MXPA02008589A - Antagonistas de receptor de interleucina-8. - Google Patents

Abstract

Esta invencion se refiere al nuevo uso de dianilino escuaratos en el tratamiento de estados de enfermedad mediados por la quimiocina, interleucina-8 (IL-8).

Description

ANTAGONISTAS DE RECEPTOR DE INTERLEUGINA-8 CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a un nuevo grupo de compuestos de dianilino escuarato, procedimientos para la preparación de los mismos, el uso de los mismos en el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-8, GROoc.GROß, GRO?, NAP-2, y ENA-78 y composiciones farmacéuticas para utilizarse en dicha terapia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se han aplicado muchos nombres diferentes a interleucina-8 (IL-8), tales como proteína-1 atrayente/ de activación de neutrófilo (NAP-1), factor quimiotáctico de neutrófilo derivado de monocito (MDNCF), factor de activación de neutrófilo (NAF), y factor quimiotáctico de linfocito de célula T. La ¡nterleucina-8 es un quimioatrayente para neutrófilos, basófilos, y un subconjunto de células T. Se produce por una mayoría de células nucleadas incluyendo macrófagos, fibroplastos, células endoteliales y epiteliales expuestas a TNF, IL-1a, I -lß o LPS, y por neutrófilos en sí mismos cuando se exponen a LPS o factores quimiotácticos tales como FMLP. M. Baggiolini et al, J. Clin. Invest. 84, 1045 (1989); J. Schroder et al, J. Immunol. 139, 3474 (1987) y J. Immunol. 144, 2223 (1990); Strieter, et al, Science 243, 1467 *?* ?*LAIA* M,..,A (ÍÚÉ9) y J. Biol. Chem. 264, 10621 (1989); Cassatelía et al, J. Immunol. 148, 3216 (1992). Groa, GROß, GRO? y NAP-2 también pertenecen a la familia de quimiocina a. Igual que IL-8 estas quimiocinas también han sido referidas mediante diferentes nombres. Por ejemplo GROa, ß, ? han sido referidas como MGSAa, ß y ? respectivamente (Melanoma Growth Stimulating Activity), ver Richmond et al, J. Cell Phvsioloav 129, 375 (1986) y Chang et al, J, Immunol 148, 451 (1992). Todas las quimiocinas de la familia a que poseen el motivo ELR precediendo directamente al motivo CXC se unen al receptor de IL-8 B. IL-8, Groa, GROß, GRO?, NAP-2 y ENA-78 estimulan un número de funciones in vitro. Todas han mostrado que tienen propiedades quimioatrayentes para neutrófilos, mientras IL-8 y GROa han demostrado actividad quimiotáctica de linfocitos T y basófilos. Además IL-8 puede inducir liberación de histamina a partir de basófilos de individuos normales y atópicos. GRO- a y IL-8 pueden además, inducir liberación de enzima lisozomal y ráfagas respiratorias de neutrófilos. IL-8 también ha mostrado que incrementa la expresión de superficie de Mac-1 (CD11b/CD18) en neutrófilos sin síntesis de proteína de novo. Esto puede contribuir a una adhesión incrementada de los neutrófilos a células endoteliales vasculares. Muchas enfermedades conocidas se caracterizan por infiltración masiva de neutrófilo. Ya que IL-8, Groa, GROß, GRO? y NAP-2 promueven la acumulación y activación de neutrófilos, estas quimiocinas han estado implicadas en una amplia gama de Üttfornos inflamatorios agudos y crónicos incluyendo psoriaris y artritis reumatoide, Baggiolini et al, FEBS Lett. 307, 97 (1992); Miller et al. Crit. Rev. Immunol. 12,17 (1992); Oppenheim et al, Annu. Rev. Immunol. 9, 617 (1991); Seitz et al., J. Clin. Invest. 87, 463 (1991); Miller et al., Am. Rev. Respir. Dis. 146, 427 (1992); Donnely et al., Lancet 341 , 643 (1993). Además las quimiocinas ELR (aquellas que contienen el motivo ELR de aminoácidos justo antes del motivo CXC) también han estado implicadas en angiostásis, Strieter et al, Science 258, 1798 (1992). In vitro, IL-8, Groa, GROß, GRO? y NAP-2 inducen cambio de forma de neutrófilo, quimiotaxis, liberación de granulo y ráfaga respiratoria, uniéndose a y activando receptores de la familia enlazada a proteína G, de siete-transmembranas, en particular mediante unión a receptores de IL-8, de manera más notable el receptor B, Thomas et al., J. Biol. Chem. 266, 14839 (1991); y Holmes et al., Science 253, 1278 (1991). El desarrollo de antagonistas de molécula pequeña no de péptido para membranas de esta familia de receptor tiene precedentes. Para una reseña consultar R. Freidinger en. Proaress in Drua Research. Vol. 40, pp. 33-98, Birkhauser Verlag, Basel 1993. De aquí que, el receptor de IL-8 representa un objetivo promisorio para el desarrollo de nuevos agentes anti-inflamatorios. Dos receptores de IL-8 humanos de alfa afinidad (77% de homología) han sido caracterizados: IL-8Ra que se une únicamente a IL-8 con alta afinidad, y IL-8RB, que tiene alta afinidad para IL-8 así como para Gro-a, GROß, GRO? y NAP-2. Consultar Holmes et al., supra; Murphy et al., Science h á?J ?i?ii i??mAji?tíhtA, ......?. ?. .^^.« . . .A . > ^.J, .»aMi.^.^?..<M^.,i ,..¡ Mh..l|.rtit[|¿r. t ^¿¿^jfafcJ .1.., A *8, 1280 (1991 ); Lee et al., J. Biol. Chem. 267, 16283 (1992); LaRosa et al., J. Biol. Chem. 267, 25402 (1992); y Gayle et al., J. Biol. Chem. 268, 7283 (1993). Permanece una necesidad para tratamiento, en este campo, para compuestos que son capaces de unirse al receptor de IL-8 a o ß. Por lo tanto, las condiciones asociadas con un incremento en producción de IL-8 (que es responsable para quimiotaxis de neutrofilo y subconjuntos de células T en el sitio inflamatorio) se beneficiarían mediante compuestos que son inhibidores de unión de receptor de IL-8.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Esta invención provee un método para tratar una enfermedad mediada por quimiocina, caracterizado porque la quimiocina es una que se une a un receptor de IL-8 a o ß y cuyo método consiste en administrar una cantidad efectiva de un compuesto de Fórmula (I) o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo. En particular la quimiocina es IL-8. Esta ¡nvención también se refiere a un método para inhibir la unión de IL-8 a sus receptores en un mamífero en necesidad del mismo que consiste en administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de un compuesto de Fórmula (I). Los compuestos de Fórmula (I) útiles en la presente invención se representan mediante la estructura: (I) en la cual: R se selecciona del grupo que consiste de OH, SH, y NHSO2Rd; Rd se selecciona del grupo que consiste de NR6R7, alquilo, arilalquilo de C1-4, arilalquenilo de C2^, heteroarilo, heteroarilalquilo de C1-4, heteroarilalquenilo de C2^, heterocíclico, y alquilo heterocíclico de C- , en el cual los anillos arilo, heteroarilo y heterocíclico están todos opcionalmente substituidos; Re y R7 son de manera independientemente hidrógeno, o un grupo alquilo de C1-4, o RQ y R7 juntos con el nitrógeno al cual están adheridos forman un anillo de 5 a 7 miembros cuyo anillo contiene de manera opcional un heteroátomo adicional que se selecciona a partir de oxígeno, nitrógeno o azufre y cuyo anillo puede estar opcionalmente sustituido; R1 se selecciona de manera independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, nitro, ciano, alquilo de CMO sustituido por halógeno, alquilo de C- O, alquenilo de C2.?o, alcoxi de C1-10, alcoxi de C- O substituido por halógeno, azida, (CR8R8)qS(O)tR4, hidroxi, hidroxialquilo de C?. 4, arilo, arilalquilo de C1-4, ariloxi, arilalquiloxi de C1-4, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterocíclico, alquilo heterocíclico de C-M; heteroarilalquiloxi de C , arilalquenilo de C2-10, heteroarilalquenilo de C2-10, alquenilo heterocíclico de C2-10, (CR8R8)qNR4R5> alquenilo de CMO C(O)NR Rd, (CR8Rd)q C(O)NR4R?o, S(O)3H, S(O)3R8, (CRßRßJq C(0)Rn, alquenilo de C2-10 C(0)Rn, alquenilo de C2-10 C(O)ORn (CRsRßJq C(O)OR?2, (CR8R8)q OC(0)Rn, (CR8R8)qNR4C(0)Rn, (CR8R8)NHS(O)2Ri7, (CRßRsíq NHS(0)2R?7, (CR8R8)qS(O)2NR4R5; o dos porciones R1 juntas forman O-(CH2)sO- o un anillo insaturado de 5 a 6 miembros; q es 0, o un entero que tiene un valor de 1 a 10; t es 0, o un entero que tiene un valor de 1 o 2; s es un entero que tiene un valor de 1 a 3; R4 y R5 se seleccionan de manera independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de CM opcionalmente substituido, arilo opcionalmente sustituido, arilalquilo de CM opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterarilalquilo de CM opcionalmente sustituido, heterocíclico, y alquilo heterocíclico de CM. o R40 R5 juntos con el hidrógeno al cual están adheridos forman un anillo de 5 a 7 miembros que consiste opcionalmente de un heteroátomo adicional seleccionado a partir de oxígeno, nitrógeno o azufre; Y se selecciona de manera independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, nitro, ciano, alquilo de C-MO sustituido por halógeno, alquilo de C-MO, alquenilo de C2-10, alcoxi de C- O, alcoxi de C- O substituido por halógeno, azida, (CR8R8)qS(0)tR4, hidroxi, hidroxialquilo de C1. 4, arilo, arilalquilo de CM, ariloxi, arilalquiloxi de C , heteroarilo, **'-*' * " l-ii.á MtMif j tlr?t l7t rrt-.j--?--.»i * — --»•—""'»> • • - _..*..«...¿.»..^. -».~ ?-»--*• -— ....^?,^. « ..,. .. . heteroarilalquilo, heteroarilalquiloxi de CM, heterocíclico, alquilo heterocíclico de C ; arilalquenilo de C2.?o, heteroarilalquenilo de C2-10, alquenilo heterocíclico de C2-10, alquenilo de d.10 C(O)NR4R5, (CR8R8)q C(O)NR4R?o, S(O)3H, S(O)3Rs, (CRsRßJqCÍOJRn, alquenilo de C2-10 C(O)Rn, alquenilo de Crio C(O)ORn, C(O)ORn, (CR8R8)qC(O)OR?2, (CRßRßtaOCÍC Rn, (CR8R8)qNR4C(O)Rn, (CR8R8)NHS(O)2Rd, y (CR8R8) S(O)2NR4R5; o dos porciones Y juntas forman O-(CH2)sO- o un anillo insaturado de 5 a 6 miembros; n es un entero que tiene un valor de 1 a 5; m es un entero que tiene un valor de 1 a 4; Rs es hidrógeno o alquilo de C1-4; R10 es alquilo de C-MO C(O)2R8; R11 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de CM, arilo opcionalmente sustituido, arilalquilo de CM opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heteroarilalquilo de CM, opcionalmente sustituido, heterocíclico opcionalmente sustituido y alquilo heterocíclico de C1-4 opcionalmente sustituido; R12 se selecciona de hidrógeno, alquilo de C?-o,arilo opcionalmente sustituido y arilalquilo opcionalmente sustituido; y R17 se selecciona del grupo que consiste de alquilo de CM. arilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroarilo, heteroarilalquilo de CM, heterocíclico, y alquilo heterocíclico de CM, en el cual los anillos arilo, heteroarilo y heterocíclico están todos opcionalmente sustituidos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION Los compuestos de Fórmula (I) también se pueden utilizar en asociación con el tratamiento veterinario de mamíferos, diferentes a seres 5 humanos, en necesidad de inhibición de IL-8 u otras quimiocinas que se unen a los receptores de IL-8RA y RB. Las enfermedades mediadas por quimiocina para tratamiento en animales, de manera terapéutica o profiláctica, ¡ncluyen estados de enfermedad tales como aquellos anotados en la presente en la sección de Métodos de Tratamiento. 10 Los siguientes términos, como se utilizan en la presente, se refieren a: • "Halo"- todos los halógenos, es decir cloro, flúor, bromo y yodo. • "Alquilo de C2-5" o "alquilo" - tanto porciones de cadena recta como ramificada de 2 a 5 átomos de carbono, a menos que la longitud de 15 cadena esté limitada de otra manera, incluyen, pero no limitado a, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo, tert-butilo, n-pentilo y similares. • El término "alquenilo" se utiliza en la presente en todas las ocurrencias para significar porciones de cadena recta o ramificada de 2-10 20 átomos de carbono, a menos que la longitud de cadena esté limitada en el mismo, incluyendo, pero no limitado a etenilo, 1 -propenilo, 2-propenilo, 2- metih -propenilo, 1 -butenilo, 2-butenilo y similares. • "Arilo'-fenilo y naftilo; ñí •¡ ßm ? Smi l k i ii > i i ii.jttt.tAi • "Heteroarilo" (por sí mismo o en cualquier combinación, tal como "heteroariloxi" o "heteroarilalquilo") - un sistema de anillo aromático de 5-10 miembros en el cual uno o más anillos contienen uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de N, O o S, tal como, pero no limitado 5 a, pirróla, pirazola, furano, tiofeno, quinolina, isoquinolina, quinazolinila, piridina, pirimidina, oxazola, tiazola, tiadiazola, triazola, imidazola, o benzimidazola. • "Heterocíclico" (por sí mismo o en cualquier combinación, tal como "alquiloeterocíclico") - un sistema de anillo saturado o parcialmente 10 insaturado de 4-10 miembros en el cual uno o más anillos contiene uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de N, O, o S; tal como, pero no limitado a, pirrolidina, piperidina, peperazina, morfolina, tetrahidropirano, o imidazolidina. • El término "arilalquilo" o "heteroarilalquilo" o "alquiloheterocíclico" 15 se utiliza en la presente para significar alquilo de C1-0, como se define anteriormente, adherido a una porción arilo, heteroarilo o heterocíclica, como también se define en la presente, a menos que se indique de otra manera. Los compuestos preferidos de la presente invención se seleccionan del grupo que consiste de: 20 1 ) 3-(4-Ciano-2-hidroxianil¡no)-4-(2-bromoanilino)-ciclobut-3-ene-1 ,2-diona; 2) 3-(4-Ciano-2-hidroxianilino)-4-(2-cloroanilino)-ciclobut-3-ene-1 ,2-diona; 3) 3-(4-Ciano-2-hidroxianilino)-4-(2,3-dicloroanilino)-ciclobut-3-ene-1 ,2-diona; 4) 3-(4-Nitro-2-hidroxianilino)-4-(2-bromoanilino)-ciclobut-3-ene-1 ,2-diona; y .~~ «?iJ* m?a k^^* Ak?AÍ.j*& ..A. 5) 3-(4-cloro-2-hidroxianilino)-4-(2-bromoanilino)-ciclobut-3-ene-1 ,2-diona.

MÉTODOS DE PREPARACIÓN 5 Los compuestos de Fórmula (I) se pueden obtener aplicando procedimientos sintéticos, algunos de los cuales se ilustran en los siguientes esquemas. La síntesis que se provee en estos esquemas es aplicable para producir compuestos de Fórmula (I) que tienen una variedad de diferentes grupos R, R-i, y arilo los cuales se hacen reaccionar, utilizando sustituyentes 10 opcionales que están protegidos de manera adecuada, para lograr compatibilidad con las reacciones que están delineadas en la presente. La desprotección subsecuente, en aquellos casos, proporciona entonces compuestos de la naturaleza que se divulga en general. Una vez que el núcleo de guanidina ha sido establecido, se pueden preparar compuestos 15 adicionales de estas fórmulas aplicando técnicas estándar para interconversión de grupo funcional bien conocidas en la técnica. Aunque los esquemas se muestran únicamente con compuestos de Fórmula (I) esto es únicamente para propósitos de ilustración solamente. ¡ tA mf^?AAß ?í ESQUEMA 1 a) Br2, NaOAc, HOAc; b) CuCN, DMF, reflujo; c) (BOC)2O, DMAP, TEA; d) K2CO3, MeOH; e) TFA La anilina 6 deseada del esquema 1 se puede preparar a partir de la benzoxazolinona 1 del esquema 1 disponible comercialmente. El bromuro 2 del esquema 1 se puede preparar a partir de la benzoxazolinona 1 del esquema 1 utilizando condiciones de brominación estándares tales como bromo y acetato de sodio en ácido acético. El bromuro 2 del esquema 1 se puede convertir al cianuro 3 del esquema 1 utilizando procedimientos estándar tales como cianuro de cobre (I) en DMF sometida a reflujo. La amida 3 del esquema 1 se puede convertir al compuesto 4 protegido por BOC del esquema 1 utilizando condiciones estándar tales como anhídrido de BOC y trietilamina con una cantidad catalítica de dimetilamino piridina en cloruro de metileno u otro solvente orgánico adecuado. La oxazolinona 4 del esquema 1 se puede convertir a la anilina 6 deseada del esquema 1 primero mediante hidrólisis al fenol 5 del esquema 1 utilizando condiciones estándar tales como carbonato de potasio en metanol seguido por remoción del grupo BOC protector utilizando condiciones estándar tales como ácido trufluoroácetico en cloruro de metileno u otro solvente orgánico adecuado para dar la anilina 6 del esquema 1.

ESQUEMA 2 1 De manera alternativa, las hidroxianilina 4 sustituida deseada se puede preparar como está delineado en el esquema 2. Las 3-cloroanilinas 1 sustituidas disponibles comercialmente se pueden convertir a la amida 2 utilizando condiciones estándar bien conocidas en la técnica tales como cloruro de pivalolilo y trietilamina en un solvente orgánico adecuado tal como cloruro de metileno. La amida se puede convertir a la benzoxazola 3 utilizando una cantidad en exceso de una base fuerte tal como butilitio en un solvente orgánico adecuado tal como THF bajo temperaturas de reacción reducidas de entre -20 y -40°C seguido por manipulación prótica. La fenolanilina 5 L Aa.^ deseada se puede obtener a partir de la benzoxazola 4 utilizando condiciones de hidrólisis estándar bien conocidas en la técnica tales como ácido sulfúrico en agua y calentando a 85° C.

ESQUEMA 3 4 5 Los compuestos de la estructura 5 se obtendrán a partir del dimetil éter escuarato 1 disponible comercialmente como está delineado en el esquema 3. El intermediario 3 se puede obtener haciendo reaccionar el dietiléter escuarato 1 con la anilina 2 deseada en etanol sometido a reflujo u otro solvente orgánico adecuado. El compuesto de escuarato 5 deseado se puede obtener haciendo reaccionar el escuarato 3 con una segunda anilina 4 en etanol sometido a reflujo u otro solvente orgánico adecuado.

EJEMPLOS SINTÉTICOS La invención se describirá enseguida mediante referencia a los siguientes ejemplos que son únicamente ilustrativos y no se deben considerar como una limitación del alcance de la presente invención. Todas las temperaturas se dan en grados centígrados, todos los solventes son de la pureza más alta disponible y todas las reacciones corren bajo condiciones anhidras en una atmósfera de argón a menos que se indique de otra manera. En los ejemplos, todas las temperaturas están en grados centígrados (°C). El espectro de masa se realizó en un espectrómetro de masa VG Zab utilizando bombardeo rápido de átomos, a menos que se indique de otra manera. El espectro de 1 H-RMN (de aquí en adelante "RMN") se registró a 250 MHz utilizando un espectrómetro Bruker AM 250 o Am 400. Las multiplicidades indicadas son : s = singulete, d = doblete, t = triplete, q = cuarteto, m = multiplete y br indica una señal amplia. Sat. indica una solución saturada, eq indica la proporción de un equivalente molar de reactivo con relación al reactivo principal.

EJEMPLO 1 Síntesis de 3-(4-Cíano-2-hidroxianilino)-4-(2-bromoanilino)-ciclobut-3- ene-1.2-diona 3-metoxi-4-(2-bromoanilino)-ciclobut-2-ene-1.2-diona A una solución de 3,4-dimetoxiciclobut-2-ene-1 ,2-diona (1 mmoles) en etanol (1 mL) se añade 2-bromoanilina (1 mmoles). Al completar la reacción, la mezcla de reacción se concentra y purifica mediante cristalización o cromatografía para dar 3-metoxi-4-(2-bromoanilino)-ciclobut-2-ene-1 ,2-diona. 3-(4-Ciano-2-hidrox¡anilino)-4-(2-bromoanilino)-ciclobut-3-ene- 1.2-diona A una solución de 3-metoxi-4-(2-bromoanilino)-ciclobut-2-ene-1 ,2-diona (1 mmoles) en etanol (1 mL) se añaden 4-ciano-2-hidroxianilina (1 mmoles). Al completar la reacción, la mezcla se concentra y purifica mediante recristalización o cromatografía para dar 3-(4-Ciano-2-hidroxianilino)-4-(2-bromoanilino)-ciclobut-3-ene-1 ,2-diona.

MÉTODO DE TRATAMIENTO Los compuestos de Fórmula (I) o una sal aceptable farmacéuticamente de los mismos se pueden utilizar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de cualquier estado de enfermedad en un humano, u otro mamífero, que es exacerbado o provocado por producción excesiva o no regulada de citocina IL-8 por las células del mamífero, tales como pero no limitado a monocitos y/o macrófagos, u otras quimiocinas que se unen al receptor de IL-8 a o ß, también referido como el receptor tipo I o tipo II. De acuerdo con esto, la presente invención provee un método para tratar una enfermedad mediada por quimiocina, caracterizado porque la quimiocina es una que se une a un receptor de IL-8 a o ß, y cuyo método consiste en administrar una cantidad efectiva de un compuesto de Fórmula (I) o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo. En particular, las quimiocinas son IL-8, GROa, GROß, GRO?, NAP-2 o ENA-78. Para los propósitos de la presente, los compuestos de Fórmulas (I) y (II) tienen todos las mismas dosificaciones, y las formulaciones como aquella de Fórmula (I) se utilizan de manera intercambiable. Los compuestos de fórmula (I) se administran en una cantidad suficiente para inhibir la función de citocina, en particular IL-8, GROa, GROß, GRO?, NAP-2 o ENA-78, de tal manera que se regulan de manera biológica a niveles normales de función fisiológica, o en algunos casos a niveles subnormales, como para aliviar el estado de enfermedad. Los niveles anormales de IL-8, GRO por ejemplo en el contexto de la presente ¡nvención, constituyen: (i) niveles de IL-8 libre más grandes que IL-8 o igual a 1 picogramo por mL; (ii) cualquier célula asociada con IL-8, GROa, GROß, ..A,» , .^¡ ^^^^^ GRO?, NAP-2 o ENA-78 por arriba de niveles fisiológicos normales; o (iii) se produce ¡a presencia de IL-8, GROa, GROß, GRO?, NAP-2 o ENA-78 por arriba de niveles básales en células o tejidos en IL-8, GROa, GROß, GRO?, NAP-2 o ENA-78 respectivamente. 5 Existen muchos estados de enfermedad en los cuales la producción excesiva o no regulada de IL-8 está implicada en la exaltación y/o provocación de la enfermedad. Las enfermedades mediadas por quimiocina ¡ncluyen psoriasis, dermatitis atópica, osteoartritis, artritis reumatoide, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, síndrome de tensión respiratoria en 10 adulto, enfermedad de intestino inflamatoria, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, accidente cerebro vascular, choque séptico, esclerosis múltiple, choque endotóxico, sepsis Gram negativa, síndrome de choque tóxico, lesión de reperfusión cardiaca y renal, glomerulonefritis, trombosis, reacción de injerto contra hospedero, enfermedad de Alzheimer, rechazos de aloinjerto, 15 malaria, restenosis, angiógenes, aterosclerosis, osteoporosis, gingivitis y liberación indeseada de células de tallo hematopoiético y enfermedades provocadas por virus respiratorias, virus de herpes, virus de hepatitis, meningitis, fibrosis cística, trabajo de pre-término, tos, prurito, disfunción de órganos múltiples, traumas, tensiones, esguinces, contusiones, artritis 20 psoriática, herpes, encefalitis, vasculitis de CNS, lesión de cerebro traumática, tumores de CNS, hemorragia subaracnoide, trauma post-quirúrgico, pneumonitis intersticial, hipersensibilidad, artritis inducida por cristal, pancreatitis aguda y crónica, hepatitis alcohólica aguda, enterocolitis ,p ...'*, -¡ ii ilUmAd&iaíi?ií A..!,.^ . . m&*z .. . « • --.. . .^., .... ... ^.^._^,...- --^. ~.^... .. -. .... » ».,- .. ..^ . ..,--..^a..^ . , ..^*A........ .. _ . . „ ¿aai, i ?A^ iiwMwffip— *- necrotizante, sinuositis crónica, uveitis, polimiositis, vasculitis, acné, úlceras gástricas y duodenales, enfermedad celiaca, esofagitis, glositis, obstrucción de flujo de aire, hiperresponsividad de conducto de aire, bronchiolitis obliterans que organiza neumonía, bronquiectasis, bronquiolitis, bronquiolitis obliterante, bronquitis crónica, cor pulmonae, dispnea, enfisema, hipercapnea, hiperinflación, hipoxemia, inflamaciones inducidas por hiperoxia, hipoxia, reducción quirúrgica de volumen de pulmón, fibrosis pulmonar, hipertensión pulmonar, hipertrofia ventricular derecha, sarcoidosis, enfermedad de conducto de aire pequeño, desequilibrio de ventilación-perfusión, jadeo, resfríos y lupus. Estas enfermedades se caracterizan principalmente por infiltración masiva de neutrófilo, infiltración de célula T, o crecimiento neovascular, y están asociadas con producción incrementada de IL-8, GROa, GROß, GRO?, NAP-2 o ENA-78 que es responsable de la quimiotaxis de neutrófilos en el sitio inflamatorio o el crecimiento direccional de células endoteliales. En contraste a otras citocinas inflamatorias (IL-1 , TNF, e IL-6), IL-8, GROa, GROß, GRO?, NAP-2 o ENA-78 tienen la propiedad única de promover la quimiotaxis de neutrófilo, liberación de enzima incluyendo pero no limitado a liberación de elastasa así como producción y activación de superóxido. Las a-quimiocinas pero en particular, IL-8, GROa, GROß, GRO?, NAP-2 o ENA-78, que trabajan a través del receptor de IL-8 tipo I o II pueden promover la neovascularización de tumores promoviendo el crecimiento direccional de células endoteliales. Por lo tanto, la inhibición de quimiotaxis o activación inducida por IL-8 conduciría a una reducción directa en la infiltración de neutrófilo. La evidencia reciente también implica el papel de quimiocinas en el tratamiento de infecciones de HIV, Littleman et al., Nature 381, pp. 661 (1996) y Koup et al., Nature 381 , pp. 667 (1996). La evidencia presente también indica el uso de inhibidores de IL- 8 en el tratamiento de aterosclerosis. La primera referencia, Boisvert et al., J.

Clin. Invest, 1998, 101:353-363 muestra, a través del transplante de medula ósea, que la ausencia de receptores de IL-8 en células de tallo (y, por lo tanto, en monocitos/macrofagos) conduce a una reducción en el desarrollo de placas ateroscleróticas en ratones deficientes de receptor de LDL. Las referencias de soporte adicionales son: Apostolopoulos, et al., Arterioscler. Thromb. Vasa Biol. 1996, 16:1007-1012; Liu, et al., Arterioscler. Thromb. Vasa Biol. 1997, 17:317-323; Rus, et al., Atheroscleorosis. 1996, 127:263-271.; Wang et al., Biol. Chem. 1996, 271 :8837-8842; Ye, et al., Eur. J. Pharmacol. 1993, 240:81 - 84; Koch, et al., Am. J. Pathol.. 1993, 142:1423-1431.; Lee, et al., Immunol.

Lett.. 1996, 53, 109-113.; y Terkeltaub et al., Arterioscler. Thromb.. 1994, 14:47-53. La presente invención también provee un medio para tratar, en un entorno agudo, así como para evitar, en aquellos individuos que se consideran propensos a, lesiones de CNS, mediante los compuestos de antagonista receptor de quimiocina de Fórmula (I).

Las lesiones de CNS como se definen en la presente incluyen trauma de cabeza abierto o penetrante, tal como mediante cirugía, o una lesión de trauma de cabeza cerrada, tal como mediante una lesión a la región de la cabeza. También está incluido dentro de esta definición el accidente cerebro vascular isquémico, en particular al área cerebral. El accidente cerebro vascular isquémico se puede definir como un trastorno neurológico focal que resulta del suministro insuficiente de sangre a un área cerebral particular, normalmente como consecuencia de una embolia, trombosis, o cierre ateromatoso local del vaso sanguíneo. El papel de citocinas inflamatorias en esta área a estado surgiendo y la presente invención provee un medio para el tratamiento potencial de estas lesiones. Ha estado disponible tratamiento relativamente escaso para una lesión aguda tal como esta. THF-a es una citocina con acciones proinflamatorias incluyendo, expresión de molécula de adhesión del leucocito endotelial. Los leucocitos se infiltran en lesiones cerebrales isquémicas y por lo tanto los compuestos que inhiben o disminuyen el nivel de THF serían útiles para el tratamiento de lesión cerebral isquémica. Consultar Liu et al., Stroke Vol. 25., No. 7, pp. 1481-88 (1994) cuya descripción está incorporada a la presente por referencia. Los modelos de lesiones de cabeza cerrada y tratamiento con agentes 5-LO/CO mezclados se explican en Shohami et al. J. of Vaisc & Clinical Physioloqy and Pharmacologv. Vol. 3, No. 2, pp. 99-107 (1992) cuya descripción está incorporada a la presente por referencia. El tratamiento, que reduce la formación de edema, se descubrió que mejora el rendimiento funcional en aquellos animales tratados. Los compuestos de Fórmula (I) se administran en una cantidad suficiente para inhibir IL-8, que se une a los receptores de IL-8 alfa o beta, que se una a estos receptores, tal como se prueba mediante una reducción en quimiotáxis y activación de neutrofilo. El descubrimiento de que los compuestos de Fórmula (I) son inhibidores de unión de IL-8 se basa en los efectos de los compuestos de Fórmulas (I) en los ensayos de unión de receptor in vitrio que se describen en la presente. Los compuestos de Fórmula (I) han mostrado que son inhibidores de los receptores de IL-8 tipo II. Como se utiliza en la presente, el término "enfermedad o estado de enfermedad mediado por IL-8" se refiere a cualquiera y todos los estados de enfermedad en los cuales IL-8 GROa, GROß, GRO?, NAP-2 o ENA-78 juegan un papel, ya sea mediante la producción de IL-8 GROa, GROß, GRO?, NAP-2 o ENA-78 en si mismos o mediante IL-8 GROa, GROß, GRO?, NAP-2 o ENA-78 que provocan que se libere otra monocina, tal como pero no limitado a IL-1 , IL-6 o THF. Un estado de enfermedad en el cual, por ejemplo IL-1 es un componente principal, y cuya producción o acción, es exacerbada o secretada en respuesta a IL-8, se consideraría por lo tanto como un estado de enfermedad mediado por IL-8. Como se utiliza en la presente, el término "enfermedad o estado de enfermedad mediado por quimiocina" se refiere a cualquiera y todos los estados de enfermedad en los cuales una quimiocina que se une a un receptor de IL-8 a o ß juega un papel, tal como pero no limitado a IL-8, GRO-a, GRO-ß, GRO?, NAP-2 o ENA-78. Esto incluiría un estado de enfermedad en el cual, IL-8 juega un papel, ya sea mediante la producción IL-8 en sí, o porque IL-8 provoca que se libere otra monocina, tal como pero no limitado a ¡L-1 , IL-6 o THF. Un estado de enfermedad en el cual, por ejemplo, IL-1 es un componente principal, y cuya producción o acción, es avivada o secretada en respuesta IL-8, se consideraría por lo tanto un estado de enfermedad mediado por IL-8. Como se utiliza en la presente, el término "citocina" se refiere a cualquier polipéptido secretado que afecta las funciones de células y es una molécula que modula interacciones entre células en la respuesta inmune, inflamatoria o ematopoiética. Una citocina incluye, pero no está limitada a, monocinas y limfocinas, sin importar cuales células las producen. Por ejemplo, una monocina es referida generalmente como que es producida y secretada por una célula mononuclear, tal como un macrófago y/o monocito. Sin embargo, muchas otras células también producen monocinas, tales como células eliminadoras naturales, fibroplastos, basofilos, neutrófilos, células endoteliales, astrocitos cerebrales, células estromales de médula ósea, queratinocitos epiderales y linfocitos B. Las linfocinas son referidas generalmente como que son producidas mediante células de linfocito. Ejemplos de citocina se incluyen, pero no están limitados a lnterleucina-1 (IL- ,j .£Í ^- ¿-.A^ibid-... 1), lnterleucina-6 (IL-6), lnterleucina-8 (IL-8), factor alfa de necrosis de tumor (TNF-a) y factor beta de necrosis de tumor (TNF-ß). Como se utiliza en la presente, el término "quimiocina" se refiere a cualquier polipétido secretado que afecta la función de células y es una molécula que modula interacciones entre células en la respuesta inmune, inflamatoria o ematopoiética, similar al término "citocina" anterior. Una quimiocina se secreta principalmente a través de transmembranas celulares y provoca la quimiotaxis y la activación de glóbulos blancos y leucocitos específicos, neutrófilos, monocitos, macrófagos, células T, células B, células endoteliales y células de músculo liso. Ejemplos de quimiocinas incluyen, pero no están limitados a IL-8, GROa, GROß, GRO?, NAP-2, ENA-78, IP-10, MIP-1a, MlP-ß, PF4, y MCP 1 , 2, y 3. Los compuestos de la presente también son útiles para normalizar conteos de leucocitos así como para normalizar niveles de quimiocinas circulantes. Con el fin de utilizar un compuesto de Fórmula (I) o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo en terapia, normalmente se formulará en una composición farmacéutica de acuerdo con la práctica farmacéutica estándar. Por lo tanto, esta invención también se refiere a una composición farmacéutica que consiste de una cantidad efectiva, no tóxica, de un compuesto de Fórmula (I) y un vehículo o diluyente aceptable farmacéuticamente.

Los compuestos de Fórmula (I), las sales aceptables farmacéuticamente del mismo y las composiciones farmacéuticas que los incorporan se pueden administrar de manera conveniente mediante cualquiera de las rutas que se utilizan de manera convencional para administración de 5 fármaco, por ejemplo, oralmente, tópicamente, de manera parenteral o mediante inhalación. Los compuestos de Fórmula (I) se pueden administrar en formas de dosificación convencional preparadas combinando un compuesto de Fórmula (I) con vehículos farmacéuticos estándar de acuerdo con procedimientos convencionales. Los compuestos de Fórmula (I) también se 10 pueden administrar en dosis convencionales en combinación con un segundo compuesto activo de manera terapéutica, conocido. Estos procedimientos pueden implicar mezclado, granulación y compresión o disolución de los ingredientes como sea adecuado para la preparación deseada. Se apreciará que la forma y carácter del vehículo o diluyente aceptable farmacéuticamente 15 se dicta por la cantidad de ingrediente activo con el cual se va a combinar, la ruta de administración y otras variables bien conocidas. El vehículo(s) debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial al receptor del mismo. El vehículo farmacéutico que se utiliza puede ser, por ejemplo, 20 un sólido o líquido. Los vehículos sólidos ilustrativos son lactosa, térra alba, sucrosa, talco, gelatina, agar, péctina, acacia, estearato de magnesio, ácido esteárico y similares. Los vehículos líquidos ilustrativos son melaza, aceite de cacahuate, aceite de oliva, agua y similares. De manera similar, el vehículo o diluyente puede incluir material de retraso de tiempo bien conocido en la técnica, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo sólo o con una cera. Se puede utilizar una amplia variedad de formas farmacéuticas. Por lo tanto, si se utiliza un vehículo sólido, la preparación se puede formar en tabletas, colocarse en una cápsula de gelatina dura en forma de polvo o pella o en forma de un trocisco o pastilla. La cantidad de vehículo sólido variará ampliamente pero preferiblemente será de 25 mg a aproximadamente 1g. Cuando se utiliza un vehículo líquido, la preparación estará en forma de un jarabe, emulsión, cápsula de gelatina blanda, líquido inyectable estéril tal como una ampolleta o suspensión líquida no acuosa. Los compuestos de Fórmula (I) se pueden administrar de manera tópica, es decir mediante administración no sistémica. Esto incluye la aplicación de un compuesto de Fórmula (I) de manera externa a la epidermis o la cavidad bucal y la instilación de dicho compuesto en el oído, ojo y nariz, de tal manera que el compuesto no entre de manera significante en el torrente sanguíneo. En contraste, la administración sistémica se refiere a la administración oral, intravenosa, intraperitoneal e intramuscular. Las formulaciones adecuadas para administración tópica incluyen preparaciones líquidas o semi-líquidas adecuadas para penetración a través de la piel al sitio de inflamación tales como linimentos, lociones, cremas, ungüentos, o pastas, y gotas adecuadas para la administración al ojo, oídos o nariz. El ingrediente activo puede consistir, para administración tópica, de 0.001 % a 10% p/p, por ejemplo de 1 % a 2% en peso de la formulación. Sin embargo puede consistir de tanto como 10% p/p pero preferiblemente consistirá de menos de 5% p/p, más preferiblemente de 0.1% a 1% p/p de la formulación. Las lociones de acuerdo con la presente invención incluyen aquellas adecuadas para aplicación a la piel u ojo. Una loción para ojos puede comprender una solución acuosa estéril que contiene opcionalmente un bactericida y se puede preparar mediante métodos similares a aquellos para la preparación de gotas. Las lociones o linimentos para aplicación a la piel también pueden incluir un agente para apresurar el secado y para enfriar la piel, tal como un alcohol o acetona, y/o un humectante tal como glicerol o un aceite tal como aceite de ricino o aceite de cacahuate. Las cremas, ungüentos o pastas de acuerdo con la presente invención son formulaciones semi-sólidas del ingrediente activo para aplicación externa. Se pueden elaborar mezclando el ingrediente activo en forma finamente dividida o en polvo, sólo o en solución o suspensión en un fluido acuoso o no acuoso, con la ayuda de maquinara adecuada, con una base grasosa o no grasosa. La base puede consistir de hidrocarburos tales como parafina dura, suave o líquida, glicerol, cera de abeja, un jabón metálico; un mucilago; un aceite de origen natural tal como aceite de almendra, de maíz, de cacahuate, de ricino o de oliva; grasa de lana o sus derivados o un ácido graso tal como ácido estérico u oleico junto con un alcohol tal como propilenglicol o un macrogel. La formulación puede incorporar cualquier agente activo de superficie adecuado tal como un agente tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico tal como un éster de sorbitán o un derivado de polioxietileno del mismo. Los agentes de suspensión tales como gomas naturales, derivados de celulosa o materiales inorgánicos tales como sílices silicaceas, y otros ingredientes tales como lanolina, también se pueden incluir. Las gotas de acuerdo con la presente ¡nvención pueden consistir de soluciones o suspensiones estériles acuosas u aceitosas y se pueden preparar disolviendo el ingrediente activo en una solución acuosa adecuada de un agente bactericida y/o fungicida y/o cualquier otro conservador adecuado, e incluyendo preferiblemente un agente activo de superficie. La solución resultante se puede aclarar entonces mediante filtración, transferirse a un envase adecuado el cual después se sella y se esteriliza mediante autoclave o mantenimiento a 98-100°C durante media hora. De manera alternativa, la solución se puede esterilizar mediante filtración y transferirse al envase mediante una técnica aséptica. Ejemplos de agentes bactericidas y fungicidas adecuados para inclusión en las gotas son nitrato o acetato fenilmercúrico (0.002%), cloruro de benzalconio (0.01 %) y acetato de clorhexidina (0.01 %). Los solventes adecuados para la preparación de una solución aceitosa incluyen glicerol, alcohol diluido y propilenglicol. Los compuestos de fórmula (I) se pueden administrar de manera parenteral, es decir mediante administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intranasal, intrarectal, intravaginal o intraperitoneal. Las formas subcutáneas e intramuscular de administración parenteral se prefieren en general. Las formas de dosificación adecuadas para dicha administración se pueden preparar mediante técnicas convencionales. Los compuestos de fórmula (I) también se pueden administrar mediante inhalación, es decir mediante administración de inhalación intranasal y oral. Las formas de dosificación adecuadas para dicha administración, tal como una formulación en aerosol o un inhalador de dosis medida, se pueden preparar mediante técnicas convencionales. Para todos los métodos de uso que se describen en la presente para los compuestos de fórmula (I), el régimen diario de dosificación oral será preferiblemente de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 80 mg/kg de peso coforal total. El régimen diario de dosificación parenteral de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 80 mg/kg de peso corporal. El régimen diario de dosificación tópica será preferiblemente de 0.1 mg a 150 mg, administrado de una a cuatro, preferiblemente de dos a tres veces al día. El régimen diario de dosificación por inhalación será preferiblemente de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg por día. También se reconocerá por un experto en la técnica que la cantidad y separación óptima de dosificaciones individuales de un compuesto de fórmula (I) o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo será determinada por la naturaleza y grado de la condición que se está tratando, la forma, ruta y sitio de administración, y el paciente particular que se está tratando, y que dichas cantidades óptimas se pueden determinar mediante técnicas convencionales. También será apreciado por un experto en la técnica que el curso óptimo de tratamiento, es decir, el número de dosis de un compuesto de fórmula (I) o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo dado por día para un número definido de días, se puede calcular por el experto en la técnica utilizando pruebas de determinación de curso de tratamiento convencionales. La invención se describirá enseguida mediante referencia a los siguientes ejemplos biológicos que son únicamente ilustrativos y no se deben considerar como una limitación del alcance de la presente invención.

EJEMPLOS BIOLÓGICOS Los efectos inhibidores de quimiocina de IL-8, y Gro-a de compuestos de la presente ¡nvención se determinaron mediante el siguiente ensayo in vitro: Ensayos de unión de receptor [125l] IL-8 (recombinante humano) se obtuvo de Amersham Corpo., Arlington Heignts, IL, con actividad específica de 2000 Ci/mmol. Gro-a se obtuvo de NEN-New England Nuclear. Todos los otros químicos fueron de grado analítico. Se expresaron altos niveles de receptores IL-8 tipo a y ß recombinante humano en células de ovario de hámster chino como se describe anteriormente (Holmes, et al., Science, 1991 , 253, 1278). Las membranas de ovario de hámster chino se homogeneizaron de acuerdo con un protocolo descrito anteriormente (Haour, et al., J Biol Chem., 249 pp 2195- 2205 (1974)). Excepto que el regulador de pH de homogeneización se cambió a 10mM Tris-HCL, 1 mM MgSO4, 0.5mM EDTA (ácido etilendiamintetraacético), I mMPMSF (fluoruro de a-toluensulfonilo), 0.5 mg/L Leupeptina, pH 7.5. La concentración de proteína de membrana se determinó 5 utilizando equipo de microensayo Pierce Co. utilizando albúmina de suero bovino como estándar. Todos los ensayos se realizaron en un formato de microplaca de 96 pozos. Cada mezcla de reacción contuvo 125l IL-8 (0.25 nM) o 125l Gro-a y 0.5 µg/mL de IL-8Ra o 1.0 ug/mL de IL-8Rß membranas en 20 mM Bis-Trispropano y 0.4 mM Tris HCl reguladores de pH, pH 8.0, que 10 contiene 1.2 mM MgSO4, 0.1 mM EDTA, 25 mM NaCI y 0.03% CHAPS. Además, se añadió fármaco o compuesto de interés el cual ha sido pre- d ¡suelto en DMSO como para alcanzar una concentración final de entre 0.01 nM y 100 uM. El ensayo se inició mediante la adición de 125l-IL-8. Después de 1 hora a temperatura ambiente la placa se cosechó utilizando un 15 cosechador Tomtec de 96 pozos en una estera de filtro de fibra de vidrio bloqueada con polietilenimina al 1%/0.5% BSA y se lavó 3 veces con 25 mM NaCI, 10 mM TrisHCI, 1 mM MgSO4, 0.5 mM EDTA, 0.03% CHAPS, pH 7.4. El filtro se secó entonces y se contó sobre el contador de escintilación de líquido Betaplate. El receptor de IL-8 Ra, recombinante o tipo I, también es referido 20 en la presente como el receptor no permisivo y el receptor de IL-8 Rß, recombinante, o tipo II, es referido como el receptor permisivo. Todos los compuestos ilustrados de fórmula (I) anotados en la presente en la sección de Química Sintética, ejemplos 1 a 15, demostraron un IC50 de aproximadamente 45 a aproximadamente <1 µg/mL en los modelos permisivos para inhibición de receptor de IL-8. De aquellos compuestos probados, los ejemplos 1 a 12 también se encontró que son inhibidores de unión de Gro-a a aproximadamente el mismo nivel. 5 Ensayo de quimiotaxis Las propiedades inhibidoras in vitro de estos compuestos se determinan en el ensayo de quimiotaxis de neutrófilo como se describe en Current Protocols in Immunology, vol I, Suppl 1 , Unit 6.12.3., cuya descripción 10 está incorporada a la presente por referencia en su totalidad. Los neutrófilos se aislaron a partir de sangre humana como se describe en Current Protocols in Immunology Vol I, Suppl 1 Unit 7.23.1 , cuya descripción está incorporada a la presente por referencia en su totalidad. Los quimioatrayentes IL-8, GRO- a, GRO-ß, GRO-? y NAP-2 se colocan en la cámara de fondo de una cámara de 15 48 pozos (Neuro Probé, Cabin John, MD) a una concentración entre 0.1 y 100 nM. Las dos cámaras están separadas por un filtro de policarbonato de 5um. Cuando se prueban los compuestos de esta invención, se mezclan con células (0.001-1000 nM) justo antes de la adición de las células a la cámara superior. La incubación se deja proceder durante entre 45 y 90 min a 20 aproximadamente 37°C en un incubador humidificado con 5% CO2. Al final del período de incubación, la membrana de policarbonato se remueve y el lado superior se lava, la membrana se entinta entonces utilizando el protocolo de tinción Diff Quick (Baxter Products, McGaw Park, IL, USA). Las células que se han quimiotaxado a la quimiocina se cuentan visualmente utilizando un microscopio. Generalmente, se cuentan cuatro campos para cada muestra, estos números se promedian para dar el número promedio de células que han emigrado. Cada muestra se prueba por triplicado y cada compuesto se repite 5 al menos cuatro veces. A ciertas células (células de control positivo) no se añade compuesto, estas células representan la respuesta máxima quimiotáctica de las células. En el caso en donde se desea un control negativo (no estimulado) no se añade quimiocina a la cámara de fondo. La diferencia entre el control positivo y el control negativo representa la actividad 10 quimiotáctica de las células.

Ensayo de liberación de elastasa Los compuestos de esta invención se prueban para su capacidad para evitar liberación de elastasa a partir de neutrófilos humanos. 15 Los neutrófilos se aislan a partir de sangre humana como se describe en Current Protocols in Immunology Vol I, Suppl 1 Unit 7.23.1. Células PMNs 0.88 x 106 suspendidas en solución de Ringer (NaCI 118, KCl 4.56, NaHCO3 25, KH2P04 1.03, Glucosa 11.1 , HEPES 5 mM, pH 7.4) se colocan en cada pozo de una placa de 96 pozos en un volumen de 50 ul. A esta placa se 20 añade el compuesto de prueba (0.001-1000 nM) en un volumen de 50 ul, Cytochlalasin B en un volumen de 50 ul (20 ug/ml) y regulador de pH de Ringers en un volumen de 50 ul. Estas células se dejan calentar (37 °C, 5% CO2, 95% RH) durante 5 minutos antes de añadir IL-8, GROa, GROß, GRO? o NAP-2 a una concentración final de 0.01-1000 nM. La reacción se deja proceder durante 45 minutos antes de que la placa de 96 pozos sea sometida a centrifugación (800 xg 5 min) y 100 ul del sobreflotante se remueven. Este sobreflotante se añade a una segunda placa de 96 pozos seguido por un substrato de elastasa artificial (MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC, Nova Biochem, La Jolla, CA) a una concentración final de 6 ug/ml disuelto en solución salina regulada de pH de fosfato. Inmediatamente, la placa se coloca en un lector de placas de 96 pozos fluorescente (Cytofluor 2350, Millipore, Bedford, MA) y los datos se recolectan a intervalos de 3 minutos de acuerdo con el método de Nakajima et al J. Biol Chem 254 4027 (1979). La cantidad de elastasa liberada desde los PMNs se calcula midiendo la velocidad de degradación de MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC.

TNF-a en ensayo de lesión cerebral traumática El ensayo presente provee el examen de la expresión de factor de necrosis de tumor de ARNm en regiones cerebrales específicas que siguen a la lesión cerebral traumática de percusión de fluido lateral (TBI) inducida de manera cerebral en ratas. Ratas adultas Sprague-Dawley (n = 42) son anestesiadas con pentobarbital de sodio (60 mg/kg, i.p.) y se someten a lesión cerebral de percusión de fluido lateral de severidad moderada (2.4 atm.) centrada sobre la corteza tempoparietal izquierda (n=18), o tratamiento "fingido" (anestesia y cirugía sin lesión n=18). Los animales se sacrifican mediante decapitación a 1, 6 y 24 h, después de la lesión, se remueven los cerebros, y se preparan muestras de tejido de la corteza parietal izquierda (lesionada) (LC), que corresponde al área de la corteza derecha contralateral (RC), corteza adyacente a la corteza parietal lesionada (LA), que corresponde al área adyacente en la corteza derecha (RA), hipocampo izquierdo (LH) e hipocampo derecho (RH). El ARN total se aisla y se realiza la hibridación Northern blot y se cuantifica con relación a un ARN de control positivo de TNF-a (macrófago = 100%). Un incremento marcado de expresión de ARNm de TNF-a se observa en LH (104+17% de control positivo, p<0.05 (comparado con fingido), LC(105±21%, p< 0.05) y LA (69±8%, p < 0.01 ) en el hemisferio traumatizado una hora después de la lesión. También se observa una expresión incrementada de ARNm de TNF-a en LH (46+8%, p < 0.05), LC (30+3%, p < 0.01 ) y LA (32+3%, p < 0.01 ) a 6 horas que se resuelve por 24 horas después de la lesión. En el hemisferio contralateral, la expresión de ARNm de TNF-a se incrementa en RH (46+2%, p < 0.01 ), RC (4±3%, y RA (22+8%) a 1 hora y en RH (28±11%), RC (7±5%) y RA (26±6%, P < 0.05) a 6 horas, pero no a 24 horas después de la lesión. En animales fingidos (cirugía sin lesión) u originales, no se observan cambios consistentes en expresión de ARNm de TNF-a en cualquiera de las 6 áreas cerebrales en cualquier hemisferio en ninguno de los tiempos. Estos resultados indican que después de la lesión cerebral de percusión de fluido parasagital, la expresión temporal de ARNm de TNF-a se altera en regiones cerebrales específicas, incluyendo aquellas del hemisferio no traumatizado. Debido a que TNF-a puede inducir factor de crecimiento de nervio (NGF) y estimular la liberación de otras citocinas a partir de astrocistos activados, esta alteración post-traumática en expresión de gen de TNF-a juega un papel importante en la respuesta aguda y regenerativa de trauma de CNS. 5 Modelo de lesión de CNS para ARNm de 1 ß (IL-1 ß) Este ensayo caracteriza la expresión regional de ARNm de interleukin-1ß (IL-1ß) en regiones cerebrales específicas siguiendo la lesión cerebral traumática de percusión de fluido lateral experimental (TBI) en ratas. Ratas adultas Sprague-Dawley (n=42) son anestesiadas con pentobarbital de 10 sodio (60 mg/kg, i.p.) y se someten a lesión cerebral de percusión de fluido lateral de severidad moderada (2.4 atm.) centrada sobre la corteza tempoparietal izquierda (n=18), o tratamiento "fingido" (anestesia y cirugía sin lesión). Los animales se sacrifican a 1 , 6 y 24 h después de la lesión, los cerebros se remueven y se preparan muestras de tejido de la corteza pariental 15 izquierda (lesionada) (LC), el área que corresponde en la corteza derecha contra lateral (RC), la corteza adyacente a la corteza parietal lesionada (LA), que corresponde al área adyacente en la corteza derecha (RA), hipocampo izquierdo (LH) e hipocampo derecho (RH). El ARN total se aisla y realiza la hibridación Northern blot y la cantidad de tejido cerebral de ARNm de IL-1 ß se 20 presenta como porcentaje de radioactividad relativa de IL-1ß positivo de macrófago de ARN que se cargo en el mismo gel. A 1 hora después de la lesión cerebral, se observa un incremento marcado y significante en la expresión de ARNm de IL-1ß en LC (20.0±0.7% de control positivo, n=6, p < 0.05 comparado con animal fingido) LH (24.5+0.9%, p < 0.05) y LA (21.5±3.1% p < 0.05) en el hemisferio lesionado, que permanece elevado hasta 6 horas después de la lesión en el LC (4.0±0.4%, n=6, p < 0.05) y LH (5.0±1.3% p < 0.05). En animales fingidos u originales, no se observa 5 expresión de ARNm de IL-1ß en cualquiera de las áreas cerebrales respectivas. Estos resultados indican que después de TBI la expresión temporal de ARNm de IL-1ß se estimula de manera regional en regiones cerebrales específicas. Estos cambios regionales en citocinas, tales como IL- 1 ß, juegan un papel en el post-traumático. 10 Todas las publicaciones, incluyendo pero no limitado a patentes y solicitudes de patente, citadas en esta especificación están incorporadas a la presente por referencia como si cada publicación individual estuviese indicada de manera específica e individual para estar incorporada por referencia a la presente como se expone por completo. 15 La descripción anterior divulga completamente la invención ? incluyendo modalidades preferidas de la misma. Las modificaciones y mejoras f de las modalidades que se divulgan de manera específica en la presente están dentro del alcance de la siguientes reivindicaciones. Sin explicación adicional, se cree que un experto en área puede, utilizando la descripción 20 precedente, utilizar la presente invención a su alcance más completo. Por lo tanto los ejemplos en la presente se deben considerar como únicamente ilustrativos y no una limitación del alcance de la presente invención en ninguna manera. Las modalidades de la invención en la cual se reivindica propiedad o privilegio exclusivo de definen de la siguiente manera. * •> i A?A. zé,.dááAi .i,

Claims (5)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto de la fórmula: (I) en la cual: R se selecciona del grupo que consiste de OH, SH, y NHS?2R ', R se selecciona del grupo que consiste de NRßR7, alquilo, arilalquilo de C1-4, arilalquenilo de C2-4, heteroarilo, heteroarilalquilo de C1-4, heteroarilalquenilo de C2-4. heterocíclico, y alquilo heterocíclico de C1-4, en el cual los anillos arilo, heteroarilo y heterocíclico están todos opcionalmente substituidos; Re y R7 son de manera independientemente hidrógeno, o un grupo alquilo de C1-4, o Rß y R7 juntos con el nitrógeno al cual están adheridos forman un anillo de 5 a 7 miembros cuyo anillo contiene de manera opcional un heteroátomo adicional que se selecciona a partir de oxígeno, nitrógeno o azufre y cuyo anillo puede estar opcionalmente sustituido; R1 se selecciona de manera independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, nitro, ciano, alquilo de C1-10 sustituido por halógeno, alquilo de C1-10, alquenilo ÍAÍ A¿A Jt •.JÍA.ÍA?AAAA,. de C

2.?o, alcoxi de C-MO, alcoxi de C1.10 substituido por halógeno, azida, (CR8R8)qS(0)tR4, hidroxi, hidroxialquilo de C-M, arilo, arilalquilo de C1-4, ariloxi, arilalquiloxi de C1-4, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterocíclico, alquilo heterocíclico de C- ; heteroarilalquiloxi de CM, arilalquenilo de C2.-?o, 5 heteroarilalquenilo de C2-10, alquenilo heterocíclico de C2.?0, (CR8R8)qNR4R5, alquenilo de C- O C(O)NR4R5, (CR8Rs)q C(O)NR4R?o, S(O)3H, S(0)3R8, (CRßR8)q C(O)Rn, alquenilo de C2-10 C(0)Rn, alquenilo de C2-10 C(O)ORn (CR8R8)q C(O)OR12, (CR8R8)q OC(O)Rn, (CR8R8)qNR4C(0)Rn, (CR8R8)NHS(O)2R17, (CR8Rs)q NHS(O)2R?7, (CR8R8)qS(O)2NR4R5; o dos 10 porciones R-i juntas forman O-(CH2)sO- o un anillo insaturado de 5 a 6 miembros; q es 0, o un entero que tiene un valor de 1 a 10; t es 0, o un entero que tiene un valor de 1 o 2; s es un entero que tiene un valor de 1 a 3; R4 y R5 se seleccionan de manera independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de CM opcionalmente substituido, arilo opcionalmente 15 sustituido, arilalquilo de CM opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterarilalquilo de CM opcionalmente sustituido, heterocíclico, y alquilo heterocíclico de CM, o R4 o R5 juntos con el hidrógeno al cual están adheridos forman un anillo de 5 a 7 miembros que consiste opcionalmente de un heteroátomo adicional seleccionado a partir de oxígeno, 20 nitrógeno o azufre; Y se selecciona de manera independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, nitro, ciano, alquilo de C-MO sustituido por halógeno, alquilo de C1-10, alquenilo de C2-10, alcoxi de C-MO, alcoxi de C-MO substituido por halógeno, azida, hidroxi, hidroxialquilo de C-i. 4, arilo, arilalquilo de CM, ariloxi, arilalquiloxi de CM, heteroarilo, heteroarilalquilo, heteroarilalquiloxi de CM, heterocíclico, alquilo heterocíclico de CM; arilalquenilo de C2_?o, heteroarilalquenilo de C2-10. alquenilo heterocíclico de C2.10, (CR8R8)qNR4R5, alquenilo de d-10 C(O)NR4R5, (CRsRs)q C(0)NR4R?o, S(O)3H, S(O)3R8, (CR8R8)qC(O)Rn, alquenilo de C2-10 C(0)Rn, alquenilo de C2-10 C(0)ORn, C(0)ORn, (CR8R8)qC(O)OR12, (CR8R8)qOC(O)Rn, (CR8R8)qNR4C(O)R??, (CR8R8)NHS(O)2Rd, y (CR8R8)qS(O)2NR4R5; o dos porciones Y juntas forman O-(CH2)sO- o un anillo insaturado de 5 a 6 miembros; n es un entero que tiene un valor de 1 a 5; m es un entero que tiene un valor de 1 a 4; Rs es hidrógeno o alquilo de C1-4; R10 es alquilo de C1.-10 C(O)2Rs; R-n se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de CM, arilo opcionalmente sustituido, arilalquilo de CM opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heteroarilalquilo de CM, opcionalmente sustituido, heterocíclico opcionalmente sustituido y alquilo heterocíclico de C opcionalmente sustituido; R-?2 se selecciona de hidrógeno, alquilo de C?.o,arilo opcionalmente sustituido y arilalquilo opcionalmente sustituido; y R17 se selecciona del grupo que consiste de alquilo de CM, arilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroarilo, heteroarilalquilo de CM, heterocíclico, y alquilo heterocíclico de CM, en el cual los anillos arilo, heteroarilo y heterocíclico están todos opcionalmente sustituidos. 2.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , seleccionado del grupo que consiste de: 1 ) 3-(4-Ciano-2-hidroxianilino)-4-(2- bromoanilino)-ciclobut-3-ene-1 ,2-diona; 2) 3-(4-Ciano-2-hidroxianilino)-4-(2- cloroanilino)-ciclobut-3-ene-1 ,2-diona; 3) 3-(4-Ciano-2-hidroxianilino)-4-(2,3- dicloroaniiino)-ciclobut-3-ene-1 ,2-diona; 4) 3-(4-Nitro-2-hidroxianilino)-4-(2- bromoanilino)-ciclobut-3-ene-1 ,2-diona; y 5) 3-(4-cloro-2-hidroxianilino)-4-(2- 5 bromoanilino)-ciclobut-3-ene-1 ,2-diona.

3.- Una composición farmacéutica que consiste de una cantidad efectiva de un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , y un vehículo o diluyente aceptable farmacéuticamente.

4.- El uso de un compuesto de la fórmula de conformidad con la 10 reivindicación 1 , para la fabricación de un medicamento para mediar un estado de enfermedad mediado por quimiocina, en donde la quimiocina se une a un receptor de IL-8 a o ß en un mamífero.

5.- El uso como se reclama en la reivindicación 4, en donde el mamífero está afligido con una enfermedad mediada por quimiocina se 15 seleccionada del grupo que consiste de psoriasis, dermatitis atópica, osteoartritis, artritis reumatoide, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, síndrome de tensión respiratoria en adulto, enfermedad de intestino inflamatoria, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, accidente cerebro vascular, choque séptico, esclerosis múltiple, choque endotóxico, sepsis Gram 20 negativa, síndrome de choque tóxico, lesión de reperfusión cardiaca y renal, glomerulonefritis, trombosis, reacción de injerto contra hospedero, enfermedad de Alzheimer, rechazos de aloinjerto, malaria, restenosis, angiógenes, aterosclerosis, osteoporosis, gingivitis y liberación indeseada de células de tallo hematopoiético y enfermedades provocadas por virus respiratorias, virus de herpes, virus de hepatitis, meningitis, fibrosis cística, trabajo de pre- término, tos, prurito, disfunción de órganos múltiples, traumas, tensiones, esguinces, contusiones, artritis psoriática, herpes, encefalitis, vasculitis de 5 CNS, lesión de cerebro traumática, tumores de CNS, hemorragia subaracnoide, trauma post-quirúrgico, pneumonitis intersticial, hipersensibilidad, artritis inducida por cristal, pancreatitis aguda y crónica, hepatitis alcohólica aguda, enterocolitis necrotizante, sinuositis crónica, uveitis, polimiositis, vasculitis, acné, úlceras gástricas y duodenales, 10 enfermedad celiaca, esofagitis, glositis, obstrucción de flujo de aire, hiperresponsividad de conducto de aire, bronchiolitis obliterans que organiza neumonía, bronquiectasis, bronquiolitis, bronquiolitis obliterante, bronquitis crónica, cor pulmonae, dispnea, enfisema, hipercapnea, hiperinflación, hipoxemia, inflamaciones inducidas por hiperoxia, hipoxia, reducción 15 quirúrgica de volumen de pulmón, fibrosis pulmonar, hipertensión pulmonar, hipertrofia ventricular derecha, sarcoidosis, enfermedad de conducto de aire t pequeño, desequilibrio de ventilación-perfusión, jadeo, resfríos y lupus.