Las
barras representan las medias de las determinaciones y las barras
de error indican las desviaciones típicas. En un momento
determinado los valores marcados con una letra distinta son
significativamente distintos entre sí según el test de Tukey a una
p < 0,05.
Figura 10: Efectos de la adición al pienso para
pollos de los AXOS-15-0,27 al 0,1% o
al 0,25%, fructooligosacáridos (FOS) al 0,25% o al 1% o
endoxilanasa en el número de bifidobacterias en el ciego de pollos
tras 14 días. Las bacterias que pertenecían al género
Bifidobacterium se determinaron mediante PCR cuantitativa.
Los valores marcados con una letra distinta son significativamente
distintos entre sí según el test de diferencias menos
significativas (p < 0,05; n = 3). Las barras representan las
medias de las determinaciones y las barras de error indican las
desviaciones típicas.
Figura 11: Efectos de la adición al pienso para
ratas de los AXOS-8-0,27,
AXOS-15-0,27,
AXOS-16-0,78 o
AXOS-122-0,6 al 0,25% en el nivel de
acetato (panel superior), propionato (panel intermedio) y butirato
(panel inferior) en las heces de las ratas tras 13 días de
alimentación. Los valores marcados con una letra distinta son
significativamente distintos entre sí según el test de diferencias
menos significativas (p < 0,05; n = 4). Las barras representan
las medias de las determinaciones y las barras de error indican las
desviaciones típicas.
Figura 12: Efectos de la adición a las dietas
para ratas de los AXOS-15-0,27 o
xilooligo-95P al 4% en el nivel de acetato en el
colon proximal (A), de acetato en el colon distal (B), de
propionato en el colon distal (C) y de butirato en el colon distal
(D) en ratas tras 14 días de alimentación. Las barras representan
las medias de las determinaciones y las barras de error indican las
desviaciones típicas.
Figura 13: Efectos de la adición a las dietas
para ratas de los AXOS-15-0,27 o
xilooligo-95P al 4% en el nivel de bifidobacterias
en el ciego tras 14 días de alimentación. Las bacterias que
pertenecen al género Bifidobacterium se determinaron
mediante PCR cuantitativa. Los valores marcados con una letra
distinta son significativamente distintos entre sí según el test de
diferencias menos significativas (p < 0,05; n = 4). Las barras
representan las medias de las determinaciones y las barras de error
indican las desviaciones típicas.
Figura 14: Efectos de la ingestión de 4,88 g/día
de los AXOS-15-0,27 o de 4,81 g/día
de WPC durante 14 días en el número de bifidobacterias en las heces
de seres humanos sanos voluntarios. Las bacterias que pertenecen
al género Bifidobacterium se determinaron mediante PCR
cuantitativa. Las barras representan las medias de las
determinaciones y las barras de error indican las desviaciones
típicas. Las barras con una estrella presentan una diferencia
significativa del nivel basal según la prueba de Wilcoxon para
datos emparejados (p < 0,05; n = 5).
Figura 15: Efectos de la ingestión de dosis
unitarias de los AXOS-15-0,27 (0,24,
0,73, 2,21 ó 4,88 g) en la excreción urinaria (A) y fecal (B) de
nitrógeno, y en el período de tránsito bucocecal (C). La excreción
de nitrógeno se expresa como el porcentaje del nitrógeno marcado
con ^{15}N administrado recuperado en las muestras tanto de orina
como de heces recogidas durante 0 a 48 h y 0 a 72 h tras la
ingestión del alimento del ensayo, respectivamente. El período de
tránsito bucocecal se expresa como el porcentaje del PEG marcado
con ^{3}H administrado en las muestras de heces recogidas durante
0 a 72 h. Las barras representan las medias de las determinaciones
y las barras de error indican las desviaciones típicas. Las barras
con una estrella o dos estrellas presentan una diferencia
significativa del nivel basal del tratamiento de control según la
prueba de Wilcoxon para datos emparejados (p < 0,05; n = 9) y p
< 0,01 (n = 9), respectivamente.
Figura 16: Efectos de la ingestión de dosis
unitarias de los AXOS-15-0,27 (0,24,
0,73, 2,21 ó 4,88 g) en la excreción urinaria de
p-cresol (A) y de fenol (B). La excreción del
p-cresol y del fenol se expresan como el contenido
total de p-cresol y fenol (mg) recuperados de las
muestras de orina recogidas durante 0 a 24 horas tras la ingestión
de la alimentación del ensayo. Las barras representan las medias de
las determinaciones y las barras de error indican las desviaciones
típicas. Las barras con una estrella o dos estrellas presentan una
diferencia significativa del nivel basal del tratamiento de control
según la prueba de Wilcoxon para datos emparejados (p < 0,05; n
= 9) y p < 0,01 (n = 9), respectivamente.
Se ha descrito anteriormente el efecto
prebiótico de complementar los alimentos o productos alimentarios
con preparaciones particulares de arabinoxilano. Más
particularmente las técnicas anteriores proporcionan ejemplos de
los efectos bifidogénicos por una parte en los
xiloarabinooligosacáridos que presentan un grado de polimerización
(DP) medio inferior a 4 y por otro lado en las preparaciones de
arabinoxilano que comprenden arabinoxilanos naturales de cadena
larga.
Las preparaciones disponibles de
xiloarabinooligosacáridos se producen bajo unas condiciones de
despolimerización rigurosas y sin control que tienen como resultado
la presencia de unos niveles relativamente elevadas de xilosa y de
xilooligosacáridos de cadena corta, que presentan un sabor dulce.
La dulzura de dichas preparaciones limita su utilización a unos
productos alimentarios específicos. Además, las moléculas de
xiloarabinooligosacáridos con un DP inferior a 4 presentan un
cierto contenido energético metabólico que no se pretende en
alimentos hipocalóricos.
Las características fisicoquímicas de los
arabinoxilanos naturales, tales como una viscosidad elevada y una
capacidad de retención del agua elevada, hacen que no resulten
apropiados para utilizar en una amplia gama de productos
alimentarios. La despolimerización parcial de los arabinoxilanos
naturales aumenta sus características fisicoquímicas y se han
descrito preparaciones que comprenden moléculas de arabinoxilano que
presentan un DP medio aproximadamente de 58. Sin embargo, la acción
prebiótica en seres humanos de dichos arabinoxilanos parcialmente
despolimerizados se ha demostrado únicamente con dosis
relativamente elevadas (> 6 g por día; Grasten et al.
2003).
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que las preparaciones de arabinoxilano que
comprenden arabinoxilanos que presentan un DP medio comprendido
entre 5 y 50 son agentes prebióticos potentes cuando se administran
a seres humanos y en los animales analizados como modelos para
seres humanos. Además, dichas preparaciones no presentan ninguno de
los inconvenientes fisicoquímicos u organolépticos de las
preparaciones que comprenden tanto arabinoxilanos naturales como
xiloarabinooligosacáridos de cadena corta. Se descubrió asimismo
que en seres humanos, ratas y pollos las preparaciones de
arabinoxilano de la presente invención presentaban un efecto
bifidogénico superior que las preparaciones que comprenden
arabinoxilanos parcialmente despolimerizados que presentan un DP
medio de 58 o superior. Además, se observó que las preparaciones de
arabinoxilano de la presente invención ejercen principalmente su
acción prebiótica en la parte distal del colon, mientras que los
xiloarabinooligosacáridos de cadena corta resultan más activos en
la parte proximal del colon. Dicho descubrimiento resulta
particularmente importante ya que parece ser que existe una
relación entre la composición de la flora del colon distal y del
desarrollo de enfermedades del colon y más particularmente el
cáncer de colon.
Aparte del efecto prebiótico de por sí, se
observaron asimismo otros efectos beneficiosos de la utilización de
preparaciones de arabinoxilano de la presente invención tales como
la reducción de la excreción de nitrógeno en la orina y el
incremento concomitante de la excreción de N en las heces, así
como una reducción de la excreción de cresol y fenol en la
orina.
Por lo tanto, constituye un primer objetivo de
la presente invención proporcionar la utilización de una
preparación de arabinoxilano que comprende moléculas de
arabinoxilano con un grado de polimerización (DP) medio comprendido
entre 5 y 50 como aditivo alimentario en la producción de un
alimento o una bebida que comprende entre 0,25 y 5 g de dichos
arabinoxilanos por ración de dicho alimento o bebida, o como base
de un complemento nutritivo. En una forma de realización preferida
la preparación de arabinoxilano comprende por lo menos un 15% de
dichas moléculas de arabinoxilano. En una forma de realización más
preferida la preparación de arabinoxilano comprende por lo menos un
30% de dichas moléculas de arabinoxilano, por ejemplo más del 60%.
En una forma de realización aún más preferida los arabinoxilanos
comprendidos en las preparaciones según la presente invención
presentan un DP medio comprendido entre 7 y 40, incluso más
preferentemente un DP comprendido entre 7 y 20. En una forma de
realización particular la presente invención proporciona la
utilización de una preparación de arabinoxilano que comprende
moléculas de arabinoxilano con un grado de polimerización (DP)
medio comprendido entre 5 y 7, o un grado de polimerización (DP)
medio de 6 con su proporción A/X (arabinosa con respecto la xilosa)
de 0,40, o un grado de polimerización (DP) medio de 8 cuando su
proporción A/X (arabinosa con respecto la xilosa) es de 0,5, como
aditivo alimentario en la producción de un alimento o una bebida
que comprende entre 0,25 y 5 g de dichos arabinoxilanos por ración
de dicho alimento o bebida. Preferentemente, el 90% de los
arabinoxilanos comprendidos en las preparaciones según la presente
invención presentan un DP comprendido entre 2 y 650, tal como se
determina utilizando cromatografía de exclusión por tamaños de alto
rendimiento (HPSEC), más preferentemente entre 2 y 130.
En una forma de realización preferida, las
preparaciones de arabinoxilano de la presente invención se pueden
obtener a partir de fuentes naturales, tales como la materia
vegetal y más preferentemente a partir de cereales. Se pueden
seleccionar fracciones de dichos arabinoxilanos naturales o se
pueden obtener mediante la despolimerización o la fragmentación de
dichos arabinoxilanos naturales o puede tratarse de análogos
estructurales producidos mediante procesos químicos, enzimáticos y/o
físicos. En una forma de realización preferida, las preparaciones
de arabinoxilano se obtienen a partir de una toma lateral de un
proceso de separación de gluten y almidón, tal como el WPC
(Pfeifer & Lagen). En otra forma de realización preferida, las
preparaciones de arabinoxilano se obtienen a partir de salvado de
cereales.
Los efectos prebióticos de las preparaciones de
arabinoxilano de la presente invención cuando se administran con la
alimentación se observaron con unas dosis de 0,25 g por ración. Por
lo tanto, un segundo objetivo de la presente invención proporciona
un producto alimentario o bebida que modula la flora intestinal
humana, que comprende entre 0,25 y 5 g de arabinoxilanos con un DP
medio comprendido entre 5 y 50 por ración de dicho producto
alimentario o bebida. En una forma de realización particular, la
presente invención proporciona un producto alimentario o bebida
que modula la flora intestinal y que comprende entre 0,25 y 5 g de
arabinoxilanos por ración de dicho producto alimentario o bebida,
presentando dichos arabinoxilanos un grado de polimerización (DP)
medio de 5 ó 7, o dichos arabinoxilanos presentan un grado de
polimerización (DP) medio de 6 cuando su proporción A/X (arabinosa
con respecto a la xilosa) es de 0,40, o dichos arabinoxilanos
presentan un grado de polimerización (DP) medio de 8 cuando su
proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,50. En
una forma de realización incluso más preferida el producto
alimentario o bebida comprende entre 1 y 3 g de arabinoxilanos que
presentan un DP medio comprendido entre 5 y 60 por ración. Tal como
se ha indicado anteriormente, las preparaciones de arabinoxilano
según la presente invención resultan particularmente apropiadas
como aditivo beneficioso para los alimentos
hipocalóricos.
hipocalóricos.
En una forma de realización particular el
producto alimenticio es un producto láctico tal como yogur o queso
fresco. Preferentemente dicho producto láctico comprende entre 0,25
y 5 g, más preferentemente entre 1 y 3 g, de arabinoxilanos que
presentan un DP medio entre 5 y 50 por 100 g por ración de 125 g.
Opcionalmente dicho producto láctico comprende bacterias vivas del
género Bifidobacterium o Lactobacillus, que puede
fermentar arabinoxilanos. En otra forma de realización particular
las bebidas de la presente invención son los denominados refrescos
funcionales sin alcohol. Preferentemente dichos refrescos
funcionales comprenden entre 0,25 y 5 g, más preferentemente entre
1 y 3 g, de arabinoxilanos que presentan un DP medio entre 5 y 50
por 100 ml. Alternativamente, dichos refrescos funcionales
comprenden la cantidad pretendida de dichos arabinoxilanos en 250
ml. En una forma de realización funcional los refrescos comprenden
bacterias vivas del género Bifidobacterium o
Lactobacillus, que puede fermentar arabinoxilanos.
En general, los productos alimentarios que
presentan cereales o materias obtenidas a partir de los cereales
como ingrediente contienen arabinoxilanos. Sin embargo, los
arabinoxilanos comprendidos en dichos productos alimentarios son
tanto arabinoxilanos naturales de cadena larga con un DP superior a
6.000 como arabinoxilanos parcialmente despolimerizados que
presentan un DP de por lo menos 200 a 300. Por lo tanto, el
enriquecimiento de dichos productos alimentarios con los
arabinoxilanos según la presente invención aumenta asimismo su
valor nutritivo. Preferentemente, dicho enriquecimiento se alcanza
añadiendo una cantidad determinada de la preparación de
arabinoxilano de la presente invención como ingrediente durante la
preparación de productos alimentarios que contienen cereales.
Resulta evidente que con dicho enriquecimiento se obtiene un
producto alimenticio que comprende arabinoxilanos que presentan un
DP de 200 o superior, próximo a un grupo de entre 0,25 y 5 g de
arabinoxilanos que presenta un DP inferior a 200 por ración de
dicho producto alimenticio, presentando dicho grupo de
arabinoxilanos un DP medio comprendido entre 5 y 50. En una forma
de realización particular, la presente invención proporciona un
producto alimentario que contiene cereales y que comprende entre
0,25 y 5 g de arabinoxilanos que presenta un DP inferior a 200 por
ración de dicho producto y presentando dicho grupo de
arabinoxilanos un grado de polimerización (DP) medio comprendido de
5 ó 7, o dichos arabinoxilanos presentan un grado de polimerización
(DP) medio de 6 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a
la xilosa) es de 0,40, o dichos arabinoxilanos presentan un grado
de polimerización (DP) medio de 8 cuando su proporción A/X
(arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,50. Los expertos en la
materia comprenderán que el enriquecimiento de los productos
alimentarios que contienen cereales con dicho grupo de
arabinoxilanos que presenta un DP inferior a 200 se pueden obtener
por lo menos en parte utilizando enzimas xilanolíticos bajo las
condiciones apropiadas durante la preparación de dichos productos
alimentarios. En una forma de realización particular dicho producto
alimentario es un producto de panadería tal como el pan.
Preferentemente dicho pan se enriquece con una cantidad comprendida
entre 0,25 y 5 g, más preferentemente entre 1 y 3 g, de
arabinoxilanos que presentan un DP medio comprendido entre 5 y 50
por 100 g. En otra forma de realización el producto alimentario es
un producto de repostería, tal como un pastel. Preferentemente
dicho producto de repostería se enriquece con una cantidad
comprendida entre 0,25 y 5 g, más preferentemente entre 1 y 3 g, de
arabinoxilanos que presentan un DP medio comprendido entre 5 y 50
por 100 g. En otra forma de realización adicional el producto
alimentario es un producto de pasta. Preferentemente dicho producto
de pasta se enriquece con una cantidad comprendida entre 0,25 y 5
g, más preferentemente entre 1 y 3 g, de arabinoxilanos que
presentan un DP medio comprendido entre 5 y 50 por 80 g. En otra
forma de realización adicional el producto alimentario es un cereal
para desayunos. Preferentemente dicho cereal para desayunos se
enriquece con una cantidad comprendida entre 0,25 y 5 g, más
preferentemente entre 1 y 3 g, de arabinoxilanos que presentan un
DP medio comprendido entre 5 y 50 por 30 g. En otra forma de
realización adicional el producto alimentario es un bizcocho.
Preferentemente dicho bizcocho se enriquece con una cantidad
comprendida entre 0,25 y 5 g, más preferentemente entre 1 y 3 g, de
arabinoxilanos que presentan un DP medio comprendido entre 5 y 50
por 125 g.
Otros productos alimentarios que se pueden
complementar beneficiosamente con las preparaciones de
arabinoxilano de la presente invención son por ejemplo, pero sin
limitarse a los mismos, productos de carne picada, chocolates,
galletas, barras y postres tales como los pudines.
En un tercer objetivo la presente invención
proporciona un aditivo nutritivo para utilizar como aditivo en la
preparación de un producto alimentario o bebida según la presente
invención, comprendiendo dicho aditivo por lo menos un 15% de
arabinoxilanos que presentan un grado de polimerización (DP) medio
comprendido entre 7 y 20. En una forma de realización particular la
presente invención proporciona un aditivo nutritivo a utilizar como
aditivo en la preparación de un producto alimentario o bebida según
la presente invención, comprendiendo dicho aditivo por lo menos un
15% de arabinoxilanos que presentan un grado de polimerización (DP)
medio comprendido entre 5 y 7, o dichos arabinoxilanos presentan un
grado de polimerización (DP) medio de 6 con su proporción A/X
(arabinosa con respecto la xilosa) de 0,40, o dichos arabinoxilanos
presentan un grado de polimerización (DP) medio de 8 con su
proporción A/X (arabinosa con respecto la xilosa) de 0,50. En una
forma de realización preferida el producto de complemento
alimentario es una cápsula, comprimido, polvo o similar. En una
forma de realización más preferida el producto de complemento
alimentario se formula de tal modo que permite una administración
diaria comprendida entre 0,25 y 5 g de arabinoxilanos que presentan
un DP medio comprendido entre 5 y 50, por ejemplo entre 1 y
3 g.
3 g.
\vskip1.000000\baselineskip
En un cuarto objetivo la presente invención
proporciona unos métodos para preparar un aditivo nutritivo a
utilizar como aditivo en la preparación de un producto alimentario
según la presente invención. En una primera forma de realización el
método comprende las etapas de:
- i.
- aislar la fracción de arabinoxilanos que no se puede extraer con agua a partir de un material rico en arabinoxilanos tal como el salvado, la harina de trigo o trigo secundario obtenido mediante la eliminación del almidón y la desproteinización de dicho material rico en arabinoxilanos, utilizando preferentemente enzimas amilolíticos y proteolíticos, respectivamente,
- ii.
- despolimerizar la fracción de arabinoxilanos que no se puede extraer con agua utilizando uno o más enzimas xilanolíticos.
\vskip1.000000\baselineskip
En una segunda forma de realización el método
comprende las etapas de:
- i.
- obtener una preparación que contiene arabinoxilanos que se pueden extraer con agua parcialmente despolimerizados, tal como una preparación obtenida en una toma lateral de un proceso de separación de gluten y almidón
- ii.
- si resulta necesario eliminar el almidón y las proteínas de dicha preparación que contiene arabinoxilanos, utilizando preferentemente enzimas amilolíticos y proteolíticos, respectivamente,
- iii.
- despolimerizar la fracción de arabinoxilano contenida en dicha preparación utilizando uno o más enzimas xilanolíticos.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización particular la
preparación se somete a ultrafiltración tras el tratamiento con los
enzimas xilanolíticos a fin de reducir la cantidad de monosacáridos
y oligosacáridos que presentan un DP de 4 o inferior de la
preparación.
\vskip1.000000\baselineskip
En un objetivo final la presente invención
proporciona un método para analizar la concentración y el DP medio
de un grupo de arabinoxilanos con un DP inferior a 200 en un
producto alimentario que contiene cereales. Dicho método comprende
las etapas de:
- i.
- triturar una muestra del producto alimentario que contiene cereales, preferentemente tras haber secado o liofilizado dicha muestra;
- ii.
- extraer la muestra triturada en agua destilada;
- iii.
- tratar el extracto con enzimas amilolíticos en las condiciones apropiadas a fin de transformar todo el almidón en glucosa, por ejemplo utilizando un tratamiento con amilasa y a continuación un tratamiento con amiloglucosidasa;
- iv.
- eliminar la glucosa de la muestra obtenida en (iii), por ejemplo metabolizando la glucosa utilizando levaduras;
- v.
- determinar el perfil de masa molecular de los arabinoxilanos comprendidos en la muestra obtenida en (iv), preferentemente utilizando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC);
- vi.
- calcular la cantidad relativa y el DP medio de la fracción de arabinoxilanos inferior a un DP de 200, por ejemplo mediante el análisis de la superficie que se encuentra por debajo de la curva de HPLC.
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La presente invención se ilustra con más detallo
mediante las formas de realización ilustrativas descritas a
continuación.
\newpage
Ejemplo
1
Xilooligo-95P. La
preparación comercial de xilooligosacáridos
Xilooligo-95P, que consiste predominantemente en
xilobiosa, xilotriosa y xilotetraosa, se obtuvo en Suntory LTD.
(Tokio, Japón).
Preparación de arabinoxilanos que no se
pueden extraer con agua a partir de salvado de trigo. Para la
preparación de arabinoxilanos que no se pueden extraer con agua
(WU-AX), se utilizó salvado de trigo comercial
(Meneba Meel BV, Rotterdam, Holanda) como material inicial. El
material distinto al arabinoxilano se retiró parcialmente del
salvado mediante tratamiento enzimático según el método descrito en
Maes et al. (2004). Una suspensión de salvado de trigo en
agua (1:7 p/v) se trató en primer lugar con una
\alpha-amilasa termoestable (Termamyl 120LS,
Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 150 \mul/g de salvado de trigo)
durante 90 minutos a 90ºC para hidrolizar el almidón. Tras enfriar
a 50ºC, se ajustó el pH de la suspensión a 6,0 utilizando HCl
concentrado y se incubó la suspensión con una proteasa (Neutrase
0.8L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 1 \mul/g de salvado de
trigo) durante 24 h a 50ºC para hidrolizar las proteínas
residuales. A continuación, se sometió a ebullición la suspensión y
se filtró, descartándose el filtrado. El residuo, al que se hace
referencia como "WU-AX de salvado", se lavó
con agua y se secó al aire.
Preparación de arabinoxilanos que no se
pueden extraer con agua a partir de harina de trigo o de almidón
secundario de trigo. La harina de trigo se puede fraccionar en
4 fracciones distintas utilizando métodos estándar (McRitchie,
1985): almidón A (almidón primario), almidón B (almidón secundario
o residual), gluten y fracción hidrosoluble. Los
WU-AX se concentran en la fracción del almidón
secundario. La materia distinta al arabinoxilano se retiró
parcialmente de la fracción secundaria mediante tratamiento
enzimático. Una suspensión de almidón secundario en agua (1:6 p/v)
se trató en primer lugar con una \alpha-amilasa
termoestable (Termamyl 120LS, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 30
\mul/g de almidón secundario) durante 60 minutos a 90ºC y
amiloglucosidasa (Megazyme, Bray, Irlanda, 20 \mug/g de almidón
secundario) durante 16 h a 60ºC para hidrolizar el almidón. Tras
hervir durante 30 minutos y centrifugar se incubó el residuo con
una proteasa (Neutrase 0.8L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca, 20
\mul/g de almidón secundario) durante 20 h a 50ºC para hidrolizar
las proteínas residuales. A continuación, se sometió a ebullición
de nuevo la suspensión (30 minutos), se filtró y se retiró el
filtrado. El residuo, al que se hace referencia como "harina de
WU-AX", se lavó con agua, etanol (95% v/v) y se
secó con aire. En vez de extraer los WU-AX a partir
del almidón del trigo, los WU-AX se pueden extraer
también directamente aislados a partir del almidón secundario del
trigo. En este caso se utilizó como materia inicial Meritena 233
(Tate & Lyle, Aalst, Bélgica), un producto secundario del
proceso industrial de separación del almidón y el gluten
comercialmente disponible. A continuación se trató una suspensión
de Meritena 233 en agua (1:5 p/v) con una a-amilasa
termoestable (Termamyl 120LS, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 30
\mul/g de Meritena 233) durante 60 minutos a 90ºC y
aminoglucosidasa (Megazyme, Bray, Irlanda, 20 \mug/g de Meritena
233) durante 16 h a 60ºC para hidrolizar el almidón. Tras hervir
durante 30 minutos y centrifugar, el residuo se incubó con una
proteasa (Neutrase 0.8L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca; 20
\mul/g de Meritena 233) durante 20 h a 50ºC para hidrolizar las
proteínas residuales. A continuación, se sometió a ebullición de
nuevo la suspensión (30 minutos), se filtró y se retiró el
filtrado. El residuo, al que se hace referencia como
"WU-AX secundario", se lavó con agua y etanol
(95% v/v), y se secó al aire.
Concentrado de pentosano de trigo (WPC).
El concentrado de pentosano de trigo (WPC, Pfeifer & Lagen,
Dormagen, Alemania) se obtiene a partir de la harina de trigo y su
composición química la describieron en detalle Courtin & Delcour
(1998). El WPC es rico en arabinoxilanos que se pueden extraer con
agua (aproximadamente un 43%) y materia proteica (aproximadamente
un 30%). La parte restante consiste principalmente en péptidos de
arabinogalactano (aproximadamente un 14%) y en un menor nivel,
glucosa polimérica (un 6%).
Preparación de AXOS con un DP medio de 122 y
una proporción A/X de 0,66
(AXOS-122-0,66). El material
inicial para la preparación de los
AXOS-122-0,66 fue el producto
comercial Wheat Pentosan Concentrate (WPC, Pfeifer & Lagen,
Dormagen, Alemania). El WPC se solubilizó en agua desionizada (1:10
p/v) y se añadió sílice como suspensión acuosa (20% p/v) hasta una
proporción sílice/proteína de 7:1. Se ajustó el pH de la mezcla a
4,8 utilizando HCl 0,1 M a fin de alcanzar una absorción máxima de
las proteínas con respecto al sílice. Tras 30 minutos de agitación,
la suspensión se filtró con un Buchner. Se retiró el residuo que
comprendía sílice/proteínas, al mismo tiempo que se sometió el
filtrado a precipitación con etanol. Se añadió etanol (95% v/v)
mientras se agitaba continuamente hasta una concentración final del
65% (v/v) y tras agitar durante unos 30 minutos adicionales,
depositarse (24 h, 24ºC) y filtrarse, el residuo obtenido se secó
con disolvente (etanol, acetona y éter dietílico) y se secó con
aire. El material obtenido se homogeneizó y se tamizó a través de
un tamiz de 250 \mum.
Preparación de AXOS con un DP medio de 16 y
una proporción A/X de 0,78
(AXOS-16-0, 78). Se prepararon
los AXOS-16-0,78 partiendo del
producto comercial Wheat Pentosan Concentrate (WPC, Pfeifer &
Lagen, Dormagen, Alemania). El WPC se trató con sílice para
eliminar las proteínas tal como se ha descrito para la preparación
de los AXOS-122-0,66. El filtrado
recuperado se continuó incubando a 30ºC durante 24 horas con un
XAA, una endoxilanasa de Aspergillus aculeatus (Shearzyme
500L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca) a 29 unidades por g de Wheat
Pentosan Concentrate. Tras la inactivación del enzima mediante
ebullición (30 minutos), la disolución obtenida se enfrió y se
sometió a una precipitación con etanol. El etanol (95% v/v) se
añadió mientras se sometía a agitación continua hasta una
concentración final del 80% (v/v) y tras agitar durante unos 30
minutos adicionales, sedimentación (24 h, 4ºC) y filtración, se
disolvió el residuo obtenido en agua desionizada y se sometió de
nuevo a precipitación con etanol. Se añadió etanol (95% v/v) bajo
agitación continua hasta una concentración final del 65% (v/v) y
tras agitar durante 30 minutos adicionales, sedimentar (24 h, 4ºC)
y filtrar, se retiró el material precipitado. El sobrenadante
restante se sometió a evaporación rotatoria, pera eliminar el
etanol, se disolvió en agua desionizada y se liofilizó. El material
obtenido se homogeneizó y se tamizó a través de un tamiz de 250
\mum.
Preparación de AXOS con un DP medio de 7 y
una proporción A/X de 0,34
(AXOS-7-0,34). El material
inicial para la preparación de los
AXOS-7-0,34 fue el
WU-AX de salvado que se aisló tal como se ha
descrito anteriormente. A continuación se incubó el
WU-AX de salvado a 30ºC durante 24 h con una
endoxilanasa XBS (Grindamyl H640, Danisco, Dinamarca) a 80 unidades
por g de WU-AX de salvado aislado en seco. Tras la
filtración y la inactivación del enzima mediante ebullición (30
minutos), se liofilizó el filtrado y el material obtenido se
homogeneizó y se tamizó a través de un tamiz de 250 \mum.
Preparación de AXOS con un DP medio de 15 y
una proporción A/X de 0,27
(AXOS-15-0,27). Se utilizó
salvado de trigo comercial (Dossche Mills & Bakery, Deinze,
Bélgica) como material inicial para la preparación de los
AXOS-15-0,27. En primer lugar se
trató una suspensión de salvado de trigo en agua (1:7 p/v) con una
a-amilasa termoestable (Termamyl 120LS, Novozymes,
Bagsvaerd, Dinamarca; 1 \mul/g de salvado de trigo) durante 90
minutos a 90ºC para hidrolizar el almidón. Tras enfriar a 50ºC, se
ajustó el pH de la suspensión a 6,0 utilizando HCl concentrado y se
incubó la suspensión con una proteasa (Neutrase 0.8L, Novozymes,
Bagsvaerd, Dinamarca; 40 \mul/g de salvado de trigo) durante 4 h
a 50ºC para hidrolizar las proteínas residuales. A continuación, se
sometió a ebullición la suspensión durante 20 minutos, se filtró,
y se descartó el filtrado. Se lavó el filtrado con agua y se volvió
a suspender en agua desionizada (1:14 p/v). Se incubó la suspensión
sometiéndola a agitación continua durante 10 h a 50ºC con
endoxilanasa XBS (Grindamyl H640, Danisco, Dinamarca) a 1,4
unidades por g de salvado de trigo al que se había retirado el
almidón y las proteínas, y durante otras 10 h a 50ºC tras la
adición de una segunda dosis de endoxilanasa XBS a 1,1 unidades por
g de salvado de trigo al que se había retirado el almidón y las
proteínas. Tras la inactivación del enzima mediante ebullición (30
minutos), se concentró la disolución hasta un 20% de materia seca
en un evaporador en capa delgada y finalmente se secó y se
deshidrató por aspersión.
Preparación de AXOS con un DP medio de 8 y
una proporción A/X de 0,27
(AXOS-8-0,27). Se prepararon los
AXOS-8-0,27 incubando una
disolución (1:10 p/v) de
AXOS-15-0,27 a 30ºC durante 1 h con
XAA, una endoxilanasa de Aspergillus aculeatus (Shearzyme
500L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca) a 125 unidades por g de
AXOS-15-0,27. Tras la inactivación
del enzima mediante ebullición (30 minutos), se liofilizó el
filtrado y el material obtenido se homogeneizó y se tamizó a través
de un tamiz de 250 \mum.
Preparación de AXOS con un DP medio de 39 y
una proporción A/X de 0,22
(AROS-39-0,22). Se prepararon
los AXOS-39-0,22 a partir de
WU-AX secundarios que se aislaron a partir de
almidón B Meritena 233 tal como se ha descrito anteriormente. Los
WU-AX, que presentaban una proporción A/X media de
0,63, se suspendieron a 3 g/l en una disolución amortiguadora de
acetato sódico 25 mM (pH 4,7) y se incubaron sometiéndose a
agitación continua durante 2 h a 30ºC con endoxilanasa XBS
(Grindamyl H640, Danisco, Dinamarca) a 3,3 unidades por g de
WU-AX secundario. Tras centrifugar (10.000 g, 15
minutos, 18ºC) se sometió a ebullición el sobrenadante durante 30
minutos, para inactivar el enzima, al mismo tiempo que se lavó el
residuo con la disolución amortiguadora de acetato sódico
mencionada anteriormente (1/4 del volumen inicial). Se inactivó el
agua del lavado (30 minutos, 100ºC) y se combinó con el
sobrenadante. Tras la filtración, la disolución obtenida se
liofilizó para producir AXOS con un DP_{GC} medio de 262 y una
proporción A/X de 0,50. La materia solubilizada con enzimas se
disolvió de nuevo en agua desionizada (1:20 p/v) y el pH de la
disolución se desplazó hasta 2,8 mediante la adición de HCl (1 M).
Se incubó la disolución durante 24 h a 90ºC para retirar una
fracción grande de los sustituyentes de la arabinosa con enlaces
\alpha-1,2 y \alpha-1,3, que son
más propensos a la hidrólisis ácida que las subunidades de xilosa
con enlaces \beta-1,4 de los AXOS. Tras enfriar a
temperatura ambiente, se neutralizó la disolución mediante la
adición de NaOH 1 M y se centrifugó (10.000 g, 20 minutos, 18ºC). Se
añadió etanol (95% v/v) al sobrenadante obtenido sometiéndose a
agitación continua hasta una concentración final de etanol del 80%
(v/v). Se agitó la mezcla durante 30 minutos adicionales y se
mantuvo durante la noche a 4ºC. Los compuestos de AXOS precipitados
se recuperaron mediante centrifugación (10.000 g, 20 minutos, 4ºC),
se disolvieron en agua desionizada, se liofilizaron y el material
obtenido se homogeneizó y se tamizó a través de un tamiz de 250
\mum.
Preparación de AXOS con un DP medio de 13 y
una proporción A/X de 0,21
(AXOS-13-0,21). Se prepararon
los AXOS-13-0,21 incubando una
disolución de AXOS-39-0,22 (3 g/l)
a 30ºC durante 2 h con XAA, una endoxilanasa de Aspergillus
aculeatus (Shearzyme 500L, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca) a
27,7 unidades por g de AXOS-39-0,22.
Tras la inactivación del enzima mediante ebullición (30 minutos), se
liofilizó la solución y el material obtenido se homogeneizó y se
tamizó a través de un tamiz de 250 \mum.
Se utilizaron distintas técnicas para
caracterizar las preparaciones de oligosacáridos.
El contenido glucídico total y de grupos
reductores terminales se determinó mediante análisis cromatográfico
gas - líquido tal como describen Courtin et al. (2000). El
contenido en arabinoxilano (AX) de las muestras se expresó como
0,88 x (% arabinosa + % xilosa). El grado de polimerización medio
de los AXOS determinado mediante cromatografía gas - líquido
(DP_{GC} medio) se calculó como la suma del contenido total en
xilosa y arabinosa dividido por el contenido en grupos reductores
terminales de xilosa. El contenido proteico (N x 5,7) de las
muestras se determinó mediante el método de combustión de Dumas una
adaptación del método oficial de la AOAC (1995).
La caracterización de los oligosacáridos
constituyentes de las preparaciones se realizó mediante
cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con
detección amperométrica por impulsos (HPAEC-PAD)
utilizando un sistema cromatográfico DX-500
(Sunnyvale, CA, EE.UU.) equipado con un detector electromecánico
ED-40, una bomba de gradiente GP-50
y un dispositivo automático de obtención de muestras
AS-3500. Se solubilizaron las muestras (10 mg) en
agua desionizada purificada (2 ml, resistencia específica 18
m\Omega-cm), se filtraron y se inyectaron (25
\mul) en una precolumna Carbopac PA-100 (4 x 25
mm) unida a una columna de intercambio de aniones Carbopac
PA-100 (4 x 250 mm). Se realizó la elución (1.0
ml/min) con un gradiente lineal de 0 a 250 mM de acetato sódico en
NaOH 100 mM durante 30 minutos, y a continuación un gradiente
lineal de 250 a 400 mM de acetato sódico en NaOH 100 mM durante 15
minutos. Tras el gradiente, la columna se eluyó durante 5 minutos
con NaOH 100 mM. Se realizó el seguimiento de la elución utilizando
el detector ED-40 detector en modo de detección
amperométrica de impulsos con los siguientes ajustes para los
potenciales y los períodos de tiempo: E_{1}, + 0,05 V (t_{1} =
400 ms); E_{2}, + 0,75 V (t_{2} = 200 ms); E_{3}, - 0,15 V
(t_{3} = 400 ms). Se utilizaron arabinosa (A), xilosa (X_{1}),
xilobiosa (X_{2}) y XOS con un DP comprendido entre 3 y 6
(X_{3} y X_{6}) como referencias.
Se realizó la cromatografía de exclusión por
tamaños de alto rendimiento (HPSEC) en un sistema de HPLC (Kontron
Instruments, 325 sistemas de bombeo, Kontron, Milán, Italia)
equipado con sistema de inyección automático. Se disolvieron todas
las preparaciones en cloruro sódico al 0.3% (1,5 ml), se filtraron
y se inyectaron (20 \mul) en una precolumna Shodex
SB-800P (Showa, Denko K. K., Tokyo, Japón, 50 x 6
mm) unida a una columna de HPSEC Shodex SB-806 HQ
(300 x 8 mm, intervalo de separación: 1 x 10^{2} - 20 x 10^{6}
Da). Se realizó la elución con cloruro sódico al 0,3% (0,5 ml/min;
30ºC) y se realizó el seguimiento con un detector del índice de
refracción (VDS Optilab, Berlín, Alemania). Los marcadores de masa
molecular fueron pululanos estándar Shodex P-82
(2.0 mg/ml) con unas masas moleculares de 78,8 x 10^{4}, 40,4 X
10^{4}, 21,2 X 10^{4}, 11, 2 X 10^{4}, 4, 73 X 10^{4}, 2,28
X 10^{4}, 1,18 X 10^{4} y 0,59 x 10^{4} Da, y glucosa con una
masa molecular de 180 Da. El grado de polimerización media (avDP)
de los oligosacáridos determinada mediante cromatografía de
exclusión por tamaños de alto rendimiento (avDP_{HPSEC}) se
calculó como MM_{HPSE}/132.
Determinación de la actividad de los enzimas
xilanolíticos. Se realizó la determinación colorimétrica de la
actividad de los enzimas xilanolíticos utilizando xilazima
(Megazyme, Bray, Irlanda) y un sustrato insoluble siguiendo las
instrucciones del fabricante para el ensayo. Se definió una unidad
como la cantidad de enzima necesario para producir un cambio en la
extinción a 590 nm de 1,0 en las condiciones del ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon distintos tipos de AXOS a partir
de salvado de trigo o almidón secundario de trigo tal como se ha
descrito en Materiales y métodos. Las propiedades de las distintas
preparaciones por lo que se refiere al contenido en arabinoxilano,
grado medio de sustitución (proporción de arabinosa con respecto a
la xilosa) y grado medio de polimerización se representan en la
Tabla 1, en la que se comparan con las del
Xilooligo-95P, una preparación comercial de XOS con
propiedades prebióticas conocidas (Campbell et al., 1997;
Hsu et al., 2004). Según la nomenclatura utilizada en la
Tabla 1 y asimismo de ahora en adelante, las preparaciones de AXOS
se refieren a AXOS-x-y, en las que x
es el grado medio de polimerización determinado mediante
cromatografía en gas - líquido e y es la proporción de arabinosa con
respecto a la xilosa. Las distintas preparaciones presentaban unos
grados medios de polimerización comprendidos entre 7 y 122 (en
comparación con el 2 del Xilooligo-95P), y los
grados de sustitución se encontraban comprendidos entre 0,21 y
0,78 (en comparación con el 0,09 del Xilooligo-95P).
Las preparaciones obtenidas a partir de salvado de trigo
(AXOS-7-0,34,
AXOS-15-0,27,
AXOS-8-0,27) presentaban un grado
de sustitución inferior que las preparaciones obtenidas a partir de
harina de trigo
(AXOS-122-0,66,
AXOS-16-0,78).
AXOS-16-0,78).
Se ha demostrado asimismo que el grado de
sustitución de los compuestos de AXOS se puede reducir mediante
tratamiento con ácido. De hecho, el
AXOS-39-0,22 se prepara a partir de
WU-AX secundario mediante distintas etapas que
comprenden el tratamiento con ácido (véase Materiales y métodos) y
ello reduce el grado medio de sustitución de 0,63 del
WU-AX secundario hasta 0,22 en el
AXOS-39-0,22.
La figura 2 representa la distribución de masas
moleculares de las distintas preparaciones de AXOS determinadas por
HPSEC. Todas las preparaciones de AXOS resultaron polidispersas y
consistían en entidades moleculares con un pico situado próximo al
avDP determinado por cromatografía en gas - líquido. El intervalo
de grados de polimerización en el que se encuentran el 90% de los
oligosacáridos, determinado a partir de los perfiles de elución por
HPSEC, se proporciona en la Tabla 1 para las distintas
preparaciones de AXOS.
\newpage
Ejemplo
2
Preparaciones de oligosacáridos. Se
obtuvieron xilooligo-95P,
AXOS-15-0,27,
AXOS-39-0,22, y
AXOS-13-0.21 tal como se ha
descrito en Materiales y métodos del ejemplo 1. La preparación de
fructooligosacáridos (FOS) fue el producto comercial Raftilose
(Orafti, Tienen, Bélgica). Los
AXOS-15-0,27 utilizados para el
análisis sensitivo se disolvieron en primer lugar en agua (1:25
p/v) y se trataron con carbono activado para eliminar los posibles
sabores extraños resultantes del proceso de producción. La
suspensión de AXOS-15-0,27 y
carbono activado (0,75 g/g de
AXOS-15-0,27) se agitó durante 1 h
a 18ºC, y tras decantar, se retiró el carbono activado por
centrifugación (10.000 g, 30 min, 18ºC).
Determinaciones de estabilidad. Las
determinaciones de estabilidad se realizaron en la parte extraíble
con agua de las preparaciones de oligosacáridos, que se obtuvo
mediante la suspensión de las preparaciones en agua desionizada
(1:10 p/v) y a continuación agitación (2 h, 18ºC), centrifugación
(10.000 g, 20 min, 18ºC) y filtración. Tras liofilizar el filtrado,
se disolvieron las muestras extraíbles con agua en una disolución
amortiguadora universal con unos valores de pH de 2, 3, 7 y 11 para
obtener unas disoluciones que presentaban unas concentraciones de
oligosacáridos del 0.15% (p/v). La disolución amortiguadora
universal se preparó a partir de una disolución inicial de 6,0 g de
ácido cítrico, 3,9 g de dihidrogenofosfato potásico, 1,8 g de ácido
bórico y 5.8 g de ácido dietilbarbitúrico en agua (1,0 l) (Britton
& Welford, 1937). Los alícuotas (20 ml) de dicha disolución
inicial se ajustaron con HCl 2,0 M o con NaOH 2,0 M para obtener el
pH pretendido.
Cada una de las disoluciones de oligosacáridos
se mantuvo en agua en ebullición durante unos períodos de tiempo
distintos (0, 5, 10, 15, 20, 30 y 60 minutos). A continuación, se
enfrió la disolución y se determinó el contenido glucídico total en
monosacáridos y en grupos reductores terminales mediante
cromatografía en gas - líquido tal como se ha descrito en
Materiales y métodos del ejemplo 1. El porcentaje de degradación de
los FOS se calculó con la fórmula (1), mientras que el porcentaje
de degradación de los xilooligo-95P y
AXOS-15-0,27 se calculó con la
fórmula (2). El porcentaje de hidrólisis de los FOS y los
xilooligo-95P y
AXOS-15-0,27 se calculó con las
fórmulas (3) y (4) respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
El porcentaje de enlaces hidrolizados de xilosa
y arabinosa en los AXOS-15-0,27 se
calcularon mediante las fórmulas (5) y (6) respectivamente.
Análisis sensitivos. Se realizaron los
análisis sensitivos en una habitación silenciosa en sesiones que
implicaban como máximo 10 voluntarios cada vez. Se pidió a los
individuos que se abstuvieran de comer y beber durante como mínimo
1 h antes de empezar la sesión. Se pidió que los individuos
participantes en el análisis se familiarizasen en primer lugar con
los procedimientos y posteriormente se les pidió que saboreasen
muestras codificadas con distintas concentraciones de
xilooligo-95P y
AXOS-15-0,27, sacarosa (estímulo
dulce de referencia), cloruro sódico (estímulo salado de
referencia) y ácido ascórbico (estímulo amargo de referencia)
preparados en agua desionizada purificada (resistencia específica
18 m\Omega-cm). La disolución con la
concentración más elevada de cada compuesto se numeró con la cifra
8 y la menos concentrada con la cifra 1 (Tabla 2). Se pidió a los
participantes que saborearan consecutivamente una gama completa de
concentraciones de un compuesto ordenada en concentraciones
crecientes, pero el orden en que cada uno de los compuestos
distintos se presentaba a cada individuo era aleatorio. Antes de
probar la serie de concentraciones de un compuesto, se enjuagaban la
boca dos veces con agua desionizada purificada (resistencia
específica 18 m\Omega-cm) y a continuación se
introducían 5 ml de cada disolución de ensayo en la boca del
participante mediante una jeringuilla desechable, se paladeaban
durante aproximadamente 5 segundos y a continuación se tragaban. Se
pidió a los participantes que indicaran la concentración inferior a
la que el sabor del compuesto se podía reconocer como dulce,
salado o amargo (umbral de reconocimiento individual). El umbral de
reconocimiento del sabor medio, determinado como la concentración a
la que la mitad de los participantes reconocieron la calidad de
sabor correcta de un compuesto particular, se calculó con los
datos de los umbrales de reconocimiento individuales obtenidos a
partir de 20 personas en total.
Determinaciones de la viscosidad. Se
realizaron determinaciones de la viscosidad en la parte extraíble
con agua de las preparaciones de oligosacáridos, que se obtuvo
mediante la suspensión de las preparaciones en agua (1:10 p/v) y a
continuación agitación (2 h, 18ºC), centrifugación (10.000 g, 20
minutos, 18ºC) y filtración. Tras liofilizar el filtrado, se
determinó la viscosidad de un 5.0% (p/v) de la disolución con un
viscosímetro de tipo Ostwald (Capillary Viscosimeter, Schott
Gerate, Tipo 50904) a 30ºC según Vinkx et al. (1991). Las
determinaciones de la viscosidad de la disolución se realizaron por
triplicado y se expresaron en relación (\eta_{rel}) con la del
agua desionizada dividiendo los períodos de flujo de cada una de
las disoluciones de oligosacáridos por los períodos de flujo del
agua desionizada en las mismas condiciones experimentales. Tras el
cálculo de la viscosidad específica (\eta_{sp} = \eta_{rel}
- 1), se determinó la viscosidad intrínseca aparente
([\eta_{app}], dl/g) utilizando la ecuación de Morris (Morris,
1984) tal como se indica en la fórmula (7) en la que c (expresada
como mg/ml) representa la concentración de oligosacáridos,
suponiendo que únicamente los oligosacáridos contribuyen a las
propiedades viscosas de las disoluciones. Tras cada análisis, se
lavó el viscosímetro dos veces con agua desionizada, dos veces con
etanol al 95%, una vez con acetona y una vez con éter dietílico y
posteriormente se secó con aire comprimido.
\vskip1.000000\baselineskip
Se comparó la estabilidad del pH de los
AXOS-15-0,27 con la de los
compuestos prebióticos conocidos, fructooligosacáridos (FOS,
producto comercial Raftilose) y xilooligosacáridos (XOS, producto
comercial Xilooligo-95P). Se mantuvieron los
distintos oligosacáridos a distintos valores de pH (pH 2, 3, 7 y
11) a 100ºC durante distintos períodos de tiempo. Se determinó la
degradación en porcentaje mediante la medida del descenso en el
contenido de los monosacáridos constituyentes, y se determinó la
hidrólisis en porcentaje mediante la medida del aumento de la
cantidad de monosacáridos constituyentes reductores. Tal como se
representa en la figura 3, ninguno de los oligosacáridos
experimentó una degradación sustancial a un pH bajo o neutro (pH de
2, 3 ó 7). Por otro lado, se observó degradación a un pH alcalino
(pH de 11) en los 3 oligosacáridos analizados. Dicho efecto resultó
más evidente en el caso del Xilooligo-95P, del que
un 73% se había degradado tras 60 minutos. Los oligosacáridos más
estables en condiciones alcalinas resultaron los
AXOS-15-0,27 (Figura 3). La
degradación observada a un pH alcalino se conoce como descamación
alcalina, una reacción que se produce a temperaturas elevadas (60 a
100ºC) y evoluciona desde el extremo reductor del oligosacárido
(Whistler & BeMiller, 1958; Santori et al., 2003).
De los tres oligosacáridos analizados, los FOS
resultaron claramente los más sensibles a la hidrólisis a un pH
bajo (figura 4). A un pH de 2 y un 3,58% y un 53% de FOS se
hidrolizaron tras 60 minutos. El Xilooligo-95P y
los AXOS-15-0,27 presentaron un
nivel de hidrólisis equivalente a un pH de 2. Sin embargo, los
AXOS-15-0,27 resultaron más estables
a un pH de 3 que el Xilooligo-95P, con únicamente
un 2% de hidrólisis de los
AXOS-15-0,27 en comparación con el
6% del Xilooligo-95P (figura 4). Las
investigaciones posteriores de la hidrólisis de los
AXOS-15-0,27 a un pH bajo
demostraron que los enlaces de la arabinosa resultan más
susceptibles ante la hidrólisis ácida que los enlaces de la xilosa.
De hecho, la incubación de los
AXOS-15-0,27 a un pH de 2, 100ºC
durante 60 minutos provocaron la hidrólisis del 54% de todos los
enlaces de la arabinosa, mientras que únicamente el 4% de los
enlaces de la xilosa se hidrolizaron en dichas condiciones (figura
5).
Se ha descrito que los xilooligosacáridos con un
DP bajo tal como el Xilooligo-95P presentan un
sabor dulce, con una dulzura aproximadamente del 40% de la de la
sacarosa (Suntory, xilooligosacárido, guía informativa del
producto, 2001). Hasta el momento no se conocen las propiedades del
sabor de los arabinoxilooligosacáridos con un grado superior de
polimerización. Con un grupo de análisis del sabor que consistía en
20 personas se ha determinado el umbral de reconocimiento del sabor
de los AXOS-15-0,27 y el
Xilooligo-95P. Las muestras del ensayo comprendían
asimismo, sacarosa, cloruro sódico y ácido ascórbico como
representantes de los sabores dulce, salado y amargo,
respectivamente. Se pidió a los participantes que indicaran la
concentración a la que reconocían un sabor como dulce, salado o
amargo para la serie de concentraciones de cada compuesto del
ensayo. Únicamente el 15% del grupo de análisis percibió un sabor
dulce para los AXOS-15-0,27 con la
concentración superior analizada (71,5 g/1), y ninguno de los
participantes indicó un sabor salado o amargo. El umbral medio de
reconocimiento del sabor para la dulzura de la sacarosa y el
Xilooligo-95P fue de 7 y 24 g/l, respectivamente,
mientras que el de los AXOS-15-0,27
es superior a 71,5 g/l. Los
AXOS-15-0,27 resultan por lo tanto
más de 10 veces menos dulces que la sacarosa y más de 3 veces menos
dulces que el Xilooligo-95P, que por sí mismo es
menos dulce que la sacarosa.
Se determinó la viscosidad para los
AXOS-15-27,
AXOS-39-0,22 y
AXOS-13-0,21, y se comparó con la de
los fructooligosacáridos (FOS, producto comercial Raftilose) y los
xilooligosacáridos (XOS, producto comercial
Xilooligo-95P). Tal como se representa en la Tabla
3, las distintas preparaciones de AXOS presentan una viscosidad
intrínseca aparente superior que es de 3 a 10 veces superior con
respecto a los FOS y el Xilooligo-95P.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Preparación de AXOS. Se preparó
WU-AX secundario tal como se ha descrito en
Materiales y métodos del ejemplo 1. El WU-AX
secundario se suspendió en una disolución amortiguadora de acetato
de sodio (25 mM, pH 4.7) a 3 g/l y se incubó con XAA, una
endoxilanasa de Aspergillus aculeatus (Shearzyme 500L,
Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca), a 18,4 U por g de
WU-AX secundario durante 4 h a 30ºC. Tras la
inactivación de los enzimas mediante ebullición durante 30 minutos
y la posterior filtración de la suspensión, se recuperaron los
AXOS en el filtrado.
Separación de los AXOS por
ultrafiltración. Se fraccionaron los AXOS en un dispositivo de
ultrafiltración "HP4750 con célula de agitación" terminal
(Sterlitech Corporation, Kent, EE. UU.). Las membranas de
ultrafiltración utilizadas presentaban un límite de masa molecular
(MMCO) de 5 kDa (P005F, Celgard, Wiesbaden, Alemania), 10 kDa
(PES-10, Synder Filtration, Vacaville, CA, EE. UU.),
o 30 kDa (PES-030H, Celgard). La polarización de la
concentración en la superficie de la membrana se minimizó con un
mecanismo de barra agitadora magnética recubierta con teflón que se
dispuso en una posición central en la célula y presentaba una
velocidad de agitación de 700 rpm. La fuente de presión era una
botella de nitrógeno gaseoso comprimido. La presión se controló
mediante un presóstato y se realizaron todos los experimentos de
filtración a una presión constante de 4 bar a temperatura ambiente.
La célula de ultrafiltración terminal se llenó con 300 ml de la
disolución a fraccionar y se detuvo la filtración cuando se hubo
recogido un volumen total aproximadamente de 200 ml de
filtrado.
Caracterización de las preparaciones
aisladas. Véase Materiales y métodos del ejemplo 1. Se realizó
la cromatografía de exclusión por tamaños de alto rendimiento
(HPSEC) tal como se ha descrito en Materiales y métodos del ejemplo
1, exceptuando que se utilizó una columna de HPSEC Shodex
SB-802.5 HQ (Showa, Denko K. K., Tokyo, Japón, 300
x 8 mm, intervalo de separación: 1 x 10^{2} -1 x 10^{4} Da).
Los marcadores de masa molecular fueron pululanos estándar Shodex
P-82 (2.0 mg/ml) con unas masas moleculares de 11,2
x 10^{4}, 4,73 X 10^{4}, 2,28 X 10^{4}, 1,18 X 10^{4} y
0,59 x 10^{3} Da, xilooligosacáridos estándar con una masa
molecular de 810 (DP6), 678 (DP5), 546 (DP4), 414 (DP3) y 282 Da
(DP2) y glucosa con una masa molecular de 180 Da.
\vskip1.000000\baselineskip
La presencia de oligosacáridos con una baja masa
molecular dulces y metabolizables en las preparaciones de AXOS
puede resultar inconveniente para aplicaciones particulares como
componente alimentario, mientras que para otras aplicaciones se
puede pretender utilizar preparaciones de AXOS de sabor dulce que
comprendan principalmente oligosacáridos con una baja masa
molecular. Por este motivo resulta útil desarrollar un método que
permite fraccionar preparaciones de AXOS de tal modo que los
AXOS/XOS con un DP de 2 a 3 se separan de los AXOS con un DP
superior. El fraccionamiento de los arabinoxilanos se ha realizado
anteriormente mediante la precipitación con disoluciones
alcohólicas con concentraciones distintas (Courtin & Delcour,
1998). Sin embargo, la aplicación de la precipitación con alcoholes
a escala industrial resulta técnica y económicamente poco
atractiva. Por lo tanto, se investigó la viabilidad del
fraccionamiento enzimático adicional de los AXOS producidos por
ultrafiltración.
A título de ejemplo, AXOS preparados mediante
incubación de WU-AX secundario con XAA (18.4 U/g)
durante 4 h a 30ºC se sometieron a ultrafiltración utilizando
membranas con un límite de masa molecular (MMCO) de 5 kDa, 10 kDa,
o 30 kDa.
Cuando se utiliza la membrana de 5 kDa, el
perfil de HPSEC de la fracción del filtrado (PER_{5 \ kDa})
(Figura 7a) presenta principalmente oligosacáridos que
corresponden al tamaño de la xilobiosa (DP2) y la xilotriosa (DP3).
La fracción retenida (RET_{5 \ kDa}), que contiene un 86% de
arabinoxilanos solubles de la disolución inicial de AXOS (Tabla 4),
presenta básicamente la misma masa molecular que la preparación de
AXOS antes de la ultrafiltración, exceptuando que la cantidad de
oligosacáridos con DP2 y DP3 se reduce aproximadamente a la mitad
(Figura 7a). La eliminación incompleta de los oligosacáridos con un
DP bajo de la fracción RET_{5 \ kDa} tiene como resultado su
retención como consecuencia de los flujos disminuidos del filtrado
provocados por la presencia de componentes con una masa molecular
elevada.
Mediante la ultrafiltración realizada utilizando
una membrana de 10 kDa, el 34% del contenido de arabinoxilanos se
recuperó en la fracción del filtrado, mientras que el 65% se retuvo
en la fracción del filtrado (Tabla 4). La fracción del filtrado
(PER_{10 \ kDa}) contenía principalmente oligosacáridos con DP2 a
DP6.
La fracción retenida (RET_{10 \ kDa})
presentaba un nivel bajo de oligosacáridos de tamaño pequeño con un
DP de 2 a 4, y consistía principalmente en monosacáridos con una
masa molecular comprendida entre 700 y >110.000 Da (DP5 a
DP>850) (Figura 7b). En comparación con la fracción PER_{10 \
kDa}, el filtrado obtenido con la membrana de 30 kDa (PER_{30 \
kDa}) presentaba un contenido superior en oligosacáridos del
intervalo de 1000 a 10.000 Da. Correspondientemente, la fracción
retenida de la membrana de 30 kDa (RET_{30 \ kDa}) presentaba un
contenido inferior de oligosacáridos del intervalo de 1000 a
10.000 Da en comparación con RET_{10kDa}, pero sorprendentemente
el contenido de oligosacáridos de DP2 y DP3 resultó superior en
RET_{30 \ kDa} que en RET_{10 \ kDa}.
Observando la Tabla 4 resulta evidente que la
ultrafiltración influye en la proporción A/X de las fracciones AXOS
obtenidas. Las fracciones del filtrado (PER_{5 \ kDa}, PER_{10 \
kDa} y PER_{30 \ kDa}) se enriquecieron con oligosacáridos con
una proporción A/X relativamente baja, mientras que las fracciones
retenidas (RET_{5 \ kDa}, RET_{10 \ kDa} y RET_{30 \ kDa})
contenían componentes con una proporción A/X superior.
Para analizar la posibilidad de un
fraccionamiento adicional de los AXOS por ultrafiltración, se
sometió la fracción RET_{10kDa} a un segundo proceso de
ultrafiltración en el que se utilizó una membrana con un MMCO de 30
kDa. Los perfiles de HPSEC de la fracción del filtrado (PER_{10 \
kDa \ + \ 30 \ kDa}) y de la fracción retenida (RET_{10 \ kDa \ +
\ 30 \ kDa}) obtenidos tras la ultrafiltración de la RET_{10 \
kDa} a través de una membrana con un MMCO de 30 kDa se presentan,
junto con la fracción PER_{10 \ kDa}, en la figura 8.
La fracción RET_{10 \ kDa \ + \ 30 \ kDa}
contiene principalmente componentes con una masa molecular elevada
(> 20.000 Da) que aparecen en el volumen vacío de la columna
Shodex SB-802.5 HQ. La fracción PER_{10 \ kDa \ + \
30 \ kDa}, que representa aproximadamente el 25% de los
arabinoxilanos de la disolución inicial de AXOS (Tabla 5), consiste
principalmente en oligosacáridos de tamaño medio con una masa
molecular comprendida entre 700 y 10.000 Da (DP 5 a 75) (figura
8).
Dichos resultados indican que la
ultrafiltración, utilizando preferentemente una membrana con un
MMCO de 10 kDa se puede utilizar como método para realizar
preparaciones de AXOS con tanto un contenido elevado en
oligosacáridos con un DP2 - 6, tomando el filtrado de la
ultrafiltración, como con un contenido elevado de oligosacáridos con
un DP > 4 y un bajo contenido de DP2 - 4, tomando el retenido de
la ultrafiltración. La ultrafiltración consecutiva, utilizando
preferentemente el retenido de una membrana de 10 kDa y pasando el
mismo por una membrana de 30 kDa, se puede utilizar para obtener
una fracción de AXOS enriquecida en AXOS comprendidos entre un DP
de 5 a 75.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Preparaciones de oligosacáridos. Véase
Materiales y métodos del ejemplo 1.
Análisis microbiológicos mediante recuento de
placas. El contenido cecal de los pollos se pesó, se diluyó
1:10 en una disolución salina fisiológica de peptona estéril (PPSS;
bactopeptona al 0.1 %, NaCl al 0.85%), se homogeneizó en un
dispositivo de digestión y se diluyó adicionalmente en PPSS según
un esquema de dilución décuplo. A continuación se cultivaron en
placa las diluciones apropiadas utilizando la técnica de vertido
en placa en agar con glucosa, bilis y rojo violeta (VRBG; Oxoid
CM0485B, Basingstoke, Reino Unido) para el recuento de
enterobacterias, y en agar anaeróbico
Wilkins-Chalgren (Oxoid CM619) modificado mediante
la adición de ácido acético glacial (1 ml/l) y mupirocina (100
mg/1) para las bifidobacterias. Las últimas modificaciones mejoran
la selectividad del agar de Wilkins-Chalgren agar
para las bifidobacterias, y el agar de
Wilkins-Chalgren modificado resultó particularmente
apropiado para la determinación en una etapa del recuento de
bifidobacterias en el ciego de pollos (Rada et al., 1999;
Rada & Petr, 2000). Se realizó el recuento de las colonias tras
1 día de incubación aeróbica a 37ºC para las enterobacterias, y
tras 4 días de incubación anaeróbica (en frascos anaeróbicos con el
sistema anaerógeno Oxoid AN0025A) a 37ºC para las bifidobacterias.
Los recuentos se expresaron en g por contenido cecal. Se tomaron
diversas precauciones para minimizar la exposición de las
bifidobacterias al oxígeno durante la preparación de las muestras:
(i) el contenido cecal se retiró del ciego únicamente antes de
iniciar la preparación de la muestra; (ii) los diluyentes y los
agares se sometieron al autoclave o a ebullición justo antes de
utilizarlos para retirar el oxígeno disuelto; (iii) las placas para
los recuentos de bifidobacterias se dispusieron en una atmósfera
anaeróbica 2 h a partir del inicio de la preparación de la
muestra.
Análisis microbiológicos mediante PCR
cuantitativa. La extracción del ADN se realizó tal como
describen Van de Wiele et al. (2004) en muestras cecales
diluidas 1:5 en PPSS. Se realizó la amplificación en 25 \mul de
mezclas de reacciones utilizando disoluciones amortiguadoras
enriquecidas con los reactivos SYBR® Green PCR Core tal como
describen los proveedores (PE Applied Biosystems, Nieuwerkerk a/d
Ijssel, Holanda) en placas de reacción de 96 pocillos MicroAmp
Optical con tapones ópticos (PE Applied Biosystems). Se utilizaron
los cebadores directos e inversos, BIF164f y BIF163r
respectivamente (Satokari et al., 2001) a una concentración
de 1 \muM para la detección de copias de los genes de ARN
ribosómico 16S de las bacterias del género Bifidobacterium.
El programa de temperaturas de la PCR fue el siguiente: 50ºC
durante 2 minutos, 95ºC durante 10 minutos, a continuación 40
ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 62ºC durante 1 minuto y 60ºC
durante 1 minuto. El molde de ADN se amplificó en mezclas de
reacción por triplicado y se realizó el seguimiento con un
dispositivo ABI Prism SDS7000 (PE Applied Biosystems). Las curvas
normales se construyeron basándose en la amplificación por PCR en
tiempo real en reacciones cuádruples en cuatro diluciones distintas
de ADN obtenido a partir de un cultivo de Bifidobacterium
breve (cepa LMG11042). Los datos de la PCR en tiempo real para
las muestras experimentales se trazaron en comparación con la curva
normal y se corrigieron con respecto a la eficiencia de la
extracción del ADN utilizando un factor que consistía en la
concentración del ADN de la muestra experimental con la mayor
concentración de ADN dividido por la concentración de ADN de cada
muestra experimental individual.
Análisis estadísticos. El efecto de las
distintas dietas en la masa corporal, la ingesta alimentaria o la
composición microbiana de los intestinos de los animales se analizó
mediante análisis de la varianza unifactorial a un nivel de
confianza del 95% utilizando el software
Analyse-it, versión 1.71. En el caso de que se
observase un efecto estadísticamente significativo para el factor
dieta, se analizaron las diferencias entre dietas tanto mediante el
test de diferencias menos significativas (LSD) o mediante el test
de Tukey a un nivel de confianza del 95%.
El efecto de la adición de preparaciones
obtenidas a partir de distintos (arabino)xilanos se analizó
con respecto a la composición de los intestinos gruesos de los
pollos.
Para un primer experimento, se adquirieron
pollos de 64 días de edad (gallos Ross) de un criadero comercial
(Avibel, Teilt, Bélgica) y se distribuyeron en 4 corrales (16
pollos por corral). En cada corral existía un abrevadero y un
depósito para los alimentos de 1 m. La temperatura del establo era
de 35ºC cuando llegaron las aves y se disminuyó posteriormente 1ºC
cada 2 días. Los animales se mantuvieron con un fotoperíodo de 23
horas de luz y 1 hora de oscuridad.
Las comidas (1 comida por corral) y el agua
potable se administraron a discreción. La duración del experimento
fue de 14 días.
Se analizaron los siguientes alimentos
experimentales:
- \sqbullet
- Pienso de control
- \sqbullet
- Pienso de control + preparación de AXOS-7-0,34 al 0,25% (0,17% de AX puro)
- \sqbullet
- Pienso de control + preparación de AXOS-122-0,66 al 0,25% (0,18% de AX puro)
- \sqbullet
- Pienso de control + Xilooligo-95P al 0,25% (0,22% de AX puro)
Las concentraciones indicadas entre corchetes se
corrigieron con respecto a su pureza calculada por su contenido en
AX. El pienso de control consistía en un pienso inicial comercial
(Krix 0, Hendrix UTD, Boxmeer, Holanda) que contenía una mezcla
enzimática de xilanasa y glucanasa (Roxazyme) como aditivo.
Se pesaron todos los animales a la edad de siete
días y se seleccionaron al azar 8 animales por grupo y se
sacrificaron por decapitación. A continuación se disecaron los
animales para extraer los ciegos. Se vaciaron los ciegos y los
contenidos se reunieron en dos grupos por tratamiento (cuatro
ciegos cada uno). Se repitió dicho protocolo cuando los animales
restantes alcanzaron la edad de catorce días, exceptuando que los
ciegos se reunieron en tres grupos por tratamiento (de tres, tres y
dos animales cada uno).
En el caso de los animales del grupo de los
AXOS-7-0,34 no se observaron
diferencias significativas en el peso corporal con respecto al
grupo de control. Los animales del grupo de los
AXOS-122-0,66 y el
Xilooligo-95P presentaron un peso corporal
significativamente inferior al grupo de control tras siete días,
pero en los animales analizados tras 14 días la diferencia con el
control no era significativa. En el caso del grupo de los
AXOS-122-0,66 el peso corporal
relativamente inferior tras 7 días se podría deber a un peso
corporal significativamente inferior de los pollos de este grupo
en la eclosión.
El análisis de la flora microbiana cecal de los
pollos indicó unos niveles elevados de enterobacterias
(aproximadamente 10^{8} - 10^{9} / g del contenido cecal),
tanto tras 7 días como tras 14 días de alimentación, y no se
observaron diferencias significativas con respecto a ninguno de los
tratamientos. Los niveles de bifidobacterias tras 7 días eran bajos
en todos los grupos de tratamiento (aproximadamente 10^{2} -
10^{3} / g del contenido cecal) (figura 9), exceptuando los
animales del grupo del Xilooligo-95P en los que el
nivel de bifidobacterias era muy superior (aproximadamente 10^{8}
/ g del contenido cecal). Tras 14 días el número de bifidobacterias
en el ciego permanecía bajo en el grupo de control. En cambio, se
observó un claro incremento en el número de bifidobacterias (en un
factor aproximadamente de 10^{5}) del contenido cecal del grupo
de los AXOS-7-0,34. En el grupo del
Xilooligo-95P, el nivel de bifidobacterias era
ligeramente inferior con respecto al nivel tras 7 días, pero tras
14 días era significativamente superior que para el grupo de
control. En el grupo de los
AXOS-122-0,66 se produjo un
incremento moderado del número de bifidobacterias del contenido
cecal tras 14 días, aunque dicho incremento no era significativo
con respecto al grupo de control.
Para un segundo experimento con pollos, se
adquirieron pollos de 54 días de edad (gallos Ross) de un criadero
comercial (Avibel, Teilt, Bélgica) y se distribuyeron en 6 corrales
(9 pollos por corral). Las condiciones de los corrales fueron las
descritas en el primer experimento (véase anteriormente).
La duración del experimento fue de 14 días:
Se analizaron los siguientes alimentos
experimentales:
- \sqbullet
- Pienso de control
- \sqbullet
- Pienso de control + preparación de AXOS-15-0,27 al 0,141% (0,1% de AX puro)
- \sqbullet
- Pienso de control + preparación de AXOS-15-0,27 al 0,352% (0,25% de AX puro)
- \sqbullet
- Pienso de control + preparación de FOS al 0,263% (0,25% de FOS puros)
- \sqbullet
- Pienso de control + preparación de FOS al 1,053% (1% de FOS puros)
- \sqbullet
- Pienso de control + preparación de xilanasa al 0,01%
Las concentraciones indicadas entre corchetes se
corrigieron con respecto su pureza calculada por su contenido en
AX o FOS. La preparación de FOS fue el producto comercial Raftilose
(Orafti, Tienen, Bélgica). La preparación de xilanasa fue el
producto comercial Belfeed (Beldem,
Groot-Bijgaarden, Bélgica). La composición del
pienso de control se proporciona en la Tabla 6. A la edad de 14
días todos los animales se pesaron y se sacrificaron por
decapitación. A continuación se disecaron los animales para extraer
los ciegos y los contenidos de los ciegos se reunieron para 3
animales que pertenecían al mismo grupo de tratamiento. El número
de bifidobacterias en las muestras cecales reunidas se determinó
mediante PCR cuantitativa.
Tras dos semanas de alimentación con las dietas
respectivas, no se pudieron observar diferencias significativas en
el peso corporal entre los distintos tratamientos. Con respecto al
número de bifidobacterias en el ciego de los pollos tras 2 semanas,
únicamente los pollos alimentados con la dieta que contenía
AXOS-15-0,27 al 0,25% presentaron
diferencias significativas con respecto al tratamiento de control
(figura 10).
El número de bifidobacterias en los pollos
alimentados con AXOS-15-0,27 al
0,25% resultó 22 veces superior al de los pollos alimentados con la
dieta de control. Se ha de indicar que los fructooligosacáridos
(FOS), un compuesto prebiótico bien documentado que se incluyó con
propósitos comparativos, no provocó un incremento del número de
bifidobacterias en los ciegos de los pollos, incluso con una dosis
4 veces superior a la que los
AXOS-15-0,27 resultan efectivos.
Ello indica que los AXOS-15-0,27
constituyen un compuesto bifidogénico sorprendentemente
potente.
Las bifidobacterias se han asociado
positivamente a la salud en animales y en seres humanos y son
componentes de muchos compuestos probióticos. Ha existido un
interés creciente en enriquecer selectivamente dichas poblaciones
bacterianas en el tracto gastrointestinal, además de proporcionar
alimentos directamente con preparaciones microbianas, para fomentar
o mantener un estado de salud positivo en animales y en seres
humanos, comprendiendo un efecto inhibidor en el cáncer colorrectal
(Van Loo et al, 2004). Los resultados de los ensayos de
alimentación con pollos indican que todos los alimentos que
contienen arabinoxilanos estimularon la presencia de
bifidobacterias en los ciegos de los pollos. La preparación de AXOS
con un grado de polimerización elevado,
AXOS-122-0,66, provocó únicamente un
incremento moderado no significativo en la población de
bifidobacterias del ciego de los pollos. Por otro lado, las
preparaciones con un grado de polimerización entre bajo e
intermedio, Xilooligo-95P,
AXOS-7-0,34 y
AXOS-15-0,27 provocaron un
incremento potente y significativo en las bifidobacterias sin
provocar una disminución del peso corporal de los animales. La
respuesta al Xilooligo-95P se pudo observar ya tras
7 días, mientras que los
AXOS-7-0,34 y
AXOS-15-0,27 provocaron únicamente
una respuesta bifidogénica tras 14 días. Ello indica que el
Xilooligo-95P se fermenta más rápidamente por las
bifidobacterias que las preparaciones de
AXOS-7-0,34 y
AXOS-15-0,27 que presentan un grado
medio de polimerización superior y un grado medio de sustitución
superior.
La fermentación lenta mediante bacterias
beneficiosas seleccionadas constituye una propiedad pretendida de
un compuesto prebiótico para su aplicación en seres humanos y otros
animales con unos intestinos largos. La fermentación lenta por
parte de las bacterias intestinales incrementa la fracción del
compuesto prebiótico que no se consume completamente tras pasar por
las partes proximales del colon y por lo tanto se puede utilizar
como sustrato para la fermentación por parte de las bacterias
apropiadas en las partes distales del colon. En los seres humanos
la incidencia del cáncer en las partes distal y rectal del colon,
tomadas en conjunto, son superiores a las de las partes proximales
del colon (http://www.state.nj.us/health/cancer/cr/subsites.htm),
y resulta por lo tanto importante que los compuestos prebióticos
puedan estimular la flora intestinal beneficiosa del colon distal y
del recto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Preparaciones de oligosacáridos. Véase
Materiales y métodos del ejemplo 1.
Análisis microbiológicos mediante PCR
cuantitativa. Véase Materiales y métodos del ejemplo 4. Análisis
de los ácidos grasos de cadena corta. Se obtuvieron muestras
intestinales con 5 volúmenes de agua/ácido fosfórico/ácido fórmico
(91/1,8/0,2, v/v/v) y se clarificaron por centrifugación (22.000 g,
10 minutos). Los ácidos grasos de cadena corta (SFCA) se
analizaron mediante cromatografía en gas - líquido (Shimadzu, GC
14A) en una columna empaquetada con Chromosorb W (tamaño de malla
60/30; Supelco, Bellefonte, EE. UU.) y se detectaron mediante
ionización de llama. Se calcularon las concentraciones de SCFA
basándose en estándares con concentraciones conocidas de ácidos
distintos. El ácido caprónico se utilizó como estándar interno.
Análisis estadísticos. El efecto de las
distintas dietas en la masa corporal, la ingesta alimentaria, los
SCFA o la composición microbiana de los intestinos de los animales
se analizó mediante análisis de la varianza unifactorial a un nivel
de confianza del 95% utilizando el software
Analyse-it, versión 1.71. En el caso de que se
observase un efecto estadísticamente significativo para el factor
dieta, se analizaron las diferencias entre dietas tanto mediante el
test de diferencias menos significativas (LSD) a un nivel de
confianza del 95%.
\vskip1.000000\baselineskip
Para un primer experimento, se adquirieron 40
ratas de 6 semanas de edad (Wistar) en Elevage Janvier (Le
Genest-St-Isle, Francia) y se
alojaron en jaulas con el fondo da alambre de acero (2 ratas por
jaula) en un recinto con el ambiente controlado (22ºC) con un
ciclo de luz - oscuridad de 14 - 10 h. Se permitió el acceso libre
de las ratas al agua y a los gránulos (10 mm) de una "dieta
humanizada básica" durante 7 días. La composición de la "dieta
humanizada básica" se proporciona en la Tabla 7. Tras 7 días de
adaptación a la dieta humanizada básica, las ratas se asignaron
aleatoriamente a uno de los 5 grupos distintos de tratamiento (8
ratas/grupo) y en cada uno de los grupos se permitió el acceso
libre a los gránulos (10 mm) de una de las siguientes dietas
durante 13 días:
- \sqbullet
- Dieta humanizada básica
- \sqbullet
- Dieta humanizada básica + preparación de AXOS-122-0,66 al 0,70% (0,5% de AX puro)
- \sqbullet
- Dieta humanizada básica + preparación de AXOS-16- 0,78 al 0,69% (0,5% de AX puro)
- \sqbullet
- Dieta humanizada básica + preparación de AXOS-15-0,27 al 0,73% (0,5% de AX puro)
- \sqbullet
- Dieta humanizada básica + preparación de AXOS-8-0,27 al 0,72% (0,5% de AX puro)
Las concentraciones indicadas entre corchetes se
corrigieron con respecto a su pureza calculada por su contenido en
AX. En el caso de las dietas que contenían AXOS, el almidón de la
dieta humanizada básica se sustituyó con la cantidad apropiada de
AXOS.
Se pesaron los animales y se determinó la
ingesta alimentaria 3 veces por semana. Tras 13 días de
tratamiento se pesaron todos los animales y se les practicó la
eutanasia con una sobredosis de Nembutal. A continuación se
disecaron los animales para recoger las heces. Se recogieron las
heces como gránulos desde el colon distal hasta el ano. Se
reunieron las heces por cada 2 animales que pertenecían al mismo
grupo de tratamiento y se analizaron con respecto al contenido en
SCFA.
La ingesta alimentaria durante el período de
tratamiento se encontraba comprendida entre 18,9 y 27,7 g/día con
una media de 22,7 g/día. Los pesos corporales iniciales de las
ratas en el inicio del tratamiento fueron en promedio de 262,0 g y
los pesos corporales finales tras 13 días de tratamiento fueron en
promedio 375,3 g. No se observaron diferencias significativas en
el peso corporal o la ingesta alimentaria entre los distintos
tratamientos.
Debido a que unos niveles aumentados de SCFS
constituyen la característica distintiva de los cambios en la flora
microbiana intestinal provocados por la ingesta de compuestos
prebióticos (Van Loo, 2004), se ha determinado el contenido en SCFA
de las heces para los distintos grupos de tratamiento. Tal como se
ilustra en la figura 11, el nivel de propionato de las heces de las
ratas alimentadas con AXOS-8-0,27,
AXOS-15-0,27 y
AXOS-16-0,78 resultó
significativamente superior al del grupo de control o al del grupo
de los AXOS-122-0,66. Se observó
asimismo una tendencia a unos niveles aumentados de acetato y de
butirato en las heces en los grupos de los
AXOS-8-0,27,
AXOS-15-0,27 y
AXOS-16-0,78.
Los SCFA tales como el acetato, el propionato y
el butirato se producen como capas electrónicas del metabolismo
respiratorio de las bacterias en el ambiente anaeróbico del
intestino. Se conoce que los compuestos prebióticos incrementan los
niveles de SCFA en el intestino grueso. Se pretenden unos niveles
elevados de SCFA debido a que reducen el pH del contenido
intestinal y de este modo limitan el crecimiento de bacterias
putrefactivas potencialmente patógenas. La disminución del pH
intestinal implica asimismo un incremento de la solubilidad y de la
biodisponibilidad de los minerales calcio y magnesio (Teitelbaum
& Walker, 2002). Los ácidos grasos de cadena corta,
especialmente el butirato, estimulan además las células epiteliales
del colon, incrementando de este modo la capacidad de absorción del
epitelio (Topping & Clifton, 2001).
El hecho de que no se observaron diferencias
significativas entre las ratas tratadas con
AXOS-15-0,27 o
AXOS-16-0,78, dos preparaciones con
aproximadamente el mismo grado medio de polimerización pero con una
distinta proporción A/X, indica que el grado de sustitución no
ejerce un impacto importante en la capacidad de los AXOS para
estimular la fermentación bacteriana en el colon. Por otro lado,
cuando se comparan los efectos de los
AXOS-16-0,78 y los
AXOS-122-0,66, dos preparaciones
con aproximadamente el mismo grado de sustitución pero con un grado
de polimerización distinto, resulta claro que las preparaciones de
AXOS con un grado elevado de polimerización tales como las de
AXOS-122-0,66 constituyen
compuestos prebióticos menos potentes que las preparaciones con un
grado medio inferior de polimerización. Por lo tanto, las
preparaciones de AXOS con un grado medio de polimerización inferior
a 120 constituyen los compuestos prebióticos preferidos. En el
caso que se prefiera una fermentación lenta, a fin de incrementar
la disponibilidad de los AXOS en el colon distal y el recto, se
prefieren las preparaciones de AXOS con un grado medio de
polimerización superior a 4.
Para un segundo experimento, se adquirieron 24
ratas machos de 6 semanas de edad (Wistar) en Elevage Janvier (Le
Genest-St-Isle, Francia) y se
alojaron en jaulas con el fondo da alambre de acero (2 ratas por
jaula) en un recinto con el ambiente controlado (22ºC) con un ciclo
de luz - oscuridad de 14 - 10 h. Se permitió el acceso libre de las
ratas al agua y a los gránulos (10 mm) de una "dieta humanizada
básica" durante 6 días. La composición de la "dieta humanizada
básica" se proporciona en la Tabla 7. Tras 6 días con la dieta
humanizada básica, las ratas se asignaron aleatoriamente a uno de
los 3 grupos distintos de tratamiento (8 ratas/grupo) y en cada uno
de los grupos se permitió el acceso libre a los gránulos (10 mm)
de una de las siguientes dietas:
- \sqbullet
- Dieta humanizada básica
- \sqbullet
- Dieta humanizada básica + preparación de AXOS-15-0,27 al 5,87% (4% de AX puro)
- \sqbullet
- Dieta humanizada básica + preparación de Xilooligo-95P al 5,26% (4% de AX puro)
Las concentraciones indicadas entre corchetes se
corrigieron con respecto a su pureza calculada por su contenido en
AX. En el caso de las dietas que contenían
AXOS-15-0,27 o
Xilooligo-95P, el almidón de la dieta humanizada
básica se sustituyó con la cantidad apropiada de AXOS.
Se pesaron los animales y se determinó la
ingesta alimentaria 3 veces por semana. Tras 14 días de
tratamiento se pesaron todos los animales, se les practicó la
eutanasia con una sobredosis de Nembutal y a continuación se
disecaron los animales para extraer el colon proximal, el ciego y
el colon distal. Se reunieron los contenidos del ciego por cada 2
animales que pertenecían al mismo grupo de tratamiento y se
analizaron con respecto a la cantidad de bifidobacterias mediante
PCR cuantitativa. Los contenidos del colon proximal y el colon
distal se reunieron por cada 2 animales que pertenecían al mismo
grupo de tratamiento y se analizaron con respecto al contenido
de
SCFA.
SCFA.
En el colon proximal, los niveles de SCFA
resultaron muy inferiores a los del colon distal y únicamente el
acetato superó el umbral de detección de las muestras del colon
proximal. Por lo tanto, únicamente se pudieron obtener datos para
el acetato en el colon proximal y para el acetato, el propionato y
el butirato en el colon distal. Ninguno de los tratamientos tuvo
como resultado un efecto significativo en los niveles de los SCFA a
un nivel de probabilidad del 95%. Sin embargo, se pudieron observar
unas tendencias claras a partir de los datos. Tal como se ilustra
en la figura 12, los grupos de los
AXOS-15-0,27 y
Xilooligo-95P presentaron unos niveles superiores
de acetato y de butirato, pero no de propionato, en comparación con
el grupo de control. El efecto más notable se observó para el
butirato en el colon distal, para el que el incremento relativo con
respecto al grupo de control fue del 58% en el grupo de los
AXOS-15-0,27 y del 34% en el grupo
del Xilooligo-95P. El efecto más intenso de los
AXOS-15-0,27 con respecto al
Xilooligo-95P se observó para todos los SCFA en el
colon distal. Resulta interesante que el
Xilooligo-95P provoco el incremento más importante
de acetato en el colon proximal, mientras que los
AXOS-15-0,27 provocaron el aumento
más importante en el colon distal.
La cantidad de bifidobacterias incrementó
significativamente en los ciegos de las ratas tras alimentarla,
tanto con AXOS-15-0,27 como con
Xilooligo-95P en comparación con las ratas a las
que se administró la dieta de control. El incremento más elevado
en las bifidobacterias cecales se observó en el grupo de los
AXOS-15-0,27 (1,08 unidades
logarítmicas o 12 veces superior con respecto al grupo de control,
figura 13).
Los resultados indican que los
AXOS-15-0,27 son un compuesto
prebiótico más potente que el Xilooligo-95P. Los
datos indican asimismo que los
AXOS-15-0,27 se fermentan más
lentamente que el Xilooligo-95P ya que el
Xilooligo-95P provoca un efecto más importante en
los SCFA del colon proximal mientras que los
AXOS-15-0,27 provocaron un efecto
más importante en el colon distal. Se observó asimismo una
fermentación más lenta de los
AXOS-15-0,27 en comparación con el
Xilooligo-95P en los experimentos con pollos
presentados en el ejemplo 5. Se pretenden las propiedades de una
fermentación lenta de los
AXOS-15-0,27 debido a que tienen
como resultado más compuesto prebiótico que alcanza el colon
distal, donde pueden ejercer sus efectos beneficiosos y la presunta
inhibición de la carcinogenia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Preparaciones de
AXOS-15-0,27 y WPC. Véase
Materiales y métodos del ejemplo 1.
Análisis microbiológicos mediante PCR
cuantitativa. Véase Materiales y métodos del ejemplo 4.
Participantes. Ninguno de los voluntarios
que participaron en los experimentos presentaban un historial de
enfermedades gastrointestinales o metabólicas o de cirugía previa.
Los participantes no presentaban tratamiento con antibióticos o
cualquier otro medicamento que influyese en el tránsito intestinal
o en la flora intestinal durante por lo menos los 3 meses previos
al inicio del estudio. Ninguna de las mujeres se encontraba
embarazada durante los experimentos. No se impusieron dietas
estándar a los voluntarios. Sin embargo, se les pidió que
mantuvieran una pauta alimentaria regular hasta el final del
período de estudio y que evitasen ingestas excesivas de productos
lácticos fermentados y de componentes alimentarios que contuvieran
unas cantidades elevadas de hidratos de carbono fermentables. El
Comité de Ética de la Universidad de Leuven autorizó los
experimentos y todos los participantes presentaron autorización por
escrito.
Sustratos marcados. Se sintetizó
lactosa-[^{15}N, ^{15}N]-ureido según el método
de Schoorl tal como lo modificó Hofmann (1931) con
[^{15}N,^{15}N]urea obtenida en
Euriso-top (Saint-Aubin, Francia).
El macrogol marcado (polietilénglico) con ^{3}H
(^{3}H-PEG) se obtuvo en New England Nuclear Life
Science Products (Boston, MA, EE. UU.).
Determinación del N_{tot} y el
^{15}N urinarios y fecales. El contenido total de N y el
enriquecimiento en ^{15}N de la orina y las heces se determinaron
utilizando un analizador elemental (ANCA-SL; PDZ,
Cheshire, Reino unido) acoplado tanto con un detector conductor
térmico (TCD; PDZ) como con un espectrómetro de masas por relación
de isótopos. Se oxidó un volumen conocido de orina (15 \mul) o
una masa conocida de heces (aproximadamente 5 a 7 mg de heces
liofilizadas) en presencia de oxígeno a 1.000ºC. Los productos de
la combustión se pasaron a continuación por un segundo horno que
contenía cobre a 600ºC en el que se absorbió el exceso de oxígeno y
se redujeron los óxidos de nitrógeno a nitrógeno elemental. El
contenido total de nitrógeno se determinó mediante un detector TCD,
mientras que el enriquecimiento en ^{15}N se determinó mediante
un detector IRMS, acoplado a una unidad de combustión del
analizador elemental. La proporción del isótopo ^{15}N con
respecto al ^{14}N del N se determinó con respecto a un estándar
de laboratorio calibrado (es decir una disolución de sulfato de
amonio estándar). El porcentaje de la dosis administrada de
^{15}N recuperado se calculó del siguiente modo (Evenepoel et
al., 1999):
\vskip1.000000\baselineskip
siendo mg
excedente
\newpage
y
AP_{t}: el enriquecimiento en ^{15}N
determinado de una muestra de orina específica, expresado en
porcentaje atómico (AP)
AP_{bas}: el enriquecimiento en ^{15}N de
una muestra de orina basal (expresado en AP)
N_{tot}: el contenido de nitrógeno total en
una muestra de orina específica.
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso de las muestras de orina, el
porcentaje de la dosis administrada de ^{15}N se acumuló durante
el período de 0 a 48 h tras la alimentación de ensayo, mientras
que en el caso de las muestras fecales, el porcentaje de la dosis
administrada de ^{15}N se acumuló durante el período de 0 a 72 h
tras la alimentación de ensayo. Se realizó una corrección para las
diferencias en el período de tránsito bucofecal para las muestras
fecales. Ello se realizó dividiendo el porcentaje acumulado de la
dosis administrada de ^{15}N recuperado en 72 h por el porcentaje
acumulado de la dosis administrada de ^{3}H-PEG
recuperado en 72 h. El contenido de ^{3}H-PEG en
las heces se determinó mediante recuento del centelleo en líquido
(espectrómetro de centelleo en líquido Tricarb, modelo 3375; Packard
Instruments, Downers Grove, IL, EE. UU.) tras la oxidación a
^{3}H-H_{2}O (oxidante de muestras Packard,
modelo 307).
Determinación de los compuestos fenólicos
urinarios. El contenido total en p-cresol y
fenol se determinaron mediante la tecnología de cromatografía en
gas - líquido - espectrometría de masas (GC - MS). El pH de 950 ml
de orina se ajustó a un pH de 1 con H_{2}SO_{4} concentrado. Se
calentó dicha disolución durante 30 minutos a 90ºC para
desproteinizar e hidrolizar los fenoles conjugados. Tras enfriar
hasta temperatura ambiente, se añadieron 50 ml de
2,6-dimetilfenol (20 mg/100 ml) como estándar
interno. Los fenoles se extrajeron con 1 ml de acetato de etil. Se
secó la capa de acetato de etilo con Na_{2}SO_{4} y se
analizaron 0,5 ml de dicha disolución mediante
GC-MS (Trace GC-MS, Thermo
Finnigan, San José, CA, EE. UU.). LA columna analítica era una
AT5-MS (Alltech Associates, Deerfield, IL, EE. UU.)
de 1 \mul de 30 m x 0.32 mm de diámetro interno. Se utilizó gas
helio de grado GC como vehículo con un caudal constante de 1,3
ml/min. La temperatura del horno se programó desde 75ºC (isotérmica
durante 5 minutos), y se incrementó en 10ºC/min hasta 160ºC y en
20ºC/min hasta 280ºC. Se realizó la espectrometría de masas en el
modo de rastreo completo de impacto de electrones desde m/z 59
hasta m/z 590 a dos rastreos/s. Los resultados para el
p-cresol y el fenol se expresaron como el contenido
total (mg) recuperado en extracciones a 0 - 24 h.
Análisis estadístico. El análisis
estadístico se realizó con el software SPSS, versión 12.0. La
valoración estadística de los datos se realizó aplicando la prueba
de Wilcoxon para datos independientes a un nivel de confianza del
95%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un primer experimento en seres
humanos con 10 voluntarios sanos (5 hombres y 5 mujeres, con una
edad comprendida entre 23 y 37 años). Cada uno de los 10
voluntarios se asignó aleatoriamente a uno de dos grupos de 5
personas. Al primer grupo se le administró durante dos semanas cada
día 7 g (4,88 g) de AXOS-15-0,27
suspendido en agua, mientras que al segundo grupo se le administró
diariamente 11,6 g (4,82 g) de WPC suspendido en agua. Los valores
de peso indicados entre corchetes se corrigieron con respecto a
los AXOS basándose en el contenido en AX y el contenido en humedad
de la preparación.
Para cada uno de los voluntarios se recogieron
muestras fecales durante el día antes del inicio del experimento, y
durante el día 15º. Cada vez se recogió la primera evacuación fecal
del día, se pesó y se almacenó a -20ºC hasta realizar el análisis
microbiano mediante PCR cuantitativa.
Tal como ilustra la figura 14, los pacientes que
recibieron 4.88 g/día de
AXOS-15-0,27 durante 14 días
presentaron un nivel de bifidobacterias fecales que resultó 1,55
unidades logarítmicas (= 35 veces) superior con respecto al nivel
basal (p = 0,043). En cambio, el nivel de bifidobacterias se redujo
significativamente tras 2 semanas en los participantes a los que
se administró 4,82 g/día de WPC, aunque la diferencia con respecto
al nivel basal no era significativa (p = 0,715).
Dichos datos indicaron que los compuestos de
AXOS con un grado medio de polimerización intermedio tal como los
AXOS-15-0,27 (DP medio = 15, Tabla
1) ejercen un efecto prebiótico más intenso que los compuestos con
un grado medio de polimerización elevado tal como el WPC (DP medio
= 58, Tabla 1). Se pudo rápidamente alcanzar la misma conclusión a
partir de los ensayos sobre los efectos bifidogénicos en pollos
(véase ejemplo 4) y en el incremento de los SCFA en ratas (véase
el ejemplo 5).
En un segundo experimento se valoró el efecto de
distintas dosis unitarias de
AXOS-15-0,27 sobre el metabolismo
del NH_{3}, el p-cresol y el fenol en el colon
humano. El NH_{3}, el p-cresol y el fenol son
metabolitos tóxicos y potencialmente cancerígenos que producen las
bacterias del colon al fermentar las proteínas. El metabolismo del
NH_{3} se valoró utilizando
lactosa-[^{15}N,^{15}N]-ureido como
biomarcador. Con la administración oral, la lactosa - ureido
alcanza el colon sin modificar, debido a que el enlace molecular
entre la parte glucídica y la urea en la lactosa - ureido resiste
la degradación enzimática en el tracto gastrointestinal humano.
Cuando la lactosa-[^{15}N,^{15}N]-ureido
alcanza el colon se degrada a urea marcada con [^{15}N,^{15}N]
por parte de bacterias seleccionadas. La urea marcada experimenta
una hidrólisis rápida con la producción de ^{15}NH_{3} (Wutzke
et al. 1997). El NH_{3} marcado se mezcla con el amoníaco
presente en el colon y, como consecuencia de ello, las variaciones
observadas en la determinación del marcador ^{15}N reflejan el
destino del NH_{3} del colon.
Además de realizar el seguimiento del
metabolismo del NH_{3} del colon, se determinó la presencia de
fenol y p-cresol en la orina como característica
distintiva de la fermentación bacteriana de las proteínas en el
colon. Basándose en los datos publicados (Evenepoel et al.
1999), se supone que en las condiciones fisiológicas
aproximadamente entre el 3 y el 6% de las proteínas ingeridas
permaneces sin digerir. Cuando las proteínas sin digerir alcanzan
el colon, la flora del colon las fermenta. La fermentación
bacteriana del aminoácido tirosina tiene como resultado la
producción de fenol y p-cresol. Dichos compuestos
se absorben en gran medida desde el colon, se elimina su toxicidad
en las mucosas y en el hígado (mediante la conjugación con los
grupos glucorónido y sulfato) y se excreta finalmente en la orina.
Debido a que el fenol y el p-cresol se originan
exclusivamente a partir del metabolismo bacteriano y no a partir
del metabolismo humano, la diuresis del fenol y el
p-cresol refleja la producción bacteriana de dichos
compuestos en el colon (Smith & Macfarlane, 1996). Como
consecuencia de ello, cualquier influencia de los compuestos
prebióticos en la fermentación de las proteínas del colon se
debería reflejar en la concentración urinaria de fenol y
p-cresol.
El segundo experimento en humanos se realizó con
9 voluntarios sanos (3 hombres y 6 mujeres, con una edad
comprendida entre 19 y 26 años). Cada uno de los voluntarios se le
administró 5 comidas de ensayo distintas que comprendían dosis
distintas de AXOS-15-0,27 con un
intervalo de 1 semana entre cada comida del ensayo. Las distintas
dosis de AXOS-15-0,27 por día
fueron 0, 0,35 g (0,24 g), 1,05 g (0,73 g), 3,17 g (2,21 g) y 7 g
(4,88 g), con los valores de los pesos que se encuentran entre
corchetes encontrándose corregidos para los AXOS basándose en el
contenido en AX y el contenido en humedad de la preparación. El
orden con el que los voluntarios recibieron las comidas del ensayo
fue aleatorio. La comida del ensayo consistía en una tortita (15,8
g de proteínas, 11,6 g de grasas y 21,1 g de hidratos de carbono;
255 kcal) que contenía 75 mg del sustrato marcado con el isótopo
estable lactosa-[^{15}N,^{15}N] -ureido, 185 kBq de macrogol
marcado con tritio (^{3}H-PEG), y
AXOS-15-0,27 en una dosis
apropiada. Se utilizó el ^{3}H-PEG como
biomarcador para el período de tránsito bucofecal (Geboes et
al., 2005).
Se recogió la orina en recipientes a los que se
añadió 1 gramo de neomicina para evitar el crecimiento bacteriano.
Se recogió una muestra de orina basal antes de consumir la comida
del ensayo. Tras la ingesta de cada comida del ensayo, se recogió
la orina de 48 horas en 3 fracciones distintas 0 - 6 h, 6 - 24 h y
24 - 48 h. Tras determinar el volumen de la orina, se tomaron las
muestras y se almacenaron a -20ºC hasta el análisis. Las heces se
recogieron en 72 h tras la comida del ensayo. Las heces se
congelaron inmediatamente tras la evacuación, se pesaron y a
continuación se almacenaron a -20ºC. Todas las heces recogidas el
mismo día se combinaron y se homogeneizaron antes de un análisis
posterior. Se retiraron las muestras con un peso conocido y se
liofilizaron. La materia seca se pesó de nuevo y se tomaron
alícuotas para el análisis del nitrógeno y de la radiactividad.
Tal como ilustra la figura 15 A, se observó una
velocidad de excreción en la orina regularmente baja del nitrógeno
marcado con ^{15}N tras la ingesta del ensayo que contenía
AXOS-15-0,27 en comparación con la
comida de control que carecía de
AXOS-15-0,27. Un 44,5% de la dosis
de ^{15}N administrada se recuperó en las muestras de orina tras
el consumo de la comida de control. Dicha fracción disminuyó hasta
un 40,4% (-9% con respecto control), un 43,7% (-2% con respecto al
control), un 33,1% (-26% con respecto al control) y un 33,6% (-25%
con respecto al control) tras la ingestión de 0,24, 0,73, 2,21 y
4,88 g de AXOS-15-0,27,
respectivamente. El descenso en la excreción en la orina del
^{15}N resultó significativo a una p < 0,05 para las dosis de
AXOS-15-0,27 de 2,21 y 4,88 g.
Por el contrario, el complemento con
AXOS-15-0,27 en las comidas del
ensayo provocaron un incremento uniforme en la excreción del
^{15}N por las heces (figura 15 B). En el grupo de la comida de
control del ensayo, un 15.1% de la dosis de ^{15}N administrada
se recuperó en las heces. Esta fracción aumentó hasta un 16,4% (+8%
con respecto al control), un 18,8% (+24% con respecto al control),
un 25,3% (+67% con respecto al control) y un 26.1% (+72% con
respecto al control) tras la ingestión de 0,24, 0,73, 2,21 y 4,88
g, respectivamente. El incremento en la excreción fecal de
^{15}N resultó significativo a una p < 0,05 para las dosis de
AXOS-15-0,27 de 2,21 y 4,88 g. Los
AXOS-15-0,27 no ejercieron efecto
alguno en el período de tránsito gastrointestinal, determinado
mediante el biomarcador ^{3}H-PEG, a cualquiera
de las dosis analizadas (figura 15 C).
Se observó una velocidad de excreción en la
orina regularmente baja del p-cresol y del fenol
tras la ingesta de las comidas del ensayo que contenían
AXOS-15-0,27 en comparación con la
comida de control que carecía de
AXOS-15-0,27 (figura 16). La
fracción de p-cresol excretada por la orina
disminuyó en un -9%, un - 21%, un -35% y un -41% con respecto al
control, tras la ingestión de 0,24, 0,73, 2,21 y 4,88 g de
AXOS-15-0,27, respectivamente
(figura 16A). La fracción de fenol excretada por la orina disminuyó
en un - 45%, un -39%, un -33% y un -45% con respecto al control,
tras la ingestión de 0, 24, 0, 73, 2,21 y 4,88 g de
AXOS-15-0,27, respectivamente
(figura 16B). El descenso en la excreción de fenol en la orina
resultó significativo a una p < 0,05 para todas las dosis de
AXOS-15-0,27 analizadas,
comprendidas entre 0,24 g y 4,88 g. Se ha demostrado de este modo
que los AXOS-15-0,27 constituyen un
compuesto prebiótico en los seres humanos que resulta activo a unas
dosis sorprendentemente bajas, hasta 0,24 g por ración.
La reducción de la excreción en la orina del
nitrógeno y el incremento concomitante de la excreción del N fecal
se había observado previamente en humanos a los que se había
administrado compuestos prebióticos conocidos tales como la inulina
y la lactulosa (De Preter et al., 2004; Geboes et
al., 2005). Se pretende excreción estimulada de amoníaco por las
heces ya que se ha demostrado que el amoníaco reduce la duración de
las células epiteliales del colon, aumentando su renovación, y
haciendo que resulten más susceptibles a la carcinogenia química
(Visek 1978). El amoníaco en la luz del colon procede
principalmente de la fermentación bacteriana de las proteínas no
digeridas (Smith & Macfarlane, 1996; Fooks et al.,
1999). Los hidratos de carbono prebiótico que se pueden fermentar
lentamente, tales como los AXOS con unos grados de polimerización
intermedios, estimulan las bacterias sacarolíticas y las vías
metabólicas sacarolíticas de las bacterias presentes en el colon.
Dichos compuestos, por lo tanto, contienen la fermentación
proteolítica en el colon y estimulan la reutilización del amoníaco
como fuente de nitrógeno por parte de las bacterias que dependen de
los hidratos de carbono como fuente principal de carbono y de
energía. En el mismo sentido, se pretende la reducción de la
excreción urinaria de los metabolitos de la fermentación proteica
cresol y fenol ya que dichos compuestos fenólicos se ven implicados
en el cáncer de intestino (Bone et al., 1976). Se ha
observado previamente una excreción urinaria reducida de compuestos
fenólicos para el compuesto prebiótico lactulosa (De Preter et
al. 2004). Se supone que la excreción disminuida del cresol y
el fenol se provocan mediante una utilización incrementada del
aminoácido tirosina o de productos metabólicos de la putrefacción
proteica mediante una actividad bacteriana sacarolítica
incrementada en el colon, estimulada por los compuestos
prebióticos.
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AX: contenido en arabinoxilanos expresado como %
de materia seca; A/X: proporción de arabinosa con respecto a la
xilosa; avDP_{GC}: grado de polimerización medio determinado
mediante cromatografía en gas - líquido; avDP_{HPSEC}: grado de
polimerización medio determinado mediante cromatografía de
exclusión por tamaños de alto rendimiento. Intervalo DP 90%:
intervalo de grados de polimerización en el que se encuentra el 90%
de los oligosacáridos.
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1999, vol. 79, 1832-1840 [0130]
Claims (26)
1. Producto alimentario o bebida que modula la
flora intestinal humana, que comprende entre 0,25 y 5 g de
arabinoxilanos por ración de dicho producto alimentario o bebida,
en el que dichos arabinoxilanos tienen un grado de polimerización
(DP) medio comprendido entre 5 y 50.
2. Producto alimentario o bebida según la
reivindicación 1, en el que dichos arabinoxilanos tienen un grado
de polimerización (DP) medio de 5 ó 7, o dichos arabinoxilanos
tienen un grado de polimerización (DP) medio de 6 cuando su
proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,40, o
dichos arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio
de 8 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa)
es de 0,50.
3. Producto alimentario o bebida según la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende entre 1 y 3 g
de arabinoxilanos por ración de dicho producto alimentario o
bebida.
4. Producto alimentario según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el producto alimentario es un
producto cárnico o un producto láctico.
5. Bebida según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que la bebida es una bebida no
alcohólica o un refresco funcional.
6. Producto alimentario o bebida según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho producto
alimentario comprende bacterias vivas del género
Bifidobacterium o Lactobacillus.
7. Producto alimentario según la reivindicación
1, en el que dicho producto alimentario es un producto alimentario
que contiene cereales que comprende entre 0,25 y 5 g de
arabinoxilanos que tienen un DP inferior a 200 por ración de dicho
producto y en el que dicho grupo de arabinoxilanos tiene un DP
medio comprendido entre 5 y 50.
8. Producto alimentario según la reivindicación
2, en el que dicho producto alimentario es un producto alimentario
que contiene cereales que comprende entre 0,25 y 5 g de
arabinoxilanos que tienen un grado de polimerización (DP) inferior
a 200 por ración de dicho producto y en el que dichos
arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio de 5 ó
7, o dichos arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP)
medio de 6 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a la
xilosa) es de 0,40, o dichos arabinoxilanos un grado de
polimerización (DP) medio de 8 cuando su proporción A/X (arabinosa
con respecto a la xilosa) es de 0,50.
9. Producto alimentario que contiene cereales
según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, que comprende
entre 1 y 3 g de dichos arabinoxilanos.
10. Producto alimentario según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, en el que el producto alimentario es un
producto de panadería o de repostería.
11. Producto alimentario según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, en el que el producto alimentario es un
cereal para desayunos, un bizcocho o un producto de pasta.
12. Producto alimentario según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el producto alimentario es un
producto para postre preparado industrialmente.
13. Producto alimentario o bebida según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho producto
alimentario o bebida es un producto hipocalórico.
14. Método para la preparación de un aditivo
nutritivo para utilizar como aditivo en la preparación de un
producto alimentario según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
13, que comprende las etapas de:
- i.
- aislar la fracción de arabinoxilanos que no se puede extraer con agua a partir de un material rico en arabinoxilanos tal como el salvado, la harina de semillas o semillas secundarias obtenido mediante la eliminación del almidón y la desproteinización de dicho material rico en arabinoxilanos, utilizando preferentemente enzimas amilolíticos y proteolíticos, respectivamente, en el que las semillas son de trigo, cebada, centeno, avena, sorgo y arroz, y
- ii.
- despolimerizar la fracción de arabinoxilanos que no se puede extraer con agua utilizando uno o más enzimas xilanolíticos.
15. Método para la preparación de un aditivo
nutritivo para utilizar como aditivo en la preparación de un
producto alimentario según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
13, que comprende las etapas de:
- i.
- obtener una preparación que contiene arabinoxilanos que se pueden extraer con agua parcialmente despolimerizados, tal como una preparación obtenida en una toma lateral de un proceso de separación de gluten y almidón
- ii.
- si resulta necesario eliminar el almidón y las proteínas de dicha preparación que contiene arabinoxilanos, utilizando preferentemente enzimas amilolíticos y proteolíticos, respectivamente;
- iii.
- despolimerizar los arabinoxilanos contenidos en dicha preparación utilizando uno o más enzimas xilanolíticos.
16. Método según la reivindicación 14 o la
reivindicación 15, en el que la preparación se somete a
ultrafiltración, tras el tratamiento con los enzimas xilanolíticos,
a fin de retirar los compuestos de bajo peso molecular que tienen
un DP de 4 o inferior.
17. Aditivo nutritivo para utilizar como aditivo
en la preparación de un producto alimentario o bebida según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho aditivo
comprende por lo menos un 15% de arabinoxilanos, que tienen un
grado de polimerización (DP) medio comprendido entre 7 y 20.
18. Aditivo nutritivo para utilizar como aditivo
en la preparación de un producto alimentario o bebida según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho aditivo
comprende por lo menos un 15% de arabinoxilanos, en el que dichos
arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio de 5 ó
7, o dichos arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP)
medio de 6 cuando su proporción A/X (arabinosa con respecto a la
xilosa) es de 0,40, o dichos arabinoxilanos tienen un grado de
polimerización (DP) medio de 8 cuando su proporción A/X (arabinosa
con respecto a la xilosa) es de 0,50.
19. Utilización de una preparación de
arabinoxilanos que comprende moléculas de arabinoxilanos con un
grado de polimerización (DP) medio comprendido entre 5 y 50 como
aditivo alimentario en la producción de un alimento o una bebida
que comprende entre 0,25 y 5 g de dichos arabinoxilanos por ración
de dicho alimento o bebida.
20. Utilización de una preparación de
arabinoxilanos según la reivindicación 19, en la que las moléculas
de arabinoxilanos tienen un grado de polimerización (DP) medio de 5
ó 7, o un grado de polimerización (DP) medio de 6 cuando su
proporción A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,40, o
un grado de polimerización (DP) medio de 8 cuando su proporción
A/X (arabinosa con respecto a la xilosa) es de 0,50, como aditivo
alimentario en la producción de un alimento o bebida, que comprende
entre 0,25 y 5 g de dichos arabinoxilanos por ración de dicho
alimento o bebida.
21. Utilización de una preparación de
arabinoxilanos según la reivindicación 19 o la reivindicación 20 en
la preparación de un alimento o bebida que comprende entre 1 y 3 g
de dichos arabinoxilanos por ración de dicho alimento o bebida.
22. Utilización de una preparación de
arabinoxilanos según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en
la que el alimento es un producto cárnico o un producto
láctico.
23. Utilización de una preparación de
arabinoxilanos según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en
la que la bebida es una bebida no alcohólica.
24. Utilización de una preparación de
arabinoxilanos según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en
la que el producto alimentario es un producto de panadería o de
repostería.
25. Utilización de una preparación de
arabinoxilanos según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en
la que el producto alimentario es un producto de pasta, un bizcocho
o un cereal para desayunos.
26. Utilización de una preparación de
arabinoxilanos según la reivindicación 22 o la reivindicación 23,
en la que el producto alimentario o bebida comprende bacterias
vivas del género Bifidobacterium o Lactobacillus.
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