CN112063638B

CN112063638B - 一种从秋茄中克隆扩增出来的丙酮酸脱羧酶基因及其应用

Info

Publication number: CN112063638B
Application number: CN202010675629.1A
Authority: CN
Inventors: 尚琛晶; 邓建文; 周乔; 王友绍; 郝凌云
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2020-07-14
Filing date: 2020-07-14
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2040-07-14
Also published as: CN112063638A

Abstract

本发明公开一种从秋茄中克隆扩增出来的丙酮酸脱羧酶基因及其应用，其中，所述丙酮酸脱羧酶基因全长为2040bp，其核苷酸序列为SEQ NO.1。本发明从秋茄中克隆扩增出来了丙酮酸脱羧酶基因，并且探索了秋茄在水淹胁迫下丙酮酸脱羧酶基因的表达量变化，这为研究植物非生物胁迫响应打下基础，从而为通过提高秋茄的水淹胁迫耐受性，进而提高农作物或其他红树植物的非生物胁迫抗性并最终实现农作物产量的提高或为红树林的保护提供基因来源与技术支持。

Description

一种从秋茄中克隆扩增出来的丙酮酸脱羧酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种从秋茄中克隆扩增出来的丙酮酸脱羧酶基因及其应用。

背景技术

秋茄是红树种的重要树种之一，为秋茄科秋茄属桃金娘目的双子叶植物。秋茄树广泛分布于印度、缅甸、泰国、越南和中国，秋茄树在潮间带的分布主要在中潮位，耐盐的同时耐水淹胁迫能力也较强。红树植物在潮间带生态系统中起着重要的作用，可以作为生产者给生态系统提供大量的初级生产力，也具有防洪防涝、固定水土、净化水体和保护生态多样性等生态修复的作用。近年来，随着大气中温室气体浓度的逐渐上升，造成的温室效应不断增强，冰川融化以及大气压力在海平面上的变化都导致海平面正在稳步上升。根据联合国报告显示，到21世纪末期，大约有13％的红树林都会被海水淹没，部分岛屿上的红树林被淹没的部分甚至超过50％。在自然情况下，潮间带的植物会根据其耐涝能力的不同而分布在潮间带不同的位置，大多数时间海水会将潮间带植物淹没，但是植物在长期进化过程中也产生了一系列适应机制，如植物的无氧呼吸。

丙酮酸脱羧酶(PDC)是一种胞内酶，广泛存在于动植物和微生物的生物体内，PDC的结构和分子量会根据来源的不同而不同。但是不同来源的PDC的相对分子质量都约为60kD，一般PDC由多个亚基组成，每个亚基都含有镁离子结合位点和TPP结合位点。但对于PDC的三维结构而言，目前人们研究的最多的物种还是运动发酵单胞菌和酿酒酵母。

PDC与环境胁迫也具有很大关系，植物处于缺氧环境时，会进行无氧呼吸来抵御缺氧环境，丙酮酸脱羧酶(PDC)是植物在进行无氧呼吸时所需的关键酶之一，在无氧呼吸的过程中，丙酮酸脱羧酶以硫胺素焦磷酸(TPP)和镁离子为辅助因子，将丙酮酸催化反应生成乙醛和二氧化碳。PDC是一种缺氧诱导的应激酶，在植物的不同生长时期和不同部位，PDC基因的表达量会有所不同，PDC的表达量还会受到外界环境的影响，如水淹。

因此本研究主要探究水淹胁迫下，红树植物秋茄的PDC的表达量变化以及秋茄PDC基因的全长克隆。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种从秋茄中克隆扩增出来的丙酮酸脱羧酶基因及其应用，旨在利用Race技术克隆、扩增并获得秋茄丙酮酸脱羧酶基因全长，并进行生物信息分析以及其应用研究。

本发明的技术方案如下：

一种从秋茄中克隆扩增出来的丙酮酸脱羧酶基因，其中，所述丙酮酸脱羧酶基因全长为2040bp，其核苷酸序列为SEQ NO.1。

所述的丙酮酸脱羧酶基因，其中，用于克隆所述丙酮酸脱羧酶基因的引物序列包括第一轮PCR引物以及巢式PCR引物，所述第一轮PCR引物的核苷酸序列为SEQ NO.2和SEQNO.3，所述巢式PCR引物的核苷酸序列为SEQ NO.4和SEQ NO.5。

所述的丙酮酸脱酸酶基因，其中，所述丙酮酸脱羧酶基因编码的蛋白包括586个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ NO.6。

一种检测所述丙酮酸脱酸酶基因表达含量变化的方法，其特征在于，包括步骤：

将秋茄进行缺氧处理预定时间后，提取秋茄的总RNA；

利用反转录试剂盒将所述总RNA反转录成cDNA；

利用序列为SEQ NO.6-SEQ NO.610的引物对所述cDNA进行定量PCR检测。

所述检测丙酮酸脱羧酶基因表达含量变化的方法，其中，所述缺氧处理为水淹处理。

一种从秋茄中克隆扩增出来的丙酮酸脱羧酶基因的应用，其中，将所述丙酮酸脱羧酶基因用于植物品种改良。

有益效果：本发明从秋茄中克隆扩增出来了丙酮酸脱羧酶基因，并且探索了秋茄在水淹胁迫下丙酮酸脱羧酶基因的表达量变化，这为研究植物非生物胁迫响应打下基础，从而为通过提高秋茄的水淹胁迫耐受性，进而提高农作物或其他红树植物的非生物胁迫抗性并最终实现农作物产量的提高或为红树林的保护提供基因来源与技术支持。

附图说明

图1为本发明KoPDC蛋白的结构图。

图2为本发明KoPDC蛋白中Mg²⁺结合位点结构示意图。

图3为本发明KoPDC蛋白的一种疏水表面图。

图4为本发明KoPDC蛋白的另一种疏水表面图。

图5为本发明一种检测所述丙酮酸脱酸酶基因表达含量变化的方法较佳实施例流程图。

图6为本发明KoPDC基因在中长期水淹胁迫下表达模式分析结果图。

具体实施方式

本发明提供一种从秋茄中克隆扩增出来的丙酮酸脱羧酶基因及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明从秋茄中克隆出了丙酮酸脱羧酶基因，命名为KoPDC，其为具有特定序列的DNA分子，所述丙酮酸脱羧酶基因全长为2040bp，其核苷酸序列为SEQ NO.1。

本发明还提供了一种用于克隆所述丙酮酸脱羧酶基因的引物序列，其包括第一轮PCR引物以及巢式PCR引物，所述第一轮PCR引物的核苷酸序列为SEQ NO.2和SEQ NO.3，所述巢式PCR引物的核苷酸序列为SEQ NO.4和SEQ NO.5。该引物根据基因KoPDC设计，使用此引物对秋茄样品基因组DNA进行PCR扩增可获得长2040bp的基因片段。

进一步地，本发明对KoPDC进行了系统发育分析，以果蝇和运动发酵单胞菌PDC基因为外部分支，部分单子叶和双子叶植物PDC基因的氨基酸序列构建系统进化树图，进化树整体上呈现如下结果：首先以果蝇和运动发酵单胞菌PDC基因氨基酸序列作为其他植物PDC及原因的外部分支单独列成一类，其他植物PDC基因氨基酸序列聚集成一大类；其次，水稻和玉米等单子叶植物(Monocotyledons)聚为一类，其余的双子叶植物纲(Dicotyledoneae)的植物根据其亲缘关系远近各自聚类.秋茄PDC基因与与麻风树(Jatropha curcas)、橡胶树(Hevea brasiliensis)、胡桃(Juglans regia)等聚集成一小类。

在一些实施方式中，本发明还提供了所述从秋茄中克隆出的丙酮酸脱羧酶基因编码的蛋白，命名为KoPDC蛋白，其包括586个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ NO.6。

具体来讲，本发明还对所述KoPDC蛋白进行了二级结构预测分析，结果如图1所示，分析发现KoPDC蛋白包含36.35％的α螺旋(Alpha-helix)，17.24％的β折叠(Beta-sheet/Extended strand)，5.46％的β转角(Beta-turn)和40.96％的无规则卷曲(Random coil)。PSIpred分析显示KoPDC蛋白中含有24个螺旋和17个折叠。信号肽序列分析表明KoPDC不包含信号肽。跨膜结构分析表明，KoPDC中可能存在1个跨膜螺旋区域，氨基酸位置为第A443-S451位。此外，亚细胞定位预测表明KoPDC是一个胞质蛋白(Cytoplasmic Protein)。本实施例还对所述KoPDC蛋白进行了功能位点预测，发现所述KoPDC蛋白包含了Mg²⁺结合位点，蛋白激酶C磷酸化位点(Protein kinase C phosphorylation site，氨基酸位置为T129-R131，T225-K227，S268-K270，S382-K384，S451-K453，T528-K530，T564-K566)，酪氨酸激酶磷酸化位点1(Tyrosine kinase phosphorylation site 1，氨基酸位置为L422-Y429)，酪蛋白激酶II磷酸化位点(Casein kinase II phosphorylation site，氨基酸位置为T52-D55，T364-E367，S382-D385，S451-D454，T469-D472，T533-E536，T564-E567)和多个N-豆蔻酰化位点(N-myristoylation site，氨基酸位置为G8-S13，G86-V91，G120-N125，G217-V222，G282-A287，G286-S291，G338-F343，G402-V407，G443-Y448，G514-I519，G572-S577)；InterPro分析结果发现，KoPDC还包含了DHS样NAD/FAD结合位点(DHS-like NAD/FAD-binding domain，氨基酸位置为K211-T364)和硫胺素二磷酸结合折叠(Thiamindiphosphate-binding fold(THDP-binding)，氨基酸位置为T25-P203，P387-R581)。

图2为KoPDC蛋白中Mg²⁺结合位点，图3及图4均为KoPDC蛋白疏水表面图。

进一步地，本发明还对KoPDC蛋白进行了三维结构预测分析，用SWISS-MODEL构建KoPDC蛋白的三维模拟结构图，模板为酿酒酵母丙酮脱羧酶变体E477Q与替代丙酮酸复合物的晶体结构(Crystal structure of the Saccharomyces cerevisiae pyruvatedecarboxylase variant E477Q in complex with the surrogate pyruvamide)，PDB ID:2w93.1。GMQE分值0.69，identity为34.12％。根据预测结果显示，该蛋白为同源二聚体结构，在A，B两条链中存在由三个氨基酸残基(D463.N490.G492)构成的Mg²⁺配体结合位点，ThDP辅因子可以通过镁离子与蛋白质结合，从而激活KoPDC的催化活性，预测含有19个氨基酸残基构成的TPP结合位点，另外，从表面属性分析显示KoPDC蛋白是一个亲水性蛋白，初步预测该蛋白位于细胞的细胞质中。

在一些实施方式中，还提供一种检测所述丙酮酸脱酸酶基因表达含量变化的方法，如图5所示，其包括步骤：

S10、将秋茄进行缺氧处理预定时间后，提取秋茄的总RNA；

S20、利用反转录试剂盒将所述总RNA反转录成cDNA；

S30、利用序列为SEQ NO.6-SEQ NO.610的引物对所述cDNA进行定量PCR检测。

在本实施例中，所述缺氧处理为水淹处理，但不限于此。本实施例探索了秋茄在水淹胁迫下KoPDC基因的表达量变化，这为研究植物非生物胁迫响应打下基础，从而为通过提高秋茄的水淹胁迫耐受性，进而提高农作物或其他红树植物的非生物胁迫抗性并最终实现农作物产量的提高或红树林的保护提供基因来源与技术支持。

进一步的，还提供检测秋茄基因KoPDC mRNA表达模式的方法，其利用SEQ ID NO.1所示KoPDC基因的核苷酸序列作为设计探针引物的保守区段，调取引物序列为表6的引物，对秋茄cDNA样品进行Rt-PCR，然后检测该基因在植物根的表达，样品秋茄的RNA经过逆转录后所得cDNA。

在一些实施方式中，还提供一种从秋茄中克隆扩增出来的丙酮酸脱羧酶基因的应用，将所述丙酮酸脱羧酶基因用于植物品种改良。

下面通过具体实施例研究秋茄在水淹胁迫下KoPDC基因的表达量变化，为研究植物非生物胁迫响应打下基础：

1、材料处理和取样

选取正常生长且长势相似的秋茄幼苗作为实验材料，对照组为非水淹处理的秋茄幼苗，处理组：永久性水淹胁迫下处理的秋茄幼苗，分别在处理3天、7天、15天、30天后取秋茄的根部组织样品。立即液氮冻存，样品保存在-80℃冰箱。一共有三个生物学重复，每个生物学重复为5棵植物的根部组织混合样品。

2、总RNA提取

RNA提取采用TIANGEN RNAplant Plus试剂，采用TIANGEN RNAplant Plus试剂可从植物组织，特别是富含多酚或淀粉的植物组织中提取总RNA，其操作方便、快捷，没100ml的TIANGEN RNAplant Plus试剂可处理100mg组织200次，其操作步骤可参考TIANGENRNAplant Plus试剂说明书。

3、RNA检测

1)、紫外分光检测

使用NanoDrop Lite Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific，USA)，设置参数(RNA)，用RNase-Free水调零，测定RNA样品浓度和纯度(OD260nm/OD280nm)。

2)、琼脂糖凝胶电泳检测

制备1％琼脂糖凝胶，将存放于-80℃的RNA样品和提前取出于37℃孵育2h的RNA样品一起上样，电泳结束后比较孵育前后的条带。

4、反转录反应

cDNA的合成采用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)试剂盒(TAKARA，Code No.RR047A)，操作方法如下：

1)、去除基因组DNA

在冰上配制反应预混液，分装到各管中，然后分别加入RNA样品。依次加入2μl的5×gDNA Eraser Buffer、1.0μl的gDNA Eraser，1μg的Total RNA和6.0μl的RNase FreedH₂O，充分混匀并短暂离心后，置于42℃孵育2min，取出后4℃暂存。

2)、反转录反应

在冰上配制预混液，分装到上述各管中，最终体系为10.0μl的上步反应液，1.0μl的PrimeScript RT Enzyme Mix I，1.0μl的RT Primer Mix，4.0μl的5×PrimeScriptBuffer 2(for Real Time)和4.0μl的RNase Free dH₂O。混匀后，将反应管置于

nexus中进行反转录反应，37℃孵育15min，85℃处理5s，取出的cDNA样品保存在-20℃。

本实施例研究潮间带高等植物在长期的水淹胁迫下PDC的表达量变化，对秋茄进行了长期的水淹胁迫，结果如图6所示，在本实验前期处理时间点与对照组无明显差异；在处理35天后，表达量显著升高(1.7倍，p<0.01)。因此推测，在水淹胁迫时，KoPDC参与的通路是作为水淹胁迫初期所采取的应急措施，在长期的水淹胁迫下KoPDC表达量的变化没有短期胁迫的变化那么明显，采取了其他的措施来应对缺氧环境。

5、秋茄丙酮酸脱羧酶(KoPDC)基因全长的克隆

将在水淹胁迫条件下处理15天的秋茄根部组织所提取的总RNA样品作为克隆基因全长材料，使用TIANGEN RNAprep pure Plant Kit植物总RNA试剂盒(天根生物，北京，Cat.No.DPDP405-02)提取试剂提取秋茄根部组织总RNA。使用SMARTer^TM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech，USA)试剂盒合成5’RACE和3’RACE第一链cDNA，具体操作步骤见试剂盒说明书。使用

RACE 5’/3’Kit(Clontech，No.634858)进行基因全长扩增。在RACE第一轮PCR的反应中，使用高保真酶Prime STAR Taq(TaKaRa公司)提高目的扩增片段的保真性。

5.1cDNA模板的制备

1)5’RACE和3’RACE的第一链cDNA的合成反应体系为的5X First-Strand Buffer，0.5μl的DTT(100mM)，1.0μl dNTPs(20mM)。

2)5’和3’RACE cDNA合成的接头混合物，如下表1所示：

表1接头混合物的制备

3)混匀后，离心5s，72℃孵育3min，42℃冷却2min，14，000g离心10s。

4)1μl的SMARTerⅡoligo加入5’RACE cDNA的接头混合物中。

5)分别配制用于5’和3’RACE cDNA合成的Master Mix，混匀，短暂离心。

6)将上述Master Mix全部加入到第(2)步(3’RACE cDNA)和第(4)步(5’RACEcDNA)中变性的RNA样品中，每个cDNA合成反应的终体积为10μl。

7)混匀，短暂离心。42℃空气浴孵育90min后，70℃加热10min。

8)用90μl Tricine-EDTA Buffer稀释第一链cDNA合成反应，存于-20℃备用。

5.2基因特异性引物设计

1)根据克隆得到的KoPDC中间片段，利用Primer Premier 5.0设计基因特异性引物，包括第一轮PCR引物(SEQ NO.2/SEQ NO.3)和巢式PCR(SEQ NO.4/SEQ NO.5)引物，引物序列见SEQ ID NO.3-6。SEQ NO.3和SEQ NO.5用于扩增KoPDC的cDNA片段5’端；SEQ NO.2和SEQ NO.4用于扩增cDNA片段的3’端。

2)按照15.5μl的PCR-Grade H₂O，25.0μl2×SeqAmp Buffer加上1.0μl的SeqAmpDNA Polymerase体系配制PCR反应预混液。

3)按照下表2配制PCR反应体系及阴性对照，温和混匀：

表2配制RACE-PCR体系

4)将微量离心管转移至

nexus(Eppendorf，Germany)，设置程序94℃30s，69℃30s，72℃3min一共25个循环。

5)按照表3配制巢式PCR体系，并重复步骤4：用95μl Tricine-EDTA Buffer稀释5μl第一轮PCR反应产物，作为巢式PCR模板。

表3配制巢式PCR体系

6)对巢式PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

6、QPCR方法

6.1逆转录合成cDNA

采用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，去除基因组DNA反应具体操作如下：加入2.0μl的5×gDNA EraserBuffer，1.0μl的gDNA Eraser和1.0μl的Total RNA，加入RNase Free H₂O至10μl，42℃孵育2分钟。

6.2反转录反应

如下表4所示配置反转录反应体系：

表4

37℃孵育15分钟，85℃5秒，cDNA保存放-20℃冰箱备用。

6.3实时荧光定量PCR

如下表5所示配置Realtime PCR反应体系：

表5

表6 qRT-PCR扩增所用引物列表

按以下程序进行：95℃，30sec；40x(95℃，5sec；60℃，40sec)。

综上所述，本发明从秋茄中克隆扩增出来了丙酮酸脱羧酶基因，并且探索了秋茄在水淹胁迫下丙酮酸脱羧酶基因的表达量变化，这为研究植物非生物胁迫响应打下基础，从而为通过提高秋茄的水淹胁迫耐受性，进而提高农作物或其他红树植物的非生物胁迫抗性并最终实现农作物产量的提高或为红树林的保护提供基因来源与技术支持。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 一种从秋茄中克隆扩增出来的丙酮酸脱羧酶基因及其应用

<160> 10

<210> 1

<211> 2040

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

ttttaccatc tgcccatagc ttttcatttc caataccagg aatcgaagcg gaaccggaag 60

cagcaccttt ggtttgctgg gaaaaaagaa aaagcagaag agagagagaa agagagagag 120

gccccactcc tcaagatcta taataagcgt gccacaaatc cttttaatca tgttgaatta 180

tcaaatatct tgatcatttg cttaaaaccc acttccaaaa agttgacatc ttttgcgttc 240

ggggagacct atccgttcag tttttccttg ttctgtgaga tggaagtagc caaccatcta 300

ggctcagcgg cttcgtctcc ggttccagtt ctcggtcacg cctcgagtgg cacgctgggt 360

cggcacttgg ctcggcggct ggtggagatc ggcgtcaggg atgtgttctc tgtgcctgga 420

gacttcaact tgaccttgtt ggaccatttg atagcagaac cagagctgaa cacgatcggc 480

tgctgcaacg agctcaacgc aggctacgcc gccgatgggt atgcacgagc caggggcgtg 540

ggggcctgtg tggtgacttt cactgttggc ggcctcagtg tgatcaacgc cattgctggt 600

gcttatagcg agaatcttcc tgtgatctgc atagttggtg ggcctaattc caatgactat 660

ggaactaata ggatcttgca tcacactatc gggttgcctg attttaccca ggagcttagg 720

tgctttcaga ctgtcacgtg catccaagca gtggtgaata acttggatga tgcacatgag 780

cagattgata cagctatttc tactgccttg aaggaaagca agccagctta tattagtata 840

agctgcaatt tgccaggaat tccccatcca actttcagta gggatcctgt gccattcttc 900

ctcgcaccta aggtaagcaa tcagttggga cttgaagcag ctgttgaagc aactgctaaa 960

tttttgaaca aggcagtgaa gcctgtcatt gtggggggac ctaagttaag agtaggaaag 1020

gcacataagg cattcatgga acttgcagat gccagtggat atccgctggc tgttatgccc 1080

tcaggaaaag ggctagtgcc agagcaccat ccacatttca taggaactta ttggggtgct 1140

gttagcacta gcttttgtgg agagatagta gagtctgctg atgcctacat ctttgttggt 1200

cctatcttga atgattacag ctctgttgga tattctttgc tgatcaagaa ggagaaatcc 1260

attgtagtgc agcctaatcg tgtgaccatt ggcaatggcc catcctttgg ctgggttttc 1320

atggttgaat ttttaagtgc attggccaag aaggtcaaga aaaacaacac agctctggag 1380

aattacagac gtatctatgt ccccccaggc aaacctctca agtctgagaa agatgagcct 1440

cttagggtca atgtactctt caagcacatt caggaaatgt taggtggaga cactgcagta 1500

attgctgaga ctggagactc ctggttcaac tgtcagaaac tgcgccttcc tgaaaattgt 1560

gggtacgagt ttcagatgca gtatggatct attggctggt cagttggtgc cactcttgga 1620

tatgctcagt ctgcaaaaga taagcgcgtt atagcttgca ttggcgatgg cagtttccag 1680

gtaacagctc aggacatttc aacaatgatg cgatgtgggc aaagaagcat catatttctc 1740

atcaacaatg gaggttatac aattgaagtt gagatccatg atggccccta caatgtgatc 1800

aagaactggg attacactgg tcttgttaat gccatccaca atggtgaagg caaatgctgg 1860

actgcaaagg tgcgcacgga ggaggaaatg atagaagcaa ttgcagcagc aacaggagag 1920

caaaaggatt ccctgtgctt cattgaagtc cttgtgcaca aggacgacac aagcaaagag 1980

ctgctagaat ggggatcacg tgtttcttct gcaaacagcc gtcctcccaa tcctcagtaa 2040

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

gattacgcca agcttagagt aggaaaggca cataaggc 38

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 3

gattacgcca agcttaggat tgggaggacg gctgtttg

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 4

gattacgcca agctttatcc gctggctgtt atgccctca

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 5

gattacgcca agcttgcatt aacaagacca gtgtaatccc 40

<210> 6

<211> 586

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 6

Met Glu Val Ala Asn His Leu Gly Ser Ala Ala Ser Ser Pro Val Pro

1 5 10 15

Val Leu Gly His Ala Ser Ser Gly Thr Leu Gly Arg His Leu Ala Arg

20 25 30

Arg Leu Val Glu Ile Gly Val Arg Asp Val Phe Ser Val Pro Gly Asp

35 40 45

Phe Asn Leu Thr Leu Leu Asp His Leu Ile Ala Glu Pro Glu Leu Asn

50 55 60

Thr Ile Gly Cys Cys Asn Glu Leu Asn Ala Gly Tyr Ala Ala Asp Gly

65 70 75 80

Tyr Ala Arg Ala Arg Gly Val Gly Ala Cys Val Val Thr Phe Thr Val

85 90 95

Gly Gly Leu Ser Val Ile Asn Ala Ile Ala Gly Ala Tyr Ser Glu Asn

100 105 110

Leu Pro Val Ile Cys Ile Val Gly Gly Pro Asn Ser Asn Asp Tyr Gly

115 120 125

Thr Asn Arg Ile Leu His His Thr Ile Gly Leu Pro Asp Phe Thr Gln

130 135 140

Glu Leu Arg Cys Phe Gln Thr Val Thr Cys Ile Gln Ala Val Val Asn

145 150 155 160

Asn Leu Asp Asp Ala His Glu Gln Ile Asp Thr Ala Ile Ser Thr Ala

165 170 175

Leu Lys Glu Ser Lys Pro Ala Tyr Ile Ser Ile Ser Cys Asn Leu Pro

180 185 190

Gly Ile Pro His Pro Thr Phe Ser Arg Asp Pro Val Pro Phe Phe Leu

195 200 205

Ala Pro Lys Val Ser Asn Gln Leu Gly Leu Glu Ala Ala Val Glu Ala

210 215 220

Thr Ala Lys Phe Leu Asn Lys Ala Val Lys Pro Val Ile Val Gly Gly

225 230 235 240

Pro Lys Leu Arg Val Gly Lys Ala His Lys Ala Phe Met Glu Leu Ala

245 250 255

Asp Ala Ser Gly Tyr Pro Leu Ala Val Met Pro Ser Gly Lys Gly Leu

260 265 270

Val Pro Glu His His Pro His Phe Ile Gly Thr Tyr Trp Gly Ala Val

275 280 285

Ser Thr Ser Phe Cys Gly Glu Ile Val Glu Ser Ala Asp Ala Tyr Ile

290 295 300

Phe Val Gly Pro Ile Leu Asn Asp Tyr Ser Ser Val Gly Tyr Ser Leu

305 310 315 320

Leu Ile Lys Lys Glu Lys Ser Ile Val Val Gln Pro Asn Arg Val Thr

325 330 335

Ile Gly Asn Gly Pro Ser Phe Gly Trp Val Phe Met Val Glu Phe Leu

340 345 350

Ser Ala Leu Ala Lys Lys Val Lys Lys Asn Asn Thr Ala Leu Glu Asn

355 360 365

Tyr Arg Arg Ile Tyr Val Pro Pro Gly Lys Pro Leu Lys Ser Glu Lys

370 375 380

Asp Glu Pro Leu Arg Val Asn Val Leu Phe Lys His Ile Gln Glu Met

385 390 395 400

Leu Gly Gly Asp Thr Ala Val Ile Ala Glu Thr Gly Asp Ser Trp Phe

405 410 415

Asn Cys Gln Lys Leu Arg Leu Pro Glu Asn Cys Gly Tyr Glu Phe Gln

420 425 430

Met Gln Tyr Gly Ser Ile Gly Trp Ser Val Gly Ala Thr Leu Gly Tyr

435 440 445

Ala Gln Ser Ala Lys Asp Lys Arg Val Ile Ala Cys Ile Gly Asp Gly

450 455 460

Ser Phe Gln Val Thr Ala Gln Asp Ile Ser Thr Met Met Arg Cys Gly

465 470 475 480

Gln Arg Ser Ile Ile Phe Leu Ile Asn Asn Gly Gly Tyr Thr Ile Glu

485 490 500

Val Glu Ile His Asp Gly Pro Tyr Asn Val Ile Lys Asn Trp Asp Tyr

505 510 515

Thr Gly Leu Val Asn Ala Ile His Asn Gly Glu Gly Lys Cys Trp Thr

520 525 530

Ala Lys Val Arg Thr Glu Glu Glu Met Ile Glu Ala Ile Ala Ala Ala

535 540 545

Thr Gly Glu Gln Lys Asp Ser Leu Cys Phe Ile Glu Val Leu Val His

550

Lys Asp Asp Thr Ser Lys Glu Leu Leu Glu Trp Gly Ser Arg Val Ser

Ser Ala Asn Ser Arg Pro Pro Asn Pro Gln

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 7

cctgtgccat tcttcctcg 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 8

gccttatgtg cctttcctac tc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 9

cctgagaaac ggctaccaca tc 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 10

acccatccca aggtccaact ac 22

Claims

1.一种从秋茄中克隆扩增出来的丙酮酸脱羧酶基因，其特征在于，所述丙酮酸脱羧酶基因全长为2040bp，其核苷酸序列为SEQ NO.1，所述丙酮酸脱羧酶基因编码的蛋白包括586个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ NO.6；所述蛋白为胞质蛋白，其含有24个螺旋和17个折叠，存在1个跨膜螺旋区域，氨基酸位置为第A443-S451位；所述蛋白包含了Mg²⁺结合位点，蛋白激酶C磷酸化位点，酪氨酸激酶磷酸化位点1，酪蛋白激酶II磷酸化位点，多个N-豆蔻酰化位点，DHS样NAD/FAD结合位点和硫胺素二磷酸结合折叠。

2.根据权利要求1所述的丙酮酸脱羧酶基因，其特征在于，用于克隆所述丙酮酸脱羧酶基因的引物序列包括第一轮PCR引物以及巢式PCR引物，所述第一轮PCR引物的核苷酸序列为SEQ NO.2和SEQ NO.3，所述巢式PCR引物的核苷酸序列为SEQ NO.4和SEQ NO.5。

3.一种检测如权利要求1-2任一所述丙酮酸脱酸酶基因表达含量变化的方法，其特征在于，包括步骤：

将秋茄进行缺氧处理预定时间后，提取秋茄的总RNA；

利用反转录试剂盒将所述总RNA反转录成cDNA；

4.根据权利要求3所述检测丙酮酸脱羧酶基因表达含量变化的方法，其特征在于，所述缺氧处理为水淹处理。

5.一种如权利要求1-2任一所述丙酮酸脱羧酶基因的应用，其特征在于，将所述丙酮酸脱羧酶基因用于植物品种改良。