JPH04252199A - 色原体基質と非色原体、淡色原体、深色原体 または浅色原体基質とを持つ検出検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【本発明の分野】本発明は競争的な基質を用いて酵素活
性を調節する方法、特に、色原体基質（ｃｈｒｏｍｏｇ
ｅｎｉｃ　　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）と非色原体（ｎｏｎ
ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、淡
色原体（ｈｙｐｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　　ｓｕｂｓ
ｔｒａｔｅ）、深色原体（ｂａｔｈｏｃｈｒｏｍｏｇｅ
ｎｉｃｓｕｂｓｔｒａｔｅ）または浅色原体基質（ｈｙ
ｐｓｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｓｕｂｓｔｒａｔｅ）と
を持ち、あるいは使用する酵素検出検定組成物と方法と
に関する。

【０００２】

【本発明の背景】本発明は競争的な基質を用いて酵素活
性を調節する化学的システムに対し広い応用を持ってい
る。この発明は特に、色原体基質と非色原体、淡色原体
、深色原体または浅色原体基質との双方を用いる、新規
の検出検定に対して適用できる。

【０００３】色原体基質は可視領域で光を強く吸収する
基質である。非色原体基質は可視領域で光を吸収しない
基質である。淡色原体基質は可視領域でほんの弱くしか
光を吸収しない（即ち、色原体基質に比較して、可視領
域で１０％以下の光を吸収する）基質である。深色原体
基質はもう１つの基質（即ち色原体基質）に比較してよ
り高い波長の可視領域で光を吸収する基質である。最後
に、浅色原体基質はもう１つの基質（即ち、色原体基質
）に比較して、より低い波長の可視領域で光を吸収する
基質である。

【０００４】このようなシステムは、それには限定され
ないが、検定の感度を調節し、それ故に試料の前希釈の
必要性を除くために色原体基質と非色原体基質とを用い
るコリンエステラーゼの検定によって説明できる。血清
コリンエステラーゼ活性の評価は工業的または農業的毒
物学と生化学的遺伝学とにおいて、そしてスクシニルジ
コリンに対し異常に敏感な患者の選別とにおいて証明さ
れた価値がある。

【０００５】コリンエステラーゼはコリンのエステルを
加水分解する酵素である。この酵素は肝臓で形成される
ようであり、或る時血漿に現れるコリンエステラーゼの
濃度は肝臓による酵素形成速度の反映である。既知の阻
害剤が存在しない場合血清中における活性の低下は肝臓
による酵素の合成が損われていることの反映である。コ
リンエステラーゼ水準の３０〜５０％の低下は急性肝炎
および長期間の慢性肝炎中に見られる。コリンエステラ
ーゼ水準の５０〜７０％の低下は進行した硬変および肝
臓への転移を伴った癌でおこる。それ故その酵素の測定
は肝臓機能の感能性試験と考えてもよい。

【０００６】その上、血清コリンエステラーゼは高度に
有毒な有機リン酸塩とカルバミン酸塩により不可逆的に
抑制される。有機リン酸塩は殺虫剤として農業ならびに
園芸実務で広く用いられている。例えばＰａｒａｔｈｉ
ｏｎとＭａｌａｔｈｉｏｎとは有機リン酸塩を含有する
。殺虫剤で汚染された食物の摂取は有機リン酸塩中毒の
ありふれた原因である。稲作保護のため殺虫剤が広く用
いられ、余儀なく行う作物の噴霧パイロットが低水準の
噴霧を行っている国国、例えば日本では、濃厚量の殺虫
剤吸入の著しい危険性が存在する。

【０００７】急性中毒の全身的な影響は１または２時間
に現れ、その量と吸収系路即ち皮膚、呼吸器系統、結膜
または消化器系統の系路とに左右され、数日続くかもし
れない。一般に受入れられている意味での慢性中毒は起
らないが、亜毒性量の連続的吸収は農業労働者に起り得
て、最終的には急性中毒の特徴をもつ蓄積、そして死さ
えも起り得る。

【０００８】確しかに、亜毒性量の有機リン酸塩への連
続的曝露は血清コリンエステラーゼの活性を減少させる
。曝露が止めば、コリンエステラーゼ活性は、その酵素
が肝臓で再合成されるにつれて５〜６週間に亘り元に戻
る。この理由で、血清コリンエステラーゼの検定はそれ
がよく定義できる故に、農業および工業労働者の審査と
監視とに好ましい。

【０００９】血清コリンエステラーゼはまた、英国でＳ
ｃｏｌｉｎｅとして市販されているサクサメトニウムに
対し感応を示す患者においても検定される。これは初め
１９５１年臨床的麻酔法中に導入された、広く使用され
ている、短期急性弛緩剤である。

【００１０】血清コリンエステラーゼの評価には多くの
方法が利用できる。その比較的簡単さと感度との故に、
チオコリンエステルの加水分解に基く検定が好ましい。 手働または自働の方法の何れかで酵素活性を測定するに
はその活性を前以て調整した直線範囲にすることが必要
である。このことは機器能力または反応混合物中の基質
濃度によって限定される。若し、試料活性が前以て調整
された範囲を越えていれば、より少量の試料を用いなけ
ればならず、そして（または）前以って希釈されなけれ
ばならない。毎日数１００の試料を検定する多くの臨床
検査室において前希釈は退屈で時間をくうものであり、
検定の不正確さの１因である。更にそれは生体に危険な
材料に曝される危険性を増加させる。その上、試料対試
薬の定った比を用いる自働分析器に対しては、試料体積
を調節することが常には実行可能ではない。

【００１１】血清中のコリンエステラーゼ検定開発中は
、検定をＴＥＣＨＮＩＣＯＮ　　ＣＨた。前希釈するこ
となく、この問題を克服する方法が必要であった。

【００１２】検定の極端な鋭敏性により、前希釈の必要
なく、検査をより鋭敏でなくする方法が最初捜し求めら
れた。緩衝剤の変を含めた在来の方法は不成功であった
。加うるに他の基質の使用は唯方法を複雑にする様にみ
えた。

【００１３】本発明に従うと、検定の鋭敏性を制御する
システムが、試料の前希釈を必要とすることなく、発見
された。

【００１４】

【本発明の要約】本発明の目的は競争的基質を用いて酵
素活性を調節する方法を提供することにある。

【００１５】本発明の他の目的は色原体基質と非色原体
、淡色原体、深色原体または浅色原体基質との両方を用
いることにより酵素検出検定を制御する方法を提供する
ことにある。

【００１６】更に他の本発明の目的はコリンエステラー
ゼ活性測定のための試料の前希釈を必要としない新規の
組成物と方法とを提供することにある。

【００１７】本発明の他の目的は高い感度を持ち、正確
で簡単な測定を与える一方、試料の前希釈の必要をなく
した酵素検定方法を提供するにある。

【００１８】本発明に従って、１つは色原体で、少くと
も１つは非色原体、淡色原体、深色原体または浅色原体
である少くとも２つの基質を用いることにより、試料の
前希釈を必要としない、高い正確さと感度とをもつ酵素
検定法を提供することができることを発見した。

【００１９】本発明を、これに限定はされないが、２元
基質としてブチリルコリンとブチリルチオコリンとを用
いるコリンエステラーゼの測定により説明する。コリン
エステラーゼはブチリルコリンとブチリルチオコリンと
の両方を加水分解する。しかし、反応混合物は１つが色
原体であり、他の１つが非色原体である２つの基質を含
有する故に、検定から生ずる信号は単一色原体基質だけ
を含有する反応混合物に比較して小さい。それ故コリン
エステラーゼの場合両基質が加水分解されるが、チオコ
リンだけが検出される。ブチリルコリン対ブチリルチオ
コリン比を調節することにより、応答出力を制御できる
。２つまたはそれ以上の基質を用いることにより、非色
原体基質の濃度を、信号を増大させることなく直線部分
を拡げるために増加し得る。

【００２０】こうして、前希釈の必要性を回避した酵素
検出検定を提供することができる。本発明は前希釈を要
する在来の方法の代替として役立ち、高い試料希釈によ
り変性され易い酵素を検定する方法を提供する。

【００２１】

【好ましい態様の説明】在来的に血清コリンエステラー
ゼの測定検定は、血清コリンエステラーゼ接触反応にお
いてチオコリンに変換する単一基質（例えばブチリルチ
オコリン、アセチルチオコリン等）を用いている。そう
して生成されたチオコリンはそれから色原体即ち試薬（
例えば５，５−ジチオ−ビス−２−ニトロ安息香酸、Ｄ
ＴＮＢ）と反応し、測定のため発色する。しかし正常の
人血清中の高い血清コリンエステラーゼ活性は試料対試
薬比１〜１４で商業的装置において極端に高い吸光度を
生ずる。問題は試料の前希釈をすることなく、定った試
料対試薬比で直接試料血清を用いる方法を達成すること
であった。

【００２２】この問題の解決は２つの基質ブチリルチオ
コリンとブチリルコリンとの使用を伴う。両基質はコリ
ンエステラーゼにより加水分解され得るが、酵素反応生
成物の唯一つ、即ちチオコリンのみがＤＴＮＢと反応で
き、４０５ｎｍに測定できる吸収を持つ生成物を形成す
る。このことは何等の試料希釈段階を実施することなく
、試料対試薬比１〜１４で人血清コリンエステラーゼの
検定を行うことを、商業的装置に可能にさせる。

【００２３】次の材料において、幾つかの略語または名
称を用いる。これらの略語または名称の意味は次の如く
である。

【００２４】この方法の原理は次の式で説明される。

【００２５】４０５ｎｍにおける吸光度の変化率（ｒａ
ｔｅ　　ｏｆ　　ｃｈａｎｇｅ）は、ＢＣとＢＴＣとが
共に存在する場合、直接的にＣＨＥ活性に比例する。光
路１．５ｍｍセルで読み取った場合、感度は０．０００
１３６　　Ａｂｓ／ｍｉｎ／Ｕ／Ｌ（対照法単位：ｒｅ
ｆｅｒｅｎｃｅ　　ｍｅｔｈｏｄ　　ｕｎｉｔ）である
。

【００２６】本発明の検定において、必須の材料は色原
体基質と非色原体、浅色原体、深色原体または淡色原体
基質と色原体と緩衝剤とである。これらの材料は試料が
添加される組成物を構成する。

【００２７】コリンエステラーゼ測定のための接触反応
においてチオコリンに変換するどんな基質でも色原体基
質として用いることができる。そのような基質には前記
して列挙したものならびにプロピオニルチオコリンとア
セチルチオジジンとが含まれる。好ましい色原体基質は
ブチリルチオコリンである。

【００２８】好ましい非色原体基質はブチリルコリンで
ある。他の適当な非色原体基質にはアセチルコリンとプ
ロピオニルチオコリンとが包含される。前記の如く、１
つ以上の非色原体基質が存在できる。しかし多くの検定
では、コリンエステラーゼの測定検定も含めて、１つ以
上の非色原体基質を用いることによって真の有利さは得
られない。

【００２９】コリンエステラーゼ測定のための、記載さ
れた検定中の本質的な考慮は、色原体基質と非色原体基
質とが存在することと、色原体基質がコリンエステラー
ゼとの反応でチオコリンに変換されることである。好ま
しい基質材料は比較的安価で、容易に自働化に受入れら
れるものである。また基質はかなり安定であるべきであ
り、総括的反応を阻害してはならない。２つの基質の比
は決定的なものではなく、総括的システムの要求に合う
よう変化し得る。

【００３０】色原体は好ましい水準約１ｍＭを用いて最
終反応混合物において０．２〜０．７ｍＭ（ミリモル）
に変えることができる。好ましい色原体はＤＴＮＢであ
る。過剰のＤＴＮＢはＣＨＥ活性を抑制するが不足量の
ＤＴＮＢは直線範囲を制限する。使用できる、ＣＨＥ反
応のための他の適当な色原体にはＤＴＢＰ［２，２′−
ジチオビス−ピリジン］、ＤＴＮＰ［２，２′−ジチオ
ビス−（５−ニトロピリジン）］、ＤＴＮＡ［６，６′
−ジチオビス（ニコチン酸）］、ＤＳＮＢ［６，６′−
ジセレノビス−（３−ニトロ安息香酸）］、２，２′−
ジチオジ安息香酸ならびに４，４′−ジチオジピリジン
などが含まれる。

【００３１】代りの色原体を用いる場合（そして特にコ
リンエステラーゼとは異る材料の測定に向けられたシス
テムには）、そのシステムに関して感度と溶解度とｐＨ
と最適波長とが変ってもよい。例えばＤＴＮＢに関して
は〜４１０ｎｍの波長と７〜８のｐＨを用いる。ＤＳＮ
Ｓに関しては〜４３０ｎｍの波長と８〜１２のｐＨとが
用いられ、ＤＴＮＰに関しては〜３８５ｎｍの波長と５
〜９のｐＨとが用いられ、ＤＴＮＡに関しては〜３５５
ｎｍの波長が用いられ、２，２′ジチオジピリジンに関
しては〜３４０ｎｍの波長と４〜５のｐＨとが用いられ
、そして４，４′−ジチオジピリジンに関しては〜３２
５ｎｍの波長が用いられることになる。

【００３２】適当なｐＨが維持され、緩衝剤が総括的反
応を妨害しなければ、適当な、どんな緩衝剤もその反応
に用いることができる。適当な緩衝剤にはトリスアミン
とリン酸塩と２つのＧｏｏｄ緩衝剤とＨＥＰＥＳ［Ｎ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンス
ルホン酸］とＭＯＰＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）−プロ
パンスルホン酸とＴＥＳ［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸］とが包含さ
れる。緩衝剤の濃度は、ｐＨさえ維持されるならば重大
なことではない。緩衝剤の濃度は通常では約５０〜２０
０ｍＭの範囲である。

【００３３】ｐＨは検定システム中に存在する他の材料
で左右されることになる。血清コリンエステル活性の評
価に向けられている検定には、ｐＨは通常約４〜１１の
範囲であり、特に好ましくはｐＨ約７〜８．５である。 血清コリンエステラーゼに関しての最適ｐＨ範囲は約８
〜８．５である。或る基質に関しては、約８以上のｐＨ
値はその基質の早過ぎる加水分解をおこさせ得る。

【００３４】試験される試料は体液例えば全血、血清ま
たは血漿であることができる。本発明の試薬システムを
用いる場合、通常の臨床的反応に用いる反応温度が好ま
しいが、どんな適当な反応温度でも用いることができる
。例えば、標準温度例えば２５℃、３０℃または３７℃
が用いられ、好ましくは検定の温度は３７℃以上に維持
する。吸光度測定は通常４０５または４１２ｎｍで読み
とられるが、これは用いられた特別な色原体や機器に左
右される。

【００３５】前記に列挙した本質的成分に加えて、随意
の成分を用いることができる。例えばキレート化剤例え
ばＥＤＴＡを、長期間の安定性の改善のためと種種な化
学分析器で発見される様な全蛋白質ビュレット試薬のＣ
ＨＥ中への繰越しによる銅の干渉を防ぐために添加でき
る。ＥＤＴＡの濃度は重金属のキレート化には約０．２
〜２ｍＭの範囲にできる。使用できる他の適当なキレー
ト化剤にはＨＥＤＴＡ（ヒドロキシエチルエチレンジア
ミントリ酢酸）とＣＤＴＡ（シクロヘキサン−１，２−
ジアミン四酢酸）とが包含される。

【００３６】キレート化剤に加えて、所望ならば、防腐
剤、界面活性剤などを、それらの材料に関して正常の濃
度水準で添加できる。

【００３７】それらの成分の処方と使用との中に、典型
的には試料を導入し、色原体と緩衝剤と混合する。それ
から色原体基質と非色原体基質とをその反応混合物に添
加する。得られる混合物の吸光度を読む。

【００３８】コリンエステラーゼ活性の測定検定を参照
して本発明を説明したが、本発明は色原体基質と非色原
体、淡色原体、深色原体または浅色原体基質とを持つ、
酵素検出検定組成物および方法とを広く指向する。酵素
検出検定システムの例には、アルカリホスファターゼ（
ＥＣ　　３．１．３．１）とγ−グルタミルトランスフ
ェラーゼ（ＥＣ　　２．３．２２）とが包含される。基
本的には、非色原体、淡色原体、深色原体または浅色原
体競争基質が存在すれば、どんな酵素でも本発明を用い
て検出できる。

【００３９】より深色原体基質の吸光係数減少のため、
基質を用いる他の例は次のものがある。着色減少効果は
、その酵素に関する基質のＫｍとνｍａｘとにおける差
に従って変わることになる。例えば加水分解酵素例えば
キモトリプシンとエラスターゼとはペプチドの４−ニト
ロフェニルエステルまたはアニリド誘導体の混合物を開
裂して黄色に着色した生成物（λｍａｘ＝４００−４０
５ｎｍ）を与える。これらの基質は競争剤として、より
深色原体色生成システムと共に用いることができる。 例えば４−ニトロフェニルＮ−カルボベンジルオキシ−
フエニルアラニンアミドとキモトリプシンならびに４−
ニトロフェニルＮ−トシルアラニナートとエラスターゼ
は、酵素に、ジアゾニウム塩例えば４−ジアゾ−２−ナ
フトール−４−スルホン酸と塩化２−メトキシ−４−モ
ルホリノベンゼンジアゾニウム（塩化亜鉛）複塩と結合
しない開裂生成物を与える。しかし、これらのペプチド
のインドキシルならびに２−ヒドロキシ−５−フェニル
ピロリルエステルと３−アミノインドキシルアミド誘導
体はジアゾニウム塩と結合し、深色原体色（普通赤紫色
、λｍａｘ＝５２０ｎｍ）を与える。検定のその着色率
は非色原体または淡色原体基質の存在の下では低められ
る。

【００４０】他の加水分解酵素例えばγ−グルタミルト
ランスフェラーゼの基質も同様に挙動することになる。

【００４１】本発明は、本発明を限定しない次の実施例
により更に説明される。

【００４２】

【実施例Ｉ】

【００４３】検体集団は次の試料、正常の無作為血清５
０個、脂肪血症血清５個、黄疸血清５個、溶血を起して
いる血清５個、尿毒血清５個および人血清ＣＨＥを加え
た他の血清８個よりなる。

【００４４】本発明に従って行った検査のための処方に
は次のものを包含する。

【００４５】最終的反応液濃度は次の通りであった。

【００４６】ｐ−ヒドロキシ安息香酸とゲンタマイシン
硫酸塩とは微生物増殖抑制に用いられている。Ｄｅｘｔ
ｒａｎ　　Ｔ４０は賦形薬である。

【００４７】３０℃と３７℃との両方での実感度は０．
１５ｃｍ光路長で０．０００１３６Ａｂｓ／ｍｉｎ／Ｕ
／Ｌであった。測定は４０５ｎｍで行った。組成物は４
℃で少くとも３０日間は安定であった。

【００４８】作業中ならびに総体での精度を次に示す。

【００４９】結果として得られた方法（“ＣＨＥＭ　　
Ｉ”法）の、標準ＡＣＢ法と比較した相関を図１で説明
している。線型回帰分析中に包含される凡ての試料を用
いて次の相関結果が得られた。 Ｙ＝０．０８２５Ｘ−８．８１ 図１で見られる如く、本発明のＣＨＥＭ　　Ｉ法はＡＣ
Ｂ法に対し一次である。

【００４９】前記の如く、本発明はコリンエステラーゼ
以外の酵素に就いての、色原体基質と非色原体、淡色原
体、深色原体または浅色原体基質との両者を用いる検出
検定に適用できる。この代表例は次の実施例である。

【００５０】

【実施例ＩＩ】グルタチオンとリポアミドとはそれぞれ
の脱水素酵素により還元され、色原体指示薬例えばＤＴ
ＮＢまたはＩＢＴＺ［３−Ｎ−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）−５−ニトロイソベンゾチアゾール−３−オン
］を用いて検出できるチオールを与える。この実施例は
非色原体指示薬、黄色生成指示薬の添加がチオールと深
色原体チオールと深色原体チオール指示薬との反応から
期待される色の量を減少することを示す。これらの指示
薬（基質）は還元されたアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
ＤＨ）と前記の酵素とにより薄くなる。若しＮＡＤＨ濃
度を一定に保つと、色形成率は酵素濃度に比例すること
になる。

【００５１】加うるに、ＮＡＤＨは脱水素酵素例えばグ
ルコースまたはコレステロール脱水素酵素のグルコース
またはコレステロールへの作用により形成される。従っ
て、このことはＮＡＤ濃度とリポアミドまたはグルタチ
オン脱水素酵素と基質（例えばグルコースまたはコレス
テロール）を一定に保ち、色形成率を検出することによ
り、これらの脱水素酵素を検出する方法を提供する。

【００５２】色原体チオール指示薬Ｎ−メチル−５−（
１−ヒドロキシ−３，６−ジスルホ−２−ナフチルアゾ
）ベンゾイソチアゾロン８５ナノモル（ｎ　　ｍｏｌ）
と非色原体または浅色原体指示薬Ａ，ＢまたはＣ（以下
に示す）８５ｎ　　ｍｏｌとの、０．１Ｍリン酸塩、ｐ
Ｈ６．５、２．９ｍｌ中混合物を含むセルに、０．６Ｍ
ジチオトレイトールを次次に量を増加させて加える。そ
の内容物を反転させて混合し、２分後に６１０ｎｍでの
吸光度を次の表の如く測定する。 評価した非色原体材料 Ａ　　Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−５−アセ
タミドベンゾイソチアゾロン Ｂ　　Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−５−アミ
ノベンゾイソチアゾロン Ｃ　　Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−５−ニト
ロベンゾイソチアゾロン

【００５３】この結果は明らかに、非色原体または浅色
原体指示薬がより深色原体指示薬により生じた色を減少
することを示している。

【００５４】（次の材料中に述べられているような緩衝
液とは０．１Ｍ、ｐＨ６．９、Ｎ−（２−アセタミド）
−２−アミノエタンスルホン酸を云う）組成物 １．緩衝液中Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−５
−（１−ヒドロキシ−３，　　　　６−ジスルホ−２−
ナフチル）アゾイソベンゾチアゾール−３−オン（ＩＢ
　　　　ＴＺ　　１、色原体指示薬）０．０２０９ｍ　
　ｍｏｌ／ｌ２．緩衝液中ＩＢＴＺ　　１　　０．２０
９ｍ　　ｍｏｌ／ｌ、５−アミノイソベンゾチアゾール
−３−オン（ＩＢＴＺ　　２、非色原体指示薬）０．２
１９ｍ　　ｍｏｌ／ｌ３．水中グルコース１．５Ｍ ４．緩衝液中ＮＡＤ６ｍ　　ｍｏｌ／ｌ５．メタノール
中リポアミド１５．７ｍ　　ｍｏｌ／ｌ６．緩衝液中、
０．５％アルブミン中のリポアミド脱水素酵素２０Ｕ／
ｍｌ ７．新に調製された、緩衝液中における、０．５％アル
ブミン中グルコース脱水素酵素２３．８Ｕ／ｍｌ

【００
５５】組成物１（０．１０５μ　　ｍｏｌ）または組成
物２（ＩＢＴＺ　　１０．１０５μ　　ｍｏｌ、ＩＢＴ
Ｚ　　２　　０．１１０μ　　ｍｏｌ）何れかの０．５
ｍｌの混合物を緩衝液２．０５ｍｌで希釈する。組成物
３（０．２ｍｌ、０．３ｍ　　ｍｏｌ）と４（０．１ｍ
ｌ、０．６μ　　ｍｏｌ）と５（０．１ｍｌ、１．５７
μ　　ｍｏｌ）と６（０．０５０ｍ１、１．０Ｕ）とを
加える。 組成物７の０．０１０ｍｌと０．０２０ｍｌと０．０３
０ｍｌと０．０４０ｍｌと０．０５０ｍｌとを個別の実
験において加え、４５秒後に６１４ｎｍで吸光度を読む
。

【００５６】このデータは、ＩＢＴＺは酵素を検出でき
ることを確証している。データの第１欄はＩＢＴＺによ
るグルコース脱水素酵素の検出を説明しており、第２欄
は非色原体ＩＢＴＺの添加が光学的信号をどれ程抑制す
るかを示している。

【００５７】

【実施例ＩＩＩ】β−ガラクトシダーゼ色原体基質例え
ば７−β−ガラクトピラノシルオキシ−９，９−ジメチ
ル−９Ｈ−アクリジン（λｍａｘ＝６３２ｎｍ）の信号
はβ−フェニルガラクトシドまたはβ−２−（ニトロフ
ェニル）ガラクトシド（λｍａｘ＝４０５ｎｍ）の添加
により減少できる。色形成率は酵素量に比例する。

【００５８】ＵＶセル中にある検定原液（以下を見よ）
８００μｌに、５０ｍＭの非色原体、淡色原体または浅
色原体指示薬１００μｌ（最終濃度５ｍＭ）あるいは空
試験値決定のため検定原液１００μｌを加える。それか
ら５μｇ／ｍｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液２０
μｌを加え、時間計測を始め、そしてふたをしたセルを
反転して振盪する。６３０ｎｍにおける吸光度を５秒か
ら３００秒まで監視する。

【００５９】捕捉剤用の指示薬には次のものが包含され
る。

【００６０】同様の結果が各指示薬に関して得られた。 以下に示すのはＡｃｉｄＲｅｄ＃１に関する結果である
。

【００６１】色形成率は初めの試料中に存在する酵素量
に比例する。

【００６２】前記のことから、本発明は明らかで、固有
の他の有利さと共に、前記した凡ての結果と目的とを達
成するのによく適合することが判るであろう。本発明は
前希釈の必要性を除くのみならず酵素活性の正確で簡単
な測定を提供する。この方法は高い感度をもっている。 他の有利さに加えて、本発明はピペット採取の精度をあ
げるため、試料サイズを増大することを可能にし、高い
希釈による酵素の変性を防ぎ、直線範囲を拡げることを
可能にする。

【００６３】明らかに、前記の如き本発明の多くの変更
態様と変形とを、その精神と範囲とから逸脱することな
く作ることができ、それ故に、そのような限定は、添付
の請求事項によって示される如く課すべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の１つの態様と標準法との相関を示す図
である。

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　色原体基質と非色原体、淡色原体、深
   色原体または浅色原体基質と緩衝剤と色原体とを含む、
   試料中の酵素活性測定のための組成物。
2. 【請求項２】　　試料が体液である、請求項１に記載の
   組成物。
3. 【請求項３】　　試料が全血と血清と血漿とからなる群
   より選ばれる体液である、請求項２に記載の組成物。
4. 【請求項４】　　色原体基質と非色原体基質と緩衝剤と
   色原体とを含む、体液中のコリンエステラーゼ測定のた
   めの組成物。
5. 【請求項５】　　色原体基質がプロピオニルチオコリン
   である、請求項４に記載の組成物。
6. 【請求項６】　　ブチリルコリンとブチリルチオコリン
   とが基質として存在する、請求項４に記載の組成物。
7. 【請求項７】　　色原体が５，５−ジチオ−ビス−２−
   ニトロ安息香酸である、請求項４に記載の組成物。
8. 【請求項８】　　色原体が２，２′−ジチオビス−ピリ
   ジンである、請求項４に記載の組成物。
9. 【請求項９】　　色原体が２，２′−ジチオビス−（５
   −ニトロピリジン）である、請求項４に記載の組成物。
10. 【請求項１０】　　色原体が６，６′−ジチオビス（ニ
    コチン酸）である、請求項４に記載の組成物。
11. 【請求項１１】　　色原体が６，６′−ジセレノビス（
    ３−ニトロ安息香酸）である、請求項４に記載の組成物
    。
12. 【請求項１２】　　色原体が２，２′−ジチオジ安息香
    酸である、請求項４に記載の組成物。
13. 【請求項１３】　　色原体が４，４′−ジチオジピリジ
    ンである、請求項４に記載の組成物。
14. 【請求項１４】　　色原体が濃度約０．２〜０．７ｍ　
    　ｍｏｌで存在する、請求項４に記載の組成物。
15. 【請求項１５】　　緩衝剤がトリス（ヒドロキシメチル
    ）アミノメタンである、請求項４に記載の組成物。
16. 【請求項１６】　　緩衝剤がリン酸塩緩衝剤である、請
    求項４に記載の組成物。
17. 【請求項１７】　　緩衝剤が濃度約５０〜２００ｍ　　
    ｍｏｌで存在する、請求項４に記載の組成物。
18. 【請求項１８】　　ｐＨを約７〜８．５の範囲に維持す
    る、請求項４に記載の組成物。
19. 【請求項１９】　　ｐＨを約７〜８の範囲に維持する、
    請求項１８に記載の組成物。
20. 【請求項２０】　　防腐剤も含まれる、請求項４に記載
    の組成物。
21. 【請求項２１】　　またｐ−ヒドロキシ安息香酸も含む
    、請求項４に記載の組成物。
22. 【請求項２２】　　コリンエステラーゼを含有する溶液
    を、色原体基質と非色原体基質と緩衝剤と色原体と混合
    し、その後で、コリンエステラーゼ活性測定のために、
    得られた混合物の光学的吸収度を測定することを包含す
    る、コリンエステラーゼ活性の測定方法。
23. 【請求項２３】　　ブチリルコリンとブチリルチオコリ
    ンとが基質として存在する、請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】　　チオコリンの光学的吸収度を検出す
    る、請求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】　　基質の比を、光学的吸収度制御のた
    めに調節する、請求項２３に記載の方法。
26. 【請求項２６】　　光学的吸収度を４０５ｎｍで測定す
    る、請求項２３に記載の方法。
27. 【請求項２７】　　光学的吸収度を４１２ｎｍで測定す
    る、請求項２３に記載の方法。
28. 【請求項２８】　　測定を実施する温度が約２５〜３７
    ℃である、請求項２３に記載の方法。
29. 【請求項２９】　　本質的に、試料を、色原体基質と非
    色原体、淡色原体、深色原体または浅色原体基質と緩衝
    剤と色原体と混合し、その後、酵素活性測定のために、
    得られた材料の光学的吸収度を測定することからなる、
    試料の前希釈を要しない、酵素活性の測定法。
30. 【請求項３０】　　基質の比を、光学的吸収度の制御の
    ために調節する、請求項２９に記載の方法。