ES2896774T3 - Una enzima que presenta actividad fructano hidrolasa - Google Patents

Una enzima que presenta actividad fructano hidrolasa Download PDF

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Abstract

Una enzima que presenta actividad fructano hidrolasa, comprendiendo dicha enzima un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID No. 2.

Description

DESCRIPCIÓN
Una enzima que presenta actividad fructano hidrolasa
Campo de la invención
La presente invención está dirigida a una enzima que permite la retirada eficaz de fructano de materia prima a base de cereales y verduras. La enzima de acuerdo con la invención produce materia a base de cereales y verduras que tiene un contenido de fructano significativamente menor en comparación con el de la materia de partida. Las materias a base de cereales y verduras con bajo contenido de fructano se pueden usar en la producción de ingredientes a base de cereales y verduras con bajo contenido de fructano, productos adecuados, por ejemplo, para una dieta con bajo contenido de FODMAP y diversos productos alimenticios a base de cereales y verduras con beneficios nutricionales. La presente invención también está dirigida a productos que contienen la enzima, tales como mejoradores y premezclas para propósitos de horneado.
Antecedentes de la invención
Los problemas relacionados con la digestión son una causa frecuente de malestar general y social. Estos problemas cubren una selección diversa de síntomas gastrointestinales, de los que la distensión abdominal, la producción de gases, el dolor abdominal, el malestar general, el estreñimiento y las heces sueltas están entre los más frecuentes. Actualmente, se cree que muchos de los que padecen estos síntomas padecen el síndrome del intestino irritable (SII). El SII es claramente más frecuente en mujeres y se cree que afecta a un 10-20 % de la población de los países industrializados; es decir, el SII es más frecuente en la población de los países industrializados que la intolerancia a la lactosa (aunque muchas personas que tienen intolerancia a la lactosa pueden tener el SII y viceversa).
Actualmente no existe ningún tratamiento médico para el SII. Se ha prestado mucha atención al abordaje nutricional del SII. Se ha prestado mayor atención a una dieta llamada dieta CON BAJO CONTENIDO DE FODMAP. La idea de la dieta es evitar los alimentos que contengan compuestos FODMAP El término FODMAP se deriva de "oligo-, di-, monosacáridos y polioles fermentables". Los FOD-MAP son monosacáridos y carbohidratos de cadena corta, que se absorben mal en el intestino delgado. Los compuestos FODMAP incluyen fructanos (incluyendo FOS), galactanos (especialmente GOS) y polioles. También la lactosa y la fructosa en exceso se pueden considerar compuestos FODMAP entre personas con problemas de digestión o absorción de estos compuestos.
Las fuentes comunes de fructanos incluyen, por ejemplo, trigo, centeno, cebolla, tupinambo y ajo. Algunos ejemplos de contenido de fructano de los cereales son como sigue: un 7 % en el centeno (salvado) (en base a la materia a base de cereales), un 3-7 % en el centeno (cereal) y un 1-4 % en la harina de trigo. Aunque, en general, no se considera que el trigo sea especialmente rico en compuestos FODMAP, su consumo relativamente alto lo convierte en una fuente pertinente de fructanos. Es por este motivo por el que las pautas de la dieta FODMAP animan a evitar el trigo. El consumo de centeno es alto en Europa del norte. El pan de centeno contiene más compuestos FODMAP en comparación con el pan de trigo, porque el centeno integral contiene más fructanos que la harina de trigo.
Los fructanos están constituidos por residuos de fructosa, normalmente con una unidad de sacarosa terminal (es decir, un disacárido glucosa-fructosa). La posición del enlace de los residuos de fructosa determina el tipo de fructano. Los tipos básicos de fructanos de enlace único son inulina y levano (o fleína). Además, existe un fructano de enlace mixto llamado graminano.
Existe alguna técnica anterior relacionada con los niveles de fructano en el pan. En el artículo por Andersson et al. (2009) se demostró que el pan fermentado con levadura, y especialmente el pan de masa madre, tenían menor contenido de fructano en comparación con la harina de centeno integral. Los resultados de Andersson et al. muestran que el contenido de fructano del centeno integral se puede reducir de un 5,0 % a un 1,9 % por masa madre (reducción de un 62 %) y a un 3,4 % por fermentación con levadura (reducción de un 32 %). Los resultados también muestran que los fructanos se degradan durante el procedimiento de elaboración del pan, lo que da como resultado un menor contenido de fibra alimentaria total y extraíble en el pan.
El artículo por Rakha et al. (2010) divulga que durante la elaboración del pan la fracción de bajo peso molecular de fructano está más disponible para su degradación por levadura o por enzimas endógenas presentes en los ingredientes. De acuerdo con Rakha et al., el contenido de fructano en fracciones de molienda de centeno varía de un 3,4 % en el endospermo interno a un 5,0 % en el salvado. El contenido de fructano de los panes de centeno varió de un 1,9 % a un 4,0 %, con un promedio de 2,8 % en panes crujientes, siendo una muestra que solo contenía harina de centeno integral la más alta en contenido de fructano.
La masa de acuerdo con la solicitud de patente de EE. UU. US 2011/0129572 A1 comprende al menos un polisacárido que contiene fructosa y al menos una enzima que puede degradar dicho polisacárido en fructosa y fructooligosacárido (FOS) de cadena corta. Se dice que el producto horneado producido usando esta masa tenía una esponjosidad incrementada en comparación con el pan de control o producto horneado de otro modo idéntico producido usando masa que no contenía la enzima.
El descubrimiento relacionado con la reducción de las cantidades de fructano en la materia vegetal de la solicitud de patente EP 1084624 A2 es que, mientras que las cepas de Lactobacillus, en general, no degradan el fructano, existen cepas de Lactobacillus que sí tienen esta propiedad. De acuerdo con el documento EP 1084624 A2, estas cepas son preferentemente Lactobacillus paracaseiy Lactobacillus plantarum.
Müller et al (1994) estudiaron la fermentación de fructanos por bacterias epifíticas de ácido láctico. Se aislaron cepas de bacterias epifíticas de ácido láctico de gramíneas forrajeras y se estudió su capacidad de hidrolizar fructanos. Solo 16 de las 712 cepas utilizaron fructanos. Dichas cepas se identificaron como Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus brevis y Pediococcus pentosaceus.
Como se puede advertir a partir de lo anterior, actualmente son conocidas y se usan algunas técnicas para alterar los niveles de fructano. Además, es conocido que el pan agrio tiene niveles naturalmente menores de fructano. Estas técnicas de reducción del contenido de fructano, en general, se basan en el uso de fermentación o enzimas que degradan fructano específicas.
Son conocidas en la técnica varias enzimas que degradan fructano. La familia de glucósido hidrolasas GH32 contiene invertasas y también enzimas que hidrolizan polisacáridos que contienen fructosa, tales como inulinasas, exoinulinasas, levanasas y p-2,6-fructano 6-levanbiohidrolasas, fructano p-(2,1)-fructosidasa/1-exohidrolasas o fructano p-(2,6)-fructosidasa/6-exohidrolasas, así como enzimas que presentan actividades de transglucosilación, tales como sacarosa:sacarosa 1-fructosiltransferasas, fructano:fructano 1-fructosiltransferasas, sacarosa:fructano 6-fructosiltransferasas, fructano:fructano 6G-fructosiltransferasas y levano fructosiltransferasas.
Las enzimas extracelulares, tales como inulinasa, que hidrolizan fructanos se extraen, por ejemplo, de Aspergillus niger y están disponibles comercialmente. Estas enzimas extracelulares son enzimas naturales que se aíslan o extraen de sus entornos naturales. Sin embargo, estas enzimas fructanasas extracelulares son costosas y difíciles de obtener en cantidades suficientes y en alta pureza para aplicaciones a gran escala.
Por ejemplo, Paludan-Müller et al (2002) estudiaron la purificación y caracterización de una fructano pfructosidasa extracelular de una cepa de Lactobacillus pentosus aislada de pescado fermentado. Se estudió una fructano hidrolasa extracelular de Lactobacillus paracasei ssp. paracasei P 4134 por Müller et al (1997), mientras que Goh et al (2007) caracterizaron una fructano hidrolasa a partir de Lactobacillus paracasei 1195. El documento WO 2010/097416 A1 divulga una proteína recombinante con actividad fructanasa que comprende un fragmento de una proteína natural derivada de bacterias de ácido láctico, tales como Lactobacillus.
Además, con el uso de enzimas que degradan fructano conocidas, tales como endofructanasa, inulinasa o levanasa, existe una posibilidad de que se formen fructooligosacáridos (FOS) como productos de degradación, ya que por este medio no todo el fructano se convierte en fructosa. Por lo tanto, todavía existe una necesidad de obtener una enzima que degrade fructano específica (fructanasa, fructano hidrolasa) que pueda descomponer eficazmente fructanos sin la formación de FOS.
Los FOS son carbohidratos que el cuerpo humano no puede digerir completamente y, por tanto, pueden funcionar como prebióticos. Se sugieren algunos efectos positivos para los FOS. Por ejemplo, pueden producir sustancias que detienen el crecimiento de bacterias gramnegativas y positivas tóxicas y perjudiciales en los intestinos. Sin embargo, de acuerdo con la evidencia científica actualmente disponible, los fOs pueden producir algunos efectos perjudiciales. Los FOS pueden provocar, por ejemplo, distensión abdominal, flatulencia, malestar abdominal e intestinal y eructos. Además, se demostró que las personas con intolerancia a la lactosa padecían, en particular, estos efectos secundarios. El motivo de estos síntomas puede ser que los FOS sean, en general, gastrointestinalmente más activos que el polímero fructano, puesto que la microflora intestinal los fermenta más rápidamente. Además, la fructosa también se puede considerar que es un compuesto FODMAP en personas que tienen problemas de absorción de fructosa. Esto es un problema cuando no está presente ninguna cantidad comparable de glucosa en el alimento o comida. Esto se debe a que la absorción de fructosa en el cuerpo humano se produce junto con el sistema de asimilación inducida por glucosa. Sin embargo, la concentración de fructosa en exceso (frente a la concentración de glucosa) es fácil de abordar con recetas o formulaciones de comidas.
Lo que todavía se necesita en la técnica es materias a base de cereales y verduras que estén sustancialmente libres de fructanos y FOS y, de este modo, se puedan usar para preparar productos que sean adecuados para dietas con bajo contenido de FODMAP. Lo que todavía se necesita en la técnica es un procedimiento y medio eficaces para la retirada de fructano de la materia a base de cereales y verduras que no dé como resultado productos de degradación desfavorables, especialmente FOS. Por lo tanto, un procedimiento y medio que posibiliten la retirada eficaz de fructano sería muy beneficioso para el desarrollo de productos alimenticios adecuados para una dieta con bajo contenido de FODMAP. El consumo de estos productos alimenticios no provocaría problemas gastrointestinales. Dichos productos alimenticios incluso podrían tener un efecto positivo sobre la salud gastrointestinal y, de esta manera, sobre el bienestar general.
Sumario de la invención
La invención se define por los rasgos característicos de las reivindicaciones independientes. Algunos modos de realización específicos se definen en las reivindicaciones dependientes.
La presente invención se basa en el hallazgo de que una enzima novedosa aislada de una cepa de Lactobacillus puede degradar y retirar eficazmente fructano de materias a base de cereales y verduras.
Se divulga en el presente documento una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una fructanasa extracelular, en la que dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID No. 1 o una secuencia análoga a la misma que tiene al menos un 96 % de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID No.1.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona una enzima que presenta actividad fructano hidrolasa, comprendiendo dicha enzima un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID. No. 2.
También se divulga en el presente documento un vector de expresión recombinante que comprende la construcción de ADN mencionada anteriormente, así como una célula que comprende dicho vector de expresión recombinante.
También se divulga un procedimiento de producción de una enzima que presenta actividad fructano hidrolasa, comprendiendo el procedimiento cultivar una célula como se define anteriormente en condiciones que permitan la producción de la enzima y recuperar la enzima del cultivo.
Se divulga además en el presente documento una enzima que presenta actividad fructano hidrolasa, estando codificada dicha enzima por una construcción de ADN como se define anteriormente o se produce por el procedimiento definido anteriormente.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una preparación con enzima para la degradación de fructano, comprendiendo dicha preparación una enzima de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una enzima o una preparación con enzima de acuerdo con la invención para la degradación de fructano en materias a base de cereales o en verduras.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una enzima o una preparación con enzima de acuerdo con la invención para la preparación de productos horneados o verduras con bajo contenido de fructano.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una premezcla para hornear, que comprende una enzima o una preparación con enzima de acuerdo con la invención, conjuntamente con uno o más ingredientes necesarios o adecuados para hornear.
Todavía otro aspecto de la invención es un mejorador para hornear, que comprende una enzima o preparación con enzima de acuerdo con la invención, conjuntamente con uno o más ingredientes del grupo que consiste en enzimas, gluten de trigo, vehículos (maltodextrina de gluten de trigo, etc.), emulsionantes, tales como, pero sin limitarse a, DATEM, y mono- y diglicéridos.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra el porcentaje de fructano residual cuando se estudió la capacidad de la enzima de degradar dos inulinas de diferente longitud, compuestos FOS y extracto de harina de centeno como una función del tiempo. En todas las reacciones, la proporción enzima:sustrato fue de aproximadamente 2.
La figura 2 muestra la cantidad de sustrato degradado por la enzima por unidad de actividad enzimática.
La figura 3 ilustra la cantidad de fructosa formada.
La figura 4 muestra los resultados de la cromatografía de filtración en gel para inulina (DPav=12) y sus productos de degradación. Las muestras se tomaron después de un tiempo de reacción de 30 min, 60 min y 120 min. En todas las muestras, la señal de fondo provocada por la enzima se ha reducido.
La figura 5 muestra los resultados de la cromatografía de filtración en gel para inulina (DPav=25) y sus productos de degradación. Las muestras se tomaron después de un tiempo de reacción de 30 min, 60 min y 120 min. En todas las muestras, la señal de fondo provocada por la enzima se ha reducido.
La figura 6 muestra las concentraciones de fructano en masas de trigo durante dos horas de leudado. La figura también muestra la concentración de fructano calculada al comienzo del leudado, en base al contenido de fructano medido de la harina de trigo.
La figura 7 ilustra el cambio en las concentraciones de fructano de masas de centeno durante dos horas de leudado. La figura también muestra la concentración de fructano teórica al comienzo del leudado, con y sin tener en cuenta el fructano del cultivo iniciador.
La figura 8 ilustra las concentraciones de fructosa en masas de trigo al comienzo y al final del leudado.
La figura 9 ilustra las concentraciones de fructosa en las masas de centeno al comienzo y al final del leudado. La figura 10 muestra la tendencia del pan horneado con y sin adición de enzima. Pan de control a la izquierda, pan con enzima a la derecha.
La figura 11 muestra el porcentaje de fructano residual cuando se estudió la capacidad de la enzima de degradar ajo y tupinambo como una función del tiempo.
Descripción detallada de la invención
En el presente contexto, se entiende que el término "análogo" usado para definir la construcción de ADN incluye cualquier secuencia de ADN que codifique una enzima con actividad fructanasa y que sea al menos un 96 % homóloga o tenga al menos un 96 % de identidad con la secuencia de ADN mostrada en SEQ ID No. 1. La secuencia de ADN análoga, por ejemplo, se puede aislar de otro organismo o puede ser una preparada en base a la secuencia de ADN mostrada en la SEQ ID No. 1, tal como por introducción de sustituciones de nucleótidos que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos de la enzima. Otros ejemplos de posibles modificaciones son la inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cualquier extremo de la secuencia o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o dentro de la secuencia.
La presente invención proporciona una enzima novedosa que puede degradar eficazmente fructanos. La enzima se aisló e identificó de una cepa de Lactobacillus que tenía actividad que degradaba fructano. Más específicamente, la cepa productora de fructanasa extracelular novedosa se identificó como Lactobacillus crispatus. Una muestra de este microorganismo se depositó en la Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) con el número de acceso DSM29598.
Se aislaron cepas de Lactobacillus que tenían actividad que degradaba fructano de un iniciador de semillas generado por adición de fermento de una tanda anterior. El iniciador de semillas se preparó a partir de materia a base de cereales que tenía un bajo contenido de almidón dañado como se divulga en la solicitud pendiente de tramitación PCT/FI2016/050011.
En resumen, se produjo un iniciador de semillas utilizando la adición de fermento de una tanda anterior. Añadir fermento de una tanda anterior significa que pequeñas cantidades de masa de la preparación de un producto fermentado de un lote previo se usan como inóculo o iniciador para la producción del lote posterior. En la preparación del iniciador de semillas, se usó materia a base de cereales que tenía un bajo contenido, preferentemente menos de un 1,0 % (en base al cereal), de almidón dañado. Se puso en remojo la materia a base de cereales en líquido, preferentemente agua, y se incubó a 20-50 °C durante de 4 a 72 horas. Al día siguiente, se mezcló como anteriormente un lote recién preparado de materia a base de cereales y líquido, preferentemente agua, y se inoculó con un 1-10 % de la mezcla incubada previamente. Esta adición de fermento de una tanda anterior se lleva a cabo varias veces, preferentemente al menos 3-6 veces, y se puede continuar tanto tiempo como sea necesario.
El resultado de la adición de fermento de una tanda anterior iniciada a partir de materia a base de cereales que tenía un bajo contenido de almidón dañado fue la formación de microflora espontánea que contenía microbios que pueden utilizar eficazmente fructanos como fuente de carbohidratos y consumir cuantitativamente (y, de este modo, retirar) fructanos de materia prima a base de cereales. La microflora adaptada tenía la capacidad de hidrolizar fructano y usar además los posibles productos de degradación y metabolitos (fructosa, FOS, manitol) para su crecimiento. La flora también puede tener un sistema de transporte para fructanos o sus productos de hidrólisis o metabolitos.
A partir del iniciador de semillas preparado como anteriormente, se aislaron colonias bacterianas con diferente morfología (tendencia) con respecto a cultivos puros. Se analizaron los microbios de las colonias para determinar su eficacia en la retirada de fructano de materia a base de cereales usándolos como inoculantes de cultivo puro en fermentaciones de laboratorio.
Se secuenció una cepa aislada eficaz en la retirada de fructano e identificó como Lactobacillus crispatus (DSM 29598). Una enzima novedosa de la invención, una fructosidasa extracelular y un miembro de la familia de glucosil hidrolasa 32, se aisló e identificó a partir de dicha cepa. Se espera que una secuencia de ADN que codifica una enzima homóloga, es decir, una secuencia de a Dn análoga, se pueda derivar de forma similar cribando una cepa de otro microorganismo, preferentemente un Lactobacillus, aislado de un iniciador de semillas preparado como se describe anteriormente. Los ejemplos de dichas cepas de Lactobacillus incluyen, pero no se limitan a, otras cepas de Lactobacillus crispatus, así como cepas de Lactobacillus helveticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus ultunensis, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorans, Lactobacillus sobrius o Lactobacillus acidophilus.
Se descubrió que la proteína enzimática aislada de Lactobacillus crispatus era un 95 % idéntica a las proteínas correspondientes en otra Lactobacillus crispatus, y un 94 % y 93 % idéntica a las proteínas correspondientes en L. amylovorus. Ninguna de estas enzimas de Lactobacillus está caracterizada bioquímicamente. Una fructano hidrolasa en L. paracasei estaba caracterizada previamente (Goh et al 2007) pero no es homóloga a la fructano hidrolasa de L. crispatus descrita aquí. La proteína tiene un péptido señal dependiente de sec (VKA-DT) previsto y es una proteína extracelular.
La enzima novedosa de la invención funciona en un amplio intervalo de temperaturas y muestra una actividad relativamente alta entre 30-60 °C. La temperatura óptima para la hidrólisis de fructano es de alrededor de 50 °C (un 100 % de actividad) mientras que a 30 °C y 60 °C la actividad es de un 80 %. La enzima muestra un 60 % de actividad a 65 °C y un 50 % de actividad a 20 °C. La enzima funciona activamente en el intervalo de pH de 4-6. Muestra una actividad máxima a pH 5,0 y una actividad muy alta (>95 %) a valores de pH 4,5 y 5,5. A valores de pH 4,0 y 6,0, la actividad es de un 75-80 % de la máxima.
Las propiedades mencionadas anteriormente muestran que la enzima de la presente invención es estable y activa en un amplio intervalo de temperaturas y pH. Dichas propiedades hacen que la enzima de la presente invención sea, en particular, adecuada para su uso en la preparación de materias a base de cereales y verduras con bajo contenido de fructano, así como ingredientes a base de cereales y verduras con bajo contenido de fructano y productos que sean adecuados, por ejemplo, para una dieta con bajo contenido de FODmAP.
Se entiende que la construcción de ADN de la divulgación incluye cualquier secuencia de ADN que codifique una enzima con actividad fructanasa y que tenga al menos un 96 %, preferentemente al menos un 97 %, incluso más preferentemente al menos un 98 % y todavía más preferentemente al menos un 99 % de identidad con la secuencia de ADN mostrada en SEQ ID No. 1. Por tanto, los cambios en la región codificante de fructanasa pueden dar lugar a la misma secuencia de aminoácidos o bien a una secuencia de aminoácidos que, a pesar de una o más desviaciones de la secuencia de aminoácidos original, corresponde a una enzima que tiene esencialmente actividad fructanasa.
También se divulga en el presente documento un vector de expresión recombinante que comprende una construcción de ADN como se define anteriormente y una célula huésped transformada con un vector de expresión recombinante como se define anteriormente. La célula huésped puede ser, por ejemplo, una bacteria, tal como una cepa de Escherichia coli, o una levadura, tal como Pichia pastoris.
La invención cubre la enzima independientemente de cómo se haya producido, por ejemplo, por tecnología de ADN recombinante, síntesis química, degradación enzimática o una combinación de las mismas. Además, la invención no solo cubre la enzima como tal, sino también en forma de una proteína de fusión o como una proteína unida física o químicamente a cualquier sustancia y que tenga actividad fructanasa.
También se divulga en el presente documento un procedimiento de producción de una enzima que presenta actividad fructanasa, que comprende la expresión en un huésped adecuado de un ADN como se define en el presente documento que codifica una enzima fructanasa. Como se establece anteriormente, la expresión puede tener lugar en diversas células huésped, entre las que Pichia pastoris es preferente. También se divulga un procedimiento como se define anteriormente en el que la enzima fructanasa producida se recupera del medio de cultivo.
Un objetivo de la invención también es una preparación con enzima o un mejorador que comprende una enzima de acuerdo con la invención, conjuntamente con vehículos y/o emulsionantes. Los vehículos pueden incluir, por ejemplo, gluten de trigo, maltodextrina, etc. Los emulsionantes adecuados incluyen emulsionantes conocidos por un experto en la técnica, tales como, por ejemplo, DATEM.
La preparación con enzima se puede preparar de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica y puede estar en forma de una preparación líquida o una seca. Por ejemplo, la preparación con enzima puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. La enzima que se va a incluir en la preparación se puede estabilizar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica.
Además de la enzima de acuerdo con la invención, la preparación con enzima también puede comprender una o más enzimas que tienen actividad hidrolasa. Las enzimas que tienen actividad hidrolasa pueden liberar, por ejemplo, glucosa o maltosa. Dichas enzimas incluyen, por ejemplo, a-glucosidasa (que libera glucosa de almidón/maltodextrina), p-glucosidasa (que libera glucosa de p-glucano), invertasa (que libera glucosa de sacarosa) y enzimas amilolíticas (que liberan maltosa de almidón). Un beneficio de tener glucosa y fructosa presentes en la formulación del producto es que se mejora la absorción de fructosa del intestino delgado cuando la glucosa está presente en cantidades iguales o mayores en comparación con la fructosa. Otro beneficio es obtener un sabor de dulzor equilibrado; aunque la fructosa sea más dulce que la glucosa o maltosa o sacarosa, su combinación con la glucosa, por ejemplo, crea un dulzor que se percibe más completo en su perfil de sabor dulce. La liberación de azúcares (glucosa, fructosa, maltosa) de ingredientes o materias primas durante el procesamiento de alimentos, incrementa, por tanto, el dulzor "natural" y, de este modo, reduce la necesidad de incluir azúcar añadido en las formulaciones del producto.
La enzima novedosa y la preparación con enzima novedosa de acuerdo con la invención se pueden usar en la degradación de fructano de materias a base de cereales o verduras. Las materias a base de cereales adecuadas incluyen, sin limitación, trigo, centeno, cebada y mezclas de los mismos. Una mezcla puede comprender las tres materias a base de cereales mencionadas o una combinación de cualesquiera dos de ellas. Las materias a base de verduras adecuadas incluyen todas las verduras que contengan fructano (por ejemplo, inulina). Los ejemplos de dichas verduras incluyen cebollas, ajo, tupinambo, raíz de achicoria, etc.
La dosificación de la enzima novedosa y la preparación con enzima novedosa necesaria para degradar fructano en una determinada materia depende de la actividad de la enzima, la cantidad de fructano en la materia y las condiciones en las que se usa la enzima o la preparación y se pueden determinar en base a procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, a un nivel de actividad de aproximadamente 500 U/g, se puede usar una proporción enzima/sustrato en el intervalo de 2:1 a 3:1, preferentemente de aproximadamente 2,5:1. En el horneado, la cantidad de enzima necesaria depende naturalmente de la cantidad de fructano en las harinas usadas. En el caso del trigo, puede ser suficiente un 0,1 % de enzima en base al peso de la harina de trigo. En el caso del centeno, la cantidad de enzima está preferentemente por encima de un 0,5 %, en base al peso de la harina de centeno.
Por tanto, la enzima novedosa se puede usar en la preparación de productos horneados, en los que se ha descubierto que reduce eficazmente el contenido de fructano. En el laboratorio, los compuestos FOS se degradaron prácticamente en su totalidad por la enzima. En el extracto de centeno, por encima de un 70 o un 80 % del fructano del extracto de centeno se degradó por la enzima novedosa.
Cuando se usó en el horneado, la enzima novedosa redujo el contenido de fructano de las masas de centeno y trigo a prácticamente cero al final del leudado de la masa. Al mismo tiempo, la cantidad de fructosa se incrementó en comparación con una masa de control sin la enzima.
La enzima novedosa también se puede usar en la preparación de verduras con bajo contenido de fructano en las que se ha descubierto que degrada aproximadamente un 60 % o más del contenido de fructano original de las verduras.
Por tanto, con la enzima novedosa o la preparación con enzima novedosa es posible proporcionar materias y productos a base de trigo, centeno, cebada y verduras que estén sustancialmente libres de fructano y, de este modo, son adecuados para una dieta específica, tal como una dieta con bajo contenido de FODMAP.
Otro objetivo de la invención es una premezcla para hornear que comprende la enzima novedosa de acuerdo con la invención o la preparación con enzima de acuerdo con la invención. Sin limitación, las premezclas típicamente incluyen trigo integral, machacado o molido, otros cereales, legumbres, frutos secos y semillas, pero también vehículos, fibras y aglutinantes de agua, tales como, pero sin limitarse a, maltodextrinas, celulosas, pectinas, concentrados de proteína (gluten, etc.). Las premezclas pueden incluir o no mejoradores de pan/masa y/o sus constituyentes.
Todavía otro aspecto de la invención es un mejorador para hornear, que comprende una enzima o preparación con enzima de acuerdo con la invención, conjuntamente con uno o más ingredientes del grupo que consiste en enzimas, gluten de trigo, vehículos (maltodextrina de gluten de trigo, etc.), emulsionantes, tales como, pero sin limitarse a, DATEM, y mono- y diglicéridos.
La enzima también se puede usar para liberar fructosa de fructano. Se puede usar conjuntamente con otras enzimas, por ejemplo, hidrolasas que liberan glucosa o maltosa de sacarosa, glucanos, como almidón o betaglucano o maltodextrina. Las enzimas que pueden liberar glucosa de los sustratos descritos incluyen invertasas, enzimas amilolíticas, alfa-glucosidasas y betaglucosidasas. La liberación de fructosa y/o glucosa posibilita disminuir la cantidad de azúcar añadido necesario para proporcionar el dulzor deseado al producto en cuestión.
Al menos algunos modos de realización de la presente invención encuentran aplicación industrial en la industria alimentaria, en particular, en productos para hornear y en la preparación de verduras con bajo contenido de FODMAP. Además, la liberación específica de fructosa también encuentra aplicación industrial en la industria alimentaria.
Evidentemente, la enzima de la invención también se puede aplicar fuera de la industria alimentaria. Por ejemplo, la enzima se puede usar en la producción de biocombustibles para liberar fructosa de materias que contengan fructano o en la producción de piensos para pretratar alimentos para animales para disminuir la cantidad de fructano y, de este modo, mejorar la digestión y el valor nutricional del pienso. Por ejemplo, los caballos pueden padecer laminitis, que se propone es la causa de que el pienso contenga cereales o pasto con alto contenido de carbohidratos no absorbibles, por ejemplo, fructano. Esto da lugar a fermentaciones intestinales en exceso que se cree que provocan la afección. La enzima también se puede aplicar como una enzima de ayuda digestiva en productos nutricéuticos de forma similar a como se añade la enzima lactasa para mejorar la digestión de la lactosa. La enzima también se podría usar en el cuidado dental para disminuir la cantidad de placa. Es conocido que los fructanos desempeñan un papel en la formación de la biopelícula de placa dental y que el uso de fructanasa podría reducir la cantidad de placa.
Aunque los siguientes ejemplos son ilustrativos de los principios de la presente invención en una o más aplicaciones particulares, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden realizar numerosas modificaciones en la forma, uso y detalles de implementación sin el ejercicio de facultad de la invención, y sin apartarse de los principios y conceptos de la invención. En consecuencia, no se pretende que la invención esté limitada, excepto por las reivindicaciones expuestas a continuación.
Los verbos "comprender" e "incluir" se usan en el presente documento como limitaciones abiertas que no excluyen ni requieren la existencia de rasgos característicos no citados. Los rasgos característicos enumerados en las reivindicaciones dependientes se pueden combinar libre y mutuamente a menos que se establezca de otro modo. Además, se debe entender que el uso de "un" de "unos", es decir, una forma singular, a lo largo del presente documento no excluye una pluralidad.
Parte experimental
Ejemplo 1. Producción de un iniciador de semillas y aislamiento de cultivos puros
Se produjo un iniciador de semillas a partir de granos cortados de centeno sin un iniciador de semillas preexistente. Los granos cortados usados en el ejemplo contienen un 0,2 % de almidón dañado.
Se pusieron en remojo 100 g de granos cortados en 150 g de agua y se incubaron a 45 °C. Después de 24 h, se mezclaron 10 g de la mezcla anterior con 100 g de granos cortados de centeno y 150 g de agua y se incubaron a 45 °C durante 24 h. Esta adición de fermento de una tanda anterior se repitió cinco veces más.
A partir del iniciador de semillas preparado como anteriormente, se aislaron colonias bacterianas con diferente morfología (tendencia) con respecto a cultivos puros. Se analizaron los microbios de las colonias para determinar su eficacia en la retirada de fructano de materia a base de cereales usándolos como inoculantes de cultivo puro en fermentaciones de laboratorio. En cada reacción de fermentación, se mezclaron 20 g de granos cortados de centeno con 30 gramos de agua del grifo y 500 mg de suspensión de iniciador de cultivos puros que contenía 109 células de cepa aislada de microbio. Después de 16 horas de fermentación a 37 °C, se analizó el contenido de fructano de las mezclas usando un kit comercial (K-FRUC, Megazyme). El contenido inicial de fructano de la materia a base de cereales fue de un 5 % (en base a la materia seca).
Se identificó una cepa aislada eficaz en la retirada de fructano como Lactobacillus crispatus.
Ejemplo 2. Identificación de fructano hidrolasa de L. crispatus (DSM 29598)
Aislamiento y secuenciación de ADN genómico: se aisló ADN genómico usando el kit de purificación de ADN genómico Wizard® (Promega) siguiendo las pautas del fabricante. La calidad y cantidad de cada muestra se evaluó usando electroforesis en gel y un espectrofotómetro NanoDrop. Las muestras se enviaron a Axeq Technologies (Seúl, Corea del Sur), donde se sometieron a otros controles de calidad y secuenciación genómica. Secuenciación hologenómica, ensamblaje y anotación: las muestras se secuenciaron usando Illumina HiSeq2000 con una cobertura > 500 veces y la calidad de las lecturas de extremos emparejados se evaluó usando la herramienta FastQC proporcionada en un paquete de programa informático Galaxy. Las lecturas se ensamblaron de novo usando ABySS (ensamblaje por secuencia corta; en cóntigos usando un valor k-méro de 63. Las secuencias repetitivas y los ensamblajes cortos se retiraron filtrando cóntigos <500 pb de tamaño. El resultado de la secuencia fue de 103 cóntigos.
La historia evolutiva se infirió usando el procedimiento de máxima verosimilitud basado en el modelo basado en la matriz JTT. El árbol está dibujado a escala, con las longitudes de las ramas medidas en el número de sustituciones por sitio. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA6.
Como resultado, se identificó una fructosidasa extracelular, un miembro de la familia de glucosil hidrolasa 32. La proteína enzimática es >93 % idéntica a las proteínas correspondientes en L. amylovorus, un 56 % idéntica a la fructano hidrolasa en Atobobium parvulum y >55 % idéntica a fructano hidrolasas en S. mutans. La proteína tiene un péptido señal dependiente de sec (VKA-DT) previsto y, por tanto, probablemente es una proteína extracelular. El análisis filogenético mostró que existen pocos homólogos en Lactobacillus spp., ninguno de estos está caracterizado bioquímicamente. La fructano hidrolasa en L. paracasei que estaba caracterizada previamente no es homóloga a la fructano hidrolasa de la L. crispatus actualmente estudiada.
Ejemplo 3. Producción de la enzima
La enzima se produjo en Pichia pastoris, una levadura metilotrófica que se usa ampliamente en la expresión extracelular de proteínas recombinantes, siguiendo procedimientos de ADN recombinante rutinarios. Se realizaron esencialmente procedimientos estándar en la producción de la enzima como se describe en Maniatis 1989, Molecular Cloning, CSH, N.Y., USA.
Ejemplo 4. Reacciones enzimáticas
Degradación de fructano
La capacidad de degradación de fructano de la enzima se examinó por dos inulinas de diferente longitud (inulina HP (DPav=25) e inulina GR (DPav=12)), por compuestos FOS y por extracto de harina de centeno. Para la reacción enzimática se preparó una solución de enzima que tenía una concentración de 10 mg/ml y una solución de sustrato que tenía una concentración de 4 mg/ml. Para la preparación de ambas soluciones, se usó tampón acetato de sodio 0,1 M (pH 4,5). Se transfirieron 0,5 ml de cada solución a la mezcla de reacción. Cuando se usó extracto de centeno como sustrato, las concentraciones fueron la mitad del tamaño. La reacción enzimática se llevó a cabo a 50 °C y el tiempo de reacción fue de 2 horas. Se tomaron muestras después de 60 min y después de 120 min. Se usó como patrón una solución en la que la solución de enzima se reemplazó por 0,5 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M (pH 4,5). Las reacciones se detuvieron colocando las muestras durante 5 min en un baño de agua hirviendo y, a continuación, se dejaron reposar durante 5 min en un baño de agua fría. Antes de la determinación de las concentraciones de fructano, las muestras se dejaron reposar durante aproximadamente 10 min a temperatura ambiente. Se diluyeron con agua desionizada de modo que la máxima concentración de fructano fuera de 1 mg/ml. La cantidad de degradación de fructano por la enzima se obtuvo restando la cantidad de fructano en la mezcla de reacción de la cantidad de fructano en el patrón.
En las reacciones se usó un compuesto enzimático, que tenía una actividad declarada de 516,6 U/g. La proporción enzima/sustrato en las reacciones fue de aproximadamente 2. La figura 1 muestra el porcentaje de fructano residual que quedaba en base a la concentración inicial. El diagrama muestra que los compuestos FOS se degradan en gran medida por la enzima, mientras que la inulina de cadena más larga se degrada menos. Después de dos horas, quedaba un 68,5 % de la inulina más larga, mientras que solo había un 3,0 % de compuestos FOS. La inulina más corta y el extracto de centeno se descompusieron aproximadamente por igual en términos porcentuales (quedaba un 25,3 % de inulina y un 27,1 % de fructano del extracto de centeno).
Puesto que las proporciones enzima/sustrato variaron ligeramente para cada sustrato, la cantidad de sustrato degradado por la enzima también se calculó por unidad de actividad enzimática (fig. 2). Se descubrió la degradación más alta con los compuestos FOS, mientras que la inulina más corta tuvo la degradación más baja. Durante dos horas, los compuestos FOS tuvieron una tasa de degradación de 0,654 mg/U, mientras que la de inulina fue de 0,25 mg/U. El fructano del extracto de centeno tuvo una mejor tasa de degradación con respecto a la cantidad de enzima que la inulina más corta (0,598 mg/U para centeno y 0,541 mg/U para inulina).
Ambos diagramas muestran que la enzima descompone los sustratos a una mayor tasa durante la primera hora y, después de esto, la tasa de degradación disminuye.
Formación de fructosa
Además de las concentraciones de fructano, también se midieron las concentraciones de fructosa en las reacciones después de los tiempos de reacción de 60 min y 120 min. La figura 3 muestra el incremento de las concentraciones de fructosa como una función del tiempo. La fructosa resultante se muestra por unidad de actividad enzimática. Las cantidades más altas de fructosa se formaron con extracto de centeno y compuestos FOS como sustratos. A partir de la inulina más corta, se formaron 0,775 mg/U de fructosa en dos horas. La cantidad más baja de fructosa se formó cuando la inulina más larga era el sustrato (0,431 mg/U). Cuando se usaron extracto de centeno y compuestos FOS como sustratos, la formación de fructosa fue significativamente menor después de una hora. La formación de fructosa a partir de inulina estuvo prácticamente al mismo nivel durante las dos horas. Las muestras también se sometieron a ensayo para determinar el contenido de glucosa y sacarosa, pero esos compuestos prácticamente no se formaron en las reacciones.
Los grados de hidrólisis se calcularon en base a la formación de fructosa de diferentes sustratos. Los compuestos FOS se hidrolizaron prácticamente por completo (96,6 %), lo que estaba muy cerca del valor obtenido a partir de los ensayos con fructano. Además, los grados de hidrólisis de la inulina más corta y el extracto de centeno estuvieron muy cerca de la tasa de degradación estimada en base a las mediciones de fructano. En cambio, la inulina más larga se hidrolizó considerablemente más, calculada en base a las concentraciones de fructosa, siendo el grado de hidrólisis de un 55,0 %, en base a la fructosa, y de un 31,5 %, en base al fructano.
Tabla 8. Grados de hidrólisis calculados en base a la formación de fructosa para varios sustratos después de un tiempo de reacción de dos horas
Sustrato Grado de hidrólisis (%)
FOS 96,6
Inulina (DPav=10) 75,5
Inulina (DPav=23) 55,0
Extracto de centeno 81,3
Procedimiento de hidrólisis
Se usó la cromatografía de filtración en gel para aclarar si la enzima degrada en primer lugar su sustrato en compuestos FOS o si libera moléculas de fructosa únicas de los extremos de la cadena de fructano. Se realizaron mediciones para reacciones de la inulina y se determinaron los productos de degradación para muestras tomadas a los 30 min, 60 min y 120 min. Además, se determinaron muestras en blanco que solo contenían el sustrato. La figura 4 muestra el pico formado por la inulina más corta y sus productos de degradación. El pico bajo aproximadamente a los 50 minutos representa inulina y los demás picos representan productos de degradación. El pico más alto en el gráfico muestra la fructosa, y los compuestos FOS también se forman en la reacción. En base a los pesos moleculares, los compuestos FOS tienen aproximadamente de 2 a 3 unidades de fructosa.
La figura 5 muestra el pico formado por la inulina más larga y sus productos de degradación. La reacción forma los mismos productos finales que la reacción de la inulina más corta. Sin embargo, en el sitio de los compuestos FOS existen más de estos compuestos FOS que tienen tres unidades de longitud que los que tienen dos unidades de longitud. Además, el gráfico muestra claramente que queda mucha inulina incluso después de dos horas.
Ejemplo 5. Horneado
Se estudió la capacidad de la enzima de degradar fructano en un procedimiento de horneado añadiendo enzima a masas de trigo y centeno. La tabla 1 muestra la receta básica de las masas de trigo y centeno. La cantidad de enzima en la masa de trigo fue de un 0,175 %, en base al peso de la harina de trigo, y en la masa de centeno de un 0,68 %, en base al peso de la harina de centeno. La harina en el cultivo iniciador no se tiene en cuenta en el cálculo. Además de las masas/panes con enzima, se prepararon masas de control sin enzima añadida.
Tabla 1. Ingredientes de las masas de trigo y centeno y sus cantidades en base a las cantidades de harina de trigo y centeno_______________________________________________________________________________ Ingrediente Masa de trigo (%) Masa de centeno (%)
Harina de trigo 100 -Harina de centeno - 100
Cultivo iniciador - 74
Agua 67 61
Levadura 3 1,2
Sal 1,7 2,3
Azúcar 1,8 -Aceite 1,2 -
Las masas se prepararon mezclando todos los ingredientes. Las masas de trigo se agitaron durante aproximadamente 5 min y las masas de centeno hasta que se mezclaron los ingredientes. La enzima se le añadió al agua antes de los demás ingredientes. Las masas se dejaron leudar durante dos horas a una temperatura de 37 °C. Se tomaron muestras de las masas inmediatamente después del mezclado y después del leudado de 30 min, 60 min y al final del leudado. Las masas se hornearon durante 20 min a una temperatura de 210 °C. La última muestra se tomó a partir de panes enfriados. Todas las muestras se congelaron y sometieron a ensayo para determinar las concentraciones de fructano y fructosa. Las muestras de masa de centeno también se sometieron a ensayo para determinar las concentraciones de manitol.
Concentraciones de fructano en las masas
Las concentraciones de fructano en las masas de trigo durante dos horas de leudado se muestran en la figura 6. La concentración de fructano en la masa de control fue de un 0,43 % al comienzo del leudado y disminuyó a un 0,23 % durante dos horas. En la masa con enzima añadida, la concentración fue de un 0,37 % al comienzo del leudado y de un 0,04 % al final del leudado. En ambas masas, las concentraciones de fructano fueron menores de lo que se esperaba en base a la concentración de fructano de la harina de trigo.
La figura 7 muestra el cambio en las concentraciones de fructano de masas de centeno durante dos horas de leudado. La figura 7 también muestra las concentraciones de fructano teóricas al comienzo del leudado, con y sin tener en cuenta el fructano del cultivo iniciador. La concentración de fructano en la masa de control fue de un 1,6 % al comienzo del leudado y de un 1,3 % al final del leudado. En la masa con enzima añadida, las concentraciones fueron de un 1,0 % al comienzo y de un 0,08 % al final. El diagrama también muestra cómo el contenido de fructano de la masa con enzima es extraordinariamente más pequeño que el del control ya al comienzo del leudado.
Concentraciones de fructosa en las masas
Se determinaron las concentraciones de fructosa en las masas al comienzo y al final del leudado. La figura 8 muestra los cambios en las concentraciones de fructosa de las masas de trigo después de dos horas. Sorprendentemente, el contenido de fructosa de la masa de control (0,64 %) al comienzo del leudado fue mayor que el de la masa con enzima (0,54 %). Sin embargo, durante dos horas, la concentración de masa de control disminuyó considerablemente más que la de la masa con enzima, siendo las concentraciones de un 0,17 % en la masa de control y de un 0,38 % en la masa con enzima.
En las masas de centeno, las concentraciones de fructosa también quedaron iguales cuando se compararon las concentraciones al comienzo y al final del leudado (figura 9). Las concentraciones de fructosa de la masa de control fueron de un 0,30 % al comienzo y de un 0,32 % al final del leudado. En la masa con enzima, la concentración de fructosa fue de un 1,29 % al comienzo y de un 1,39 % al final del leudado.
Pan horneado
Finalmente, se hornearon las masas y se determinaron las concentraciones de fructano y fructosa de los panes horneados finales. También se determinaron las concentraciones de manitol del pan de centeno. El ensayo con manitol se realizó por el procedimiento del kit de ensayo para D-manitol/L-arabitol. Se pesaron muestras de 1-2 g y, a continuación, se disolvieron en agua por calentamiento y agitación. El ensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En el tratamiento de muestras sólidas, las muestras no se filtraron después de disolverse en agua, sino que se centrifugaron durante 5 minutos (5000 rpm).
Los resultados se resumen en la tabla 2. En general, los niveles se incrementaron ligeramente durante la cocción (evaporación del agua). El contenido de fructano del pan de trigo que contenía enzima fue de un 0,05 %. El contenido de fructano del pan de centeno que contenía enzima fue de un 0,15 %. Las concentraciones de manitol de los panes de centeno fueron muy similares entre sí. En particular, el pan de centeno con enzima contenía más fructosa que el control.
Tabla 2. Concentraciones de fructano, fructosa y manitol en panes horneados
Pan Fructano (%) Fructosa (%) Manitol (%) Trigo, control 0,25 0,01 -Trigo, enzima 0,05 0,40 -Centeno, control 1,40 0,20 0,34 Centeno, enzima 0,15 1,31 0,36
Los panes horneados de trigo y centeno también se evaluaron a nivel sensorial. Las propiedades evaluadas incluyeron el color de la corteza, la textura y la esponjosidad del pan, así como el tiempo de conservación. Los panes también se pesaron y midieron para determinar su volumen. Apenas existió diferencia en los panes con enzima en comparación con los panes de control. La única diferencia detectada fue el color de la corteza de los panes de trigo. La corteza del pan con enzima era ligeramente más oscura que la del control (figura 11).
Ejemplo 6. Tratamiento de las verduras
a) Ajo
El ajo contenía alrededor de 20 g de fructano/100 g (peso fresco). Se machacaron cuatro gramos de ajo y se mezclaron con 50 ml de agua del grifo. Se le añadió la enzima fructanasa (1000 U) y la suspensión se incubó a 50 °C durante 5 horas. Se analizaron las muestras en puntos de tiempo de 0 h, 4 h y 5 h. El contenido de fructano disminuyó durante 4-5 horas de incubación, dejando el contenido de fructano residual en un 40 % de la muestra a las 0 h (fig. 11).
b) Tupinambo
El tupinambo contenía alrededor de un 12 % de fructano/100 g (peso fresco). Se cortaron en rodajas ocho gramos de tupinambo en trozos pequeños y se mezclaron con 30 ml de agua del grifo. Se le añadió la enzima fructanasa (1250 U) y la mezcla se incubó a 50 °C durante 5 horas. Las muestras se analizaron en los puntos de tiempo de 0 h, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h y 5 h. El contenido de fructano disminuyó constantemente, dejando un 32 % de fructano residual después de 5 h de incubación (fig 11).
Ejemplo 7. Horneado (mezcla de harinas)
La enzima se sometió a prueba en un procedimiento de horneado de masa simple para pan mixto que contenía una mezcla de harinas de trigo, avena y centeno. Se mezclaron los ingredientes (véase la tabla 3) durante 5 min en una amasadora y la masa se dejó reposar durante 20 min.
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La masa se moldeó en panes planos que se dejaron crecer durante 45 min a 40 °C y se hornearon en horno a 230 °C durante 15 min y se enfriaron a temperatura ambiente. El contenido de fructano se determinó después del enfriamiento. El contenido de fructano fue de un 0,34 % para el pan blanco y de un 0,17 % para pan con enzima.
Lista de citas
Literatura patente
Documento EP 1084624 A2
Documento US 20110129572 A1
Documento WO 2010/097416 A1
Literatura no patente
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Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Una enzima que presenta actividad fructano hidrolasa, comprendiendo dicha enzima un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID No. 2.
2. Una preparación con enzima para la degradación de fructano, comprendiendo dicha preparación una enzima de acuerdo con la reivindicación 1, conjuntamente con vehículos y/o emulsionantes.
3. La preparación con enzima de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende adicionalmente una o más de otras enzimas que tienen actividad hidrolasa, y en la que la(s) otra(s) enzima(s) libera(n) preferentemente glucosa o maltosa.
4. La preparación con enzima de acuerdo con la reivindicación 3, en la que se libera glucosa de almidón/maltodextrina por a-glucosidasa, de b-glucano por p-glucosidasa o de sacarosa por una invertasa; o se libera maltosa de almidón por enzimas amilolíticas.
5. Uso de una enzima de acuerdo con la reivindicación 1 o una preparación con enzima de acuerdo con la reivindicación 2 para la degradación de fructano en materias a base de cereales, preferentemente para la preparación de productos horneados, o en verduras para la preparación de verduras con bajo contenido de fructano.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la materia a base de cereales se selecciona del grupo que consiste en trigo, centeno, cebada y mezclas de los mismos.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que las verduras se seleccionan del grupo que consiste en cebolla, ajo y tupinambo.
8. Una premezcla para hornear, que comprende una enzima de acuerdo con la reivindicación 1 o una preparación con enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-4.
9. La premezcla de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además ingredientes seleccionados del grupo que consiste en trigo integral, machacado y molido, otros cereales, legumbres, frutos secos, semillas, vehículos, fibras y aglutinantes de agua, tales como, pero sin limitarse a, maltodextrinas, celulosas, pectinas, concentrados de proteína (gluten, etc.), mejoradores de pan/masa y/o sus constituyentes.
10. Un mejorador para hornear, que comprende una enzima de acuerdo con la reivindicación 1 o una preparación con enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-4 conjuntamente con uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en enzimas, gluten de trigo, vehículos (maltodextrina de gluten de trigo, etc.), emulsionantes, tales como, pero sin limitarse a, DATEM, mono- y diglicéridos.
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