LA TIMOSINA ß4 PROMUEVE LA CURACIÓN DE HERIDAS
Declaración Respecto a Investigaciones Patrocinadas por el Gobierno Federal de los Estados Unidos Esta invención se hizo en parte con fondos de los Institutos Nacionales de Salud, Programa Intramuros. El gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en esta invención. Campo técnico de la Invención La presente invención se refiere en general a la reparación del tejido, y más específicamente a métodos para sanar heridas utilizando timosina ß4. Antecedentes de la Invención Los métodos y composiciones inadecuados para sanar efectivamente las heridas crónicas son un problema significativo en el cuidado de la salud. Un sanado de heridas deteriorado incrementa las oportunidades de mortalidad y morbidez. Este problema es especialmente prominente en los pacientes con diabetes, quienes desarrollan severas heridas que amenazan la vida en las extremidades del cuerpo. Las úlceras diabéticas cróniccis de los pies con frecuencia conducen a amputaciones. Estas heridas con frecuencia son el resultado de una mala circulación derivada de las células insulina-comprometidas de los pacientes diabéticos, así como de una vascularización deteriorada del lecho de la herida, una infiltración reducida de las células que luchan contra los gérmenes, y una epitelialización reducida del tejido. Como resultado, la mayoría de las terapias actuales incluyen intentos por re-vascularizar el lecho de la herida y prevenir la infección. Las heridas en los tejidos no comprometidos sufren una serie compleja y ordenada de eventos para reparar el tejido. La serie de eventos puede incluir infiltración de las células inmunes, como parte del proceso para remover y destruir el tejido necrótico, mayor vascularización por los factores angiogénicos, y menor proliferación celular y depósito de matriz extra-celular. Aunque el proceso básico de reparación del tejido ya se ha caracterizado, no se entienden bien los pasos individuales y los factores necesarios para llevar a cabo esta compleja serie de eventos,. La identificación de los pasos y factores individuales podría conducir a métodos mejorados para el tratamiento de enfermedades resultantes de los procesos inadecuados de reparación de heridas. Los estudios anteriores han utilizado el ensayo de cierre de herida "rascada" para evaluar los efectos potenciales de un agente sobre la migración celular in vi tro . Aunque es informativa, esta prueba no imita las condiciones de sanado de heridas dinámicas en vivo hasta el grado en que no todos los factores involucrados en el cierre de heridas están presentes en el ensayo in vi tro . Por esta razón, se han desarrollado sistemas en vivo para evaluar la capacidad de un agente o factor para modular las actividades de sanado de heridas . Utilizando estos tipos de modelos in vi tro, se han reconocido un número de factores de crecimiento específicos por su efecto sobre la angiogénesis . Uno de estos factores de crecimiento es el TGF-ß. Esta familia de proteínas diméricas incluye TGF-ßl, TGF-ß2, TGF-ß3, TGF-ß4 y TGF-ß5, que regulan el crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células. Esta familici de proteínas exhibe un rango de efectos biológicos, desde estimular el crecimiento de algunos tipos de células (Noda y colaboradores (1989) Endocrinology, 124:2991-2995), hasta inhibir el crecimiento de otros tipos de células (Goey y colaboradores (1989), J". Immunol . , 143:877-880; Pietenpol y colaboradores (1990), Proc . Nat ' l . Acad. Sci . USA, 87:3758-3762). También se ha demostrado que el TGF-ß incrementa la expresión de las proteínas de matriz extra-celular, incluyendo el colágeno y la fibronectina (Ignotz y colaboradores, 1986), J. Biol . Chem . , 261:4337-4345) y acelera el sanado de heridas (Mustoe y colaboradores (1987) , Science, 237:1333-1335). Otro factor de crecimiento reconocido por su efecto sobre la angiogénesis, es el Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF) . Originalmente se descubrió que el PDGF es un potente mitógeno para las células derivadas del mesénquima (Ross R. y colaboradores (1974), Proc Nat ' l Acad Sci USA 71(4):1207-1210; Kohler N. y colaboradores (1974), Exp . Cell Res . 87:297-301) . Los estudios adicionales han demostrado que el PDGF incrementa el índice de celularidad y granulación en la formación del tejido. Las heridas tratadas con PDGF tienen la apariencia de una respuesta inflamatoria de etapa temprana, incluyendo un increme'nto en los tipos de células de neutrófilos y macrófagos en el sitio de la herida. Estas heridas también muestran una mejor función de fibroblastos (Pierce, GF y colaboradores (1988) , J. Exp . Med. 167:974-987) . Tanto el PDGF como el TGFßß han demostrado incrementar la formación de colágeno, el contenido de ADN y los niveles de proteína en estudios animales. (Grotendorst , GR y colaboradores (1985), J". Clin . Invest . 76:2323-2329; Sporm, MB y colaboradores (1983), Science 219:1329) . Se ha demostrado que el efecto del PDGF en el sanado de heridas es efectivo en las heridas; humanas . En las heridas humanas , se incrementa la expresión de PDGF-AA adentro de las úlceras de presión que se someten a sanado. El incremento de PDGF-AA corresponde a un incremento en fibroblastos activados, depósito de matriz extra-celulaz-, y vascularización activa de la herida. Además, este increme¡nto en el PDGF-AA no se ve en las heridas crónicas que no sanan. Un número de otros factores de crecimiento que tienen la capacidad para inducir la angiogénesis y el sanado de heridas incluyen el Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) , Factor de Crecimiento de Queratinocitos (KGF) , y Factor de Crecimiento de Fibroblastos básico (bFGF) . Sin embargo, la mayoría de estos factores de crecimien-to y angiogénicos tienen efectos secundarios. De conformidad con lo anterior, existe una necesidad de factores adicionales útiles para promover la reparación de heridas. Compendio de la Invención La presente invención se basa en el descubrimiento de que la timosina ß4 (Tß4) acelera el sanado de heridas, y estimula la reparación de heridas. Basándose en este descubrimiento, ahora es posible desarrollar métodos para acelerar el sanado de heridas en sujeitos que tengan heridas que necesiten dicho tratamiento. En una primera modalidad, la invención proporciona un método para promover la reparación de heridas en un sujeto que necesite este tratamiento, mediante la administración al sujeto, en contacto con el sitio de la herida, de una cantidad sanadora de heridas efectiva de una composición que contenga un polipépti-do saneLdor de heridas que comprenda la secuencia de aminoácidos LKKTET, y sus variantes conservadoras que tengan actividad sanadora de heridas. En un aspecto del método, el polipéptido sanador de heridas es Tß4 o una isoforma de Tß4. En otra modalidad, la invención proporciona un método para promover la reparación del tejido en un tejido que necesite dicho tratamiento, poniendo en contacto el tejido con una cantida.d efectiva de una composición que contenga un polipéptido sanador de heridas que comprenda la secuencia de aminoácidos LKKTET, y sus variantes conservadoras que tengan actividad sanadora de heridas, o ácido nucleico que codifique un polipépti-do sanador de heridas. En un aspecto del método, un péptido sanador de heridas es Tß4 o una isoforma de Tß4. El tejido se puede poner en contacto in vivo o ex vivo . En todavía otra modalidad, la invención proporciona un método para modular la reparación de heridas en un sujeto que necesite dicho tratamiento, mediante el suministro sistémico de una cantidad sanadora de heridas efectiva de un polipéptido sanador de heridas que comprenda la secuencia de aminoácidos LKKTET y sus varianted conservadoras que tengan actividad sanadora de heridas. En un aspecto del método, un péptido sanador de heridas es Tß4 o una isoforma de Tß4. En todavía otra modalidad, la presente invención proporciona un método para estimular la migración de las células epiteliales en el sitio de una herida, poniendo en contacto la herida con una cantidad efectiva de un polipéptido Tß4. En otra modalidad, la invención proporciona un método para diagnosticar una condición patológica en un sujeto, caracterizado por un desorden de sanado de heridas asociado con Tß4, incluyendo obtener una muestra de la que se sospeche que contenga Tß4 del sujeto, detectar un nivel de Tß4 en la muestra, y comparar el nivel de Tß4 con el nivel encontrado en una muestra normal (es decir, una muestra estándar) . En otra modalidad, la invención proporciona un método para aminorar un desorden de sanado de heridas asociado con Tß4, incluyendo tratar a un sujeto que tenga el desorden, con una composición que module la actividad de Tß4 o la actividad de una isoforma de Tß4. En todavía otra modalidad, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido sanador de heridas que comprende la secuencia de aminoácidos LKKTET, y sus variantes conservadoras que tengan actividad sanadora de heridas, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, el polipéptido sanador de heridas es Tß4 o una isoforma de Tß4. Los detalles de una o más modalidades de la invención se estipulan en los dibujos acompañantes y en la siguiente descripción. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la descripción y de los dibujos, y a partir de las reivindicaciones. Descripción de los Dibujos La Figura 1 es un dibujo esquemático de una herida. La Figura 2 es una gráfica de barras que muestra el efecto del suministro tópico y sistémico de Tß4 sobre el ancho de una herida perforada, comparándose con el control. (A) Se realizó el suministro tópico de 5 microgramos/50 microlitros en tres de las seis heridas en cada animal en el día de la herida, y a las 48 horas después de la herida. (B) Se hicieron inyecciones intra-peritoneales de 60 microgramos/300 microlitros en el día de la herida, y después cada tercer día. Los animales de control se trataron similarmente con suero. Las mediciones se expresetn como el porcentaje promedio de reducción + SEM. La Figura 3 es una gráfica de barras que muestra el efecto del suministro tópico y sistémico de Tß4 sobre el hueco de una herida perforada, comparándose con el control. (A) Se realizó el suministro tópico de 5 microgramos/50 microlitros en el día de la herida, y 48 horas después de la herida. (B) Se hicieron inyecciones intra-peritoneales de 60 microgramos/300 microlitros en el día de la herida, y después cada tercer día. Las mediciones se expresan como el porcentaje promedio de reducción + SEM. La Figura 4 es una sección histológica, teñida con H&E, que demuestra la apariencia de las heridas de control y tratadas con timosina ß4 en una baja amplificación y en una amplificación más alta. Las heridas son desde el día 7, como se describe en la leyendci de la Figura 2. Las flechas indican las orillas de la herida original. (A) Herida de control tratada con suero. La migración del epitelio es visible en las orillas de la herida, y se pueden ver los desechos sobre la herida no sanada. (B) Se presentó una mayor re-epitelialización de la herida cuando se inyectó Tß4 intra-peritonealmente (60 microgramos/300 microlitros en días alternados) . (C) El tratamiento tópico (50 microgramos/50 microlitros de Tß4) dio como resultado una re-epitelialización completa de la epidermis de la herida. Las áreas en cuadros son la localización de los campos de amplificación más alta (D-F) . (D-F) Dermis cerca de la unión dérmica y epidérmica. (D) Control que muestra pocas células cerca de la dermis y poca neovasculari-zación. (E) y (F) Dermis que muestra tejido de granulación infiltrado con fibroblastos, y extensa neo-vascularización (puntas de flecha) . (E) El tratamiento intra-peritoneal, y (F) la aplicación tópica, dieron ambos como resultado capilares nuevos significativos. (Barra de escala = 1 milímetro) . La Figura 5 muestra secciones histológicas de las heridas en el día 7, que muestran depósito/acumulación de colágeno. El teñido con tricromo de Masson muestra colágeno y células endoteliales . (A) Vista de baja amplificación de una herida de control tratada con suero. (B) y (C) Vistas de baja amplificación de heridas en donde se inyectó Tß4 intra-perito-nealmente (B) , o se aplicó tópicamente (A) . Las áreas en cuadros son la localización de los campos de amplificación más alta (D-F) . Las flechas indican las orillas de la herida original. (D) Herida de control con una amplificación más alta, mostrando la acumula.ción de colágeno de la línea base. El tratamiento intra-peritonealmente (E) o (F) tópicamente dio como resultado una mejor producción/acumulación de colágeno, comparándose con las heridas tratadas con suero. (Barra de escala = 1 milímetro) . La Figura 6 muestra la migración de queratinocitos estimulada por Tß4 en los ensayos de cámara de Boyden. (A) Tß4 en las cavidades inferiores de la cámara dio como resultado un increme:nto de 2 a 3 veces en la migración sobre los filtros recubie¡rtos con colágeno IV. El control positivo, un medio acondicionado, también mostró una mayor migración sobre el medio solamente . La Figura 7 muestra una gráfica que demuestra la migración de las células epiteliales córneas en diferentes concentraciones de Tß4. La Figura 8 muestra una gráfica que representa la re-epitelialización córnea en córneas de rata en la presencia y en ausencia de Tß4. La Figura 9 muestra una gráfica que representa la re-epitelialización córnea en la presencia y en ausencia de diferertes concentraciones de Tß4. La Figura 10 muestra una secuencia de aminoácidos de Tß4. La Figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos de varias isoformas conocidas de Tß4, y su distribución filogenéti-ca. La acetilación N-terminal se indica por "ac". Se piensa que los residuos entre 13 y 24 son importantes para el enlace de actina. Descripción Detallada de la Invención Inicialmente se identificó la timosina ß4 como una proteína que se regula hacia arriba durante la migración y diferenciación de células in vi tro . La timosina ß4 originalmente se aisló a partir del timo, y es un polipéptido ubíquito de 4.9 kDa, de 43 aminoácidos, identificado en una variedad de tejidos. Se han adscrito varios papeles a esta proteína, incluyendo un papel en la diferenciación y migración de las células endotelia-les, en la diferenciación de las células T, en el secuestro de actina, y en la vascularización. Una actividad biológica de la tirnosina ß4 (Tß4) , como se muestra en la presente, efectúa la reparación del tejido y el sanado de heridas. Otra actividad de la Tß4 es una actividad anti-inflamatoria. La presente invención resultó de la investigación de los efectos de Tß4 sobre el sanado de heridas. Los resultados en vivo han demostrado que el suministro tópico y sistémico de Tß4 promueve el sanado de heridas. Los experimentos adicionales demostraron que las heridas tratadas con Tß4 tienen un mayor depósito de matriz extra-celular en el lecho de la herida. La presente invención identifica la Tß4 como un factor activo para promover el cierre de la herida y la reparación del tejido en vivo, así como para incrementar la migración de las células epiteliales. La administración en vivo de Tß4 indica que la migración celular, la angiogénesis, y el depósito de matriz extra-celular son estimulados en o arriba de los niveles observados para la migración, angiogénesis y depósito de matriz en los animales de control . La Tß4 promueve el cierre de la herida cuando se administra sistémicamente (por ejemplo, intraperitonealmente) , y tópicamente en los modelos animales heridos. También se observaron mayores niveles de colágeno en las heridas tratadas, mostrando que el tratamiento con Tß4 también puede acelerar la contracción de la herida, y estimular el proceso de sanado . Los métodos de la invención resultan de la identificación del efecto de Tß4 sobre el sanado de heridas. En vivo, la Tß4 estimula el sanado de heridas en una. herida perforada a todo el espesor (ver el Ejemplo 1) , y en la reparación de las heridas relacionadas con los ojos (Ejemplo 4) . Cuando se dio tópicamente o sistémicamente (por ejemplo, intra-peritonealmente) , la Tß4 aceleró el cierre y el sanado de las heridas (ver los Ejemplos 1, 4 y 5) . Promoción de Regeneración del Tejido En una modalidad, la invención proporciona un método para acelerar el sanado de heridas en un sujeto, poniendo en contacto una herida con una cantidad efectiva sanadora de heridas de una composición que contenga Tß4 o una isoforma de Tß4. El contacto puede ser tópico o sistémico. Los ejemplos de la administración tópica incluyen, por ejemplo, poner en contacto la herida con una loción, pomada, gel, crema, pasta, rocío, suspensión, dispersión, hidrogel, ungüento, o aceite que comprenda Tß4. La administración sistémica incluye, por ejemplo, inyecciones intra-venosas, intra-peritoneales e intra-musculares de una composición que contenga Tß4 o una isoforma de Tß4. Un sujeto puede ser cualquier mamífero, de preferencia un ser humano , En adición, la Tß4 o una isoforma de Tß4 es terapéuti-camente valiosa en los casos en donde haya un proceso de sanado de heridas deteriorado, tal como en los sujetos que tienen compronetido el sanado de heridas. "Sanado de heridas comprometido" significa los sujetos que tienen una incapacidad reducida o disminuida para recuperarse de una herida o trauma, debido a herida o trauma recurrente, o a una incapacidad del sistema natura!, del sujeto para efectuar apropiadamente el sanado de heridas. Por ejemplo, los esteroides reducen la capacidad de un sujeto para sanar, comparándose con un sujeto que no use esteroides. Otras heridas presentes en los sujetos comprometidos incluyen, pero no se limitan a, heridas de la piel, tales como úlceras diabéticas, úlceras venosas o úlceras por presión. Adicionalmente, la Tß4 o una isoforma de Tß4 es terapéuticamente valiosa para aumentar el proceso de sanado normal. Como se utiliza en la presente, una "cantidad sanadora de heridas efectiva" de una composición que contenga Tß4 o una isoforma de Tß4 para utilizarse en el sanado de heridas, se define como la cantidad que sea efectiva para promover la regeneración y reparación del tejido. La "cantidad sanadora de heridas efectiva" puede ser la cantidad terapéuticamente efectiva. Las enfermedades, desórdenes o malestares posiblemente modulados por Tß4 o una isoforma de Tß4 incluyen reparación del tejido subsecuente a lesiones traumáticas, o condiciones que incluyan artritis, osteoporosis y otros desórdenes músculo-esqueléticos, quemaduras, úlceras y otras lesiones de la piel, enfermedad neurológica y nerviosa y enfermedades cardiovascula- res, incluyendo isquemia y ateroesclerosis . Otros tejidos potenciales que pueden ser tratados mediante los métodos y composiciones de la invención incluyen los tejidos epidérmico, del ojo, urogenital, gastrointestinal, cardiovascular, muscular, conectivo y neural . El término "inducir", "inducción" o "efecto", como se utiliza en la presente, se refiere a la activación, estímulo, mejora, inicio y/o mantenimiento de los mecanismos o procesos celulares necesarios para la formación de un tejido o una porción del mismo, el proceso de reparación, o el desarrollo del tejido como se describe en la presente. Modulación del Sanado de Heridas El sanado de heridas, la regeneración del tejido, y la reparación del tejido resultan de un complejo proceso que incluye la proliferación y migración de las células inflamatorias, las células endoteliales, las células estromales, y las células de parénquima, el depósito de los materiales de matriz extra-celular, y el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, particularmente capilares. Este complejo proceso tiene un papel crucial en funciones benéficas, tales como la embriogénesis, el ciclo reproductor femenino, así como en las funciones anormales, tales como artritis, ulceraciones crónicas y enfermedades neurodegenerativas . En otra modalidad, la invención proporciona un método para modular el sanado de heridas en un sujeto o en un tejido, incluyendo poner en contacto al sujeto o al tejido con una cantidad sanadora de heridas efectiva de una composición que contenga Tß4 o una isoforma de Tß4. Se prevé que la Tß4 o una isoforma de Tß4 se puede administrar tópicamente o sistémicamente para prevenir o tratar un tejido dañado, incluyendo, por ejemplo, los tejidos dañados debido a isquemia, incluyendo cerebro isquémico, enfermedad ósea y del corazón, daño al tejido córneo o retinal del ojo, y daño al tejido epitelial, incluyendo la piel . En adición, el método de la invención es útil para promove;r el sanado de heridas en tejidos, mediante la promoción de angiogénesis en el tejido privado de un flujo sanguíneo adecuado. Por ejemplo, una composición que contenga Tß4 puede promove:r el sanado de úlceras crónicas mediante el incremento del suministro sanguíneo al sitio del tejido, así como el incremento de la migración de queratinocitos para cerrar una herida. Se han identificado las isoformas de Tß4, y tienen aproximadamente el 70 por ciento, o aproximadamente el 75 por ciento, o aproximadamente el 80 por ciento o más homología con la secuencia de aminoácidos de Tß4 estipulada en la Figura 10. Estas isoformas incluyen, por ejemplo, Tß4ala, Tß9, TßlO, Tßll, Tßl2, Tßl3, Tßl4 y Tßl5 (Figura 11; ver también, Mihelic y colaboradores (1994), Amino Acids, 6:1-13, que describe la secuencia de aminoácidos de otras isoformas de Tß4 y se incorpora a la presente como referencia). De una manera similar a Tß4, se ha demostrado que las isoformas TßlO y Tßl5 secuestran la actina.
Tß4, TßlO y Tßl5, así como estas otras isoformas, comparten una secuencia de aminoácidos, LKKTET, que parece estar involucrada en la mediación del secuestro o enlace de actina. Aunque no deseamos obligarnos por ninguna teoría en particular, la actividad sanadora de heridas de Tß4 y de las isoformas de Tß4, se puede deber en parte a la capacidad para polimerizar la actina. Por ejemplo, Tß4 puede modular la polimerización de actina en heridas para promover el sanado (por ejemplo, las ß-timosinas parecen despolimerizar la F-actina mediante el secuestro de la G-actina libre) . La capacidad de Tß4 para modular la polimerización de actina, por consiguiente, se puede deber total o parcialmente a su capacidad para enlazarse con, o secuestrar la actina por medio de la secuencia LKKTET. Por consiguiente, como con la Tß4, otras proteínas que se enlacen con o secuestren la actina, o modulen la polimerización de actina, incluyendo las isoformas de Tß4 que tengan la secuencia de aminoácidos LKKTET, tienen posibilidades de promover el sanado de heridas solas, o en una combinación con Tß4, como se estipula en la presente. Por consiguiente, se contempla específicamente que las isoformas de Tß4 conocidas, tales como Tß4ala, Tß9, TßlO, Tßll, Tßl2, Tßl3, Tßl4 y Tßl5, así como las isoformas de Tß4 todavía no identificadas, serán útiles en los métodos de la invención. Debido a que tales isoformas de Tß4 son útiles en los métodos de la invención, incluyendo los métodos practicados en un sujeto, por cor.siguiente, la invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden las isoformas de Tß4 : Tß4ala, Tß9, TßlO, Tßll, Tßl2, Tßl3, Tßl4 y Tßl5, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En adición, de una manera similar, en los métodos de la invención se pueden emplear otras proteínas que tengan capacidad de secuestro o enlace de actina, o que puedan movilizar la actina o modular la polimerización de actina, como se demuestra en un ensayo apropiado de secuestro, enlace, movilización o polimerización, o identificadas por la presencia de una secuencia de aminoácidos que medie el enlace de actina, tales como LKKTET, por ejemplo. Estas proteínas incluyen gelsolina, proteína de enlace de vitamina D (DBP), profilina, cofilina, depactina, Dnasel, vilina, fragmina, severina, proteína de tapa, ß-actinina y acumentina, por ejemplo. Debido a que estos métodos incluyen los practicados en un sujeto, la invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden gelsolina, proteína de enlace de vitamina D (DBP) , profilina, cofilina, depactina, Dnasel, vilina, fragmina, severina, proteína de tapa, ß-actinina y acumentina, como se estipulan en la presente. Por lo tanto, la invención incluye el uso del polipéptido sanador de heridas que comprende la secuencia de aminoácidos LKKTET y sus variantes conservadoras . Como se utiliza en la presente, el término "variante conservadora" o las variaciones gramaticales del mismo, denota el reemplcizo de un residuo de aminoácido por otro residuo biológica-mente similar, los ejemplos de las variaciones conservadoras incluyen el reemplazo de un residuo hidrófobo, tal como isoleuci-na, va.-ina, leucina o metionina por otro, el reemplazo de un residuo polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y similares. La Tß4 se ha localizado en un número de tipos de tejidos y células, y por lo tanto, se pueden agregar agentes que estimulen la producción de Tß4 a una composición para efectuar la producción de Tß4 a partir de un tejido y/o de una célula. Los agentes que efectúan reparación de heridas también se pueden incluir en esta composición para aumentar el proceso de sanado de heridas. Estos agentes incluyen miembros de la familia de factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento de tipo de insulina (IG-1) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento transformante beta (TGF-ß) , factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) , timosina al (Tal) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) . De una manera más preferíble, el agente es el factor de crecimiento transformante beta (TGF-ß) u otros miembros de la superfamilia de TGF-ß. Las composiciones de Tß4 de la invención ayudan al sanado de heridas al efectuar el crecimiento del tejido conectivo a través del depósito de matriz extra-celular, la migración celular y la vascularización del lecho de la herida.
Adicionalmente, se pueden agregar agentes que asistan o estimulen al proceso de sanado de heridas a una composición junto con Tß4 o a una isoforma de Tß4, para modular adicionalmente el proceso de sanado de heridas. Estos agentes incluyen agentes: angiogénicos, factores de crecimiento, agentes que dirijan la diferenciación de células, agentes que promuevan la migración de células, y agentes que estimulen la provisión de materia.les de matriz extra-celular en el lecho de la herida. Por ejemplo, y no a manera de limitación, la Tß4 o una isoforma de Tß4 so a o en combinación, se puede agregar en combinación con cualquier o más de los siguientes agentes: VEGF, KGF, FGF, PDGF, TGFß, 1GF-1, IGF-2, IL-1, y protimosina ß y timosina Oíl, en una cantide.d sanadora de heridas efectiva. En otro aspecto, la invención es útil para reparar el tejido resultante de lesiones debido a procedimientos quirúrgicos, irradiación, laceración, productos químicos tóxicos, infecciones virales, infecciones bacterianas o quemaduras. Adicionalmente, la invención es útil para revitalizar el tejido cicatrizado resultante de cualquier número de procedimientos, accidentes o traumas. El término "tejido cicatrizado" significa el tejido fibrótico o colagenoso formado durante el sanado de una herida u otro proceso mórbido. Por ejemplo, se puede incluir Tß4 en una matriz de liberación controlada que se pueda colocar en proximidad al tejido dañado, promoviendo de esta manera la regeneración, reparación y/o revascularización de ese tejido. El término "matriz de liberación controlada" significa cualquier composición que permita la liberación de una sustancia bioactiva que se mezcle en la misma. La matriz puede ser una composición sólida, un material poroso (tal como una férula, malla o esponja), o un gel semi-sólido o suspensión líquida que contenga las sustancias bioactivas. El término "material bioactivo" significa cualquier composición que module la reparación del tejido cuando se utilice de acuerdo con el método de la presente invención. Los materiales bio-activos o la matriz se pueden introducir por medio de inyección, cirugía, catéteres o cualesquiera otros medios adecuados para modular la reparación del tejido. Se prevé que los métodos y composiciones de la invención se puedan utilizar para ayudar a sanar heridas y en la reparación en los procedimientos de regeneración de tejido guiada
(GTR) . Estos procedimientos son utilizados actualmente por los expertos en la técnica médica para acelerar el sanado de heridas.
Normalmente, se utilizan materiales no resorbibles o bio-absorbibles para acelerar el sanado de heridas, promoviendo la repobla.ción del área de la herida con células que formen la matriz arquitectónica y estructural del tejido. Por ejemplo, los métodos, y composiciones de la invención se pueden utilizar para ayudar a la reparación del tejido o a la regeneración en un sitio de úlcera en un ser humano o en otro sujeto, mediante la coloca-ción de una composición que contenga un polímero bio-reabsorbible y Tß4 en el sitio que necesite reparación del tejido o regeneración, de tal manera que la composición sea efectiva para ayudar a la regeneración del tejido mediante la liberación de una cantidad sanadora de heridas efectiva de Tß4 en el sitio. En otro aspecto, la invención es útil para los propósitos de promover el crecimiento del tejido durante el proceso de ingeniería del tejido. Como se utiliza en la presente, "ingeniería de tejidos" se define como la creación, diseño y fabricación de dispositivos prostéticos biológicos, en combínación con materiales sintéticos o naturales, para la creación, aumento o reemplazo de los tejidos y órganos del cuerpo. Por consig iente, el presente método se puede utilizar para aumentar el diseño y crecimiento de los tejidos humanos afuera del cuerpo, para la implantación posterior adentro del cuerpo, o para aumentar el diseño y crecimiento de un tejido adentro del cuerpo para reparar o reemplazar el tejido enfermo o dañado. Por ejemplo, la Tß4 puede ser útil para promover el crecimiento de los reemplazos de injertos de piel que se utilizan como una terapia en el tratamiento de quemaduras y úlceras. En otro aspecto de ingeniería del tejido, la Tß4 se puede incluir en dispositivos externos o internos que contengan tejido humano diseñados para reemplazar la función de un tejido interno enfermo. Este planteamiento involucra aislar células del cuerpo, colocarlas sobre o dentro de matrices tridimensionales, e implantar el nuevo sistema adentro del cuerpo, o utilizar el sistema afuera del cuerpo. Los métodos y composiciones de la invención se pueden utilizar e incluir en estas matrices para promover el crecimiento de tejidos contenidos en las matrices. Por ejemplo, se puede incluir Tß4 en una construcción de tejido diseñado para promover el crecimiento de las células contenidas en la construcción. Se prevé que el método de la invención se pueda utilizar para aumentar la reparación, regeneración e ingeniería del tejido en los productos relacionados con las células endoteliales que puedan contener cartílago, compuestos de cartílago-hueso, hueso, tejidos del sistema nervioso central, músculc, hígado, células de islotes pancreáticos (productoras de insulina), tejidos urogenitales, pecho y tejidos para aplicaciones de terapia genética. La presente invención proporciona además métodos y composiciones para modular la función del tracto reproductor femenino. Se ha demostrado que los factores de crecimiento tienen un papel en la mitosis cíclica y en la diferenciación de los componentes celulares endometriales, en el reclutamiento de macrófagos para decidualizar el endometrio, en las interacciones endometriales-trofoblastos, en el mantenimiento del embarazo temprano, y en la regeneración funcional endometrial . El término "modular", como se utiliza en la presente, denota una modificación de una condición o estado biológico existente. La modulación de una condición como se define en la presente, abarca tanto un incremento como una reducciónón en los determinantes que afectan la condición existente. Por ejemplo, se podría utilizar la administración de Tß4 para aumentar las funciones uterinas en una condición en donde se desee la promoción del crecimiento de células endoteliales . Por ejemplo, el útero se puede tratar con Tß4 para promover el crecimiento y desarrollo de las membranas placentarias o el crecimiento endometrial o la reparación de este tejido enseguida de lesión del tejido. Además, se puede utilizar el tratamiento con Tß4 para promover y mantener un embarazo, facilitando la interacción endometrial-trofoblastos . De una manera alternativa, se podría administrar un antagonista para Tß4, con el fin de modular las condiciones de un crecimiento endometrial excesivo, en donde sea excesivo el nivel de Tß4 en comparación con una condición biológica normal. En adición, la Tß4 en combinación con otros agentes, tales como timosina al, puede ser deseable para el tratamiento de desórdenes del tracto reproductor. Los planteamientos terapéuticos descritos en la presente involucran diferentes vías de administración o suministro de reactivos o composiciones que comprendan la Tß4 de la invención, incluyendo cualesquiera técnicas de administración convencionales (por ejemplo, pero no limitándose a, administración tópica, inyección local, inhalación, o administración sistémica), a un sujeto con una herida o tejido que necesite sanar o reparar. La administración de Tß4, como se describe anteriormente, puede acelerar el sanado de heridas, incrementar la migración celular hacia un sitio de herida, inducir la formación de reparación o regeneración del tejido, o promover el crecimiento y desarrollo del endometrio. El reactivo, la formule.ción o la composición también se puede dirigir a las células o receptores específicos mediante cualquier método descrito en la presente, o mediante cualquier método conocido en la técnica del suministro, dirección de polipéptidos Tß4, y expresión de genes que codifiquen Tß . Por ejemplo, los métodos y composiciones que utilizan o contienen la Tß4 de la invención se pueden formular en composiciones farmacéuticas mezclándose con excipientes o vehículos no tóxicos farmacéuticamente aceptables. Estas composiciones se pueden preparar para administración parenteral, particularmente en la forma de soluciones o suspensiones líquidas en soluciones reguladoras fisiológicas acuosas; para administración oral, particularmente en la forma de tabletas o cápsulas, o para administración intra-nasal, particularmente en la forma de polvos, gotas nasales o aerosoles. La presente invención también abarca composiciones de liberación sostenida. Se pueden preparar composiciones para otras vías de administra-ción según se desee, utilizando los métodos convencionales. Una composición de la invención que contenga Tß4 se puede cidministrar convenientemente en una forma de dosificación unitaria, y se puede preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo, como se describe en Reminqton's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pennsylvania, Estados Unidos, 1990) . Las formulaciones para administración parenteral pueden contener, como excipientes comunes, agua estéril o suero, polialquilenglicoles, tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftálenos hidroge-nados, y similares. En particular, los ejemplos de los excipientes para controlar la liberación de un compuesto de la invención en vivo son polímero de láctido biodegradable y biocompatible, copolímero de láctido/glicólido, copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno. Otros sistemas de suministro parenteral adecuados incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables, y liposomas. Las formulaciones para administración por inhalación pueden contener excipientes, tales como lactosa, si se desea. Las formulc.ciones de inhalación pueden ser soluciones acuosas que contengan, por ejemplo, polioxietilen-9-lauriléter, glicocolato y desoxicolato, o pueden ser soluciones oleosas para administración en la forma de gotas nasales. Si se desea, los compuestos se pueden formular como un gel para aplicarse intra-nasalmente. Las formulc.ciones para aplicación parenteral también pueden incluir glicocolato para administración bucal . La composición del liposoma normalmente es una combincción de fosfolípidos, particularmente fosfolípidos de alta tempereitura de transición de fases, usualmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También se pueden utilizar otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, de la concentración iónica, y de la presencia de cationes divalentes. Los ejemplos de los lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfati-diletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos . Son particularmente útiles los diacilfosfatidilgliceroles, en donde la fracción de lípido contiene de 14 a 18 átomos de carbono, particularmente de 16 a 18 átomos de carbono, y está saturada. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina. La dirección de los liposomas se ha clasificado basándose en los factores anatómicos y mecánicos. La clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por ejemplo, específica de órganos, específica de células, y específica de organelos . La dirección mecánica se puede distinguir basándose en si es pasiva o activa. La dirección pasiva utiliza la tendencia natural de los liposomas a distribuirse en las células del sistemé, reticuloendotelial (RES) en los órganos que contengan capilares senoidales. La dirección activa, por otra parte, involucra la alteración del liposoma, mediante el acoplamiento del liposoma con un ligando específico, tal como un anti-cuerpo monoclonal, azúcar, glicolípido, o proteína, o cambiando la composición o el tamaño del liposoma con el objeto de lograr la dirección a órganos y tipos de células diferentes de los sitios de loca.lización que se presentan naturalmente. La superficie del sistema de suministro dirigido se puede modificar en una variedad de maneras. En el caso del sistema de suministro dirigido liposomal, se pueden incorporar grupos de lípidos en la bicapa de lípido del liposoma, con el objeto de mantener al ligando de dirección en asociación estable con la bicapa liposomal. Se pueden utilizar diferentes grupos de enlace para unir las cadenas de lípido con el ligando de dirección. En general, los compuestos enlazados a la superficie del sistema de suministro dirigido serán ligandos y receptores que permitan que el sistema de suministro dirigido encuentre y se aloje en las células deseadas. Un ligando puede ser cualquier compuesto de interés que se enlace con otro compuesto, tal como un receptor. Los agentes terapéuticos útiles en el método de la invención se pueden administrar parenteralmente mediante inyección, o mediante perfusión gradual a través del tiempo. La administración puede ser intra-venosa, intra-peritoneal, intramuscular, sub-cutánea, intra-cavidad, o transdérmica. Las preparaciones para administración parenteral incluyan soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Los ejemplos de los solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de olivo, y esteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo suero y un medio regulado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, vehículos intra-venosos de Ringer lactados, incluyendo rellena.dores de fluidos y nutrientes, rellenadores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. También puede haber conservadores y otros aditivos presentes, tales como, por ejemplo, anti-microbianos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes, y similares. La invención también incluye una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de Tß4 o una isoforma de Tß4, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estos vehículos incluyen los mencionados anteriormente con referer.cia a la administración parenteral. La dosifición o reactivo real, la formulación o composición que module un proceso de reparación de tejido, desorden fibrótico, un desorden esclerótico, un desorden proliferativo celular, o el sanado de heridas, depende de muchos factores, incluyendo el tamaño y la salud de un sujeto. Sin embargo, un experto ordinario en este campo puede utilizar las siguientes enseñanzas que describen los métodos y técnicas para determinar las dosificaciones clínicas (Spilker B., Guide to Clinica l Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., Nueva York, 1984, páginas 7-13, 54-60; Spilker B., Guide to Clinica l Triáis, Raven Press, Ltd., Nueva York, 1991, páginas 93- 101; Craig C, y R. Stitzel, editores, Modern Phar acology , 2a. edición, Little, Brown and Co. , Boston, 1986, páginas 127-33; T. Speight, editor, Avery' s Drug Treatment : Principies and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics , 3a. edición, Williams y Wilkins, Baltimore, 1987, páginas 50-56; R. Tallarida R. Raffa y P. McGonigle, Principies in General Pharmacology, Springer-Verlag, Nueva York, 1988, páginas 18-20), o para determinar la dosificación apropiada a utilizar. Anti -Cuervos que se Enlazan con Tß4 Los anti-cuerpos para los péptidos o fragmentos de Tß4 podrían, ser valiosos como herramientas de diagnóstico para ayudar en la detección de enfermedades en donde la Tß4 sea un factor patológico. Además, el uso de anti-cuerpos que se enlacen con Tß4 e inhiban o prevengan las acciones de Tß4 se incluye en la presente invención. Terapéuticamente, también se podrían utilizar anti-cu.erpos o fragmentos de la molécula de anti-cuerpo para neutralizar la actividad biológica de Tß4 en enfermedades en donde se sobre-exprese la Tß . Estos anti-cuerpos pueden reconocer un epítopo de Tß4 o fragmentos del mismo adecuados para el reconocimiento del anti-cuerpo y la neutralización de la activid.ad de Tß4. Como se utiliza en esta invención, el término epítopo se refiere a un determinante antigénico sobre un antígepo, tal como un péptido Tß4, con el que se enlaza el parátopo de un anti-cuerpo, tal como un anti-cuerpo específico de Tß4. Los determinantes antigénicos normalmente consisten en agrupaciones superficiales de moléculas químicamente activas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y pueden tener características estructurales tridimensionales, así como características de carga específicas. La preparación de un anti-cuerpo requiere de una fracción sustancialmente purificada que pueda proporcionar un determinante antigénico. El término "sustancialmente pura", como se utiliza en la presente, se refiere a Tß4, o variantes de la misma, que esté sustancialmente exenta de otras proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los que esté naturalmente asociada. Sustancialmente purificada o aislada, se refiere a las moléculas, ya sea secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, que se remuevan de su medio ambiente natural, que se aislen o se separen, y que estén cuando menos el 60 por ciento exentas, de preferencia el 75 por ciento exentas, y más preferiblemente el 90 por ciento exentas de otros componentes con los que estén naturalmente asociadas . Un experto en la materia puede aislar la Tß4 o una isoforma de Tß4 utilizando técnicas convencionales para la purificación de proteínas. El péptido sustan-cialmente puro producirá una sola banda mayor sobre un gel de poliacrilamida no reductor. La pureza del péptido Tß4 también se puede determinar mediante análisis de secuencia de aminoácidos amino-terminal . El péptido Tß4 o una isoforma de Tß4 incluye los fragmentos funcionales del péptido, siempre que permanezca la actividad de Tß4 o de una isoforma de Tß4. En la invención se incluyen los péptidos más pequeños que contengan la actividad biológica de Tß4 o de una isoforma de Tß4. Como se utiliza en la presente invención, el término "anti-cuerpo" incluye, en adición a los anti-cuerpos convencionales, los fragmentos de proteína que tengan la capacidad para reconocer específicamente y fijar la proteína Tß4 o sus variantes. Las regiones del gen que difieren en el nivel de la proteína están bien definidas. Se puede reproducir una proteína mediante la expresión del gen de tipo silvestre (wt) de las variantes, o de preferencia, las fracciones para el mismo. Por ejemplo, se puede clonar la secuencia de ácido nucleico en vectores de expresión. De conformidad con esta modalidad, primero se puede obtener la secuencia de interés mediante el empleo de reacción en cadena de la polimerasa, como se describe anteriormente, o a partir de una construcción de un gen sintético con oligonucleótidos sintéticos traslapados y ligados. Otra alternativa involucraría la síntesis de un péptido corto. Todas estas metodologías son bien conocidas por un experto en este campo. Ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Volúmenes 1 y 2 (1987), con suplementos, y Maniatis y colaboradores, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, todo lo cual se incorpora a la presente como referencia. La invención proporciona un método para detectar Tß4, o variantes de la misma, el cual incluye poner en un contacto un anti-cuerpo anti-Tß4 con una muestra de la que se sospeche que contiene Tß4 (por ejemplo, célula o proteína) , y detectar el enlace con el anti-cuerpo. Un anti-cuerpo que se enlaza con el péptido Tß4 se marca con un compuesto que permita la detección del enlace con Tß4. Existen muchas marcas y métodos diferentes para marcar conocidos por los expertos ordinarios en la técnica. Los ejemplos de los tipos de marcas que se pueden utilizar en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, metales coloidales, compuestos quimiluminiscentes, compuestos fosforescentes, y compuestos bioluminiscentes . Los expertos ordinarios en la materia conocerán otras marcas adecuadas para enlazarse con el anti-cuerpo, o podrán aseverarlas, utilizando experimentación de rutina. Para los propósitos de la invención, se puede utilizar un anti-cuerpo específico para el péptido Tß4, con el fin de detectar el nivel de Tß4 en fluidos y tejidos biológicos. Se puede utilizar cualquier muestra que contenga una cantidad detectable del antígeno. El nivel de Tß4 en la célula de la que se sospeche, se puede comparar con el nivel en una célula normal, para determinar si el sujeto está predispuesto a un incremento asociado con Tß4 en la angiogénesis o el sanado de heridas . El uso de anti-cuerpos para los métodos de diagnóstico de la invención incluye, por ejemplo, inmunoensayos , en donde los anti-cuerpos se pueden utilizar en la fase líquida, o se pueden enlazar a un vehículo en fase sólida. En adición, los anti-cuerpos en estos inmunoensayos se pueden marcar detectablemente de diferentes maneras. Los ejemplos de los tipos de inmunoensayos que pueden utilizar los anti-cuerpos de la invención son inmunoensayos competitivos y no competitivos, ya sea en un formato directo o indirecto. Los ejemplos de estos inmunoensayos son el radio-inmunoensayo (RÍA) , y el ensayo de emparedado (inmunométrico) . La detección de los antíge?os utilizando los anti-cuerpos de la invención se puede hacer utilizando inmunoensayos c;ue se ejecuten en los modos hacia adelante, en reversa, o simultáneos, incluyendo los ensayos inmuno-histoquímicos sobre muestra.s fisiológicas. Los expertos en este campo conocerán, o pueden discernir fácilmente, otros formatos de inmunoensayo sin una indebida experimentación. Los anti-cuerpos de Tß4 se pueden enlazar a muchos vehículos diferentes, y se pueden utilizar para detectar la presencia de un antígeno que comprenda el péptido de la invención. Los ejemplos de los vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilami-das, acarosas y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble o insoluble para los propósitos de la invención. Los expertos en la técnica conocerán otros vehículos adecuados para fijar a.nti-cuerpos, o podrán aseverarlos, utilizando la experimentación de rutina. Otra técnica que también puede dar como resultado una mayor sensibilidad consiste en el acoplamiento de los anti-cuerpos con haptenos de bajo peso molecular. Entonces estos haptenos se pueden detectar específicamente por medio de una segundei reacción. Por ejemplo, es común utilizar haptenos tales como biotina, que reacciona con avidina, o dinitrofenilo, puridoxal y fluoresceína, que pueden reaccionar con anti-cuerpos anti-he.ptenos específicos. La invención incluye el uso de anti-cuerpos que inmunorreaccionan con el péptido Tß4 o sus fragmentos funcionales, se proporcionan anti-cuerpos que consisten esencialmente en anti-cuerpos monoclonales agrupados con diferentes especificidades epitópicas, así como distintas preparaciones de anti-cuerpos monoclonales. Los anti-cuerpos monoclonales se hacen a partir de antíger.o que comprenda fragmentos de la proteína, mediante métodos bien conocidos por los expertos en la materia (Kohler y colaboradores, Nature, 256:495, 1975). El término "anti-cuerpo", como se utiliza en esta invención, significa las moléculas intactas, así como sus fragmentos, tales como Fab y F(ab')2, Fv y SCA, que son capaces de fijar un determinante epitópico sobre Tß4. (1) Un fragmento Fab consiste en un fragmento de enlace de antígeno monovalente de una molécula de anti-cuerpo, y se puede producir mediante la digestión de una molécula de anticuerpo entera con la enzima papaína, para producir un fragmento consistente en una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada.
(2) Un fragmento Fab' de una molécula de anti-cuerpo se pued.e obtener mediante el tratamiento de una molécula de anticuerpo entera con pepsina, seguido por reducción, para producir una molécula consistente en una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada. Se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anti-cuerpo tratada de esta manera. (3) Un fragmento (Fab')2 de un anti-cuerpo se puede obtener mediante el tratamiento de una molécula de anti-cuerpo entera con la enzima pepsina, sin reducción subsecuente. Un fragmento (Fab')2 es un dímero de dos fragmentos Fab', mantenidos juntos mediante dos enlaces de disulfuro. (4) Un fragmento Fav se define como un fragmento genéticamente diseñado que contiene la región variable de una cadena ligera, y la región variable de una cadena pesada, expresadas como dos cadenas . (5) Un anti-cuerpo de una sola cadena ("SCA") es una molécula de una sola cadena genéticamente diseñada que contiene la región variable de una cadena ligera, y la región variable de una cadena pesada, enlazadas mediante un enlazador polipeptídico flexible adecuado. De una manera alternativa, un anti-cuerpo anti-Tß4 terapéuticamente o diagnósticamente útil, se puede derivar a partir de un anti-cuerpo monoclonal "humanizado" . Los anticuerpos monoclonales humanizados se producen mediante la transferencia de las regiones determinantes de complementariedad de ratón a partir de las cadenas variables pesada y ligera de la inmunoglobulina de ratón hacia un dominio variable humano, y luego se sustituyen los residuos humanos en las regiones de estruct.ura de las contrapartes de murino. El uso de componentes de antí-cuerpo derivados a partir de anti-cuerpos monoclonales humanizados, obvia los problemas potenciales asociados con la inmunogenicidad de las regiones constantes del murino. Las técnica.s generales para la clonación de los dominios variables de inmunoglobulina de murino son descritas, por ejemplo, por Orlandi y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 86=3833 (1989), que se incorpora a la presente en su totalidad como referencia. Las técnicas para producir anti-cuerpos monoclonales humanizados son descritas, por ejemplo, por Jones y colaboradores, Nature 321 : 522 (1986); Riechmann y colaboradores, Nature 332 :323 (1988); Verhoeyen y colaboradores, Science 239 : 1534 (1988); Cárter y colaboradores, Proc . Nat ' l Acad. Sci . USA 89:4285 (1992); Sandhu, Crit. Rev. Biotech . 12:437 (1992) ; y Singer y colaboradores, J. Immunol . 150 :2844 (1993), que se incorporan a la presente como referencia. Los anti-cuerpos de la invención también se pueden derivar a partir de fragmentos de anti-cuerpos humanos aislados a partir de una biblioteca de inmunoglobulina de combinación. Ver, por ejemplo, Barbas y colaboradores, METHODS: A COMPA?IO? TO METHODS I? E?ZYMOLOGY, Volumen 2, página 119 (1991); Winter y colaboradores, Anp. .Rev. Immunol . 12:433 (1994), que se incorpo- ran a la presente como referencia. Los vectores de clonación y expresión que son útiles para producir una biblioteca de fago de inmunoglobulina humana se pueden obtener, por ejemplo, en STRATAGENE Cloning Systems (La Jolla, CA) . Métodos ? Composiciones para el Tratamiento o el Diacmóstico de Desórdenes Asociados con Tß4 En otra modalidad de la invención, se proporciona un método para diagnosticar un estado patológico en un sujeto del que se sospeche que tiene una patología caracterizada por un desorden asociado con Tß4. El método incluye obtener una muestra de la que se sospeche que contiene Tß4 del sujeto, determinar el nivel de Tß4 en la muestra, y comparar el nivel de Tß4 en la muestra, con el nivel de Tß4 en una muestra estándar normal . Estas condiciones incluyen, pero no se limitan a, los sujetos que tengan desórdenes proliferativos celulares, heridas recurrentes, desórdenes de reparación del tejido, desórdenes de tejido fibrótico, úlceras crónicas, y otros desórdenes descritos en la presente. Estos desórdenes incluyen además los asociados con las diferentes isoformas de Tß4, conocidas o todavía no identifica-das . El término "desorden proliferativo celular" denota las poblaciones celulares malignas, así como no malignas que parecen con frecuencia diferir del tejido circundante, tanto morfológicamente como genotípicamente. Las células malignas (es decir, cáncer) se desarrollan como un resultado de un proceso de múltiples pasos. Estos desórdenes se pueden detectar utilizando los métodos de la presente invención. Por ejemplo, se obtiene de un sujeto una muestra de la que se sospeche que contiene Tß4, se determi.na el nivel del péptido Tß4, y se compara con el nivel del péptido Tß4 en una muestra de tejido normal. El nivel de Tß4 se puede determinar mediante cualquier número de métodos, incluyendo, por ejemplo, inmunoensayo utilizando anti-cuerpos anti-péptido Tß4. Otras variaciones de estos ensayos incluyen radioinmunoensayo (RÍA) , ELISA e inmunofluorescencia. De una manera alternativa, se pueden utilizar sondas de ácidos nucleicos para detectar y cuantificar el ARNm del péptido Tß4 para el mismo propósi.to. Estos métodos de detección son estándares en la materici . En otra modalidad, la invención proporciona un método para aminorar un desorden de sanado de heridas asociado con Tß4 o una i.soforma de Tß4, incluyendo tratar a un sujeto que tenga el desorden, con una composición que regule la actividad de Tß4. El término "aminorar" denota una disminución del efecto perjudicial de la respuesta inductora de la enfermedad en el sujeto que reciba la terapia. Cuando la enfermedad se debe a un nivel anormalmente alto de Tß4, puede ser efectiva la administración de un .agente, tal como un antagonista de la actividad de Tß4, para reducir la cantidad de actividad de Tß4. De una manera alternéLtiva, cuando la enfermedad se deba a un nivel anormalmente bajo d Tß4, puede ser efectiva la administración de Tß4 o un agente que incremente la actividad de Tß4, tal como un agonista, para incrementar la cantidad de actividad de Tß4. En todavía otra modalidad, la invención proporciona un método para el tratamiento de un sujeto que tenga un desorden de sanado de heridas, caracterizado por heridas recurrentes o lentas para sanar, o heridas que sean heridas crónicas que no sanen, asociadas con una expresión alterada del gen de Tß4 o de la isoforma de Tß4 en un sujeto. El método incluye administrar a un sujeto que tenga el desorden, una cantidad sanadora de heridas efectiva de un agente que module la expresión del gen Tß4, tratando de esta manera el desorden. El término "modular" se refiere! a la inhibición o supresión de la expresión de Tß4 cuando se sobreexprese la Tß4, y la inducción de la expresión cuando se subexprese la Tß4. El término "cantidad sanadora de heridas efectiva", significa la cantidad de agente Tß4 que sea efectiva para modular la expresión del gen Tß4, dando como resultado la reducción de los síntomas del desorden de sanado de heridas asociac.o con Tß4. Un agente que module la expresión del gen Tß4 o de una isoforma de Tß4 puede ser un polinucleótido, por ejemplo. El polinucleótido puede ser anti-sentido, un agente triplex, o una ribozima. Por ejemplo, un anti-sentido se puede dirigir hacia la región del gen estructural o hacia la región promotora de Tß4. Cuando un desorden de sanado de heridas esté asociado con la expresión de Tß4, es posible un planteamiento terapéutico que interfiera directamente con la traducción del ARNm de Tß4 en la proteína. Por ejemplo, se puede utilizar un ácido nucleico anti-sentido o una ribozima para enlazarse con el ARN de Tß4, o para disociarlo. Las moléculas de ARN o ADN anti-sentido se enlazan específicamente con un mensaje de ARN del gen dirigido, interrumpiendo la expresión de ese producto de proteína del gen. El anti.-sentido se enlaza con el ARNm formando una molécula de doble cadena que no puede ser traducida por la célula. Se prefieren los oligonucleótidos anti-sentido de aproximadamente 15 a 25 nucleótidos, debido a que son sintetizados fácilmente, y tienen un efecto inhibidor, igual que las moléculas de ARN antisentido. En adición, se puede unir un grupo químicamente reactivo, tal como el ácido etilendiaminatetraacético enlazado con hierro (EDTA-Fe) a un oligonucleótido anti-sentido, ocasio-nando la disociación del ARN en el sitio de la hibridación. Estos y otros usos de métodos anti-sentido para inhibir la traducción in vi tro de genes, son bien conocidos en este campo (Marcus-Sakura, Anal., Biochem., 172:289, 1988). Los ácidos nucleicos anti-sentido son moléculas de ADN o de ARN que son complementarias para cuando menos una porción de una molécula de ARNm específica (Weintraub, Scientific American, 262.: 40, 1990) . En la célula, los ácidos nucleicos anti-sentido se hibridan en el ARNm correspondiente, formando una molécula de doble cadena. Los ácidos nucleicos anti-sentido interfieren con la traducción del ARNm, debido a que la célula no traducirá un ARNm que sea de doble cadena. Se prefieren los oligómeros anti-sentido de aproximadamente 15 nucleótidos, debido a que son sinteti.zados fácilmente, y tienen menos probabilidades de ocasionar problemas que las moléculas más grandes cuando se introducen en la célula productora de Tß4 objetivo. El uso de métodos! anti-sentido para inhibir la traducción in vi tro de genes, es bien conocida en la técnica (Marcus-Sakura, Anal . Biochem. , 172:289, 1988). El uso de un oligonucleótido para detener la transcrip-ción ss conoce como la estrategia triplex, debido a que el oligómero se enrolla alrededor de un ADN de doble hélice, formando una hélice de tres cadenas. Por consiguiente, estos compuestos triplex se pueden diseñar para reconocer un sitio único en un gen seleccionado (Maher y colaboradores, Antisense Res . and Dev. , 1 (3) :227, 1991; Helene, C, Anticancer Drug Design, 6(6) :569, 1991) . Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen la capacic.ad para disociar específicamente otro ARN de una sola cadena de una manera análoga a las endonucleasas de restricción de ADN. A través de la modificación de las secuencias de nucleótidos que codifiquen estos ARNs, es posible diseñar moléculas que reconozcan secuencias de nucleótidos específicas en una molécula de ARN, y disociarlas (Cech y colaboradores, J\ Amer. Med. Assn . , 260 : 3030 , 1988). Una ventaja mayor de este planteamiento es que, debido a que son específicas de la secuencia, solamente se inactivan los ARNms con secuencias particulares . Existen dos tipos básicos de ribozimas, es decir, el tipo tetrahymena (Hasselhoff, Nature, 334 :585, 1988), y el tipo de "cabeza de martillo". Las ribozimas de tipo tetrahymena reconocen secuencias que son de cuatro bases de longitud, mientras que las ribozimas de tipo de "cabeza de martillo" reconocen secuencias de bases de 11 a 18 bases de longitud. Mientras más larga sea la secuencia de reconocimiento, mayor será la posibilidad de que la secuencia se presente exclusivamente en las especies de ARNm objetivo. Estos y otros usos de métodos anti-sentido para inhibir la traducción en vivo de genes, son bien conocidos en este campo
(por ejemplo, De Mesmaeker y colaboradores, 1995. Backbone modifications in oligonucleotides and peptide nucleic acid systems. Curr. Opin . Struct . Biol . 5:343-355; Gewirtz, A.M. y colaboradores, 1996b. Facilitating delivery of antisense oligodeoxynucleotides : Helping antisense deliver on its promise;
Proc . atl . Acad . Sci . USA 93:3161-3163; Stein, C.A. A discusión of G-tetrads 1996. Exploiting the potential of antisense: beyond phosphcrothioate oligodeoxynucleotides. Chem. and Biol . 3:319- 323) . El suministro de anti-sentido, agentes triplex, ribozimas, inhibidores competitivos y similares, se puede lograr utilizando un vector de expresión recombinante, tal como un virus quiméri.co, o un sistema de dispersión coloidal. Diferentes vectores virales que se pueden utilizar para la terapia genética como se enseña en la presente incluyen adenovirus, virus de herpes, vacuna, o de preferencia un virus de ARN; tal como un retrovirus. De preferencia, el vector retroviral es un derivado de un retrovirus de murino o de ave. Los ejemplos de vectores retrovi.rales en donde se puede insertar un solo gen extraño incluyen, pero no se limitan a: virus de leucemia de murino Moloney (MoMuLV) , virus de sarcoma de murino Harvey (HaMuSV) , virus de tumor mamario de murino (MuMTV) , y Virus de Sarcoma Rous (RSV) . Un número de vectores retrovirales adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o i.ncorporar un gen para un marcador seleccionable, de tal manera que se puedan identificar y generar células transducidas . Mediante la inserción de una secuencia de polinucleótidos de interés en el vector viral, junto con otro gen que codifique el ligandc para un receptor sobre una célula objetivo específica, por ejemplo, el vector es ahora específico del objetivo. Los vectores retrovirales se pueden hacer específicos del objetivo mediante la inserción, por ejemplo, de un polinucleótido que codifique un azúcar, un glicolípido, o una proteína. La dirección preferida se realiza utilizando un anti-cuerpo para dirigir el vector retroviral. Los expertos en la materia conocerán, o pueden aseverar fácilmente, sin una indebida experimentación, las secuencias de polinucleótidos específicas que se pueden insertar en el genoma retroviral para permitir el suministro específico del objetivo del vector retroviral que contenga el polinucleótido anti-sentido. Debido a que los retrovirus recombinantes son defectuo-sos, requieren de asistencia con el objeto de producir partículas de vector infecciosas. Esta asistencia se puede proporcionar, por ejemplo, mediante la utilización de líneas celulares auxiliares que contengan plásmidos que codifiquen todos los genes estructurales c.el retrovirus bajo el control de las secuencias regulado-ras adentro de la LTR. Estos plásmidos carecen de una secuencia de nucLeótidos que haga posible que el mecanismo de empaque reconozca una transcripción de ARN para la encapsidación. Las líneas celulares auxiliares que tienen supresiones de la señal de empaque incluyen, pero no se limitan a, ?2 , PA317 y PA12, por ejemplo. Estas líneas celulares producen viriones vacíos, debido a que no se empaca ningún genoma. Si se introduce un vector retroviral en estas células, en donde la señal de empaque esté intacta., pero los genes estructurales sean reemplazados por otros genes de interés, se puede empacar el vector, y se puede producir el virión del vector. De una manera alternativa, las NIH 3T3 u otras células de cultivo de tejido, se pueden transfectar directamente con plásmic.os que codifiquen los genes estructurales retrovirales gag, pol y env, mediante transfección convencional con fosfato de calcio. Luego estas células se transfectan con el plásmido del vector que contenga los genes de interés . Las células resultantes liberan el vector retroviral en el medio de cultivo. Un sistema de suministro dirigido para el suministro de ácidos nucleicos como se describe en la presente, incluye un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromolécula, nanocápsulas, microesferas, perlas, matrices activadas por el gen, y sistemas basados! en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelios, micelios mixtos, y liposomas. El sistema coloidal preferi.do de esta invención es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificiales que son útiles como vehículos de suministro in vi tro e in vivo . Se ha demostrado que las vesículas unilamelares grandes (LUV) , que son de un tamaño de 0.2 a 4.0 mieras, pueden encapsular un porcentaje sustancial de un regulador acuoso que contenga macromoléculas grandes. El ARN, el ADN y los viriones intactos se pueden encapsular adentro del interior acuoso, y se pueden suministrar a las células en una forma biológicamente activa (Fraley y colaboradores, Trends Biochem. Sci . , 6:77, 1981) . En adición a las células de mamífero, los liposomas se han utilizado para el suministro de polinucleótidos e¡n células de plantas, de levadura y bacterianas. Con el objeto de que un liposoma sea un vehículo de transferencia genética eficiente, deben estar presentes las siguientes características: (1) una encapsulación de los genes de interés con una alta eficiencia, mientras que no se comprometa su actividad biológica; (2) un enlace preferencial y sustancial con una célula objetivo en comparación con las células no objetivo; (3) suministro del contenido acuoso de la vesícula hacia el citopletsma de la célula objetivo con un alta eficiencia; y (4) expresión precisa y efectiva de la información genética (Mannino y colaboradores, Biotechniques, 6:682, 1988). Patológicamente, la Tß4 puede estar involucrada en enfermedades en donde haya un sobre-crecimiento de vasos sanguír.eos, tal como cáncer, formación y crecimiento tumoral, retinop>atía diabética, glaucoma neovascular, artritis reumatoide y psoriasis . Es esencial el crecimiento hacia adentro de los capilares y vasos sanguíneos auxiliares para el crecimiento de tumores sólidos, y por lo tanto, es una respuesta fisiológica indeseada que facilita la extensión del tejido maligno y de las metástasis. Por consiguiente, la inhibición de la angiogénesis y el crecimiento resultante de capilares y vasos sanguíneos es un componente del tratamiento efectivo de malignidad en el uso del tratamiento de pacientes de cáncer. Por consiguiente, en otra modalidad, la invención proporciona un método para inhibir la angiogénesis en un sujeto, el cuaL incluye administrar al sujeto una composición que contenga un agente que regule la actividad de Tß4. La composición puede incluir agentes que regulen la angiogénesis, por ejemplo, agentes que afecten a la timosina l, PDGF, VEGF, IGF, FGF y TGFß . Por ejemplo, la inhibición de angiogénesis y de la migración de células endoteliales puede ser benéfica para controlar el crecimiento de tumores sólidos. La mayoría de, si no es que todos, los tumores sólidos, como el tejido normal, requieren de un suministro de sangre continuo y suficiente para un crecimiento óptimo. Se sabe que los tumores hacen uso de los factores de crecimiento angiogénicos para atraer a los nuevos vasos sanguíneos y aseverar el suministro con suficientes cantidades de nutrientes para sostener su crecimiento. Muchos tumores están bien vascularizados, y la inhibición de la formación de un suministro de sangre adecuado hacia el tumor mediante la inhibición de la vascularización del tumor, como un resultado de la inhibición de la angiogénesis, es benéfica en el control del crecimiento tumoral. Sin un fuerte suministro de sangre, no se puede sostener un crecimiento rápido y prolongado del tejido tumoral. Por consiguiente, se pueden utilizar agentes que inhiban la actividad de Tß4 para prevenir el crecimiento neoplástico. El agente inhibidor de Tß4 se puede administrar oralmente, parenteralmente, tópicamente, intra-venosamente o sistémicamente . En adición, para inhibir la proliferación de las células tumorales y el crecimiento del tumor, el agente se puede administrar de manera local, directamente al tumor, o como una parte de una formulación de liberación lenta depositada. La administración se puede hacer sobre una base diaria durante tanto tiempo como se necesite para inhibir la angiogénesis, la prolifgiración de células endoteliales, la proliferación de células tumorales, o el crecimiento del tumor. De una manera alterna.tiva, una formulación de liberación lenta puede continuar durante' tanto tiempo como se necesite para controlar el creci-miento del tumor. Este régimen de dosificación se puede ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente, o la dosis se puede reducir proporcionalmente, como sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. En este aspecto, las composiciones de esta invención que son útiles como inhibidores de angiogénesis, proliferación de células endoteliales, proliferación de células tumorales, y del crecimiento del tumor, contienen un vehículo farmacéuticamente aceptable, y una cantidad de agente modulador de Tß4 efectiva para inhibir la proliferación de células tumorales o endoteliales. Estas composiciones también pueden incluir conservadores, antioxidantes, inmunosupresores, y otros agentes biológicamente y farmacéuticamente efectivos que tengan efectos sobre el crecimiento del tumor, pero que no ejerzan un efecto perjudicial sobre el agente modulador de Tß4. Para el tratamiento de células tumoralss, la composición puede incluir un agente quimioterapéu-tico, por ejemplo, un agente contra el cáncer, que aniquile selectivamente las células tumorales que se replican más rápido, muchos de los cuales son conocidos y clínicamente utilizados. Los agentes contra el cáncer de ejemplo incluyen mefalán, ciclofosfa-mida, metotrexato, adriamicina y belomicina. Rastreo de Compuestos que Modulen la Actividad de Tß4 En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que module la actividad de Tß4, la actividad de angiogénesis o la actividad del sanado de heridas. El método incluye incubar componentes que incluyan al compuesto y Tß4 bajo condiciones suficientes para permitir que los componentes interactúen, y determinar el efecto del compuesto sobre la actividad de Tß4 antes y después de incubar en la presencia del compuesto. Los compuestos que afectan la actividad de Tß4 (por ejemplo, antagonistas y agonistas) incluyen péptidos, peptidomiméticos, polipéptidos, compuestos químicos, minerales, tales como zincs, y agentes biológicos. La actividad de Tß4 se puede ensayar utilizando la metodología descrita en los presentes ejemplos. Los presentes Ejemplos son para ilustrar, pero no limitar, el alcance de las reivindicaciones adjuntas. De conformidad con lo anterior, un experto en este campo reconocerá un número de materiales y métodos equivalentes, que pretenden ser cubiertos por la presente invención y divulgación. EJEMPLO 1 El sanado de heridas en vivo es acelerado por la Tß4 La Tß4, ya sea administrada tópicamente o bien intraperitonealmente, aceleró de una manera significativa el sanado de heridas, comparándose con las heridas no tratadas (Figuras 2 y 3) . Se hicieron heridas de biopsia con una perforación de 8 milímetros de espesor total sobre la superficie dorsal de ratas como se reportó anteriormente (Bhartiya y colaboradores, J\ Cell . Physiol . 150:312, 1992; Sihhu y colaboradores, J. Cell . Physiol . 169 : 108 , 1996), y se dio la Tß4 tópicamente en el momento de la herida (5 microgramos en 50 microlitros) , y nuevamente después de 48 horeis . Los controles para el tratamiento tópico recibieron cantidades idénticas de suero en el momento de la herida y a las 48 horas. Ratas adicionales recibieron inyecciones intra-peritoneales en el momento de la herida (60 microgramos en 300 microlitros) , y nuevamente cada tercer día (por ejemplo, días 0, 2, 4 y 6) . Los controles para estos animales recibieron cantidades idénticas de suero intra-peritonealmente con el mismo programa de inyección. En los días 4 y 7 después de la herida, se hicieron mediciones del tamaño de la herida. En los días 8 y 9 después de la herida, se recolectó el tejido, y se fijó en formalina regulada al 10 por ciento. Las muestras se seccionaron y se tiñeron con H&E y Tricromo de Masson (American Histolabs, Gaithersburg, Maryland, Estados Unidos) . Se utilizaron secciones histológicas para medir la re-epitelialización y la contracción de la herida utilizando un micrómetro ocular. La migración epidérmica se determinó midiendo las longitudes de las lengüetas del epitelio que migraba desde cualquier lado de la herida sobre el lecho de la herida desde la zona de proliferación en el margen de la piel no lesionada y la herida. También se midió el espesor epidérmico empezando en la unión de la epidermis no lesionada y en proliferación. El espesor se midi.ó verticalmente desde la membrana de basamento hasta la capa más superficial de la epidermis migratoria cada 200 mieras. El espesor epidérmico promedio de cada lengua migratoria de epidermis se calculó entonces a partir de cada herida. Los conteos de vasos se realizaron identificando primero los espacios vasculares por su revestimiento endotelial. Todos los vasos en el lecho de la herida se contaron, incluyendo los de la unión de la dermis y la sub-cutis, debido a que la angiogénesis hacia adentro de las heridas se presenta hasta un gran grado a partir de estos vasos. Los números se promediaron en conteos de vasos por 10 campos de alta energía (40x) . El efecto de la Tß4 sobre el sanado de heridas se estudió en un modelo de herida cutánea de rata a todo el espesor. La Figura 1 muestra un diagrama del sitio de la herida que se extiende desde la epidermis hasta la capa de grasa/músculo. Este modelo permitió hacer la medición de dos parámetros: la re-epitelialización (hueco) , y la contracción (ancho) de la herida. Las heridas tratadas tópicamente con Tß4 mostraron una reducción de aproximadamente el 15 por ciento en el ancho, y una reducción de aproximadamente el 15 por ciento en el hueco en los tratados contra los controles (Figuras 2 y 3, respectivamente). La Figura 2 muestra una reducción del 15 por ciento en el ancho de la herida, comparándose con los controles de suero, tan pronto como 4 días después de la herida, y continuando hasta el día 7. La inyección intra-peritoneal de Tß4 dio como resultado una reducción del 18 por ciento en el ancho de la herida en relación con los controles tratados con suero en el día 4, y una reducción del 11 por ciento en el día 7. Esta tendencia se observe en el cuarto día después de la herida, y continuó hasta el día 7 (*P<0.0001, **P<0.08, diferencia significativa de la media solamente, prueba-t del estudiante) . Estos datos demuestran que la TJS4, cuando se da tópicamente o sistémicamente, incrementa la re-epitelialización y contracción de la herida. Tanto el tratamiento tópico como sistémico son igualmente efectivos. Se probaron dosis más bajas de Tß4, incluyendo 2.5 microgramos y 0.5 microgramos en 50 microlitros para el tratamiento tópico, y 30 microgramos y 6 microgramos en 300 microlitros para la inyección intra-peritoneal, pero se observó un efecto reducido o ningún efecto, respectivamente, sobre el sanado de heridas. La Figura 3 muestra una reducción del 18 por ciento en la longitud del hueco, comparándose con los controles de suero, cuando se administró Tß4 tópicamente, tan pronto como a los 4 días después de la herida. Esta tendencia continúa hasta la terminación en el día 7 (*P<0.04, prueba-t del estudiante). Las inyecciones intra-peritoneales dieron como resultado una reducción del 42 por ciento en el tamaño del hueco, en relación con los controles tratados con suero. Esta reducción se observó en el cuarto día después de la herida, y continuó hasta el día 7 (**P<0.0007, prueba-t del estudiante). El incremento en la re-epitelialización se observó en las heridas tratadas durante 7 días, y la velocidad de cierre del hueco se aceleró ligeramente sobre la observada en el día 4. Se observó una reducción del 62 por ciento en el tamaño del hueco en la heridas tratadas con Tß4. La cuantificación de la migración epidérmica mostró un incremento de 1.5 veces estadísticamente significativo en la migración de las lenguas epidérmicas sobre el lecho de la herida después del tratamiento tópico (Tabla 1) . La cuantificación de la migración epitelial en las heridas intra-peritonealmente tratadas mostró un incremento estadísticamente significativo en la migración de las lenguas epidérmicas, comprándose con los controles (Tabla 1) . No hubo ninguna diferencia en el espesor de la epidermis migratoria entre los tratamiento con Tß4 y el control (Tabla 1) . Las secciones histológicas de las heridas muestran claramente una mayor re-epitelialización en las heridas tratadas, comparándose con los controles en las heridas del día 7 (Figura 4) .
Tabla 1 Mediciones Morfométricas de Muestras de Control y Tratadas con Timosina ß4
HPF: Campo de alta energía. *P<0.00001 mediante la prueba-t de Welch, significativamente diferente del control. La Figura 4 muestra una comparación de secciones típicas de control (D) y tratadas con Tß4 (E y F) de heridas a los 7 días. El tratamiento con Tß4 dio como resultado un crecimiento capilar hacia adentro considerable (Figuras 4E y F, flechas) . Los conteos de los vasos mostraron un incremento significativo (aproximadamente del doble) en el número de vasos en las heridas tratadas con Tß4 (Tabla 1) . No se observaron incrementos en el número de macrófagos en las heridas . No hubo ningún incremento aparente en la acumulación/biosíntesis de colágeno en las heridas tratadas con Tß4 (Figuras 5B y C contra A) , apoyando un ancho de herida reducido, y apoyando un papel para la Tß4 en la contracción de la herida. Tanto la herida tratada tópicamente como sistémicamente apareció similar, aunque la contracción de la herida procedió ligeramente más rápido con el trat.amiento tópico Se observó una reducción del tamaño de la herida en ambos grupos experimentales, comparándose con los grupos de control (Grupos 2 a 4) . Se observaron más vasos sanguíneos y más grandes en los grupos experimentales, comparándose con los controles (Figura 4) . Adicionalmente, un incremento en la acumulación/biosíntesis de colágeno por las heridas tratadas con Tß4, comparándose con el control, sugiere un papel para Tß4 en la contracción de la herida y en el depósito de matriz extra-celular. El teñido histológico de estas heridas demostró un incremento en la densidad de colágeno y en el depósito de la matriz extra-celular, comparándose con los controles (Figura 5) . EJEMPLO 2 Ensayos de Migración de Queratinocitos Se prepararon queratinocitos primarios a partir de ratones recién nacidos Balb/c o CD-1, como se describió anteriormente (Dlugosz y colaboradores, 1995) . Se recubrieron células en un Medio Esencial Mínimo de Eagle exento de calcio y magnesio (EMEM) conteniendo suero fetal de becerro al 8 por ciento tratado con Chelex al 8 por ciento (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, Estados Unidos) , 20 unidades/mililitro de penicilina-estreptomicina, y la concentración de calcio se ajustó a 0.25 mM. Al día siguiente, los cultivos se lavaron con suero regulado con fosfato exento de calcio y magnesio, se trataron brevemente con tripsinéi (Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, Estados Unidos) , se lavaron con un medio de cultivo, y se volvieron a suspender en EMEM conteniendo calcio 0.05 mM. Las células se utilizaron inmediatamente en los ensayos de migración. Se realizaron ensayos de migración de queratinocitos en la cámara Boyden utilizando membranas de poliéster con poros de 12 mieras (Poretics, Livermore, California, Estados Unidos) recubiertas con una solución de 0.1 miligramos/mililitro de colágeno IV en dH20 (Trevigen, Gaithersburg, Maryland, Estados Unidos) . Luego los filtros se secaron durante cuando menos 1 hora. lias células se cosecharon utilizando verseno o tripsina
(Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, Estados Unidos) , y se volvieron a suspender en un medio esencial mínimo de Eagle con
Ca2+ 0.05 mM. La cámara del fondo se cargó con EMEM conteniendo
0.01, 0.1, 10, 100 y 1,000 nanogramos/mililitro de Tß4 sintética. Se agregó un medio acondicionado a partir de fibroblastos dérmicos primarios y/o factor de crecimiento de queratinocitos a varias cavidades como un control positivo. Se agregaron células a la cámara superior en una concentración de 50,000 células por cavidad. Las cámaras se incubaron a 35°C/C02 al 7 por ciento durante 4 a 5 horas, y los filtros se fijaron luego y se tiñeron utilizando Diff-Quik (Baxter Healthcare Corporation, McGraw Park, Illinois, Estados Unidos) . Las células que migraron a través del filtro eie cuantificaron contando el centro de cada cavidad a lOx, utilizando un microscopio Olympus CK2. Cada condición se ensayó en cavidades por triplicado, y cada experimento se repitió cuatro veces con diferentes preparaciones de células. Los resultados demostraron que los queratinocitos migraron en respuesta a la Tß4 después de 4 a 5 horas de exposición. La migración se mejoró de 2 a 3 veces (P<.0.003) sobre la migración en la presencia del medio solamente (Figura 6) , y en la máxi.ma dosis de respuesta, excedió al control positivo. El efecto de la Tß4 sobre la migración, aunque muestra curvas de dosis ligeramente diferentes, dependiendo de la preparación y de la fuente de células, demostró claramente un patrón bifásico con 1,000 nanogramos/mililitro y 0.01 nanogramos/mililitro mostrando la mayor migración, y mostrando las dosis medias el menor estímulo (pero todavía mayor que los medios de control) en los 4 ensayos . EJEMPLO 3 Ensayos de Migración de Células Epiteliales Córneas Se realizaron ensayos de migración de células epiteliales córneas en una cámara Boyden utilizando membranas de poliéster con poros de 12 mieras (Poretics, Livermore, California, Estados Unidos) recubiertas con una solución de 0.1 miligramos/mililitro de colágeno IV en dH20 (Trevigen, Gaithersburg, MD) . Luego se secaron los filtros durante cuando menos 1 hora. Las células se cultivaron y se volvieron a suspender en un Medio Esencial Mínimo de Eagle con Ca2+ 0.05 mM. La cámara del fondo se cargó con EMEM conteniendo 0.01, 0.1, 10, 100 y 1,000 nanogramos/mililitro de TS4 sintética. Se agregó un medio acondicionado a partir de fibroblastos dérmicos primarios y/o factor de crecimiento de queratinocitos a varias cavidades como un control positivo. Se agregaron las células a la cámara superior en una concentración de 50,000 células por cavidad. Las cámaras se incubaron a 35°C/C02 al 7 por ciento durante 4 a 5 horas, y luego se fijaron los filtros y se tiñeron utilizando Diff-Quik (Baxter Healthcare Corporation, McGraw Park, Illinois, Estados Unidos) . Las células que migraron a través del filtro se cuantificaron contando el centro de cada cavidad a 10x, utilizan-do un microscopio Olympus CK2. Cada condición se ensayó en cavidades por triplicado, y cada experimento se repitió cuatro veces con diferentes preparaciones de células. Los resultados demostraron que las células epiteliales córneas migraban en respuesta a la Tß4 después de 4 a 5 horas de exposición. La migración se mejoró de 2 a 3 veces sobre la migración en la presencia del medio solamente (Figura 7) , viéndose el nivel más alto de migración con 100 nanogramos/ mililitro de Tß4. EJEMPLO 4 Re-Epit'3lialización Córnea en Vivo Para determinar el efecto de la re-epitelialización córnea en vivo, se desepitelializaron córneas de rata, y se trataron con Tß4. Los filtros se sumergieron en heptanol, se aplicaron al ojo durante 30 segundos, y luego se raspó el epitelio. Se aplicaron diferentes concentraciones de Tß4 en suero al ojo, y a las 24 horas se sacrificaron las ratas. Los ojos se fijaron, se seccionaron, y se determinó el grado de migración epitelial córnea (medida en pixeles) utilizando un microscopio con un calibre interno mediante un observador enmascarado. Los resultados demuestran que la re-epitelialización de la córnea se incrementó 2 veces sobre el control no tratado en la presencia de aproximadamente 1 a 25 microgramos de Tß4 (Figuras 8 y 9) . En adición, se observó que los ojos tratados con Tß4 tenían una inflamación reducida, comparándose con las córneas no tratadas. EJEMPLO 5 Modelo de Sanado Deteriorado La timosina ß4 también mejoró el sanado de heridas en un modelo deteriorado. El tratamiento con esteroides reduce la velocidad de reparación de heridas en mamíferos. Las ratas tratadas con esteroides, tales como hidrocortisona, sirven como un modelo del sanado de heridas deteriorado, debido a la demora observada en el cierre de la herida. Los animales se inyectaron intra-muscularmente cada día con hidrocortisona. Las ratas tratadas con esteroide mostraron un incremento significativo en el nive!. de sanado cuando se agregó Tß4 tópicamente, o se inyectó intra-peritonealmente . En el punto del tiempo inicial, el día 4, los am.males tópicamente tratados mostraron poca respuesta (cierre del hueco o ancho < 7 por ciento, N=3) comparándose con el tratamiento con suero. Sin embargo, la inyección intra-peritoneal dio como resultado una reducción del 28 por ciento en el tamaño del hueco, y una reducción del 14 por ciento en el ancho de la herida. En el día 7, se observó una respuesta tanto con el tratamiento tópico como con la inyección intra-peritoneal. El hueco en los animales tópicamente tratados disminuyó por el 39 por ciento, comparándose con el tratamiento con suero. El ancho de la herida disminuyó por el 23 por ciento. La inyección intra-peritoneal dio como resultado una disminución del 26 por ciento en el tamaño del hueco, y una disminución del 10 por ciento en el ancho de la herida. Tomados juntos, éstos demuestran que la Tß4 es útil para tratar heridas crónicas, así como agudas . Se han descrito un número de modalidades de la presente invención. No obstante, se entenderá que se pueden hacer diferentes modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. De conformidad con lo anterior, otras modalidades están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.