ES2870678T3

ES2870678T3 - Composición

Info

Publication number: ES2870678T3
Application number: ES16823473T
Authority: ES
Inventors: Jan Charles Hansen; Jens Frisbaek Sorensen; Rene Mikkelsen
Original assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2016-12-20
Publication date: 2021-10-27
Anticipated expiration: 2036-12-20
Also published as: CN108471759A; EP3393254B1; GB201522603D0; US20210177017A1; MX2018007717A; EP3393254A1; BR112018012766A2; CA3009315A1; US20190000119A1; DK3393254T3; WO2017112660A1

Abstract

Una composición que comprende: (a) un salvado de cereal que comprende salvado de avena, salvado de centeno o una mezcla de los mismos; y (b) una composición de enzimas que comprende una mezcla de una enzima celulasa, una enzima glucanasa y una enzima xilanasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición

Campo de la invención

Esta invención se refiere a una composición que contiene un salvado de cereal. También se refiere a métodos para producir la composición y a su uso en una serie de aplicaciones, en particular en productos alimentarios y, en particular, aunque no exclusivamente, en productos horneados como el pan.

Antecedentes de la invención

El salvado son las capas exteriores duras del grano de cereal. Consiste en la combinación de aleurona y pericarpio. Junto con el germen, es una parte integral de los cereales integrales y, a menudo, se produce como un subproducto de la molienda en la producción de cereales refinados. El salvado es particularmente rico en fibra dietética y ácidos grasos esenciales y contiene cantidades significativas de almidón, proteínas, vitaminas y minerales dietéticos. Por lo tanto, el salvado se usa a menudo para enriquecer productos alimentarios, especialmente panes y otros productos horneados, para aquellos que buscan aumentar su ingesta de fibra dietética.

El salvado es en gran parte insoluble en agua. Por tanto, es deseable solubilizar al menos parcialmente el salvado para que sea más fácil de incorporar a las composiciones alimentarias.

Los documentos WO 2010/081869 y WO 2010/081870 describen ambos métodos de solubilización de salvado de cereal para producir una composición que comprende al menos una parte del salvado de cereal que está solubilizado. El documento WO 2010/081870 describe que este proceso se lleva a cabo tratando el salvado de cereal con una o más enzimas modificadoras de la pared celular; una o más enzimas modificadoras de almidón, y opcionalmente una o más enzimas adicionales. El documento WO 2010/081869 describe que este proceso se lleva a cabo tratando el salvado de cereal con una o más enzimas modificadoras de lípidos, y opcionalmente una o más enzimas adicionales, tales como xilanasas y celulasas.

Ambos documentos WO 2010/081869 y WO 2010/081870 describen que el salvado de cereal solubilizado puede incorporarse a una composición de harina que luego se usa para formar una masa para hornear. Sin embargo, todos los ejemplos de los documentos WO 2010/081869 y WO 2010/081870 describen composiciones y métodos en los que el salvado de cereal es salvado de trigo. Ninguno de los dos documentos WO 2010/081869 y WO 2010/081870 describe específicamente una composición que incluye un salvado de cereal y una enzima, en la que el salvado de cereal es salvado de avena y/o salvado de centeno y la enzima es una enzima celulasa, una enzima glucanasa y/o una enzima xilanasa.

El documento WO 2011/124678 se refiere a un método para la modificación de un salvado de cereal y a un método para la producción de un producto de salvado de cereal modificado.

El documento WO 2014/177304 se refiere a un método para preparar una base de avena líquida, en el que un material que comprende salvado de avena se suspende en un medio acuoso y se pone en contacto con a-amilasa, p-glucanasa y xilanasa para aumentar la concentración de arabinoxilano soluble en un factor de 5 o más.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención proporciona una composición que comprende:

(a) un salvado de cereal que comprende salvado de avena, salvado de centeno o una mezcla de los mismos; y

(b) una composición de enzimas que comprende una mezcla de una enzima celulasa, una enzima glucanasa y una enzima xilanasa.

Normalmente, la composición es una suspensión líquida (preferiblemente una suspensión acuosa) que contiene el salvado de cereal y la composición de enzimas. Normalmente, la composición de enzimas hace que el salvado de cereal se modifique y/o solubilice al menos parcialmente.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para preparar la composición anterior, que comprende poner en contacto el salvado de cereal con la enzima y, opcionalmente, otros componentes de la composición, preferiblemente que comprende además la adición de un líquido, típicamente agua, para formar una suspensión acuosa del salvado de cereal y la composición de enzimas.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición de harina que comprende: (a) una harina; y (b) una composición como se definió anteriormente.

En otro aspecto más, la invención proporciona un producto alimentario que contiene una composición como se definió anteriormente o una composición de harina como se definió anteriormente.

En otro aspecto más, la invención proporciona una composición de masa que comprende:

(a) la composición de harina como se definió anteriormente; y (b) agua.

En otro aspecto más, la invención proporciona un producto horneado que se puede obtener horneando la composición de masa como se define anteriormente.

En otro aspecto más, la invención proporciona un método para solubilizar un salvado de cereal, comprendiendo dicho método tratar una suspensión líquida de dicho salvado de cereal con una enzima, en el que:

(a) dicho salvado de cereal comprende salvado de avena, salvado de centeno o una mezcla de los mismos; y (b) dicha enzima comprende una mezcla de una enzima celulasa, una enzima glucanasa y una enzima xilanasa. En otro aspecto más, la invención proporciona un salvado de cereal solubilizado obtenido o que puede obtenerse de acuerdo con el método anterior.

En otro aspecto más, la invención proporciona un ingrediente alimentario obtenido o que puede obtenerse mediante el secado del salvado de cereal solubilizado anterior.

En otro aspecto más, la invención proporciona el uso de un salvado de cereal solubilizado como se definió anteriormente, en la preparación de un producto alimentario, preferiblemente en el que el producto alimentario es una masa o un producto horneado preparado a partir de masa.

En otro aspecto más, la invención proporciona un kit de partes que comprende:

(a) un salvado de cereal que comprende salvado de avena, salvado de centeno o una mezcla de los mismos;

(b) una enzima que comprende una mezcla de una enzima celulasa, una glucanasa y una enzima xilanasa;

(c) instrucciones de uso en un método como se definió anteriormente; y

(d) opcionalmente otros ingredientes para un producto alimentario.

En otro aspecto más, la invención proporciona el uso de una enzima para mejorar el volumen de pan que contiene un salvado de cereal, en el que:

(a) dicho salvado de cereal comprende salvado de avena, salvado de centeno o una mezcla de los mismos; y (b) dicha enzima comprende una enzima celulasa, una enzima glucanasa y/o xilanasa o una mezcla de las mismas. En otro aspecto más, la invención proporciona el uso de una enzima para mejorar la molicie del pan que contiene un salvado de cereal, en el que:

(a) dicho salvado de cereal comprende salvado de avena, salvado de centeno o una mezcla de los mismos; y (b) dicha enzima comprende una enzima celulasa, una enzima glucanasa y/o una enzima xilanasa o una mezcla de las mismas.

Ventajas y hallazgos sorprendentes

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que, cuando un salvado de cereal que comprende salvado de avena y/o salvado de centeno se trata con una composición de enzimas como se define en el presente documento, y la composición resultante se incorpora a una composición de masa que luego se hornea para formar pan, el pan resultante presenta un volumen mejorado y una molicie mejorada. Esto es contrario a lo que se hubiera esperado, ya que la técnica anterior solo describe específicamente composiciones de salvado de trigo tratadas con enzimas y en ninguna parte describe o sugiere que un pan que tenga suficiente molicie y volumen pueda producirse utilizando una harina a la que se le haya añadido salvado de avena o de centeno.

En particular, los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que, cuando un salvado de cereal que comprende salvado de avena y/o salvado de centeno se trata con una composición de enzimas como se define en el presente documento, y la composición resultante se incorpora a una composición de masa que incluye harina de centeno que es luego horneada para formar pan, el pan resultante exhibe un volumen y molicie mejorados. Esto es contrario a lo que se hubiera esperado, ya que la producción de un pan de volumen y molicie aceptables utilizando harina de centeno ha resultado particularmente difícil en la técnica anterior.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una fotografía que muestra la miga de pan producida en el ensayo de horneado del ejemplo 2; y La Figura 2 es una fotografía que muestra la miga de los panes producidos en el ensayo de horneado del ejemplo 3.

Definiciones generales

Los aminoácidos se mencionan en el presente documento usando el nombre del aminoácido, la abreviatura de tres letras o la abreviatura de una sola letra.

El término "proteína", como se usa en este documento, incluye proteínas, polipéptidos y péptidos. Como se usa en este documento, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónima del término "polipéptido" y/o el término "proteína". En algunos casos, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónima del término "péptido". En algunos casos, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónima del término "enzima".

Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en el presente documento. En la presente descripción y reivindicaciones, pueden usarse los códigos convencionales de una y tres letras para restos aminoácidos. El código de 3 letras para aminoácidos se define de conformidad con la Comisión Conjunta de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC IUB (JCBN). También se entiende que un polipéptido puede ser codificado por más de una secuencia de nucleótidos debido a la degeneración del código genético.

Pueden aparecer otras definiciones de términos a lo largo de la memoria descriptiva. Antes de que los ejemplos de realizaciones se describan con más detalle, debe entenderse que esta descripción no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que tales pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones concretas, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente descripción estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese intervalo, también se describe específicamente. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor indicado o valor intermedio en un intervalo indicado y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado está incluido en esta descripción. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse o excluirse independientemente en el intervalo, y cada intervalo en el que cualquiera, ninguno o ambos límites están incluidos en los intervalos más pequeños también se incluye dentro de esta descripción, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos límites incluidos también se incluyen en esta descripción.

Debe observarse que, como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", “la” y "el" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una enzima" incluye una pluralidad de tales agentes candidatos y sus equivalentes conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

Las publicaciones analizadas en este documento se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo aquí mencionado debe interpretarse como una admisión de que tales publicaciones constituyan la técnica anterior a las reivindicaciones adjuntas.

El término "cereal" como se usa en este documento se refiere a los frutos de una planta de la familia Poaceae, y dicha semilla contiene al menos el salvado que comprende la aleurona y el endospermo almidonado, con o sin la presencia adicional de pericarpio, cubierta de la semilla (que también se denomina testa) y/o germen. El término incluye, pero no se limita a especies como trigo, cebada, avena, espelta, centeno, sorgo, maíz y arroz.

El término "solubilización" como se usa en este documento se refiere a la solubilización del salvado de cereal en los métodos de acuerdo con la invención y se pretende que incluya cualquier grado de solubilización. Por consiguiente, la "solubilización" puede ser para obtener 100% de material soluble o puede ser para obtener un grado de solubilización menor que 100%, tal como menor que 70%, tal como en el intervalo de 40%-60% o tal como en el intervalo de 20%-40%. En algunas realizaciones, el grado de solubilización se determina en la materia seca frente al salvado de la materia seca.

Composición

En un primer aspecto, la invención proporciona una composición que comprende:

Esta composición también se denomina en el presente documento "la composición de salvado de la invención".

Normalmente, la composición es una suspensión líquida (preferiblemente una suspensión acuosa) que contiene el salvado de cereal y la composición de enzimas.

Salvado

La composición de la invención comprende un salvado de cereal. El término "salvado" como se usa en este documento se refiere a una fracción de molienda derivada de cereales enriquecida en cualquiera o en todos los tejidos a seleccionar de aleurona, pericarpio y cubierta de la semilla, en comparación con la semilla intacta correspondiente.

La expresión "fracción de molienda", como se usa en este documento, se refiere a la totalidad o a parte de las fracciones que resultan de la reducción mecánica del tamaño de los granos, a través, por ejemplo, pero sin limitarse a cortado, apisonamiento, triturado, rotura o molienda, con o sin fraccionamiento, mediante, por ejemplos, pero sin limitarse a tamizado, filtrado, cribado, soplado, aspiración, cribado centrífugo, separación por aire, separación electrostática o separación de campo eléctrico.

En una realización, el salvado de cereal comprende, consiste esencialmente o consiste en salvado de avena. En una realización, el salvado de cereal comprende, consiste esencialmente o consiste en salvado de centeno.

La composición de la invención puede contener adicionalmente salvado de otros granos además del salvado de avena y/o el salvado de centeno. Los ejemplos de otros granos que pueden ser aceptables incluyen salvado de trigo, cebada, triticale, arroz y maíz.

En una realización, el salvado de avena comprende al menos 50%, tal como al menos 60%, tal como al menos 70%, tal como al menos 80%, tal como al menos 90%, tal como al menos 95%, tal como al menos el 97%, tal como al menos 98%, tal como al menos 99%, tal como al menos 99,5% en peso del peso total del salvado en la composición.

En una realización, el salvado de centeno comprende al menos 50%, tal como al menos 60%, tal como al menos 70%, tal como al menos 80%, tal como al menos 90%, tal como al menos 95%, tal como al menos el 97%, tal como al menos 98%, tal como al menos 99%, tal como al menos 99,5% en peso del peso total del salvado en la composición.

Cuando el salvado de cereal se pone en contacto con la composición de enzimas (en particular, aunque no exclusivamente, en una suspensión acuosa), la actividad de la composición de enzimas normalmente hace que el salvado de cereal se modifique al menos parcialmente. La actividad de la composición de enzimas también, o como alternativa, generalmente provoca que el salvado de cereal se solubilice al menos parcialmente. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que estas modificaciones ayudan a obtener un producto de pan que contiene salvado de cereal (en particular, en el que se ha añadido salvado de avena y/o de centeno a la harina utilizada para formar la masa) que tiene un volumen y una molicie aceptables y mejorados.

Después del tratamiento con la composición de enzimas, la suspensión de salvado de cereal se puede secar para formar una composición secada. Las composiciones secadas son típicamente más adecuadas para incorporarlas en composiciones de harina para hacer una masa para formar productos horneados tales como pan.

Composición de enzimas

La composición de enzimas utilizada en la presente invención comprende una mezcla de una enzima celulasa, una enzima glucanasa y una enzima xilanasa.

En una realización, la composición de enzimas utilizada en la composición de la presente invención comprende, consiste esencialmente o consiste en una mezcla de una enzima celulasa, una enzima glucanasa y una enzima xilanasa.

En una realización, una enzima utilizada en la presente invención es una glucanasa. Las glucanasas son enzimas que degradan un glucano, que es un polisacárido que comprende (o consiste en) subunidades de glucosa. Como realizan la hidrólisis del enlace glucosídico, son hidrolasas.

En una realización, la enzima es una a-glucanasa. La a-glucanasa puede ser una a-1,4-glucanasa (es decir, una enzima que degrada los a-1,4-glucanos), una a-1,6-glucanasa (es decir, una enzima que degrada el a-1,6-glucano) o una mezcla de las mismas.

En una realización, la enzima es una p-glucanasa. La p-glucanasa puede ser una p-1,3-glucanasa (es decir, una enzima que degrada los p-1,3-glucanos), una p-1,4-glucanasa (es decir, una enzima que degrada los p-1,4 -glucanos), una p-1,6-glucanasa (es decir, una enzima que degrada los p-1,6-glucanos) o una mezcla de cualquiera de ellas. La celulasa es una forma específica de p-glucanasa, que realiza la hidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en la celulosa, liquenina y p-D-glucanos de cereales.

En una realización, la enzima es una mezcla de a-glucanasa y p-glucanasa.

En una realización, la enzima es una glucanasa distinta de una celulasa. En una realización, la enzima es una pglucanasa distinta de una celulasa. En una realización, la enzima es una p-1,4-glucanasa distinta de una celulasa.

En algunas realizaciones, la composición de enzimas, además de tener una actividad glucanasa, puede comprender además una o más de las actividades seleccionadas del grupo que consiste en: una mananasa, una pectinasa, una xilanasa, una glucuronidasa, una galactanasa. En una realización, la composición de enzimas comprende una actividad glucanasa (por ejemplo, una p-glucanasa) y una actividad mananasa. En una realización, la composición de enzimas comprende una actividad endoglucanasa (por ejemplo, una p-glucanasa) y una actividad pectinasa.

En algunas realizaciones, la actividad glucanasa comprende al menos el 50%, tal como al menos 60%, tal como al menos 70%, tal como al menos 80%, tal como al menos 90%, tal como al menos 95%, tal como al menos 97%, tal como al menos 98%, tal como al menos 99%, tal como 100% de la actividad total de la enzima.

En algunas realizaciones, la enzima glucanasa es de origen vegetal. En algunas realizaciones, la enzima glucanasa es de origen bacteriano. En algunas realizaciones, la enzima glucanasa es de origen fúngico.

En una realización, una enzima utilizada en la presente invención es una celulasa. En esta memoria descriptiva, se entiende que el término "celulasa" significa una enzima que cataliza la celulólisis (es decir, la degradación de la celulosa y de algunos polisacáridos relacionados); específicamente, una enzima p-1,4-glucanasa que realiza la hidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en la celulosa, liquenina y p-D-glucanos de cereales. Las celulasas degradan la molécula de celulosa en monosacáridos como beta-glucosa, o polisacáridos y oligosacáridos más cortos.

El término "celulasas" o la expresión "enzimas celulolíticas" como se usan en este documento se entienden como que comprenden las celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91), por ejemplo, celobiohidrolasa I y celobiohidrolasa II, así como las endoglucanasas (EC 3.2.1.4) y beta- glucosidasas (EC 3.2.1.21).

Dentro de la definición de celulasas se incluyen: endoglucanasas (EC 3.2.1.4) que cortan las cadenas de celulosa al azar; celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) que escinden unidades de celobiosilo de los extremos de la cadena de celulosa, y beta-glucosidasas (EC 3.2.1.21) que convierten la celobiosa y las celodextrinas solubles en glucosa. Entre estas tres categorías de enzimas involucradas en la biodegradación de la celulosa, las celobiohidrolasas son las enzimas clave para la degradación de la celulosa cristalina nativa. La expresión "celobiohidrolasa I" se define en el presente documento como una actividad de celulosa 1,4-beta-celobiosidasa (también denominada exoglucanasa, exocelobiohidrolasa o 1,4-beta-celobiohidrolasa), como se define en la clase de enzimas EC 3.2.1.91, que cataliza la hidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en la celulosa y la celotetraosa, mediante la liberación de celobiosa de los extremos no reductores de las cadenas. La definición de la expresión "actividad celobiohidrolasa II" es idéntica, excepto que la celobiohidrolasa II ataca desde los extremos reductores de las cadenas.

En algunas realizaciones, la enzima celulasa es de origen vegetal. En algunas realizaciones, la enzima celulasa es de origen bacteriano. En algunas realizaciones, la enzima celulasa es de origen fúngico. En algunas realizaciones, la enzima celulasa se deriva de hongos del género Aspergillus. En algunas realizaciones, la enzima celulasa se deriva de hongos del género Aspergillus niger. En algunas realizaciones, la enzima celulasa se deriva de hongos de la especie Trichoderma reesei. En algunas realizaciones, la enzima celulasa se deriva de hongos de la especie Trichoderma reesei. En algunas realizaciones, la enzima celulasa se deriva de hongos del género Humicola. En algunas realizaciones, la enzima celulasa se deriva de hongos de la especie Humicola insolens.

En una realización preferida, la enzima celulasa utilizada en la presente invención se deriva de hongos de la especie Trichoderma reesei. Por ejemplo, la enzima celulasa para usar en la presente invención puede ser un extracto bruto o purificado de un fermentado de Trichoderma reseei. Un ejemplo particular de tal composición es el descrito en el documento PCT/EP2015/080439, inédito en la fecha de presentación de la presente solicitud. DuPont vende una composición de este tipo con el nombre de Laminex BG2.

En algunas realizaciones, la composición de enzimas además de tener actividad celulasa puede comprender también una o más de las actividades seleccionadas del grupo que consiste en: una mananasa, una pectinasa, una xilanasa, una glucuronidasa, una galactanasa. En algunas realizaciones, la actividad celulasa comprende al menos el 50%, tal como al menos 60%, tal como al menos 70%, tal como al menos 80%, tal como al menos 90%, tal como al menos 95%, tal como al menos el 97%, tal como al menos 98%, tal como al menos 99%, tal como 100% de la actividad total de la enzima.

En una realización, la celulasa es una endoglucanasa (EC 3.2.1.4). En una realización, la celulasa es una celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91). En una realización, la celulasa es una beta-glucosidasa (EC 3.2.1.21).

Las celulasas pueden comprender un módulo de unión a carbohidratos (“carbohydrate-binding module”, CBM) que mejora la unión de la enzima a una fibra que contiene celulosa y aumenta la eficacia de la parte catalítica activa de la enzima. Un CBM se define como una secuencia de aminoácidos contigua dentro de una enzima activa en carbohidratos con un plegamiento discreto que tiene actividad de unión a carbohidratos. Para obtener más información sobre CBM, véase el servidor de Internet CAZy o Tomme et al. (1995) en Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides (Saddler y Penner, eds.), Cellulose-binding domains: classification and properties, pp. 142-163, American Chemical Society, Washington. En una realización preferida, la preparación celulolítica que comprende un polipéptido que tiene actividad potenciadora de la celulolítica (GH61A), preferiblemente el que se describe en el documento Wo 2005/074656.

En algunas realizaciones, la enzima celulasa es un producto disponible comercialmente, tal como GC220 disponible ^{en Genencor, A Danisco Division, EE.UU. o CELLUCLAST®}1.5l ^{o CELLUZYME™ disponible en Novozymes A/S,}Dinamarca.

Las endoglucanasas (EC n.° 3.2.1.4) catalizan la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glicosídicos en la celulosa, derivados de celulosa (como carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa), liquenina, enlaces beta-1,4 en beta-1,3 glucanos mixtos, tales como beta-D-glucanos de cereales o xiloglucanos y otro material vegetal que contenga partes celulósicas. El nombre autorizado es endo-1,4-beta-D-glucano 4-glucano hidrolasa, pero en la presente memoria se utiliza el término abreviado endoglucanasa. La actividad endoglucanasa se puede determinar usando la hidrólisis de carboximetilcelulosa (CMC) de acuerdo con el procedimiento de Ghose, Pure y Appl. Chem. 1987, 59, 257-268.

En algunas realizaciones, la endoglucanasa es de origen vegetal. En algunas realizaciones, la endoglucanasa es de origen fúngico. En algunas realizaciones, la endoglucanasa es de origen bacteriano. En algunas realizaciones, las endoglucanasas pueden derivarse de un hongo del género Trichoderma, tal como un hongo de la especie Trichoderma reesei. En algunas realizaciones, las endoglucanasas pueden derivarse de un hongo de una cepa del género Humicola, tal como un hongo de la especie Humicola insolens. En algunas realizaciones, las endoglucanasas pueden derivarse de un hongo del género Chrysosporium, tal como un hongo de la especie Chrysosporium lucknowense.

El término "celobiohidrolasa" significa una 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91), que cataliza la hidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en celulosa, celooligosacáridos o cualquier polímero que contiene glucosa con enlaces beta-1,4, que libera celobiosa desde los extremos reductores o no reductores de la cadena.

Los ejemplos de celobiohidrolosas se mencionaron anteriormente, e incluyen las celobiohidrolasa CBH I y CBH II de Trichoderma reesei; Humicola insolens y CBH II de Thielavia terrestris (CELL6A). La actividad celobiohidrolasa se puede determinar de acuerdo con los procedimientos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem., 47 273-279, y por van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh y Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288. El método de Lever et al. es adecuado para evaluar la hidrólisis de celulosa en rastrojos de maíz y el método de van Tilbeurgh et al. es adecuado para determinar la actividad celobiohidrolasa en un derivado de disacárido fluorescente.

El término "beta-glucosidasa" significa una beta-D-glucósido glucohidrolasa (CE 3.2.1.21), que cataliza la hidrólisis de restos terminales de beta-D-glucosa no reductores con la liberación de beta-D-glucosa. Para los propósitos de la presente invención, la actividad beta-glucosidasa se determina de acuerdo con el procedimiento básico descrito por Venturi et al., 2002, J. Basic Microbiol., 42: 55-66, excepto que se emplearon diferentes condiciones como se describe en el presente documento. Una unidad de actividad beta-glucosidasa se define como 1,0 gmol de p-nitrofenol producido por minuto a 50 °C, pH 5, a partir de p-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido 4 mM como sustrato en citrato de sodio 100 mM, TWEEN® 20 al 0,01%.

En algunas realizaciones, la beta-glucosidasa es de origen vegetal. En algunas realizaciones, la beta-glucosidasa es de origen fúngico. En algunas realizaciones, la beta-glucosidasa es de origen bacteriano. En una realización, la betaglucosidasa se deriva de un hongo del género Trichoderma. En algunas realizaciones, la beta-glucosidasa se deriva de un hongo de la especie Trichoderma reesei, tal como la beta-glucosidasa codificada por el gen bgl1 (ver documento EP 562003). En una realización, la beta-glucosidasa se deriva de un hongo del género Aspergillus. En algunas realizaciones, la beta-glucosidasa se deriva de Aspergillus oryzae (producido de forma recombinante en Aspergillus oryzae según el documento WO 02/095014), Aspergillus fumigatus (producido de forma recombinante en Aspergillus oryzae según el ejemplo 22 del documento WO 02/095014) o Aspergillus niger (1981, J. Appl., 3:157-163). En una realización, la beta-glucosidasa se deriva de un hongo del género Penicillium.

En una realización, una enzima utilizada en la presente invención es una xilanasa. El término "xilanasa", como se usa en este documento, se refiere a una enzima que es capaz de hidrolizar el enlace beta-1,4 glicosilo en las unidades de beta-D-xilopiranosil-1,4-beta-D-xilopiranosilo no terminales del xilano o arabinoxilano. Tales enzimas también pueden ser conocidas por incluir 1,4-beta-D-xilano xilanohidrolasa, 1,4-beta-xilano xilanohidrolasa, beta-1,4-xilano xilanohidrolasa, (1-4) -beta-xilano 4-xilanohidrolasa, endo-1,4-beta-xilanasa, endo-(1-4)-beta-xilanasa, endo-beta-1,4-xilanasa, endo-1,4-beta-D-xilanasa, endo-1,4- xilanasa, beta-1,4-xilanasa, beta-xilanasa y beta-D-xilanasa.

En algunas realizaciones, la composición de enzimas además de tener una actividad xilanasa puede comprender también una o más de las actividades seleccionadas del grupo que consiste en: una mananasa, una pectinasa, una celulasa, una glucuronidasa, una galactanasa. En algunas realizaciones, la actividad xilanasa comprende al menos el 50%, tal como al menos 60%, tal como al menos 70%, tal como al menos 80%, tal como al menos 90%, tal como al menos 95%, tal como al menos el 97%, tal como al menos 98%, tal como al menos 99%, tal como 100% de la actividad total de la enzima.

Las xilanasas se pueden obtener de una diversidad de organismos. En una realización, la xilanasa es de origen vegetal. En una realización, la xilanasa es de origen fúngico. En una realización, la xilanasa se deriva de un hongo del género Aspergillus. En una realización, la xilanasa se deriva de un hongo del género Penicillium. En una realización, la xilanasa se deriva de un hongo del género Disporotrichum. En una realización, la xilanasa se deriva de un hongo del género Neurospora. En una realización, la xilanasa se deriva de un hongo del género Fusarium. En una realización, la xilanasa se deriva de un hongo del género Humicola. En una realización, la xilanasa se deriva de un hongo del género Trichoderma.

En una realización, la xilanasa es de origen bacteriano. En una realización, la xilanasa se deriva de una bacteria del género Bacillus. En una realización, la xilanasa se deriva de una bacteria del género Aeromonas. En una realización, la xilanasa se deriva de una bacteria del género Streptomyces. En una realización, la xilanasa se deriva de una bacteria del género Nocardiopsis. En una realización, la xilanasa se deriva de una bacteria del género Thermomyces. Se describen ejemplos de xilanasas adecuadas en los documentos WO92/17573, WO92/01793, WO91/19782 y WO94/21785.

En un aspecto de la invención, la xilanasa usada en la presente invención es una enzima clasificada como EC 3.2.1.8. El nombre oficial es endo-1,4-beta-xilanasa. El nombre sistemático es 1,4-beta-D-xilano xilanohidrolasa. Pueden usarse otros nombres, tales como endo-(1-4)-beta-xilanasa; (1-4)-beta-xilano 4-xilanohidrolasa; endo-1,4-xilanasa; xilanasa; beta-1,4-xilanasa; endo-1,4-xilanasa; endo-beta-1,4-xilanasa; endo-1,4-beta-D-xilanasa; 1,4-beta-xilano xilanohidrolasa; beta-xilanasa; beta-1,4-xilano xilanohidrolasa; endo-1,4-beta-xilanasa; beta-D-xilanasa. La reacción catalizada es la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-xilosídicos en xilanos.

En un aspecto de la invención, la xilanasa de la invención es una xilanasa de la familia 11 de glucósido hidrolasa (GH). La expresión "de la familia 11 de glucósido hidrolasa (GH)" significa que la xilanasa en cuestión está o puede clasificarse en la familia 11 de GH. En un aspecto de la invención, la xilanasa usada según la invención es una xilanasa que tiene actividad xilanasa medida en el "ensayo de xilanasa" como se describe en el presente documento.

Según el sitio de Cazy(ModO), las glucósido hidrolasas de la familia 11 se pueden caracterizar de la siguiente manera:

Actividades conocidas: xilanasa (EC 3.2.1.8)

Mecanismo: Retención

Nucleófilo catalítico/base: Glu (experimental)

Donante catalítico de protones: Glu (experimental)

Estado de la estructura tridimensional: Plegamiento: rollo de gelatina p

Clan: GH-C

Como se usa en este documento, "clan C" se refiere a agrupaciones de familias que comparten un plegamiento tridimensional común y una maquinaria catalítica idéntica (ver, por ejemplo, Henrissat, B. y Bairoch, A. (1996), Biochem. J., 316, 695-696).

Como se usa en este documento, "familia 11" se refiere a una familia de enzimas según lo establecido por Henrissat y Bairoch (1993), Biochem J., 293, 781-788 (ver también, Henrissat y Davies (1997), Current Opinion in Structural Biol., 1997, 7, 637-644). Las características comunes de los miembros de la familia 11 incluyen una alta homología genética, un tamaño de aproximadamente 20 kDa y un mecanismo catalítico de doble desplazamiento (ver Tenkanen et al., 1992; Wakarchuk et al., 1994). La estructura de las xilanasas de la familia 11 incluye dos láminas p grandes formadas por cadenas p y hélices a.

Las xilanasas de la familia 11 incluyen las siguientes: Aspergillus n igerXynA, Aspergillus kawachii XynC, Aspergillus tubigensis XynA, Bacillus circulans XynA, Bacillus punzilus XynA, Bacillus subtilis XynA, Neocalliniastix patriciarum XynA, Streptomyces lividans XynB, Streptomyces lividans XynC, Streptomyces thermoviolaceus XynII, Thermomonospora fusca XynA, Trichoderma harzianum Xyn, Trichoderma reesei XynI, Trichoderma reesei XynII, Trichoderma viride Xyn.

En algunas realizaciones, la xilanasa se deriva de un hongo filamentoso, preferiblemente derivado de una cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus aculeatus; o una cepa de Humicola, preferiblemente Humicola lanuginosa. La xilanasa puede ser preferiblemente una endo-1,4-beta-xilanasa, más preferiblemente una endo-1,4-beta-xilanasa de GH10 o GH11. Los ejemplos de xilanasas comerciales incluyen Grindamyl H121 o Grindamyl Powerbake 930 de DuPont Nutrition Biosciences ApS, Dinamarca, o SHEARZYME™ y BIOFEED WHEAT™ de Novozymes A/S, Dinamarca.

En algunas realizaciones, la composición de enzimas también contiene enzimas adicionales además de la glucanasa, celulasa y/o xilanasa. Los ejemplos de enzimas adicionales que pueden estar presentes incluyen hidrolasas (incluyendo amilasas), proteasas lipasas, fosfolipasas (por ejemplo, una fosfolipasa A1, una fosfolipasa A2, una fosfolipasa B, una fosfolipasa C o una fosfolipasa D) y glicolipasas.

En una realización, la composición de enzimas contiene una lipasa. En una realización, la lipasa es una trigliceridasa. En una realización, la lipasa es una glicolipasa.

La lipasa (por ejemplo, una glicolipasa) se puede obtener de una diversidad de organismos. En una realización, la lipasa es de origen vegetal. En una realización, la lipasa es de origen fúngico. En una realización, la lipasa es de origen bacteriano.

En una realización, la lipasa se deriva de un hongo del género Fusarium. En una realización, la lipasa se deriva de un hongo de la especie Fusarium heterosporum.

En una realización particularmente preferida, la lipasa es la lipasa específica derivada de un hongo de la especie Fusarium heterosporum, descrito general y específicamente en el documento WO2005/087918.

Dosis

La enzima o enzimas para usar en la presente invención pueden dosificarse como sigue.

Normalmente, la enzima celulasa está presente en una cantidad de 0,1 mg a 100 mg por 100 g de salvado. En una realización, la enzima celulasa está presente en una cantidad de 0,2 mg a 50 mg por 100 g de salvado. En una realización, la enzima celulasa está presente en una cantidad de 0,5 mg a 20 mg por 100 g de salvado. En una realización, la enzima celulasa está presente en una cantidad de 1 mg a 10 mg por 100 g de salvado. Estas cantidades se expresan en peso de proteína enzimática pura.

Normalmente, la enzima xilanasa está presente en una cantidad de 0,006 mg a 0,6 mg por 100 g de salvado. En una realización, la enzima xilanasa está presente en una cantidad de 0,012 mg a 0,3 mg por 100 g de salvado. En una realización, la enzima xilanasa está presente en una cantidad de 0,03 mg a 0,12 mg por 100 g de salvado. Estas cantidades se expresan en peso de proteína enzimática pura.

Normalmente, la enzima celulasa está presente en una cantidad de 30 a 3000 unidades de actividad celulasa por 100 g de salvado. En una realización, la enzima celulasa está presente en una cantidad de 60 a 1500 unidades de actividad celulasa por 100 g de salvado. En una realización, la enzima celulasa está presente en una cantidad de 150 a 600 unidades de actividad celulasa por 100 g de salvado. Las unidades de actividad celulasa se miden de acuerdo con el ensayo de actividad CMC-DNS descrito a continuación.

Normalmente, la enzima xilanasa está presente en una cantidad de 50 a 5000 unidades de actividad xilanasa (XU) por 100 g de salvado. En una realización, la enzima xilanasa está presente en una cantidad de 100 a 2500 unidades de actividad xilanasa (XU) por 100 g de salvado. En una realización, la enzima xilanasa está presente en una cantidad de 250 a 1000 unidades de actividad xilanasa (XU) por 100 g de salvado. Las unidades de actividad xilanasa se miden de acuerdo con los ensayos de actividad descritos a continuación.

Normalmente, la enzima glucanasa está presente en una cantidad de 0,1 mg a 100 mg por 100 g de salvado. En una realización, la enzima glucanasa está presente en una cantidad de 0,2 mg a 50 mg por 100 g de salvado. En una realización, la enzima glucanasa está presente en una cantidad de 0,5 mg a 20 mg por 100 g de salvado. En una realización, la enzima glucanasa está presente en una cantidad de 1 mg a 10 mg por 100 g de salvado. Estas cantidades se expresan en peso de proteína enzimática pura.

Normalmente, la enzima glucanasa está presente en una cantidad de 30 a 3000 unidades de actividad glucanasa por 100 g de salvado. En una realización, la enzima glucanasa está presente en una cantidad de 60 a 1500 unidades de actividad celulasa por 100 g de salvado. En una realización, la enzima glucanasa está presente en una cantidad de 150 a 600 unidades de actividad celulasa por 100 g de salvado. Las unidades de actividad celulasa se miden de acuerdo con el ensayo de actividad CMC-DNS descrito a continuación.

En una realización preferida, la composición de enzimas es una mezcla de una xilanasa y una celulasa, la enzima xilanasa está presente en una cantidad de 0,006 mg a 0,6 mg por 100 g de salvado y la enzima celulasa está presente en una cantidad de 0,1 mg a 100 mg. por 100 g de salvado. En una realización más preferida, la composición de enzimas es una mezcla de una xilanasa y una celulasa, la enzima xilanasa está presente en una cantidad de 0,03 mg a 0,12 mg por 100 g de salvado y la enzima celulasa está presente en una cantidad de 1 mg a 10 mg por 100 g de salvado. Estas cantidades se expresan en peso de proteína enzimática pura.

En una realización preferida, la composición de enzimas es una mezcla de una xilanasa y una celulasa, la enzima xilanasa está presente en una cantidad de 50 a 5000 unidades de actividad xilanasa (XU) por 100 g de salvado y la enzima celulasa está presente en una cantidad de 30 a 3000 unidades de actividad celulasa por 100 g de salvado. En una realización más preferida, la composición de enzimas es una mezcla de una xilanasa y una celulasa, la enzima xilanasa está presente en una cantidad de 250 a 1000 unidades de actividad xilanasa (XU) por 100 g de salvado y la enzima celulasa está presente en una cantidad de 150 a 600 unidades de actividad celulasa por 100 g de salvado.

En una realización especialmente preferida, la composición de enzimas es una mezcla de una xilanasa bacteriana (Grindamyl Powerbake 930 de DuPont Nutrition Biosciences ApS) y una enzima celulasa y/o glucanasa que se deriva de un extracto bruto o purificado de un fermentado de Trichoderma reseei (como se describe en el documento PCT/EP2015/080439, inédito en la fecha de presentación de la presente solicitud y comercializado por DuPont con el nombre de Laminex BG2). Una composición de enzimas de este tipo también se denomina en esta memoria descriptiva "TS-E 1732". Preferiblemente, en esta mezcla, la enzima xilanasa está presente en una cantidad de 0,006 mg a 0,6 mg por 100 g de salvado y esta enzima celulasa está presente en una cantidad de 0,1 mg a 100 mg por 100 g de salvado. En una realización más preferida, la composición de enzimas es una mezcla de la xilanasa especificada y la celulasa especificada, la enzima xilanasa especificada está presente en una cantidad de 0,03 mg a 0,12 mg por 100 g de salvado y la enzima celulasa especificada está presente en una cantidad de 1 mg a 10 mg por 100 g de salvado. Estas cantidades se expresan en peso de proteína enzimática pura.

En una realización especialmente preferida, la composición de enzimas es una mezcla de una xilanasa bacteriana (Grindamyl Powerbake 930 de DuPont Nutrition Biosciences ApS) y una enzima celulasa y/o glucanasa que se deriva de un extracto bruto o purificado de un fermentado Trichoderma reseei (como se describe en el documento PCT/EP2015/080439, inédito en la fecha de presentación de la presente solicitud y comercializado por DuPont con el nombre de Laminex BG2), la enzima xilanasa está presente en una cantidad de 50 a 5000 unidades de actividad xilanasa (XU) por 100 g de salvado y la enzima celulasa es presente en una cantidad de 30 a 3000 unidades de actividad celulasa por 100 g de salvado. En una realización más preferida, la composición de enzimas es una mezcla de la xilanasa especificada y la celulasa especificada, la enzima xilanasa especificada está presente en una cantidad de 250 a 1000 unidades de actividad xilanasa (XU) por 100 g de salvado y la enzima celulasa especificada es presente en una cantidad de 150 a 600 unidades de actividad celulasa por 100 g de salvado.

Ensayos de actividad enzimática

El grado de solubilización del salvado en la composición de salvado de la presente invención se puede medir de acuerdo con el siguiente método:

El grado de solubilización de un material vegetal, por ejemplo, salvado de cereal, se puede determinar suspendiendo el material vegetal insoluble (típicamente salvado al 25%) en agua con y sin enzimas, e incubando la suspensión con agitación y 50 °C durante un tiempo controlado (por ejemplo, de 30 a 1440 minutos). Después de la solubilización, el material solubilizado se separa del material insoluble por centrifugación (20 min, 25000 x g, temperatura ambiente). El contenido en materia seca en el sobrenadante se determina liofilizando parte de la muestra o mediante un análisis de la humedad (analizador de humedad Y ML-50, Buch & Holm, Dinamarca). Sin embargo, no se puede recuperar todo el tampón de extracción utilizando este protocolo, pero se supone que la concentración de material soluble es la misma en el tampón de extracción recuperado que en el tampón de extracción no recuperado, razón por la cual se hace una corrección para el tampón de extracción utilizado en total.

Habiendo determinado el contenido en materia seca en la fracción soluble, conociendo la cantidad de material vegetal inicial y la cantidad de tampón de extracción, se puede determinar el grado de solubilización utilizando la siguiente ecuación.

Grado de solubilización = (((gramos de materia seca/ml de sobrenadante recuperados) x (ml de tampón de extracción usados)) x 100%)/gramo de material vegetal inicial

Ensayo de la actividad celulasa: mediante el procedimiento de CMC-DNS

El ensayo de la actividad celulasa (por ejemplo, actividad endo-1,4-p-glucanasa) se basa en la hidrólisis enzimática de los enlaces 1,4-p-D-glucosídicos en la carboximetilcelulosa (CM-celulosa 4 M, Megazyme Ltd), un p-1,4-glucano. La enzima se diluye en agua bidestilada (ddH²O) y 0,25 ml de disolución enzimática añadida a 1,75 ml de sustrato (CMC al 1,5% en tampón acetato de sodio 0,2 M, pH 5,0) a 50 °C. Después de 10 min de incubación, se agrega una disolución de 2 ml de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) al 1 % y la muestra se coloca en baño de agua hirviendo durante 5 min. Los productos de la reacción (oligosacáridos de p-1,4 glucano) se determinan colorimétricamente a 540 nm midiendo el aumento resultante en los grupos reductores que reaccionan con el DNS. La actividad enzimática se calcula a partir de la relación entre la concentración de grupos reductores, como equivalentes de glucosa, y la absorbancia usando un patrón de glucosa en el intervalo de 0,125-0,5 mg/ml. Una unidad de actividad celulasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 gmol de equivalentes de glucosa por minuto en las condiciones del ensayo.

Ensayo de xilanasa (actividad endo-fi-1,4-xilanasa)

Las muestras se diluyeron en tampón de ácido cítrico (0,1 M)-di-sodio-bifosfato (0,2 M), pH 5,0, para obtener aproximadamente DO⁵⁹⁰= 0,7 en este ensayo. Se preincubaron tres diluciones diferentes de la muestra durante 5 minutos a 40 °C. En el momento = 5 minutos, se añadió 1 comprimido de xilazima (sustrato de xilano teñido y reticulado, Megazyme, Bray, Irlanda) a la disolución de enzima en un volumen de reacción de 1 ml. En el momento = 15 minutos, la reacción se terminó añadiendo 10 ml de TRIS al 2%/NaOH, pH 12. Se prepararon blancos usando 1000 gl de tampón en lugar de la disolución de enzima. La mezcla de reacción se centrifugó (1500 x g, 10 minutos, 20 °C) y se midió la DO del sobrenadante a 590 nm. Una unidad de xilanasa (XU) se define como la actividad de xilanasa que aumenta la DO⁵⁹⁰a 0,025 por minuto.

Célula huésped

El organismo huésped puede ser un organismo procariota o eucariota. Dicha al menos una enzima se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de cualquier fuente. Dicha al menos una enzima puede ser una enzima recombinante, por ejemplo, una enzima que es heteróloga a la célula en la que se expresa. En otras realizaciones, la enzima puede ser nativa a la célula en la que se expresa. En una realización, dichas una o más enzimas no se pueden obtener (por ejemplo, no se obtienen) de una célula huésped de Trichoderma (por ejemplo, Trichoderma reesei).

Otras células huésped alternativas pueden ser hongos, levaduras o plantas, por ejemplo. La célula huésped puede ser cualquier célula de Bacillus que no sea B. subtilis. Preferiblemente, dicha célula huésped de Bacillus pertenece a una de las siguientes especies: Bacillus licheniformis; B. alcalophilus; B. amyloliquefaciens; B. circulans; B. clausii; B. coagulans; B. firmus; B. lautus; B. lentus; B. megaterium; B. pumilus o B. stearothermophilus. De forma adecuada, la célula huésped puede ser una célula huésped fúngica. De forma adecuada, la célula huésped puede ser cualquier célula huésped de Trichoderma, Meripilus, Humicola, Aspergillus, Fusarium o Chrysosporium. De manera adecuada, la célula huésped puede ser una cepa deficiente en proteasa o una cepa sin proteasa y/o una cepa deficiente en aamilasa o sin a-amilasa.

El término "heterólogo", como se usa en este documento, significa una secuencia derivada de una fuente o especie genética separada. Una secuencia heteróloga es una secuencia que no pertenece al huésped, una secuencia modificada, una secuencia de una cepa de célula huésped diferente o una secuencia homóloga procedente de una ubicación cromosómica diferente de la célula huésped. Como se usa en el presente documento, una secuencia "homóloga" es una secuencia que se encuentra en la misma fuente genética o especie, es decir, que se encuentra de forma natural en la especie relevante de célula huésped.

Secuencias reguladoras

En algunas aplicaciones, una enzima para usar en los métodos y/o usos descritos en este documento puede obtenerse uniendo operativamente una secuencia de nucleótidos que la codifica a una secuencia reguladora que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia de nucleótidos, tal como por la célula huésped seleccionada (tal como una célula de B. licheniformis).

Como se usa en el presente documento, la expresión "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite actuar de la manera prevista. Una secuencia reguladora "unida operativamente" a una secuencia codificadora se une de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Como se usa en este documento, la expresión "secuencias reguladoras" incluye promotores y potenciadores y otras señales de regulación de la expresión.

Como se usa en este documento, el término "promotor" se usa en el sentido normal de la técnica, por ejemplo, un sitio de unión de la ARN polimerasa.

La expresión mejorada de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que tiene las propiedades específicas definidas en el presente documento también se puede lograr mediante la selección de las regiones reguladoras, por ejemplo, regiones de promotores, de conductores de la secreción y terminadoras que no son regiones reguladoras para la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima en la naturaleza. De manera adecuada, la secuencia de nucleótidos se puede unir operativamente al menos a un promotor.

Promotor

La secuencia de promotor a usar de acuerdo con los presentes métodos puede ser heteróloga u homóloga a la secuencia que codifica cualquiera de las enzimas para su uso en los presentes métodos o usos descritos en el presente documento. La secuencia de promotor puede ser cualquier secuencia de promotor capaz de dirigir la expresión de una enzima en la célula huésped elegida.

De forma adecuada, la secuencia de promotor puede ser homóloga a una especie de Bacillus, por ejemplo B. licheniformis. Preferiblemente, la secuencia de promotor es homóloga a la célula huésped elegida.

En otra realización, el promotor puede ser homólogo a una especie de Geosmithia, por ejemplo, Geosmithia emersonii.

De forma adecuada, la secuencia de promotor puede ser homóloga a la célula huésped. "Homólogo a la célula huésped" significa que se origina dentro del organismo huésped, es decir, una secuencia de promotor que se encuentra en el organismo huésped en la naturaleza.

De forma adecuada, la secuencia de promotor puede seleccionarse del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica: un promotor de a-amilasa, un promotor de proteasa, un promotor de subtilisina, un promotor de proteasa específico del ácido glutámico y un promotor de levansacarasa.

De forma adecuada, la secuencia de promotor puede ser una secuencia de nucleótidos que codifique: el LAT (por ejemplo, el promotor de alfa-amilasa de B. licheniformis, también conocido como AmyL), AprL (por ejemplo, promotor de subtilisina Carlsberg), EndoGluC (por ejemplo, el promotor específico de ácido glutámico de B. licheniformis), AmyQ (por ejemplo, el promotor de alfa amilasa procedente del promotor de alfa-amilasa de B. amyloliquefaciens) y SacB (por ejemplo, el promotor de levansacarasa de B. subtilis).

Otros ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de una secuencia de ácido nucleico pueden incluir: el promotor del gen de proteasa alcalina de Bacillus lentus en (aprH); el promotor del gen de la alfa-amilasa de Bacillus subtilis (amyE); el promotor del gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM); el promotor del gen de la penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP); los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis; y/o el promotor del gen CryIIIA de Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis.

Péptido señal

La enzima producida por una célula huésped mediante la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima puede secretarse o puede estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o del vector utilizado. Puede usarse una secuencia señal para dirigir la secreción de las secuencias codificadoras a través de una membrana celular particular. Las secuencias señal pueden ser naturales o extrañas a la secuencia codificadora de las enzimas. Por ejemplo, la secuencia codificadora del péptido señal puede obtenerse de un gen de amilasa o proteasa de una especie de Bacillus, preferiblemente de Bacillus licheniformis.

Se pueden obtener secuencias codificadoras de péptidos señal adecuados a partir de uno o más de los siguientes genes: gen de a-amilasa maltogénico, gen de subtilisina, gen de beta-lactamasa, gen de proteasa neutra y/o gen prsA. En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal puede unirse operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las enzimas descritas en este documento. La enzima para usar de acuerdo con los presentes métodos puede expresarse en una célula huésped como se define en la presente como una proteína de fusión.

Vector de expresión

La expresión "vector de expresión" significa una construcción capaz de expresarse in vivo o in vitro. Preferiblemente, el vector de expresión se incorpora al genoma del organismo, tal como un huésped de B. licheniformis. El término "incorporado" incluye preferiblemente la incorporación estable en el genoma.

La secuencia de nucleótidos que codifica una enzima como se define en este documento puede estar presente en un vector, en el que la secuencia de nucleótidos está unida operativamente a secuencias reguladoras de modo que las secuencias reguladoras son capaces de proporcionar la expresión de la secuencia de nucleótidos por un organismo huésped adecuado (tal como B. licheniformis), es decir, el vector es un vector de expresión. Los vectores se pueden transformar en una célula huésped adecuada como se describió anteriormente para proporcionar la expresión de un polipéptido que tiene actividad celulasa como se define en este documento. La elección del vector, por ejemplo, plásmido, cósmido, virus o vector de fago, inserto genómico, a menudo dependerá de la célula huésped en la que se va a introducir. Los presentes métodos pueden incluir otras formas de vectores de expresión que cumplen funciones equivalentes y que son, o serán, conocidas en la técnica.

Una vez transformado en la célula huésped de elección, el vector puede replicarse y actuar independientemente del genoma de la célula huésped, o puede integrarse en el propio genoma. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, tal como un gen que confiere resistencia a los antibióticos, por ejemplo, resistencia a ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Como alternativa, la selección puede realizarse mediante cotransformación (como se describe en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO91/17243). Se pueden utilizar vectores in vitro, por ejemplo, para la producción de ARN o para transfectar o transformar una célula huésped. El vector puede comprender además una secuencia de nucleótidos que permite que el vector se replique en la célula huésped en cuestión. Los ejemplos de tales secuencias son los orígenes de la replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702.

Aislado

En un aspecto, la enzima es una enzima recuperada/aislada. Por tanto, una o más de las enzimas producidas pueden estar en forma aislada.

Purificado

En un aspecto, la enzima o enzimas pueden estar en forma purificada. Como se usa en el presente documento, el término "purificado" significa que la secuencia está en un estado relativamente puro, por ejemplo, al menos aproximadamente 51% puro, o al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90% puro, o al menos aproximadamente 95% puro o al menos aproximadamente 98% puro.

Métodos

La invención también proporciona un método para formar la composición de la invención. El método comprende poner en contacto el salvado de cereal con la composición de enzimas y, opcionalmente, otros componentes de la composición.

El método se lleva a cabo típicamente formando una suspensión líquida que contiene el salvado de cereal, la composición de enzimas y un líquido de suspensión, típicamente agua.

Por lo tanto, se prefiere que el método comprenda además la adición de agua para formar una suspensión acuosa del salvado de cereal y la composición de enzimas.

Se ha descubierto que el método de la invención funciona particularmente bien cuando la suspensión líquida (preferiblemente acuosa) que contiene el salvado de cereal y la composición de enzimas se calienta hasta una temperatura por encima de la temperatura ambiente.

Por tanto, en una realización preferida, el método según la invención comprende además calentar la suspensión acuosa.

Preferiblemente, la suspensión acuosa se calienta hasta una temperatura de 30 °C a 100 °C, tal como de 35 °C a 80 °C, tal como de 40 °C a 60 °C, tal como de 45 a 55 °C.

Preferiblemente, la suspensión acuosa se calienta durante un tiempo de 10 minutos a 48 horas, tal como de 30 minutos a 24 horas, tal como de 1 a 12 horas, tal como de 2 a 6 horas, tal como de 3 a 5 horas.

Antes de mezclar el salvado con la enzima, en algunas realizaciones de la presente invención, el método puede comprender además una etapa de i) fraccionar el grano de cereal para obtener el endospermo, el salvado y el germen; ii) separar y distribuir el endospermo, el salvado y el germen para permitir su tratamiento; y iii) moler el salvado.

Normalmente, el método de la presente invención hace que el salvado de cereal se solubilice al menos parcialmente. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la invención proporciona un método para solubilizar un salvado de cereal, comprendiendo dicho método tratar una suspensión líquida de dicho salvado de cereal con una enzima, en el que:

(a) dicho salvado de cereal comprende salvado de avena, salvado de centeno o una mezcla de los mismos; y

(b) dicha enzima comprende una mezcla de una enzima celulasa, una enzima glucanasa y una enzima xilanasa.

En algunas realizaciones, el grado de solubilización del salvado es superior al 20%, tal como superior al 25%, tal como superior al 30%, tal como superior al 35%, tal como superior al 35%, tal como superior al 40%, tal como superior al 50%, tal como en el intervalo de 40%-60%, tal como en el intervalo de 50%-60%. El grado de solubilización del salvado se expresa como se mide en un "Contenido de materia seca (%) en el ensayo de la fracción soluble" y se puede medir de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1 del documento WO2010/081870.

El método se puede realizar en una suspensión líquida con bajo contenido de almidón. En algunas realizaciones, menos del 50%, tal como menos del 40%, tal como menos del 30%, tal como menos del 20%, tal como menos del 10% en peso de la suspensión líquida puede ser almidón o componentes que contienen almidón.

En algunas realizaciones de la presente invención, el método comprende además una etapa de secado del salvado de cereal solubilizado obtenido.

En algunas realizaciones de la presente invención, el método comprende además una etapa de secado por pulverización del salvado de cereal solubilizado obtenido.

En algunas realizaciones de la presente invención, el método comprende además una etapa de liofilización del salvado de cereal solubilizado obtenido.

Aplicaciones y composiciones alimentarias

La presente invención se refiere además al uso de la composición de salvado obtenida según la presente invención en la preparación de un producto alimentario. La composición de salvado es útil como ingrediente alimentario, en particular, aunque no exclusivamente, para su incorporación en composiciones de harina para preparar masa y productos horneados, tales como pan, preparados a partir de masa.

La composición de la presente invención puede usarse como un producto alimentario o en su preparación. En este caso, la expresión "producto alimentario" se utiliza en un sentido amplio y abarca tanto los alimentos para seres humanos como los alimentos para animales (es decir, un pienso). En algunos aspectos, el alimento es para consumo humano. El alimento puede estar en forma de una disolución o como un sólido, dependiendo del uso y/o del modo de aplicación y/o del modo de administración.

En algunas realizaciones de la presente invención, la composición según la invención se agrega directamente en la producción del producto alimentario.

En algunas realizaciones de la presente invención, el salvado de cereal solubilizado obtenido en el método según la invención se añade directamente como una mezcla de material de salvado de cereal soluble e insoluble en la producción del producto alimentario.

Debe entenderse que los métodos de acuerdo con la presente invención pueden producir una fracción solubilizada aislada con solo material de salvado de cereal soluble, tal como cuando la fracción soluble se recolecta de una mezcla de material de salvado de cereal soluble e insoluble. En algunas realizaciones, dicho material de salvado de cereal soluble recolectado se usa en la producción de productos alimentarios.

En otras realizaciones alternativas, el salvado de cereal solubilizado que contiene material tanto soluble como insoluble puede usarse sin separación adicional o recolección directamente en la producción de productos alimentarios.

En algunas realizaciones de la presente invención, el producto alimentario se selecciona del grupo que consiste en pan, cereales para el desayuno, pasta, bizcochos, galletas, aperitivos y cerveza.

La composición de la presente invención también se puede utilizar como ingrediente alimentario. Como se usa en el presente documento, la expresión "ingrediente alimentario" incluye una formulación que se añade o se puede añadir a alimentos funcionales o productos alimentarios, por ejemplo, como un suplemento nutricional y/o un suplemento de fibra. La expresión ingrediente alimentario, como se usa en la presente, también se refiere a formulaciones que se pueden usar a niveles bajos en una amplia variedad de productos que requieren gelificación, texturización, estabilización, suspensión, formación de película y estructuración, retención de jugosidad y sensación en boca mejorada, sin agregar viscosidad. . El ingrediente alimentario puede estar en forma de una disolución o como un sólido, dependiendo del uso y/o del modo de aplicación y/o del modo de administración.

En una realización, la composición de la presente invención puede ser un complemento alimentario o añadirse a estos. En una realización, la composición de la presente invención puede ser un alimento funcional o puede añadirse a estos. Como se usa en este documento, la expresión "alimento funcional" significa un alimento que es capaz de proporcionar no solo un efecto nutricional y/o un buen sabor, sino que también es capaz de proporcionar un efecto beneficioso adicional al consumidor. Por consiguiente, los alimentos funcionales son alimentos normales que tienen componentes o ingredientes (como los descritos en el presente documento) incorporados que imparten al alimento una función específica, por ejemplo, un beneficio médico o fisiológico, distinto de un efecto puramente nutricional. Aunque no existe una definición legal de alimento funcional, la mayoría de las partes interesadas en esta área coinciden en que son alimentos comercializados por tener efectos específicos sobre la salud.

Algunos alimentos funcionales son nutracéuticos. En la presente, el término "nutracéutico" significa un alimento que es capaz de proporcionar no solo un efecto nutricional y/o un buen sabor, sino que también es capaz de proporcionar un efecto terapéutico (u otro efecto beneficioso) al consumidor. Los nutracéuticos cruzan las líneas divisorias tradicionales entre alimentos y medicamentos.

Por tanto, la invención proporciona además un producto alimentario que contiene una composición según la invención.

En ciertos aspectos, el alimento es un producto de panadería, tal como pan, bollería danesa, bizcochos o galletas.

La composición de salvado de la invención se puede incorporar a una harina. Por tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona una composición de harina que comprende:

(a) una harina; y

(b) una composición según la invención o una composición que puede obtenerse mediante un método según la invención.

La harina puede estar preparada a partir de cualquier grano adecuado para ser molido para formar una harina. Los granos típicos incluyen trigo, cebada, avena, centeno y triticale, arroz y maíz. La harina puede estar preparada a partir del grano de una especie o de una mezcla de especies. En una realización, la harina comprende, consiste esencialmente o consiste en harina de trigo. En una realización, la harina comprende, consiste esencialmente o consiste en harina de centeno.

En un aspecto, la harina en la composición de harina de la invención es una harina integral. En este aspecto, la composición de harina contiene salvado y germen endógeno a la harina, además del salvado de la composición de salvado de la invención.

En un aspecto, la harina en la composición de harina de la invención es una harina blanca (es decir, una harina de la que se ha eliminado el salvado). En este aspecto, el salvado presente en la composición de harina es únicamente de la composición de salvado de la invención.

En una realización, la harina comprende, consiste esencialmente o consiste en una mezcla de harina de trigo y harina de centeno. Típicamente, la harina comprende, consiste esencialmente o consiste en 20% a 40% en peso, tal como 25 a 35% en peso de harina de trigo, y 60 a 80% en peso, tal como 65 a 75% en peso de harina de centeno. Típicamente, la harina comprende, consiste esencialmente o consiste en 30% en peso de harina de trigo y 70% en peso de harina de centeno. Una mezcla de este tipo es conocida por los expertos en la técnica como la composición de harina para preparar "Mischbrot".

En una realización, la composición de salvado según la invención se añade a la harina. La composición se puede mezclar con la harina mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

En una realización, la composición de salvado de la invención está presente en la composición de harina de la invención en una cantidad del 0,1% al 20% en peso del peso total de la composición de harina. En una realización, la composición de salvado de la invención está presente en la composición de harina de la invención en una cantidad del 1% al 15% en peso del peso total de la composición de harina. En una realización, la composición de salvado de la invención está presente en la composición de harina de la invención en una cantidad del 2% al 10% en peso del peso total de la composición de harina. En una realización, la composición de salvado de la invención está presente en la composición de harina de la invención en una cantidad del 5% al 7% en peso del peso total de la composición de harina. La cantidad en peso de la composición de salvado se expresa como sólidos secos de salvado, lo que significa que la cantidad indicada de sólidos secos de salvado forma el porcentaje especificado del peso total de la composición de harina.

La composición de harina de la invención puede usarse para formar una composición de masa mezclándola con agua. Por consiguiente, la invención también proporciona una composición de masa que comprende: (a) la composición de harina según la invención; y (b) agua. En una realización, la composición de masa de la invención comprende además levadura.

La composición de masa de la invención se puede hornear para preparar productos horneados, tales como pan. Las condiciones de horneado son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Por consiguiente, la invención también proporciona un producto horneado que se puede obtener horneando la composición de masa de la invención. En una realización, dicho producto horneado comprende pan.

Se ha descubierto sorprendentemente de acuerdo con la presente invención que cuando la composición de salvado de la invención se agrega o se incorpora a una composición de harina (particularmente cuando la harina es harina de trigo y/o harina de centeno), el pan producido a partir de la harina tiene un mayor volumen de lo esperado.

Por consiguiente, la invención proporciona además el uso de una enzima para mejorar el volumen de pan que contiene un salvado de cereal, en el que:

(b) dicha enzima comprende una enzima celulasa, una enzima glucanasa y/o xilanasa o una mezcla de las mismas.

Sorprendentemente se ha descubierto de acuerdo con la presente invención que cuando la composición de salvado de la invención se agrega/incorpora a una composición de harina (en particular, la harina es harina de trigo y/o harina de centeno), el pan producido a partir de la harina es más blando de lo esperado.

Por consiguiente, la invención proporciona además el uso de una enzima para mejorar la molicie del pan que contiene un salvado de cereal, en el que:

(b) dicha enzima comprende una enzima celulasa, una enzima glucanasa y/o una enzima xilanasa o una mezcla de las mismas.

Además del pan y otros productos horneados preparados a partir de masa, la composición de salvado de la presente invención se puede usar en la preparación de productos alimentarios, tales como uno o más de: mermeladas, jaleas, gelatinas, productos lácteos (como leche o queso), productos cárnicos, productos avícolas, productos pesqueros y productos de panadería.

A modo de ejemplo, la composición de salvado de la presente invención se puede utilizar como ingrediente para refrescos, un zumo de frutas o una bebida que comprenda proteína de suero, tés saludables, bebidas de cacao, bebidas lácteas y bebidas con bacterias del ácido láctico, yogur y yogur para beber, queso, helados, helados de agua y postres, confitería, pasteles y mezclas para pasteles, aperitivos, cereales para el desayuno, fideos instantáneos y fideos en taza, sopas instantáneas y sopas en taza, alimentos y bebidas equilibrados, edulcorantes, barras de aperitivo con textura mejorada, barras de fibra, rellenos de frutas estables para hornear, glaseado para tartas, relleno de chocolate para repostería, relleno con sabor a tarta de queso, relleno de tarta con sabor a fruta, glaseado para pasteles y rosquillas, relleno para repostería estable al calor, cremas de relleno instantáneas para repostería, relleno para galletas, relleno para repostería listo para usar, relleno bajo en calorías, bebida nutricional para adultos, bebida acidificada de soja/zumo, bebida de chocolate aséptica/destilada, mezclas para barras, bebidas en polvo, leche de soja/normal y con chocolate fortalecida con calcio, bebida de cacao fortalecida con calcio.

La composición de salvado de la presente invención se puede utilizar además como ingrediente en productos alimentarios, tales como salsa de queso americano, agente antiaglomerante para queso rallado y desmenuzado, salsa para patatas fritas, queso cremoso, crema agria sin grasa de cobertura de nata mezclada en seco, nata láctea congelada/descongelada, cobertura de nata estable congelada/descongelada, queso cheddar natural bajo en grasa y ligero, yogur de estilo suizo bajo en grasa, postres helados aireados y barras novedosas, helado en envase rígido, helado en envase rígido flexible con respecto al precio y con etiquetado sencillo, helado bajo en grasa, postres blandos, salsa barbacoa, salsa de queso, aderezo de requesón, salsa Alfredo de mezcla seca, salsa de queso mixta, salsa de tomate mixta seca y otros.

La composición de salvado de la presente invención también se puede usar en bebidas, en particular bebidas alcohólicas, tales como la cerveza.

Por tanto, la invención también proporciona un kit de partes que comprende:

(c) instrucciones de uso en un método según la invención; y

(d) opcionalmente otros ingredientes para un producto alimentario.

Ejemplos

Materiales y métodos

Enzimas

La composición de enzimas utilizada en estos ejemplos es una mezcla de enzimas, que comprende:

(a) un componente de xilanasa bacteriana que se encuentra en el producto comercial disponible en DuPont Nutrition Biosciences ApS con el nombre comercial Powerbake 930 (mencionado en el documento WO 2010/081869); y (b) componentes de glucanasa y celulasa derivados de una fermentación de Trichoderma reesei como se menciona en el documento PCT/EP2015/080439, inédito en la fecha de presentación de la presente solicitud y disponible en DuPont Nutrition Biosciences ApS con el nombre comercial Laminex BG2.

Esta composición específica se denomina en estos ejemplos "TSE 1732".

El componente xilanasa (a) estaba presente en una cantidad de 5400 unidades de actividad xilanasa (XU) por g de composición de enzimas, midiéndose las unidades de acuerdo con el ensayo de actividad xilanasa mencionado anteriormente.

El componente glucanasa/celulasa (b) estaba presente en una cantidad de 2900 unidades de actividad celulasa por g de composición de enzimas, midiéndose las unidades de acuerdo con el ensayo de actividad CMC-DNS mencionado anteriormente.

Algunos de los ejemplos también usan una lipasa mencionada en estos como "PB4070", que es una glicolipasa disponible en DuPont Nutrition Biosciences ApS. Esta es una enzima de Fusarium heterosporum y se describe en el documento WO2005/087918.

Salvado

Salvado de centeno, lote 5011582, de Lantmannen Suecia

Salvado de avena, lote 2014-00075, de Lantmannen Suecia

Mediciones del volumen

Las mediciones del volumen del pan final se llevaron a cabo utilizando un medidor de volumen de desplazamiento de colza calibrado de National MFG, EE. UU. La determinación del volumen se basa en el método internacional AACC 10-05.01. Después de pesar el pan, el volumen específico del pan se expresa como volumen en centímetros cúbicos (cm3) por g de pan.

Mediciones de la dureza

La dureza de las rebanadas de pan se determinó a partir de un análisis del perfil de textura (“texture profile analysis”, TPA) utilizando un analizador de textura TAXTplus de Stable Microsystems.

Ejemplo 1 - Tratamiento con enzimas de muestras de salvado

La configuración experimental y los resultados del tratamiento con enzimas del salvado se muestran en la tabla 1. Se calentó una suspensión de salvado, agua y la composición de enzimas TSE 1732 en un recipiente calefactor a 50 °C y se mantuvo a esta temperatura durante 4 horas. Luego se llevó la temperatura hasta 95 °C durante 15 minutos para inactivar las enzimas y luego se enfrió hasta la temperatura ambiente. La composición de salvado tratada de la invención se conservó a -20 °C. La solubilización se determinó según el método de solubilización de salvado descrito anteriormente.

Tabla 1

Ejemplo 2 - Ensayos de horneado en harina de trigo al 100%

Las muestras generadas en la tabla 1 se analizaron en pan tostado convencional utilizando harina de trigo al 100%. La adición de agua se ajustó para obtener la misma viscosidad de la masa en cada ensayo. Todas las muestras de salvado se dosificaron al 6% (sólidos secos de salvado), lo que significa que el salvado de sólidos secos constituirá 6% de la composición total de la harina.

La configuración y los resultados se muestran en la tabla 2, en la que:

"Salvado de avena calentado" significa la muestra 2 de la tabla 1;

"Salvado de avena tratado con enzimas" significa la muestra 1 de la tabla 1;

"Salvado de centeno calentado" significa la muestra 4 de la tabla 1; y

"Salvado de centeno tratado con enzima" significa la muestra 3 de la tabla 1.

Tabla 2

En la Figura 1 se muestra una fotografía que muestra la miga de los panes finales.

De estos experimentos se puede concluir lo siguiente:

Salvado de avena:

El tratamiento con enzimas del salvado de avena según la invención tuvo un efecto positivo sobre el volumen específico del pan que incorpora el salvado de avena, en comparación con el pan que contiene salvado de avena sin tratar. El pan que incorporaba el salvado tratado con enzimas tenía casi el mismo volumen que el producido a partir de harina de trigo al 100%. Además, el pan formado a partir de salvado tratado con la composición de enzimas y lipasa tenía un volumen específico mayor.

Además, puede verse que el pan que contiene el salvado de avena tratado según la invención es más blando el día 1 y el día 7, en comparación con el pan que contiene salvado de avena sin tratar.

Salvado de centeno:

Puede verse que el pan que contiene el salvado de centeno tratado según la invención es más blando el día 1 y el día 7, en comparación con el pan que contiene salvado de centeno sin tratar.

Ejemplo 3 - Ensayos de horneado de harina de centeno al 70% y harina de trigo al 30%, panes abiertos

Las muestras generadas en la tabla 1 se analizaron en ensayos abiertos de horneado Mischbrot utilizando harina de centeno al 70% y harina de trigo al 30%. La adición de agua se ajustó para obtener la misma viscosidad de la masa en cada ensayo. Todas las muestras de salvado se dosificaron al 6% (sólidos secos de salvado), lo que significa que el salvado de sólidos secos constituirá el 6% de la harina total.

La configuración y los resultados se muestran en la tabla 3, en la que los términos significan lo mismo que en la tabla 2.

Tabla 3

La Figura 2 muestra las migas de los panes finales.

De estos experimentos se puede concluir lo siguiente:

Salvado de avena:

El tratamiento con enzimas del salvado de avena según la invención tuvo un efecto positivo sobre el volumen específico del pan que incorpora el salvado de avena, tanto en comparación con el pan que contiene salvado de avena sin tratar como en comparación con el pan elaborado a partir de harina a la que no se le había añadido salvado de avena. Además, el pan formado a partir de salvado tratado con la composición de enzimas y lipasa tenía un volumen específico mayor.

Además, se puede ver que el pan que contiene el salvado de avena tratado según la invención es más blando el día 7, en comparación con el pan que contiene salvado de avena sin tratar y en comparación con el pan elaborado a partir de harina al que no se le ha añadido salvado de avena.

Salvado de centeno:

El tratamiento con enzimas del salvado de centeno según la invención tuvo un efecto positivo sobre el volumen específico del pan que incorpora el salvado de centeno, tanto en comparación con el pan que contiene salvado de centeno sin tratar como en comparación con el pan elaborado a partir de harina a la que no se le había añadido salvado de centeno. También se puede ver que el pan que contiene el salvado de centeno tratado según la invención es más blando el día 7, en comparación con el pan que contiene salvado de centeno sin tratar.

Ejemplo 4 - Ensayo de horneado de harina de centeno al 70% y harina de trigo al 30%, horneada en cubetas

Las muestras generadas en la tabla 1 se analizaron en ensayos de horneado Mischbrot horneados en estaño utilizando harina de centeno al 70% y harina de trigo al 30%. La adición de agua se ajustó para obtener la misma viscosidad de la masa en cada ensayo. Todas las muestras de salvado se dosificaron al 6% (sólidos secos de salvado), lo que significa que el salvado de sólidos secos constituirá el 6% de la harina total.

La configuración y los resultados se muestran en la tabla 4, y los términos tienen el mismo significado que en la tabla 2.

Tabla 4

De estos experimentos se puede concluir que el tratamiento con enzimas del salvado de avena según la invención tuvo un efecto positivo sobre el volumen específico del pan que incorpora el salvado de avena, tanto en comparación con el pan que contiene salvado de avena sin tratar como en comparación con el pan elaborado a partir de harina que no contiene salvado de avena. Además, se puede ver que el pan que contiene el salvado de avena tratado según la invención es más blando que el pan elaborado a partir de salvado de avena que no contiene.

Ejemplo 5 - Ensayo de horneado de harina de centeno al 100%

Las muestras generadas en la tabla 1 se analizaron en ensayos de horneado utilizando harina de centeno al 100%. La adición de agua se ajustó para obtener la misma viscosidad de la masa en cada ensayo. Todas las muestras de salvado se dosificaron al 6% (sólidos secos de salvado), lo que significa que el salvado de sólidos secos constituirá el 6% de la harina total.

La configuración y los resultados se muestran en la tabla 5, y los términos tienen el mismo significado que en la tabla 2.

Tabla 5

De estos experimentos se puede concluir que el tratamiento con enzimas del salvado de avena según la invención tuvo un efecto positivo sobre el volumen específico de pan a partir de harina de centeno al 100% que incorpora el salvado de avena, tanto en comparación con el pan que contiene salvado de avena sin tratar como en comparación con el pan. producido a partir de harina de centeno al 100%. Además, puede verse que el pan que contiene el salvado de avena tratado según la invención es más blando, tanto en comparación con el pan que contiene salvado de avena sin tratar como en comparación con el pan elaborado a partir de harina de centeno al 100%.

Claims

REIVINDICACIONES

1 Una composición que comprende:

(a) un salvado de cereal que comprende salvado de avena, salvado de centeno o una mezcla de los mismos; y (b) una composición de enzimas que comprende una mezcla de una enzima celulasa, una enzima glucanasa y una enzima xilanasa.
2. - Una composición según la reivindicación 1, en la que la composición de enzimas provoca que el salvado de cereal se modifique al menos parcialmente.
3. - Una composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el salvado de cereal es salvado de avena o en la que el salvado de cereal es salvado de centeno.
4. - Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que:

(i) la enzima celulasa está presente en una cantidad de 0,1 mg a 100 mg por 100 g de salvado;

(ii) la enzima celulasa está presente en una cantidad de 30 a 3000 unidades de actividad celulasa por 100 g de salvado; (iii) la enzima xilanasa está presente en una cantidad de 0,006 mg a 0,6 mg por 100 g de salvado; y/o

(iv) la enzima xilanasa está presente en una cantidad de 50 a 5000 unidades de actividad xilanasa (XU) por 100 g de salvado.
5. - Una composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es una suspensión líquida que contiene el salvado de cereal y la composición de enzimas, preferiblemente que es una suspensión acuosa que contiene el salvado de cereal y la composición de enzimas.
6. - Una composición según la reivindicación 5, en la que la composición de enzimas provoca que el salvado de cereal se solubilice al menos parcialmente.
7. - Una composición obtenida u que puede obtenerse mediante el secado de la composición según la reivindicación 5 o la reivindicación 6.
8. - Una composición según cualquier reivindicación anterior, que comprende además una enzima lipasa.
9. - Un método para preparar una composición según cualquier reivindicación anterior, que comprende poner en contacto el salvado de cereal con la enzima y, opcionalmente, otros componentes de la composición, preferiblemente que comprende además la adición de agua para formar una suspensión acuosa del salvado de cereal y la composición de enzimas.
10. - Un método según la reivindicación 9, que comprende además calentar la suspensión acuosa, preferiblemente en el que la suspensión acuosa se calienta hasta una temperatura de 30 °C a 100 °C y/o en el que la suspensión acuosa se calienta durante un tiempo de 10 minutos a 48 horas.
11. - Una composición de harina que comprende:

(a) una harina; y

(b) una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
12. - Una composición de harina según la reivindicación 11, en la que la harina comprende harina de trigo, o en la que la harina comprende harina de centeno o en la que la harina comprende una mezcla de harina de trigo y harina de centeno.
13. - Un producto alimentario que contiene una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una composición de harina según la reivindicación 11 o la reivindicación 12.
14. - Una composición de masa que comprende:

(a) la composición de harina según la reivindicación 11 o la reivindicación 12; y

(b) agua.
15. - Un producto horneado que se puede obtener horneando la composición de masa según la reivindicación 14.
16. - Un producto horneado según la reivindicación 15, comprendiendo dicho producto horneado pan.
17.- Un método para solubilizar un salvado de cereal, comprendiendo dicho método tratar una suspensión líquida de dicho salvado de cereal con una enzima, en el que:

(a) dicho salvado de cereal comprende salvado de avena, salvado de centeno o una mezcla de los mismos; y (b) dicha enzima comprende una mezcla de una enzima celulasa, una enzima glucanasa y una enzima xilanasa.
18.- Un método según la reivindicación 17, en el que menos del 30% en peso de la suspensión líquida es almidón o componentes que contienen almidón, o en el que menos del 20% en peso de la suspensión líquida es almidón o componentes que contienen almidón.
19.- El salvado de cereal solubilizado obtenido o que puede obtenerse según el método de la reivindicación 17 o la reivindicación 18.
20.- Un ingrediente alimentario obtenido o que puede obtenerse mediante el secado del salvado de cereal solubilizado de la reivindicación 19.
21.- El uso de un salvado de cereal solubilizado según la reivindicación 19 en la preparación de un producto alimentario, preferiblemente en el que el producto alimentario es una masa o un producto horneado preparado a partir de masa.
22.- Un kit de partes que comprende:

(a) un salvado de cereal que comprende salvado de avena, salvado de centeno o una mezcla de los mismos;

(b) una enzima que comprende una mezcla de una enzima celulasa, una enzima glucanasa y xilanasa;

(c) instrucciones de uso en un método según la reivindicación 15; y

(d) opcionalmente otros ingredientes para un producto alimentario.
23.- El uso de una enzima para mejorar el volumen de un pan que contiene un salvado de cereal, en el que:

(a) dicho salvado de cereal comprende salvado de avena, salvado de centeno o una mezcla de los mismos; y (b) dicha enzima comprende una enzima celulasa, una glucanasa y/o una enzima xilanasa o una mezcla de las mismas.
24.- El uso de una enzima para mejorar la molicie de un pan que contiene un salvado de cereal, en el que:

(a) dicho salvado de cereal comprende salvado de avena, salvado de centeno o una mezcla de los mismos; y (b) dicha enzima comprende una enzima celulasa, una enzima glucanasa y/o una enzima xilanasa o una mezcla de las mismas.