MXPA04005679A

MXPA04005679A - Alimento animal.

Info

Publication number: MXPA04005679A
Application number: MXPA04005679A
Authority: MX
Inventors: Troels Gravesen
Original assignee: Danisco
Priority date: 2001-12-13
Filing date: 2002-12-13
Publication date: 2004-12-06
Also published as: AU2002366594A1; EP1460904A2; CN1617674A; US20050037053A1; KR100936213B1; BR0214847A; WO2003049550A2; KR20040065237A; GB0129864D0; CN100429989C; CA2469276A1; WO2003049550A3; JP2005511071A

Abstract

La presente invencion se refiere a un componente que comprende una enzima para su uso en un alimento que comprende almidon; en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar almidon resistente.

Description

ALIMENTO ANIMAL CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con un alimento. En particular la presente invención se relaciona con un alimento que comprende almidón adecuado para consumo animal. Para algunas modalidades el animal es aves de corral o cerdo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La digestibilidad del almidón en alimentos es altamente variable y depende de un número de factores que incluyen estructura física tanto del almidón como de la matriz de alimento. El almidón que está atrapado dentro de células enteras de plantas o dentro de la matriz de alimento y algunos granulos de almidón que no estén totalmente gelatinizados se hidrolizan únicamente de manera muy lenta mediante la a-amilasa y por ello pueden escapar de la digestión completa en el intestino delgado. El almidón y los productos de degradación del almidón que son altamente resistentes a la digestión por parte de la amilasa en el intestino delgado se convierten en substratos para la fermentación micróbica en el intestino grueso. El rendimiento calorífico del almidón fermentado en el intestino grueso es menor que la proporcionada si el almidón fuera digerido y absorbido en el intestino delgado, lo que resulta en pérdidas importantes dé energía para el animal. El almidón degradado en el intestino delgado, antes de la degradación micróbica, es absorbido directamente por el epitelio intestinal, liberando así de manera eficiente la energía del alimento para el animal. Del almidón degradado por la comunidad micróbica, únicamente una fracción de la energía será captada por el animal. Esto implica que el almidón fácilmente degradable y el almidón resistente digerido por enzimas degradadoras resistentes al almidón será utilizado de manera más eficiente que el almidón resistente, el cual es degradado por la flora micróbica. De Schrijver et al. (6) reporta que las ratas y los cerdos alimentados con almidón resistente tienen una dígestíbilidad de energía ilíaca aparente significativamente menor en comparación con aquellos animales alimentados con almidón fácilmente degradable, incluso cuando la cantidad de almidón resistente está presente únicamente en una cantidad de alrededor de 6% de la dieta total. Las fibras de dieta y el almidón resistente son substratos para la microflora en el colon de animajes monogástricos. Se han llevado a cabo investigaciones amplias para estimar la cantidad de almidón resistente que escapa del intestino delgado de los humanos, debido a la importancia de estos substratos para la salud humana. El efecto mayormente aceptado de almidón resistente es la formación de ácidos grasos volátiles, VFA, los cuales previenen el cáncer de colon, pero el almidón resistente también puede tener otros efectos benéficos (16). La mayor parte de las pruebas reportadas se han realizado en humanos (principalmente con ileostomas humanos, que se revisa por ejemplo (1 1 )), aunque también se ha realizado pruebas con cerdos y ratas. Las investigaciones que comparan la degradación in vivo (humana) e in vitro de diferentes tipos de almidón demuestran que las degradaciones del modelo in vitro dan resultados confiables. Por ejemplo, Silvester eí al. (24) han cuantificado la cantidad de almidón resistente que escapa al intestino delgado de ileostomas y que se compara con una digestión in vitro con base en el método descrito por Englyst et al. (8). Han encontrado que el 97% de todo el almidón resistente escapa al intestino delgado. De manera similar, las investigaciones de Englyst er al han mostrado que más de 91 % del almidón resistente escapa a la digestión en el intestino delgado. Se puede definir que el almidón resistente consiste de diversos tipos de almidón, siendo uno almidón crudo. Esto ha sido demostrado experimentalmente, por ejemplo, por Muir et al (20), quienes identificaron el almidón crudo como un ejemplo de almidón resistente. De Schrijver eí al. (6) reportan valores de energía digeribles y metabolizables fecales que fueron significativamente menores en ratas que recibieron almidón resistente. Adicionalmente, la ingesta de almidón resistente de parte de cerdos disminuyó de manera significativa la digestibilidad de energía ¡leal aparente cuando se les alimentó con almidón de maíz de alta amilosa degenerada.

Ranhotra et al. (22) encontró que las ratas a las que se les dio almidón resistente ganaron mucho menos peso que un grupo que recibió almidón fácilmente degradable.

Ito et al. (15) han cuantificado la cantidad de almidón en diferentes partes del sistema digestivo en ratas a las que se alimentó con tres dietas diferentes con almidón normal, maíz con almidón altamente resistente sin procesar y maíz con almidón altamente resistente procesado. Han encontrado que las ratas que recibieron las dietas con almidón resistente, en particular el almidón resistente procesado, tienen un mayor contenido de almidón en el ciego. Adicionalmente, al comparar la digestión de almidón resistente en humanos y ratas, Roe et al. (23) han encontrado que las ratas son más eficientes utilizando el almidón resistente y los polisacáridos que no son de almidón que los humanos. En contraste Moran (19) reporta que la digestión de almidón no es un problema en las aves domésticas, lo que implica que todo el almidón es capaz de ser degradado y asimilado en el sistema digestivo de aves domésticas como pollos. La presente invención busca proveer un medio útil para preparar t un alimento para consumo animal que pueda contener almidón.

Presente invención En un aspecto amplio, la presente invención se relaciona con el uso de un componente que comprende un enzima para su uso en un alimento que comprende almidón. La presente invención también se relaciona con alimentos que han sido agregados coloidalmente con dicho componente. En un aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de un componente que comprende una enzima que tenga actividad de amilasa y que sea capaz de degradar el almidón resistente para su uso en un alimento que comprende almidón. La presente invención también se relaciona con alimentos que han sido agregados coloidalmente con dicho componente.

Declaraciones de la invención Se presentan los aspectos de la invención con las reivindicaciones adjuntas y en la siguiente descripción. Como ejemplo, en un primer aspecto la presente invención se relaciona con un componente para su uso en un alimento que comprende almidón, en donde dicho componente comprende una enzima; en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar el almidón resistente. En un segundo aspecto, la presente invención se relaciona con un alimento que comprende un almidón y un enzima, en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar el almidón resistente. En un tercer aspecto, la presente invención se relaciona con un método para degradar almidón resistente en un alimento que comprende poner en contacto dicho almidón resistente con una enzima que tiene i actividad de amilasa y que es capaz de degradar dicho almidón resistente.

En un cuarto aspecto la presente invención se relaciona con el uso de una enzima en la preparación de un alimento que comprende un almidón, para degradar almidón resistente, en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar dicho almidón resistente. En un quinto aspecto la presente invención se relaciona con el uso de una enzima en la preparación de un alimento para mejora el valor calorífico de dicho alimento, en donde la enzima tiene la actividad de amilasa y es capaz de degradar el almidón resistente. En un sexto aspecto la presente invención se relaciona con el uso de una enzima en la preparación de un alimento para mejorar el rendimiento animal, en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar el almidón resistente. i En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un procedimiento para preparar un alimento que comprende agregar coloidalmente un almidón y una enzima, en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar el almidón resistente. En incluso un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un procedimiento para identificar un componente para su uso en un alimento, en donde dicho componente comprende una enzima, dicho procedimiento comprende poner en contacto el almidón resistente con un componente candidato y determinar el grado de degradación de dicho almidón resistente; en donde dicha enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar dicho almidón resistente.

Algunos aspectos preferidos En un aspecto preferido, la enzima para su uso en la presente invención es una enzima de amilasa. En un aspecto preferido, la enzima para su uso en la presente invención es termoestable. En un aspecto preferido, la enzima para su uso en la presente invención tiene un pH estable. En un aspecto preferido, la enzima para su uso en la presente invención es una enzima de degradación de almidón crudo. En un aspecto preferido, la enzima para su uso en la presente invención es una enzima de amilasa seleccionada del grupo que consiste de amilasa de Bacillus circulans F2, amilasa de Streptococcus bovis, amilasa de Cryptococcus S-2, amilasa de Aspergillus K-27, amilasa de Bacillus licheniformis y amilasa de Thermomyces lanuginosus. En un aspecto preferido de la presente invención el alimento es para cerdo o para aves de corral. En un aspecto mayormente preferido de la presente invención el alimento contiene una materia prima como una legumbre o un cereal.

Algunas ventajas Se presentan en el presente comentario algunas ventajas de la presente invención. Como ejemplo, el uso de un componente que comprende una enzima que cuenta con actividad de amilasa y que es capaz de degradar el almidón resistente es ventajoso porque existe un incremento marcado en la degradación de almidón y/o productos de degradación de almidón en un animal. Adicionalmente, el uso de un componente que comprende una enzima que tiene actividad de amilasa y que es capaz de degradar el almidón resistente es conveniente porque existe un incremento marcado en la digestibilidad de almidón y/o productos de degradación de almidón de un animal. Como ejemplo adicional, el uso de un componente que comprende una enzima que tiene actividad de amilasa y que es capaz de degradar el almidón resistente es conveniente porque provee un medio para potenciar la eficiencia de derivar énergía de un alimento de un animal. Adicionalmente, el uso de un componente que comprende una enzima que tiene actividad de amilasa y que es capaz de degradar el almidón resistente es conveniente porque provee un medio para potenciar la biodisponibilidad de almidón resistente.

Alimento Se pueden formular alimentos animales para su uso en la presente invención para que cumplan con las necesidades específicas de grupos animales en particular y para que provean los carbohidratos, grasa, proteína y otros nutrientes necesarios en una forma que pueda ser metabolizada por el animal. Preferiblemente, el alimento animal es un alimento para cerdo o aves de corral. Como se utiliza en la presente el término "cerdo" se relaciona con omnívoros no rumiantes como puercos, marranos o verracos. Típicamente, el alimento de cerdo incluye alrededor de 50 por ciento de carbohidratos, alrededor de 20% de proteína y alrededor de 5% de grasa. Un ejemplo de un alimento para cerdo de alta energía se basa en maíz que generalmente se combina con suplementos alimenticios, por ejemplo proteína, minerales, vitaminas y aminoácidos como lísina y triptofano. Ejemplos de alimentos para cerdo incluyen , productos de proteína animal, productos marinos, productos lácteos, productos de granos y productos de proteínas de plantas, todos los cuales pueden comprender adicionalmente saborizantes naturales, saborizantes artificiales, micro y macro minerales, grasas animales, grasas vegetales, vitaminas, conservadores o medicamentos como antibióticos. Debe comprenderse que cuando se haga referencia en la siguiente especificación, incluyendo en las reivindicaciones adjuntas, a "alimento para cerdo", dicha referencia abarca alimentos "de transición" o "de partida" (que se utilizan para destetar lechones) y alimentos "de terminado" o "de crecimiento" (que se utilizan posterior a la etapa de transición del crecimiento del cerdo a una edad y/o tamaño adecuado para el mercado). Como se utiliza en la presente el término "aves de corral" se relaciona con aves domésticas como pollos, pollos tiernos, gallinas, gallos, pollos castrados, pavos, patos, aves de caza, polluelos o pollitos. Se puede hacer referencia a los alimentos para aves de corral como alimentos "completos" porque contienen toda la proteína, energía, vitaminas, minerales y otros nutrientes necesarios para el crecimiento apropiado, producción de huevo y salud de las aves. Sin embargo, los alimentos para aves de corral pueden comprender además vitaminas, minerales o medicamentos como coccidiostatos (por ejemplo Monensin sódica, Lasalocid,) Amprolium, salinomicina y sulfaquinoxalina) y/o antibióticos (por ejemplo penicilina, bacitracina, clortetraciclina y oxitetraciclina). Los pollos jóvenes o tiernos, pavos y patos que se conservan para producción de carne se alimentan de manera diferente de los pollos jóvenes que se utilizan para la producción de huevos. Los pollos tiernos, patos y pavos tienen cuerpos más grandes y ganan peso más rápidamente que los tipos de pollos que producen huevos. Por ello, estas aves son alimentadas con dietas con mayores niveles de proteína y energía. Debe comprenderse que cuando se haga referencia en la presente especificación, incluyendo en las reivindicaciones adjuntas, a "alimento para aves de corral" dicha referencia pretende incluir alimentos "iniciadores" (posterior a la salida del huevo), alimentos "de terminado", "de crecimiento" o "de desarrollo" (a partir de 6-8 semanas de edad hasta que alcancen el tamaño para el matadero) y alimentos "de capa" (que se dan durante la producción de huevo).

Los alimentos animales para uso en la presente invención están formulados par cumplir con las necesidades nutricionales del animal con respeto a, por ejemplo, la producción de carne, producción de leche, producción de huevo, reproducción y respuesta al estrés. Adicionalmente, los alimentos animales para su uso en la presente invención están formulados para mejorar la calidad de estiércol. En un aspecto preferido el alimento animal contiene una materia prima como una legumbre, por ejemplo un guisante o soya o un cereal, por ejemplo trigo, elote (maíz), centeno o cebada. De manera adecuada, la materia prima puede ser papa.

Almidón El almidón es la sustancia de reserva de alimento predominante en plantas y provee 70-80% de las calorías consumidas por los humanos , alrededor del mundo. El almidón, los productos derivados del almidón y la sacarosa constituyen la mayor parte del carbohidrato digerible en la dieta animal. La cantidad de almidón utilizada en la preparación de productos alimenticios supera en gran medida la cantidad de otros componentes alimenticios combinados. El almidón se presenta naturalmente como partículas discretas llamadas gránulos, los cuales son relativamente densos e insolubles. La mayor parte de los gránulos de almidón están compuestos de una mezcla de dos polímeros: un polisacárido 'esencialmente lineal llamado amilosa y un polisacárido altamente ramificado llamado amilopectina. La amilopectina es una molécula ramificada muy grande que consiste de cadenas de unidades de -D-glucopiranosilo por unidas por (1 ?4) enlaces, en donde dichas cadenas están unidas mediante enlaces a-D-(1 D6) para formar ramificaciones. La amilopectina está presente en todos los almidones naturales, y constituye alrededor de 75% de la mayor parte de los almidones comunes. Se conoce a los almidones que consisten en su totalidad de amilopectina como almidones cerosos, por ejemplo maíz ceroso (elote ceroso). La amilosa es esencialmente una cadena lineal de (1 D4) unidades de a-D- glucopiranosilo ligadas que tienen pocas ramificaciones a-D-(1 D6). La mayor parte de los almidones contienen alrededor de 25% de amilosa. Los gránulos de almidón sin dañar no son solubles en agua fría pero pueden saturarse inversamente de agua. Sin embargo, al calentarse, en presencia de agua, el orden molecular dentro de los gránulos de almidón se interrumpe. Este proceso se conoce como gelatinización. El calentamiento continuo de los granos de almidón en agua en exceso resulta en una hinchazón adicional y en un lixiviado adicional de componentes solubles. Al aplicar un esfuerzo cortante los gránulos se rompen y se forma una pasta. Al enfriarse, algunas moléculas de almidón vuelven a reasociarse, formando un precipitado o gel. Ese proceso se conoce como degeneración o retroceso. Las moléculas de almidón, como otras moléculas de polisacárido, se despolimerizan mediante hidrólisis para formar monosacáridos y oligosacáridos como la glucosa y la maltosa. Las enzimas como la amilasa y amiloglucosidasa (glucoamilasa) hidrolizan el almidón a D-glucosa. Las enzimas de desramificación, como isoamilasa o pulanasa hidrolizan los enlaces (1 D6) en amilopectina. Las ciclodextrina glucanotransferasas forman anillos de unidades de a-D-glucopiranosilo ligadas de (1 D4) a partir de amilosa y la amilopectina. Las propiedades funcionales de almidones naturales como la gelatinización, degeneración y formación de pasta pueden ser mejoradas mediante modificación. La modificación incrementa la capacidad de las pastas de almidón para soportar el calor y el ácido asociados con las condiciones de procesamiento e introducen funcionalidades específicas. Los almidones modificados son funcionales y son macroingredientes y aditivos para alimentos abundantes. Típicamente, las modificaciones se pueden hacer individualmente o en combinación como entrelazado o cadenas de polímero, derivación de no entrelazado y pregelatinización. Mejoras específicas que se pueden obtener incluyen una mayor solubilidad, inhibición de formación de gel, mejora en interacción con otras sustancias y mejora en propiedades de estabilización. Debe comprenderse que cuando se hace referencia en la presente especificación, incluyendo en las reivindicaciones adjuntas, a "almidón" se pretende incluir en dicha referencia al almidón natural y el almidón que ha sido parcial o totalmente modificado, por ejemplo estabilizado, entrelazado, pregelatinizado o derivado.

Almidón resistente El almidón resistente ha sido definido como "la suma de almidón y productos de degradación de almidón, que no son absorbidos en el intestino delgado de individuos sanos" (3). El almidón resistente es una mezcla heterogénea con por lo menos cuatro tipos principales: Almidón resistente 1 - almidón atrapado físicamente, que se encuentra en cereales, legumbres y granos molidos o masticados toscamente; Almidón resistente 2 - granulos de almidón resistentes o granulos de almidón sin gelatinizar que son altamente resistentes a la digestión de parte de a-amilasa hasta que son gelatinizados, por ejemplo el almidón crudo como el de papa no cocida, plátano verde y almidón de alta amilosa; Almidón resistente 3 - polímero de almidón degenerado (principalmente amilosa) que son producidos cuando se enfría el almidón después de su gelatinización. La amilosa degenerada es altamente resistente al ataque enzimático, mientras que la amilopectina degenerada es menos resistente y puede ser gelatinizada mediante recalentamiento; y Almidón resistente 4 - almidón químicamente modificado. Se puede manipular las cantidades de los cuatro tipos de almidones resistentes en los alimentos mediante técnicas de procesamiento de alimentos y práctica de reproducción de plantas (por ejemplo variantes de alta o baja amilosa de cereales y granos). Las cantidades de almidón que alcanzan el intestino grueso (colon) son influenciadas en gran medida por la naturaleza de la dieta de un animal (es decir, la cantidad y fuentes botánicas de almidón) y la influencia de un procesamiento en la preparación de alimentos que comprenden almidón. Como ejemplo, Goñi et al. (10) ha clasificado la cantidad de almidón resistente en materiales de alimento no cocidos como sigue: Los alimentos para uso en la presente invención pueden comprender almidón, que puede ser cualquiera de uno o más de los cuatro tipos de almidón resistente 1 -4 como se describieron anteriormente. Adicionalmente, los alimentos para uso en la presente invención pueden comprender almidón fácilmente degradable y/o almidón resistente como almidón encapsulado o almidón crudo. A la fecha, nadie ha sugerido el uso de un componente que comprende una enzima que tenga actividad de amilasa y que sea capaz de degradar el almidón resistente para su uso en un alimento que comprenda almidón. Como ejemplo, se puede hacer referencia a la siguiente enseñanza. uir et al (Am. J. Nutr. 1995, vol. 61 , páginas 82-89) enseñan los efectos de procesamiento de alimentos y diferentes variedades de maíz que afectan las cantidades de almidón que escapan a la digestión en el intestino delgado. En particular, enseña que los alimentos con contenido de almidón pueden ser manipulados para incrementar la cantidad de almidón que escapa a la digestión, por ejemplo, utilizando alta amilosa en vez de variedades normales de cereales o mediante un molido más grueso de los granos.

Amilasa Las enzimas adecuadas para su uso en la presente invención deben ser capaces de hidrolizar o degradar el almidón como almidón resistente y/o productos de degradación de almidón. En un aspecto, las enzimas para su uso en la presente invención son amilasas, es decir enzimas que son capaces de hidrolizar almidón a monosacáridos y/o oligosacáridos, y/o derivados del mismo (por ejemplo dextrina). Como se utiliza en la presente, el término "amilasa" se relaciona con una endoenzima como a-amilasa la cual participa en la trayectoria responsable para el desdoblamiento de almidón para reducir azúcares como monosacáridos u oligosacáridos, por ejemplo disacáridos como maltosa. En particular, a-amilasa cataliza la endohidrólisis de enlaces 1 ,4-a-glucosídicos con la producción de principalmente a-maltosa de la amilosa (un homopolímero de glucosa ligado mediante uniones de a(1 - 4) o amilopectina. Las alfa-amilasas tienen un valor comercial considerable, y se utilizan en las etapas iniciales (licuefacción) del procedimiento de almidón; en la producción de alcohol; como agentes de limpieza en matrices de detergente y en la industria textil para el descrudado de almidón. Las alfa-amilasas se producen mediante una gran variedad de microorganismos que incluyen ! Bacillus, Aspergillus y Thermomyces. Las amilasas más comerciales son producidas por B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, o B. stearothermophilus. En años recientes las enzimas preferidas para uso comercial provienen de B. licheniformis debido a su estabilidad al calor y desempeño, por lo menos en pH neutral y ligeramente alcalino. Preferiblemente, las amilasas se seleccionan de amilasa de Bacillus circulans F2, amilasa de Streptococcus bovis, amilasa de Cryptococcus S-2, amilasa de Aspergillus K-27, amilasa de Bacillus licheniformis y/o amilasa de Thermomyces lanuginosus.

Se han utilizado técnicas de ADN recombinante para explorar qué residuos son importantes para la actividad catalítica de amilasas y/o para explorar el efecto de modificar ciertos aminoácidos dentro del sitio activo de varias amilasas (Vihinen, M. et al. (1990) J. Bichem. 107:272; Holm, L. et al. 81990) Protein Engineering 3:181-191 ; Takase, K. et al. (1992) Biochemica et Biophysica Acta, 1120:281-288; Matsui, I. Et al. (1992) Febs Letters vol. 310, No. 3, pp. 216-218); cuáles residuos son importantes para la estabilidad térmica (Suzuki, Y. et al. (1989) j. Biol. Chem. 264:18933-18938); y un grupo ha utilizado tales métodos para introducir mutaciones en diversos residuos de histidina en una amilasa de B. lichenifornis (que se sabe es termoestable). Cuando se compara con otras amilasas de Bacillus similares, una amilasa de B. lichenifornis tiene un exceso de histidinas y, por ello, se sugirió que reemplazar una histidina podría afectar la estabilidad térmica de la enzima (Declerck, N. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:15481 -15488; FR 2 665 178-A1 ; Joyet, P. et al. (1992) Bio/Technology 10:1579-1583). Comercialmente, se pueden utilizar las enzimas de alfa-amilasa bajo condiciones radicalmente diferentes como condiciones tanto elevadas como bajas de pH, dependiendo de la aplicación comercial. Por ejemplo, se puede utilizar las alfa-amilasas en la licuefacción del almidón, un procedimiento que preferiblemente se lleva a cabo a un pH bajo (pH<5.5). por otro lado, se pueden utilizar las amilasas en detergentes comerciales para el cuidado de vajillas o lavandería, los cuales contienen frecuentemente oxidantes como blanqueador o perácidos, y que se utilizan en condiciones mucho más alcalinas. Para alterar la estabilidad o perfil de actividad de las enzimas de amilasa bajo condiciones variadas, se ha encontrado que el reemplazo, sustitución o deleción selectiva de aminoácidos oxidables como una metionina, triptofano, tirosina, histidina o cisteína resulta en un perfil alterado de la enzima vanante en comparación con su precursora. Debido que las amilasas comercialmente disponibles en la actualidad no son aceptables (estables) bajo varias condiciones, existe la necesidad de una amilasa que tenga una estabilidad alterada y/o perfil de actividad. Esta estabilidad alterada (perfil de desempeño oxidante, térmico o de pH) se puede lograr y simultáneamente mantener actividad enzimática adecuada, en comparación con la enzima de tipo silvestre o precursora. La característica que se ve afectada al introducir tales mutaciones puede ser un cambio en la estabilidad oxidante mientras se mantiene estabilidad térmica o viceversa. Adicionalmente, la substitución de diferentes aminoácidos por aminoácidos oxidables en la secuencia precursora de alfa-amilasa o la de lesión de uno o más aminoácido(s) oxidable(s) puede resultar en una actividad enzimática alterada en un pH diferente al que se considera óptimo para alfa-amilasa precursora. En otras palabras, las enzimas mutantes de la presente invención pueden también haber alterado, los perfiles de desempeño de pH, que puede deberse a la estabilidad oxidante potenciada de la enzima. Como se utiliza en la presente el término "amilasa" también se relaciona con todas las formas de enzimas de alfa-amilasa que incluyen mutantes de alfa-amilasa que son el producto dé expresión de una secuencia mutada de ADN que codifica una alfa-amilasa, en donde las alfa-amilasa mutantes, en general, se obtienen mediante modificación in vitro de una secuencia precursora de ADN que codifica una alfa-amilasa que se presenta naturalmente o recombinante para codificar la substitución o deleción de uno o más residuos de aminoácido en una secuencia precursora de aminoácido. Los organismos productores de amilasa incluyen animales, plantas, algas, hongos, arcabacteria y bacterias. Se han aislado y caracterizado los genes que codifican a-amilasa. Como ejemplo, EP-B-0470145 describe la secuencia de nucleótido de a-amilasa en plantas de papa, a-amilasa es codificada mediante una familia génica que consiste de por lo menos 5 genes individuales, los cuales, con base en su homología, se pueden dividir en 2 subfamilias, amilasa(s) de tipo 3 y amilasa(s) de tipo 1 . Por ejemplo, en plantas de papa los dos grupos de a-amilasa se expresan de manera diferente; las a-amilasa tipo 3 expresan en raíz, en tubérculos, en retoños y tejido de tallo; mientras que a-amilasa tipo 1 se expresan en retoños y tejidos de tallo. A la fecha nadie ha sugerido el uso de un componente que comprenda una enzima que tenga actividad de amilasa y que sea capaz de degradar el almidón resistente para su uso en un alimento que comprende almidón. Como ejemplo, se puede hacer referencia a las siguientes enseñanzas. Taniguchi et al. (26) describen una amilasa Bacillus circulans F2 que es mucho más eficiente para degradar el almidón natural de la papa a 37°C que la amilasa del páncreas porcino y la amilasa de Streptococcus bovis, las cuales se menciona tienen altas actividades sobre el almidón natural. Las 3 enzimas se desempeñan de manera muy similar sobre el almidón de maíz. La amilasa de Bacillus tiene un dominio de unión sobre el almidón crudo y la remoción proteolítica de este dominio reduce la actividad sobre el almidón de papa cruda a 17% (17). De igual manera, un dominio de unión de almidón crudo de una amilasa de Cryptococcus sp S-2 es esencial para su habilidad para unirse y degradar el almidón crudo (14). En trigo crudo y en almidón de maíz la amilasa de Cryptococcus tiene la misma actividad que la amilasa del páncreas porcino, mientras que la amilasa de Aspergillus oryzae tiene 15 veces menos actividad. En almidón de papa cruda la amilasa de Cryptococcus tiene 3 veces mayor actividad que la amilasa de páncreas porcino y más de 70 veces una mayor actividad que la amilasa Aspergillus oryzae. La amilasa Cryptococcus es termoestable (supervivencia de 50% después de 30 minutos a 80°C sin substrato y con 2nM de CaC ) y tiene >50% de actividad con un pH de 3 (pH óptimo a 6). En 1992, Gruchala y Pomeranz (12) mostraron una diferencia en la habilidad de diferentes amilasas para degradar el almidón resistente. Se coció amilomaíz para incrementar la cantidad de almidón resistente degenerado. Posteriormente se trató una cantidad conocida de almidón resistente con 2 amilasas diferentes durante 12 horas a 60°C, se filtró la suspensión y la cantidad residual de almidón se midió y comparó con un control (tratamientos sin adición de amilasa). Encontraron que una a-amilasa estable al calor de Bacillus licheniformis fue capaz de solubilizar 16% del almidón resistente, mientras que una amilasa de Aspergillus sp. K-27 solubilizó 41 % del almidón resistente.

Amilasas que degradan almidón crudo Las amilasas para uso en la presente invención incluyen amilasas que degradan almidón crudo. Las amilasas que degradan almidón crudo pueden comprender un dominio de unión de almidón y se ha encontrado que se comparan con la amilasa de páncreas porcino cuando degradan almidón crudo como el que se encuentra en el maíz silvestre y en el almidón de trigo, pero que es superior sobre la papa u otros almidones que son más resistentes a la degradación. Las ciclodextrina glicosil transferasa (CGTasa) degradan el almidón mediante la formación de ciclodextrinas, mediante hidrólisis y desproporcionalización/transglicosilación similares a amilasas convencionales. Se ha reportado que las CGTasas degradan el almidón crudo (25)(27). Se puede utilizar la amilasa maltogenica relacionada con CGTasa Novamyl™ (Novo Nordisk A/S) para la producción de maltosa a partir de almidón crudo (4). Adicionalmente, en algunas aplicaciones se pueden utilizar CGTasa para la licuefacción de almidón en vez de las amilasas de licuefacción como la amilása de B. Licheniformis (Termamyl , Novo Nordisk A/S) o la amilasa de B. Amyloliquefaciens. Una CGTasa derivada de Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes (Toruzyme™ Novo Nordisk A/S), es altamente termoestable y puede sobrevivir a 90°C durante horas en presencia de almidón. La amilasa de Aspergillus sp. K-27 y las amilasas de páncreas porcino degradan el trigo silvestre y el almidón de maíz de manera similar, mientras que la amilasa de Aspergillus sp. K-27 es mucho más eficiente que esta última enzima para degradar la papa natural y el almidón de maíz de alta amilosa (21 ). Amilasas adecuadas también pueden incluir amilasa de Pseudomonas saccharophila productora de maltotetroasa y Glucan 1 ,4-alfa-maltotetrahidrolasa homologas de EC 3.2.1 .60. Preferiblemente la enzima de amilasa se deriva y/o se aisla de la amilasa de Bacillus circulans F2, amilasa de Streptococcus bovis, amilasa de Cryptococcus S-2, amilasa de Aspergillus K-27, amilasa de Bacillus licheniformis y amilasa de Thermomyces lanuginosus. Se describen por ejemplo en la publicación WO 9601323 de la PCT amilasas de T. lanuginosus y en Enzyme Microbiol. Technol. (1992), 14, 1 12-1 16).

Actividad dé ámilasa Como se utiliza en la presente el término "actividad de amilasa" se relaciona con cualquier enzima capaz de hidrolizar o degradar almidón -como almidón resistente y/o productos de degradación de almidón. La habilidad de diferentes amilasas para degradar almidón resistente se puede medir mediante técnicas muy conocidas en el arte, como el método de Gruchala y Pomeranz (12) en donde se midió la cantidad residual de almidón después de la degradación con diferentes amilasas y proporcionó diferencias significativas. Típicamente se puede medir la actividad de amilasa sobre el almidón resistente utilizando métodos con base en, por ejemplo, Englyst et al. (9); (8), Silvester et al (24) y Morales et al. (18). Dichos métodos emplean un método de digestión in vitro que estimula el sistema digestivo humano previo al intestino grueso.

Dominio de unión de almidón La amilasa para su uso en la presente invención puede comprender un dominio de unión de almidón. Como se utiliza en la presente el término "dominio de unión de almidón" pretende definir todas las secuencias de polipéptidos o secuencias de péptidos que tienen afinidad de unión con el almidón. Los dominios de unión de almidón pueden incluir dominios de unión de almidón de unidad individual, dominios de unión de almidón aislados de microorganismos, como bacterias, hongos filamentosos o levaduras, o dominios de unión de almidón de una proteína de unión de almidón o una proteína diseñada y/o configurada para ser capaz de unirse con el almidón. Los dominios de unión de almidón pueden ser útiles como un polipéptido de dominio individual o como un dímero, un trímero o un polímero; o como parte de un híbrido de proteína. También se puede referir a un dominio de unión de almidón de unidad individual como un "dominio de unión de almidón aislado" o "dominio de unión de almidón separado". Un dominio de unión de almidón de unidad individual incluye hasta la parte completa de la secuencia de aminoácido de una enzima con contenido de dominio de unión de almidón de unidad individual, por ejemplo una enzima hidrolizante de polisacárido, que está esencialmente libre del dominio catalítico, pero que retiene el(los) dominío(s) de unión de almidón. Así, la secuencia de aminoácido catalítica completa de una enzima que degrada almidón (por ejemplo una glucoamilasa) u otras enzimas que comprenden uno o más dominio de unión de almidón no deben ser visualizadas como un dominio de unión de almidón de unidad individual. Un dominio de unión de almidón de unidad individual puede constituir uno o más dominios de unión de almidón de una enzima hidrolizante de polisacárido, uno o más dominios de unión de almidón de una proteína de unión de almidón o una proteína diseñada y/o conformada para ser capaz de unirse con el almidón.

Termoestable Preferiblemente la enzima que tenga actividad de amilasa y que sea capaz de degradar el almidón resistente es termoestable. Como se utiliza en la presente el término "termoestable" se relaciona con la capacidad de la enzima para retener actividad después de su exposición a temperaturas elevadas. Preferiblemente la enzima que tiene actividad de amilasa para su uso en la presente invención es capaz de degradar el almidón resistente a temperaturas de alrededor de 20°C a aproximadamente 50°C. De manera adecuada, la enzima retiene su actividad después de la exposición a temperaturas de hasta alrededor de 95°C. pH estable Preferiblemente la enzima que tiene la actividad de amilasa y que es capaz de degradar el almidón resistente tiene un pH estable. Como se utiliza en la presente el término "pH estable" se relaciona con la capacidad de la enzima para retener la actividad sobre una gran escala de pH. Preferiblemente, la enzima que tiene actividad de amilasa para su uso en la presente invención es capaz de degradar el almidón resistente en un pH de alrededor de 3 a aproximadamente 7.

Sustancialmente resistente a la inhibición de amilasa La enzima que tiene actividad de amilasa y que es capaz de degradar el almidón resistente puede ser sustancialmente resistente a la inhibición de amilasa. Un factor importante para la eficiencia de amilasas en la digestión de almidón es su susceptibilidad hacia los inhibidores de amilasa a partir de materiales de alimento. Al-Kahtan¡ ha reportado una inhibición significativa de una amilasa de Bacillus subtilis comercial así como de amilasa de páncreas porcino mediante extractos de fríjol de soya (1 ). Se ha reportado que el centeno contiene grandes cantidades de inhibidores de amilasa que son efectivos contra la amilasa del páncreas porcino asi como la amilasa de B. Licheniformis (7). Estructuralmente, la amilasa de B. Licheniformis está estrechamente relacionada con la amilasa de alimento de 8. Amyloliquefaciens. De igual manera, se ha reportado la presencia de inhibidores de amilasa en maíz y en muchas otras plantas para alimento (2). Como se utiliza en la presente el término "sustancialmente resistente a la inhibición de amilasa" se relaciona con la habilidad de la enzima para mantener un nivel de actividad suficiente para degradar parcial o totalmente el almidón resistente como el que se produce a partir de la degradación de un alimento que comprende almidón.

Capaz de degradar almidón resistente La enzima para su uso en la presente invención es capaz de degradar el almidón resistente. Como se utiliza en la presente "degradar" se relaciona con la hidrólisis parcial o completa o degradación de almidón resistente a monosacáridos - como glucosa y/o oligosacáridos, por ejemplo disacáridos -como maltosa y/o dextrinas. La enzima para su uso en la presente invención puede degradar el almidón resistente residual que no ha sido completamente degradado por la amilasa de un animal. Como ejemplo, la enzima para su uso en la presente invención puede ser capaz de ayudar a la amilasa de un animal (por ejemplo la amilasa pancreática -como la a-amilasa pancreática) para mejorar la degradación del almidón resistente. Se excreta la a-amilasa pancreática en el sistema digestivo de los animales. La a-amilasa pancreática degrada el almidón en el alimento. Sin embargo, una parte del almidón, el almidón resistente, no es degradada completamente por la a-amilasa pancreática y por ello no es absorbido por el intestino delgado (ver definición de almidón resistente). La enzima para su uso en la presente invención es capaz de ayudar a la a-amilasa pancreática a degradar el almidón en el sistema digestivo e incrementar así la utilización del almidón de parte del animal. Puede analizárse a habilidad de una enzima para degradar el almidón resistente por ejemplo mediante un método desarrollado y descrito por Megazyme International Ireland Ltd, para la medición de almidón resistente, almidón solubilizado y contenido total de almidón de una muestra (Resistant Starch Assay Procedure, AOAC Method 2002.02, AACC ethod 32-40).

Componente Adecuadamente el componente que comprende una enzima para su uso en la presente invención es un material alimenticio. Como se utiliza en la presente el término "material alimenticio" puede incluir ingredientes de alimento adecuados para consumo animal. Los ingredientes de alimento típico pueden incluir uno o más de un aditivo como una grasa animal o vegetal, un sazonador natural o sintético, antioxidante, modificador de viscosidad, aceite esencial y/o sabor, teñido y/o colorante, vitamina, mineral, aminoácido natural y/o no natural, nutriente, enzima adicional (incluyendo enzimas manipuladas genéticamente) un agente de unión como goma de guar o goma de xantano, solución reguladora de pH, emulsionante, lubricante, adyuvante, agente de suspensión, conservador, agentes de revestimiento o agente de solubilización y similares. Los componentes para su uso en la presente invención comprenden una enzima que tiene actividad de amilasa o es capaz de degradar el almidón resistente.' Típicamente los componentes de la presente invención se utilizan en la preparación de alimentos para consumo animal mediante la aplicación indirecta o directa de los componentes de la presente invención al alimento. Ejemplos de los métodos de aplicación que se pueden utilizar en la presente invención incluye, pero no se limitan a, revestimiento del alimento en un material que comprenda el componente, la aplicación directa al mezclar el componente con el alimento, rociar el componente sobre la superficie del alimento o sumergir el alimento en una preparación del componente. El componente de la presente invención preferiblemente se aplica al mezclar el componente con un alimento o al rociarlo sobre partículas de alimento para consumo animal. Alternativamente, se puede incluir el componente en la emulsión de un alimento, o en el interior de productos sólidos mediante inyección o revoltura.

Aplicación de componente El componente de la presente invención se puede aplicar para intercalar, revestir y/o impregnar un alimento con una cantidad controlada de una enzima que tiene actividad de amilasa o que es capaz de degradar el almidón resistente. También se pueden utilizar mezclas de componentes que comprenden una enzima y que se pueden aplicar por separado, de manera simultánea o en secuencia. También se pueden aplicar de manera similar agentes de quelación, agentes de unión, emulsionantes y otros aditivos como micro o macrominerales, aminoácidos, vitaminas, grasas animales, grasas vegetales, conservadores, saborizantes, colorantes al alimento de manera simultánea (ya sea en mezcla o por separado) o aplicados en secuencia.

Cantidad de componente La cantidad óptima del componente a ser utilizado en la presente invención dependerá del alimento a ser tratado y/o el método de poner en contacto el alimento con el componente y/o el uso que se pretenda para el mismo. La cantidad de enzima utilizada en el componente debe ser en una cantidad suficiente para que sea efectiva para degradar de manera sustancial el almidón resistente posterior a la ingestión y durante la digestión del alimento. Convenientemente, el componente que comprende la enzima permanecería efectivo después de la ingestión de un alimento para consumo animal y durante la digestión del alimento hasta obtener la digestión completa del alimento; es decir, el valor calorífico total del alimento se libera.

Preparación del alimento Se pueden preparar los alimentos mediante técnicas bien conocidas en la técnica, como las que se describen en la presente en el ejemplo 7. Una preparación particularmente adecuada de alimento para su uso en la presente invención es alimento que tiene la forma de pellas. Enzimas de amilasa particularmente adecuadas para su uso en la presente invención deben ser eficientes para degradar el alimento en pellas que comprende almidón resistente.

Medición de almidón resistente Se conocen bien en la técnica métodos para determinar la cantidad de almidón resistente a la hidrólisis. Por ejemplo, la presencia de una fracción de almidón resistente a la hidrólisis enzimática fue reconocida en primer lugar por Englyst et al en 1982 (Analyst, 107, p.307-318, 1982) durante su investigación sobre la medición de polisacáridos diferentes de almidón (1 ). Este trabajo fue empleado por Berry (J. cereal Science, 4, p.301 -304, 1986), quien desarrolló un procedimiento para la medición de almidón resistente que incorpora el tratamiento de -amilasa pululanasa empleado por Englyst et al (Analyst, 107, p.307-318, 1982), pero omitiendo el paso de calentamiento inicial a 100°C, para imitar de manera más cercana las condiciones fisiológicas. Bajo estas condiciones, los contenidos de almidón resistente medidos de las muestras fueron mucho más altos. Este hallazgo fuer posteriormente confirmado por Englyst et al (Am.J.CIin.Nutr, 42, p.778-787, 1985; Am.J.CIin.Nutr. 44, p.42-50, 1986; Am.J.CIin.Nutr. 45, p.423-431 , 1987) mediante estudios con sujetos con ileostomía saludable. A inicio de la década de 1990 se descubrió en su totalidad la importancia fisiológica del almidón resistente. Se desarrollaron diversos métodos nuevos/modificados durante el programa de investigación Europea EURESTA (Englyst et al, european J.CIin.Nutr, 48, suppl.2, S33-S50). El método de Champ (Eür.J.CIin.Nutr. 46, suppl.2, S51 -S62) se basó en modificaciones al método de Berry (J. Cereal Science, 4, P.301 -304, 1986) y dio una medición directa del almidón resistente utilizando a-am¡lasa pancreático en donde las incubaciones se llevaron a cabo con un pH de 6.9. Muir y O'Dea (Muir, J.G. & O'Dea, K. (1992)) Am. J. Clin. Nutr. 56, 123-127) desarrollaron un procedimiento en el cual se masticaban las muestras, se trataban con pepsina y posteriormente con una mezcla de a-amilasa pancreática y amiloglucosidasa en un baño de agua por agitación a pH 5.0, 37°C durante 15 horas. La pella residual (que contenía almidón resistente) se recuperaba mediante centrifugado, se lavaba con solución reguladora de acetato mediante centrifugado y el almidón resistente era digerido mediante una combinación de calor, DMSO y tratamientos de a-amilasa termoestables. De manera más reciente, estos métodos fueron modificados por Faisant eí al. (Faisant, N., Planchot, V., Kozlowski, F., M.-P.Pacouret, P. Colonna. & M. Champ. (1995) Sciences des Aliments, 15, 83-89), Goni eí al. (Goni, I., Garcia-Diz, E., Manas, E. & Saura-Calixto, F. (1996), Fd. Chem., 56, 445-449), Akerberg eí al. (Akerberg, A.K.E., Liljberg, G.M., Granfeldt, Y.E. Drews, A.W. & Bjorck, M.E. (1998), Am. Soc. Nutr. Sciences, 128, 651 -660) y Champ eí al. (Champ, M., Martin, L., Noah, L & Gratas, M. (1999) en "Complex carbohydrates in foods (S.S.Cho, L. Prosky & M. Dreher, Eds.) pp. 169-187. Marcel Dekker, Inc., New York, USA). Estas modificaciones incluyeron cambios en las concentraciones de enzima empleadas, tipos de enzima utilizadas, pretratamiento de muestra (masticado), pH de incubación y la adición (o no) de etanol después del paso de incubación de a-amilasa. Todas estas modificaciones tendrán algún efecto sobre el nivel determinado de almidón resistente en una muestra. Adicionalmente, Megazime International Ireland Ltd. Ha desarrollado un ensayo para la medición de almidón resistente, almidón solubilizado y contenido total de almidón en una muestra (Resistant Starch Assay Procedure, AOAC Method 2002.02, AACC Method 32-40).

Rendimiento animal En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con el uso de una enzima según se describe en la presente en la preparación de un alimento para mejorar el rendimiento animal. Como se utiliza en la presente, el término "mejorar el rendimiento animal" se refiere a, por ejemplo, mejorar una o más características de un animal -como mejorar el crecimiento o mejorar la conversión de alimento. El rendimiento animal se puede medir utilizando diversos métodos conocidos en la técnica, tales como medición de crecimiento, relaciones de conversión de alimentación, y/o ingestión. También la calidad de deyecciones, caso de muerte, cantidad de fosfato en huesos, etc. pueden ser medidos como parámetros de rendimiento animal. La invención se describirá ahora por medio de ejemplos, los cuales tienen la intención de servir para ayudar al experto en la técnica a llevar a cabo la invención y no pretenden de máhera alguna limitar el alcance de la invención.

EJEMPLOS 1. Prueba para determinar la actividad de enzimas candidatas que tienen actividad de amilasa en alimentos que comprenden almidón Se tomó materia prima para alimento tal como trigo, soya o maíz y se agregó enzima candidata además de enzimas digestivas típicas. Siguiendo la digestión in vitro, se determinó la cantidad de almidón resistente a partir de la cantidad de almidón residual (no digerido) y se comparó con aquella de un control en ausencia de una enzima amilasa candidata. 2. Determinación de la presencia de inhibidores de amilasa en materias primas de alimentos Se determinó el nivel de inhibición de muestras de candidatos de amilasa utilizando extractos de materias primas de alimentos y una prueba de amilasa estándar. Se agregó una cantidad incrementada de extracto de materias primas de alimentos a la prueba y se calculó el nivel de inhibición como una reducción en actividad de amilasa.

Protocolo para prueba de inhibidores de a-amilasa Definiciones Una unidad de actividad de amilasa cataliza la hidrólisis de enlaces glucosídicos de una micromol en un minuto bajo las condiciones descritas. La inhibición se mide en porcentaje y es la reducción relativa de actividad en comparación con la actividad de una solución de amilasa no inhibida.

Reactivos Substrato: Tableta de prueba de amilasa Phadebas para uso de diagnóstico in vitro (Pharmacia Diagnostics). Solución de reactivo: (9.0 g de cloruro de sodio, 2.0 g de albúmina de suero bovino y 2.2 g de cloruro de calcio disuelto en agua destilada hasta un volumen total de 1000 mi). Solución de reactivo doblemente concentrada: (9.0 g de cloruro de sodio, 2.0 g de albúmina de suero bovino y 2.2 g de cloruro de calcio disuelto en agua destilada hasta un volumen total de 500 mi). Extracto de material de prueba que contiene posibles inhibidores: (la muestra se tritura finamente y aproximadamente 2 g se mezclan con 10 mi de agua fría durante 10 minutos, posteriormente la suspensión es filtrada.) Solución de NaOH 0.5M.

Papel de filtro Espectrofotómetro para medir absorbancia a 640 nm Muestra de la enzima probada Procedimiento Muestra de enzima de prueba 0.2 mi de enzima diluida en solución de reactivo y 4.0 mi de solución de reactivo se introdujeron con pipeta en un tubo de ensayo y se equilibró a +37°C durante 5 minutos. La tableta de substrato se agregó con pinzas, se mezcló bien durante 10 segundos y se incubó a +37°C durante 15 minutos. El tiempo de inicio de la reacción se registró con la adición de la tableta. 1.0 mi de solución de NaOH 0.5M se agregó y se agitó bien. La solución se filtró o se centrifugó a 3500 rpm durante 10 minutos y se midió la absorbancia contra una preforma de reactivo a 620 nm. La absorbancia de la muestra de enzima estuvo generalmente entre 0.3-0.5.

Prueba de inhibición Se realizó el mismo procedimiento descrito anteriormente para muestras de enzima de prueba, sin embargo, se utilizaron 2.0 mi de solución de reactivo doblemente concentrada y 2.0 mi de extracto de material de prueba que contiene posibles inhibidores en lugar de 4.0 mi de solución de reactivo.

Preforma de reactivo 4.2 mi de solución de reactivo se equilibraron a +37°C durante 5 minutos. La tableta de substrato se agregó con pinzas, se agitó bien durante 10 segundos, luego se incubó a +37°C durante 15 minutos. Se añadieron 1.0 mi de solución de NaOH 0.5M y se agitó bien. La solución se filtró o centrifugó a 3500 rpm durante 10 minutos.

Cálculo La absorbencia de la muestra fue proporcional a la actividad de a-amilasa. La actividad de cada dilución enzimática se determinó a partir del cuadro calibrado adjunto al equipo de tableta. La actividad de amilasa de la muestra se calculó de la siguiente manera: Actividad (U/g) = Act * DF 000 en donde Act = valor de la actividad de amilasa (expresado U/litro) de dilución de enzima leído de la tableta de prueba de amilasa Phadebas Df = factor de dilución (ml/g) 1000 = factor para conversión de litro a mi. La actividad se calculó tanto para la enzima pura como para muestras de prueba que contienen extracto de material. La inhibición del extracto se determinó como la reducción en actividad cuando el extracto se añadió como un porcentaje de la actividad de la enzima pura.

Inhibición = Actividad de enzima con extracto Actividad de enzima pura * 100% 3. Determinación de la cantidad de almidón resistente Muestras almidón que tienen bajo contenido de agua se molieron para pasar a través de un tamiz de 1 mm. Las muestras que tienen un contenido de grasa de >5% fueron desgrasadas (utilizando extracción de petróleo-éter) antes de molienda. Las muestras luego se homogeneizaron y colocaron directamente en tubos de centrífuga para análisis. Se colocaron 100 mg de muestra molida seca en un tubo de centrífuga de 50 mi y se agregaron 10 mi de regulador de KCI-HCI pH 1.5 (ajuste con HCI 2 M o NaOH 0.5M). Para muestras húmedas, se agregó una porción que pesa el equivalente a 100 mg de materia seca a regulador de KCL-HCI pH 1.5, se homogeneizó y se colocó en un tubo de centrífuga. Se agregaron 0.2 mi de solución de pepsina (1 pepsína/10 mi de regulador de KCI-HCI), se mezclaron y el tubo se dejó en un baño de agua a 40°C durante 60 minutos con agitación constante. Después de incubación a 40°C, las muestras se removieron y se dejaron enfriar a temperatura ambiente. Se añadieron 9 mi de regulador de Tris-maleato 0.1 M, pH 6.9 (ajuste de pH con HCI 2 M o NaOH 0.5M) y 1 mi de la solución a-amilasa (40 mg de a-amilasa por mi de regulador de Tris-maleato). Después de mezclado, las muestras se incubaron durante 16 horas en un baño de agua a 37°C con agitación constante. Las muestras se centrifugaron posteriormente (15 minutos, 3000 g) y se descartaron los sobrenadantes. Se agregaron 3 mi de agua destilada al residuo, humectando cuidadosamente la muestra. Se agregaron 3 mi de KOH 4 M y las muestras se mezclaron y se dejaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación constante. Se añadieron 5.5 mi de HCI 2 M y 3 mi de regulador dé acetato de sodio 0.4 M, pH 4.75 (ajuste de pH con HCI 2 M o NaOH 0.5M) seguido de 80 µ? de amiloglucosidasa. Después de mezclado, las muestras se dejaron durante 56 minutos en un baño de agua a 60°C con agitación constante. Las muestras se centrifugaron (15 minutos, 3000 g), y se recolectó el sobrenadante. Los residuos se lavaron por lo menos una vez con 10 mi de agua destilada, se centrifugaron nuevamente y el sobrenadante se combinó con aquel previamente obtenido. 3.1 Preparación de una curva estándar para determinar concentraciones de glucosa (10-60 ppm) 0.5 mi de agua, muestra y estándar se introdujeron con pipeta en tubos de ensayo. Se agregó 1 mi del reactivo de un equipo de determinación de glucosa (GOD-PAP). Las soluciones se mezclaron y se dejaron durante 30 minutos en un baño de agua a 37°C. Entre 5 y 45 minutos después de incubación, se leyó la absorbancia de las muestras y estándares a 500 nm contra una preforma de reactivo. La concentración de glucosa de las muestras se calculó utilizando una curva estándar construida a partir de las absorbencias de estándares que tienen concentraciones de glucosa conocidas (10-60 ppm). La concentración de almidón resistente de la muestra de prueba se calculó como mg de glucosa x 0.9. 4. Medición de almidón resistente en almidones puros y materiales vegetales 4.1 Preparación de muestras de prueba 50 g de muestra de grano o malta se trituró en un molino de trituración para pasar a través de un tamiz de 1 .0 mm. Se desmenuzaron muestras frescas (por ejemplo frijoles enlatados, plátano, papas) en un desmenuzador de carne manualmente operado para pasar a través de un tamiz de 4 mm. El contenido de humedad de muestra seca se determinó a través del método AOAC 925.10 (14), y aquél de muestras frescas se determinó mediante liofilización seguido por secado en horno de acuerdo con el método AOAC 925.10. 4.2 Medición de almidón resistente 100 mg de muestras se pesaron directamente en tubos con tapa roscada. Se añadieron a cada tubo 4.0 mi de a-amilasa pancreática (10 mg/ml) que contiene AMG (3 U/ml) en regulador de maleato de sodio (pH 6). Después de mezclado, las muestras se incubaron a 37°C con agitación continua (200 carreras/mih). Después de 16 horas, las muestras se trataron con 4.0 mi de IMS (99% v/v) y se centrifugaron a 3,000 rpm durante 10 min. Los sobrenadante se decantaron y las pellas se resuspendieron en 2 mi de IMS al 50% con agitación vigorosa en un mezclador de molino. Se agregaron y se mezclaron 6 mi de IMS al 50%, y los tubos se centrifugaron a 3,000 rpm durante 10 min. Se repitió el paso de suspensión y centrifugación. Se añadieron 2 mi de KOH 2 M a cada tubo y las pellas se resuspendieron (disolviendo el almidón resistente) agitando durante aproximadamente 20 minutos en un baño de hielo/agua. Cada tubo se trató con 8 mi de regulador de acetato de sodio 1 .2 M (pH 3.8) con agitación. Se agregó 0.1 mi de AMG (3200 U/ml) inmediatamente y los tubos se colocaron en un baño de agua a 50°C durante 30 minutos con mezclado continuo. Las muestras que contienen >10% de almidón resistente se transfirieron a un matraz volumétrico de 100 mi (utilizando un frasco lavador de agua) y se ajustaron a volumen con agua. Las alícuotas de la solución se centrifugaron a 3,000 rpm durante 10 min. Las muestras que contienen <10% de almidón resistente (sin dilución) se centrifugaron a 3,000 rpm durante 10 min. 0.1 mi de alícuotas (por duplicado) de cualquiera de los sobrenadantes diluidos o no diluidos se transfirieron en tubos de ensayo de vidrio (16 x 100 mm), se trataron con 3.0 mi de reactivo de GOPOD (mezcla de regulador de glucosa oxidasa-peroxidasa-aminoantipirina - una mezcla de glucosa oxidasa, >12000 U/L; peroxidasa, >650 U/L; y 4-aminoantipirina, 0.4 mM en regulador de fosfato pH 7.4) y se incubaron a 50°C durante 20 minutos. Las soluciones de preforma de reactivos se prepararon al mezclar 0.1 mi de regulador de acetato de sodio 0.1 M (pH 4.5) y 3.0 mi de reactivo GOPOD. Los estándares de glucosa se prepararon (por cuadruplicado) al mezclar 0.1 mi de glucosa (1 mg/ml) y 3.0 mi de reactivo de GOPOD. Después de incubación a 50°C durante 20 minutos, se midió la absorbancia de cada solución a 510 nm contra la preforma de reactivo. 4.3 Cálculos El contenido de almidón resistente (%, sobre una base de peso seco) en muestras de prueba se calculó de la siguiente manera: Para muestras que contienen >10% de almidón resistente: = ?? x F x 100/0.1 x 1/100 x 100/W x 162/180 = ?? x F/W x 90. Para muestras que contienen <10% de almidón resistente: = ?? x F x 10.3/0.1 x 1/1000 x 100/W x 162/180 = ?? x F/W x 9.27. en donde: ??= absorbancia (reacción) leída contra la preforma de reactivo; F = conversión de absorbancia a microgramos = 100 ^g de glucosa)/absorbancia de 100 µg de glucosa; 100/0.1 = corrección de volumen (0.1 mi tomados de 100 mi); 1/1000= conversión de microgramos a miligramos; W= peso seco de muestra analizada [= peso "tal cual" x (100-contenido de humedad)/100]; 100/W= factor para presentar almidón como un porcentaje de peso de muestra; 162/180 = factor para convertir de glucosa libre, según lo determinado, en anhidro-glucosa como ocurre en almidón; 10.3/0.1 = corrección de volumen (0.1 mi tomados de 10.3 mi) para muestras que contienen 0-10% de almidón resistente en donde la solución de incubación no se diluye y el volumen final es - 10.3 mi. 5. Medición de almidón puro degradado En este ejemplo, se determinó la capacidad de ayudar a la oc-amilasa pancreática a degradar almidón puro de dos enzimas que tienen actividad de amilasa. Las enzimas eran amilasa de Bacillus amyloloquefaciens (LTAA, Genecor International Inc.) y amilasa de Thermomyces lanuginosus, descritas en el documento WO9601323. 5.1 Principio Este análisis se basa en el equipo de prueba de almidón resistente (Cat. No. K-RSTAR) de Megazyme (Megazyme International Ireland Limited). El principio del procedimiento de prueba de almidón resistente (Método AOAC 2002.02 Método AACC 32-40) ha sido modificado para los propósitos de este ejemplo, de modo que el tiempo de incubación sea solamente de 1 .5 horas en lugar de 16 horas. Las muestras se incubaron en un baño de agua con agitación con a-amilasa pancreática y amiloglucosidasa (AMG) y opcionalmente con amilasa de Bacillus amyloloquefaciens (LTAA, Genencor International Inc.) o amilasa de Thermomyces lanuginosus durante 1 .5 horas a 37°C, tiempo durante el cual, el almidón se solubilizó e hidrolizó en glucosa por la acción combinada de las enzimas. La reacción se terminó con la adición de un volumen igual de alcoholes metilados industriales (IMS, etanol desnaturalizado). El almidón solubilizado en el sobrenadante se hidrolizó cuantitativamente a glucosa con AMG. La glucosa se midió con reactivo de oxidasa/peroxidasa (GOPOD). Esta es una medición directa del contenido de almidón solubilizado de la muestra. Las unidades de amilasa de Bacillus amyloloquefaciens (LTAA) o amilasa de Thermomyces lanuginosus se midieron a través de la prueba de amilasa Phadebas® (Pharmacia & Upjohn). 5.2 Medición de almidón fácilmente deqradable 100 mg de muestras se pesaron directamente en tubos con tapa roscada (tubo de cultivo Corning; 16 x 125 mm). 4.0 mi de a-amilasa pancreática (10 mg/ml) que contiene AMG (3 U/ml), y opcionalmente 0.4 U en total de amilasa de B. amyloloquefaciens o amilasa de T. lanuginosus en regulador de maleato de sodio se agregaron a cada tubo. Después de mezclado, las muestras se incubaron a 37°C con agitación constante (200 carreras/min) durante 1.5 horas. Después de 1 .5 horas, las muestras se trataron con 4.0 mi de IMS (99% v/v) con agitación vigorosa en un mezclador de remolino y se centrifugaron a 3,000 rpm durante 20 minutos. Los sobrenadantes se decantaron en matraces volumétricos de 100 mi y se llenaron hasta 100 mi de agua desmineralizada. Se tomó una muestra de 2 mi y 0.2 mi de AMG (3200 U/ml) se agregaron a la misma. Los tubos se colocaron en un baño de agua a 50°C durante 30 minutos con mezclado continuo. 0.1 mi de alícuotas de cualquiera de los sobrenadantes diluidos o no diluidos se transfirieron en tubos de ensayo de vidrio (16 x 100 mm), se trataron con 3.0 mi de reactivo de GOPOD y se incubaron a 50°C durante 20 minutos. Se prepararon soluciones de preforma de reactivo al mezclar 0.1 mi de regulador de acetato de sodio 0.1 M (pH 4.5) y 3.0 mi de reactivo de GOPOD. Se prepararon estándares de glucosa (por cuadruplicado) al mezclar 0.1 mi de glucosa (1 mg/ml) y 3.0 mi de reactivo de GOPOD. Después de incubación a 50CC durante 20 minutos, se midió la absorbancia de cada solución a 510 nm contra agua. 5.3 Cálculos El contenido de almidón el cual ha sido solubilizado (%, sobre una base de peso seco) en las muestras se calculó de la siguiente manera: = ?? x G x D x 100/0.1 x 1 .1 x 1/1000 x 100/W x 162/180 = ?? x (G x D)/W x 99. en donde: ?? = absorbancia (reacción) leída contra la preforma de reactivo; G = conversión de absorbancia a microgramos = 100 (µ? de glucosa)/absorbancia de 100 de glucosa; D = diluciones del sobrenadante; 100/0.1 = corrección de volumen (0.1 mi tomados de 100 mi); 1 .1 = dilución cuando se agrega AMG a la muestra después de 1.5 horas de incubación, 1 /1000 = conversión de microgramos a miligramos; 162/180 = factor para convertir de glucosa libre, según se determina, a anhidro-glucosa como ocurre en almidón. 5.4 Los resultados Primeramente, se analizó la acción de amilasa de B. amyloloquefaciens y se comparó con una referencia que contiene solamente una a-amilasa pancreática y amiloglucosidasa (AMG). La cantidad (%) de almidón soluble en las muestras después del tratamiento, se presenta en el cuadro 1 .

CUADRO 1 Promedio Estos resultados indican que LTAA no tiene algún efecto aditivo para degradar almidón insolubie en comparación con a-amilasa pancreática y AMG solas. En segundo lugar, se analizó la acción de amilasa de B. amyloloquefaciens y se comparó con la acción de amilasa de T. Lanuginosus. La cantidad (%) de almidón soluble en las muestras después del tratamiento de amilasa de B. amyloloquefaciens y amilasa de T. lanuginosus se presenta en el cuadro 2.

CUADRO 2 Estos resultados indican que amilasa de T. lanuginosus tiene un efecto aditivo para degradar almidón insolubie (los promedios son una diferencia importante con un nivel de confianza de 99%). 6. Preparación de alimento animal Un alimento típico se preparó a partir de los siguientes ingredientes: Maíz 57.71 % Alimento de grano de soya 48 31.52% Aceite de soya 6.30% NaCI 0.40% DL Metionina 0.20% Fosfato dicálcico 1.46% Mezcla de vitamina/mineral 1.25% Total 100% La mezcla de alimentos se calentó al inyectar vapor para dar una temperatura de 80°C durante 30 segundos y después formarse en pellas en un formador de pellas. Las pellas se secaron posteriormente. Este procedimiento es típico en la industria alimenticia para obtener un alimento en pellas. 7. Efecto de la adición de enzimá amilasa a alimento animal que comprende almidón 7.1 Prueba de alimentación - Cerdos Dietas Cerdos de control se alimentaron con una dieta comercial, mientras que se proveyeron 5 dietas experimentales con 1-10 U de amilasas exógenas por gramo de alimento para ganado. Las dietas se ofrecieron sobre una base ad libitum. El agua también estuvo disponible ad libitum de abrevaderos de boquilla localizados en cada una de los corrales de retención. Cada dieta tuvo una fase iniciadora y de crecimiento. Los cerdos fueron asignados a uno de los 6 tratamientos y cada combinación de dieta (iniciadora y de crecimiento) se alimentó a 6 réplicas.

Animales/alojamiento Se utilizaron 36 lechones hembra obtenidos en destete (escala de peso vivo 7.5 - 9kg) de una unidad comercial. Los cerdos se alojaron en corrales individuales.

Procedimiento A la llegada, los animales se pesaron individualmente, se transfirieron inmediatamente a la unidad experimental, se alojaron en el corral de retención debidamente numerado y fueron asignados a un control o una dieta iniciadora experimental. Posteriormente, los cerdos se pesaron cada 7 días. Los cerdos se alimentaron sobre una base ad libitum y el alimento de ganado consumido a partir del día 0 se registró sobre una base semanal. Cuando los cerdos pesaron 16.0kg. o más, se transfirieron a una dieta de crecimiento. La ingestión de alimento y peso se registró semanalmente. Los animales fueron inspeccionados dos veces al día al momento de la alimentación. Se registró la salud, limpieza y cualquier otra observación relevante. La prueba concluyó cuando los lechones alcanzaron un peso 27.5kg. De esta manera, se determinó la velocidad de crecimiento, la ingestión de alimento y relación de conversión de alimento en lechones entre aproximadamente 10 y 25 kg. de peso vivo.

Conclusión Los animales alimentados con dietas experimentales que contiene amilasa degradante de almidón resistente mostraron una disminución notable en relación de conversión de alimentación (FCR) que indica que se necesita menos alimento para lograr un incremento de peso determinado en comparación con controles. Los cerdos alimentados con dietas experimentales también mostraron un incremento notable en velocidad de crecimiento y una disminución en ingestión de alimento. 7.2 Prueba de alimentación - Pollos tiernos Dietas Animales de control se alimentaron con una dieta comercial, mientras que se suministraron 5 dietas experimentales con 1 -10 U de amilasas exógenas por gramo de alimento para ganado. Las dietas se ofrecieron sobre una base ad libitum. El agua estuvo disponible ad litíum. Cada dieta tuvo una fase iniciadora y de crecimiento.

Animales Los pollos tiernos fueron asignados a una de las 6 dietas y cada combinación de dieta (iniciadora y de crecimiento) se dio a 8 réplicas de 42 animales cada una. Los animales se inspeccionaron regularmente. Se registró la salud, limpieza y cualquier otra observación relevante.

Procedimiento A la llegada, los animales se pesaron, se transfirieron inmediatamente a la unidad experimental, se alojaron en el corral de retención debidamente numerado y fueron asignaron a una dieta experimental. Los pollos tiernos se pesaron después de 20 y 40 días. También se registró el uso de alimento para ganado después de 20 y 40 días. Se determinó la velocidad de crecimiento, ingestión de alimento y relación de conversión de alimentación.

Conclusión Los animales alimentados con dietas experimentales que contiene amilasa degradante de almidón resistente mostraron un disminución notable en relación de conversión de alimentación (FCR) que indica que se necesita menos alimento para alcanzar un incremento de peso determinado en comparación con controles. Los pollos tiernos alimentados con dietas experimentales también mostraron un incremento notable en velocidad de crecimiento y una disminución en ingestión de alimento.

Aspectos breves de la invención En un aspecto amplio, la presente invención se refiere a un componente para uso en un alimento que comprende almidón en donde dicho componente comprende una enzima; en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar almidón resistente. En otro aspecto amplio, la presente invención se refiere a un método para degradar almidón resistente en un alimento que comprende poner en contacto dicho almidón resistente con un enzima que tiene actividad de amilasa y que es capaz de degradar dicho almidón resistente.

Otros aspectos de la invención Ahora se describirán otros aspectos de la presente invención por medio de párrafos numerados. 1. Un componente para uso en un alimento que comprende almidón en donde dicho componente comprende un enzima; en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar almidón resistente y en donde la enzima comprende una o más de las siguientes características: a. un dominio de unión a almidón b. es termoestable c. es de pH estable d. es sustancialmente resistente a inhibidores de amilasa. 2. Un componente de conformidad con el párrafo 1 , en donde la enzima comprende un dominio de unión a almidón. 3. Un componte de conformidad con el párrafo 1 o párrafo 2, en donde la enzima es termoestable. 4. Un componte de conformidad con los párrafos 1 , 2 ó 3, en donde la enzima es de pH estable. 5. Un componte de conformidad con cualquiera de los párrafos anteriores, en donde la enzima es sustancialmente resistente a inhibidores de amilasa. 6. Un componte de conformidad con cualquiera de los párrafos anteriores, en donde la enzima es una enzima degradante de almidón crudo. 7. Un componte de conformidad con cualquiera de los párrafos anteriores, en donde la enzima es una ciclodextringlicosiltransferasa (CGTasa). 8. Un componte de conformidad con el párrafo 7, en donde la (CGTasa) se deriva de Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes. 9. Un componte de conformidad con el párrafo 7 o párrafo 8, en donde la (CGTasa) es Toruzyme™. 10. Un componte de conformidad con el párrafo 7, en donde la (CGTasa) es una amilasa maltogénica tal como Novamyl™. 11 . Un componte de conformidad con el párrafo 1 , en donde la enzima es una enzima amilasa seleccionada del grupo que consiste en amilasa de Bacillus circulans F2, amilasa de Streptococcus bovis, amilasa de Cryptococcus S-2, amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa de Aspergillus K-27, amilasa de Bacillus licheniformis, amilasa de Bacillus subtilis y amilasa de Bacillus amyloliquefaciens. 12. Un componte de conformidad con el párrafo 1 1 , en donde la enzima es una amilasa de licuefacción tal como amilasa de Bacillus licheniformis (Termamyl) o amilasa de Bacillus amyloliquefaciens. 13. Un componente para uso en un alimento de conformidad con cualquiera de los párrafos anteriores, en donde el alimento es un alimento para cerdos o aves de corral. 4. Un componente para uso en un alimento de conformidad con el párrafo 13, en donde el alimento es una materia prima tal como una legumbre o un cereal. 15. Un alimento que comprende un almidón o una enzima; en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar almidón resistente y en donde la enzima comprende una o más de las siguientes características: a. un dominio de unión a almidón b. es termoestable c. es de pH estable d. es sustancialmente resistente a inhibidores de amilasa. 16. Un alimento de conformidad con el párrafo 15, en donde la enzima comprende un dominio de unión a almidón. 17. Un alimento de conformidad con el párrafo 15 ó párrafo 16, en donde la enzima es termoestable. 18. Un alimento de conformidad con los párrafos 15, 16 ó 17, en donde la enzima es de pH estable. 19. Un alimento de conformidad con cualquiera de los párrafos 15 a 18, en donde la enzima es sustancialmente resistente a inhibidores de amilasa. 20. Un alimento de conformidad con cualquiera de los párrafos 15 a 19, en donde la enzima es una enzima degradante de almidón crudo. 21. Un alimento de conformidad con cualquiera de los párrafos 15 a 20, el cual es un alimento para cerdos o aves de corral. 22. Un alimento de conformidad con el párrafo 21 , el cual es una materia prima tal como una legumbre o un cereal. 23. Un método para degradar almidón resistente en un alimento que comprende poner en contacto dicho almidón resistente con una enzima que tiene actividad de amilasa y que es capaz de degradar dicho almidón resistente en donde la enzima comprende una o más de las siguientes características: a. un dominio de unión a almidón b. es termoestable c. es de pH estable d. es sustancialmente resistente a inhibidores de amilasa. 24. Un método de conformidad con el párrafo 23, en donde la enzima comprende un dominio de unión a almidón. 25. Un método de conformidad con el párrafo 23 o párrafo 24, en donde la enzima es termoestable. 26. Un método de conformidad con los párrafos 23, 24 ó 25, en donde la enzima es de pH estable. 27. Un método de conformidad con cualquiera de los párrafos 23 a 26, en donde la enzima es sustancialmente resistente a inhibidores de amilasa. 28. Un método de conformidad con los párrafos 23 a 27, en donde la enzima es una enzima degradante de almidón crudo. 29. Un método de conformidad con los párrafos 23 a 28, en donde el alimento es un alimento para cerdos o aves de corral. 30. Un método de conformidad con el párrafo 29, en donde el alimento es una materia prima tal como una legumbre o un cereal. 31. El uso de una enzima en la preparación de un alimento que comprende un almidón, para degradar almidón resistente, en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar dicho almidón resistente y en donde la enzima comprende una o más de las siguientes características: a. un dominio de unión a almidón b. es termoestable c. es de pH estable d. es sustancialmente resistente a inhibidores de amilasa. 32. El uso de una enzima en la preparación de un alimento que comprende un almidón, para mejorar la cantidad de energía que se deriva de dicho alimento, en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar almidón resistente. 33. Un procedimiento para preparar un alimento que comprende combinar un almidón y una enzima, en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar almidón resistente. 34. Un procedimiento para identificar un componente para uso en un alimento, en donde dicho componente comprende una enzima, dicho procedimiento comprende poner en contacto almidón resistente con un componente candidato y determinar el alcance de degradación de dicho almidón resistente, en donde dicha enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar dicho almidón resistente y en donde la enzima comprende una o más de las siguientes características: a. un dominio de unión a almidón b. es termoestable c. es de pH estable d. es sustancialmente resistente a inhibidores de amilasa. Todas las publicaciones mencionadas en la especificación anterior se incorporan a la presente como referencia. Diversas modificaciones y variaciones de los métodos y sistemas descritos de la invención serán evidentes para los expertos de la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención ha sido descrita con relación a modalidades preferidas específicas, se entenderá que la invención como se reclama no debe ser indebidamente limitada a dichas modalidades específicas. Desde luego, se pretende que diversas modificaciones de los modos descritos para realizar la invención los cuales son obvios para los expertos en la técnica, estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un componente para uso en un alimento que comprende almidón en donde dicho componente comprende una enzima; en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar almidón resistente. 2.- El componente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la enzima es termoestable. 3.- El componente de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado además porque la enzima es de pH estable. 4.- El componente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la enzima es una enzima degradante de almidón crudo. 5.- El componente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la enzima es una enzima amilasa seleccionada del grupo que consiste en amilasa de Bacillus circulans F2, amilasa de Streptococcus bovis, amilasa de Cryptococcus S-2, amilasa de Aspergillus K-27, amilasa de Bacillus licheniformis y amilasa de Thermomyces lanuginosus. 6.- El componente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el alimento es un alimento para cerdos o aves de corral. 7. - El componente de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el alimento es una matena prima tal como una legumbre o un cereal. 8. - Un alimento que comprende un almidón y una enzima; en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar almidón resistente. 9. - El alimento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la enzima es termoestable. 10. - El alimento de conformidad con la reivindicación 8 o reivindicación 9, caracterizado además porque la enzima es de pH estable. 1 1 . - El alimento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado además porque la enzima es una enzima degradante de almidón crudo. 12. - El alimento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 1 1 , caracterizado además porque es un alimento para cerdos o aves de corral. 13. - El alimento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque es una materia prima tal como una legumbre o un cereal. 14.- Un método para degradar almidón resistente en un alimento que comprende poner en contacto dicho almidón resistente con una enzima que tiene actividad de amilasa y que es capaz de degradar dicho almidón resistente. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la enzima es termoestable. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 14 o reivindicación 15, caracterizado además porque la enzima es de pH estable. 17.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado además porque la enzima es una enzima degradante de almidón crudo. 18. - El método de conformidad con las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado además porque de alimento es un alimento para cerdos o aves de corral. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el alimento es una materia prima tal como una legumbre o un cereal. 20. - El uso de una enzima en la preparación de un alimento que comprende un almidón, para degradar almidón resistente, en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar dicho almidón resistente. 21. - El uso de una enzima en la preparación de un alimento para mejorar el valor calorífico de dicho alimento, en donde la enzima tiene la actividad de amilasa y es capaz de degradar almidón resistente. 22. - El uso de una enzima en la preparación de un alimento para mejorar el rendimiento animal, en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar almidón resistente. 23.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en donde la enzima es termoestable. 24 - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde la enzima es de pH estable. 25 - Un procedimiento para preparar un alimento que comprende combinar un almidón y una enzima, en donde la enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar almidón resistente. 26 - Un procedimiento para identificar un componente para uso en un alimento, en donde dicho componente comprende una enzima, dicho procedimiento comprende poner en contacto almidón resistente con un componente candidato y determinar el alcance de degradación de dicho almidón resistente; en donde dicha enzima tiene actividad de amilasa y es capaz de degradar dicho almidón resistente. 27. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 25 o reivindicación 26, caracterizado además porque la enzima es termoestable. 28. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, caracterizado además porque la enzima es de pH estable. 29. - Un componente sustancialmente como se describe en la presente y con referencia a los ejemplos anexos. 30. - Un alimento sustancialmente como se describe en la presente y con referencia a los ejemplos anexos. 31. - Un uso sustancialmente como se describe en la presente y con referencia a los ejemplos anexos. 32.- Un procedimiento para preparar un alimento sustancialmente como se describe en la presente y con referencia a los ejemplos anexos. 33 - Un procedimiento para identificar un componente para uso en un alimento sustancialmente como se describe en la presente y con referencia a los ejemplos anexos.