MXPA04006323A

MXPA04006323A - Metodo para determinacion cuantitativa de hemoglobina en sangre pura no hemolizada y no diluida.

Info

Publication number: MXPA04006323A
Application number: MXPA04006323A
Authority: MX
Inventors: Johnny Svensson
Original assignee: Hemocue Ab
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2005-03-31
Also published as: NO20033690L; NO20033690D0; EP1698883B1; RU2004123207A; CA2468513A1; EP1456649B1; DE60212444T2; PL369207A1; PL211569B1; DE60239019D1; SI1698883T1; CN1610827A; DK1698883T3; DK1456649T3; KR100953472B1; ATE330223T1; AU2002359193B2; JP4532905B2; PT1456649E; BR0207671A

Abstract

La invencion involucra un metodo para la determinacion cuantitativa de hemoglobina en sangre pura sin diluir y sin hemolizar que comprende los pasos de: proveer una cubeta capilar desechable que tiene una longitud de trayectoria optica de menos de 1mm; llenar dicha cubeta con una muestra de sangre pura sin alterar; llevar a cabo una primera medicion de absorcion en una longitud de onda en la escala de 490-520 nm directamente sobre la muestra en la cubeta, y llevar adicionalmente a cabo una segunda medicion de absorcion, y procesar los resultados de la primera y segunda mediciones de absorcion para determinar la concentracion de hemoglobina en la muestra, en donde el paso de procesamiento comprende compensar la dispersion en la muestra, y dicha compensacion depende del resultado de la segunda medicion de absorcion; tambien se describe un sistema para implementar el metodo.

Description

METODO PARA DETERMINACION CUANTITATIVA DE HEMOGLOBINA EN SANGRE PURA NO HEMOLIZADA Y NO DILUIDA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención involucra un método de análisis y un sistema para llevar a cabo este análisis. Específicamente la invención involucra un método para determinar la hemoglobina en sangre pura sin alterar y un sistema que puede ser utilizado para esta determinación.

TECNICA ANTECEDENTE Se conocía previamente de la patente de E.U.A. No. 4,088,448 una cubeta desechable para muestrear un fluido, mezclar la muestra con un agente reactivo y hacer directamente análisis ópticos de la muestra mezclada con el agente reactivo. Esta cubeta conocida tiene diversas ventajas, ya que, en ausencia, simplifica el procedimiento de muestreo, reduce el número de utensilios y mejora de manera considerable la precisión del análisis al independizar el procedimiento de análisis de la técnica operativa del operador que lleva a cabo el análisis. Se describe en la patente de E.U.A. No. 5 674' 457 una construcción de cubeta con base en el mismo principio y con mejores características de flujo. Una cubeta desechable desarrollada de conformidad con estas patentes actualmente se utiliza ampliamente para la medición de hemoglobina (determinación de Hb) de sangre pura no diluida. Para este fin, la cavidad de cubeta ha sido pre-tratada con un agente reactivo, para que cuando se coloque una muestra de sangre en la cubeta, se desintegren las paredes de los glóbulos rojos y se inicie una reacción química. El resultado de la reacción permite la determinación de Hb mediante la medición de absorción directamente a través de las paredes transparentes de la cubeta, la cual, en la zona de medición, que también se llama la ventana óptica, cuenta con una distancia predeterminada y definida de manera precisa entre las superficies internas de las paredes planas opuestas. El método de medición se basa en un método de azidmethemoglobina modificado de conformidad con Vanzetti, G., Am.J. Lab.& Clin. Med. 67, 1 16 (1966). Las mediciones espectrofotométricas se llevan a cabo a 570 y 880 nm. Este método de medición cuantitativa con base en química en seco ha logrado un éxito considerable como se puede observar por ejemplo en el artículo de von Schenck et al en Clinical Chemistry, vol 321 , No 3, 1986, ya que el método genera resultados iguales e incluso superiores en comparación con los resultados obtenidos con métodos en húmedo estandarizados para la determinación de Hb. El agente reactivo utilizado comprende deoxicolato de sodio, el cual hemoliza los glóbulos rojos, la azida de sodio y el nitrito de sodio, el cual convierte la hemoglobina a azidmethemoglobina. Debido a las propiedades higroscópicas de los agentes activos utilizados, la vida de anaquel está limitada y se requiere el almacenamiento de las cubetas en paquetes sellados Incluyendo un agente secador. Pero aún más problemático es el hecho que, en climas con alta humedad, la cubeta tiene que utilizarse a los pocos minutos después de la remoción del paquete, ya que de otro modo los agentes reactivos serán destruidos y la medición será imprecisa y por ende inútil. Sin embargo, los problemas que se originan de las propiedades higroscópicas de los agentes reactivos utilizados pueden ser eliminados, ya que se ha descubierto que estos agentes reactivos no deben ser utilizados como se describe en la solicitud de patente co-pendiente PCT SE01/01442 de conformidad con la cual la primera medición de absorción se lleva a cabo en una escala de longitud de onda de 490-520 nm directamente sobre la muestra en la microcubeta. De conformidad con la invención descrita en esta solicitud de patente, es necesario que la sangre sea hemolizada antes de que se lleve a cabo la medición. Así, la cavidad de la cubeta debe incluir un agente de hemolización para desintegrar los glóbulos rojos y liberar la hemoglobina contenida en estas células. La necesidad de utilizar un agente de hemolización cuando se llevan a cabo mediciones de absorbancia fotométricas de hemoglobina en una muestra de sangre también se describen en, por ejemplo, la patente de E.U.A. 5 064 282 (Artel). Se conocen métodos cuantitativos para la determinación óptica de hemoglobina en sangre pura sin utilizar un agente de hemolización, pero estos métodos tiene en común que todos son complicados comparativamente. Esto depende sobre todo de la no-homogeneidad de la sangre debido a la alta concentración de glóbulos rojos, consecuencia de lo cual es que la luz sea dispersada al interactuar con esas partículas de muestra de sangre no homogénea. En consecuencia, la luz no se transmite directamente sobre una muestra sino que más bien es desviada sobre una escala de ángulos de dispersión. Otro factor que ocasiona problemas es el hecho que la sangre puede contener hasta cinco especies diferentes de hemoglobina. Publicaciones de patente que tratan estos problemas son por ejemplo, en ausencia, la patente de E.U.A. 6 262 798 (Shepherd) y WO 01/53806 (Radiometer). De conformidad con la descripción descrita en la patente de E.U.A. 6 282 798 se necesita una pluralidad de longitudes de onda para lograr una medición correcta. El hecho de que se necesiten muchas longitudes de onda complica de manera comparativa el espectrofotómetro. Se seleccionan las longitudes de onda por su capacidad de distinguir las especies de hemoglobina con una dispersión mínima y una absorbancia máxima. La patente también describe el uso de un detector grande el cual reduce el problema de la dispersión más allá de la escala de detección. WO 01/53806 describe un aparato que es especialmente aplicable para mediciones ópticas en sangre pura. Este aparato comprende un filtro de absorción o un filtro de interferencia, el cual provee correcciones para variaciones en la sensibilidad del detector y en la longitud de trayectoria óptica efectiva según se observa al variar el nivel de dispersión. El aparato utiliza un detector grande para detectar luz dispersa y transmitida a través del filtro de absorción o el filtro de interferencia. Por ello, el descubrimiento de conformidad con la presente invención fue más bien inesperado en el sentido de que una determinación precisa de la cantidad total de hemoglobina en sangre pura puede realizarse no sólo sin utilizar un agente de hemolización sino también sin utilizar una pluralidad de longitudes de onda como se describe en la patente de E.U.A. 6 262 798 o un filtro de absorción o interferencia especial que provea correcciones para variaciones en la sensibilidad del detector y en la longitud de trayectoria óptica efectivas según se observa con un nivel variado de dispersión según se describe en WO 01/53806.

Objetos de la invención Un objeto de la presente invención es proveer un método rápido y cuantitativo para la determinación de hemoglobina en sangre pura sin alterar. Un segundo objeto es proveer un método para la terminación de hemoglobina en sangre pura sin alterar, que puede ser llevado a cabo en una microcubeta desechable. Un tercer objeto es proveer una cubeta con entrada capilar y sin agentes reactivos activos y agente de hemolización para determinar la hemoglobina en sangre pura sin alterar. Un cuarto objeto es proveer un método para procesar resultados de mediciones de absorción para determinar la hemoglobina en sangre pura sin alterar. Un quinto objeto es proveer un sistema para implementar los métodos para determinar la hemoglobina en sangre pura sin alterar. Serán evidentes otros objetos a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION De conformidad con un aspecto de la presente invención un método para lograr dicha determinación de hemoglobina comprende los pasos de proveer una cubeta capilar desechable que tiene una longitud de trayectoria óptica de menos de 1 mm; llenar dicha cubeta con una muestra de sangre pura sin alterar; llevar a cabo una primera medición de absorción a una longitud de onda en la escala de 490-520 directamente sobre la muestra en la cubeta, además llevar a cabo una segunda medición de absorción, y presentar los resultados de la primera y segunda medidas de absorción para determinar la concentración de hemoglobina en la muestra, en donde el paso de procesamiento comprende compensar la dispersión en la muestra, y dicha compensación depende del resultado de la segunda medición de absorción. De conformidad con otro aspecto de la presente invención se provee un método para determinar una concentración de hemoglobina en una muestra de sangre pura sin diluir y sin hemolizar a partir de un resultado de una primera medición de absorción sobre la muestra llevada a cabo en una longitud de onda en la escala de 490-520 nm y un resultado de una segunda medición de absorción sobre la muestra. El método comprende: procesar los resultados de la primera y segunda medición de absorción para determinar la concentración de hemoglobina en la muestra, en donde el paso de procesar comprende procesar la dispersión en la muestra, y la compensación depende del resultado de la segunda medición de absorción. De conformidad con un aspecto adicional de la presente invención un sistema que provee dicha determinación de hemoglobina comprende: medios para emitir luz en una primera longitud de onda en una primera escala de 490-520 nm y una segunda longitud de onda en una segunda escala, un soporte de cubeta dispuesto para recibir una cubeta capilar, que tienen una longitud de trayectoria óptica de menos de 1 mm y que tiene una muestra de sangre pura sin alterar, un detector para detectar luz transmitida a través de la muestra en una primera medición de absorción de luz en dicha primera escala y en una segunda medición de absorción para luz en dicha segunda escala, y una unidad de procesamiento para procesar resultados de la primera y segunda medición de absorción para determinar la concentración de hemoglobina en al muestra, en donde el procesamiento comprende compensar la dispersión en la muestra, y dicha compensación depende del resultado de la segunda medición de absorción. Así, se ha descubierto inesperadamente que se pueden llevar fácilmente a cabo determinaciones cuantitativas de hemoglobina sin los agentes activos químicos azida de sodio y nitrito de sodio únicamente, sino también sin un agente de hemolización directamente sobre la sangre pura sin alterar; es decir, sin diluir y sin hemolizar. Ya que la sangre pura sin alterar contiene glóbulos, existe una dispersión sustancial de la luz en la muestra. Así, antes se esperaba que una determinación cuantitativa de hemoglobina en sangre pura sin diluir y sin hemolizar requeriría la detección y análisis de la luz dispersa. De conformidad con la invención, se puede llevar a cabo la determinación de hemoglobina mediante dos mediciones de absorción sin la necesidad de saber cuantitativamente los coeficientes de dispersión de los contenidos de la sangre o reducir físicamente los efectos medidos de la luz dispersa. Se ha descubierto inesperadamente que al compensar el nivel de absorción en la muestra en la segunda medición de absorción, se puede contabilizar el efecto de dispersión. Así como de conformidad con la invención, la determinación de hemoglobina es simple, y requiere únicamente dos mediciones de absorción. De conformidad con la presente invención además se ha descubierto que se pueden eliminar los agentes reactivos higroscópicos. Adicionalmente se ha encontrado que se puede reducir el tiempo para obtener la determinación analítica. Ya que los análisis se llevan a cabo en grandes cantidades, por ejemplo hospitales y bancos de sangre, el aspecto del tiempo es importante. Dentro del contexto de esta aplicación el término "medición de absorción" debe ser interpretado como una medición relacionada con la absorción en una muestra. En una medición de absorción, la intensidad de luz detectada después de interactuar con una muestra se compara con la intensidad de luz irradiada sobre la muestra. La luz detectada corresponde a la transmitencia a través de la muestra. Se considera que la luz que no alcanza el detector fue absorbida. Así, en el resultado de las mediciones se puede utilizar la transmitencia en vez de la absorción. Ya que la transmitencia es lo inverso de la absorción, detectar la transmitencia seguiría siendo una medición de absorción. Sin embargo, la absorción medida no corresponde únicamente a la luz que ha sido absorbida realmente en la muestra, ya que algo de la luz ha sido dispersada en la muestra por lo que no alcanza el detector. Adicionalmente, se debe interpretar el término "determinación" como la medición que no necesariamente obtiene un valor exacto y absoluto de hemoglobina en la sangre. Así, la concentración de hemoglobina se "determina" dentro de márgenes razonables de error para que el resultado no ofrezca un orden meramente de magnitud de la concentración, aunque no necesariamente de un valor absoluto.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Se describirá ahora la invención a modo ejemplo a mayor detalle con referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales: la figura 1 es un diagrama de flujo y de un método de conformidad con la invención, la figura 2 es un diagrama esquemático de la absorbancia de hemoglobina, la figura 3 es una vista esquemática de un sistema de conformidad con la invención, la figura 4A es un diagrama que ilustra una evaluación preliminar del método inventivo en comparación con microcubetas HemoCue actualizadas actualmente. La figura 4B es un diagrama que ilustra una evaluación preliminar del método inventivo en comparación con un método de referencia Internacional.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Ahora en referencia a la figura 1 , se describirá un método para la determinación de hemoglobina de conformidad con la invención. En primer lugar, se llena una cubeta capilar desechable con una muestra de sangre pura sin alterar, paso 1. Así, se obtiene una muestra que va a ser analizada. Luego se lleva a cabo una primera medición de absorción sobre la muestra a una longitud de onda en escala de 490 - 520 nm, paso 2. Adicionalmente se lleva a cabo una segunda medición de absorción sobre la muestra, paso 3. Se lleva a cabo la segunda medición de absorción a una longitud de onda en la escala de 650 - 1200 nm. Se utiliza esta segunda medición de absorción para compensar la dispersión de la luz de la muestra, como se describirá en mayor detalle a continuación. Finalmente se procesan los resultados de las mediciones, paso 4, usando un algoritmo predeterminado para establecer la concentración de hemoglobina en la muestra. La microcubeta desechable utilizada de conformidad con la presente invención puede ser del tipo descrita en la patente de E.U.A. 4 088 448 o preferiblemente en la patente de los E.U.A. 5 674 457, las cuales son incorporadas a la presente mediante referencia. Se puede definir la cubeta como un elemento de cuerpo unitario que incluye por lo menos una cavidad con una ventana óptima (zona de medición) en donde se colocan dos superficies planas o curvas de cara a la cavidad a una distancia predeterminada una de otra y que ha si definen una longitud de trayectoria óptima predeterminada. Esta distancia entre las superficies que definen la zona de medición es un parámetro crítico para promover la longitud de trayectoria óptica apropiada para la medición de hemoglobina. La longitud de trayectoria óptica debe ser menor a 1 mm para asegurar que la intensidad de luz transmitida a través de una muestra en la cubeta sea suficiente para permitir la determinación de hemoglobina en la muestra. En una modalidad preferida, esta distancia es menor a 0.2 mm, y más preferiblemente entre 0.05 y 0.2 mm. La distancia entre las superficies interna y el resto de la cavidad preferiblemente está en el orden de 0.1-2 mm, lo cual es efectivo para permitir a la muestra entrar a la cavidad mediante fuerza capilar a través de la entrada de cavidad, la cual se comunica con el exterior del elemento de cuerpo. Adicionalmente, la cavidad tiene un volumen fijo predeterminado de menos de alrededor de 25 µ?. No son necesarios aditivos activos, como agentes reactivos o agentes de hemolización para la determinación de conformidad con el método inventivo. Las cubetas de conformidad con la presente invención pueden ser hechas en cualquier material adecuado, que permita la formación de los niveles de tolerancia justos necesarios. Preferiblemente la cubeta se fabrica mediante moldeo por inyección de un material polimérico transparente. Para superar los problemas relacionados con el llenado capilar de la cubeta puede ser necesario pretratar las superficies internas de la cubeta para impartir un carácter hidrófilo a estas superficies. Esto se puede lograr al revestir las superficies con un detergente adecuado como Brij 35. Otra posibilidad es seleccionar un material hidrófilo para la fabricación de la cubeta. Una característica del método inventivo es que la determinación de absorción debe ser llevada a cabo a una longitud de onda en una escala de 490 520 nm, más preferiblemente en la escala de 500-510 nm, y más preferentemente a 506 nm. La medición de absorción compensatoria secundaria preferiblemente se lleva a cabo en una longitud de onda en la escala de 650 - 1200 nm, más preferiblemente en la escala de 850 - 910 nm, y más preferentemente en la escala de 860 - 900 nm. Las mediciones de absorción se llevan a cabo directamente en la sangre pura en la muestra; es decir, que la sangre no haya sido alterada (sin diluir y sin hemolizar). En la escala de longitud de onda de 490 - 520 nm, la absorción de las cinco formas diferentes de hemoglobina, a saber oxi-, deoxi-, carboxi-, met- y sulfohemoglobina, son similares e igualmente importantes. Así, la absorción en esta escala de longitud de onda dependerá únicamente de la distribución entre diferentes formas de hemoglobina en la sangre. Especialmente, a 506 nm, la diferencia entre las absorbancias de oxi- y de oxihemoglobina está cercana a cero. Ya que estas formas de hemoglobina son predominantes en sangre normal, se podría utilizar convenientemente la absorción de oxi- y deoxihemoglobina para determinar un coeficiente de absorción para relacionar una absorción medida a la concentración de hemoglobina a 506 nm. En consecuencia, se hacen algunas hipótesis respecto a los contenidos de diferentes formas de hemoglobina en la muestra de sangre. Así, la determinación de hemoglobina no será tan precisa o se tendrá que modificar el procesamiento de los resultados de medición si se hace una medición sobre una muestra de sangre que tenga una distribución muy diferente de las formas de hemoglobina. Adicionalmente, las mediciones determinarán únicamente la concentración total de hemoglobina y no las concentraciones de las tomas específicas de hemoglobina. Se lleva a cabo una segunda medición de absorción a una longitud de onda, en donde la absorción de luz en la sangre es sustancíaímente menor. Dicha medición de absorción podría ser llevada a cabo adecuadamente en una longitud de onda en la escala de 650 - 1200 nm. Se considera entonces que las diferencias entre las mediciones de absorción se deben a la absorción de hemoglobina.

Sin embargo, la dispersión de la luz varía con la concentración de hemoglobina en la muestra, pero la dispersión de luz no depende únicamente de la concentración de hemoglobina. La dispersión de luz se debe a la interacción de la luz con partículas en la sangre, como por ejemplo los glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas, lípidos y otras macromoléculas. De conformidad con la invención, se ha descubierto inesperadamente que el efecto de dispersión puede estar relacionado con el resultado medido en la segunda medición de absorción, como se explicará con referencia al diagrama esquemático en la figura 2. En la figura 2, la línea sólida ilustra de manera esquemática la absorción medida en una primer muestra que tiene una alta concentración de hemoglobina. La absorción incluye tanto la absorción verdadera como la luz dispersa para que no alcance un detector. La línea de rayas en la figura 2 ilustra de manera esquemática la absorción medida en una segunda muestra que tiene una menor concentración de hemoglobina. Debe observarse que el diagrama esquemático en la figura 2 enfatiza únicamente las características principales de absorción de muestras de sangre pura, y no ¡lustran la absorción de muestras reales. Como puede observarse en la figura 2, la diferencia en absorción para la primera muestra entre una primera longitud de onda a 506 nm y una segunda longitud de onda a 880 nm es sustancialmente igual a la diferencia en absorción correspondiente para la segunda muestra. Por ello, si se determina directamente la concentración de hemoglobina a partir de las diferencies en las absorciones medidas, podría retornar un resultado erróneo, por lo menos para una de las muestras. Así se necesitará una compensación para dispersión de la luz, y de conformidad con la invención se ha descubierto que una compensación del nivel de absorción representará la dispersión y permitirá una determinación más simple de hemoglobina. Se ha determinado empíricamente que cuando se utiliza una compensación que sea proporcional al nivel de absorción, se puede obtener un valor correcto de la concentración de hemoglobina. De conformidad con lo anterior, se deben procesar los resultados de las mediciones de absorción para determinar la concentración de hemoglobina en la muestra. Este procesamiento puede llevarse a cabo mediante un algoritmo predeterminado. Este algoritmo calcula la concentración de hemoglobina de conformidad con el esquema descrito anteriormente. La compensación de la dispersión de luz preferiblemente depende del resultado de la segunda medición de absorción. Se podría determinar una función de compensación al llevar a cabo mediciones de absorción en un conjunto de muestras de sangre que tengan concentraciones conocidas de hemoglobina. Estas mediciones de absorción se llevan a cabo en una disposición de medición que va a ser utilizada. Posteriormente, se compara la compensación necesaria para la dispersión de la luz para obtener resultados correctos con los valores de la segunda medición de absorción. De esta manera, se podría encontrar una función de la segunda medición de absorción que generaría una compensación para que las concentraciones determinadas de hemoglobina cayeran dentro de un margen de error aceptable. En un modelo simplificado, la compensación depende linealmente del resultado de la segunda medición de absorción, por lo menos en una escala del resultado de la segunda medición de absorción. Esta escala del resultado de la segunda medición de absorción puede generar valores típicos de la segunda medición de absorción que se obtienen con la disposición de medición específica. El procesamiento puede determinar la concentración de hemoglobina en la muestra al calcular la siguiente fórmula: [Tot Hb] = (AbSrAbs2)-k+F(Abs2) en donde [Tot Hb] es la concentración total de hemoglobina en la muestra, Absi es la absorbancia medida de la primera medición de absorción, Abs2 es la absorbancia medida de la segunda medición de absorción, k es un coeficiente de calibración, el cual depende de la disposición de medición, y F(Abs?) es una función que depende de la absorbancia medida de la segunda medición de absorción. El coeficiente de calibración k puede ser específico para cada instrumento utilizado para determinar la hemoglobina. La función de compensación F(Abs2) puede tener una parte constante, que también es una calibración para cada instrumento, y una parte variable, la cual depende del resultado de la segunda medición de absorción y se obtiene como se describe anteriormente. En este caso, la parte variable puede ser 0 para un resultado de la segunda medición de absorción que está en el centro de la escala de los resultados de la segunda medición de absorción. Ahora en referencia a la figura 3, se describirá un sistema que implementa el método descrito anteriormente. El sistema comprende un medio 10 para emitir luz en una primera longitud de onda en una primera escala de 490 - 520 nm y en una segunda longitud de onda en una segunda escala de 650-1200 nm. Este medio 10 para emitir luz puede ser implementado mediante una combinación de una fuente de luz que emite a diferentes longitudes de onda o en escalas de longitud de onda amplia junto con filtros. Así, la fuente de luz está dispuesta para emitir luz tanto en la primer longitud de onda como en la segunda longitud de onda. Utilizando el filtro se podría controlar de manera selectiva la longitud de onda emitida para que estuviera dentro de una de estas escalas. Alternativamente, se puede utilizar una primera y una segunda fuente de luz para emitir la primera y la segunda longitudes de onda, respectivamente. Se pueden utilizar diodos fotoemisores como fuentes de luz. Posteriormente, al apagar y encender las dos fuentes de luz, se puede controlar selectivamente el medio 10 para emitir luz para que emita luz en la primera o en la segunda longitud de onda. Preferiblemente, la primera longitud de onda emitida por el medio 10 para emitir luz está en la escala de 500-510 nm, más preferiblemente 506 nm. Adicionalmente, la segunda longitud de onda emitida por el medio 10 para emitir luz preferiblemente está en la escala de 850-910 nm, y más preferiblemente en la escala de 860-900 nm. El sistema además comprende un soporte de cubeta 12 dispuesto para recibir una cubeta capilar, que tiene una longitud de trayectoria óptica de menos de 1 mm y que sostiene una muestra de sangre pura sin alterar. Cuando se coloca una cubeta en el soporte 12, la ventana óptica se colocará correctamente para que sea irradiada con la luz de la fuente de luz. Preferiblemente, el soporte de cubeta está dispuesto para recibir una cubeta, que tiene una longitud de trayectoria óptica de menos de 0.2 mm, y más preferiblemente en la escala de 0.05-0.2 mm. La luz transmitida a través de la muestra será detectada por un detector 14 para que se obtenga una primera medición de absorción para luz en la primera escala y se obtenga una segunda medición de absorción para la luz en la segunda escala. El sistema además comprende una unidad de procesamiento 16 para procesar los resultados de la primera y segunda mediciones de absorción para determinar la concentración de hemoglobina en la muestra de conformidad con el algoritmo descrito anteriormente. El sistema puede ser implementado adecuadamente en un fotómetro que comprende el medio 10 para emitir luz, el soporte de cubeta 12 y el detector 14. Se pueden obtener fotómetros adecuados para llevar a cabo estas mediciones utilizando fotómetros modificados con filtros de longitud de onda adecuados y diodos fotoemisores. De conformidad con una modalidad preferida de la invención un fotómetro mide la absorbancia en las dos longitudes de onda y un microprocesador integrado calcula, de conformidad con un algoritmo programado, la concentración total de hemoglobina en la sangre. Así, no son necesarios un filtro de absorción o interferencia especial que provea corrección para las variaciones en la sensibilidad del detector y en la longitud de trayectoria óptica efectiva como se describe en WO 01/53806. En el caso anterior, la unidad de procesamiento 16 está inserta en el fotómetro. Sin embargo, la unidad de procesamiento 16 también puede estar conectada al fotómetro, y ser implementada así fuera del fotómetro. Por ejemplo, se puede utilizar una computadora conectada al fotómetro. El detector 14 puede estar dispuesto para detectar esencialmente únicamente luz transmitida directamente, ya que la luz dispersa no necesita ser detectada. Esto implica que el detector 14 detecta luz que está esencialmente dentro del diámetro del as de luz irradiado sobre la muestra y transmitida directamente a través de la muestra. Por supuesto, algo de luz se puede dispersar, aunque sigue estando dentro de este diámetro. De conformidad con una modalidad preferida, el diámetro de un área de detección del detector 14 puede ser típicamente de aproximadamente 2 mm. El detector 14 preferiblemente está dispuesto más cerca a los 10 mm al soporte de muestra. Esto implica que la luz que ha sido dispersada a ángulos más pequeños es detectada. El siguiente ejemplo no restrictivo ¡lustra el método inventivo. Se descubrió que el periodo para analizar la sangre fue de alrededor de 30 segundos más corto para el método inventivo en comparación con el método para determinación de la hemoglobina en las microcubetas HemoCue actualmente utilizadas. Esto permite una reducción más clara del tiempo total de determinación de hemoglobina que puede ser conveniente en hospitales muy ocupados y en otras situaciones donde se llevan a cabo determinaciones. Otra ventaja es que no existe la necesidad de que la cubeta contenga agentes reactivos activos o agentes de hemolización. Así, el almacenamiento de las cubetas es insensible a la temperatura y humedad en el ambiente de almacenamiento, lo cual simplifica mucho más el manejo de las cubetas antes de su uso. Se describe en la figura 4a una evaluación preliminar del nuevo método en comparación con el método HemoCue. La evaluación se hizo bajo condiciones de laboratorio. Como puede observarse el acuerdo entre los métodos es muy bueno. Se hicieron las mediciones de absorción espectrofotométricas alrededor de 570 nm para el método conocido y de alrededor de 505 nm para el nuevo método. Para ambos métodos se hicieron mediciones de compensación a alrededor de 880 nm. Se describe en la figura 4b adicionalmente una segunda evaluación del nuevo método en comparación con el método ICSH estándar. Como puede observarse el acuerdo entre estos métodos también es muy bueno. Lo anterior ha sido una descripción de una cierta modalidad preferida de la presente invención, pero no pretende limitar la invención en modo alguno. Por el contrario, se pueden hacer muchas modificaciones, variaciones y cambios en detalles dentro del alcance de la presente invención.

Claims

21 NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método para la determinación cuantitativa de hemoglobina en sangre pura sin diluir y sin hemolizar que comprende los pasos de: proveer una cubeta capilar desechable que tiene una longitud de trayectoria óptica de menos de 1 mm; llenar dicha cubeta con una muestra de sangre pura sin alterar; llevar a cabo una primera medición de absorción en una longitud de onda en la escala de 490-520 nm directamente sobre la muestra en la cubeta, llevar a cabo adicionalmente una segunda medición de absorción, y procesar los resultados de la primera y segunda mediciones de absorción para determinar la concentración de hemoglobina en la muestra, en donde el paso de procesamiento comprende compensar la dispersión en la muestra, dicha compensación depende del resultado de la segunda medición de absorción. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la primera medición de absorción se lleva a cabo a una longitud de onda en la escala de 500 - 510 nm, más preferiblemente a 506 nm. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque la segunda medición de absorción se lleva a cabo en una longitud de onda en la escala de 650 - 1200 nm, más preferiblemente en la escala de 850 - 910 nm, más preferiblemente en la 22 escala de 860 - 900 nm. 4. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la medición de absorción se lleva a cabo en un fotómetro sin un filtro de absorción o un filtro de interferencia, los cuales proveen corrección para variaciones en la sensibilidad del detector y en la longitud de trayectoria óptica efectiva. 5. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque dicha cubeta tiene una longitud de trayectoria óptica de menos de 0.2 mm. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicha cubeta tiene una longitud de trayectoria óptica en la escala de 0.05 - 0.2 mm. 7 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque dicho procesamiento se lleva a cabo mediante un algoritmo predeterminado. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 7 caracterizado además porque dicho procesamiento determina la concentración de hemoglobina en la muestra al calcular la siguiente fórmula: [TotHb] = {Absx - Abs2 ).k + F{Abs2 ) en donde Tot Hb] es la concentración total de hemoglobina en la muestra, Abs es la absorbancia medida de la primera medición de absorción, AbS2 es la absorbancia medida de la segunda medición de absorción, k es un coeficiente de calibración, el cual depende de la disposición de medición, y 23 F(Abs2) es una función que depende de la absorbancia medida de la segunda medición de absorción. 9. - Un método para determinar una concentración de hemoglobina en una muestra de sangre pura sin diluir y sin hemolizar de un resultado de una primera medición de absorción en la muestra llevada a cabo en una longitud de onda en la escala de 490 - 520 nm y un resultado de una segunda medición de absorción en la muestra, dicho método comprende: procesar los resultados de la primera y segunda mediciones de absorción para determinar la concentración de hemoglobina en la muestra, en donde el paso de procesar comprende compensar la dispersión en la muestra, dicha compensación depende del resultado de la segunda medición de absorción. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho procesamiento determina la concentración de hemoglobina en la muestra al calcular la siguiente fórmula: [TotHb] = {Absx - Abs2 ).k + F(Abs2 ) en donde [Tot Hb] es la concentración total de hemoglobina en la muestra, Abs-i es la absorbancia medida de la primera medición de absorción, Abs2 es la absorbancia medida de la segunda medición de absorción, k es un coeficiente de calibración, el cual depende de la disposición de medición, y F(Abs2) es una función que depende de la absorbancia medida de la segunda medición de absorción. 1 1. - El método de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, caracterizado además porque la primera medición de absorción se lleva a 24 cabo en una longitud de onda en la escala de 500 - 510 nm, más preferiblemente a 506 nm. 12. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-11 , caracterizado además porque la segunda medición de absorción se lleva a cabo en una longitud de onda en la escala de 650 - 1200 nm, más preferiblemente en la escala de 850 - 910 nm, más preferentemente en la escala de 860 - 900 nm. 13. - Un sistema para la determinación cuantitativa de hemoglobina en sangre pura no diluida no hemolizada, que comprende: un medio para emitir luz en una primera longitud de onda en una primera escala de 490 - 520 nm y en una segunda longitud de onda en una segunda escala, un soporte de cubeta dispuesto para recibir una cubeta capilar, que tiene una longitud de trayectoria óptica menor a 1 mm que sostiene una muestra de sangre pura sin alterar, un detector para detectar luz transmitida a través de la muestra en una primera medición de absorción para luz en dicho primer escala y en una segunda medición de absorción para luz en dicha segunda escala, y una unidad de procesamiento para procesar resultados de la primera y segunda mediciones de absorción para determinar la concentración de hemoglobina en la muestra, en donde el procesamiento comprende compensar la dispersión en la muestra, y dicha compensación depende del resultado de la segunda medición de absorción. 14 - El sistema de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho medio para emitir luz, soporte de cubeta y 25 detector están dispuestos en un fotómetro. 15.- El sistema de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicha unidad de procesamiento está inserta en el fotómetro. 16.- El sistema de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicha unidad de procesamiento está conectada al fotómetro. 17. - El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado además porque un área de detección del detector tiene un tamaño de modo tal que se detecta esencialmente luz transmitida directamente únicamente. 18. - El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-17, caracterizado además porque el detector esta dispuesto más cerca a 10 mm al soporte de muestra. 19.- El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-18, caracterizado además porque dicho medio para emitir luz comprende una fuente de luz, la cual está dispuesta para emitir luz en la primer longitud de onda y emitir luz en la segunda longitud de onda. 20.- El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-18, caracterizado además porque el medio para emitir luz comprende una primera fuente de luz, la cual está dispuesta para emitir luz en la primera longitud de onda y una segunda fuente de luz, que está dispuesta para emitir luz en la segunda longitud de onda. 26 21.- El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-20, caracterizado además porque la primera longitud de onda emitida por el medio para emitir luz está en la escala de 500-510 nm, más preferiblemente 506 nm. 22.- El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-21 , caracterizado además porque la segunda longitud de onda emitida por el medio para emitir luz está en la escala de 650-1200 nm, más preferiblemente en la escala de 850-910 nm, más preferiblemente en la escala 860-900 nm. 23.- El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-22, caracterizado además porque el soporte de cubeta está dispuesto para recibir una cubeta, que tiene una longitud de trayectoria óptica de menos de 0.2 mm. 24. - El sistema de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el soporte de cubeta está dispuesto para recibir una cubeta, que tiene una longitud de trayectoria óptica en la escala de 0.05-0.2 mm. 25. - El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-24, caracterizado además porque caracterizado además porque dicha unidad de procesamiento utiliza un algoritmo predeterminado para llevar a cabo dicho procesamiento. 26. - El sistema de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicho procesamiento determina la 27 concentración de hemoglobina en la muestra al calcular la siguiente fórmula [TotHb] = (Abs, - Abs2 )- k + F(Abs2 ) en donde [Tot Hb] es la concentración total de hemoglobina en la muestra, Absi, es la absorbancia medida de la primera medición de absorción, y Abs2 es la absorbancia medida de la segunda medición de absorción, k es un coeficiente de calibración, el cual depende de la disposición de medición, y F(Abs2) es una función que depende en la absorbancia medida de la segunda medición de absorción.