CN104198406A - 一种泥蚶血红蛋白过氧化物酶活性的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到一种泥蚶血红蛋白过氧化物酶活性的检测方法，其特征在于包括下述步骤：向磷酸盐缓冲液中加入愈创木酚和双氧水，控制愈创木酚和双氧水的浓度，得到底物；向半微量比色皿中加入底物，25～40℃下将待测Tg-Hb置于比色皿壁上，混合摇匀；用分光光度计测其吸光度，记录A₄₇₀；酶活力(U/ml)＝4×△A₄₇₀/min×V_A×N÷(ε₄₇₀×V_B)。本发明方法简单易行、检测速度快、误差小、易标准化，能够在其失活前完成检测，彻底解决了Tg-Hb过氧化物酶对底物双氧水不稳定问题。

Description

一种泥蚶血红蛋白过氧化物酶活性的检测方法

技术领域

本发明涉及到血红蛋白过氧化物酶活性的检测方法，具体指一种泥蚶血红蛋白过氧化物酶活性的检测方法。 

背景技术

血红蛋白是所有脊椎动物和部分无脊椎动物血液中所含有的一大类含铁的呼吸蛋白，除具有运输氧气的主要功能外，还具有稳定血压、抗菌、运输硫化物、调节酸碱平衡、过氧化酶活性等多种生物学功能，是最具有研究价值的蛋白质家族之一。 

泥蚶是一种具有重要经济价值的双壳类软体动物，在海洋无脊椎动物中它是一个较为特别的含有血红蛋白的种类，具有补血、温中、健胃的功效。泥蚶的血液中存在大量的血红蛋白，并且研究发现，泥蚶血红蛋白(Tg-Hb)的抗菌能力与其过氧化物酶活性相关。因此，检测泥蚶血红蛋白过氧化物酶酶活性对研究泥蚶血红蛋白的抗菌作用，甚至泥蚶的抗菌性能具有重要的意义。 

血红蛋白的过氧化酶活性通常采用终止反应法进行检测。如将底物(胺或酚和双氧水)与血红蛋白混合，在一定pH、温度下反应10分钟，然后用酸碱或变性剂终止反应，测酶反应前后吸光值的变化(△A)，通过△A计算血红蛋白的过氧化物酶活力。但是这些方法操作过程繁琐，不易控制反应，误差较大，无法标准化。 

另外，由于Tg-Hb对底物之一双氧水不稳定，在上述测酶活常用的双氧水浓度下会逐渐失活，3分钟后基本无活性，如果测酶活时减少双氧水用量，则又会因底物不足影响反应速度。所以，采用终止反应法检测Tg-Hb的误差尤其大。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种具有简单、快速、误差小、易标准化的Tg-Hb中过氧化物酶活性的检测方法，在其失活前完成检测，解决其对底物双氧水不稳定问题。 

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该Tg-Hb过氧化物酶的活性检测方法，其特征在于包括下述步骤： 

向45-55mml/L pH6.5-7.5磷酸盐缓冲液中加入愈创木酚和双氧水，控制愈创木酚 的浓度为2-6mmol/L，优选4mmol/L，双氧水浓度为1-2mmol/L，优选2mmol/L；得到底物； 

向半微量比色皿中加入1ml底物，控制底物温度为25～40℃，优选35℃； 

将9-11ul待测Tg-Hb置于比色皿壁上，加盖后在5s内混合摇匀；用分光光度计在470nm下采用动力学模式测其吸光度；每5秒记录数据A₄₇₀，记录2分钟；仪器显示的活度或slope即为△A₄₇₀/min；对于不能直接显示活度或slope的分光光度计，可用A₄₇₀对时间作图，从图中求出每分钟吸光度值的变化，即△A₄₇₀/min； 

调整Tg-Hb的量，使△A₄₇₀/min不大于0.4； 

每分钟吸光度的变化值即为过氧化物酶活力，每分钟转化lumolH₂O₂为一个酶活，酶活力(U/ml)的计算方法如下： 

酶活力(U/ml)＝4×△A₄₇₀/min×V_A×N÷(ε₄₇₀×V_B) 

＝15×△A₄₇₀/min×N 

其中：ε₄₇₀＝26.6mM^-1·cm^-1，为产物四邻甲氧基联酚消光系数； 

V_A为底物溶液量，单位ml； 

V_B为加入的样品溶液体积，单位ml； 

N为稀释倍数。 

优选所述记录时长为1分钟。 

更好的，在所述底物和所述待测Tg-Hb混合均匀10秒后开始记录，记录时长为30秒。 

与现有技术相比，本发明所提供的Tg-Hb过氧化物酶活性的检测方法简单易行、检测速度快、误差小、易标准化，能够在其失活前完成检测，彻底解决了Tg-Hb过氧化物酶对底物双氧水不稳定问题。 

附图说明

图1和图2为本发明实施例1中两种检测方法检测的Tg-Hb酶活性与其浓度的关系图；其中图1为Tg-HbⅠ，图2为Tg-HbⅡ。◆表示本发明方法测定的酶活，■表示OPDA法测定的酶活。 

图3本发明实施例3中pH值与相对酶活力的关系图； 

图4为本发明实施例4中温度和相对酶活力的关系图； 

图5、图6为实施例5中不同浓度的愈创木酚对Tg-Hb酶活影响图；其中图5为Tg-Hb Ⅰ，图6为Tg-Hb Ⅱ； 

图7和图8为实施例6中不同浓度的双氧水对Tg-Hb酶活影响图；其中图7为Tg-HbⅠ，图8为Tg-Hb Ⅱ； 

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 

实施例1 

本发明与常规过氧化物酶活性测定方法的对比。 

取1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL5种浓度的Tg-HbI样品和2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL5种浓度的Tg-Hb Ⅱ样品，用两种方法检测其过氧化物酶活性。 

本发明检测方法如下： 

向50mml/L、pH值为7.0的磷酸盐缓冲液中加入愈创木酚和双氧水，控制愈创木酚的浓度为4mmol/L，双氧水浓度为2mmol/L，得到底物； 

向半微量比色皿中加入1ml底物，控制底物温度为25℃； 

将10ul待测Tg-HbTg-Hb置于比色皿壁上，加盖后在5s内混合摇匀；用分光光度计在470nm波长下采用动力学模式测其吸光度，设置延时10秒，测量时间10～40秒，每5秒记录数据A₄₇₀，仪器显示的slope(斜率)即为△A₄₇₀/min。 

调整Tg-Hb的量，使△A₄₇₀/min不大于0.4； 

每分钟吸光度的变化值即为过氧化物酶活力大小，以每分钟转化lumolH₂O₂为一个酶活，按下式计算酶活力(U/ml)：按下式计算酶活力(U/ml)： 

酶活力(U/ml)＝4×△A₄₇₀/min×V_A×N÷(ε₄₇₀×V_B) 

＝15×△A₄₇₀/min×N 

其中：ε₄₇₀＝26.6mM^-1·cm^-1，产物四邻甲氧基联酚消光系数， 

V_A＝1.0ml(底物溶液)， 

V_B：0.01ml(加入的样品溶液体积)， 

N：1(稀释倍数) 

现有OPDA法血红蛋白过氧化物酶的检测方法： 

在25℃、0.1mol/L Na₂HPO₄一柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制成含4.6mmol/L邻苯二胺(OPDA)、0.1mmol/L H₂O₂的溶液，分别加入不同浓度的Tg-Hb开始反应，反应10min用1mol/L H₂SO₄(2mI)终止反应，430nm处检测吸光度的变化。 

两种方法检测结果见图1、图2。图中◆表示本发明方法测定的酶活，■表示OPDA法测定的酶活。 

由图1和图2可知，该发明方法检测结果是：在1～5mg/mL的浓度范围内，Tg-Hb Ⅰ酶活与其浓度呈很好的线性关系；在2～10mg/mL的浓度范围内，Tg-Hb II的浓度与酶活也呈现很好的线性关系，相关系数分别为0.9963、0.9990，均在0.99以上。而用OPDA法测 的两种Tg-Hb的酶活与其浓度均未呈现线性关系，随着Tg-Hb浓度的增大，检测的酶活结果逐渐偏低。 

实施例2 

本实施例为底物选择。 

在50mml/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液中加入双氧水，使其浓度为2mmol/L，然后加入愈创木酚，配制一系列浓度的愈创木酚溶液。用不同浓度愈创木酚溶液作底物，在25℃、470nm波长下测定两种Tg-Hb的酶活，绘制双倒数图，计算Km值。同样方法测定邻苯二酚、左旋多巴、苯酚、对苯二酚、L-酪氨酸、对甲酚的Km值。结果如表1所示。 

表1 Tg-HbI/Tg-HbII在不同底物下的米氏常数 

Km值可作为反应酶与底物的亲和力大小的表征：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲和力大。Km值小亲和力最大的是邻苯二酚的，其次是愈创木酚。但因为邻苯二酚的毒性较大，考虑到安全性的问题，选用愈创木酚作为Tg-Hb过氧化物酶活性测定的底物。 

实施例3 

检测缓冲液pH值的选择 

先配制pH为2、3、4、5的50mmol/L的柠檬酸钠缓冲液和pH为6、7、8、9、10的50mmol/L的磷酸盐缓冲液，加入愈创木酚和双氧水，使愈创木酚的浓度为4mmol/L，双氧水浓度为2mmol/L，得到底物；在25℃、470nm波长下测定两种Tg-Hb的酶活，相对酶活力与pH值的关系如图3所示。 

由图3可以看出，Tg-HbI/Tg-HbII的最适pH均为5，在此pH下测其酶活比较灵敏。但Tg-Hb在pH低于6的溶液中容易发生解聚，失去其天然结构。pH7.0接近生理pH，虽然在此条件下测定值较低，但可测定天然状态Tg-Hb的过氧化物酶活性，因此，采用pH7.0的缓冲液作为测定pH。 

实施例4 

检测温度的选择 

在50mml/L、pH值为7.0的磷酸盐缓冲液加入愈创木酚和双氧水，使愈创木酚的浓度为4mmol/L，双氧水浓度为2mmol/L，得到底物；分别控制底物在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃，用分光光度计在470nm波长下测定两种Tg-Hb的酶活，相对酶活力与温度的关系如如图4所示。 

由图4可以看出，30～40℃是其最适温度，优选35℃；但在25℃的时候，相对酶活力也挺高的。考虑到室温25℃比较好控制，所以，也可以选定25℃进行检测。 

实施例5 

底物愈创木酚浓度的确定 

将愈创木酚、双氧水加入到50mml/L、pH值为7的磷酸盐缓冲液中，分别配置愈创木酚浓度为0.2mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L，双氧水浓度均为2mmol/L的底物。用分光光度计在25℃、470nm波长下测定两种Tg-Hb的酶活，每5S记一个数据，记录2min，结果见图5和图6。图中线1-7愈创木酚浓度分别为0.2mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L。 

由图5和图6看出，当愈创木酚浓度为0.2mmol/L～4mmol/L，Tg-Hb的酶活与愈创木酚的浓度成正相关的关系，并且随着愈创木酚底物浓度的增加，其反应延滞期逐渐缩短，但是当愈创木酚的浓度超过4mmol/L之后，其酶活与愈创木酚的浓度成负相关性，可见，高浓度的愈创木酚对酶活起抑制作用。因此，适合测定两种Tg-Hb的愈创木酚浓度均为2～6mmol/L，最适的浓度则为4mmol/L。 

实施例6 

H₂O₂浓度的确定 

将愈创木酚、双氧水加入到50mml/L、pH值为7的磷酸盐缓冲液中，分别配置H₂O₂浓度为0.2mmol/L，0.5mmol/L，1mmol/L，1.5mmol/L，2mmol/L，2.5mmol/L，3mmol/L，愈创木酚浓度为4mmol/L的底物。用分光光度计在25℃、470nm波长下测定两种Tg-Hb的酶活，每5S记一个数据，记录2min，结果见图7和图8。图中线1-7双氧水浓度分 别为0.2mmol/L，0.5mmol/L，1mmol/L，1.5mmol/L，2mmol/L，2.5mmol/L，3mmol/L。 

由图7和图8可以看出，随着双氧水浓度的升高，反应延滞期逐渐变短，但是当浓度逐渐变高的时候，其线性反应期也在缩短。连续监测法测定酶活其监测时间至少30秒，所以，适合Tg-HbI测定的双氧水浓度为1～2mmol/L，最适的浓度为2mmol/L。在测定时，延时10秒，测定时间10～40秒；适合Tg-HbⅡ测定的双氧水浓度为1～2.5mmol/L，最适的浓度为2mmol/L。在测定时，延时5秒，测定时间5～40秒。综合考虑，能同时测定两种Tg-Hb的双氧水浓度为1～2mmol/L，最适的浓度为2mmol/L。在测定时，延时10秒，测定时间10～40秒。 

Claims (4)

1.一种泥蚶血红蛋白过氧化物酶活性的检测方法，其特征在于包括下述步骤：

向45-55mml/L pH6.5-7.5磷酸盐缓冲液中加入愈创木酚和双氧水，控制愈创木酚的浓度为2-6mmol/L，双氧水浓度为1-2mmol/L，得到底物；

向半微量比色皿中加入1ml底物，控制底物温度为25～40℃；

将9-11ul待测Tg-Hb置于比色皿壁上，加盖后在5s内混合摇匀；用分光光度计在470nm下采用动力学模式测其吸光度，用分光光度计在470nm下采用动力学模式测其吸光度；每5秒记录数据A₄₇₀，记录2分钟；仪器显示的活度或slope即为△A₄₇₀/min；对于不能直接显示活度或slope的分光光度计，可用A₄₇₀对时间作图，从图中求出每分钟吸光度值的变化，即△A₄₇₀/min；

调整Tg-Hb的量，使△A₄₇₀/min不大于0.4；

酶活力(U/ml)＝4×△A₄₇₀/min×V_A×N÷(ε₄₇₀×V_B)

其中：ε₄₇₀＝26.6mM^-1·cm^-1，为产物四邻甲氧基联酚消光系数；

V_A为底物溶液量，单位ml；

V_B为加入的样品溶液体积，单位ml；

N为稀释倍数。

2.根据权利要求1所述的泥蚶血红蛋白过氧化物酶活性的检测方法，其特征在于所述记录时长为1分钟。

3.根据权利要求1或2所述的泥蚶血红蛋白过氧化物酶活性的检测方法，其特征在于所述底物和所述待测Tg-Hb混合均匀10秒后开始记录，记录时长为30秒。

4.根据权利要求3所述的泥蚶血红蛋白过氧化物酶活性的检测方法，其特征在于愈创木酚的浓度为4mmol/L，双氧水浓度为2mmol/L。