MXPA04004998A - Metodos para tratar cancer mediante la utilizacion de una combinacion de un antagonista del factor inhibidor de celula dentritica derivado de tumor y un antagonista del receptor de tipo toll. - Google Patents

Abstract

Las celulas dentriticas (CD) juegan un papel importante en las respuestas inmunes antigeno-especificas; se proporcionan materiales y metodos para tratar estados enfermos, incluido cancer al activar las celulas dentriticas del hospedero, las cuales se vuelven hiposensibles a los estimulos de la activacion por la enfermedad; en particular, se proporcionan metodos para tratar cancer en un mamifero que comprende la administracion a dicho mamifero de una cantidad efectiva de un antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor en combinacion con una cantidad efectiva de un antagonista receptor de tipo Toll (TLR).

Description

METODOS PARA TRATAR CANCER MEDIANTE LA UTILIZACION DE UNA COMBINACION DE UN ANTAGONISTA DEL FACTOR INHIBIDOR DE CELULA DENDRITICA DERIVADO DE TUMOR Y UN AGONISTA DEL RECEPTOR DE TIPO TOLL CAMPO DE LA INVENCION La invención se relaciona con métodos para la manipulación y activación de células dendriticas (CD) en el tratamiento de estados enfermos, especialmente cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las células dendriticas (CD) comprenden un papel crucial en el inicio y modulación de respuestas inmunes innatas y adaptativas (Banchereau ef al. , 1998 Nature, 392:245-252). En el contexto del cáncer, las células dendriticas son capaces de mostrar y presentar los antígenos de tumor y sensibilizar las células T citotóxicas específicas de tumor (Chiodini ef al., 1999, J. Exp. Med. 190:125-133). En adición, las células dendriticas pueden ser una fuente importante de citosinas lnterleucina-12 (IL-12), factor de necrosis de tumor alfa (TNFa) e interferona alfa (IFNa), los cuales juegan un papel en las respuestas inmunes antitumorales (Banchereau ef al., 1998, Nature 392:245-252). De este modo, en años recientes, los investigadores han intentado explotar la actividad de las CD en el tratamiento del cáncer (ver, por ejemplo, Mehta-Damani et al., 1994, J. Immunology 153:996-1003. Hsu et al, 1996 Nature Medicine 2:52; urphy ef al, 1996, The prostate 29:371 , Mehta-Damani ef al., 1994, J. Immunology 153:996-1003, Dallal ef al., 2000, Curé. Opin. Immunol. 12:283-588; Zeid et a/.,1993, Pathology 25:338, Furihaton ef al., 1992, 61 :409, Tsujitani ef al., 1990, Cáncer 66:2012; Gianni ef al., 1991 , Pathol. Res. Pract. 187:496, Murphy ef al., 1993, J. Inv. Dermatol. 100:3358). Para inducir una respuesta inmune adecuada, las células dendriticas deben suministrarse en el lugar de la expresión del antígeno, captación de antígenos y migrar a órganos linfoides secundarios mientras se reciben señales de activación emitidas por los agentes patógenos, células colorantes y/o células T. Gran cantidad de estudios se han referido al estado de CD en tumores humanos y han dado a conocer funciones de CD perjudiciales dentro de los tumores o en pacientes con cáncer (Bell ef al., 1999, J. Exp. Med. 190:1417-1426; Scarpino et al., 2000, A . J. Pathol. 156:831-837; Lespagnard et al., 1999, Int. J. Cáncer 84:309-314; Enk et al., 1997, Int. J. Cáncer 73:309-316). Además, la observación de CD activas en algunos estudios fue un factor de prognosis positivo (Enk et al., 1997, Int. J. Cáncer 73:309-316). De este modo, el incremento de la activación de las células dendriticas en los tumores podría ser un método útil para tratar el cáncer.

Los tumores pueden evadir el sistema inmune al interferir con la navegación de las células CD o al fallar en proporcionar las señales de activación necesarias (Vicari et al., 2001 , Seminare in Cáncer Biology, en la prensa). En particular, es probable que los tumores no presenten gran cantidad de Patrones Moleculares Patógenos Asociados (PAMP) (Medzhitov ef al,.2000, Sem. Immunol. 12:185-188), los cuales estimulan la activación de CD (Reis eí al., 2001 , Immunity 14:495-498). En años recientes, las moléculas del receptor de Toll (TLR) se han identificado como una clase importante de receptores para PAMP. Los receptores similares a Toll (TLR) reconocen patrones moleculares específicos para agentes patógenos microbianos (Aderem eí al., 2000, Nature 406:782-787). En el hombre se han descrito diez moléculas TLR distintas WO 98/50547 publicada el 12 de noviembre de 1999 divulga algunos TLR 2-10. Notablemente, la actual nomenclatura pública incluye diez TLR distintos en el hombre, nueve de los cuales corresponden a TLR-2 a TLR-10 de WO 98/50547, pero con cantidades desiguales (Kadowaki ef al., 2001 , J. Immunol. 194:863-869. Las señales a través de TLR estimuladas mediante moléculas microbianas activan fuertemente CD para regular positivamente las moléculas coestlmuladoras (CD80 y CD86) (Hertz el al. J. Immunol. 166:2444-2450) y para producir citosinas proinflamatorias (TNF-a, IL-6 e IL-12) (Thoma-Uszynski et al., 2001 , J. Immunol.) 154:3804-3810). Numerosos estudios han identificado una amplia variedad de productos bacterianos químicamente diversos los cuales sirven como ligando para las proteínas TL , incluidos lipopolisacárido bacteriano (TLR-4), flagelina (TLR-5), ácido lipoteicoico (TLR-2) y Poli l:C (TLR-3). Más particularmente, TLR-9 ha demostrado ser un ligando para ADN CpG bacteriano inmunoestimulador (Hemmi ef al., 2000, Nature 408:740745, Wagner, 2001 Immunity 14:499-502). Además, los tumores estimulan la secreción de factores que inhiben las funciones o la diferenciación de CD. Uno de los factores asociados al tumor que podría inhibir la función de CD en el cáncer es IL-10. Se ha informado que numerosos tumores primarios humanos o metástasis secretan lnterleucina-10 (IL-10) (Chouaib eí al., 1997, Immunol. Today 18:4993-497). Este factor se ha descrito como un modulador fuerte de I función de CD. En efecto, IL-10 puede regular negativamente la producción de IL-12 e inhibir el potencial coestimulador de la célula T de CD (DeSmedt ef al., 1997, Eur. J. Immunol. 27:1229-1235, Caux ef al., 1994, Int. Immunol. 6:1177-1185). Sin embargo, aún se desconoce el efecto de antagonizar las señales inhibidoras de CD como IL-10 para mejorar la activación de las CD y en consecuencia la respuesta inmune del hospedero contra el cáncer. Los métodos actualmente disponibles de la terapia contra el cáncer como terapia quirúrgica, radioterapia, quimioterapia y métodos inmunobiológicos han sido de éxito limitado o han hecho surgir efectos colaterales graves e indeseables. En gran cantidad de tumores sólidos diagnosticados clínicamente (en los cuales el tumor es un crecimiento localizado), se considera la remoción quirúrgica el medio principal de tratamiento. Sin embargo, muchas veces luego de la cirugía y luego de algún periodo de atraso, se observa que el tumor original se ha extendido pro metástasis de modo que los lugares secundarios de la invasión del cáncer se han diseminado a lo largo de todo el cuerpo y el paciente subsiguientemente muere del crecimiento del cáncer secundario. Aunque la quimioterapia se utiliza ampliamente en el tratamiento del cáncer, es un tratamiento sistemático basado generalmente en la prevención de la proliferación celular. En consecuencia, la quimioterapia es una modalidad de tratamiento no específica que afecta la totalidad de las células proliferantes, incluidas células normales, lo cual conduce a efectos laterales indeseables y a menudo graves. De este modo, existe una necesidad por métodos nuevos para tratar enfermedades, las cuales se cree resultan de respuestas inmunes aberrantes, especialmente cáncer. En particular, la elucidación de los factores que facilitan la activación de células dendríticas infiltrantes de tumor permitiría la manipulación de las células dendríticas para incrementar una respuesta inmune a través de la manipulación de las células dendríticas será útil en el tratamiento de estas enfermedades.

DESCRIPCION BREVE DE LA INVENCION La presente invención satisface la necesidad anterior al proporcionar materiales y métodos para inmunoterapia de enfermedades como el cáncer al facilitar la activación de células dendríticas infiltrantes de tumor. Recientemente se ha descubierto que la administración combinada de un antagonista IL-10 y un agonista TLR-9 es una terapia efectiva contra el cáncer. De este modo, la invención proporciona un método para tratar cáncer, el cual comprende la administración a un individuo que requiere una cantidad efectiva de un antagonista del factor inhibidor de CD derivado el tumor en combinación con una cantidad efectiva de un agonista TLR. En las modalidades preferidas, el agonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor puede ser un antagonista de cualesquier de los siguientes factores asociados al tumor, los cuales se conocen por inhibir la función de la célula dendrítica IL-6, VEGF, CTLA-4, OX-40, TGF-ß, prostaglandina, glangliosida, -CSF e IL-10. Más preferible, el antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor es un antagonista IL-10. Idealmente, el antagonista IL-10 es un agonista directo de la citosina IL-10 o un antagonista del receptor IL-10. En ciertas modalidades, el antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una molécula pequeña o secuencia de nucleótido de antisentido. Idealmente, el antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor es un anticuerpo del receptor anti-IL-10. En ciertas modalidades, el agonista TLR es una molécula pequeña, una proteína recombinante, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, una secuencia de nucleótido o una secuencia de ácido nucleico-proteína. En modalidades preferidas, el agonista TLR es un agonista de TLR-9. Más preferible, el agonista TLR es una secuencia de nucleótidos inmunoestimuladores, aún más preferible la secuencia de nucleótidos inmunoestimuladores contiene un motivo CpG. Idealmente, la secuencia de nucleótidos inmunoestimuladores se selecciona del grupo constituido por: CpG 2006 (cuadro 2 y SEC ID N°1 ), CpG 2216 (cuadro 2 y SEC ID N°:2); AAC-30 (cuadro 2 y SEC ID N°:3), y GAC-30 (cuadro 2 y SEC ID N°:4). La secuencia de nucleótidos inmunoestimuladores se puede estabilizar mediante la modificación de la estructura como la modificación fosforotioato o se puede encapsular en liposomas catiónicos para mejorar la farmacocinética in vivo y la eficacia de los tratamientos contra el tumor. En ciertas modalidades, el antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor y/o agonista TLR se administran por vía intravenosa, intratumoral, intradérmica, intramuscular, subcutánea o tópica. En algunas modalidades, el antagonista del factor de incapacidad de las CD derivado de tumor y el agonista TLR se administran en la forma de una proteina de fusión o se unen de otra forma entre sí. Los métodos de la invención además pueden comprender la administración de al menos un antígeno asociado al tumor. El antígeno de tumor se puede suministrar en la forma de una proteína de fusión o se puede unir al agonista TLR y/o el antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor. En otro aspecto de la invención, también se administra un agente activante como TNF-a, IFN-a, RANK-L o agonistas de RANK, CD40-L o agonistas de CD40, 41 BBL o agonistas de 41 BB u otro ligando agonista putativo de miembros de la familia del receptor TNF/CD40. En otro aspecto de la invención, las citosinas se administran en combinación, antes o coincidentemente, con el antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor y/o agonista TLR. En un aspecto preferido, las citosinas son GM-CSF o G-CSF o FLT-31 , utilizadas como proteínas recombinantes o proteínas recombinantes de fusión o vectores de suministro. La administración de estos factores estimula la generación de ciertos subconjuntos de CD de precursores, de modo de incrementar la cantidad de células dendriticas infiltrantes de tumor dispuestas a la activación con la combinación del antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor y el agonista TLR. En otro aspecto de la invención, las quimiocinas seleccionadas se administran, antes o coincidentemente, con el antagonista de factor inhibidor de CD derivado de tumor y/o agonista TLR. En un aspecto preferido, las quimiocinas se seleccionan del grupo de CCL13, CCL16, CCL7, CCL19, CCL20, CCL21 , CXCL9, CXCL10M CSCK11 , CXCL12, utilizadas como proteínas recombinantes o proteínas recombinantes de fusión o vectores de suministro. En un aspecto más preferido, la quimiocina se suministra al tumor directamente luego de la inyección intratumoral o mediante un elemento objetivo como un anticuerpo recombinante o mediante la encapsulaclón en vesículas partículas que posibilitan un suministro preferencial en los tumores. La administración de las quimiocinas puede estimular el reclutamiento de ciertos solventes de CD en el tumor, de tal modo de incrementar la cantidad de las células dendríticas infiltrantes de tumor para la activación con la combinación del antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor y el agonista TLR.

DESCRIPCION BREVE DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra que las células dendríticas infiltrantes de tumor C26-6CK no son sensibles a la combinación de LPS + anti-CD10 + IFNy, cuando se comparan con las células dendríticas derivadas de médula ósea. La figura 1A representa los resultados del análisis de expresión de superficie de MHC clase IL, CD40 y CD8 por FACS (regulado en las células positivas CD11c). La figura 1 B representa la expresión intracelular de IL-12p40 por las células CDH c* luego de 20 horas, incluidas 2.5 horas de incubación con Brefeldin A. Figura 1C representa una reacción de leucocito mixto en la figura 1 D, 11-12 p70 se midió en sobrenadantes de cultivo luego de la activación con LPS + IFNy + anti-CD40 mediante un ELISA especifico. La figura 2 muestra la combinación CpG 1668 + anti-IL-10R restauraron IL-12 y TNF en las células dendríticas infiltrantes de tumor C26-6CK TIDC de los tumores C26-6CK se enriquecieron mediante la utilización de partículas magnéticas ant¡-CD11c y se cultivaron durante toda la noche en presencia de GM-CSF y varias combinaciones de LPS, IFNy anti-CD40, anti- IL10R y CpG 1668. Los niveles de IL-12 p70 y TNFa se midieron en sobrenadantes de cultivo mediante ELISA específica. La figura 3 muestra la combinación CpG 1668 + anti-IL-10R restauró la capacidad estimuladora MLR de CD para infiltrar los tumores C26-6CK TIDC de los tumores C26-6CK se enriquecieron mediante la utilización de partículas magnéticas anti-CD11 c y se cultivaron durante toda la noche en presencia de GM-CSF y varias combinaciones de LPS, IFNy, anti-CD40, anti-IL10R y CpG 168. Luego, las células se irradiaron y cultivaron durante 5 días en cantidades variables en presencia de una cantidad constante de células T alogeneicas enriquecidas (células T3 x 105). La proliferación se midió durante las ultimas 18 horas de cultivo mediante la incorporación de timidina radioactiva. La figura 4 muestra las células dendríticas infiltrantes de tumores C26 parenterales así como también de los tumores de origen histológico diferente no son sensibles a la combinación de LPS + IFNy + anti-CD40, pero producen IL-12 en respuesta a CpG 1668+anti-IL-10R TIDC de los tumores indicados se enriqueció mediante la utilización de partículas magnéticas anti-CD11c y se cultivaron durante toda la noche en presencia de GM-CSF, LPS + IFNy + anti-CD40 o anti-IL-10R + CpG 1668. La figura 4 representa expresión intracelular de IL-12p40 y expresión de superficie de CD11c en células cultivadas luego de 20 horas, incluidas 2.5 horas de incubación con Brefeldin A.

La figura 5 representa el efecto terapéutico de CpG 1668 · anticuerpo-IL-10R en el modelo de tumor C26-6CK. Los grupos de los ratones BALB/c hembras de 7 semanas de edad se inyectaron subcutáneamente con 5 x 104 de células C26-6CK y se trataron dos veces a la semana con 5 combinaciones de inyección intratumoral de 10 CpG 1668, durante tres semanas comenzando el día 7 de la inoculación de tumor. La figura 6 representa el efecto terapéutico de CpG 1668+anticuerpo anti-IL-10R en el modelo de tumor C26. Los grupos de los ratones BALB/c hembras de 7 semanas de edad se inyectaron 10 subcutáneamente con 5 x 104 de células C26 y se trataron semanalmente con combinaciones de inyección intraperitoneal de 250 ^ig del anticuerpo anti-IL- 10R purificado e inyecciones intratumorales de 5 µ9 CpG 1668, durante tres semanas comenzando el día 7 luego de la inoculación de tumor. La figura 7 representa el efecto terapéutico de CpG 15 1668+anticuerpo anti-IL-10R en el modelo de tumor de melanoma B1 F0. Los grupos de los ratones BALB/c hembras de 7 semanas de edad se inyectaron subcutáneamente con 5 x 104 de células B16F0 y se trataron semanalmente con combinaciones de inyección intraperitoneal de 250 ng del anticuerpo anti- IL-10R purificado e inyecciones intratumorales de 5 µg CpG 1668, durante tres 20 semanas comenzando el día 7 luego de la inoculación de tumor. La figura 8 demuestra que otro antagonista IL-10 un anticuerpo monoclonal anti-IL10 puede inducir en combinación con el agonista TLR-9 CpG 1668 la producción de IL-12 mediante CD infiltrantes de tumores C26- 6CK 11 DC de los tumores C26-6CK se enriquecieron mediante la utilización de partículas magnéticas anti-CD11c y se cultivaron durante toda la noche en presencia de GM-CSF o anti-IL-10R CpG 1668 o anti-IL-10+CpG 1668. La figura 8 representa la expresión intracelular de IL-12p40 y la expresión de 5 superficie de CD11c en las células cultivadas luego de 20 horas incluidas 2.5 horas de incubación con Brefeldin A. La figura 9 demuestra que otro factor inhibidor de CD derivado de tumor PGE2, se pueden antagonizar con el fin de permitir la activación de las CD. Las CD derivadas de médula ósea se cultivaron en presencia o 10 ausencia de un sobrenadante de tumor que contenía PGE2 (tratado con indometacina). Las CD diferentes se examinaron para determinar la expresión de indicadores de maduración y la producción de IL-12, luego de la activación con combinaciones de LPS, IFNy y anticuerpo anti-CD40 en presencia o ausencia del anticuerpo anti-IL10R. 15 La figura 10 representa el efecto terapéutico de CpG 1668 + indometacina en el modelo de tumor de carcinoma de colon C26-6CK. Los grupos de los ratones BALB/c hembras de 8 semanas de edad se inyectaron subcutáneamente con 5 x 104 de células C26-6CK y se trataron semanalmente con combinaciones de inyección intratumoral de 5 ^ig del CpG 20 1668, durante tres semanas comenzando el día 7 luego de la inoculación de tumor y/o indometacina, 5 ng/ml en agua potable del día 5 al día 28.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Todas las referencias citadas aquí se incorporan en su totalidad como referencia. La invención presente se basa en parte en el descubrimiento sorprendente de que la administración combinada de un antagonista del facto inhibidor de CD derivado de tumor y un agonista TLR comprende actividad terapéutica fuerte en varios modelos in vivo del desarrollo de tumor incluido C26-6CK, C26 y B16F0. Se ha descubierto que la administración combinada de un antagonista IL-10 y un agonista TLR-9 permite que las células dendríticas infiltrantes de tumor. De otro modo refractario a la activación, produzcan IL-12 y TNFcc y para inducir respuestas inmunes antígeno-específicas de tumor mejoradas. Además, ahora se ha descubierto que la administración de un antagonista IL-10 y un agonista TLR-9 a animales que tienen tumor podría inducir el rechazo de los tumores. Una cantidad de informes ha tratado el estado de activación de CD dentro de los tumores. En uno de estos informes los tumores de carcinoma de colon C26 de ratones transducidos para expresar GM-CSF y CD40L, se infiltraron bastante por medio de CD con un fenotipo maduro y una proporción de tumores regresaron luego del crecimiento inicial (Chiodoni ef al, 1999. J. Exp. Med. 190:125-133). Las mismas células C26 que expresan 6Ck¡ne se infiltraron mediante CD inmaduras (Vicari ef al. 2000. J. Immunol 165:1992-2000). Puesto que la activación y la maduración subsiguiente de CD son eventos cruciales para el inicio de la respuesta inmune, se pensó que la activación de células dendríticas infiltrantes de tumor C26-6CK podría conducir al rechazo de tumor. Inesperadamente, se descubrió que aquellas CD infiltrantes de tumor no respondieron a la estimulación a través de CD40 5 mediante un anticuerpo agonista anti-CD40, mediante la utilización de la interpretación de la regulación positiva de moléculas coestimuladoras, la capacidad para estimular las células T en la reacción mixta de leucocito y la capacidad para producir IL-12 y TNFa. No respondieron al estimulo bacteriano LPS, un ligando para TLR-4, a la citosina IFNy ni a cualquiera combinación de 10 LPS. IFNy y anticuerpo anti-CD40. En consecuencia, los inventores crearon la hipótesis de que los factores derivados de tumor indujeron un estado refractario en CD infiltrantes de tumor, cuando se consideran los estímulos particulares que utilizaron. De este modo, la elucidación de los factores que podrían inhibir este estado 15 refractario podría conducir a terapias útiles contra el cáncer. En vista de los informes que IL-10, una señal inhibidora de CD, se secreta por gran cantidad de tumores humanos (Chouaib eí ai, 1997, immunol. Today 18:493-497. De Smedt ef al., 1997, Eur. J. Immunol 27:1229-1235. Caux ef al., 1994, Int. Immunol, 6:1177-1185), los inventores analizaron si la antagonización de IL- 20 10 podría mejorar la activación de CD y en consecuencia la respuesta inmune del hospedero contra el cáncer. Sin embargo, se descubrió que tratar los ratones con un anticuerpo que bloquear el receptor IL-10 (anti-IL10R) tuvo poco efecto en el desarrollo de tumor de carcinoma de colon C26 o su variante C26-6CK (la última formación se describe en (Vicari et al., 2000. J. Immunol 165 1992-2000 para expresar la quimiocina CCL21/SLC 6Ckine ver ejemplo IV y figura 5)). En efecto, como se muestra en los ejemplos II y III, un anticuerpo anti-IL10R no comprendió un efecto mínimo en la activación de CD infiltrantes de tumor con LPS + IFNy + anti-CD40. Subsiguientemente, los inventores crearon la hipótesis de que otras señales de activación, en particular señales mediadas a través de receptores de patrón molecular asociados a agentes patógenos de la familia de tipo Toll, pero distintos a TLR-4 podrían ser operativos en las células dendríticas infiltrantes de tumor. En particular estudiaron el efecto de CpG 1668, un ligando para TLR-9 en el ratón (Hemmi ef a/., 2000. Nature 408:740-745). Sin embargo, observaron que CpG 1668 comprendió un efecto marginal en la activación de las células dendríticas infiltrantes de tumor (ejemplos II y III) o en el tratamiento de tumores subcutáneos establecidos en ratones (ejemplos V a VII). En marcado contraste, pero los inventores han descubierto de modo sorprendente que la combinación de CpG 1668 y anti-IL 10R induce la producción de IL 12p70 y TNFa mediante las CD infiltrantes de tumor C26-6CK e incrementa enormemente la capacidad estimuladora de aquellas CD en MLR (ver ejemplo II y III). Subsiguientemente, la combinación de CpG 1668 más el anticuerpo anti-IL 10R presentó un efecto antitumoral significativo en ratones con tumores C26-6CK (ejemplo V). Además, la combinación de CpG 1668 y el anticuerpo anti-IL 10R, pero no la combinación de LPS + IFNy + anticuerpo anti-CD40 fue similarmente capaz de inducir la producción de IL-12 en las CD infiltrantes de tumor C26 parental y tumores de otro origen histológico el melanoma B 6 y el carcinoma del pulmón LL2 (ver ejemplo IV). La combinación de CpG 1668 más anti-IL 10R también presentó actividad antitumoral en modelos de tumor C26 y B16Fo (ejemplos VI y VII). En consecuencia, la invención proporciona métodos para tratar cáncer en un mamífero, los cuales comprenden la administración a este mamífero de una cantidad efectiva de un antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor en combinación con una cantidad efectiva de un agonista TLR a través de la activación de células dendríticas infiltrantes de tumor. Un "antagonista del factor inhibidor de células dendríticas (CD) derivado de tumor" como se define aquí es un agente que se presenta en un análisis funcional o de enlace para bloquear la acción de un agente, el cual se secreta mediante células de tumor y se conoce por inhibir la función de células dendríticas. Un "agonista de TLR" como se define aquí es cualquiera molécula, la cual activa un receptor de tipo Toll ("TLR") como se describe en Bauer ef al. , 2001. Proc. Nati. Acad. Sel. EUA 98:9237-9242. En una modalidad particularmente preferida, el agonista TLR es un agonista de TLR9, como se describe en Hemmi ef al., 2000, Nature 408:740-745 y Bauer ef al., 2001 , Proc. Nati. Acad. Sei. EUA 98:9237-9242. 1. Antagonistas del Factor Inhibidor de CP Derivado de tumor. El término "antagonistas del factor inhibidor de CD derivado de tumor" incluye cualquier agente que bloquea la acción de un factor derivado de tumor, el cual induce un estado refractario en las CD infiltrantes de tumor. Ejemplos de estos factores derivados de tumor incluyen, pero no se limitan a, IL-6, VEGF, CTLA-4, OX-40, TGF-ß, prostaglandina, gangliosida, M-CSF y IL-10 (Chouaib er a/. 1997, Immunol. Today 18:493-497). Los antagonistas del factor inhibidor de CD derivado de tumor se pueden identificar al analizar sus efectos en las células dendríticas en presencia de un estimulo de activación. En presencia de una cantidad efectiva del antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor, las células dendríticas de tumor se someterían a un proceso de maduración que se puede suceder por la medición de la producción de las citosinas como IL-12, TNFa, IFNa o la expresión de las moléculas comúnmente expresadas mediante células dendríticas maduras como CD80, CD86, CD83 y CD-lámpara. Alternativamente, el efecto del antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor se puede observar cuando se analiza la activación de las células dendríticas humanas no aisladas de tumor, activadas en presencia de factores purificados o no purificados del origen de tumor que inhibe la maduración de la célula dendrítíca. Los antagonistas del factor inhibidor de CD derivado de tumor pueden actuar en los factores inhibidores de CD como, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-IL-10 bloquearía la acción de IL-10 o mediante cualesquier otro medios que prevendrían los factores inhibidores de CD de comprender su efecto normal en las CD infiltrantes de tumor como por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-IL-10R prevendría la señalización de IL-10 a través de su receptor en CD. Los antagonistas de los factores inhibidores de CD derivados de tumor se pueden derivar de anticuerpo o comprender fragmentos de anticuerpos o comprender fragmentos de anticuerpos. En adición, cualesquier antagonistas de moléculas pequeñas, secuencia de nucleótido de antisentido, secuencias de nucleótido incluidas en vectores de suministro de genes como vectores adenovirales o retrovirales que se muestran en un análisis de enlace o funcional para inhibir la activación del receptor caería dentro de esta definición. Se conoce en la técnica el modo de clasificar las moléculas pequeñas que unen específicamente un objetivo dado, por ejemplo, moléculas asociadas al tumor como receptores. Ver, por ejemplo, Meetings on High Throughput Screening, International Business Communications, Southborough, MA 01772-1749. En forma similar, se pueden utilizar las formas solubles del receptor que carecen de dominios de transmembrana. Finalmente, las formas antagonistas mutantes del factor inhibidor de CD derivado de tumor se pueden utilizar, las cuales se unen fuertemente a los receptores correspondientes, pero esencialmente carecen de actividad biológica. En las modalidades de la invención particularmente preferidas, el antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor es un antagonista IL- 10. El término "antagonista IL-10" incluye ambos antagonistas de IL-10 mismos y antagonistas del receptor IL-10 que inhiben la actividad de IL-10. Ejemplos de los antagonistas IL-10, los cuales serían útiles en esta invención incluyen, pero no se limitan a aquellos descritos en la patente estadounidense No. 5,231 ,012, registrada el 27 de julio de 1993 (dirigida a IL-10 y a los antagonistas de IL-10) y la patente estadounidense No. 5,863,796, registrado el 26 de enero de 1999 (dirigida al receptor IL-10 y a los antagonistas del receptor IL-10), ambos se incorporan expresamente aquí como referencia. 2. Agonistas TLR Se ha descrito gran cantidad de agonistas de TLR derivados de microbios como lipopolisacáridos, peptidoglicanos, flagelina y ácido lipoteicoico (Aderem ef al., 2000. Nature 406:782-787, Akira ef a/., 2001. Nat. Immunol. 2:675-680). Algunos de estos ligados pueden activar diferentes subconjuntos de células dendriticas, los cuales expresan patrones distintos de TLR (Kadowaki et al., 2001. J. Exp. Med. 194:863-869). En consecuencia, un agonista TLR podría ser cualquiera preparación de un agente microbiano que posee propiedades del agonista TLR. Por ejemplo, el agente OK-432 estreptocócico eliminado con penicilina contiene ácido lipoteicoico, el cual puede inducir la producción de citosinas Th1 a través del enlace de TLR (Okamoto ef al., 2000. Immunopharmacology 49:363-376). En el cuadro 1 enumera gran cantidad de ligandos TLR conocidos.

CUADRO 1 Ligados TLR conocidos LTA: ácido lipoteicoico LPS: lipopolisacárido PG: peptidoglicano Se ha demostrado que ciertos tipos de ADN sin trasladar estimulan las respuestas inmunes al activar TLR. En particular, los oligonucleótidos inmunoestimuladores que contienen motivos CpG se han divulgado ampliamente e informado que activan linfocitos (ver, por ejemplo, la patente estadounidense N°6: 194-388). Un "motivo CpG" como se utiliza aquí se define como un dinucleótido sin metllar de citosina-guanina (CpG). Los oligonucleótidos inmunoestimuladores, los cuales contienen motivos CpG también se pueden utilizar como agonistas TLR de acuerdo con los métodos de la invención presente. Gran cantidad de secuencias de nucleótidos inmunoestimuladores se ha descrito en la técnica y se puede identificar rápidamente mediante la utilización de análisis estándares, los cuales indican varios aspectos de la respuesta inmune, como secreción de citosina, producción de anticuerpos, activación de células NK y proliferación de células T. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses No. 6,194,388 y 6,207,646; WO 98/52962; WO 98/55495; WO 97/28259; WO 99/11275; Krieg ef a/., 1995, Nature 374:546-549 Yamamoto ef al., 1992 J. Immunol. 148:4072-4076; Bailas ef a/., 1996, J. Immunol 157(5)1840-1845; Klinman et al., 1997, PNAS 93(7):2879-83; Shimada et al., 1986, Jpn. J. Cáncer Res 77:808-816, Cowdery ef al., 1996, J. Immunol. 156:4570-75. Hartmann ef a/„ 2000, J. Immunol. 164(3):1617-24. Las secuencias de nucleótidos inmunoestimuladores pueden ser de cualquier longitud mayor a 6 bases o pares bases. Una secuencia de nucleótidos inmunoestimuladores puede contener modificaciones, como la modificación del grupo 3' OH o 5' OH, las modificaciones de una base de nucleótido, las modificaciones del componente de azúcar y las modificaciones del anillo de fosfato. La secuencia de nucleótidos inmunoestimuladores puede ser ADN con uno o dos filamentos, así como también ARN simple o con dos filamentos u otro polinucleótidos modificados. Una secuencia de nucleótidos inmunoestimuladores puede o no incluir una o más regiones palindrómicas.

La secuencia de nucleótidos inmunoestimuladores puede aislarse mediante la utilización de procedimientos convencionales de aislamiento del polinucleótido o se puede sintetizar mediante la utilización de técnicas y equipo de síntesis de ácido nucleico, los cuales se conocen en la técnica incluidos, pero sin limitarse a, métodos enzimáticos, métodos químicos y la degradación de mayores secuencias de oligonucleótidos (ver, por ejemplo, Ausubel ef al., 1987 y Sambrook et al., 1989) Ejemplos de secuencias de nucleótidos inmunoestimuladores, las cuales son útiles en los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a aquellas divulgadas en la patente estadounidense 6,207,646,1a patente estadounidense 6,239,116 y la publicación PCT No. WO 00/06588 (Universidad de lowa), PCT publicación No. WO 01/62909, PCT publicación No. WO 01/62910; PCT publicación No. WO 01/12223; PCT publicación No. WO 98/55495; y PCT publicación No. WO 99/62923 (Dynavax Technologies Corporation), cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia. En particular, la patente estadounidense No. 6,194,388 (Universidad de lowa) divulga ácidos nucleicos inmunoestimuladores, los cuales comprenden una secuencia de oligonucleótido que incluye al menos la fórmula siguiente donde C y G no son metilados, donde X^ son dinucleótidos seleccionados del grupo constituido por GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT y TpG y X3X4 son dinucleótidos seleccionados del grupo constituido por TpT, CpT, ApT, TpG, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA y CpA y donde al menos un nucleótido comprende una modificación del esqueleto de fosfato para facilitar la captación en las células, CpG preferidos que contienen oligonucleótidos inmunoestimuladores se describen con un tamaño en el intervalo de 8 a 40 pares bases. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores que corresponden a esta fórmula serian útiles en los métodos actualmente reivindicados. WO 99/62923 divulga ejemplos adicionales de secuencias de nucleótidos ¡nmunoestimuladores, las cuales se pueden utilizar en conjunto con la invención presente. En particular, se divulgan secuencias de nucleótidos ¡nmunoestimuladores modificadas de nucleótidos modificadas que comprenden secuencias hexaméricas o hexanucleótidos que comprenden una secuencia CG central, donde el residuo C se modifica mediante la adición de C-5 y/o C-6 de una fracción extractora de electrodos. Los oligonucleótidos ¡nmunoestimuladores se pueden estabilizar mediante la modificación de la estructura, la cual los vuelve relativamente resistentes a la degradación in vivo. Ejemplos de modificaciones estabilizantes incluyen la modificación fosforotioato (es decir, al menos uno de los oxígenos de fosfato se reemplaza por azufre), análogos de ADN no iónicos, como alquil-y arilfosfatos (en los cuales el oxígeno cargado con fosfonato se reemplaza mediante un grupo alquilo o arilo), fosfodiéster y alquilfosfotriésteres, en los cuales la fracción de oxigeno cargada es alquilada. Los oligonucleótidos que contienen un diol, como tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en uno o ambos extremos también se han presentado como substancialmente resistentes a la degradación de nucleasa (Ver la patente estadounidense No. 6,194,388 (Universidad de lowa)). Las secuencias de nucleótidos inmunoestimuladores también se pueden encapsular en o unirse a un complejo de suministro, lo cual resulta en un enlace de mayor afinidad con las superficies celulares blanco y/o captación incrementada mediante las células blanco. Ejemplos de los complejos de suministro de secuencias de nucleótidos inmunoestimuladores incluyen asociación con un esteral (por ejemplo, colesterol), un lipido (por ejemplo, 5 lipido catiónico, virosoma o liposoma) o un agente de enlace específico de célula blanco (por ejemplo, un ligando reconocido por el receptor específico de célula blanco). Los complejos preferidos deben ser suficientemente estables in vivo para prevenir el desacople significativo antes de la internalización mediante la célula blanco. Sin embargo, el complejo debe descomponerse 10 bajo condiciones apropiadas dentro de la célula de modo que el oligocleótido se libere en un forma funcional (patente estadounidense No. 6,194,388; WO 99/62923). En una modalidad particularmente preferida, el agonista TLR es un agonista de TLR9, como se describe en Hemmi ef ai, 2000, Nature 15 408:740-745 y Bauer eí al., 2001 , Proc. Nati. Acad. Sci. Sci. USA 98:9237- 9242. Los ligandos conocidos por TLR-9 hasta la fecha son secuencias de oligonucleotido sin metilar que contienen motivos CpG como CpG 1668 en el ratón (TCCATGACGTTCCTGATGCD) (SEQ. ID NO. 5) y CpG 2006 en el hombre (TCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTT)(SEQ ID NO Bauer ef al., 2001. 20 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:9237-9242). El siguiente cuadro 2 enumera los agonistas preferidos de TLR9: CUADRO 2 Ejemplos de CpG activo en CD (T) humanas CpG 2006: TCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID No. 1 ) CPG 2216: GGGGGACGATCGTCGGGGGG (SEQ ID No. 2) AAC-30: ACCGATAACGTTGCCGGTGACGGCACCACG (SEQ ID No. 3) | GAC-30: ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACG (SEQ ID No. 4) En adición a aquellos mencionados anteriormente, la selección del ligando mediante la utilización de TLR o fragmentos de ellos se pueden realizar para identificar otras moléculas, incluidas moléculas pequeñas con afinidad de enlace con los receptores Ver, por ejemplo, Meetings on Throughput Screening, International Business Communications, Southborough, A 01772-1749. Los análisis biológicos subsiguientes se pueden utilizar para determinar si un agonista putativo puede proporcionar actividad si un compuesto comprende actividad estimulante intrínseca, puede activar el receptor y de esta forma es un agonista puesto que estimula la actividad del ligando, por ejemplo, induciendo la señalización. Una cantidad "cantidad efectiva" de un agonista TLR como se utiliza aquí es una cantidad que produce el efecto biológico deseado en particular, una cantidad efectiva es aquella cantidad, la cual se combina con una cantidad efectiva de un antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor es suficiente para estimular activar la activación de las CD infiltrantes de tumor.

Una "cantidad efectiva" de un antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor es una cantidad que produce el efecto biológico deseado. En particular una cantidad efectiva es aquella cantidad, la cual cuando se combina con una cantidad efectiva de un agonista TLR es suficiente para estimular activar la activación de las CD infiltrantes de tumor.

La administración "en combinación" se refiere a la administración simultánea y consecutiva. Los antagonistas del factor inhibidor de CD derivado de tumor se pueden suministrar o administrar en el mismo lugar o en un lugar diferentes y se pueden administrar al mismo tiempo o con una demora no superior a las 48 horas. La administración coincidente o combinada, como se utiliza aquí, significa que el antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor y/o agonista TLR y/o antígeno se administran al sujeto (a) simultáneamente o (b) en tiempos diferentes durante el curso de un programa de tratamiento común. En el último caso, los dos compuestos se administran suficientemente cerca de tiempo para lograr el efecto pretendido. Los antagonistas del factor inhibidor de CD derivado de tumor y/o agonistas de TLR utilizados en la práctica de la invención, puede ser la proteína recombinante con una secuencia de amino ácidos idénticos al producto natural o una proteína recombinante derivada del producto natural, pero incluidas las modificaciones que cambian sus propiedades farmacocinéticas y/o añaden propiedades biológicas mientras se conservan sus propiedades antitumorales o activantes de CD originales.

El modo de suministro del antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor y/o agonista de TLR puede ser mediante inyección, incluida intravenosa, intratumoral, intradérmica, intramuscular, subcutánea o tópica. En una modalidad particularmente preferida de la invención, el/los antagonista(s) del factor inhibidor de CD derivado de tumor y el/los agonista(s) de TLR se administran en combinación con un antígeno asociado al tumor. Los antigenos asociados al tumor para utilizar en la invención Incluyen, pero no se limitan a Melan-A, tirosinasa, p97, p-HCG, GalNAc, AGE-1 , AGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-12, ART-1 , MUC1 , UC2, UC3, MUC4, MUC18, CEA, DDC, antigeno de melanoma gp75, Hker 8, antigeno de melanoma con mayor peso molecular K19, Tyr1 y Tyr2, miembros de la familia de genes p e117, c-Met, PSA, PSM, a-fetoproteína, tiroperoxida, gp100, NY-ESO-1 , telomerasa y p53. No pretende que esta lista sea exhaustiva, pero solamente ejemplificar de los tipos de antígeno, los cuales se pueden utilizar en la practica de la invención. Otro antígenos diferentes de los antígenos asociados al tumor se pueden administrar junto con el/los antagonista(s) del factor inhibidor de CD derivado de tumor y el/los agonísta(s) de TLR con el fin de aumentar la respuesta inmune especifica contra estos antígenos. Estos antígenos incluyen, pero no se limitan a moléculas nativas o modificadas expresadas bacterias, virus, hongos, parásitos. Los antígenos también pueden incluir alérgenos y autoantígenos y en este caso la combinación del/los antagonista(s) del factor inhibidor de CD derivado de tumor y el/los agonista(s) de TLR se administrará en conjunto con el antígeno con el fin de re-dirigir la respuesta inmune hacia una secuencia más favorable, por ejemplo, para transformar una respuesta inmune del tipo Th2 en una respuesta inmune del tipo Th1. Se pueden utilizar combinaciones diferentes de antígenos que presenten una función óptima con diferentes grupos étnicos, sexo, distribuciones geográficas y etapa de la enfermedad. En una modalidad de la invención al menos dos o más antígenos diferentes se administran en conjunto con la administración de la combinación del/de los antagonista(s) del factor inhibidor de CD derivado de tumor y el/los agonista(s) de TLR. El antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor y/o agonista de TLR se pueden administrar en combinación mutua y/o con el/los antígeno(s) o se pueden unir entre si o con el/los antígeno(s) en una variedad de modos (ver ejemplo, WO 98/16247, WO 98/55495, WO 99/68223). Por ejemplo, el agonista TLR y o un factor inhibidor de CD derivado de tumor y/o un antígeno se puede administrar espacialmente próximo con respecto entre sí, o como una mezcla (es decir, en solución). El enlace se puede realizar en una cantidad de modos, incluía la conjugación encapsulación mediante la adición a una plataforma de adsorción en una superficie. Para conjugar el/los agonista(s) TLR con el/los antagonista(s) del factor inhibidor de CD derivado de tumor y/o el/los antígeno(s) se pueden utilizar una variedad de métodos. La asociación puede realizarse a través de interacciones covalentes y/o a través de interacciones no covalentes, incluidas interacciones de gran afinidad y/o baja afinidad ejemplos interacciones no covalentes que pueden unir un agonista TLR y un factor inhibidor de CD derivado de tumor incluye, pero no se limitan a, enlaces iónicos, interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno y atracciones Van der Walls. Cuando el agonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor es una proteína o anticuerpo y el agonista TLR es un polinucleótido inmunoestimulador, por ejemplo, la porción de péptido del conjugado se puede unir al 3' extremo del polinucleótido inmunoestimulador a través de sólida química de apoyo mediante la utilización de métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Haralambidis er al., 1990a, Nucleic Acids Res 18:493-499 y Haralambidis et al., 1990b, Nucleic Acids Res 18:501-505). Alternativamente, la incorporación de un "brazo de unión" que posee una funcionalidad reactiva latente, como un grupo carboxilo o amina, a C-5 de una base de citosina proporciona una manipulación para el enlace de péptido (Ruth, 4lh Annual Congress for Recombinant DNA Research, p 123). La unión de polinucleótido inmunoestimulador con un péptido también se puede formar a través de una gran afinidad, interacción no covalente como un complejo de biotina-estreptavidina. Un grupo biotinilo se puede unir, por ejemplo, con una base modificada de un oligonucleótido (Roget et al., Nucleic Acids Res (1989) 17:17643-7651 ). La incorporación de una fracción de estreptavidina en la porción del péptido permite la formación de un complejo de enlace no covalente del péptido conjugado de estreptavidina y el polinucleótido biotinilado.

Una fracción diseñada para activar mayormente o estimular la madurez de las CD se puede administrar en forma ventajosa. Ejemplos de estos agente son TNF-a, IFN-a, RANK-L o agonistas del RANK, CD40-L o agonistas de CD40. Estos agentes activantes pueden proporcionar las señales de maduración adicionales, las cuales pueden participar en conjunto con el/los agonista(s) TLR i) en la conducción de la migración de CD desde tejidos hacia órganos linfoides a través del drenaje linfático y ii) en la activación de CD para secretar moléculas las cuales incrementan las respuestas comunes, en particular la respuesta antitumoral, como IL-12 y IFN-a (Banchereau et al., Nature 392:245-252). GM-CSF, G-CSF o FLT3-L también se puede administrar ventajosamente en los métodos de la invención G -CSL, G-CSF o FLT3-L se puede administrar con el fin de incrementar la cantidad de CD circulantes, las cuales pueden suministrarse localmente en el tumor. Este protocolo implicaría un pretratamiento sistemático durante al menos cinco a siete días con GM-CSF, G-CSF o FLT3-L. Una alternativa sería favorecer mediante la administración local de GM-CSF, G-CSF o FLT3-L la diferencia local de los precursores de CD (monocitos, precursores de plasmacitoides de CD) en CD los cuales podrían recoger el antígeno suministrado en el mismo lugar. En adición, las quimiocinas o combinaciones de las quimiocinas múltiples se pueden administrar ventajosamente en combinación con los antagonistas del factor inhibidor de CD derivado de tumor y agonistas TLR de la invención. Las quimiocinas, las cuales se han demostrado que comprenden efectos benéficos incluyen CCL21 , CCL3, CCL20, CCL16, CCL5, CCL25, CXCL12, CCL7, CCL8, CCL2, CCL13, CXCL9, CXCL10, CXCL11 (ver, por ejemplo, Sozzani ef al., 1995, J. Immunol. 155:3292-3295. Sozzanl ef al., 1997, J. Immunol. 159:1993-2000; Xu er a/., 1996, J. Leukoc. Brol. 60:365-371 ; acPherson ef al., 1995, J. Immunol. 154:1317-1322; ;Roake ef al., 1995, J. Exp. Med. 181 :2237-2247 y la solicitud de patente europea EP 0 974 357 A1 registrada el 16 de julio de 1998 y publicada di 26 de enero de 2000) Generalmente, los antagonistas del factor inhibidor de CD derivado de tumor, agonistas TLR y/o el/los agente(s) activante(s) y/o la(s) citosina(s) se administran como composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de un antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor y el/los agonista(s) TLR y/o el/los antígeno(s) y/o el/los agente(s) activante(s) y/o la(s) citosina(s) en un portador farmacéutico. Estos reactivos se pueden combinar para uso terapéutico con ingredientes adicionales activos o inertes, por ejemplo, en diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables convencionales, por ejemplo, elementos auxiliares inmunogénicos junto con excipientes y estabilizantes fisiológicamente inocuos. Un portador farmacéutico puede ser cualquiera substancia compatible, no tóxica adecuada para suministrar las composiciones de la invención a un paciente. Las citocinas y/o quimiocinas pueden opcionalmente suministrarse al tumor mediante la utilización de una formación objetivo que comprende una quimiocina o citosina o un fragmento biológicamente activo o variante de ellos y una fracción objetivo. Una "fracción objetivo" como se denomina aquí es una fracción la cual reconoce o apunta a un antígeno asociado al tumor o una estructura expresada específicamente mediante componentes no cancerosos de tumor como la vascularización de tumor. Ejemplos de fracciones objetivo incluyen, pero no se limitan a péptidos, proteínas, moléculas pequeñas, vectores, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, los cuales reconocen o apuntan a antígenos asociados al tumor o estructuras expresadas específicamente mediante componentes no cancerosos de un tumor. En modalidades preferidas, la fracción objetivo es un péptido, una proteína, una molécula pequeña, un vector como un vector viral, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En modalidades más preferidas, la fracción objetivo es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En modalidades más preferidas el vector objetivo es un fragmento ScFv. La fracción objetivo puede ser específica para un antígeno expresado por células de tumor como se ha descrito en los humanos, por ejemplo, para el receptor de folato (Melani er a/ , 1998, Cáncer Res. 58:4146-4154), receptor Her2/neu, Epidemial Growth Factor Receptor y antígeno de tumor CA125 (Glennie eí al., 2000, Immunol. Today 21:403-410) Gran cantidad de otros antígenos de tumor se pueden utilizar como objetivos y se expresan preferencíalmente, se expresan únicamente, se sobreexpresan o expresan con una forma mutada mediante las células malignas de tumor (Boon et al., 1997. Curr. Opin. Immunol 9:681-683). Estas pueden incluir elan-A, tirosinasa, p97„ ß-HCG, GalNAc. AGE-1 , MAGE-2, AGE-3, AGE-4, MAGE-12, MARI-L UCL, MUC2, MUC3, UC4, MUC18, CEA, DDC, antígeno de melanoma gp75, Hker 8, antígeno de melanoma con alto peso molecular, K19, Tyr1 , Tyr2, miembros de la familia de genes pMel 17, c- et, PSA, PSM, a-fenoproteína, tiroperoxidasa, gp100, receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IGF-R), telomerasa y p53. No pretende que esta lista sea exhaustiva, pero solamente ejemplar de los tipos de antígeno, los cuales se pueden utilizar en la práctica de la invención. Alternativamente, la fracción objetivo puede ser específica para un antígeno de preferencia expresado mediante un componente de tumor diferente de las células malignas y en particular los vasos sanguíneos de tumor. La familia de las v integrinas alfa, el receptor VEGF y el proteoglicano NG2 son ejemplos de estos antígenos asociados a los vasos sanguíneos de tumor (Pasqualim ef al., 1997, Nat. Brotec mol. 15:542-546). El cáncer primario y el metastásíco se pueden tratar de acuerdo con la invención. Los tipos de cánceres, los cuales se pueden tratar incluyen, pero no se limitan a melanoma, carcinomas mamario, pancreático, colónico, pulmonar, de glioma, hepatocelular, endometrial, gástrico, intestinal, renal, prostático, tiroidal, ovárico, testicular, hepático, de cabeza y cuello, colorrectal, esofágico, estomacal, ocular, vesicular, de glioblastoma y metastásíco. El término "carcinoma" se refiere a malignidades de tejidos epiteliales o endocrinos incluidos carcinomas del sistema respiratorio, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carinomas prostéticos, carcinomas del sistema endocrino y melanomas. Metastásíco, como este término se utiliza aquí, se define como la ramificación de tumor a un lugar distante hacia los nodos linfáticos regionales. Las cantidades de reactivos necesarios para una terapia efectiva dependerán de gran cantidad de factores diferentes incluidos medios de administración, lugar objetivo, estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. De este modo, las dosificaciones del tratamiento deben titularse para optimizar la seguridad y eficacia. El análisis de los animales de dosis efectivas para el tratamiento de cánceres particulares proporcionan mayor indicación predictiva de dosificación humana. Se describen varias consideraciones, por ejemplo, en Gilman er al. (eds) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacotoglcal Bases of Therapeutics, octava edición. Pergamon Press, y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17 edición (1990), Mack Publishing o. Easton, PA. Los métodos para la administración se discuten aquí y posteriormente, por ejemplo, para administración intravenosa, intraperitoneral o intramuscular, difusión transdérmica y otros. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, tampones y otros compuestos descritos, por ejemplo, en Merck. Index. Merck & Co. Rahway, Nueva Jersey. Las formulaciones con liberación lenta o un dispositivo de liberación lenta se pueden utilizar para administración continua. Los intervalos de dosificación para antagonistas del factor inhibidores de CD derivado de tumor y/o agente(s) agonista TLR variarán dependiendo de la forma de agonista/antagonistas. Por ejemplo, la dosis efectiva de un anticuerpo receptor IL-10 comúnmente fluctuará de 0.05 a 25 ng/kg/día aproximadamente, de preferencia de 0.1 a 20 ng/kg/día aproximadamente, idealmente de 1 a 10 ng/kg/dia aproximadamente. Para las composiciones inmunogénicas como agonistas TLR, las cantidades pueden variar basadas en la forma del antagonista TLR, el individuo, cual condición se va a tratar y otros factores evidentes para aquellos experimentados en la técnica, los factores a considerar incluyen la antigenicidad, si o no el agonista TLR se complejizará o se unirá covalentemente a un elemento auxiliar o molécula de suministro, vía de administración y la cantidad de dosis inmunizantes a administrarse. Estos factores se conocen en la técnica. Un intervalo de dosis adecuado es uno que proporciona la activación deseada de células dendríticas. Generalmente, un intervalo de dosificación para un oligonucleótido inmunoestimulador puede ser, ejemplo, desde cualesquier de los siguientes en forma aproximada: 0.1 a 100 0.1 a 50 µ9, 0.1 a 25 µg, 0.1 a 10 ug, 1 a 500 ug, 100 a 400 ug, 200 a 300 ug, 1 a 100 µg, 100 a 200 ug, 300 a 400 ^ig, 400 a 500 ug. Alternativamente, las dosis pueden ser cualesquiera de las siguientes: 0.1 µg, 0.25 µg, 0.5 µg, 1.0 µg, 2.0 µg, 5.0 µg, 10 g, 25 µg, 50 µg, 75 g, 100 µg. En consecuencia, los intervalos de dosificación pueden ser aquellos con un limite inferior a cualesquier de los siguientes en forma aproximada 0.1 g, 0.25 µg ^ .0 µg, y con un limite superior de cualesquier de los siguientes en forma aproximada 25 µg, 50 g y 100 µg. En estas composiciones, puede variar el cociente molar del polinucleótido que contiene ISS al antigeno. La cantidad absoluta dada a cada paciente depende de las propiedades farmacológicas como biodisponibilidad, tasa de evacuación y vía de administración. Generalmente, el tratamiento se inicia con menores dosis, las cuales son menores que la dosis óptima del compuesto. Subsiguientemente, la dosificación se incrementa mediante pequeños incrementos hasta que se alcanza el efecto óptimo de acuerdo con las circunstancias. La determinación de la dosificación apropiada y el régimen de administración para una situación particular radica en la experiencia en la técnica. La dosificación de los antagonistas del factor inhibidor DC derivado de tumor y los agonistas TLR, los cuales se administran mediante un vector, dependerá bastante de la eficacia del vector particular empleado y de la condición el paciente, así como también del peso corporal o del área superficial del paciente a tratarse. El tamaño de la dosificación también se determinará mediante la existencia, naturaleza y grado de cualesquier efectos laterales adversos que acompañan la administración de un vector particular o tipo celular translúcido en un paciente particular. En la determinación de la cantidad efectiva del vector a administrarse en el tratamiento, el médico evalúa los niveles de plasma circulante del vector, toxicidades del vector, progreso de la enfermedad y la producción de anticuerpos antivectoriales. La dosis común para un ácido nucleico depende fuertemente de la vía de administración y del sistema suministrador de genes. Dependiendo del método de suministro la dosificación puede fluctuar fácilmente de 1 ^ig a 100 mg o más. En general, la dosis equivalente a un ácido nucleico desnudo de un vector es de 1 µ? a 100 para un paciente común de 70 kilogramos y dosis de vectores que incluyen una particular viral se calculan para producir una cantidad equivalente de ácido nucleico terapéutico. La dosis preferida biológicamente activa de G -CSF, G-CSF o FLT-L en la práctica de la invención reivindicada es aquella combinación de dosificación, la cual inducirá el aumento máximo de la cantidad de células precursoras CD14+/CD13+ circulantes; la expresión de las moléculas que presentan antigenos en la superficie de los precursores de CD y CD maduras, los antígenos que presentan actividad con las células T y/o la fusión de CD maduras. La cantidad de GM-CSF a utilizarse para administración subcutánea comúnmente fluctúa de 0.25 ng/kg/día a 10.0 µg/kg día aproximadamente, de preferencia de 1.0 a 8.0 ng/kg/dla aproximadamente, idealmente 2.5-5.0 ng/kg/día. Una cantidad efectiva para un paciente particular se puede establecer al medir un cambio significativo en uno o más parámetros (indicados anteriormente).

EJEMPLO La invención se puede ilustrar mediante los siguientes ejemplos ¡limitados.

EJEMPLO I Células dendríticas infitlrantes de tumor C26-6CK no son sensibles a la combinación de LPS + anti-CD40 + IFy cuando se comparan con células dendríticas derivadas de médula ósea En este ejemplo, los inventores han demostrado que las CD infiltrantes de tumores C26-6CK no son sensibles a LPS + IFNy + anticuerpo anti-CD40 cuando se considera la producción de IL-12 o la capacidad estimuladora en reacción de leucocitos mixta (MLR) en comparación con CD derivadas de médula ósea (figura 1 ). Todos los cultivos de las células tumorales se realizaron en DMEM (Gibco-BRL, Life Technologies, Paisley Park, Escocia) complementado con 10% FCS (Gibco-BRL), 1 mM hepes (Gibco-BRL). Gentallin (Schering-Plough, Union, NJ), 2 x 10"5 M beta-2 mercaptoetanol (sigma, St. Louis, MO). Todos los cultivos celulares se realizaron a 37°C en una incubadora humedecida con 5° C02. El carcinoma del colon C26 y el carcinoma mamario TSA se proporcionaron por Mario Colombo (Istituto Nazionale per lo Studio e la Cura de tumori, Milán, Italia). El melanoma B16F0 y el carcinoma del pulmón LD2 se obtuvieron de American Type Culture Collectlon (LGC, Strasbourg, Francia). La especie celular C26-6CK diseñada para secretar en forma estable la quimiocina del ratón 6Ckine SLC/CCCI21 , se ha descrito previamente por los inventores (Vicari et al., 2000, J. Im unol 165:1992-2000) TIDC de los tumores C26-6CK se enriquecieron mediante la utilización de las partículas magnéticas anti-CD11c (Myltenyi Biotec Gmbh, Alemania). Las CD derivadas de la médula ósea se obtuvieron mediante el cultivo de progenitores de médula ósea con GM-CSF (Schering-Plough, Union, Nueva York) y TNFa (R&D Systems, inneapolis, N) durante 5 días. La activación se realizó durante la noche al añadir 10 ng/ml de LPS (Sigma, ST Louis, MO). 20 ng/ml IFNy (R&D Systems) y 20 de anticuerpo anti-CD40 del agonista FKG45.5 purificado (un amable obsequio de AG Rolink. Basel Institute for Immunology, Suecia) para cultivo mediano. La figura 1A muestra el análisis de la expresión de superficie de MHC clase II. CD40 y CD76 por FACS (regulado en las células positivas CD11 ). La figura 1 B representa la expresión intracelular de IL-12p40 por las células CD11 c luego de 20 horas. Incluidas 2.5 horas de incubación con Brefeldin A. En la figura 1 C, TIDC de reacción mixta de leucocito o CD derivadas de médula ósea estimulada con LPS + IFNy + anti-CD40 se irradiaron y cultivaron durante 5 días a cantidades variables en presencia de una cantidad constante de células T alogeneicas enriquecidas (3 x 105 células T). La proliferación se midió durante las últimas 18 horas de cultivo mediante la incorporación de timidina radiactiva). La figura 1 D representa la medición de IL-12 p70 en sobrenadantes de cultivo luego de la activación con LPS + IFNy + anti-CD40 mediante ELISA específico. Estos resultados combinados sugieren que las células dendríticas infiltrantes de tumores C26-6CK no son capaces de adquirir funciones comunes de células dendríticas en la estimulación con la combinación de LPS + IFNy + anti-CD40 principalmente la capacidad para estimular células T alogeneicas y la capacidad para secretar IL-12. Es probable que estas funciones deterioradas sean el resultado de interacción de células dendriticas con tumores.

EJEMPLO II La combinación de CoG 1668 + anti-IL10R restauro 11-12 v TNFa en células dendriticas infiltrantes de tumor C26-6CK En este ejemplo, los inventores han demostrado que la administración combinada de CpG 1668 y anticuerpo anti-IL10R restauro IL-12 y TNFa en células dendriticas infiltrantes de tumor C26-6CK (figura 2). TIDC de tumores C26-6CK se enriquecieron mediante la utilización de partículas magnéticas ant¡-CD11 c. LA activación se realizó durante toda la noche en presencia de 10 ng/ml de GM-CSF. Los activadores se utilizaron a 10 ng/ml LPS, 20 ng/ml, IFNy, 20 ng/ml de anticuerpo anti-CD40 de agonista F G45.5, 5 ng/ml CpG 1668 (secuencia TCC-ATG-ACG-TTC-CTG-ATG-CT, fosforotioato modificado, MWG Biotech, Alemania) y 10 ng/ml anti-IL10R (clon 1 B13A, Casfro eí ai, 2000, J. Exp. Med. 192:1529-1534). IL-12 p70 y TNFa se midieron en sobrenadantes cultivados luego de 24 horas de estimulación mediante ELISA específicos. En resumen, estos resultados indican que CpG 16687 por sí mismo no induce a la producción de IL-12 mediante las CD infiltrantes de tumor C26-6CK. Anti-IL10R no comprende efecto por sí mismo (no mostrado) efecto mínimo cuando se combinó con LPS + IFNy + anti-CD40. Solamente la combinación de anti-IL10R y CpG 1668 fue capaz de inducir una producción significativa de IL-12 biaoctivo y TNFa de CD infiltrantes de tumor C26-6CK.

EJEMPLO III La combinación de CpG 1668 + anti-IL10R restauró la capacidad estimuladora MLR en las células dendríticas infiltrantes de tumor C26- 6CK En este ejemplo, los inventores han demostrado que la administración combinada de CpG 1668 y el anticuerpo receptor anti-ID40 restauro la capacidad estimuladora MLR. TIDC de los tumores C26-6CK se enriquecieron mediante la utilización de partículas magnéticas anti-CD11c y se cultivaron durante toda la noche en presencia de GM-CSF y varias combinaciones de LPS, IFNy anti-Cd40, ant¡-IL10R y CpG 1668. Luego, las células se Irradiaron y cultivaron durante 5 días a cantidades variables en presencia de una cantidad constante de células T alogeneicas enriquecidas (3 x 105 células T). La proliferación se midió durante las últimas 18 horas de cultivo mediante la incorporación de timidina radioactiva. Los resultados muestran que las CD infiltrantes de tumor son células estimuladoras deficientes en el análisis MLR, pero su capacidad estimuladora se puede incrementar mínimamente con CpG 1668, mayormente incrementada con la combinación de anti-IL10R + LPS + IFNy + anti-CD40 y mejor incrementada con la combinación de anti-IL10R y CpG 1668. De este modo, este ejemplo muestra que anti-IL10R más CpG 1668 es la combinación más adecuada para restaurar la capacidad estimuladora de CD en MLR. Esto podría traducirse en una mejor sensibilización de las células T vírgenes in vivo y, en consecuencia, en una mejor respuesta inmune mediada con células T contra tumores cuando se utiliza la combinación de un antagonista IL-10 y un agonista TLR9 para tratar el cáncer.

EJEMPLO IV Células dendríticas infiltrantes de tumor del tipo silvestre C26 v tumores de otra naturaleza histiolóaica no responden a LPS + IFNY + anti-CD40. pero producen IL-12 en respuesta a CpG 1668 + anti-IL10R Este ejemplo muestra que las células dendríticas infiltrantes de tumor del tipo silvestre C26 y los tumores de otra naturaleza histiológica no son sensibles a LPS + IFNy + anti-CD40, pero producen IL-12 en respuesta a CpG 1668 + anti-IL10R. TIDC del carcinoma de colon C26, melanoma C16 y tumores del carcinoma del pulmón LL2, todos desarrollados en forma subcutánea, se enriquecieron mediante la utilización de partículas magnéticas anti-CD1 1c y se cultivaron durante toda la noche en presencia de GM-CSF y varias combinaciones de LPS, IFNy anti-CD40, anti-IL10R y CpG 1668. El análisis FACS de la expresión intracelular de IL-12p40 con respecto a la expresión de superficie de CD1 1c luego de 20 horas, incluidas 2.5 horas de incubación con Brefeldin A. La figura 4 muestra que, como se encontró para los tumores C26-6CK, CD aisladas de tumores parentales C26 asi como también tumores de diferente origen histiológico no son sensibles a de la activación con LPS, IFNy, anti-CD40, pero responden a la combinación del agonista TLR-9 CpG 1668 más anti-IL10R al producir IL-12. De este modo, estas observaciones sugieren que la combinación de un antagonista IL10 y un agonista TLR-9 podría ser una terapia efectiva en una variedad de tumores.

EJEMPLO V Efecto terapéutico de CpG 1668 + anticuerpo antí-IL10R en el modelo de tumor C26-6CK - 1x 105 células de tumor C26-6CK se implantaron s.c. el día 0 en grupos de siete ratones hembras BALB/c de 8 semanas de edad y se trataron como se indica a continuación - 10 ng de CpG 1668 se inyectaron peri- (cuando el tumor era demasiado pequeño) o intratumoralmente el día 7, 14 y 21 - 250 µg de anticuerpo anti-IL10R purificado se inyectaron intraperitonealmente en dos veces a la semana comenzando el día 7 (terminó el día 24). El anticuerpo de control purificó el anticuerpo GL113. El desarrollo de tumor se determinó tres veces a la semana mediante palpación y los tumores se midieron mediante la utilización de un calibrador con volumen de tumor = I2 x L x 0.4, 1 es el diámetro pequeño y L es el diámetro grande. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores excedieron 1500 mm3 o de acuerdo con el criterio humano. La figura 5 muestra que todos los ratones inyectados con anticuerpo de control o anticuerpo anti-ILOR solo desarrollaron tumores en el transcurso de 7 a 10 días, lo cual finalmente condujo a sacrificio de los animales a las 4 semanas aproximadamente. La inyección del TLR-9 agonista CpG 1668 comprendió un efecto menor puesto que 1/7 ratones no desarrolló un tumor. En adición, la supervivencia fue levemente mejor en este grupo CpG 1668 y el volumen promedio de tumores fue menor que en el grupo de control luego de tres semanas. En contraste, los ratones tratados con la combinación de CpG 1668 y anti-IL10R, aunque se desarrollaron tumores palpables, rechazaron estos tumores de 6 a 7 ratones. Subsiguientemente, aquellos ratones permanecieron libres de tumor por el resto del experimento. Estos resultados indican que la combinación del agonista TLR-9 y el antagonista IL-10 comprende valor terapéutico en el modelo C26-26CK, lo cual sugiere que se podría utilizar para tratar otros tumores, incluidos en el hombre.

EJEMPLO VI Efecto terapéutico de CpG 1668 * anticuerpo anti-IL10R en el modelo de tumor C26 - 5 x 104 células de tumor C26 se implantaron s.c. el día 0 en grupos de siete ratones hembras BALB/c de 8 semanas de edad y se trataron como se indica a continuación - 5 µ? de CpG 1668 se inyectaron intratumoralmente el día 7, 14 y 21 - 250 de anticuerpo anti-IL10R purificado se inyectaron intraperitonealmente el día 7, 14 y 21. El anticuerpo de control purificó el anticuerpo GL1 13. El desarrollo de tumor se determinó tres veces a la semana mediante palpación y los tumores se midieron mediante la utilización de un calibrador con un volumen de tumor = I2 x L x 0.4, I es el diámetro pequeño y L es el diámetro grande. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores excedieron 1500 mm3 o de acuerdo con el criterio humano. La figura 6 muestra que todos los ratones inyectados con anticuerpo de control, CpG 1668 o el anticuerpo anti-IL10R solo desarrollaron tumores en el transcurso de 7 días, lo cual finalmente condujo al sacrificio de los animales a las 3 a 4 semanas aproximadamente. En contraste, los ratones tratados con la combinación de CpG 1668 y anti-IL10R, aunque desarrollaron tumores palpables, 6 de 7 ratones rechazaron estos tumores.

Subsiguientemente, aquellos ratones permanecieron libres de tumor por el resto del experimento. Estos resultados indican que la combinación del agonista TLR-9 y el antagonista 11-10 comprende valor terapéutico en el modelo C26, lo cual sugiere que se podría utilizar para tratar otros tumores, incluidos en el hombre.

EJEMPLO VII Efecto terapéutico de CpG 1668 ÷ anticuerpo anti-IL10R en el modelo de tumor melanoma B16F0 - 5 x 104 células de tumor B16F0 se implantaron s.c. el día 0 en grupos de ratones hembras C57BL/6 de 8 semanas de edad y se trataron como se indica a continuación - 5 í_ig de CpG 1668 se inyectaron intratumoralmente el día 7, 14 y 21 - 250 ng de anticuerpo anti-IL10R purificado se inyectaron intraperitonealmente el día 7, 14 y 21. El anticuerpo de control purificó el anticuerpo GL113. El desarrollo de tumor se determinó tres veces a la semana mediante palpación y los tumores se midieron mediante la utilización de un calibrador con un volumen de tumor = I2 x L x 0.4, I es el diámetro pequeño y L es el diámetro grande. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores excedieron 1500 mm3 o de acuerdo con el criterio humano.

La figura 7 muestra que todos los ratones inyectados con anticuerpo de control, CpG 1668 o el anticuerpo anti-ILOR solo desarrollaron tumores en el transcurso de 7 días, lo cual finalmente condujo a sacrificio de los animales a las 3 a 4 semanas aproximadamente CpG solo comprendió un efecto menor en la supervivencia. En contraste, los ratones tratados con la combinación de CpG 1668 y anti-IL10R, aunque desarrollaron tumores palpables, rechazaron estos tumores 6 de 7 ratones. Subsiguientemente, aquellos ratones permanecieron libres de tumor por el resto del experimento. Estos resultados indican que la combinación del agonista TLR-9 y el antagonista IL-10 comprende valor terapéutico en el modelo B16F, lo cual sugiere que se podría utilizar para tratar otros tumores, incluidos en el hombre.

EJEMPLO VIII CP infiltrantes de tumores C26-6CK pueden producir IL-12 en respuesta a la combinación del anticuerpo anti-IL10 v CpG 1668 TIDC de los tumores C26-6CK se enriquecieron mediante la utilización de partículas magnéticas anti-CD11c y se cultivaron durante toda la noche en presencia de GM-CSF y varias combinaciones de un anticuerpo anti-IL10 purificado y CpG 1668. El análisis FACS de la expresión intracelular de IL-12p40 con respecto a la expresión de superficie de CD11c luego de 20 horas incluidas 2.5 horas de incubación con Brefeldin A.

La figura 8 muestra que la combinación de CpG 1668 y ant¡-IL10 puede inducir a la producción de IL-12 en células dendríticas Infiltrantes de tumor C26-6CK, lo cual sugiere que un antagonista de IL-10 mismo, cuando se asocia con una cantidad efectiva del agonista TLR-9, es efectivo en el tratamiento del cáncer.

EJEMPLO IX La inhibición de la activación de CP derivadas de la médula ósea mediante un sobrenadante de un tumor C26 se puede restaurar mediante anti-ILIOR v/o indometacina un inhibidor de ciclooxiqenasas Las CD derivadas de la médula ósea se obtuvieron mediante el cultivo de progenitores de médula ósea con GM-CSF y TNF-a durante 5 días en presencia o ausencia de 10% p/p de un sobrenadante de los tumores C26. Para preparar el sobrenadante de tumor, 0.5 cm de tumores C26 desarrollados subcutáneamente en ratones BALB/c se extirparon y cortaron, luego se cultivaron durante 48 horas en 10 mi de DMEM. El sobrenadante resultante se filtró a 0.2 µp\ y se congeló antes de su utilización. Este sobrenadante resultante se filtró a 0.2 µ?? y se congeló antes de su utilización. Este sobrenadante contenía 0.25 ng/ml IL-10 y 50 ng/ml PGE2, como se determina mediante ELISA específico (R&D Systems). Con el fin de Inhibir la síntesis de PGE2 en el sobrenadante, el inhibidor de clclooxigenasa indometacina (Sigma) se añadió a 1 ng mi durante 48 horas de cultivo.

Luego de 5 días, las CD de médula ósea se activaron con diferentes combinaciones de dosis óptimas de LPS, IFNy y anticuerpo anti-CD40 en presencia o ausencia de 10 9/G?? de anticuerpo ant¡-IL10R. La activación de CD se midió mediante su expresión de moléculas coestimuladoras CD40 y CD86 por FACS así como también mediante la producción de IL-12 como se detectó mediante la coloración ¡ntracelular. La figura 9 muestra que el sobrenadante de tumor C26 es capaz de inhibir la activación de las CD. La adición del sobrenadante se realizó en presencia de ¡ndometacina o de anti-IL10R para el cultivo de CD alivio parcialmente el efecto, mientras que la combinación de ambos podría restaurar completamente la regulación positiva de CD40 y CDE86 así como también la expresión IL-12. Estos experimentos siguieren fuertemente que los productos de ciclooxigenasas, en particular prostaglandlnas, también son factor inhibidor de CD derivado de tumor.

EJEMPLO X Efecto terapéutico de CpG 668 + indometacina en el modelo de tumor C26-6CK - 5 x 104 células de tumor C26-6CK se implantaron s.c. el día 0 en grupos de ratones hembras BALB/c de 6 semanas de edad y se trataron como se indica a continuación 5 µg de CpG 1668 se inyectaron intratumoralmente el día 7, 14 y 21 - 5 ng/ml de indometacina ad libitum en agua potable comenzando el día 5 hasta el día 28 El desarrollo de tumor se determinó tres veces a la semana mediante palpación. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores excedieron 1500 mm3 o de acuerdo con el criterio humano. La figura 10 muestra que todos los ratones de control desarrollaron tumores en el transcurso de 7 días, lo cual finalmente condujo al sacrificio de los animales a las 3 a 4 semanas aproximadamente. Solamente, 1/7 ratones en CpG o grupos de indometacina no desarrollaron tumores. En contraste, 4.7 ratones tratados con la combinación de CpG 1668 e indometacina no desarrollaron tumores. Estos resultados indican que la combinación del agonista TLR-9 y el inhibidor de ciclooxigenasa comprende valor terapéutico en el modelo C26-6CK, lo cual sugiere que se podría utilizar para tratar otros tumores, incluidos en el hombre. Gran cantidad de modificaciones y variaciones de esta invención se pueden realizar sin apartarse del espíritu y área como será evidente por aquellos experimentos en la técnica. Las modalidades especificas descritas aquí se ofrecen como medio de ejemplo solamente y la invención se va a limitar solamente por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el área total de equivalentes a los cuales estas reivindicaciones se refieren.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1- El uso de un antagonista del factor inhibidor de célula dendritica (CD) derivado de tumor en combinación con una cantidad efectiva de un agonista TLR en la preparación de un medicamento para tratar cáncer. 2. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en que el antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor se selecciona del grupo constituido por un antagonista IL-6, un antagonista VEGF, un antagonista CTL-4, un antagonista OX-40, un antagonista TGF-B, un antagonista de prostaglandina, un antagonista de gangliosida, un antagonista M-CSF y un antagonista M-CSF y un antagonista IL-10. 3. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en que el antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor es un antagonista IL-10. 4. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en que el antagonista IL-10 se selecciona del grupo constituido por un antagonista de IL-10 y un antagonista del receptor IL-10 5.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 4, en que el antagonista IL-10 es: a) recombinante, b) un ligando natural, c) una molécula pequeña, d) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, e) una secuencia de nucleótido de antisentido, o f) una molécula del receptor IL-10 soluble. 6.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 5, en que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 7.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-LL-10R. 8. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en que el antagonista TLR es: a) recombinante, b) un ligando natural, c) una secuencia de nucleótidos inmunoestimuladores, d) una molécula pequeña, e) un extracto bacteriano purificado, f) una preparación de bacterias inactivas. 9. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en que el antagonista TLR es un antagonista TLR-9. 10. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en que el antagonista TLR es una secuencia de nucleótidos inmunoestimuladores. 11.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 10, en que la secuencia de nucleótidos inmunoestimuladores contiene motivo CpG. 12. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 11 , en que el nucleótido inmunoestimulador se selecciona del grupo constituido por CpG 2006 (SEC ID N°1 ), CpG 2216 (SEC ID ND2), AAC-30 (SEC ID N°3) y GAC-30 (SEC ID N°4). 13. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 10, en que la secuencia de nucleótidos inmunoestimuladores se estabiliza mediante la modificación de la estructura como modificación de fosforotioato. 14. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 10, en que la secuencia de nucleótidos inmunoestimuladores se encapsula en liposomas catiónicos. 15. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en que el antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor es un anticuerpo monoclonal anti-IL-10R y el antagonista TLR es CpG 2006 (SEC ID N°1 ). 16. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , que comprende adicionalmente la provisión de una sustancia, la cual permite la liberación lenta del antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor y/o antagonista TLR es un lugar de suministro. 17. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en que el antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor y/o antagonista TLR se provee por vía intravenosa, intratumoral, ¡ntradérmica, intramuscular, subcutánea o tópica. 18.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , que comprende adicionalmente la provisión de al menos un antígeno asociado al tumor. 19.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 18, en que el antigeno asociado al tumor se une al agonista TLR. 20.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 18, en que al antigeno asociado al tumor se selecciona del grupo constituido por Melan-A, tirosinasa, p97, ß-HCG, GalNAc, MAGE-1 , MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-12, MART-1 , MUC1 , MUC2, MUC3, MUC4, MUC18, CEA, DDC, antigeno de melanoma gp75, Hker 8, antígeno de melanoma con alto peso molecular, K19, Tyr1 y Tyr2, miembros de la familia de genes p el 17, c- et, PSA, PSM, a-fetoproteína, tiroperoxidasa, gp100, NY-ESO-1 , telomerasa p5. 21.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en que el cáncer a tratarse se selecciona del grupo constituido por melanoma, carcinomas mamario, pancreático, colónico, pulmonar, de glioma, hepatocelular, endometrial, gástrico, intestinal, renal, prostético, tiroidal, oválico, testicular, hepático, de cabeza y cuello, colorrectal, esofágico, estomacal, ocular, vesicular, de glioblastoma y metastásico. 22 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , que comprende adicionalmente la provisión de un agente activante. 23. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 22, en que el agente activante se selecciona del grupo constituido por IFIM-ct, TNF-a, ligando/antagonista RANK, ligando/agonista CD40-L o ligando/agonista de otro miembro de la familia del receptor TNF/CD40. 24. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , que comprende adicionalmente la provisión de una citosina, la cual incrementa la cantidad de células dendríticas en la sangre. 25.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 24, caracterizado porque el agente de proliferación de células dendríticas se selecciona del grupo constituido por FLT3-L, GM-CSF y G-CSF. 26. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , que comprende adicionalmente el suministro al tumor de una quimiocina activa en las células dendríticas. 27. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 26, en que la quimiocina se selecciona del grupo constituido por CCL21 , CCL3, CCL20, CCL16, CCL5, CCL25, CXCL12, CCL7, CCL8, CCL2, CCL13, CXCL9, CXCL10, CXCL11. 28. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 26, en que la quimiocina se suministra al tumor mediante la utilización de una formación objetivo que comprende una quimiocina o un fragmento biológicamente activo o una variante de él y una fracción objetivo. 29. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en que la fracción objetivo se selecciona del grupo constituido por: a) un péptido de al menos 10 aminoácidos, b) una proteína, c) una molécula pequeña, d) un vector y e) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. 30. - El uso como el que se reclama en la reivindicación , en que el antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor y/o antagonista TLR se unen entre sí. 31. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 30, en que el antagonista del factor inhibidor de CD derivado de tumor y/o antagonista TLR además se unen a un antígeno asociado al tumor.