MXPA03009877A - Clonacion y secuenciamiento de genes de piruvato decarboxilasa (pdc) a partir de bacterias y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La invencion ofrece moleculas de acido nucleico aisladas que codifican enzimas piruvato decarboxilasa que tienen una actividad decarboxilasa mejorada, afinidad por substrato, termo-estabilidad, y actividad en nivels diferentes de pH. Los acidos nucleicos de la invencion tienen tambien un uso de codon que permite una alta expresion en varias celulas huespedes. Por consiguiente, la invencion ofrece vectores de expresion recombinantes que contienen dichas moleculas de acido nucleico, celulas huespedes recombinantes que comprenden los vectores de expresion, celulas huespedes que comprenden ademas otras enzimas etanologenicas, y metodos para la produccion de sustancias utiles, por ejemplo, acetaldehido y etanol, utilizando tales celulas huespedes.

Description

CLONACIÓN Y SECUENCIAMIENTO DE GENES DE PIRUVATO DECARBOXILASA (PDC) A PARTIR DE BACTERIAS Y USOS DE LOS MISMOS Información relacionada Esta solicitud reclama prioridad sobre la solicitud provisional norteamericana No. 60/288,638 titulada "High-Level Production of Active Sarcina ventriculi Pyruvate Decarboxylase in Recombinante Bacillus megaterium"; solicitud provisional norteamericana No. 60/288,671, titulada "Cloning, Expression, y Characterization of Pyruvate Decarboxylase from the Acid-Tolerant, Anaerobic Gram-Positive Bacterium Sarcina ventriculi Goodsir"; solicitud provisional norteamericana No. 60/288,698, titulada "Acetobacter pasteurianus Pyruvate Decarboxylase: Biochemical, Genetic, y Physiological Properties", solicitud provisional norteamericana No. 60/288,622, titulada ""Biochemical and Biophysical Characterization of Pyruvate Decarboxylase from t ;« Acetic Acid Bacterium Acetobacter pasteurianus"; y solicitud provisional norteamericana No. 60/288, 699, titulada "Pyruvate Decarboxylase"; todas las cuales fueron presentadas el día 4 de mayo del 2001 y se incorporan aqui en su totalidad por referencia. El contenido de todas las patentes, solicitudes de patente, y referencias citadas en esta especificación se incorporan aqui por referencia en su totalidad. Investigación patrocinada por el gobierno Este trabajo fue apoyado, en parte, por aportaciones del National Renewable Energy Laboratory [Laboratorio Nacional de Energías Renovables] del departamento norteamericano en materia de energía /ZDH-9-29009-04 ) , Energy Biosciences Program [Programa de biociencias en materia de energía] (FG02-96ER20222) , y el Florida Agricultural Experiment Station [Estación experimental agrícola de Florida] . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Muchos beneficios ambientales y para la sociedad resultarían del reemplazo de combustibles basados en petróleos para los automóviles por combustibles renovables obtenidos de materiales vegetales (Lyn y colaboradores (191) Science 251:1318-1323; Olson y colaboradores (1996) Enzyme Microb. Technol. 18:1-17: Wyman y colaboradores (1995) Amer. Chem. Soc. Symp. 618:212-290) . Cada año, los Estados Unidos de América queman más de 500,000,000,000 litros (120 billones de galones) de combustible para automóviles, lo que equivale aproximadamente a la cantidad total del petróleo importado. El desarrollo de etanol como una fuente alternativa renovable tiene el potencial de eliminar la dependencia norteamericana del petróleo importado, mejorar el medio ambiente y proporcionar nuevos empleos (Sheehan, (1994) ACS Symposium Series No. 566, ,ACS Press, páginas 1-53) . En teoría, la solución al problema del petróleo importado para combustible para automóviles parece bastante sencilla.

En lugar de utilizar petróleo, un recurso limitado, el etanol, un recurso renovable, puede ser producido eficientemente por fermentación del material vegetal. De hecho, el Brasil ha demostrado la posibilidad de producir etanol y del uso del etanol como combustible automotriz primario durante más de 20 años. De manera similar, los Estados Unidos de Norteamericana producen más de 5,000,000,000 de litros (1.2 billones de galones) de etanol combustible cada año. Hoy en día, el etanol combustible es producido a partir de almidón de maíz o bien jarabe de caña utilizando ya sea Saecharomyees cerevisiae o Zymomonas obilis (Z. mobilis) . Sin embargo, ninguna de estas fuentes de azucares puede suministrar los volúmenes requeridos para reemplazar los combustibles basados en petróleo para los automóviles. Además, tanto el azúcar de caña como el almidón de maíz son materia iniciales relativamente costosas que tienen usos como productos alimenticios que compiten con su uso como combustible. Además, estos substratos de azúcares representan solamente una fracción del total de carbohidratos en plantas. De hecho, la mayoría de los carbohidratos en plantas están en forma de lignocelulosa, un polímero estructural complejo que contiene celulosa, en hemicelulosa, pectina y lignina. La lignocelulosa se encuentra por ejemplo en los talles, hojas, cáscaras, vainas y mazorcas de plantas. La hidrólisis de estos polímeros libera una mezcla de azúcares neutrales incluyendo glucosa, xilosa, ¦ mañosa, galactosa, y arabinosa. Ningún organismo natural conocido puede metabolizar rápida y eficientemente todos estos azúcares en etanol. Sin embargo, en un esfuerzo por explotar esta fuente de substrato, la Gulf Oil Company desarrollo un método para la producción de etanol a partir de celulosa utilizando un proceso basado en levadura llamado sacarificación y fermentación simultánea (SSF por sus siglas en inglés) (Gauss y colaboradores (1976) U.S.P.N. 3,990,944). Preparaciones de celulasa fúngales y levaduras fueron agregadas a una pasta del substrato celulósico en un recipiente único. Se produjo etanol concurrentemente durante la hidrólisis de la celulosa. Sin embargo, el proceso de SSF de Gulf tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, el tiempo de ciclo celular para la levadura es relativamente largo (24-36 horas) y son incapaces de fermentar azúcares complejos. Además, celulasa fúngales han sido agregadas las cuales han sido consideradas hasta la fecha como excesivamente costosas para su uso en procesos de bioetanol a gran escala (Himmel y colaboradores (1997) Amer. Chem. Soc. páginas 2-45; Ingram y colaboradores (1987) Appl. Envizon. Microbiol . 23:2420-2425; Okamoto y colaboradores (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 42:563-568; Philippidis, G., (1994) Amer. Chem. Soc. páginas 188-217; Saito y colaboradores (1990) J. Ferment. Bioeng 69:282-286, Sheehan, J. (1994) er. Chem. Soc. Páginas 1-52; Su y colaboradores (1993) Biotechnol. Lett. 15:979-984). Además, la producción de etanol utilizando otros organismos es difícil puesto que el piruvato decarboxxlasa (PDC) , una enzima clave para la fermentación del etanol, es común solamente en plantas, levadura y hongos; y se encuentra raras veces en bacterias y no se encuentra en animales (Candy, J. M. y . G. Duggleby. 1998. Structure and properties of pyruvate decarboxylase and site-directed mutagenesis of the Zymomonas mobills enzyme [Estructura y propiedades de piruvato decarboxilasa y mutagenesis dirigida a sitio de la enzima Zymomonas mobills]. Biochim. Biophys . Acta 1385:323-338; Kónig, S. 1998. Subunit structure, function and organization of pyruvate decarboxylases from various organisms [Estructura sub-unitaria, función y administración de piruvatos decarboxilasas de varios organismos] . Biochim. Biophys. Acta 1385:271-286). COMPENDIO DE LA INVENCIÓN El desarrollo de métodos enzimáticos económicos para la fermentación del etanol tiene un gran potencial para mejorar la eficiencia de la utilización de substrato y los aspectos económicos del proceso de fermentación. Por consiguiente, el desarrollo de enzimas y de manera provechosa de biocatalizadores que producen tales enzimas que pueden ser utilizados para la despolimerización eficiente de azúcares complejos y la fermentación rápida subsecuente del azúcar en alcohol, sería de gran beneficio. Algunos microbios, por ejemplo bacterias gram negativas y bacterias gram positivas producen numerosas enzimas de fermentación que se pueden catalizar, por ejemplo, la despolimerización de celulosa y hemicelulosa para producir azúcares fermentables, la conversión de un azúcar en piruvato, la conversión del piruvato de substrato en acetaldehído, y finalmente la conversión de acetaldehído de substrato en metanol. Sin embargo, tales organismos producen raras veces todas las enzimas necesarias en los niveles más deseables . Por consiguiente, la presente invención ofrece genes que codifican piruvato decarboxilasas que pueden ser expresados en altos niveles en un rango de organismos. Así, cuando se expresan en un organismo o cuando se cultivan con un organismo que produce las enzimas claves restantes requeridas para la fermentación de etanol, niveles superiores de producción de etanol pueden lograrse. Estas enzimas, por ejemplo, piruvato decarboxilasa (PDC) , solas o en combinación con alcohol deshidrogenasa (ADH) , pueden utilizarse como un extracto crudo que tiene una mezcla deseada de actividad, o bien pueden utilizarse como una composición purificada. Además, un biocatalizador, de manera provechosa o una bacteria recombinante de manera más provechosa una bacteria etanologénica, puede ser manipulada para expresar una o varias de estas actividades enzimáticas en cantidades particulares suficientes para la fermentación de un azúcar (varios azúcares) . Dicho biocatalizador es adecuado para la degradación eficiente de azúcares complejos y la fermentación subsecuente en alcohol por un proceso conocido como sacarificación y fermentación simultáneas (SSF por sus siglas en inglés) . La presente invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de genes que codifican enzimas claves de fermentación de etanol en bacterias. En particular, la identificación del gen pdc de Zymobacter palmae, Acetobacter pasteurianus, y Saxcina ventriculi se ha logrado. Se ha determinado que estos genes codifican las enzimas piruvato decarboxilasa gue tienen una actividad piruvato decarboxilasa superior, afinidad de substrato, por ejemplo, para piruvato, asi como termoestabilidad, y actividad superior en pH diferente. Además, los genes pdc de la presente invención tienen un uso de codón que permite su expresión alta en un rango de organismos. Por consiguiente, en un aspecto, la invención ofrece moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de piruvato decarboxilasa (PDC por sus siglas en inglés) o bien porciones biológicamente activas de las mismas, asi como fragmentos de ácido nucleico adecuados como cebadores o sondas de hibridación para la detección de ácidos nucleicos que codifican PDC." En una modalidad, una moléculas de ácido nucleico de piruvato decarboxilasa {pdc) de esta invención tiene por lo menos un nivel de identidad de aproximadamente 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o más con la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en comparación con la longitud global de la secuencia de nucleótidos) mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 5, o un complemento del mismo. En una modalidad . particular, la molécula de ácido nucleico aislada incluye la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 5, o un complemento de la misma. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de pdc incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homologa con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID . NO: 2, 4 ó 6. En una modalidad particular, una molécula de ácido nucleico de pdc incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido (PDC) que tiene un nivel de identidad de por lo menos 50%, 60%, 705, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o más de identidad (por ejemplo, en comparación con la longitud global de la secuencia de aminoácidos) con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, 4 ó 6. En una modalidad particular, una molécula de ácido nucleico aislada codifica la secuencia de aminoácidos de la enzima piruvato decarboxilasa de Zymobacter palmae que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En otra modalidad particular, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la secuencia de aminoácidos de la enzima piruvato decarboxilasa de Acetobacter pasteurianus que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En otra modalidad particular, una molécula de ácido nucleico aislada codifica la secuencia de aminoácidos de la enzima piruvato de decarboxilasa de Sarcina ventriculi que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En otra modalidad particular, la molécula de ácido nucleico tiene por lo menos aproximadamente 1600 nucleótidos de longitud y codifica un polipéptido que tiene una actividad piruvato decarboxilasa (de conformidad con lo descrito aqui) . En una modalidad más particular, la invención ofrece un plásmido pJAM3440, que codifica un gen pdc derivado de Zymobacter palmae representado por un depósito ante la American Type Culture Collection designado como número de deposito ATCC PTA-4254. En una modalidad relacionada, la invención ofrece un plásmido pJAM304, que codifica un gen pdc derivado de Acetobacter pasteurianus representado por un depósito ante la American Type Culture Collection designado como número de depósito ATCC PTA-4252. En otra modalidad relacionada, la invención ofrece un plásmido, pJAM419, que codifica un gen pdc derivado de de Barcina ventriculi representado por un depósito ante la American Type Culture Collection designado como número de depósito ATCC 4253. Otra modalidad de la invención presenta moléculas de ácido nucleico,- de manera provechosa, moléculas de ácido nucleico de piruvato decarboxilasa, que detectan en forma específica moléculas de ácido nucleico de piruvato decarboxilasa (es decir, gen (es) de pdc) con relación a moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de no piruvato decarboxilasa (PDC) . Por ejemplo, en una modalidad, dicha molécula de ácido nucleico tiene por lo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 500-1000, 1000-1500, 1500-1500 o más nucleotidos de longitud y/o se híbrida bajo condiciones estrictas a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de. nucleotidos mostrada en SEQ ID NO: 1, 3 ó 5, o un complemento de la misma. Se entenderá que la molécula de ácido nucleico puede tener una longitud dentro de un rango que tiene uno de los números representados arriba como límite inferior y otro número como límite superior para el número de nucleotidos de longitud, por ejemplo, moléculas que tienen 60-80, 300-1000, o 150-400 nucleotidos de longitud. En modalidades particulares, las moléculas de ácido nucleico tienen por lo menos 15 nucleótidos (por ejemplo, contiguos) de longitud y se hibrida bajo condiciones estrictas con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3 ó 5. Por consiguiente, la invención ofrece un método para detectar la presencia de un ácido nucleico de pdc de la invención utilizando el ácido nucleico antes mencionado. En otras modalidades particulares, la molécula de ácido nucleico codifica una variante alélica que ocurre naturalmente de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, ó 6, en donde la molécula de ácido nucleico, se hibrida a una molécula de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 1, 3 ó 5, respectivamente, ajo condiciones estrictas. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico de la presente invención se encuentra en un vector y puede estar opcionalmente unida a un promotor sustituto y/o secuencias adicionales de ácido nucleico que codifican un polipéptido heterólogo. En una modalidad particular, la invención ofrece células huésped que contiene una molécula de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, contenida en un vector o bien integrada en forma estable en el genoma de la célula huésped. En una modalidad particular, la célula huésped comprende una secuencia de ácido nucleico héterologa que codifica piruvato decarboxilasa derivada de una célula bacteriana, por ejemplo Zymobacter palmae, Acetobacter pasteurianus, o Sarcir. ventriculi , por ejemplo, de conformidad con lo proporcionado en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o bien SEQ ID NO: 5. En otra modalidad, la célula huésped que contiene un gen pdc puede ser etanologénica, por ejemplo, naturalmente etanologénico y/o puede comprender además un gen etanologénico o varios genes etanologénicos que codifica (n) alcohol deshidrogenase, glucanasa, secretasa, o una combinación de ellas. En una modalidad relacionada, la célula huésped es adecuada para fermentar etanol a partir de un azúcar. En una modalidad particular, la célula huésped es una célula huésped etanologénica recombinante que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una PDC mostrada en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6. El ácido nucleico heterólogo puede estar bajo el control de un promotor sustituto exógeno. La célula huésped mencionada arriba puede ser una célula bacteriana gram negativa o una célula bacteriana gram positiva. Una célula huésped gram negativa de la presente invención puede ser, por ejemplo, Gluconcbacter, Rhizobium, Bradyrhizobiumr Alcaligenesr Rhodobacter, Rhodococcus, Azospírillum, Rhodospirillum, Sphingomonas, Burkholderia, Desulfomonas, . Geospixillum, Succinomonas, Aeromonas, Shewanella, Halochromatium, Citzobacterf Escherichia, Klebsiella, Zymomonas, Zymobacterr o bien Acetobacter.

Una células huésped gram positiva de la invención puede ser por ejemplo, Fíbrobacter, Acidobacter, Bacteroides Sphingobacterium, Actinomycesr Corynebacterium, Nocardia Rhodococcus, Propionibacterium, Bífidobacterium, Bacillus GeobacilluSr Paenibacillus, Sulfobacillus, Clostridium Anaerobacterr Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus Leuconostoc, Enterococcus, Lactococcusr Thermobifida Cellulomonas, o Sarcina. otro aspecto, la invención ofrece un polipéptido aislado que tiene un nivel de identidad de por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o más de (por ejemplo, en comparación con la longitud global de la secuencia de aminoácidos) con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, 4 ó 6. En una modalidad, el polipéptido aislado de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6. En una modalidad relacionada, el polipéptido aislado tiene una actividad piruvato decarboxilasa . La piruvato decarboxilasa de la invención puede seleccionarse para actividad mejorada, por ejemplo, actividad piruvato decarboxilasa, pero también, por ejemplo, uso mejorado de codón, afinidad de substrato (por ejemplo, piruvato), estabilidad térmica y/o actividad a un cierto pH. Dicho piruvato decarboxilasa de la invención puede ser un polipéptido alterado o quimérico para lograr cualquiera de las propiedades mencionadas arriba. Además, el polipéptido puede comprender adicionalmente aminoácidos heterólogos, por ejemplo, un inmunomarcador para purificación o detección.

En otro aspecto, la invención ofrece un anticuerpo que se une selectivamente a un polipéptido de la invención (o fragmento del mismo), por ejemplo, una enzima piruvato decarboxilasa, como se muestra, por ejemplo, en SEQ ID NO: 2, 4 ó 6. Por consiguiente, la invención ofrece un método para detectar un piruvato decarboxilasa de la invención utilizando dicho anticuerpo . En otro aspecto, la invención ofrece un método para la producción de una piruvato decarboxilasa de la invención mediante la expresión de la célula huésped de uno de los ácidos nucleicos antes mencionados de la invención bajo condiciones de cultivo adecuadas . Un ácido nucleico puede ser alterado o sometido a mutación para mejorar el uso de codón del ácido nucleico a la actividad decarboxilasa del producto · codificado [por ejemplo, estabilidad térmica, afinidad de substrato, o actividad en varios pH) . En otro aspecto, la invención ofrece un método para la producción de un acetaldehido mediante el cultivo de uno de los huéspedes antes mencionados bajo condiciones en los cuales se expresa piruvato decarboxilasa en niveles suficientes de tal manera que se produzca acetaldehido a partir de piruvato. En una modalidad relacionada, un método para la producción de acetaldehido se lleva a cabo mediante la puesta en contacto de un lisado celular obtenido a partir de la célula huésped antes mencionada bajo condiciones en las cuales se produce acetaldehido a partir de piruvato. Por-consiguiente, la invención ofrece extractos de enzima que tienen una actividad decarboxilasa mejorada y que tienen, por ejemplo, una estabilidad térmica, actividad en varios pH, y/o afinidad superior de substrato. En otro aspecto, la invención ofrece un método para la producción de etanol mediante el cultivo de la célula huésped antes mencionada bajo condiciones en las cuales piruvato decarboxilasa y alcohol deshidrogenasa se expresan en niveles suficientes de tal manera que se produzca etanol como un producto primario de fermentación. En otro aspecto, la invención ofrece un método para seleccionar una enzima piruvato decarboxilasa con una actividad decarboxilasa mejorada (por ejemplo, una afinidad mejorada para piruvato, estabilidad térmica, actividad a pH diferente) comparando la secuencia de aminoácidos de una piruvato decarboxilasa con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o bien SEQ ID NO: 6; y alterando por lo menos ' un residuo de aminoácidos de la piruvato decarboxilasa para que tenga identidad con el residuo de aminoácido correspondiente de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6, de tal manera que se logre un polipéptido con actividad piruvato decarboxilasa mejorada. En una modalidad relacionada, la invención, ofrece un método para seleccionar una enzima piruvato decarboxilasa para expresión en una célula huésped receptora en comparación con la secuencia de ácido nucleico que codifica una piruvato decarboxilasa con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o bien SEQ ID NO: 5; y alterando por lo menos un codón del ácido nucleico que codifica la enzima piruvato decarboxilasa para que tenga identidad con el codón correspondiente de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5, de tal manera que la expresión mejorada del ácido nucleico alterado que codifica la enzima piruvato decarboxilasa se logre en la célula huésped. En otra modalidad relacionada, la invención ofrece un método para seleccionar una enzima piruvato decarboxilasa con expresión mejorada en una célula huésped receptora mediante la comparación de la secuencia de ácido nucleico que codifica una piruvato decarboxilasa con el uso de codón de la célula huésped receptora y alterando por lo menos un codón del ácido nucleico que codifica la enzima piruvato decarboxilasa de tal manera que corresponda con el uso de codón de la célula huésped receptora de tal manera que se logre en la célula huésped una expresión mejorada del ácido nucleico alterad: que codifica la enzima piruvato decarboxilasa. En otra modalidad relacionada, la invención proporciona un método para seleccionar una enzima piruvato decarboxilasa por expresión mejorada de una célula huésped receptora mediante la comparación de la secuencia de ácido nucleico que codifica usía pxruvato decarboxilasa con el uso de codón de la célula huésped receptora y alterando la célula huésped receptora para producir en forma recombinante por lo menos un ARNt que corresponde a un codón del ácido nucleico que codifica la enzima piruvato decarboxilasa de tal manera que se logre una expresión mejorada del ácido nucleico que codifica la enzima piruvato decarboxilasa en la célula huésped alterada. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones adjuntas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra una representación esquemática del gen pdc de Zymobacter palmae. El plásmido pJAM3400 lleva un fragmento BamHI de 6-kb de ADN genómico de Z. palmae de extremo plano y ligado en el vector de plásmido pLITUMS28. Los plásmidos restantes fueron derivados de pJAM3400 y fueron utilizados para análisis de secuencia de ADN de una región de 2.9 kb que incluyo el gen pdc. El plásmido pJAM3440 fue utilizado para producir el polipéptido de PDC de Z. palmae en E. coli recombinante. La cabeza de flecha indica la dirección de transcripción de gen pdc. La figura 2 muestra una representación esquemática del gen pdc Acetobacter pasteurianus. El plásmido pJAM301 lleva un fragmento AatlI de 6,331 pares de bases de ADN genómico de A. pasteurianus ligado al sitio Xhol de vector de plásmido pLITMU28. Las salientes 3' y 5' generadas por AatlI y Xhol fueron terminadas en forma plana con Vent ADN polimerasa antes de ligación. Los plásmidos restantes fueron derivados de pJAM301 y fueron utilizados para análisis de secuencia de ADN. El plásmido pJAM304 fue utilizado para producir una proteina de PDC de A. pasteurianus en E. coli recombinante . Las cabezas de flecha indican la dirección de transcripción y traducción de los ORFs deducidos. La figura 3 muestra una representación esquemática del gen pdc de S. ventriculir varios plásmidos producidos para secuenciamiento y caracterización de locus de pdcr y los plásmidos pJAM413, pJAM419, y pJAM418 que comprenden el cuadro de lectura abierto de pdc y son adecuados para expresión más elevada del gen pdc en bacterias. La figura 4 muestra la secuencia de ácido nucleico . (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) para el gen pdc y el producto génico de Zymobacter palmae. La figura 5 muestra la secuencia de ácido nucleico {SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) para el gen pdc y el producto génico de Acetobacter pasteurianus. Un promotor putativo es subrayado dos veces con la secuencia de consenso de promotor -35 y —10 indicada directamente debajo d la secuencia predicha para PDC y resaltada por letras mayúsculas en la secuencia de ácido nucleico de pdc. Las cabezas de flecha arriba de la secuencia de ADN indican los sitios de inicio de transcripción. Las bases subrayadas indican un sitio de unión de ribosoma de "Shine-Delgarno" . Un asterisco indica un codón de terminación de traducción. Flechas debajo de la secuencia de ADN indican una estructura de tallo-bucle, que puede facilitar la terminación de transcripción independiente de p- . La figura 6 muestra a la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 5) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) para el gen pdc y el producto génico de Sarcina ventrículi. La figura 7 muestra una gráfica que ilustra la termoestabilidad de enzimas PDC bacterianas diferentes . Los polipéptidos Zmo (·) , Zpa(«), Apa (o) y Sve (?) , de PDC "recombinante" fueron pre-incubados a en las temperaturas indicadas en 50 mM de amortiguador de citrato de sodio a pH 5.0 con 1 mM de TOO y 1 mM de MgCl2 durante 30 minutos, enfriados a 0o C, y ensayados para determinar la reactividad residual a 25° C en el mismo amortiguador. 100% es la actividad después de pre-incubado a 0o C. Se purificó SvePDC a partir de BL21-CodonPlus-RIL de E. coli (pJAM419) . La figura 8 muestra una gráfica que ilustra el efecto del pH sobre la actividad de las enzimas de PDC bacterianas . ZpaPDC (·) y ApaPDC (.) "recombinantes", ZpaPDC (o) y ApaPDC (?) "nativos". La actividad fue medida a una temperatura de 25° C en 50 mM de citrato de sodio desde pH 4.0 a 5.0 y 50 mM de amortiguador de fosfato de sodio de pH 5.5 a pH 8.0. 100% es la actividad en pH óptimo. La figura 9 muestra una alineación de múltiples secuencias de aminoácidos del polipéptido de PDC deducido de Z. palmae (SEQ ID NO: 2) alineado con polipéptidos de PDC seleccionados, es decir, Z. mobílis (SEQ ID NO: 8), A. pasteurianus (SEQ ID NO: 4), S. ventriculi (SEQ ID NO: 6), Z. mays (SEQ ID NO: 9), y S. cerevisiae (SEQ ID NO: 10) . Los residuos de aminoácidos funcionalmente conservados (resaltados en negro) y los residuos de aminoácidos semiconservados [resaltados en gris) . Se introdujeron espacios en la alineación (—) . Residuos dentro de 0.4 nm de los sitios de unión de Mg2+ y TPP de la levadura y polipéptidos de de PDC de Z. mobilis (*) . Residuos de PDC 1 de levadura que forman enlaces hidrógeno con piruvamida (.) . Residuos con doble subrayado se conservan entre las enzimas dependientes de TPP. Abreviatura y número de acceso GenBank o SwissProt: Zpa, Z. palmae AF474145; Apa, A. pasteurianus, AR368435; Sce, Saccharomyces cerevisiae, P06169 Sve, Sarcina ventriculi , AF354297; Zma, Zea maysr P28516; Zmo, Zymomonas mobilis,. P06672. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Con el objeto de entender con mayor claridad el alcance cabal de la presente invención, se proporcionan las definiciones siguientes. Definiciones Como se emplea, aquí, el término "alcohol deshidrogenase" incluye la enzima capaz de convertir el acetaldehido en un alcohol, de manera provechosa, etanol. El término "quimérico" incluye una PDC mutante o alterada en donde un dominio entero derivado de otra PDC es manipulado (fusionado, intercambiado) con un dominio correspondiente en una PDC, utilizando, por ejemplo, la manipulación genética. El término "uso de codón" tiene el propósito de incluir el análisis de un ácido nucleico dado considerado para expresión en un organismo huésped receptor (o bien extracto acelular del mismo) para la ocurrencia o "uso" de ciertos codones que el organismo huésped requerirá (de manera provechosa en niveles suficientes) con el objeto de traducir el ácido nucleico en un polipéptido correspondiente. Con base en tales observaciones, el huésped receptor puede ser complementado en forma recombinante con cualquier codón necesario. Alternativamente, otro huésped puede ser seleccionado con un uso de codón superior o un ácido nucleico puede ser alterado para que ya no contenga un codón de limitación (por ejemplo, mediante la introducción de una mutación silencia o de varias mutaciones silenciosas) .

El término "actividad decarboxilasa" tiene el propósito de incluir la capacidad "de un polipéptido para convertir enzimáticamente piruvato en acetaldehido. Típicamente, la actividad de un polipéptido seleccionado abarca la actividad enzimática total asociada con el polipéptido producido, que comprende, por ejemplo, la afinidad superior de substrato de la enzima, termo-estabilidad, estabilidad en pHs diferentes, o una combinación de estos atributos. El término "derivado de" tiene el propósito de incluir el aislamiento (total o parcial) de un segmento de polinucleótido a partir de una fuente indicada. El término incluye, por ejemplo, clonación directa, amplificación por reacción en cadena de polimerasa, o bien síntesis artificial a partir de una secuencia asociada con la fuente de polinucleótidos indicada o basada en dicha secuencia. El término "etanologénico" tiene el propósito de incluir la capacidad de un microorganismo" para producir etanol a partir de un carbohidrato como producto de fermentación primario. El término abarca organismos etanologénicos que ocurren naturalmente, organismos etanologénicos con mutaciones naturales o inducidas así como organismos etanologénicos que han sido genéticamente modificados. Los términos "fermentar" y "fermentación" abarcan el proceso enzimático (por ejemplo, celular o acelular, por ejemplo, un lisado o mezclas de polipéptidos purificados) a través del cuál produce etanol a partir de un carbohidrato, en particular como producto primario de fermentación. El término "gen involucrado en la etanologénesis" se contempla para incluir cualquier gen capaz de proporcionar a una célula unas propiedades etanologénicas o capaz de mejorar cualquier aspecto de etanologénesis celular, por ejemplo, absorción de substrato, procesamiento de substrato, tolerancia al etanol, etc. Genes involucrados en la etanologénesis son, por ejemplo, alcohol deshidrogenasa, piruvato decarboxilasa, polipéptido secretario (polipéptidos secretarios), y polisacarasas, y estos genes o sus homólogos, pueden derivarse de cualquier organismo apropiado. El término "glucanasa" incluye un polipéptido capaz de catalizar la degradación o de polimerización de cualquier porción azúcar enlazada, por ejemplo, disacáridos, trisacáridos, oligosacáridos, incluyendo, carbohidratos complejos, que se conocen también aquí como azúcares complejos, por ejemplo, celooligosacárido y lignocelulosa, que comprende celulosa, hemicelulosa y pectina. Los términos incluyen celulasas tales como glucanasas, incluyendo de manera provechosa endoglucanasas, pero incluyendo también, por ejemplo, exoglucanasa, ß-glucosidasa, celobiohidrolasa, endo-1, 4-p-xilanasa, ß-xilosidasa, -glucuronidasa, -L-arabinofuranosidasa, acetilesterasa, acetilxilanesterasa, a-amilasa, ß-amilasa, glucoamilasa, pululanasa, ß-glucanasa, hemicelulasa, arabinosidasa, mananasa, pectina idrolasa, pectato liasa, o una combinación de cualquiera de estas celulasas . El término "célula bacteriana gram negativa" abarca la definición reconocida en la técnica con relación a este término. Típicamente, las bacterias gram negativas incluyen Gluconobacter, Rhizobium, Bradyhizoblum, Alcaligenes, Rhodobacterr Bhodococcus, Azospirillum, Bhodospirillum, Sphingomonasr Burkholderia, Desulfomonas, Geospirillum, Succinomonas, Aeromonas, Shewanella, Halochromatium, Citrobacter, Escherichia, Klebsiella, Zymomonas, (por ejemplo, Zymomonas mobilis) , Zymobacter (por ejemplo, Zymobacter palmae) , y Acetobacter (por ej mplo, Acetobacter pasteurianus) . El término "bacterias gram positivas" incluyen la definidos reconocida en la técnica con relación a este término. Típicamente bacterias gram positivas incluyen Fibrobacter, Acidobacter, Bacteroides, Sphingobacterium, Actinomyces, Corynebacteriu , Nocardia, Bhodococcus, Propionibacterium, Bifidobacterium, Bacillus, Geobacillus, Paeníbacillus, Sulfobacillus, Clostridium, Anaerobacter, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, leuconostoc, Enterococcus, actococcus, Thermobifida, Cellulomonas, y Sarcina (por ejemplo, Sarcina ventriculí) . El término "polipéptido heterólogo" se contempla como incluyen un polipéptido o porción del mismo que puede ser codificado por un ácido nucleico heterólogo derivado de cualquier fuente, por ejemplo, eucariotos, procariotos, virus, o fragmentos de ácidos nucleicos sintético. El término ¦ "homólogo" se contempla como incluyendo una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes o nucleótidos idénticos o equivalentes, por ejemplo, un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar, con una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos de tal manera que la primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos y la segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos compartan dominios estructurales comunes y/o una actividad funcional común. El término "células huésped" y "células huésped recombinante" se contemplan como incluyendo una célula adecuada para manipulación genética, por ejemplo, que puede incorporar secuencias de polinucleótidos heterólogas, por ejemplo, que puede ser transíectada . La célula puede ser un microorganismo o una célula eucariótica superior, por ejemplo, una célula de animal o una célula vegetal. El término incluye la progenie de la célula originalmente transfectada . En modalidades particulares, la célula es una célula bacteriana, por ejemplo, una célula bacteriana gram negativa o una célula gram positiva. Particularmente, el término célula huésped recombinante se contempla para incluir una célula que ya ha sido seleccionada o manipulada para que tenga ciertas propiedades deseables y adecuada para modificación adicional empleando las composiciones y métodos de la invención. El término "un polipéptido aislado" (por ejemplo, una enzima biosintética aislada o purificada) es sustancialmente libre de material celular u otros polipéptidos contaminantes provenientes de microorganismos a partir del cuál el polipéptido es derivado o bien sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente . El término "ácido nucleico tiene el propósito de incluir moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, nucleótidos que incluyen un cuadro de lectura abierto que codifica un polipéptido, y puede incluir además unas secuencias reguladoras no codificadoras, e intrones. Además, los términos se contemplan para incluir uno o varios genes que se mapean en un locus funcional. Además, los términos se contemplan para que incluyan un gen específico para un propósito seleccionado. El gen puede ser endógeno para la células huésped o bien puede ser introducido recombinantemente en la célula huésped, por ejemplo, como un plásmido mantenido de manera episómica o un plásmido (o fragmento del mismo) integrado en forma estable en el genoma. En una modalidad, el gen de segmento de polinucleótido está involucrado en por lo menos una etapa en la bioconversión de un carbohidrato en etanol. Por consiguiente, el término tiene el propósito de incluir cualquier gen que codifica un polipéptido, por ejemplo, piruvato decarboxilasa, alcohol deshidrogenasa, un polipéptido secretorio (unos polipéptidos secretorios) o bien una polisacarasa, por ejemplo, glucanasa, o combinación de los mismos . La expresión "molécula de ácido nucleico mutante" o bien "gen mutante" tiene el propósito de incluir una molécula de ácido nucleico o un gen que tiene una secuencia de nucleótidos que incluye por lo menos una alteración (por ejemplo, sustitución, inserción, deleción) , de tal manera que el polipéptido que puede ser codificado por dicho mutante inhiba una actividad que difiere del polipéptido o del polipéptido codificado por el gen o molécula de ácido nucleico de tipo silvestre. La expresión "enlazado operativamente" significa que la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico o gen de interés está unida a la secuencia regulatoria (secuencias " regulatorias) de una manera que permite la expresión (por ejemplo, expresión incrementada, realzada, constitutiva, basal, atenuada, disminuida o reprimida) de la secuencia de nucleótidos, de manera provechosa la expresión de un producto génico codificado por la secuencia de nucleótidos (véase, por ejemplo, cuando la molécula de ácido nucleico recombinante está incluida en un vector recombinante, de conformidad con lo definido aquí, y se introduce en un microorganismo) . El término "pH" incluye su significado conocido en la técnica. Típicamente, las enzimas piruvato decarboxilasa de la presente invención muestran una actividad decarboxilasa en un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, con mayor particularidad a un pH de aproximadamente 5 a 7, con particularidad mayor a un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.0. El término "piruvato decarboxilasa" incluye la enzima descrita aquí que puede decarboxilar piruvato en acetaldehído . Por convención, el término "pdc" se refiere a un gen de piruvato decarboxilasa, mientras que el término "PDC" se refiere a un producto génico de pdc, es decir, una enzima o polipéptido de piruvato decarboxilasa. El término "molécula de ácido nucleico recombinante" incluye una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ADN) que ha sido alterada, modificada, o manipulada de tal manera que difiera en cuanto a secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico nativa o natural a partir de la cuál se derivó la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, por adición, deleción o sustitución de uno o varios nucleótidos) . De manera provechosa, una molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, una molécula de ADN recombinante) incluye una molécula de ácido nucleico asilada o gen de la presente invención (por ejemplo un gen pdc aislado) unido operativamente a secuencias reguladoras. El término "secretasa" tiene el propósito de incluir cualquier polipéptido solo o en combinación con otros polipéptidos que facilite el transporte de otro polipéptido desde el espacio extracelular de. una célula hacia el medio extracelular. En una modalidad, el polipéptido secretorio (polipéptidos secretorios) abarca (n) todos los polipéptidos secretorios necesarios suficientes para proporcionar una actividad secretoria a una célula huésped gram negativa o gram positiva. El término "sacarificación y fermentación simultánea" o "SSF" tiene el propósito de incluir el uso de uno o varios huéspedes recombinantes (o extractos de los mismos, incluyendo extractos purificados o no purificados, y si se desea, otras adiciones de enzima, por ejemplo, a partir de una o varias fuentes diferentes) para la degradación o despolimerización contemporánea de un azúcar complejo y bioconversión de este residuo de azúcar en acetaldehído y subsecuentemente, si se desea, en etanol por fermentación. El término . "afinidad por substrato" incluye las características cinéticas de unión de una enzima para un substrato, ' por ejemplo, la KM de la enzima piruvato decarboxilasa por su substrato piruvato (o análogo del mismo) . Típicamente, las enzimas piruvato decarboxilasa de la presente invención presenta una afinidad por substrato (por ejemplo, por piruvato) que tiene una KM de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1, más particularmente una KM de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5, con particularidad aún mayor una KM de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.4. El término azúcar" se contempla de tal manera que incluya cualquier fuente de carbohidratos en donde una (s) molécula (s) de azúcar. Tales azúcares son fuentes potenciales de azúcares para la despolimerización (si se requiere) y la bioconversión subsecuente en acetaldehído y subsecuentemente en etanol por fermentación de conformidad con los productos y métodos de la presente invención. El termino "promotor sustituto" se contempla de tal manera que incluya un segmento de polinucleotido que pueda controlar en forma transcripcional un gen de interés, por ejemplo, un gen de piruvato decarboxilasa, que no controla transcripcionalmente en la naturaleza. En una modalidad, el control transcripcional de un promotor sustituto resulta en un incremento de la expresión del gen de interés. En otra modalidad, un promotor sustituto se coloca 5' con relación al gen de interés. Un promotor sustituto puede utilizarse para reemplazar el promotor natural, o bien puede utilizarse además del promotor natural. Un promotor sustituto puede ser endógeno con relación a la célula huésped en donde se utiliza o bien puede ser una secuencia de polinucleótidos heteróloga introducida en la célula huésped, por ejemplo, exógena con relación a la célula huésped en donde se utiliza. Otros promotores adecuados para su uso en bacterias incluyen, por ejemplo, lacZ, T7, y SP6 (véase, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, infra) . Los términos "estabilidad térmica" y "termo-estabilidad" se emplean en forma intercambiable y tienen el propósito de incluir la capacidad de una enzima (por ejemplo, ya sea expresada en una célula, presente en un extracto celular, lisado celular, o bien en forma purificada o parcialmente purificada) para presentar la capacidad de catalizar una reacción (por ejemplo, la conversión de piruvato en acetaldehido) por lo menos a una temperatura de aproximadamente 20° C, de manera provechosa a una temperatura de aproximadamente 25° C hasta 35° C, de una manera todavía más provechosa a una temperatura de aproximadamente 37° C o más, en particular, a una temperatura de aproximadamente 50° C o más, por ejemplo, a una temperatura de por lo menos aproximadamente 60° C o más. Genes y moléculas de ácido nucleico aisladas La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que comprenden genes piruvato decarboxilasa ipdc) que codifican enzimas de polipéptidos de piruvato decarboxilasa (PDC) en donde los ácidos nucleicos han sido aislados a partir de bacterias gram positivas y gram negativas, por ejemplo, las bacterias gram negativas Zymobacter palmae, Acetobacter pasteuríanus y a partir de la bacteria gram positiva Sarcina ventriculi. Se presentan también ácidos nucleicos genómicos aislados que comprenden cualquiera de los genes piruvato decarboxilasa mencionados arriba (es decir, pdc) pero también otras regiones de flanco que comprenden regiones reguladoras (por ejemplo, promoto (es) y sitio (s) de unión de ribosoma) así como otros genes asociados involucrados en la etanologénesis, por ejemplo, alcohol deshidrogenasa {adh) ) . La moléculas de ácido nucleico incluye moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc lineal, circular, o bien ADN cromosómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNt, ARNr, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados mediante la utilización de análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de una cadena simple o de una cadena doble pero de manera provechosa es ADN de cadena doble. La molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención incluye una molécula de ácido nucleico libre de secuencias que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' de la molécula de ácido nucleico) en el ADN cromosómico del organismo a partir del cuál se deriva el ácido nucleico. En varias modalidades, una molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos que 10 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.1 kb, 50 bp, o 25 bp o 10 bp de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN cromosómico del microorganismo a partir del cuál se deriva la molécula de ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", por ejemplo, una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otros materiales celulares cuando se produce por técnicas recombinantes o bien sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza de manera química. Los genes pdc, de conformidad con lo descrito aquí (en cursivas por convención) , incluyen una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ADN o segmento de la misma) , por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica ARN o polipéptido que, en un organismo, está separado de otro gen o de otros genes, por ADN intergénico (es decir, ADN de espaciador o de intervención que flanquean naturalmente el gen y/o separa genes en el ADN cromosómico del organismo) . Un gen puede dirigir la síntesis de una enzima u otra molécula de polipéptidos (por ejemplo, puede comprender secuencias codificadoras, por ejemplo, un cuadro de lectura abierto contiguo (ORF) que codifica un polipéptido) o bien puede en sí ser funcional en el organismo. Un gen en organismo puede estar agrupado en un operón, de conformidad con lo definido aquí, en donde el operón está separado de otros gentes y/u operones por ADN intergénico. En genes individuales contenidos dentro de un operón pueden empalmarse sin ADN intergénico entre los genes individuales - Un gen aislado de conformidad con lo descrito aquí, incluye un gen esencialmente libre de secuencias que flanquean naturalmente el gen en el ADN cromosómico del organismo a partir del cual se deriva el gen (es decir, libre de secuencias codificadores adyacentes que codifican una segunda molécula de ARN o polipéptido distinto, secuencias estructurales adyacentes o similares) , e incluye opcionalmente secuencias reguladoras 5r y 3' , por ejemplo secuencias de promotor y/o secuencias de terminador. En una modalidad, un gen aislado incluye secuencias predominantemente codificadoras para un polipéptido (por ejemplo, secuencias que codifican polipéptidos de PDC) . En otra modalidad, un gen aislado incluye secuencias codificadoras para un polipéptido (por ejemplo, para un polipéptido de PDC) y secuencias reguladoras 5' y/o 3' adyacentes a partir del ADN cromosómico del organismo a partir del cual se deriva el gen (por ejemplo, secuencias reguladoras 5' y/o 3' adyacentes) . De manera provechosa, un gen aislado contiene menos que aproximadamente 10 kb, 5 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.2 kb, 0.1 kb, 50 bp, 25 bp o 10 bp de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente el gen en el ADN cromosómico del organismo a partir del cual se deriva el gen. En un aspecto, la presente invención presenta secuencias de ácido nucleico de pdc aisladas o genes aislados, secuencias o genes de ácido nucleico de alcohol deshidrogenasa (adn) o genes aislados derivados en forma provechosa de bacterias Gram positivas o Gram negativas. De manera provechosa, el ácido nucleico o gen pdc se deriva de un microorganismo seleccionado dentro del grupo que consiste de Gluconobacterr Rhizobium, Bradyrhizobium, Alcaligenes, Rhodobacter, Rhodococcus, Azospirillum, Rhodospirillum, Sphingomonas, Burkholderia, Desulfomonas, Geospirillum, Succinomonas, Aeromonas, Shewanella, Halochromatium, Citrobacter, Escherichia, Klebsiella Zymo onas (por ejemplo, Zymomonas mobilis) , Zymobacter (por ejemplo, Zymobacter palmae) , y acetobacter (por ejemplo, Acetobacter pasteurianus) . En otra modalidad, el gen o ácido nucleico de pdc se deriva de un microorganismo seleccionado dentro del grupo que consiste de Fibrobacter, Acidobacter, Eacteroides, Sphingobacterium, Actinomyces, Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Propionibacterium, Bifldobacterium, Bacillusr Geobacillus, Paenibacillus, Sulfobacillus, Anaerobacterr Eubacteríum, Streptococcusr Lactobacillus, Leuconostoc, Enterococcus, L'actococcus, Thermobifida, Cellulomonas y Sarcina (por ejemplo, Sarcina ventriculí) . En una modalidad, el gen o ácido nucleico de pdc es derivado de la bacteria Gram negativa Zymobacter palmae. En otra modalidad, el gen o ácido nucleico de pdc es derivado de la bacteria Gram negativa Acetobacter pasteurianus. En otra modalidad, el gen o ácido nucleico de pdc puede ser derivado de la bacteria Gram positiva Sarcina ventriculí . En una modalidad, un ácido nucleico aislado de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que presenta un nivel de identidad de por lo menos aproximadamente 60-65%, de manera provechosa por lo menos aproximadamente 70-75%, con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 80-85%, y con preferencia aún mayor por lo menos aproximadamente 90-95% con una secuencia de nucleótidos en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico aislado se híbrida bajo condiciones estrictas con una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos presentados como SEQ ID NO: 1, SEQ. ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5. Tales condiciones estrictas son conocidas por parte de las personas con conocimientos en la materia y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos Actuales en Biología Molecular], John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo particular, no limitativo de condiciones estrictas de hibridación (por ejemplo, alto nivel de estrictez) son hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a una temperatura de aproximadamente 45°C, seguido por uno o varios lavados en 0.2 X SSC 0.1% SDS a una temperatura de 50-65°C. De manera provechosa, una molécula de ácido nucleico de la presente invención que se híbrida bajo condiciones estrictas con la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5 corresponde a una molécula de ácido nucleico que ocurre naturalmente. Típicamente, una molécula de ácido nucleico que ocurre naturalmente incluye una molécula de AR o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que ocurre en la naturaleza. Una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5 puede ser aislada empleando técnicas estándares de biología molecular y la información de secuencia proporcionada aquí. Por ejemplo, moléculas de ácido nucleico pueden ser aisladas empleando técnicas estándares de hibridación y clonación (por ejemplo, de conformidad con lo descrito en Sambrook, J., Fritsh, E. F. , y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación Molecular; Un Manual de Laboratorio],- 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) o bien puede aislarse a través de reacción en cadena de polimerasa empleando cebadores de oligonucleótidos sintéticos diseñados con base en la secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 3. Un ácido nucleico de la puede amplificado empleando ADNc, ARNm o alternativamente, ADN genómico, como templado y cebadores oligonucleótidos · apropiados de conformidad con técnicas estándares de amplificación por reacción en cadena de polimerasa. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5. Secuencias de adicionales de ácido nucleico de pdc son las secuencias que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5, que codifican un homólogo del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6 (por ejemplo, codifican un polipéptido que tiene un nivel de identidad de por lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o más con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6, y que tiene una actividad sustancialmente idéntica al polipéptido) , se hibridan bajo condiciones estrictas a la totalidad o a una parte de la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5 o con la totalidad o una parte de la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6, o son. complementarios de una secuencia de nucleotidos de pdc de conformidad con lo presentado aqui. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de pdc aislada o gen pdc codifica un homólogo del polipéptido PDC que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6. Típicamente, el término "homólogo" incluye un polipéptido o un polipéptido que comparte por lo menos un nivel de identidad de aproximadamente 30-35%, de manera provechosa por lo menos aproximadamente 35-40%, de manera más provechosa por lo menos aproximadamente 40-50% y de manera todavía más provechosa por lo menos aproximadamente, 60%, 70%, 80%, 90% o más con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de tipo silvestre o polipéptido descrito aquí y que tiene una actividad funcional o biológica sustancialmente equivalente al polipéptido de tipo silvestre o polipéptido. Por ejemplo, un homólogo de PDC comparte un nivel de identidad de por lo menos aproximadamente 30-35%, de manera provechosa por lo menos aproximadamente 35-40%, con forma más provechosa por lo menos aproximadamente 40-50%, y hasta de manera todavía más provechosa por lo menos aproximadamente, 60%, 70%, 80%, 90% o más de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6, y tiene una actividad funcional o biológica sustancialmente equivalente (es decir, es un equivalente funcional) del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6 (por ejemplo, tiene una actividad piruvato decarboxilasa. sus ancialmente equivalente) . En una modalidad, el gen o molécula de ácido nucleico de pdc aislado comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con cualquiera de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de pdc aislada se híbrida con la totalidad o con una parte de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5 o se híbrida con la totalidad o una parte de una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6. Tales condiciones de hibridación son conocidas por parte de las personas con conocimientos en la materia y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos Actuales en Biología Molecular], Ausubel y colaboradores, eds., John Wiley & Sons, (1995), secciones 2, 4 y 6. Condiciones estrictas adicionales pueden encontrase Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación Molecular; ün Manual de Laboratorio], Sambrook. y colaboradores, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), capítulos 7, 9 y 11. Un ejemplo no limitativo particular de condiciones estrictas de hibridación incluye la hibridación en 4X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) , a una temperatura de aproximadamente 65-70°C (o hibridación en 4X SSC más formamida al 50% a una temperatura de aproximadamente 42-50 °C) seguida por uno o más lavados en IX SSC, a una temperatura de aproximadamente 65-70°C. Un ejemplo no limitativo particular de condiciones altamente estrictas de hibridación incluye la hibridación en IX SSC, a una temperatura de aproximadamente 65-70°C (o bien hibridación en IX SSC más formamida al 50% a una temperatura de aproximadamente 42-50°C) seguida por uno o varios lavados en 0.3X SSC, a una temperatura de aproximadamente 65-70°C. Un ejemplo particular no limitativo de condiciones con estrictez reducida incluye la hibridación en 4X SSC, a una temperatura de aproximadamente 50-60°C (o bien alternativamente hibridación en 6X SSC más formamida al 50% a una temperatura de aproximadamente 40-45°C) seguida por uno o varios lavados en 2X SSC, a una temperatura de aproximadamente 50-60°C. Rangos intermedios de los valores arriba mencionados, por ejemplo, a 65-70°C o a 42-50°C se contemplan también dentr-del marco de la presente invención. SSPE (IX SSPE es NaCl 0.15 M, 10 mM NaH2P04, y 1.25 mM EDTA, pH 7.4) puede ser sustituido por SSC (IX SSC es NaCl 0.15 M y 15 mM citrato de sodio) en amortiguadores de lavado e hibridación; los lavados se efectúan durante 15 minutos cada uno después de la terminación de la hibridación. La temperatura de hibridación para híbridos anticipados por presentar menos 50 pares de bases de longitud debe ser de 5-10°C inferior a la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, en donde Tm es determinado de conformidad con las ecuaciones siguientes. Para híbridos menores que 18 pares de base de longitud, Tm(°C) = 2 (# de bases A + T) + 4 (# de bases G+C) . En el caso de híbridos entre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tm(°C) = 81.5 + 16.6 (logi0[Na+] ) + 0.41 (% G+C) + (600/N=, en donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones sodio en el amortiguador de hibridación ( [Na+] para IX SSC IX = 0.165 M) . Se observará por parte de la persona con conocimientos en la materia que reactivos adicionales pueden ser agregados a los amortiguadores de hibridación y/o lavado para disminuir la hibridación no específica de las moléculas de ácido nucleico con membranas, por ejemplo, membranas de nitrocelulosa o nylon, incluyendo, sin limitación agentes de bloqueo, (por ejemplo BSA o bien ADN vehículo de esperma de arenque o salmón) , detergentes (por ejemplo, SDS) , agentes de quelación (por e emplo, , EDTA) , Ficoll, PVP y similares. Cuando se utilizan membranas de nylon, en particular, un ejemplo no limitativo adicional de condiciones de hibridación estrictas es la hibridación en NaH2P04 0.25-0.5M, 7% SDS a una temperatura de aproximadamente 65°C, seguido por uno o varios lavados a NaH2PC>4 0.02M, 1% SDS a 65°C. véase, por ejemplo, Church y Gilbert (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:19991-1995, (o bien alternativamente, 0.2X SSC, 1% SDS). En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria d una secuencia de nucleótidos de pdc de conformidad con lo establecido aquí (por ejemplo, es complemento completo de la secuencia de nucleótidos establecido como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5) . En otra modalidad de la presente invención, presenta genes o moléculas de ácido nucleico de pdc imitantes o quiméricos. Típicamente, un gen mutante o una molécula de ácido nucleico mutante de conformidad con lo descrito aquí incluye un gen o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que incluye por lo menos una alteración (por ejemplo, sustitución, inserción, deleción) de tal manera que el polipéptido o polipéptido que ha sido codificado por dicho mutante presenta una actividad que difiere del polipéptido o polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de tipo silvestre o gen de tipo silvestre. Típicamente, un pdc quimérico incluye un dominio entero derivado de otro PDC que es manipulado (fusionado, intercambiado) con un dominio correspondiente en un PDC. De manera provechosa, una molécula de ácido nucleico imitante o un gen mutante (por ejemplo, un gen de pdc mutante) codifica un polipéptido de PDC que tiene una actividad mejorada, por ejemplo, actividad decarboxilasa (por ejemplo, afinidad con substrato (por ejemplo, un piruvato) ; termoestabilidad; actividad a un pH diferente; o bien uso de codón (por ejemplo, para expresión mejorada en la célula huésped receptora) . III. Vectores y Moléculas de Ácido Nucleico Recombinantes La presente invención presenta además moléculas de ácido nucleico recombinantes (por ejemplo, moléculas de ADN recombinantes) que incluyen moléculas de ácido nucleico y/o genes descritos aqui (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico aisladas y/o genes aislados), de manera provechosa genes pdc, con mayor provecho, genes pdc derivados de una bacteria Gram negativa o de una bacteria Gram positiva. La presente invención presenta además vectores (por ejemplo, vectores recombinantes) que incluyen moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes y/o genes aislados o recombinantes) descritas aqui. En particular, vectores recombinantes se presentan los cuales incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican productos génicos bacterianos de conformidad con lo descrito aquí, de manera provechosa productos de gen pdc, con mayor provecho productos de pdc dé una bacteria Gram negativo o de una bacteria Gram positivo, de manera todavía más provechosa productos de gen pdc derivados de Zymobacter palmae, Acetobacter pasteurianusr o Sarcina ventric li . El vector recombinante (por ejemplo, plásmido, fago, fásmido, virus, cósmido u otro vector de ácido nucleico purificado) puede ser alterado, modificado o manipulado de tal manera que contenga una mayor cantidad, una menor cantidad, o bien secuencias de ácido nucleico diferentes que las secuencias incluidas en la molécula de ácido nucleico nativa o natural a -partir de la cual se derivó el vector recombinante. De manera provechosa, el vector recombinante incluye un gen pdc, o una molécula de ácido nucleico recombinante que incluye dicho gen pdc, enlazado operativamente a secuencias regulatorias , por ejemplo, secuencias de promotor, secuencias de terminador y/o sitio de unión de ribozima artificiales (RBSs) , de conformidad con lo definido aquí. Típicamente, el gen pdc está unido operativamente a secuencia (s) reguladora ( s) de una manera que permite la expresión (por ejemplo, expresión incrementada, realzada, constitutiva, basal, atenuada, disminuida o reprimida) de la secuencia de nucleótidos, de manera provechosa la expresión de un producto génico codificado por al secuencia de nucleótidos (por ejemplo, cuando la molécula de ácido nucleico recombinante está incluida en un vector recombinate, de conformidad con lo definido aquí, y es introducida en un microorganismo) . La secuencia reguladora incluye secuencias de ácido nucleico que afectan (por ejemplo, modulado o regulado) la expresión de otras secuencias de ácido nucleico. En una modalidad, una secuencia reguladora está incluida en una molécula de ácido nucleico recom ínate o vector recombinante en una posición similar o idéntica y/o en una orientación similar o idéntica con relación a un gen particular de interés como se observa para la secuencia reguladora y gen de interés conforme aparece en la naturaleza, por ejemplo, en una posición y/o orientación nativa. Por ejemplo, un gen de interés puede estar incluido en una molécula de ácido nucleico recombinante o vector recombinante enlazado operativamente en una secuencia reguladora que acompaña o es adyacente al gen de interés en el organismo natural (por ejemplo, enlazado operativamente a secuencias reguladoras "nativa", por ejemplo, al promotor "nativo") . Alternativamente, un gen de interés puede estar incluido en una molécula de ácido nucleico recombinante o vector recombinante enlazado operativamente a una secuencia reguladora que acompaña o es adyacente a otro gen (por ejemplo, un gen diferente) en el organismo natural. Alternativamente, un gen de interés puede estar incluido en una molécula de ácido nucleico recombinante o vector recombinante enlazado operativamente a una secuencia reguladora de otro organismo. Por ejemplo, secuencias reguladoras de otros microbios (por ejemplo, otras secuencias reguladoras bacterianas, secuencias reguladoras de bacteriófagos y similares) pueden estar unidas operativamente a un gen de interés particular. En una modalidad,' una secuencia reguladora es una secuencia no nativa o que no ocurre naturalmente (por ejemplo, una secuencia que ha - sido modificada, mutada, sustituida, derivada, borrada, incluyendo secuencias sintetizadas químicamente) . Secuencias de reguladoras provechosas incluyen promotores, realzados, señales de terminación, señales antiterminación y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, secuencias a las cuales se unen represores o inductores y/o sitios de unión para polipéptidos reguladores de transcripción y/o traducción, por ejemplo, en el i¾RNm transcrito) . Tales secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación Molecular; Un Manual de Laboratorio], 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en un microorganismo (por ejemplo, promotores constitutivos y promotores constitutivos fuertes); las que dirigen la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos en un microorganismo (por ejemplo, promotores inducibles, por ejemplo, promotores inducibles por xilosa) ; y las que atenúan o reprimen la expresión de una secuencia de nucleótidos en un microorganismo (por ejemplo, señales de atenuación o secuencias de represor) . Dentro del alcance de la presente invención se encuentra también la regulación de la expresión de un gen de interés mediante la remoción o deleción de secuencias reguladoras. Por ejemplo, secuencias involucradas en la regulación negativa, de transcripción pueden ser removidas de tal manera que se incremente la expresión de un gen de interés . En una modalidad, una molécula de ácido nucleico recombinante o un vector recombinante de la presente invención incluye una secuencia de ácido nucleico o gen que codifica por lo menos un producto de gen pdc bacteriano enlazado operativamente a un promotor o secuencia de promotor. Promotores provechosos de la presente invención incluyen promotores nativos, promotores sustitutos y/o promotores de bacteriófagos. En una modalidad, un promotor es un promotor asociado con un gen de mantenimiento bioquímico o un promotor asociado con una via etanologénica. En otra modalidad, un promotor es un promotor de bacteriófago. Otros promotores incluyen tef (promotor de factor de elongación de traducción (TEF) ) y pyc (el promotor de piruvato carboxilasa (PYC) ) , que promueve una expresión de alto, nivel en Bacillus (por ejemplo, Bacillus subtilis) . Promotores provechosos adicionales, por ejemplo, para su uso en microorganismos Gram positivos incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, el promotor amyE o los promotores de fagos SP02. Promotores provechosos adicionales, por ejemplo, para su uso en microorganismos Gram negativos incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, tac, trp, tet, trp-tetr Ipp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, ?-?? o ?-?£. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico recombinante o vector recombinante de la presente invención incluye una secuencia de terminador o secuencias de terminadores (por ejemplo, secuencias de terminador de transcripción) . Típicamente, secuencias de terminador se refieren a las secuencias reguladoras que sirven para terminar la transcripción de un gen. Secuencias de terminador (o terminadores de transcripción en tándem) pueden servir además a estabilizar el ARNm (por ejemplo, mediante la adición de estructura ARNm) . Por ejemplo, contra nucleasas. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico recombinante o vector recombinante de la presente invención incluye secuencias que permiten la detección del vector que contiene tales secuencias (es decir, marcadores detectables y/o seleccionables ) , por ejemplo, secuencias que superan las mutaciones 'auxotróficas, por ejemplo, uxa3 o ilvE, marcadores fluorescentes, y/o marcadores calorimétricos (por ejemplo, JacZ/ß-galactosidasa) , y/o genes de resistencia a los antibióticos (por ejemplo, bla o tet) . Se entiende que cualquiera de los genes pdc de la presente invención puede ser introducido en un vector que comprende también uno o varios genes etanologénicos (por ejemplo, alcohol deshidrogenasa (es decir, adh) ) y/o un gen que codifica un producto génico adecuado para la fermentación de un azúcar o la degradación de un azúcar para fermentación subsecuente de conformidad con lo descrita por ejemplo, en los Ejemplos 8 y 9 y de conformidad con lo presentado en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,821,093; 5,482,846; 5,424,202; 5,028,539; 5,000,000; 5,487,989; 5,554,520 y 5,162,515. Estos dos o mas genes pueden ser expresados independientemente utilizando elementos reguladores separados (por ejemplo, promotores), elemento (s) regulador (es) común(es), elemento (s) regulador (es) nativo (s) o una combinación de los mismos. TV. Polipéptidos Aislados Otro aspecto de la presente invención presenta polipéptidos aislados (por ejemplo, enzimas etanologénicas aisladas, por ejemplo, piruvato de decarboxilasa (PDC) ) . En una modalidad, polipéptidos de PDC son productos por técnicas de ADN recombinante y pueden ser aislados a partir de microorganismos de la presente invención a través de un esquema de purificación apropiado empleando técnicas de purificación de polipéptidos estándares. En otra modalidad, polipéptidos son sintetizados químicamente utilizando técnicas estándares de síntesis de péptidos. U polipéptido aislado o purificado (por ejemplo, una PDC aislada o purificada) es sustancialmente libre de material celular u otros polipéptidos contaminantes del microorganismo a partir del cual se deriva el polipéptido, o bien sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando es sintetizado químicamente. En una modalidad, un polipéptido aislado purificado tiene menos que aproximadamente 30% (en peso seco) de polipéptido contaminante o químicos contaminantes, con mayor provecho menos que aproximadamente 20% de polipéptido contaminante o químicos contaminantes, de manera todavía más provechosa menos que aproximadamente 10% de polipéptido contaminante o químicos contaminantes, y muy especialmente menos que aproximadamente 5% de polipéptido contaminante o químicos contaminantes . En una modalidad, el polipéptido de PDC o el producto génico de PDC se deriva de una bacteria Gram positiva o de una bacteria Gram negativa. De manera provechosa, el polipéptido de PDC o el producto génico de PDC se deriva de un microorganismo Gram negativo seleccionado dentro del grupo que consiste de Gluconohacter, Rnizobíum, Bxadyrhizobium, Alcaligenes, Rhodobacter, Rhodococcus, Azospixillum, Rhodospirillum, Sphingomonas, Burkholderiar Desulfomonasr Geospirillum, Succlnomonas, Aeromonas, Shewanella, Halochromatium, Citrobacter, Escherichia, Klebsiella Zymomonas (por ejemplo, Zymomonas mobilís) , Zymobacter (por ejemplo, Zymobacter palmae) , y acetobacter (por ejemplo, Acetobact r pasteurianus) . En otra modalidad, el polipéptido de PDC o producto génico de PDC se deriva de un microorganismo Gram positivo seleccionado dentro del grupo que consiste de Fibrobacter, Acldobacter, Bacteroides, Sphingobacterium, Actinomyces, Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Propionibacteri m, Bifidobacterium, Bacillus, Geobacillus, Paeníbacillus, Sulfobacillus, Anaerobacter, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Enterococcus, Lactococcus, Th.erm.oblfida, Cellulo onas y Sarcina (por ejemplo, Sarcina ventricvli) . De manera provechosa, el producto génico es derivado de un microorganismo seleccionado dentro del grupo que consiste de las bacterias de Gram negativas Zymobacter palmae, o Sarcina ventriculi y de la bacteria Gram positiva Sarcina ventriculi. Dentro del alcance de la presente invención se incluyen polipéptidos de PDC o productos génicos de PDC que son polipéptidos derivados de Zymobacter palmae, Acetobacter pasteurianus ?· Sarcina ventriculi o productos génicos codificados por genes bacterianos que ocurren naturalmente. Dentro del alcance de la presente invención se incluyen además polipéptidos derivados de bacterias o productos genicos que difieren de genes bacterianos que ocurren naturalmente, y/o genes de Zymabacter palmae Acetobacter pasteurianus o Sarcina ventrículi (por ejemplo, pdc) , por ejemplo, genes que tienen ácidos nucleicos con mutaciones, inserciones o deleciones, pero que codifican polipéptidos sustancialmente similares a los productos génicos que ocurren naturalmente de la presente invención, por ejemplo, que comprenden una actividad piruvato decarboxxlasa. Por ejemplo, se entiende que un experto en la materia puede mutar (por ejemplo, sustituir) ácidos nucleicos que, debido a la degeneración del código genético, codifican un aminoácido idéntico al aminoácido codificado por el gen que ocurre naturalmente. Esto puede ser deseable con el objeto de mejorar el uso de codón de un ácido nucleico a expresar en un organismo particular. Además, se entiende que un experto en la materia puede mutar (por ejemplo, sustituir) ácido nucleicos que codifican sustituciones conservadoras de aminoácidos. Se entiende además que un experto en la materia puede sustituir, agregar o borrar ácidos nucleicos hasta cierto punto sin afectar sustancialmente la función de un producto génico (por ejemplo, actividad decarboxilasa) en comparación con el producto génico que ocurre naturalmente, cada caso ' contemplándose para estar incluido dentro del alcance de la presente invención. La actividad decarboxilasa y, por- ejemplo, la afinidad enzima/substrato, termoestabilidad de enzima, y/o actividad de enzima en varios pHs, pueden determinarse fácilmente utilizando los ensayos descritos aquí. En una modalidad, un polipéptido aislado de la presente invención (por ejemplo, una enzima piruvato decarboxilasa aislada, por ejemplo, polipéptido de PDC aislado tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 8. En otras modalidades, un polipéptido aislado de la presente invención es un homólogo de por lo menos uno de los polipéptidos presentados como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 8 (por ejemplo, comprenden una secuencia de aminoácidos que tienen un nivel de identidad de por lo menos aproximadamente 30-40%, de manera provechosa tiene un nivel de identidad de aproximadamente 40-50%, de manera más provechosa tiene un nivel de identidad de aproximadamente 50-60%, de manera todavía más provechosa tiene un nivel de identidad de aproximadamente 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 8, y tiene una actividad sustancialmente similar a la actividad del polipéptido codificado por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 2, ' SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 8, respectivamente.

Para determinar la identidad porcentual de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos,, las secuencias son alineadas para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o ácido nucleico para alineación óptima con una segunda secuencia, de aminoácidos o ácido nucleico) . Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esta posición. El porcentaje de identidad entre dos secuencias depende del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100) , tomando en cuenta de manera provechosa el número de espacios y el tamaño de dichos espacios que son necesarios para producir una alineación óptima. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden lograrse empleando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativo particular de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:22674-68, modificado de conformidad con Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Dicho algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Búsquedas de nucleótídos BLAST pueden efectuarse con el programa NBLAST. Resultado = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas con las moléculas de ácido nucleico de la invención. Se pueden efectuar búsquedas de polipéptidos según BLAST co el programa XBLAST, resultado = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas con moléculas de polipéptidos de la invención. Para obtener alineaciones con espacios para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST de conformidad con lo descrito en Altschul y colaboradores (1997) Nuclelc Acids Research 25 (17) : 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros por omisión de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) . Véase htt : //www.ncbi .nlm.ni . go . Otro ejemplo particular no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) Coput Appl Biosci. 4:11-17. Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN disponible, por ejemplo, en el servido de red GENESTREAM, IGH Montpellier, FRANCIA o bien en el servidor de ISREC. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla ' de residuos de peso PAM120, una penalidad de longitud de espacio de 12, y una penalidad de espacio de 4.

En otra modalidad, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede ser determinado utilizando el programa GAP en el paquete de programática GCG, empleando ya sea una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250 y un peso de espacio de 12,.10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 2, 3 ó 4. En otra modalidad, el porcentaje de homología entre dos secuencias de ácido nucleico puede lograrse empleando el programa GAP en el paquete de programática GCG (disponible en htt : //gcg. com) , utilizando un peso de espacio de 50 y un peso de longitud de 3. Con base en los polipéptidos de PDC aislados antes mencionados, se pueden crear anticuerpos inmunoespecíficos contra un polipéptido de PDC o porción del mismo, utilizando técnicas estándares de conformidad con lo descrito aquí. V. Métodos de Uso Métodos para la Producción de ñcetaldehído La producen' <¾n limpia y eficiente de acetaldehído como un producto deseable tiene aplicaciones comerciales e industriales amplias. Por ejemplo, el acetaldehído es utilizado en la producción de ácido acético, saborizantes, alimentos, bebidas, perfumes, plásticos, colorantes de anilina, fabricación de caucho sintético, el plateado de lunas, endurecimiento de fibras de gelatina y en investigación de laboratorio. Además, el acetaldehído sirve como substrato para la producción de etanol por ejemplo, a través de fermentación. Por consiguiente, la presente invención incluye métodos para la conversión de un substrato, por ejemplo, piruvato o un análogo de piruvato, en acetaldehido, utilizando las enzimas de PDC de la invención. En una modalidad, la invención ofrece métodos para la producción de acetaldehído a partir de piruvato utilizando microorganismos (por ejemplo, organismos recombinantes) que expresan un gen pdc y producto génico (PDC) de- conformidad con lo descrito aquí. Los métodos incluyen también procesos biológicos que resultan en la producción (por ejemplo, transformación o conversión) de piruvato o bien análogo convertible del mismo, que puede ser convertido o decarboxiladp en acetaldehido., o análogo del mismo. El método comprende la puesta en contacto de un microorganismo que expresa un gen pdc y producto génico de la invención' y opcionalmente uno o varios genes etanologénicos, con un azúcar, esqueleto de carbono capaz de ser convertido en piruvato, piruvato, o un análogo del mismo, bajo condiciones de cultivo, de tal manera que se produzca acetaldehido (o análogo del mismo) . En otra modalidad de la invención, el microorganismo mencionado arriba puede ser procesado en un lisado enzimático para efectuar la reacción de conversión mencionada arriba. En otra modalidad, el producto de gen pdc, es purificado, de conformidad con lo descrito aquí, para llevar a cabo la reacción de conversión. El (los) microorganismo (s) y/o enzimas (por ejemplo, en forma de un lisado, parcialmente purificado, o purificado) ) utilizados en las reacciones de conversión están en una forma que permite que lleven a cabo su función contemplada (por ejemplo, la producción de un compuesto deseado, por ejemplo, acetalde ido) . Los microorganismos pueden ser células enteras, o bien pueden ser solamente porciones de las células que son necesarias para obtener el resultado final deseado. Los microorganismos pueden estar suspendidos (por ejemplo, en una solución apropiada como por ejemplo solución amortiguada o medio amortiguado), enjuagados (por ejemplo, enjuagados sin el medio a partir del cual se cultivó el microorganismo) , secados en acetona, inmovilizados (por ejemplo, con gel de poliacrilamida o k-carragenano o en soportes sintéticos, por ejemplo, perlas, matrices y similares), fijados, reticulados o permeabilizados (por ejemplo, tener membranas permeabilizadas y/o paredes permeabilizadas de tal manera que compuestos, por ejemplo, substratos, productos intermedios o productos puedan pasar más fácilmente a través de dicha membrana o pared) . Enzimas de PDC purificadas o no purificadas (solas o en combinación ' con otra(s) enzima(s) etanologénica(s) ) pueden también utilizarse en las reacciones de conversión. La enzima puede estar en una forma que le permite desempeñar su función contemplada (por ejemplo, obtener el compuesto deseado, por ejemplo, acetaldehido, o bien, si está en presencia de los productos génicos etanologénicos necesarios, etanol) . Por ejemplo, la enzima puede encontrarse en forma libre o bien, inmovilizada. Métodos para la Producción de Etanol En una modalidad de loa presente invención, la. célula huésped que tiene los atributos mencionados arriba es también etanologénica. Por consiguiente, la invención, ofrece métodos para la producció de etanol utilizando tales células huéspedes (o bien extractos/enzimas derivadas de ellas) . Además, las células huéspedes pueden ser aplicadas en la degradación sinérgica o despolimerización de un sacárido complejo en un monosacárido. Subsecuentemente, la célula puede catabolizar el azúcar más simple en etanol por fermentación. Este proceso de despolimerización concurrente de sacárido complejo en residuos de azucares más pequeños seguido por fermentación se conoce como sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) . Típicamente, las condiciones de fermentación se seleccionan de tal manera que proporcionen un pH óptimo y una temperatura óptima para promover las mejores características cinéticas de crecimiento de las cepas de células huéspedes productoras y las mejores condiciones catalíticas para las enzimas producidas, por - el cultivo (Doran y colaboradores, (1993) BiotechnoX. Progrese. 9:533-538). Po ejemplo, en el caso de Klebsiella, por- ejemplo, la cepa P2, las condiciones óptimas fueron determinadas como encontrándose entre 35 y 37°C y con un pH entre 5.0 y 5.4. En estas condiciones, aún las endoglucanasas y las exoglucanasas fúngales agregadas en forma exógena son bastante estables y siguen funcionando durante largos periodos. Otras condiciones se comentan en los Ejemplos. Además, se observará por parte de una persona con conocimientos en la materia que se requiere solamente de un experimento rutinario, empleando técnicas conocidas, para optimizar una reacción de fermentación dada de conformidad con la presente invención. Véase, por ejemplo Patentes Norteamericanas Nos. 5,424,202 y 5,916,787, que se incorporan específicamente aquí por referencia. Esta invenció se ilustra adicionalmente a través de los ejemplos siguientes, que no deben considerarse como limitantes . " Ejemplificación En los ejemplos, los siguientes materiales y métodos se utilizan a menos · que se indique lo contrario. Las abreviaturas son las siguientes: PDC, piruvato decarboxilasa; ADH, alcohol deshidrogenasa; SDS-PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida - dodecil sulfato sódico; TPP, difosfato de tiamina; PCMS, ácido para-cloromercurifenil-sulfónico; PCMB, ácido. , para-cloromercuribenzoico; DTT, ditiotreitol. Apa, Acetobacter pasteuríanus; Sver Sarcina. ventriculi; Zpa, Zymobacter palmae; Zmo Z. mobilis. Materiales y Métodos Cepas y Medios - Zr palmae, cepa T109 (IAM 14233, ATCC 51623) fue cultivada en medio ATCC 1956 MY (10 g extracta de levadura, 20 g de maltosa, 2 g„- dé KH2P04, y 5 g de NaCl por litro) a una temperatura da. 26° C (200 revoluciones por minuto). A. pasteuríanus cepa NCIB8618 (ATCC 12874) fue cultivada con aeración a una temperatura de 25° C en medio mínimo (pH 5.0 a 5.5) suplementado con. 2% (volumen/volumen) de D-L-lactato de conformidad con lo previamente descrito (Atkinson, D.E. 1956. Hydrogen metabolism in Acetobacter peroxydans. J. Bacteriol. 72:189-197; DeLey, J. 1958. Studies on the metabolism of Acetobacter peroxydans. Part I. General properties and. taxonomic positioD of" the- species [Estudios del metabolismo de. Acetobacte peroxydans.. Parte I. Propiedades generales y posición taxonómica, de las- especies] . Antonie Van Leeuwenhoek J. Microbiol. Serol. 24:281-297) con adición de- 0.1 - mi por litro de 1% (volumen/volumen) antiespuma. E. coli, cepas ER1648 F fhuA2A (lacZ) rl supE44 trp31 mcrA1272: :TnlÓ (Ter) his-2 rpsLl04{StrE) xyL-7 mtl-2 metBI A (mcrC-mrr) 102: :Tnl0 (Tetr) (New England Biolabs, Beverly, MA) , DH5a-F?reC-¾ endAl hsdR17 (rK~m ) supE44 thi-1 gyrA relAl (Life Technologies, Rockville, MD) , BL21-CodonPlus-RIL F'ompT hsdS (rB~mB-) dcm+ ¦ Tetr gal ? (DE3) encíá Hte [argü ileY" leulV CamJ (una cepa B de E. coli) (Strategene, LaJolla, CA) , y Rosetta (DE3) F'ompT hsdSB (RB~MB~) gal dcm lacYl (pRARE) (Novagen, Madison, WI) se utilizan para experimentos de ADN recombinante - Las cepas de E. coli fueron cultivadas a una temperatura de 37° C (200 revoluciones por minuto) en medio Luria-Bertani (LB) . El medio fue suplementado con 2% (peso/volumen) de glucosa y antibióticos incluyendo ampicilina (100 mg por litro) , kanomicina (100 mg por litro) y cloramfenicol (30 mg por litro) según lo necesario. Aislamiento y clonación de ADN - Se aisló ADN de plásmido utilizando un Kit de Quantum Prep Plasmid Miniprep kit de BioRad (Hercules, CA) . Fragmentos de ADN fueron eluidos a partir de geles 0.8% SeaKem GTG agaros (EMC Bioproducts, Rockland, ME) con amortiguador IX TAE (40 mM Tris acetato, 2mM EDTA, pH 8.5) utilizando el kit de extracción de gel QIAquick de Qiagen (Valencia, CA) . El ADN genómico fue aislado empleando el método descrito por Harwood y Cutting (Harwood, C. R. y S. M Cutting. 1990. In Molecular Biological Methods for Bacillus, en [Métodos biológicos moleculares para Bacillus] . Wiley, New York) . Análisis de ADN y secuencias de polipéptidos de Z. palmae -Plásmidos fueron secuenciados empleando el método de didesoxi de Sanger (Sanger, F., S. Nicklen, y A. R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain terminating inhibitors [Secuenciamient de ADN con inhibidores de terminación de cadena] .Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467) utilizando un secuenciador LICOR (DNA Sequencing Facility, Department of Microbiology and Cell Science, Universidad de Florida). Genpro 5.0 (Hoefer Scientific, San Francisco, CA) , Clustal W versión 1.81 (Thompson, J. D., D. G. Higgins, y T. J. Gibson. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice [CLUSTAL W: mejora de la sensibilidad de alineación de secuencias múltiples progresiva a través de ponderación de secuencia, penalidades por espacio especificas según la posición y elección de matriz de ponderación]. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680), Treevie versión 1.5 (Page, R. D. 1996. TreeVie : an application to display phylogenetic trees on personal computers [TreeView: una aplicación para desplegar árboles filogenéticos en computadoras personales]. Comput . Appl. Biosci. 12:357-358), y MultiAln (Corpet, F. 1988. Múltiple sequence alignment ith hierarchical clustering [Alineación de secuencias múltiples con agrupamiento jerárquicos]. Nucleic Acids Res. 16:10881-10890) se utilizaron para alineaciones y comparaciones de secuencias de ADN y polipéptidos .. Las secuencias de aminoácidos deducidas fueron comparadas con las secuencias de polipéptidos en el GenBank, EMBL, y Swiss Prot en el National Center for Biotechnology Information [Centro Nacional en materia de información de biotecnología] (Bethesda, MD) empleando el servidor de red BLAST. Purificación de. pclipéptidos de PDC - Purificaciones de PDC fueron efectuadas de conformidad con lo presentado en la tabla 2. Todos los procedimientos fueron efectuados a temperatura ambiente y todos los amortiguadores de purificación contenian 1 mM de TPP y 1 mM de MgCl2 a menos que se indique lo contrario. Se purificó PDC de S. Ventriculi a partir de E. colí BL21-CodonPlus-RIL (pJAM419) y Rosetta (DE3) (pRARE, pJAM419) de conformidad con lo previamente descrito (Talarico, L. A. , L. O. Ingram, y J. A. Maupin-Furlow. 2001. Production of the Gram-positive Sarcina ventriculi pyruvate decarboxylase in Escherlchia coli [Producción de la piruvato decarboxilasa de Sarcina ventriculi Gram-positiva en Esc erícia coli] . Microbiology 147:2425-2435). Se purificó PDC de Z. mobilis a partir de E. coli DH5a recombinante (pLOI1276) (Conway, T . , Y. A. Osman, J. I. onnan, E. M. Hoffmann, y L. O. Ingram. 1987. Promoter and nucleotide sequences of the Zymo onas mobilis pyruvate decarboxylase [Secuencias de promotor y nucleótidos de piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis]. J. Bacteriol. 169:949-954) utilizando tratamiento térmico, procedimientos Q-Sepharose, y Superdex 200 según lo descrito abajo para la PDC de Z. palmee a excepción que la PDC de Z. mobilis fue eluida a partir de Q-Sepharose a NaCl 0.22 a 0.32 M. (i) Purificación de PDC de Z. pal ae - células de Z. palmae y E. coli DH5a (pJAM3440) fueron cultivadas hasta la fase estacionaria y cosechadas por centrifugación a 10,000 X g (10 minutos, 4o C) . Células (de 12 a 15 g en peso húmedo) fueron resuspendidas en 6 volúmenes de amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 que contenia 1 mM de TPP y 1 MM de MgCl2 (amortiguador A) y pasadas a través de una celda de presión Frenen enfriada a 1,400 kg por cm2 (20,000 libras por pulgada cuadrada) . Residuos de células fueron removidos por centrifugación a 16,000 X g (20 minutos, 4o C) . El lisado de células fue calentado a 60° C durante 30 minutos, enfriado en hielo durante 15 minutos y centrifugado a 16, 000 X g (30 minutos a 4o C) para remover los polipéptidos desnaturalizados. El sobrenadante fue aplicado a una columna HiLoad Q-Sepharose 26-10 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) equilibrada en amortiguador A 50 mM. La columna fue lavada con 200 mi de amortiguador A 50 mM y se aplicó un gradiente de 400 mi lineal de NaCl 0-1 M a 4.0 mi por minuto. El pico de actividad de PDC fue eluido entre NaCl 0.4 M y 0.5 M y fue combinado. La PDC de Z. palmae recombinante proveniente de E. coli fue purificada hasta homogeneidad por inyección de alícuotas (0.5 mi) en una columna de Superdex 200 10/30 (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con amortiguador A 50 mM que contenía NaCl 150 mM y 10% en glicerol a 0.2 mi por minuto. La purificación de PDC "nativa" a partir Z. palmae requirió de pasos adicionales. El lisado tratado térmicamente fue aplicado a una columna de hidroxiapatita CHT5-1 (BioRad) equilibrada con amortiguador A 10 mM. La columna fue lavada con 30 mi de amortiguador A 10 mM y un gradiente lineal de 30 mi de fosfato de sodio 10 mM - 1M fue aplicado a 0.5 mi por minuto . El pico de actividad de PDC se eluyó a fosfato de sodio 0.45 a 0.5 M y fue combinado. Alícuotas fueron purificadas adicionaliaente empleando una columna Superdex 200 10/30 de conformidad con lo descrito arriba. Se agregó sulfato de amonio sólido a las fracciones activas combinadas a 1 M y después se cargó en una columna Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (bajo sub) (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con amortiguador A 50 mM que contenía sulfato de amonio 1 M. Después de un lavado de 15 mi, la columna fue revelada con un gradiente en línea decreciente de 15 mi de sulfato de amonio 1-0 M a 0.5 mi por minuto. El pico de actividad de PDC "nativa" fue eluido en sal entre .55 y 0.3 M. (11) Purificación de PDC de ?. pasteurlanus - Se purificó PDC a partir de A. pasteurlanus y E. col!, utilizando tratamiento térmico Q-Sepharose, Superdex 200, e hidroxiapatita de conformidad con lo descrito para la PDC de Z. palmae con las modificaciones siguientes. Las células fueron pasadas a través de una celda de presión French a 2,100 kg/orr (30,000 58 libras por pulgada cuadrada) . La actividad de PDC, que fue eluida a NaCl 0.17 a 0.26 a partir de la columna Q-Sepharose, fue combinada y concentrada por diálisis contra PEG8000 antes de cargarse en la columna Superdex 200. - Las PDCs de Z. palmae y A. pasteuxianus fueron almacenadas durante hasta un mes en glicerol al 10% en nitrógeno liquido sin perdida de actividad. Las PDCs de S. ventriculi y Z. mobilis fueron almacenadas a 4o C. Cuantificación de PDC y ensayo de actividad de enzima - La concentración de polipéptido fue determinada empleando el reactivo Bradford con albúmina sérica bovina como el estándar (BioRad) . La actividad de PDC fue medida a través del ensayo acoplado con alcohol deshidrogenasa de levadura (ADH) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) de conformidad con lo previamente descrito (Con ay, T., Y. A. Osman, J. I. onnan, E. M. Hoffmann, y L. O. Ingram. 1987. Proraoter and núcleotide sequences of the Zymomonas mobilis py uvate decarboxylase [Secuencias de promotor y nucleótidos de piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis]. J. Bacteriol. 169:949- 954). La mezcla de la reacción contenia WADH 0.15 mM, MgCl2 5 mM, TPP 0.1 mM, piruvato 5 mM, y 10 U de ADH en amortiguador de citrato de sodio 50 mM a pH 5.0 y fue medida a una temperatura de 25° C a menos que se indique lo contrario. Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que genera 1 umol de acetaldehido por minuto.

Determinación de masa molecular y secuencia de aminoácidos del polipéptido de PDC - Masas moleculares sub-unitarias y pureza enzimática fueron determinadas por electroforesis en gel de poliacrilamida - dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) empleando geles de poliacrilamida al 12% teñidos con azul Coomassie R-250 Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural polypeptides during the assembly of the head of bacteriophage T4 [Disociación de polipéptidos estructurales durante el ensamblaje de la cabeza de bacteriófago T4] . Nature. 227:680-685) . Los estándares de pesos moleculares para SDS-PAGE fueron los siguientes: fosforilasa b (97.4 kDa) , albúmina sérica (66.2 kDa), ovalbúmina (45 kDa), anhidrasa carbónica (31 kDa), inhibidor de tripsina (21.5 kDa) y lisozima (14.4 kDa) . Para la determinación de masa molecular nativa, las muestras fueron aplicadas a una columna Superdex 200 10/30 equilibrada en amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con NaCl 150 mM. Los estándares de masa molecular incluyeron: albúmina sérica (66 kDa), alcohol deshidrogenasa (150 kDa), a-amilasa (200 kDa), apoferritina (443 kDa), y tiroglobulina (669 kDa) . Las secuencias N-terminales de los polipéptidos de PDC purificados fueron determinadas después de SDS-PAGE y después de someter los polipéptidos a electroabsorción en membrana de dicloruro de pilivinilideno (PVDF-PLUS) (Micron Separations Inc., Westborough, ??) . Secuencias fueron determinadas a partir de degradación automatizada de Edman en la Polypeptxde Chemistry Core Facility [Instalaciones Centrales de Química de Polipéptidos] de la University of Florida Interdesciplinary Center for Biotechnology Research [Centro Interdisciplinario para Investigación de Biotecnología de la Universidad de Florida] . Preparación de apoenzimas - Se diluyó PDC purificado (0.75 mg por 0.5 mi) con 1.5 mi de un amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 9.0 y se concentro inmediatamente 8 veces empleando un concentrador Centricon YM30 (Millipore, Bedford, ??) . Después de ajusfar el volumen a 0.5 mi, el polipéptido fue incubado a 25° C durante 45 minutos. Se purificó PDC a partir de los co-factores no unidos para aplicación a una columna Superdex 200 10/30 equilibrada con amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 9.0 con glicerilo al 10% y NaCl 150 mM. Inmediatamente después de la elusión, la apoenzima fue diluida 5 veces en amortiguador de citrato de sodio 50 mM a pH 5.0 almacenada a una temperatura de 4o C, y utilizada dentro de un período de 16 horas para ensayo de reconstitución. Se midió TPP por fluorescencia después de oxidación en difosfato de tricromo utilizando K3Fe(CN)6 en NaOH al 15% (Diefenbach, R. J. y R. G. Duggleby. 1991. Pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis. Structure and re-activatlon ¦ of apoenzyme by the cofactors thiamin diphosphate and magnesium ion [Piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis. Estructura y reactivación de apoenzima por los co-factores tiamin difosfato y ion magnesio] . Biochem. J. 276:439-445) . Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron 375nm y 430nm/ respectivamente. Para reconstitución, la apoenzima (755 ng) fue diluida en 1 mi de amortiguador de citrato de sodio 50 M a pH 5.0 con TPP 1 mM: y/o MgCl2 1 mM. La mezcla fue ensayada para actividad de PDC en el mismo amortiguador. Materiales - Bioquímicos fueron obtenidos en Sigma-Aldrich . Otros químicos de grava analíticos orgánicos e inorgánicos fueron adquiridos en Fisher Scientific (Atlanta, GA) . Endonucleasas de restricción y enzimas modificadoras de ADN fueron adquiridas en New England BioLabs . Digoxigenin-11-düTP (2' -desoxiuridin-5'-trifosfato acoplado por un espaciador de 11 átomos a digoxigenina) , anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina elevada contra digoxigenina, y membranas de nylon para hibridaciones de colonias y placas provinieron de Roche Molecular Biochemicals . Membranas de nylon cargadas positivamente para hibridación Southern fueron adquiridas en Ambion (Austin, TX) . EJEMPLO 1 IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE GEN DE PDC A PARTIR DE LA BACTERIA GRAM NEGATIVA ZYMCBACTER PALMAE En este ' ejemplo, se describe la identificación y caracterización de un gen de PDC a partir de la bacteria grara negativa Z. palmae. En resumen, un operon de piruvato decarboxilasa [pdc) fue aislado a partir de una biblioteca genómica de Zymobacter palmae utilizando una sonda de oligonucleótidos degenerada basada en la secuencia de aminoácidos N-terminal de la proteina purificada (figura 1) . ün sub-clon de PstI a a íI de 1.7-kb de este fragmento (pJAM3440) fue encontrado como requerido para actividad de PDC en E. coli recombinante . Con base en la secuencia de ADN, se identificó un ORF de 1668 pares de bases (55% molar de contenido G+C) en esta región que codificó un polipéptido putativo de PDC (Figura 1) . Una secuencia canónica de Shine-Dalgarno (GGAGG) se encontró 10 pares de bases corriente arriba del codón de inicio de traducción (ATG) . Además, un promotor putativo -35 y -10 (TtcACt-Ni7-atTAAT, en donde N es cualquier nucleótido y las letras mayúsculas corresponden al consenso de promotor bacteriano) se localizó de 16 a 44 pares de bases corriente arriba de codón de inicio (Hénaut, A. y A. Danchin. 1996. Analysis and predictions from Escherichia coli sequences, or E. coli in silico, p. 2047-2066. En F. C. Neidhardt y colaboradores. (eds.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology [Análisis y predicción a partir de secuencias de Escherichia coli o bien E. coli en silicio, p. 2047-2066] [Biología molecular y celular de Escherichia coli y Salmonella] . ASM Press, Washington, DC) .

Corriente abajo (21 pares de bases) del codón de terminación de traducción se encontró una secuencia de 62 pares de bases predicha para formar dos estructuras tallo-bucle seguidas por una región de 16 pares de bases rica en At, lo que es consistente con la terminación de transcripción independiente de p (Hénaut, A. y A. Danchin. 1996. Analysis and predictions from Escherichia coli sequences, or E. coli in silico, p. 2047-2066. En F. C. Neidhardt y colaboradores. (eds.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology [Análisis y predicción a partir de secuencias de Escherichia coli o bien E. coli en silicio, p. 2047-2066] [Biología molecular y celular de Escherichia. coli y Salmonella] . ASM Press, Washington, DC) . Los cuatro genes bacterianos pdc, incluyendo los de Z. mobilisr S. ventriculi y A. pasteurianus, son predichos como independientemente transcritos a partir de un operon monocistrónico (Con ay, . , Y. A. Osman, J. I. Konnan, E. M. Hoffmann, y L. 0. Ingram. 1987. Promoter and nucleotide sequences of the Zymomonas mobilis pyruvate decarboxylase [Secuencias de promotor y nucleótidos de piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis] . J. Bacteriol. 169:949-954; Raj , K. C, L. 0. Ingram, y J. A. Maupin-Furlo . 2001. Pyruvate decarboxylase: a key enzyme for the oxidative metabolism of lactic acid by Acetobacter pasteurianus [Piruvato decarboxilasa: una enzima clave para el metabolismo oxidante de ácido láctico por Acetobacter pasteurianus]. Arch. Microbiol. 176:443-451; Talarico, L. A. , L. 0. Ingram, y J. A. Maupin-Furlow. 2001. Production of the Gram-positive Sarcina ventriculi pyruvate decarboxylase in Escherichia coli [Producción de la piruvato decarboxilasa de Sarcina ventriculi Gram-positiva en Escherichia coli] . Microbiology 147:2425-2435). El polipéptido de PDC deducido de Z. palmae (ZpaPDC) contenia 556 aminoácidos (incluyendo la metionina N-terminal) con una masa molecular anhidra de 60,113 Da (Figura 4). Esto es similar a las tres otras PDCs bacterianas que se ubican dentro de un rango de 552 a 568 aminoácidos y 59,830 a 61,809 Da. El número de acceso de GenBank AF47 145 ha sido asignado a la secuencia de Z. palmae. EJEMPLO 2 IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE GEN DE PDC A PARTIR DE LA BACTERIA AERÓBICA GRAM NEGATIVA ACETOBACTER PASTEURIANUS En este ejemplo, se describe la identificación y caracterización de un gen de PDC a partir de la bacteria gram negativa Acetobacter pasteurianus. En resumen, un ADN cromosómico fue aislado a partir de células de A. pasteurianus utilizando un método descrito por Harwood y colaboradores (Harwood, C. R. y S. M Cutting. 1990. In Molecular Biological Methods for Bacillus, en [Métodos biológicos moleculares para Bacillus] . Wiley, New York) . Para análisis de Southern, el ADN genómico (de 1 a 2 µg por carril) fue disociado con enzimas de restricción (Aatll, BamBlf Clal, EcóRI, y HíncII) , separadas por electroforesis en gel (agarosa al 0.8%) y transferido por acción capilar descendente hasta membrana de nylon cargadas positivamente. Las membranas fueron equilibradas a una temperatura de 60° C durante 2 horas en 5X SSC (IX SSC en NaCl 0.15 M más citrato sódico 0.015 M) que contenia reactivos de bloqueo al 1%, N-lauroilsarcosina al 0.1%, y dodecil sulfato sódico (SDS) al 0.02%. Cebadores aleatorios fueron utilizados para marcar una sonda con digoxigenin-ll-dUTP utilizando un fragmento de 0.7 kb de Kpnl del gen pdc de Z. mobilis como templado. Después de la adición de la sonda marcada (1 ng por mi) membranas fueron incubadas a una temperatura de 60° C durante 14 horas y lavadas dos veces con una solución que contenia 2X SSC y SDS al 0.1% (5 minutos por lavado) y dos veces con una solución que contenia 0.5X SSC y SDS al 0.1% (15 minutos por lavado a 60° C) . Las señales fueron visualizadas por quimioluminiscencia utilizando una película de rayos X. Una biblioteca sub-genómica fue generada utilizando fragmentos de AatlI de 5 a 7 kb de ADN cromosómico de A. pasteurianus. Salientes fueron convertidas en extremos planos utilizando Vent ADN polimerasa y ligadas en los extremos planos (Vent ADN polimerasa) , el sitio Xhol defosforilado (fosfatasa alcalina intestinal de becerro) de pLITMUS28. Después de transformación, los recombinantes fueron tamizados por hibridación utilizando condiciones similares a las condiciones para el análisis Southern lo que permitió el aislamiento del plásmido pJAM301 que contiene los genes pdc y aldl de longitud completa (Figura 2) . El fragmento de ADN A. pasteurianus (4.2 kb) en pJAM301 fue después subclonado (Figura 2) y secuenciado por el método didesoxi de Sanger (Sanger, F. , S. Nicklen, y A. R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain terminating inhibitors [Secuenciamiento de ADN con inhibidores de terminación de cadena] .Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. . 74:5463-5467) utilizando un secuenciador LICOR (DNA Sequencing Facility, Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida) . El número de acceso de GenBank AF368435 ha sido asignado a esta secuencia. Se utilizaron Genepro 5.0 (Riverside Scientific, Seattle, WA) , Clustal W versión 1.81 (Thompson y colaboradores, 1994), Treeview versión 1.5 (Page, 1996), y MultiAln (Corpet, 1988) para comparaciones y alineaciones de secuencias de ADN y/o polipéptidos . Las secuencias de aminoácidos deducidas fueron comparadas con la secuencias de polipéptidos disponibles en las bases de datos de GenBank, EMBL, y Swiss Prot en el National Center for Biotechnology Information [Centro Nacional para Información en materia de Biotecnología] (Bethesda) , MD) utilizando el servidor de red BLAST.

Un fragmento del gen de piruvato decarboxilasa (pdc) a partir de Z. mobilis fue utilizado como sonda de hibridación de ADN para aislar un fragmento de Aatll de 6,337 pares de bases con un contenido de 58.5% de G+C a partir del ADN genómico de A. pasteurianus (Figura 2) . Con base en un análisis BLAST de la secuencia de ADN, se identificó un gen pdc. Este gen es predicho como codificando un polipéptido de 548 aminoácidos (incluyendo la formil-metionina N-terminal) con un pl calculado de 5.49 y una masa molecular anhidra de 58,873 Da (Figura 5) . El uso de codón del gen pdc fue comparado con los dos otros genes pdc bacterianos, Z. mobilis (Conway, T., Y. A. Osman, J. I. Konnan, E. M. Hoffmann, y L. O. Ingram. 1987. Promoter and nucleotide sequences of the Zy omonas mobilis pyruvate decarboxylase [Secuencias de promotor y nucleótidos de piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis] . J. Bacteriol. 169:949-954; Neale, A. D., R. K. Scopes, R. E. Wettenhall, y N. J. Hoogenraad. 1987. Pyruvate decarboxylase of Zymomonas mobilis: isolation, properties, and genetic expression in Escherichia coli [Piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis: Aislamiento, propiedades y expresión genética en Escherichia coli], J. Bacteriol. 169:1024-1028, Reynen y Sahm, J. Bacteriol. 170:3310-3313 (1988)) y S. ventriculi, asi como el genoma de E. coli K-12 (Tabla 1) . De manera consistente con el alto contenido de G+C para el gen pdc de A. pasteurianus (60.4%), los codones presentaron una predominancia de C y/o G en una tercera posición de base a excepción de Glu, His y Tyr (Tabla 1) . Esto contrasta con los genes pdc de Z. mobills (52.4%), y S. ventriculi (30.9%) que tienen un contenido menor de G+C y difieren en cuanto a su uso de codón. El análisis del extremo 5' del gen pdc de A. pasteurianus reveló una secuencia canónica Shine-Dalgarno que se encuentra 8' pares de bases corriente arriba del codón de inicio de traducción predicho de GTG. Además, una región 72 a 101 pares de bases corriente arriba del gen pdc tiene una alta identidad con una secuencia de consenso eurobacteriana -35 y -10 para un promotor dependiente de s70. Inmediatamente corriente abajo (17 pares de bases) del codón de terminación de traducción de pdc se encuentra una serie de estructuras de bucle de tipo pasador predic as que son seguidas por una región rica en AT, lo que indica una terminación independiente de p de la transcripción de pdc. Asi, el gen pdc de A. pasteurianus fue determinado como transcrito como un operon monocistrónicp como el de los genes pdc Z. mobilis (Conway, T., ?. A. Osman, J. I. Konnan, E. M. Hoffmann, y L. O. Ingram. 1987. Promoter and nucleotide sequences of the Zymomonas mobilis pyruvate decarboxylase [Secuencias de promotor y nucleótidos de piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis]. J. Bacteriol. 169:949-954) y S. ventriculi. Cuadros de lectura abiertos adicionales (ORFs) fueron identificados en la región de gen pdc incluyendo un ORF indicado como aldl, que es transcrito en forma divergente a partir de pdc (Figura 2) . El gen aldJ putativo es predicho como codificando un polipéptido de 357 aminoácidos (incluyendo la formil-metionina N-terminal) con una masa molecular calculada de 38,108 Da y pl de 6.32. La secuencia de polipéptidos deducida (Aldl) es muy similar a los miembros de la familia ADH de cadena media dependiente de Zn2+ y NAD+ (clase III) más especialmente las formaldehído deshidrogenasas dependientes de glutationa (GSH-FDH) (Jornvall y colaboradores, J. Biochem 167:195-201 (1987)). Residuos de aminoácidos que son probables ligandos tanto para iones zinc estructurales (C-92, C-95, C-98, y C-106) como iones zinc catalíticos (C-40, H-62, y C-169) importantes para la actividad de GSH-FDH se conservan. Una secuencia de consenso de pliegue de Rossman (residuos 194-GLGGIG-199) está también presente e indica que Aldl puede unirse a a NAD(P)+. El polipéptido de Aldl de A. pasteurianus predicho tiene poca identidad de secuencia con las tres sub-unidades de las enzimas ALD o ADH unidas a membrana, que se requieren para oxidación de etanol en Acetobacter (Thurner y colaboradores, 1997; Kondo y Horinouchi, J Bacteriol . 177:5048-5055 (1997)). Al contrario, este polipéptido predicho fue determinado come teniendo relaciones evolucionarías estrechas con polipéptidos GSH-FDH. En forma más notable, el polipéptido de ?. pasteurianus codificado por los grupos aldJ con enzimas GSH-FDH a partir de la a-proteobacterias, la cianobacteria Anabaena azolla, y en menos medida con las ß- y ?-proteobacterias lo que es consistente con la clasificación taxonómica de las bacterias de ácido acético. Subclones del fragmento genómico de 6.3 kb de Aatl de A. pasteurianus que llevan el gen pdc en un plásmido con alto número de copias fueron analizados para actividad PDC por el ensayo acoplado ADH. Niveles significativos de actividad de PDC fueron detectados solamente para cepas que llevan el plásmido pJAM304, que tiene el cuadro de lectura abierto de pdc completo además de 124 pares de bases corriente arriba y 236 pares de bases corriente abajo del en (Figuras 2 y 5) . El número da acceso de GenBank AR368435 ha sido asignada a la secuencia de Acetobacter pasteurianus. EJEMPLO 2 IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL GEN DE PDC A PARTIR DE LA BACTERIA GRAM POSITIVA SARCINA VENTRICÜLI En este ejemplo, se describe la identificación y caracterización de un gen de PDC a partir de la bacteria gram positiva Sarcina ventriculí . En resumen, un oligonucleótido degenerado 5'-AARGARGTNAAYGTNGARCAYATGTTYGGNGT-3' (SEQ ID NO: 11) fue sintetizado con base en la secuencia de aminoácidos N-terminal de PDC purificada a partir de S. ventriculí (Lowe y Zeikus, 1992) (en donde, R es A ó G; N es ?, C, G o T; Y es C o T) . Este oligonucleótido- fue marcado en el extremo 3' utilizando transferasa terminal con digoxigenin-ll-dUTP y dATP de conformidad con lo recomendado por el proveedor (Roche Molecular Biochemicals) y se utilizó para tamizar el ADN genómico del S. ventriculi. Para análisis Southern, el ADN genómico fue digerido con Bgll, EcóRl, o HincII, separado por electroforesis en agarosa al 0.8%, y transferido a membranas de nylon cargadas positivamente (Southern, 1975) . Las membranas fueron equilibradas a una temperatura de 58° C durante 2 horas en 5 X SSC (1 X SSC es NaCl 0.15 M más citrato de sodio 0.015 M) que contenían reactivos de bloqueo a 1% (Roche Molecular Biochemicals), N-lauroilsarcosina al 0.1%, y SDS al 0.02%. Después de la adición de la sonda (0.2 pmol por mi) y poly (A) (0.01 mg por mi), las membranas fueron incubadas a una temperatura de 58° C durante 18.5 horas. Las membranas fueron lavadas dos veces con 2 X SSC que contenía SDS al 0.1% (5 minutos por lavado) a una temperatura de 25° C y dos veces con 0.5 X SSC que contenía SDS al 0.1% (15 minutos por lavado) a una temperatura de 58° C. Señales fueron visualizadas utilizando detección calorimétrica de conformidad con el proveedor (Roche Molecular Biochemicals) . Para la generación de una biblioteca subgenómica en el plásmido pBR322, el ADN cromosómico de S. ventriculi fue digerido con HincII y fraccionado por electroforesis. Los fragmentos de ADN de HincII de 2.5 a 3.5 kb fueron ligados en el sitio de ScoRV de pBR322 y transformados en E. coli SE2309. Colonias fueron tamizadas con el oligonucleótido degenerado por detección calorimétrica. A través de este método, el plásmido pJAM400 que lleva un fragmento HincII que contiene 1,350 pares de bases del gen pdc fue aislado (Figura 3) . El ????????? Vector Sysytem (Novagen) fue utilizado para crear una biblioteca subgenomica adicional para facilitar el aislamiento del gen pdc de longitud completa a partir del 5. ventriculi . El ADN genómico fue digerido con Bell separado por el electroforesis en agarosa al 0.8%, y los fragmentos de 6.5 a 8.5 kb fueron ligados con los brazos Bamül de BlueSTAR. El empaque in vitro y la colocación en placas de fago fue efectuada de conformidad con las instrucciones del proveedor (Novagen) . Una sonda de ADN fue generada empleando un fragmento EcoRI de 800 pares de bases del gen pdc de pJAM400 que fue marcado con digoxigenin-ll-dUTP utilizando el método de cebado aleatorio de conformidad con lo recomendado por el proveedor (Roche Molecular Biochemicals ) . Placas fueron tamizadas utilizando detección calorimétrica. Una subclonación mediada por Cre-loxP fue utilizada para circularizar' el ADN de las placas positivas mediante la colocación en placas de fago BlueSTAR con E. coli B25.8 que expresa Cre recombinase (Novagen) . El plásmido circularizado pJAM410 fue después purificado y sometido a electroporación en E. col! DH5a. Para la generación de un vector de expresión de pdc, el gen pdc sin promotor fue subclonado en pET21 después de amplificación a partir de pJAM413 (Figura 3) por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Cebadores fueron diseñados para inserción de direccional utilizando los sitios de restricción BspRl (oligo 1) y Xhol (oligo 2) . El fragmento resultante fue ligado en sitios Ncol y Xhol compatibles de pET21d (Novagen)' para producir pJAM419 (Figura 3) . La fidelidad del gen pdc fue confirmada por secuenciamiento de ADN. Para determinar el operon de piruvato decarboxilasa de S. ventriculi, la" secuencia de aminoácidos N-terminal del polipéptido de PDC modificado a partir de S. ventriculi (Lowe y Zeikus, 1992) fue utilizado para generar un oligonucleótido degenerado para hibridación con ADN genómico. Este enfoque facilitó el aislamiento de un fragmento de ADN genómico de Bell de 7.0 kb a partir de kS. Ventriculi. El fragmento fue subclonado adicionalmente con el objeto de secuenciar ambas cadenas de una región HincIl-a.-Kincll de 3, 886 pares de bases que se híbrido con la sonda de oligonucleótido (Figura 3) . El análisis de la secuencia de ADN revela un cuadro de lectura abierto (ORF) de 1,656 pares de bases que codifica un polipéptido con un extremo N idéntico al de PDC de S. ventriculi previamente purificado (Figura 6) . El ORF es por consiguiente designado pdc. Una secuencia Shine-Delgarno canónica está presente 7 pares de bases corriente arriba del codón de inicio de traducción de pdc. En adición, una región de 82 a 110 pares de bases corriente arriba de pdc tiene una identidad limitada con la secuencia de consenso de promotor -35 y -10 eubacteriano . Corriente abajo (43 pares de bases) del codón de terminación de traducción de pdc se encuentra en una región predic a para formar una estructura tallo-bucle seguido por una región rica en AT, lo que es consistente con un terminador de transcripción independiente de p. Asi, pdc de S. vent iculi es transcrito como un operón monocistrónico como, el gen pdc de Z. mobilis (Conway y colaboradores, 1987) . Un ORF parcial fue identificado 722 pares de bases corriente arriba de pdc que codifica un fragmento de polipéptido de 177 aminoácidos (ORF*) (Figura 3) . ORF1* tiene una identidad (28-29%) con varios polipéptidos de membrana hipotéticos (número de acceso GenBank CAC11620, CA24018, CAA22902) y se predice que forma varios dominios que abarcan la transmembrana (datos no ilustrados) . El gen que codifica ORF* no es predicho que vaya a ser transcrito a partir del promotor -35 y -10 putativo del operon pdc. Con base en los estudios anteriores, el gen pdc de S. ventriculi fue determinado como codificando un polipéptido de 552 aminoácidos (incluyendo la metionina N-terminal) con un pl calculado de 5.16 y una masa molecular anhidra de 61,737 Da. El número de acceso GenBank AF354297 ha sido asignado a la secuencia de Sarcina ventriculi. EJEMPLO 4 MÉTODOS PARA PRODUCIR UN ANTICUERPO QUE SE UNE ESPECÍFICAMENTE A UN POLIPEPTIDO DE PDC En este ejemplo, se describen métodos para elaborar un anticuerpo inmunoespecifico contra una piruvato decarboxilasa. En resumen, un polipéptido de PDC de A. pasteurianus recombinante purificado (300 µg) fue separado por SDS-PAGE. Un fragmento de gel que contiene la proteina de PDC fue removida antes de tinción con azul Coomassie R-250. Esto fue utilizado como antigeno para producción de anticuerpos policlonales en conejos (anti-ApPDC) de conformidad con lo recomendado por el proveedor (Cocalico Biologicals, Reamstown, Penn) . Para un análisis de inmunoabsorción, proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y transferidas a membranas de PVDF en MES 10 mM a pH 6.0 con metanol al 10% durante 16 horas a 20 volts a una temperatura de 4o C. Para detectar un antigeno, se utilizaron técnicas estándares de procedimientos de inmunoabsorción y detección calorimétrica. El anticuerpo primario anti-ApPDC, fue diluido 1:7,000. El anticuerpo secundario de anti-conejo de cabra unida a fosfatase alcalina (Fisher Biotech) fue diluido 1:7,500. Utilizando el método anterior, se identificó un anticuerpo policlonal que se une específicamente a un polipéptido de PDC. Si se desea, las moléculas de anticuerpo dirigidas contra PDC pueden ser aisladas a partir de mamífero (por ejemplo, a partir de la sangre) y purificados adicionalmente por técnicas bien conocidas, por ejemplo, cromatografía de proteína ? para obtener la fracción de IgG. Además, en un tiempo apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos, de anticuerpo anti-PDC son los más elevados, células productoras de anticuerpos pueden ser obtenidas a partir de sujeto y utilizadas para preparar anticuerpos monoclonales por técnicas estándares, por ejemplo, técnica de hibridoma originalmente descrita por ohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497; véase también, Using Antibodíes: A laboratory Manual [Utilización de anticuerpos: Un Manual de Laboratorio], Harlow y colaboradores, C.S.H.I. Press, Pub. (1999)). EJEMPLO 5 MÉTODOS PARA IDENTIFICAR EL USO DE CODÓN DE GENES DE PDC EN DIFERENTES CÉLULAS HUÉSPEDES En este ejemplo, se describen métodos para identificar polipéptidos de PDC adecuados para una expresión mejorada con base en uso de codón.

PDC bacteriano puede ser utilizado para manipular vías de etanol en una amplia gama de organismos. Sin embargo, patrones compatibles de uso de codón son determinados de manera provechosa con el objeto de asegurar la expresión funcional en sistemas heterólogos (Barbosa, M.F.S. y L.O. Ingram. 1994. Expression of the Zymomonas mobllis alcohol dehydrogenase II {adhB) and pyruvate decarboxylase (pdc) genes in Bacillus [Expresiones de los genes de alcohol deshidrogenasa II (adhB) y piruvato decarboxilasa (pdc) de Zymomonas obills en Bacillus]. Curr. Microbiol. 28:279-282; Deng, M. D. y J. R. Coleman. 1999. Ethanol synthesis by genetic engxneering in cyanobacteria [Síntesis de etanol por manipulación genética en cianobacterias] . Appl. Environ. Microbiol. 65:523-528; Gold, R. S., M. . Meagher, S. Tong, R. W. Hutkins, y T. Conway. 1996. Cloning and expression of the Zymomonas mobllis "production of ethanol" genes in Lactobacillus casei [Clonación y expresión de los genes de "producción de etanol" de Zymomonas mobllis en Lactobacillus casei]. Curr. Microbiol. 33:256-260; Ingram, L. 0., H. C. Aldrich, A. C. Borges, T. B. Causey, A. Martínez, F. Morales, A. Salen, S. A. Underwood, L. P. Yomano, S. . York, J. Zaldivar,- y S. Zhou. 1999. Enterr bacterial catalysts for fuel ethanol production [catalizadores bacterianos entéricos para producción de etanol combustible]. Biotechnol. Prog. 15:855-866). Una simple tabulación del contenido de G+C puede. ser como guía inicial. El contenido de G+C en estos cuatro genes pdc se ubica dentro de un rango de 60% para A. pasteurianus a 31% para S. ventriculi. El contenido promedio de G+C para ORFs de E. coli es del 50%, lo que es idéntico al caso de pdc de Z. mobilis (52%) y similar a pdc de Z. palmae (55%) . En el caso de la mayoría de los aminoácidos, patrones de- uso de codón para estos dos organismos fueron similares entre ellos y con E. coli. El pdc de Z. palmae fue expresado funcionalmente en niveles altos (aproximadamente 1/3 de polipéptido basado en actividad) en E. coli recombinante. Pdc de Z. mobilis y pdc de A. pasteurianus fueron expresados en niveles más bajos (de 7 a 9% de polipéptido con base en actividad) y pdc de S. ventriculi fue expresado en forma limitada en E. coli recombinante (menos que 0.3% del polipéptido con base en actividad) ( Talarico, L. A., L. 0. Ingram, y J. A. Maupin-Furlow. 2001. Production of the Gram-positive Sarcina ventriculi pyruvate decarboxylase in Escherichia coli [Producción de la piruvato decarboxilasa de Sarcina ventriculi Gram-positiva en Escherichia coli] . Microbiology 147:2425-2435) . Para producir cantidades mayores de PDC de S. ventriculi recombinante funcional, el uso de un huésped de E. coli, modificado que contiene genes de ARNt adicionales para codones poco frecuentes, por ejemplo, AGA (arginina) , GGA (glicina) , AUA (isoleucina) y CÜA (leucina) comprobó ser importante para producción de polipéptidos de alto nivel (casi de polipéptido con base en actividad) ( Taiarico, L. A., L. 0. Ingram, y J. ?. Maupin-Furlo . 2001. Production of the Gram-positive Sarcina ventriculi pyruvate decarboxylase in Escherichia coli [Producción de la piruvato decarboxilasa de Sarcina ventriculi Gram-positiva en Escherichia coli] . icrobiology 147:2425-2435). El patrón de uso de codón en pdc de S. ventriculi es especialmente útil para la manipulación genética de una via de etanol en bacterias gram positivas con bajo contenido de G+C como se ilustra a través de la comparación con ORFs de B. subtilis (Tabla 1) . En contraste, pdc de A, pasteurianus puede seleccionarse para la manipulación de una via de homoetanol en bacterias celuloliticas con alto contenido de G+C, por ejemplo, Thermobífida sp. ( Ir in, D. C, S. Zhang, y D. B. Wilson. 2000. Cloning, expression and characterization of a Family 48 exocellulase, Cel48A, f om Thermobífida fusca [Clonación, expresión y caracterización de exocelulasa Familia 48, Cel48A, de Thermobífida fusca]. Eur. J. Biochem. 267:4988-4997) o bien Cellulomonas sp (Notenboom, V., C. Birsan, R. A. Warren, S. G. Withers, y D. R. Rose. 1998. Exploring the cellulose/xylan specificity of the beta-1, 4-glycanase cex from Cellulomonas fimi through crystallography and mutation [Exploración de la especificidad de celulosa/xilano de beta-1 , 4-glicanasa cex de Cellulomonas fimi a través de cristalografía y mutación]. Biochemistry 37:4751-4758).

Tabla 1. Uso de codon de genes pdc bacterianos Amino Codon Zpa pcd* Apa pcd* Zmo pcd* Ácido Ala GCA ¦ 41.3 (32) 17.9 (14) 31.6 (21) GCC 39.5 (30) 73.5 (56) 31.6 (21) GCG 3.6 (03) 30.5 (23) 10.5 (07) GCÜ 46.7 (36) 9.0 (07) 75.6 (51) Arg AGA 0 (—) 0 (—) o (--) AGG 0 (—) 1.8 (04) 0 (—) CGC 23.3 (50) 28.7 (64) 14.1 (47) CGG 0 (—) 5.4 (12) 1.8 (06) CGÜ 23.3 (50) 9.0 (20) 14.1 (47) CGA o (—) 0 (—) 0 (—) Asn AAC 41.3 (77) 32.3 (67) 49.2 (82) AAÜ 12.6 (23) 16.1 (33) 10.5 (18) Asp GAC 37.7 (78) 32.3 (67) 22.8 (54) GAÜ 10.8 (22). 16.1 (33) 19.3 (46) Cys ÜGC 10.8 (60) 32.3 (67) 10.5 (85) UGÜ 7.2 (40) 16.1 (33) 1.8 (15) Gln CAA 9.0 (25) 3.6 (11) 0(—) CAG 26.9 (75) 28.7 (89) 17.6 (100) Glu GAA 61.0 (87) 43.0 (80) 63.3 (92) GAG 9.0 (13) 10.8 (20) 5.3 (08) Gly GGA 1.8 (02) 3.6 (05) 1.8 (02) GGC 35.9 (44) 64.5 (82) 19.3 (24) GGG 0 (—) 3.6 (05) 0 (—) GGU 44.9 (54) 7.2 (09) 59.8 (74) His CAC 14.4 (67) 10.8 (43) 12.3 (58) CAÜ 7.2 (33) 14.3 (57) 8.8 (42) lie AÜA (0 (—) 0 (--) 0 (—) AUC 55.7 (89) 34.1 (66) 36.9 (78) AUU 7.2 (11) 17.9 (34) 10.5 (22) Leu CUA 7.2 (09) 0 (—) 0 (—) CUC 5.4 (07) 9.0 (08) 19.3 (22) CÜG 59.2 (73) 69.9 (64) 33.4 (38) CUU 3.6 (04) 10.8 (10) 15.8 (18) UUA 0 (--) 0 (—) 1.8 (02) UUG 5.4 (07) 13.9 (18) 17.6 (20) Lys AAA 26.9 (94) 12.5 (35) 35.1 (56) AAG 1.8 (06) 23.3 (65) 28.1 (44) Met AUG 26.9 (100) 26.9 (100) 21.1 (100) Phe UUC 23.3 (87) 19.7 (78) 28.1 (89) DUU 3.6 (13) 5.4 (22) 3.5 (11) Pro CCA 1.8 (04) 1.8 (04) 5.3 (11) CCC 1.8 (04) 21.5 (50) 3.5 (07) CCG 30.5 (74) 14.3 (33) 28.1 (59) ccu 7.2 " (17) 5.4 (13) 10.5 (22) Ser AGC 12.6 (26) 19.7 (35) 15.8 (37) AGÜ 1.8 (04) 0 ( — ) 5.3 (13) OCA 3.6 (07) 7.2 (13) 1.8 (04) ucc 9.0 (19) 19.7 (35) 14.1 (33) UCG 1.8 (04) 7.2 (13) 0 ( — ) UCU 19.7 (41) 1.8 (03) 5.3 (13) Thr ACA 5.4 (09) 10.8 (16) 0 ( — ) ACC 19.7 (34) 30.5 (45) 28.1 (62) ACG 10.8 (19) 23.3 (34) 10.5 (23) ACU 21.5 (38) 3.6 (05) 7.0 (15) Trp ÜGG 16.2 (100) 12.5 (100) 12.3 (100) Tyr ÜAC 18.0 (59) 14.3 (47) 12.3 (32) ÜAÜ 12.6 (41) 16.1 (53) 26.4 (68) Val GÜA 14.4 (20) 7.2 (10) 0 (—) GUC 34.1 (49) 23.3 (32) 31.6 (40) GÜG 3.6 (05) 26.9 (38) 5.3 (07) GÜU 18.0 (26) 14.3 (20) 42.2 (53) ADN codificador porcentaje molar G+C 55 60 52 Amino Codon Sve pcd* Eco K12 Bsu Ácido genoma+ genoma- Ala GCA 32.5 (47) 20.1 (21) 21.7 (28) GCC 0 (— ) 25.5 (27) 15.8 (21) GCG 1.8 (03) 33.6 (36) 20.2 (26) GCU 34.4 (50) 15.3 (16) 19.0 (25) Arg AGA 39.8 (100) 2.1 (04) 10.6 (26) AGG O (—) 1.2 (02) 3.9 (09) CGC O (--) 22.0 (40) 8.6 (21) CGG O (—) 5.4 (10) 6.5 (16) CGÜ O (—) 20.9 (38) 7.6 (18) CGA O (—) 3.6 (07) 4.1 (10) Asn AAC 19.9 (42) 21.7 (55) 17.3 (44) AAU 27.1 (58) 17.7 (45) 22.1 (56) Asp GAC 3.6 (07) 19.1 (37) 18.8 (36) GAO 47.0 (93) 32.1 (63) 33. C (64) Cys UGC 1.8 (20) 6.5 (55) 4.3 (55) UGU 7.2 (80) 5.2 (44) 3.6 (45) Gln CAA 28.9 (100) 15.3 (35) 19.8 (51) CAG O (—) 28.8 (65) 18.7 (49) Glu GAA 85.0 (94) 39.4 (69) 48.9 (68) GAG 5.4 (06) 17.8 (31) 23.1 (32) Gly GGA 50.6 (72) 8.0 (11) 21.7 (31) GGC O (—) 29.6 (40) 23.4 (34) GGG O (—) 11.1 (15) 11.2 (16) GGÜ 19.9 (28) 24.7 (34) 12.8 (19) His CAC 3.6 (22) 9.7 (43) 7.5 (33) CAU 12.7 (78) 12.9 (57) 15.2 (67) lie AUA 39.8 (56) 4.4 (07) 9.3 (13) AUC 9.0 (13) 25.1 (42) 27.0 (37) AUO 21.7 (31) 30.3 (51) 36.8 (50) Leu CÜA 7.2 (09) 3.9 (04) 4.9 (05) CÜC 0 (--) 11.1 (10) 10.8 (11) CÜG . 0 (—) 52.6 (50) 23.1 (24) CÜÜ 14.5 (18) 11.0 (10) 23.0 (24) UÜA 59.7 (73) 13.9 (13) 19.1 (20) UUG 0 (—) 13.7 (13) 15.3 (16) Lys AAA 63.3 (92) 33.6 (76) _ 49.1 (70) AAG 5. (0-8) 10.3 (24) 20.8 (30) et AUG 27.1 (100) 27.9 (100) 26.9 (100) Phe UUC 18.1 (38) ' 16.6 (43) 14.2 (32) UUU 28.9 (62) 22.3 (57) 30.2 (68) Pro CCA 18.1 (67) 8.4 (19) 7.0 (19) CCC 0 (—) 5.5 (12) 3.3 (09) CCG (07) 23.2 (53) (44) CCÜ (27) 7.0 (15) (29) Ser AGC 12.7 (20) 16.1 (28) 14.2 (23) AGU 12.7 (20) 8.8 (15) 6.6 (10) UCA 32.5 (50) 7.2 (12) 4.8 (23) ÜCC 0 (--) 8.6 (15) 8.1 (13) UCG 0 (—) 8.9 (15) 6.4 (10) ÜCU 7.2 (11) 8.5 (15) 12.9 (21) Thr ACA 34.4 (53) 7.1 (13) 22.3 (41) ACC 0 (—) 23.4 (43) 8.6 (16) ACG 0 (— ) 14.4 (27) 14.6 (27) ACU 30.7 (47) 9.0 (17) 8.7 (16) Trp UGG 5.4 (100) 15.2 (100) 10.3 (100) Tyr ÜAC 7.2 (18) 12.2 (43) 12.0 (35) ÜAÜ 32.5 (82) 16.2 (57) 22.6 (65) Val GUA 36.2 (46) 10.9 (15) 13.4 (20) GÜC 0 (--) 15.3 (22) 17.3 (26) GUG 0 (— ) 26.4 (37) 17.7 (26) GUÜ 43.4 (54) 18.3 (26) 19.2 (28) ADN codificador porcentaje molar G+C 31 52 44 üso de codon para pdc(*) y ADN genómico (†) representado como frecuencia por mil bases. Porcentaje de uso de codon por amino ácido indicado entre paréntesis . Codones de terminación no están incluidos. Abreviaturas (número de acceso Genbank) : Apa, A. pasteurianus pdc (AF368435) Zpa, A. palmae pdc (AF474145) ; Zmo, Z. mobilis (M15393) ; Sve, S. ventriculi (AF354297); Eco, E . coli; Bsu, B. subtilis . EJEMPLO 6 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE ACTIVIDAD DE PDC En este ejemplo, se describe la caracterización bioquímica de varios polipéptidos de PDC representativos. La purificación de cuatro polipéptidos de PDC bacterianos representativos fue efectuada de conformidad con lo presentado en la tabla 2, ínfra. Se purificó ZpaPDC hasta homogeneidad a partir de Z. palmae y E. coli recombinante para propósitos de comparación, se purificaron tres otras PDCs bacterianas a partir de E. coli recombinante. Se purificó también PDC a partir de A. pasteurianus. En general, la purificación de las PDCs nativas requirió de pasos adicionales (es decir, cromatografía con fenil Sepharose e hidroxiapatita) . Esto se debió a los niveles menores de 10 a 250 veces de actividad de PDC de lisado de células "nativas" en comparación con lisado de células "recombinantes" . Todos los polipéptidos de PDC presentaron masas moleculares sub-unitarias de 55 a 60 kDa, de conformidad con lo estimado por SDS-PAGE reductora, lo que fue consistente con las masas calculadas a partir de las secuencias de polipéptidos deducidas . Las secuencias de aminoácidos N-terminal de PDC purificada a partir de Z. palmae (MYTGMYLAE) fue idéntica a la secuencia deducida a partir del gen e incluyo la metionina N-terminal. Estudios previos han demostrado que PDC purificada a partir de S. ventriculi conserva también la metionina N-terminal que es amino con relación a un residuo de lisina (Lowe, S. E. y J. G. Zeikus. 1992. Purification and characterization of pyruvate decarboxylase from Sarcina ventriculi [Purificación y caracterización de piruvato decarboxilasa de Sarcina ventriculi]. J. Gen. Microbiol. 138:803-807; Talarico, L. A., L. O. Ingram, y J. A. Maupin-Furlow. 2001. Production of the Gram-positive Sarcina ventriculi pyruvate decarboxylase in Escherichia coli [Producción de la piruvato decarboxilasa de Sarcina ventriculi Gram-positiva en Escherichia coli] . Microbiology 147:2425-2435). En contraste, la secuencia N-terminal de PDC purificada a partir de A. pasteurianus (TYTVGMYLAERL) no presentó una metionina N-terminal lo que indica que ocurre disociación por una metionina aminopeptidasa nativa. La PDC purificada a partir de Z. mobilis fue también determinada como disociada para exponer una serina N-terminal (Neale, A. D. , R. K. Scopes, R. E. Wettenhall, y N. J. Hoogenraad. 1987. Pyruvate decarboxylase of Zymomonas mobilis: isolation, properties, and genetic expression in Escherichia coli [Piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis: Aislamiento, propiedades y expresión genética en Escherichia coli]. J. Bacteriol. 169:1024-1028). Estos resultados son consistentes con la especificidad de substrato altamente conservada de metionina aminopeptidasas que se debe al residuo i' (Bradshaw, R.A. , W.W. Brickey, y K.W. Walker. 1998. N-terminal processing: t e methionine aminopeptidase and Na-acetyl transferase families [Procesamiento N-terminal: las familias de metionina aminopeptidasa y Na-acetiltransferasa] . Trends Biochem. Sci. 23:263-267). La metionina N-terminal es removida solamente si el segundo residuo es pequeño y no cargado. Esta preferencia de substrato es opuesta a la "regla de extremo N" para degradación de polipéptidos (Tobías, J. W., T. E. Shrader, G. Rocap, y A. Varshavsky. 1991. The N-end rule in bacteria [La regla de extremo N en bacterias]. Science 254:1374-1377). Una determinación de la estructura cuaternaria de los polipéptidos de PDC se llevo también a cabo. La ZmoPDC asocia como tetrámero de 240 kDa aún después de la remoción de los co-factores PP y Mg2+ (Diefenbach, R. J. y R. G. Duggleby. 1991. Pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis. Structure and re-activation of apoenzyme by the cofactors thiamin diphosphate and magnesium ion [Piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis. Estructura y reactivación de apoenzima por los co-factores tiamin difosfato y ion magnesio] . Biochem. J. 276: 439-445) . De la misma manera, SvewPDC y ZpaPDC se asociaron como tetrámeros de 240 kDa aún después de disociación de co-factor (datos no ilustrados) . Es interesante observar que ApaPDC formó tanto tetrámeros como octámeros (224 y 447 kDa) de actividad especifica similar, y se disociaron en dimeros (120 kDa) después de extracción de co-factor. La actividad y configuración tetrámerica de la apoenzima ApaPDC fueron totalmente restauradas después de adición de Mg2+ y TPP con constantes de semi-saturación de 3.1 µ? y 5.8 µ? y constante de Hill de 1.17 a 1.22, respectivamente. La configuración tetramérica observada para las cuatro PDCs bacterianas es consistente con la estructura cuaternaria de la mayoría de las PDCs eucarióticas . Sin embargo, en forma. similar a ApaPDC, estructuras de orden más alto se observaron para la PDC proveniente del hongo filamentoso {Neurospora crasa, que se asocia como filamento homopolimérico de 8 a 10 nm (1) . De manera similar, en plantas (maíz, chícharos, y germen de trigo) la PDC forma complejos de hasta 1 MDa ( enworthy, P. y D. D. Davies. 1976.

Kinetic aspects of regulation of pyruvic decarboxylase [Aspectos cinéticos de la regulación de decarboxilasa pirúvica] . Phytochemistry 15:279-282; Lee, T. C. y' P. J. Langston-Unkefer. 1985. Pyruvate decarboxylase from Zea Mays L. I. Purification and partial characterization from nature kernels and anaerobically treated roots [Piruvato decarboxilasa de Zea mays L. I. Purificación y caracterización parcial a partir de núcleos maduros y raices tratadas en forma anaeróbica] . Plant Physiol. 79:242-247; Mücke, U., S. Kónig, y G. Hübner. 1995. Purification and characterization of pyruvate decarboxylase from pea seeds (Pisum sativum cv. Miko) [Purificación y caracterización de piruvato decarboxilasa a partir de semillas de chícharo {Pisum sativum cv. Miko)]. Biol. Chem. Hoppe Seyler 376:111-117) . La disociación de ApaPDC en dimeros después de remoción de los co-factores es también consistente con PDCs eucarióticas (Konig, S. 1998. Subunit structure, function and organization of pyruvate decarboxylases from various organisms [Estructura sub-unitaria, función y administración de piruvatos decarboxilasas de varios organismos] . Biochim. Biophys. Acta 1385:271-286). Tabla 2. Purificación de polipéptidos de PDC bacterianos Paso de purificación Actividad de Factor de Sp (ü mg-1) purificación ZpaPDC Lisado 0.13 1 Q-Sepharose 1.3 10 (Fenil Sepharose) 66 510 ZpaPDC-R Lisado 32 1 Q-Sepharose 92 3 (Superdex 200) 100 4 ApaPDC Lisado 0.62 1 Q-Sepharose 12 18 (hidroxiapatita) 71 110 ApaPDC-R Lisado 6.7 1 Q-Sepharose 58 9 (Superdex 200) 92 14 ZmoPDC-R Lisado 6.2 1 Q-Sepharose- 57 9 (Superdex 200) 72 12 SvePDC-R Lisado 8.7 1 Q-Sepharose 33 2 (Superdex 200) 37 6 PDC-R, PDC purificada a partir de E. coli recombinante SvePDC-R representa polipéptido ' urificado a partir de E coli Rosetta (DE3) (pRARE, pJAM419) . La actividad de SvePDC-R no fue detectada en lisado celular de E. coli B121-CodonPlus-RIL (pJAM419) . Los paréntesis indican un paso de purificación final Q-Sepharose y Superdex 200 fueron pasos de purificación comunes para todas las PDCs bacterianas . EJEMPLO 7 CARACTERIZACIÓN DE TERMOESTABILIDAD DE PDC En este ejemplo, se describe la termoestabilidad de varios polipéptidos de PDC representativos. Se observo que la ZmoPDC es termoestable después de calentamiento de lisado celular a 60° C en presencia de co-factores (TPP y Mg2+) ( Conway, . , Y. A. Osman, J. I. Konnan, E. M. Hoffmann, y L. O. Ingram. 1987. Promoter and nucleotide sequences of the Zymomonas mobilis pyruvate decarboxylase [Secuencias de promotor y nucleótidos de piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis]. J. Bacteriol. 169:949-954) . Para estudiar adicionalmente este fenómeno/ se analizó la actividad de las PDCs bacterianas purificadas a una temperatura de 25° C después de exposición a varias temperaturas en presencia de co-factores de saturación (Figura 7) . Las tres PDCs gram negativas fueron relativamente termoestables y conservaron de 60 a 100% de actividad después de calentamiento después de 60° C durante 30 minutos. En contraste, la SvePDC purificada fue totalmente desactivada después de exposición a temperaturas de 50° C o más. Aún cuando no se puede utilizar una composición de aminoácidos como una guía universal de la termoestabilidad (Matthews, B. W. 1993. Structural and genetic analysis of polypeptide stability [Análisis estructural y genético de la estabilidad de polipéptidos]. Annu. Rev. Biochem. 62:139-160; Mozhaev, V. V. y K. Martinek. 1984. Structure-stability relationships in polypeptides : new approaches to stabilizing enzymes [Pvelaciones estructura-estabilidad en polipéptidos: nuevos enfoques para estabilizar enzimas] . Enzyme Microb. Technol. 6:50-59; Vieille, C. y G. J. Zeikus. 2001. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability [Enzimas hipertermofílicas : fuentes, usos y mecanismos moleculares de termoestabilidad] . Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65:1-43)- se observó que las tres PDCs termoestables contenían niveles más altos de alanina y cisteína, y niveles bajos de fenilalanina. Estos cambios son consistentes con un incremento de la termoestabilidad con base en comparaciones de composiciones de enzimas homologas (Argos, P., M.G. Rossman, U.M. Grau, H. Zuber, G. Frank, y J.D. Tratschin. 1979. Thermal stability and polypeptide structure [Estabilidad térmica y estructura de polipéptidos] . Biochemistry 18:5698-5703; Mozhaev, V. V. y K. Martinek. 1984. Structure-stability relationships in polypeptides: new approaches · to stabilizing enzymes [Relaciones estructura-estabilidad en polipéptidos: nuevos enfoques para estabilizar enzimas]. Enzyme Microb. Technol. 6:50-59). Niveles incrementados de alanina pueden estabilizar polipéptidos de PDC gram negativos a alta temperatura facilitando la formación de hélices y un núcleo de polipéptidos más compacto. Por consiguiente, la presente invención incluye también genes pdc que han sido alterados para expresar una polipéptido de PDC' que comprende cambios de aminoácidos cisteina y/o alanina para lograr una termoestabilidad mejorada. Además, un análisis de la PDCs termoestables a partir de bacterias gram negativas reveló un incremento de más de 2.5 veces en cuanto a actividad cuando se ensayo en su temperatura óptima de 60° C en comparación con la temperatura ambiente. Con base en gráficas de Arrhenius, estas enzimas fueron estimadas como teniendo una entalpia de activación dentro de un rango de 12.6 a 14.2 kJ mol-1 y valores de entropía de -92.8 a -98.2 J mol^K"1. EJEMPLO 8 CARACTERIZACIÓN DE AFINIDADES DE SUBSTRATO DE PDC Y pH ÓPTIMO En este ejemplo, la caracterización de afinidad de substrato para varios polipéptidos de PDC representativos así como pH óptimos se describen. En particular, diferencias significativas en cuanto a pH óptimo fueron observadas para los polipéptidos de PDC bacterianos. La ZpaPDC fue más activa a un pH de 5.5 a 6.0 (figura 8), lo que es similar a ZmoPDC que presentó un pH óptimo de 6.0 (Neale, A. D., R. K. Scopes, R. E. Wettenhall, y N. J. Hoogenraad. 1987. Pyruvate decarboxylase of Zymomonas mobilis: isolation, properties, and genetic expression in Escherichia coli [Piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis: Aislamiento, propiedades y expresión genética en Escherichia coli]. J. Bacteriol . 169:1024-1028). El pH óptimo de ApaPDC , sin embargo, fue significativamente menor que lo observado para las demás PDCs gram negativas y se ubico dentro de un rango de 5.0 a 5.5 (figura 8). El pH óptimo para la SvePDC gram positiva (pH 6.3 a 7.6) fue mucho más amplio y más neutral que las PDCs gram negativas (Lo e, S. E. y J. G. Zeikus. 1992. Purification and characterization of pyruvate decarboxylase from Sarcina ventriculi [Purificación y caracterización de piruvato decarboxilasa de Sarcina ventriculi]. J. Gen. Microbiol. 138:803-807). Esto indica que existen diferencias en cuanto a la conformación y/o composición de residuos cargados en el sitio activo o cerca de dicho sitio. Las SvePDC eucarióticas y bacterianas presentan características cinéticas cooperadoras positivas en presencia del substrato piruvato (Candy, J. M. y R. G. Duggleby. 1998. Structure and properties of pyruvate decarboxylase and site-directed mutagenesis of the Zymomonas mobilis enzyme [Estructura y propiedades de piruvato decarboxilasa y mutagénesis dirigida a sitio de la enzima Zymomonas mobilis] .

Biochim. Biophys. Acta 1385:323-338; Kónig, S. 1998. Subunit structure, function and organization of pyruvate decarboxylases from various organisms [Estructura sub-unitaria, función y administración de piruvatos decarboxilasas de varios organismos]. Biochim. Biophys. Acta 1385:271-286; Lowe, S. E. y J. G. Zeikus. 1992. Purification and characterization of pyruvate decarboxylase from Sarcina ventriculi [Purificación . y caracterización de piruvato decarboxilasa de Sarcina ventriculi] . J. Gen. icrobiol. 138:803-807). La ZpaPDC y ApaPDC, sin embargo, presentó unas características de Michaelis-Menten normales con valores Km de 0.2 a 0.4 mM para piruvato y valores kcat de 20,500 a 30,500 min""1 (pH óptimo'-25° C) (Tabla 3). La falta de control alostérico con relación al piruvato, que se observo para estas enzimas PDC negativas es similar a lo establecido para la PDC altamente relacionada de Z. mobilis (Bringer-Meyer, S., K.-L. Schimz, y H. Sahm. 1986. Pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis. Isolation and partial characterization [Piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis. Aislamiento y caracterización parcial] Arch. Microbiol 146:105-110; Neale, A. D., R. K. Scopes, R. E. Wettenhall, y N. J. Hoogenraad. 1987. Pyruvate decarboxylase of Zymomonas mobilis: isolation, properties, and genetic expression in Escherichia coli [Piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis: Aislamiento, propiedades y expresión genética en Escherichia col! . J. Bacteriol. 169:1024-1028). Como comparación adicional, las constantes cinéticas de cuatro polipéptidos de PDC bacterianos fueron determinadas en su pH óptimo asi como a pH 7.0 (Tabla 3). Este enfoque fue seleccionado para analizar las enzimas de PDC bacterianas para que reflejen en forma más cercana el citosol neutral de huéspedes recombinantes utilizados previamente para la producción de etanol a alto nivel (por ejemplo, E. coli, Erwinia spp) . Estos modestos cambios de pH tuvieron solamente un efecto leve sobre la velocidad máxima de reacción para los cuatro polipéptidos de PDC bacterianos. En contraste, el pH influenció significativamente la actividad de PDCs gram negativas para piruvato. Más notablemente, se observo un incremento de 13 veces en Km cuando ApaPDC fue cambiado de su pH óptimo a condiciones neutrales. Tabla 3. Parámetros cinéticos de enzimas PDC bacterianas recombinantes Parámetros ZpaPDC ApaPDC ZmoPDC SvePDC Tipo de N N N S características cinéticas pH óptimo 5.5-6.0 5.0-5.5 6.0 6.3-6.7 m (pH) 0.24 (6.0) 0.39(5.0) 0.43 (6.0) 5.7 (6.5) 0.71(7.0) 5.1(7.0) 0.9 (7.0) 4.0 (7.0) V, (pH) 130 (6.0) 97 (5.0) 100 (6.0) 45 (6.5) 140(7.0) 79(7.0) 78(7.0) 35(7.0) Abreviaturas: , características cinéticas normales de ichaelis-Menten S, características cinéticas sigmoidales, SvePDC fue purificada a partir de E. col! Rosetta(DE3) (pRARE, pJAM419) . Estos resultados indican que las tres PDCs gram negativas presentaron un residuo de aminoácido (unos residuos de aminoácidos) que permiten que la enzima se una más eficientemente al piruvato en forma protonada (a pH óptimo) que en forma desprotonada (pH neutral) . Sin embargo, el estado protonado de este residuo no influencia la velocidad global de decarboxilación. Debido a los cambios en Km para las PDCs gram negativas que se observaron entre valores de pH de 5 a 7, es posible que el residuo involucrado en la modulación de unión con substrato para las tres enzimas sea una histidina. El pKa para histidina libre es de 6.04; mientras que el p a para piruvato así como los demás residuos de aminoácidos ionizables (es decir, Asp, Glu, Lys, y Arg) no caen dentro de este rango de pH. La protonación de una o varias histidinas es importante para facilitar la unión con substrato mediante la formación de un par de iones con el grupo carboxilo de piruvato o bien haciendo que el sitio activo sea más accesible a substrato. Es también posible que diferentes residuos estén involucrados en la modulación de unión con substrato; sin embargo, su pK es modificada por un polipéptido. El efecto de pH sobre <cat/¾i en comparación con kcat para la enzima PDC de Z. mobilis fue determinada utilizando curvas de trituración con valores de pKa estimados en 6.23 a 6.45 para el residuo involucrado en la modulación de unión con substrato (Huang, C. Y., A. K. C ang, Pj . F. Nixon, y R. G. Duggleby. 2001. Site-directed mutagenesis of the ionizable groups in the active site of Zymomonas mobilis pyruvate decarboxylase: effect on activity and pH dependence [Mutagénesis dirigida por sitio de los grupos ionizables en el sitio activo de piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis: Efectos sobre la actividad y dependencia del pH] . Eur. J. Biochem. 268:3558-3565; Schenk, G., F. J. Leeper, R. England. P.F. Nixon, y R. G. Duggleby. 1997. The role of Hisll3 and Hisll4 in pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis [La función de Hisll3 y Hisll4 en piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis]. Eur. J. Biochem. 248:63-71) . La desprotonación de Hisll3 ha sido indicada como llevando a cambios de conformación que resultan en un bucle flexible (residuo 105 a 112) para cerrar el sitio activo durante catálisis (Schenk, G., F. J. Leeper, R. England. P.F. Nixon, y R. G. Duggleby. 1997. The role of Hisll3 and Hisll4 in pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis [La función de Hisll3 y Hisll4 en piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis] . Eur. J. Biochem. 248:63-71). Tanto Hisll3 como Hisll4 se conservan en todos los polipéptidos de PDC que han sido caracterizados. Asi, Hisll3 es un candidato lógico para los cambios dependientes del pH observados en Km para las tres PDCs gram-negativas . Sin embargo, cinco residuos cruciales con cadenas laterales ionizables que sobresalen el sitio activo de PDC de Z. mobilis (Asp27, Glu50, Hisll3, Hisll4 y Glu473) fueron modificados en residuos que no fueron -ionizables o presentaron valores de pKa alterados (Huang, C. Y., ?. K. Chang, Pj . F. Nixon, y R. G. Duggleby. 2001. Site-directed mutagenesis of the ionizable groups in the active site of Zymomonas mobilis pyruvate decarboxylase : effect on activity and pH dependence [ utagénesis dirigida por sitio de los grupos ionizables en el sitio activo de piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis: Efectos sobre la actividad y dependencia del pH] . Eur. J. Biochem. 268:3558-3565) . La dependencia de pH de Kcat/Km fue relativamente poco afectada por estas modificaciones, lo que indica que estos residuos, incluyendo Hisll3, no participan. Es importante observar, en este mismo estudio, que una modificación de Hisll3 en un residuo con valor pKa significativamente mayor (es decir Arg y Lys) incrementó la afinidad de ZmoPDC para piruvato en más de 20 veces. Estos resultados muestran que la forma cargada positivamente de Hisll3 mantiene abierto el sitio activo para unión con substrato.

EJEMPLO 9 ALINEACIÓN COMPARATIVA DE GENES PDC DE ORGANISMOS DIFERENTES En este ejemplo, una comparación de alineaciones de secuencias de aminoácidos de enzimas piruvato decarboxilasa (PDC) de diferentes organismos se efectúa y contrasta. El polipéptido de PDC deducido de Z. palmae contenia 556 aminoácidos (incluyendo la metionina N-terminal) con una masa molecular anhidra de 60,113 Da. Esto es similar a las tres otras PDCs bacterianas con un rango de 552 a 568 aminoácidos y 59,830 a 61,890 Da. La ZpaPDC representó un pl calculado de 4.93 lo que es análogo al pl determinado experimentalirtente (4.87 a 5.3) para la PDC de Z. mobilis (Bringer-Meyer, S., K.-L. Schimz, y H. Sahm. 1986. Pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis. Isolation and partial characterization [Piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis. Aislamiento y caracterización parcial] Aren. Microbiol 146:105-110; Neale, S. D., R. K. Scopes, R. E. Wettenhal, y N. J. Hoogenraad. 1987. Nucleotide sequence of the pyruvate decarboxylase gene from Zymomonas mobilis [Secuencia de nucleótidos del gen de piruvato decarboxilasa de Zymomonas mobilis] . Nucleic Acids Res. 15:1753-1761). El contenido relativamente alto de alanina de ZpaPDC (13.1%) fue comparable al contenido de alanina de PDCs de Z. mobilis y A. Pasteurianus gram-negativas (Zmo y ApaPDC) pero casi dos veces mayor que el contenido de alanina de la PDC de S. ventriculi gram-positiva (SvePDC) (6.9%). Una alineación de múltiples secuencias de aminoácidos (Figura 9) y análisis de grupo de dendrogramo reveló que ZpaPDC fue más estrechamente relacionada con ApaPDC (nivel de identidad del 72%) y altamente relacionada con ZmoPDC (nivel de identidad del 62%) . Las tres PDCs gram-negativas se agruparon en similaridad de secuencias con las PDCs de planta (por ejemplo, PDC de Zea mays; de 39 a 40% de identidad) . En contraste la SvePDC gram-positivo presentó una identidad de solamente de 30 a 31% con las PDCs gram-negativas y se agruparon al contrario, la mayoría de las PDCs de hongos filamentosos y levadura (por ejemplo, PDC1 de Saccharomyces cerevisiae; identidad del 38%) . La extensión N-terminal común a PDC del reino vegetal estuvo ausente de cuatro de las PDCs bacterianas. Residuos involucrados en unión de TPP y Mg2÷, con base en las estructuras de cristal de las PDC de Z. mobilis y levadura fueron conservados en las cuatro PDCs bacterianas, los residuos de la PDC1 de levadura (Tyrl57 y Arg224) están involucrados en activación de substrato, con base en unión con el análogo de piruvato piruvamida (Lu, G., D. Dobritzsch, S. Baumann, G. Schneider, y S. Konig. 2000. The structural basis of substrate activation in yeast pyruvate decarboxylase. A crystallographic and kinetic study [La base estructural de activación de substrato en piruvato decarboxilasa de levadura. Un estudio cristalográfico y cinético]. Eur. J. Biochem. 267:861-868), se observaron solamente en la SvePDC bacteriana y no se encontraron en las tres PDCs bacterianas restantes. La secuencia de aminoácidos de PDC A. pasteurianus deducida fue alineada con secuencias de PDC de Z. mobilis y levadura (PDC1), ambas analizadas por cristalografía de rayos X (Dyda y colaboradores, 1993, Arjunan y colaboradores, 1996; Lu y colaboradores, 2000; Dobritzsch y colaboradores, 1998), así como de Zea mays (Figura 9) . Las alineaciones múltiples revelaron que la PDC de A. pasteurianus es más similar a la PDC de Z. mobilis (identidad del 62% y similaridad del 74%) . La extensión N-terminal de la PDC de Z. mays común a otras PDC vegetales, no se encuentra en los polipéptidos de PDC fúngales o bacterianos, incluyendo de A. pasteurianus. Residuos de los cuales se demostró que estaban dentro de 0.4 nm de los sitios de unión de TPP y Mg2+ de la levadura y enzimas PDC de Z. mobilis fueron altamente conservados en la secuencia de polipéptidos de PDC de A. pasteurianus (V24, D27, E50, T72, V75, N82, H113, H114, T384, D386, G408, 1410, D435, S437, L440, 1460, N462, G464, 1467, E468) . Además, el motivo identificado en enzimas dependientes de TPP que fue propuesto por Hawkins y colaboradores (1989) como involucrado en la unión de Mg2÷ y TPP está también conservado en la secuencia de polipéptidos de PDC de A. Pasteurianus (G435 a N462) . Residuos de la PCD1 de levadura (Tyrl57 y R224' propuestos como involucrados en el control alostérico y de los cuales se demostró que se unían con el análogo de piruvato piruvamida (Lu y colaboradores, 2000), no se conservaron en los polipéptidos de PDC de A. pasteurianus, Z. mobilis, o Z. mays. Al contrario, estos residuos están restringidos a la mayoría de las PDCs fúngales y polipéptido de PDC relacionado de la bacteria gram-positiva S. ventriculi que es activada por substrato (Lowe y Zeikus, 1992) . Con base en las características cinéticas de la producción de C02 a partir de piruvato observadas para lisado celular de bacterias de ácido acético (King y Cheldelin, 1953), se llegó a la conclusión que el polipéptido de PDC de A. pasteurianus, de manera similar a la PDC de Z. mobilis no es activado por substrato. Sin embargo, las PDCs de plantas no contienen estos residuos conservados sino que son reguladas por substrato, indicando una cierta diferencia en cuanto al mecanismo de control alostérico entre polipéptidos de PDC. Con base en análisis de grupo de polipéptidos de PDC, la PDC de A. pasteurianus se relaciona en forma más estrecha con la PDC de Z. mobilis. Esto es consistente con la clasificación de estas dos bacterias como a-proteobacterias gram-negativas . En contraste con la PDC de S. ventriculi gram-positiva con bajo contenido de G+C, que comparte raíces evolucionarlas cercanas con la mayoría de las PDCs fúngales, los polipéptidos de PDC provenientes de a-proteobacterias se relacionan en forma más estrecha con las plantas y algunas PDCs fúngales fuera de grupo. Equivalentes Los expertos en la materia reconocerán o bien podrán determinar utilizando solamente experimentos de rutina muchos equivalentes de las modalidades especificas de la invención descrita aqui. Tales equivalentes se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes. Además, numerosos constructos genéticos, células huéspedes y métodos descritos en las patentes norteamericanas Nos. 5,821,093; 5,482,846; 5,424,202; 5,028,539; 5,000,000; 5,487,989, 5,554,520, y 5,162,516 pueden emplearse el efectuar la presente invención y se incorporan aqui por referencia.

LISTA DE SECUENCIAS <110> The üniversity of Florida et al. <120> CLONACIÓN Y SECUENCIAMIENTO DE GENES DE PIRUVATO DECARBOXILASA (PDC) A PARTIR DE BACTERIAS Y USOS DE LOS MISMOS <130> BCI-029CPPC <150> 60/288,638 <151> 2001-05-04 <150> 60/288,671 <151> 2001-05-04 <150> 60/288,698 <151> 2001-05-04 <150> 60/288,622 <151> 2001-05-04 <150> 60/288,699 <151> 2001-05-04 <160> 11 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 1671 <212> ADN <213> Zymobacter palmae <400> 1 atgtataccg ttggtatgta cttggcagaa cgcctagccc agatcggcct gaaacaccac 60 tttgccgtgg ccggtgacta caacctggtg ttgcttgatc agctcctgct gaacaaagac 120 atggagcagg tctactgctg taacgaactt aactgcggct ttagcgccga aggttacgct 130 cgtgcacgtg gtgccgccgc tgccatcgtc acgttcagcg taggtgctat ctctgcaatg 240 aacgccatcg gtggcgccta tgcagaaaac ctgccggtca tcctgatctc tggctcaccg 300 aacaccaatg actacggcac aggccacatc ctgcaccaca ccattggtac tactgactat 360 aactatcagc tggaaatggt aaaacacgtt acctgcgcac gtgaaagcat cgtttctgcc 420 gaagaagcac cggcaaaaat cgaccacgtc 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lie Leu His 100 105 110 His Thr lie Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Tyr Gln Leu Glu Met Val Lys 115 120 125 His Val Thr Cys Ala Arg Glu Ser lie Val Ser Ala Glu Glu Ala Pro 130 135 140 Ala Lys lie Asp His Val lie Arg Thr Ala Leu Arg Glu Arg Lys Pro 145 150 155 160 Ala Tyr Leu Glu lie Ala Cys Asn Val Ala Gly Ala Glu Cys Val Arg 165 ' 170 175 Pro Gly Pro lie Asn Ser Leu Leu Arg Glu Leu Glu Val Asp Gln Thr 180 185 190 Ser Val Thr Ala Ala Val Asp Ala Ala Val Glu Trp Leu Gln Asp Arg 195 200 205 Gln Asn Val Val Met Leu Val Gly Ser Lys Leu Arg Ala Ala Ala Ala 210 215 220 Glu Lys Gln Ala Val Ala Leu Ala Asp Arg Leu Gly Cys Ala Val Thr 225 230 235 240 lie Met Ala Ala Glu Lys Gly Phe Phe Pro Glu Asp His Pro Asn Phe 245 250 255 Arg Gly Leu Tyr Trp Gly Glu Val Ser Ser Glu Gly Ala Gln Glu Leu ' 260 265 270 Val Glu Asn Ala Asp Ala lie Leu Cys Leu Ala Pro Val Phe Asn Asp 275 280 285 Tyr Ala Thr Val Gly Trp Asn Ser Trp Pro Lys Gly Asp Asn Val Met 290 295 300 Val Met Asp Thr Asp Arg Val Thr Phe Ala Gly Gln Ser 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ccaccccgaa ggaactgaca gaagccatcg ccagggcaaa agccaatacc 1560 cgcggcccga cgctgatcga atgccagatc gaccgcacgg actgcacgga tatgctggtt 1620 caatggggcc gcaaggttgc ctcaaccaac gcgcgcaaga ccactctggc ctga 1674 <210> 4 <211> 557 <212> PRT <213> Acetobacter pasteurianus <400> 4 et Thr Tyr T r Val Gly Met Tyr Leu Ala Glu Arg Leu Val Gln lie 1 5 10 15 Gly Leu Lys His His Phe Ala Val Gly Gly Asp Tyr Asn Leu Val Leu 20 25 30 Leu Asp Gln Leu Leu Leu Asn Lys Asp Met Lys Gln lie Tyr Cys Cys 35 40 45 Asn Glu Leu Asn Cys Gly Phe Ser Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser n 50 55 60 Gly Ala Ala Ala Ala Val Val Thr Phe Ser Val Gly Ala lie Ser Ala 65 70 75 80 Met Asn Ala Leu Gly Gly Ala Tyr Ala Glu Asn Leu Pro Val lie Leu 85 90 95 lie Ser Gly Ala Pro Asn Ser Asn Asp Gln Gly Thr Gly His lie Leu 100 105 110 His His Thr lie Gly Lys Thr Asp Tyr Ser Tyr Gln Leu Glu Met Ala 115 120 125 Arg Gln Val Thr Cys Ala Ala Glu Ser lie Thr Asp Ala His Ser Ala 130 135 140 Pro Ala Lys lie Asp His Val lie Arg Thr Ala Leu Arg Glu Arg Lys 145 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caagaagcaa gtctatttag ttctcaaaat aactactaa 1659 <210> 6 <211> 552 <212> PRT <213> Sarcina ventriculi <400> 6 Met Lys lie Thr lie Ala Glu Tyr Leu Leu Lys Arg Leu Lys Glu Val 1 5 10 15 Asn Val Glu His Met Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu Gly Phe 20 25 30 Leu Asp Tyr Val Glu Asp Ser Lys Asp lie Glu Trp Val Gly Ser Cys 35 40 45 Asn Glu Leu Asn Ala Gly Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Leu Arg 50 55 60 Gly Phe Gly Val lie Leu Thr Thr Tyr Gly Val Gly Ser Leu Ser Ala 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Thr Gly Ser Phe Ala Glu Asn Val Pro Val Leu His 85 90 95 lie Ser Gly Val Pro Ser Ala Leu Val Gln Gln Asn Arg Lys Leu Val 100 105 110 His His Ser Thr Ala Arg Gly Glu Phe Asp Thr Phe Glu Arg Met Phe 115 120 125 Arg Glu lie Thr Glu Phe Gln Ser lie lie Ser Glu Tyr Asn Ala Ala 130 135 140 Glu Glu lie Asp Arg Val lie Glu Ser lie Tyr Lys Tyr Gln Leu Pro 145 150 155 160 Gly Tyr lie Glu Leu Pro Val Asp lie Val Ser Lys Glu lie Glu lie 165 170 175 Asp Glu Met Lys Pro Leu Asn Leu Thr Met Arg Ser Asn Glu Lys Thr 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gaaaaccggt 1020 gctttggact tcttcaaatc cctcaatgca ggtgaactga agaaagccgc tccggctgat 1080 ccgagtgctc cgttggtcaa cgcagaaatc gcccgtcagg tcgaagctct tctgaccccg 1140 aacacgacgg ttattgctga aaccggtgac tcttggttca atgctcagcg catgaagctc 1200 ccgaacggtg ctcgcgttga atatgaaatg cagtggggtc acatcggttg gtccgttcct 1260 gccgccttcg gttatgccgt cggtgctccg gaacgtcgca acatcctcat ggttggtgat 1320 ggttccttcc agctgacggc tcaggaagtc gctcagatgg ttcgcctgaa actgccggtt 1380 atcatcttct tgatcaataa ctatggttac accatcgaag ttatgatcca tgatggtccg 1440 tacaacaaca tcaagaactg ggattatgcc ggtctgatgg aagtgttcaa cggtaacggt 1500 ggttatgaca gcggtgctgg taaaggcctg aaggctaaaa ccggtggcga actggcagaa 1560 gctatcaagg ttgctctggc aaacaccgac ggcccaaccc tgatcgaatg cttcatcggt 1620 cgtgaagact gcactgaaga attggtcaaa tggggtaagc gcgttgctgc cgccaacagc 1680 cgtaagcctg ttaacaagct cctctag 1707 <210> 8 <211> 568 · <212> PRT <213> Zymomonas mobilis <400> 8 Met Ser Tyr Thr Val Gly Thr Tyr Leu Ala Glu Arg Leu Val Glu lie 1 5 10 15 Gly Leu Lys His His Phe Ala Val 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Leu Asp Tyr 65 70 75 80 Leu lie Ala Glu Pro Gly Leu Thr Leu Val Gly Cys Cys Asn Glu Leu 85 90 95 Asn Ala Gly Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ser Arg Gly Val Gly 100 105 110 Ala Cys Ala Val Thr Phe Thr Val Gly Gly Leu Ser Val Leu Asn Ala 115 · 120 L25 lie Ala Gly Ala Tyr Ser Glu Asn Leu Pro Val Val Cys lie Val Gly 130 135 140 Gly Pro Asn Ser Asn Asp Tyr Gly Thr Asn Arg lie Leu His His Thr 145 150 155 160 lie Gly Leu Pro Asp Pñe Ser Gln Glu Leu Arg Cys Phe Gln Thr lie 165 170 175 Thr Cys Tyr Gln Ala lie lie Asn Asn Leu Asp Asp Ala His Glu Gln 180 185 190 lie Asp Thr Ala lie Ala Thr Ala Leu Arg Glu Ser Lys Pro Val Tyr 195 200 205 lie Ser Val Ser Cys Asn Leu Ala Gly Leu Ser His Pro Thr Phe Ser 210 215 220 Arg Asp Pro Val Pro Met Phe lie Ser Pro Arg Leu Ser Asn Lys Ala 225 230 235 240 Asn Leu Glu Tyr Ala Val Glu Ala Ala Ala Asp Phe Leu Asn Lys Ala 245 250 255 Val Lys Pro Val Met Val Gly Gly Pro Lys lie Arg Val Ala Lys Ala 260 265 270 Arg Glu Ala Phe Ala Ala Val Ala Asp Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Ala 275 280 285 Val Met Pro Ala Ala Lys Gly Leu Val Pro Glu His His Pro Arg Phe 290 295 300 lie Gly Thr Tyr Trp Gly Ala Val Ser Thr Thr Phe Cys Ala Glu lie 305 310 315 320 Val Glu Ser Ala Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Gly Pro lie Phe Asn Asp 325 330 335 Tyr Ser Ser Val Gly Tyr Ser Leu Leu Leu Lys Arg Glu Lys Ala Val 340 345 350 lie Val Gln Ero Asp Arg Met Val Val Gly Asp Gly Pro Ala Phe Gly 355 360 365 Cys lie Leu Met Pro Glu Phe Leu Arg Ala Leu Ala Lys Arg Leu Arg 370 375 380 Arg Asn Thr Thr Ala Tyr Asp Asn Tyr Arg Arg lie Phe Val Pro Asp 385 390 395 400 Arg Glu Pro Pro Asn Gly Lys Pro Asn Glu Pro Leu Arg Val Asn Val 405 410 415 Leu Phe Lys His lie Lys Gly Met Leu Ser Gly Asp Ser Ala Val Val 420 425 430 Ala Glu Thr Gly Asp Ser Trp Phe Asn Cys Gln Lys Leu Arg Leu Pro 435 440 445 Glu Gly Cys Gly Tyr Glu Phe Gln Met Gln Tyr Gly Ser lie Gly Trp 450 455 460 Ser Val Gly Ala Thr Leu Gly Tyr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Lys Arg 465 470 475 480 · Val lie Ala Cys lie Gly Asp Gly Ser Phe Gln Val Thr Ala Gln Asp 485 490 495 Val Ser Thr Met Leu Arg Cys Gly Gln Lys Ser lie lie Phe Leu lie 500 505 510 Asn Asn Gly Gly Tyr Thr lie Glu Val Glu lie His Asp Gly Pro Tyr 515 520 525 Asn Val lie Lys Asn Trp Asp Tyr Thr Gly Leu Val Asn Ala lie His 530 535 540 Asn Ser Glu Gly- Asn Cys Trp Thr Met Lys Val Arg Thr Glu Glu Gln 545 '550 555 560 Leu Lys Glu Ala lie Ala Thr Val Thr Gly Ala Lys Lys Asp Cys Leu 565 570 575 Cys Phe lie Glu Val lie Val His Lys Asp Asp Thr Ser Lys Glu Leu 580 585 590 Leu Glu Trp Gly Ser Arg Val Ser Ala Ala Asn Ser Arg Pro Pro Asn 595 600 605 Pro Gln 610 <210> 10 <211> 563 <212> PRT <213> Saccromyces cerevisae <400> 10 Met Ser Glu lie Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln 1 5 10 15 Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Asp Lys lie Tyr Glu Val Glu Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn 35 40 45 Ala Asn Glu Leu Asn Ala Arg Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg lie 50 55 60 Lys Gly Met Ser Cys lie lie Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser 65 70 75 80 Ala Leu Asn Gly lie Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu 85 " 90 95 His Val Val Gly Val Pro Ser lie Ser Ser Gln Ala Lys Gln Leu Leu 100 105 110 Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met 115 120 125 Ser Ala Asn lie Ser Glu Thr Thr Ala Met lie Thr Asp lie Cys Thr 130 135 140 Ala Pro Ala Glu lie Asp Arg Cys lie Arg Thr Thr Tyr Val Thr Gln 145 150 155 160 Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Asn Val 165 170 175 Pro Ala Lys Leu Leu Gln Thr Pro lie Asp Met Ser Leu Lys Pro Asn 180 185 190 Asp Ala Glu Ser Glu Lys Glu Val lie Asp Thr lie Leu Val Leu Ala 195 200 205 Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val lie Leu Ala Asp Ala Cys Cys Ser Arg . 210 215 220 His Asp Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu lie Asp Leu Thr Gln Phe 225 230 235 240 Pro Ala Phe Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ser lie Ser Glu Gln His 245 250 255 Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Pro Glu Val 260 265 270 Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu lie Leu Ser Val Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys 290 295 ' 300 Asn lie Val Glu Phe His Ser Asp His Met Lys lie Arg Asn Ala Thr 305 310 315 320 Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Val Leu Gln Lys Leu Leu Thr Asn 325 330 335 lie Ala Asp Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Pro Val Ala Val Pro Ala Arg 340 345 350 Thr Pro Ala Asn Ala Ala Val Pro Ala Ser Thr Pro Leu Lys Gln Glu 355 360 365 Trp Met Trp Asn Gln Leu Gly Asn Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val Val 370 375 380 lie Ala Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly lie Asn Gln Thr Thr Phe 385 390 395 400 Pro Asn Asn Thr Tyr Gly lie Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser lie Gly 405 410 415 Phe Thr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Ala Glu Glu lie 420 425 430 Asp Pro Lys Lys Arg Val lie Leu Phe lie Gly Asp Gly Ser Leu Gln 435 440 445 Leu Thr Val Gln Glu lie Ser Thr Met lie Arg Trp Gly Leu Lys Pro 450 · 455 460 Tyr Leu Phe Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr lie Glu Lys Leu lie 465 470 475 480 His Gly Pro Lys Ala Gln Tyr Asn Glu lie Gln Gly Trp Asp His Leu 485 490 495 Ser Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Glu Thr His Arg Val 500 505 510 Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asp Lys Leu Thr Gln Asp Lys Ser Phe Asn 515 520 525 Asp Asn Ser Lys lie Arg Met lie Glu Val Met Leu Pro Val Phe Asp 530 535 540 Ala Pro Gln Asn Leu Val Glu Gln Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Asn 545 550 555 . 560 Ala Lys Gln <210> 11 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador <221> misc_feature <222> 3, 6, 18 <223> r= a ó g <221> misc_feature <222> 12, 21, 27 <223> y= c ó t <221> misc_feature <222> 9, 15, 30

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada dentro del grupo que consiste de: a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene un nivel de homología de por lo menos 60% con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5, o un complemento de la misma; b) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de por lo menos 000 nucleótidos de un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 5, o un complemento de la misma; c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta un nivel de homología de por lo menos aproximadamente el 50% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6; d) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6; en donde el fragmento comprende por lo menos 15 residuos de aminoácidos contiguos de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6; y e) una molécula de ácido nucleico que codifica una variante alélica que ocurre naturalmente de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6; en donde la molécula de ácido nucleico se híbrida con un complemento de una molécula de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5? bajo condiciones estrictas. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 1, que se selecciona dentro del grupo que consiste de: a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, o un complemento de la misma; Y b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, que comprende además secuencias de ácido nucleico de vector. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, unida en forma operativa a un promotor sustituto. 5. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, que comprende además, secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido heterólogo. 6. Una célula huésped que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1. 7. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 6, en donde la célula huésped se selecciona dentro del grupo que consiste de una célula bacteriana gram negativa y una célula bacteriana gram positiva. 8. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 6, en donde la célula bacteriana gram negativa se selecciona dentro del grupo que consiste de Gluconobacter, Rhizobium, Bradyrhizobium, Alcaligenes, Rhodobacter, Rhodococcus, Azospirillum, Rhodospirillum, Sphingomonas, Burkholderia, Desulfomonas, Geospirillum, Succinomonas, Aeromonas, Shewanella, Halochromatium, Citrobacter, Escherichia, Klebsiella, Zymomonas, Zymobacter, y Acetobacter. 9. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 6, en donde la célula bacteriana gram positiva se selecciona dentro del - grupo que consiste de Fibrobacter, Acidobacter, Bacteroidesr Sphingobacterium, Actinomyces, Corynebacterium, Nocardia , Rhodococcusr Propionibacterium, Bifidobacterium, Bacillusr Geobacillus, Paenibac llusr SulfobacilluSr Clostridium, Anaerobacterr Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Enterococcus, Lactococcus, Thermobifida, Cellulomonas, y Sarcina. Un polipéptido aislado seleccionado dentro del grupo que consiste de: a) un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6, en donde el fragmento comprende por lo menos 15 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6; b) una variante alélica que ocurre naturalmente de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6, en donde el polipéptido es codificado por una molécula de ácido nucleico que se híbrida con un complemento de uña molécula de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5, bajo condiciones estrictas; c) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de por lo menos un 50% con un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5; y d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de por lo menos 30% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6. 11. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 10, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6. 12. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en donde el polipéptido tiene una actividad decarboxilasa mejorada. 13. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11, en donde el polipéptido tiene una estabilidad térmica mejorada. 14. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11, en donde el polipéptido tiene una afinidad mejorada para substrato. 15. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11, que comprende además secuencias heterólogas de aminoácidos. 16. Un anticuerpo que se une selectivamente a un polipéptido de la reivindicación 10 o 11. 17. Un método para la producción de un polipéptido seleccionado dentro del grupo que consiste de: a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6; b) un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6; en donde el fragmento comprende por lo menos 15 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6; c) una variante alélica que ocurre naturalmente de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6, en donde el polipéptido es codificado por una molécula >de ácido nucleico que se híbrida con un complemento de una molécula de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5, bajo condiciones jestrictas; y que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 6 bajo condiciones en las cuales se expresa la molécula de 'ácido nucleico. Un método para detectar la presencia de un polipéptido de la reivindicación 10 o 11, en una muestra, que comprende : a) poner en contacto la muestra con un compuesto que se une selectivamente al polipéptido; y b) determinar si el compuesto se une al polipéptido en la muestra con el objeto de detectar de esta forma la presencia de un polipéptido de la reivindicación 10 en la muestra. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde el compuesto que se une al polipéptido es un anticuerpo. 20. Un método para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra, con una sonda de ácido nucleico o cebador que se híbrida selectivamente con un complemento de la molécula de ácido nucleico; y b) determinar si la sonda de ácido nucleico o cebador se une a una molécula de ácido nucleico en la muestra con el objeto de detectar de esta forma la presencia de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 en la muestra. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde la muestra comprende moléculas de ARNm y está en contacto con una sonda de ácido nucleico. 22. ün kit que comprende un compuesto que se híbrida en forma selectiva con un complemento de una molécula de ácido' nucleico de la reivindicación e instrucciones para su uso. 23. Una célula huésped recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica piruvato decarboxilasa en donde la secuencia de ácido nucleico se selecciona para uso mejorado de codón en dicha célula huésped. 24. Una célula huésped recombinante que comprende una secuencia heterologa de ácido nucleico que codifica piruvato decarboxilasa seleccionada para mejorar la actividad decarboxilasa. 25. Una célula huésped recombinante que comprende una secuencia heterologa de ácido nucleico que codifica piruvato decarboxilasa seleccionada para una estabilidad térmica mejorada. 26. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 23, en donde la secuencia heterologa de ácido nucleico que piruvato decarboxilasa está unida operativamente a un promotor sustituto. 27. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 23, en donde la secuencia heterologa de ácido nucleico que codifica piruvato decarboxilasa se deriva de una célula bacteriana seleccionada dentro del grupo que consiste de Zymobacter palmae, Acetobacter pasteurianus, y Sarcina ventriculí . 28. La célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicación 23-26, en donde la secuencia heterologa de ácido nucleico se selecciona dentro del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, y SEQ ID NO: 5. 29.1a célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicación 6 y 23-26, en donde la célula huésped comprende además un ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado dentro del grupo que consiste de un alcohol deshidrogenasa, glucanasa, y secretasa. 30. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 29, en donde la célula huésped comprende además un ácido nucleico que codifica alcohol deshidrogenasa. 31.1a célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 y 23-26, en donde la célula huésped es etanologénica . 32. La célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 y 23-26, en .donde la célula huésped es adecuada para la fermentación de etanol a partir de un azúcar. 33. La célula huésped recom inante de cualquiera de las reivindicaciones 23-26, en donde dicha célula huésped es una célula bacteriana seleccionada dentro del grupo que consiste de célula bacteriana gram negativa y célula bacteriana gram positiva. 34. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 33, en donde la célula bacteriana gram negativa se selecciona dentro del grupo que consiste de Gluconobacter, Rhizoblum, Bradyrhizobiumr Alcaligenes, Rhodobacter, Rhodococcus, Azospirillum, Rhodospirillum, Sphingomonas, Burkholderia , Desulfomonas, Geospirillumr Succinomonas, Aeromonas, Shewanella, Halochromatlum, Citrobacter, Escherichia , Klebsiella, Zymomonas Zymobacter, y Acetobacter. 35. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 33, en donde la célula bacteria gram positiva se selecciona dentro del grupo - que consiste de Fibrobacter, Acidobacter, Bacteroides, SphLngobacterium, Actinomyces, Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Propionibacterium, Bifidobacterium, Bacillus, Geobacillus, Paenibacillus, Sulfobacillus, Clostridium, Anaerobacter, Eubacterium, Streptococcus, actobacillus, Leuconostoc, Enterococcus, Lactococcus, Thermobifida, Cellulomonas, y Sarcina. 36. Una célula huésped etanologénica recombinante que comprende un ácido nucleico heterologo que codifica una PDC que se selecciona dentro del grupo que consiste de SEQ ID NC: 2, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 6, en donde el ácido nucleico se encuentra bajo el control transcripcional de un promotor sustituto exógeno. 37. Un método para la producción de acetaldehido, que comprende el cultivo de la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 6 y 23-26, en condiciones en las cuales piruvato decarboxilasa se expresa en niveles suficientes de tal manera que se produzca acetaldehido a partir de piruvato. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, en donde la célula huésped comprende además un gen etanologénico seleccionado dentro del grupo que consiste de alcohol deshidrogensa, secretasa, y glucanasa . 39. Un método para la producción de acetaldehido, que comprende la puesta en contacto de un lisado celular obtenido a partir de la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 6 y 23-26, en condiciones en las cuales se produce acetaldehido a partir de piruvato. · 40. Un método para la producción de etanol que comprende el cultivo de la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 6 y 23-26, en condiciones en las cuales piruvato decarboxilasa y alcohol deshidrogenasa se expresan en niveles suficientes de tal manera que se produzca etanol como producto primario de fermentación. 41. E método de conformidad con la reivindicación 38, en donde dicho método se lleva a cabo en la solución acuosa. 42. El método de conformidad con la reivindicación 4C, en donde dicho método se lleva a cabo en una solución acuosa . 43. Un extracto de enzima que comprende niveles detectables de piruvato decarboxilasa derivado de la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 6 y 23-26. 44. El extracto de enzima de la reivindicación 37, en donde la piruvato decarboxilasa tiene una actividad decarboxilasa mejorada. 45. El extracto de enzima de la reivindicación 40, en donde la piruvato decarboxilasa tiene una actividad decarboxilasa mejorada. 46. El extracto de enzima de conformidad con la reivindicación 43, en donde la piruvato decarboxilasa tiene una estabilidad térmica mejorada. 47. El extracto de enzima de conformidad con la reivindicación 43, en donde la piruvato decarboxilasa tiene una afinidad mejorada par el substrato. 48. Un método para seleccionar una enzima piruvato decarboxilasa con actividad decarboxilasa mejorada, que comprende, comparar la secuencia de aminoácidos de una piruvato decarboxilasa con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6; y alterar por lo menos un residuo de aminoácido de dicha piruvato decarboxilasa para que tenga identidad con al residuo de aminoácido correspondiente de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, de tal manera que se logre una actividad piruvato decarboxilasa mejorada. 49. El método de conformidad con la reivindicación 48, en donde la actividad piruvato decarboxilasa comprende una afinidad mejorada de piruvato decarboxilasa para piruvato . 50. El método de conformidad con la reivindicación 48, en donde la actividad piruvato decarboxilasa comprende una mejor estabilidad térmica. 51. ün método para seleccionar una enzima piruvato decarboxilasa con expresión mejorada en una célula huésped receptora, que comprende: comparar la secuencia de ácido nucleico que codifica una piruvato decarboxilasa con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5; y alterar por lo menos un codón de dicho ácido nucleico que codifica dicha enzima piruvato decarboxilasa para que tenga identidad con el codón correspondiente de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5, de tal manera que se logre en dicha células huésped una expresión mejorada de dicho ácido nucleico alterado que codifica la enzima piruvato decarboxilasa. 52. Un método para seleccionar una enzima piruvato decarboxilasa con expresión mejorada en una célula huésped receptora, que comprende: comparar la secuencia de ácido nucleico que codifica una piruvato decarboxilasa con el uso de codón de dicha célula huésped receptora; y alterar por lo menos un codón de dicho ácido nucleico que codifica dicha enzima piruvato decarboxilasa para que corresponda al uso de codón de dicha células huésped receptora de tal manera que se logre en dicha célula huésped una expresión mejorada de dicho ácido nucleico alterado que codifica la enzima piruvato decarboxilasa . 3. Un método para seleccionar una enzima piruvato decarboxilasa con expresión mejorada en la células huésped receptora, que comprende: comparar la secuencia de ácido nucleico que codifica una piruvato decarboxilasa con el uso de codón de dicha células huésped receptora; y alterar dicha célula huésped receptora para producir en forma recombinante un ARNt que corresponde a un codón de dicho ácido nucleico que codifica dicha enzima piruvato decarboxilasa de tal manera que se logre en dicha célula huésped alterada una expresión mejorada de dicho ácido nucleico que codifica la enzima piruvato decarboxilasa . 4. El plásmido pJA 3440 que codifica un gen pdc derivado de Zymobacter palmae representado por un depósito ante la American Type Culture Collection designado como número de depósito ATCC PTA-4254. El plásmido pJAM304 que codifica un gen pdc derivado de Acetobacter pasteurianus representado por un depósito ante la American Type Culture Collection designado como número de depósito ATCC PTA-4252. El plásmido pJAM419 que codifica un gen pdc derivado de Sarcina ventriculi representado por un depósito ante la American Type Culture Collection designado como número de depósito ATCC PTA-4253.