MXPA00008965A - Nuevas secuencias nucleotidas que codifican el gen pg1.. - Google Patents

Abstract

El polinucleotido aislado, que contiene una secuencia polinucleotida seleccionada del grupo a) polinucleotido que es al menos 70% identico a un polinucleotido que codifica un polipeptido que contiene la secuencia de aminoacido de la SEC ID no. 2, b) polinucleotido que codifica un polipeptido que contiene una secuencia de aminoacido que es al menos 70% identifica a la secuencia de aminoacido de la Sec ID no. 2, c) polipeptido que es complementario a los polinucleotidos de a) o b), y d) polinucleotido que contiene al menos 15 bases sucesivas de la secuencia polinucleotida de a), b) o c), y el proceso para aumentar el flujo a traves del ciclo de pentosa fosfato atenuando el gen pgi.

Description

NUEVAS SECUENCIAS NUCLEOTIDAS QUE CODIFICAN EL GEN PGI La presente invención proporciona secuencias nucleótidas de corinebacterias que codifican el gen pgi y un proceso para aumentar el flujo metabólico por medio del ciclo de pentosa fosfato atenuando el gen pgi Arte previo Los nucleótidos, vitaminas y en particular L-aminoácidos, muy particularmente lisina y triptófano, se usan en la industria de producción de alimentos, en la nutrición animal, medicina humana y la industria de farmacéuticos .

Se conoce que estas sustancias se producen por fermentación usando cepas de corinebacterias, en particular Corynebacterium glutamicum. Debido a su gran trascendencia, se están haciendo _ constantemente esfuerzos para mejorar el proceso de producción. Los mejoramientos al proceso podrían referirse a mediciones con relación a la tecnología de fermentación, por ejemplo agitación y suministro de oxígeno, o a la REF.: 122957 composición del medio nutriente, tal como por ejemplo concentración de azúcar durante la fermentación, o al desarrollo del producto, por ejemplo, por cromatografía de intercambio iónico o a las características de desarrollo intrínsecas del microorganismo mismo.

Las características de desarrollo de estos microorganismos se mejoran usando los métodos de mutagénesis, selección y selección mutante. De esta manera, se obtienen las cepas, las cuales son resistentes a antimetabolitos o son auxotróficas para los intermediarios reguladorament e significativos y producen nucleótidos, vitaminas o aminoácidos.

Durante algunos años, los métodos de la tecnología de ADN recombinante también se han usado para mejorar las cepas 'de Corynebacterium que producen nucleótidos, vitaminas y L-aminoácidos .

Una materia prima para la producción de estos compuestos en la glucosa, que se usa usualmente en la forma de almidón hidrolisado. La sacarosa también se usa como una material prima.

En la absorción celular, la glucosa se fosforila con el consumo de fos foenolpiruva t o (sistema de fosfotransferasa) (Malin & Bourd, Journal of Applied Bacteriology 71, 517-523 (1991)) y después está disponible para la célula como glucosa- 6- fos fato . La sacarosa se convierte a fructosa y glucosa- 6- fos fato por un sistema de fos fot rans ferasa (Shio et al., Agricultural and Biological Chemistry 54, 1513-1519 (1990)) y la reacción de invertasa (Yamamoto et al., Journal of Fermentation Technology 64, 285-291 (1986) ) .

Durante el metabolismo de glucosa, las enzimas glucosa- 6-fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.14.9) y glucosa-6-fosfato isomerasa (EC 5.3.1.9) compiten para el sustrato glucosa- 6-fos fato . La enzima glucosa-6-fosfato isomerasa cataliza la primera etapa de reacción de la ruta o glicólisis de Embden-Meyerhof - Parnas , es decir la conversión en fructosa-6-fosfato. La enzima glucosa- 6-fos fato deshidrogenasa cataliza la primera etapa de reacción de la porción oxidativa del ciclo de pentosa fosfato, es decir la conversión en 6-fosfoqlucono lactona .

En la porción oxidativa del ciclo de pentosa fosfato, la glucosa- 6- fos fato se convierte en ribulosa-5-fosfato, produciendo de esta manera equivalentes de reducción en la forma de NADPH. Conforme el ciclo de pentosa fosfato procede, las pentosas fosfato, hexosas fosfato y las triosas fosfato se int erconvierten . Las pentosas fosfato, tal como por ejemplo, 5-fos foribosil-1-pirofos fato se requieren, por ejemplo, en la biosíntesis de nucleótidos. La 5-fos for ibosil- 1 -pirofosfato es además un precursor para los aminoácidos aromáticos y el aminoácido L-histidina. NADPH actúa como un equivalente de reducción en numerosas biosíntesis anabólicas. Cuatro moléculas o NADPH de esta manera se consumen para la biosíntesis de una molécula de L-lisina del ácido oxalacético.

El significado del ciclo de pentosa fosfato para la biosíntesis y la producción de aminoácidos, en particular L-lisina, por corinebacterias se conoce y ha sido el enfoque del interés del especialista.

Oishi & Aida ( Agr icul tural and Biological Chemistry 29, 83-89 (1965)) sin embargo, han reportado la "derivación de hexosa monofosfato" de Brevibacterium ammoriiagenes . Las investigaciones usando los métodos del isótopo 13C por Ishino et al. (Journal of General and Applied Microbiology 37, 157-165 (1991)) en el metabolismo de glucosa durante la fermentación de ácido glutámico y lisina indican una correlación entre la producción de lisina y el flujo metabólico por medio del ciclo de pentosa fosfato.

Objetivo de la Invención Los inventores establecen el objetivo de proporcionar un proceso para aumentar el flujo metabólico por medio del ciclo de pentosa fosfato.

Breve Descripción de la Invención Los nucleótidos, vitaminas y en particular L-aminoácidos, muy particularmente L-lisina y L-triptófano, se usan en la industria de producción de alimentos, en la nutrición animal, medicina humana y la industria de farmacéuticos. Por lo tanto, existe interés general en proporcionar procesos mejorados parala producción de estos productos.

La presente invención proporciona un polinucleótido aislado que contiene una secuencia pol inucleót ida seleccionada del grupo a) polinucleótido que es al menos 70% idéntico a un polinucleótido que codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID no. 2, b) polinucleótido que codifica urt polipéptido que contiene una secuencia de aminoácido que es al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de la SEC ID no. 2, polipéptido que es complementario a los polinucleótidos de a) o b) , y d) polinucleótido que contiene al menos 15 bases sucesivas de la secuencia polinucleót ida de a) , b) o c) .

La presente invención también proporciona el polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 1, en donde preferentemente comprende ADN duplicable que cont iene : (i) la secuencia nucleótida mostrada en la SEC ID no . l o (ü) al menos una secuencia que iguala la secuencia (i) dentro del rango de degeneración del código genético, o (iii) al menos una secuencia que hibridiza con la secuencia complementaria a la secuencia (i) o (ii) y opcionalmente (iv) mutaciones sentido funcionalmente neutras en ( i ) .

La presente invención también proporciona un polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 2, que contiene la secuencia nucleótida como se muestra en la SEC ID no. 1 , un polinucleótido como se reivindica en la rei indicación 2 que codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID no. 2, un vector que contiene el polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 1, corte d, en particular pMCl, depositado en DSM 12969 de E. coli y bacterias de conversión que actúan como células huéspedes que contienen el vector como se reivindica en la reivindicación 6.

"Aislado" significa separado de su ambiente natural .

"Polinucleótido" en general, se refiere a polirribonucleót idos y polidesoxirribonucleót idos , en donde el ARN o ADN podrían ser modificados o no modificados .

"Polipéptidos" significan péptidos o proteínas que contienen dos o más aminoácidos conectados por enlaces pept í di eos .

Los po'lipéptidos de acuerdo a la invención incluyen el polipéptido de acuerdo a la SEC ID no. 2, en particular los que tienen la actividad biológica de glucosa- 6- fos fato isomerasa y también los que son al menos 70% idénticos al polipéptido de acuerdo a la SEC ID no. 2, preferentemente que son al menos 80% y particularmente preferentemente al menos 90% a 95% idénticos al polipéptido de acuerdo a la SEC ID no. 2, y qu-e tienen la estabilidad establecida.

Esta invención se refiere además a un proceso para la producción fermentativa de nucleótidos, vitaminas y en particular L-aminoácidos , muy particularmente lisina y triptófano, usando corinebacterias que en particular, ya producen las sustancias establecidas y en las que las secuencias nucleótidas que codifican el gen pgi se atenúan, en particular expresadas a un bajo nivel.

A este respecto, el término "atenuación" describe la reducción en o el corte de la activ_i dad intracelular de una o más enzimas (proteínas) en un microorganismo, estas enzimas se codifican por el ADN correspondiente, por ejemplo usando un promotor débil o un gen o alelo que codifica una enzima correspondiente que tiene baja actividad o inactiva la enzima correspondiente (proteína) y opcionalmente combinando estas medidas.

Los microorganismos proporcionados por la presente invención son capaces de producir nucleótidos, vitaminas y en particular L-aminoácidos, muy particularmente lisina y triptófano, de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, molasas, almidón, celulosa o de glicerol y etanol. Los microorganismos podrían comprender representativos de las corinebacterias en particular del género Corynebacterium. Dentro del género Corynebacterium, Corynebacterium glutamicum, en particular, podrían mencionarse, que se conoce en los círculos especialistas por su capacidad para producir L-amino ácidos .

Las cepas apropiadas del género Corynebacterium, en particular de las especies Corynebacterium glutamicum, son las cepas conocidas de tipo silvestre Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acet oglut amicum ATCC15806 Corynebacterium ace t oacidophilum ATCC13870 Corynebacterium t hermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC14020 y las mutantes o cepas producidas de las mismas que producen nucleótidos, vitaminas y L-aminoácidos, tal como por ejemplo el ácido 5' -inosínico que produce las cepas Corynebacterium ammoniagenes ATCC15190 Corynebacterium ammoniagenes ATCC15454 y Corynebacterium glutamicum ATCC14998 o tal como por ejemplo el ácido 5' -guanílico que produce las cepas Corynebacterium glutamicum ATCC21171 y Corynebacterium ammoniagenes ATCC19216 o tal como por ejemplo el ácido D-pant oténico que produce las cepas Corynebacterium glutamicum ATCC13032 /pEM3i 1vBNCD, pEKEX2panBC y Corynebacterium glutamicum ATCC13032 /pND-D2 o tal como por ejemplo L-lisina que produce las cepas Corynebactérium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium 1 actoferment um FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 y Corynebacterium glutamicum DSM 5714 o tal como por ejemplo L-triptófano que produce las cepas Corynebacterium glutamicum ATCC21850 y Corynebacterium glutamicum KY 9218 ( pKW9901 Los inventores fueron exitosos en el aislamiento del nuevo gen pgi que codifica la enzima glucosa-6-fosfato isomerasa (EC 5.3.1.9) de C. glutamicum.

Para aislar el gen pgi o también otros genes de C. glutamicum, una biblioteca del gen de este microorganismo primero se construye en E. coli. La construcción de las bibliotecas genómicas se describe en general, en los manuales y libros de texto conocidos. Ejemplos que podrían mencionarse son el libro de texto de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gent echno 1 ogie (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990) o el manual de Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Una biblioteca genómica muy bien conocida es la de la cepa W3110 de E. coli K-12, que se construyó por Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987) en vectores ?. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996) describen una biblioteca genómica de C. glutamicum ATCC13032, que se construyó usando el vector cósmido SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) en la cepa NM554 de E. coli K-12 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575) . Bormann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326)) nuevamente describen una biblioteca genómica de C. glutamicum ATCC13032 usando pHC79 cósmido (Hohn & Collins, Gene 11, 291-298 (1980)) . O'Donohue (The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acids Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway, 1997) describe la clonación de los genes de C. glutamicum usando el Sistema de Expresión ? Zap descrito por Short et al. (Nucleic Acids Research, 16: 7583) .

Una biblioteca genómica de C. glutamicum en E. coli también podría producirse usando los plásmidos, tal como'pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979) o pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19:259-268) . Los huéspedes apropiados en particular los de las cepas de E. coli con defectos de restricción o recombinación, tal como por ejemplo, la cepa DH5a (Jeffrey H. Miller: "A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992 La biblioteca genómica después se inserta en una cepa indicadora por la transformación (Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, 557-580, 1983) o electroporación (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123:343-347) . La cepa indicadora se distingue porque tiene una mutación en el gen por la cuestión de que causa un fenotipo detectable. DF1311 mutante de E. coli descrito por Kupor & Fraenkel (Journal of Bacteriology 100: 1296-1301 (1969)) es de trascendencia para los propósitos de la presente invención. Esta cepa porta mutaciones en los genes pgi y pgl, como resultado de lo cual el crecimiento en glucosa se inhibe severamente. Después de la transformación con un vector que contiene el gen pgi, el crecimiento en glucosa se re-establece. Un ejemplo de tal vector que contiene el gen pgi es pAMCl ( Figura 1 ) .

Los fragmentos de ADN largos clonados con la ayuda de cósmidos de otros vectores ? en cambio, podrían clonarse subsecuentemente en los vectores us.uales apropiados para la secuenciación de ADN.

Los métodos de secuenciación de ADN se describen inter alia en Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA, 74:5 63-5467, 1977) .

Las secuencias de ADN resultantes después podrían investigarse usando los algoritmos conocidos o los programas de análisis de secuencias, por ejemplo el programa de Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232 (1986)), el programa GCG de Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)), el algoritmo FASTA de Pearson & Lip an (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85, 2444-2448 (1988)) o el algoritmo BLAST de Altschul et al. (Nature Genetics 6, 119-129 (1994)) y comparado con las entradas de las secuencias disponibles en las bases de datos públicamente accesibles. Las bases de datos de las secuencias nucleótidas públicamente accesibles son, por ejemplo, la base de datos de European Molecular Biology Laboratory (EMBL, Heidelberg, Alemania) o la base de datos de la National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) .

Estos fueron los métodos usados para obtener la nueva secuencia de ADN que codifica el gen pgi de C. glutamicum, que se proporciona por la presente invención como la SEC ID no. 1. La secuencia de aminoácido de la proteína correspondiente se dedujo además de la secuencia de ADN anterior usando losa métodos descritos anteriormente. La SEC ID no. 2 muestra la secuencia de aminoácido resultante del producto del gen pgi.

La codificación de las secuencias de ADN que surgen de la SEC ID NO. 1 por la degeneración del código genético también se proporcionan por la presente invención. Similarmente, las secuencias de ADN que hibridizan con la SEC ID no. 1 o las porciones de la SEC ID no. 1 también se proporcionan por la presente invención. Finalmente, las secuencias de ADN producidas por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando los cebadores obtenidos de la SEC ID no. 1 también se proporcionan por la presente invención.

El experto en el arte podría encontrar las instrucciones para identificar las secuencias de ADN por medio de la hibridización inter alia en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260) . El experto en el arte podría encontrar las instrucciones para amplificar las secuencias de ADN usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) inter alia en el manual de Gait: Oligonucleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) y en Newton & Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994) .

Los inventores descubrieron que, después de la atenuación del gen pgi, las corinebacterias exhiben un flujo metabólico mejorado por medio del ciclo de pentosa fosfato y producen nucleótidos, vitaminas y en particular L-aminoácidos, particularmente preferentemente L-lisina y L-triptófano, de una manera me j orada .

La atenuación podría llevarse a cabo reduciendo o cortando la expresión del gen pgi o las propiedades catalíticas de la proteína de la enzima. Ambas medidas opcionalmente podrían combinarse.

La expresión del gen reducida podría lograrse por el control apropiado del cultivo o por la modificación genética (mutación) de las estructuras de las señales para la expresión del gen. Las estructuras de las señales para la expresión del gen son, por ejemplo, genes represores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de enlazamiento de ribosomas, el codón de inicio y terminadores. El experto en el arte encontrará la información en este contexto, por ejemplo, en la solicitud de patente WO 96/15246, en Boyd & Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), en Voskuil & Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), en Jensen & Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), en Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996) y en los libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tal como por ejemplo el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6th edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995) o por Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinhem, Alemania, 1990) .

Las mutaciones que resultan en la modificación o reducción de las propiedades catalíticas o las proteínas de la enzima se conocen del arte previo; ejemplo que podrían mencionarse son los papeles por Qiu & Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) y Móckel ("Die Threonindehydra tase aus Corybact erium glutamicum: Aufhebung der allos terischen Regulation und Struktur des Enzyms", Fors chungs zen t rum Jülich reports, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Alemania, 1994) . Las presentaciones resumidas podrían encontrarse en los libros de texto conocidos de genética y biología molecular tal como, por ejemplo, el libro de texto de Hagemann ("Allgemeine Genetik" , Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) .

Las mutaciones que podrían considerarse son transiciones, transversiones, inserciones, eliminaciones y trans versiones [sic]. Dependiendo del efecto del intercambio de los aminoácidos en la actividad enzimática, las mutaciones se conocen como mutaciones de sentido equivocado o mutaciones de no sentido. Las inserciones o eliminaciones de al menos un par de bases en un gen da origen a mutaciones de cambio de marco, como resultado de lo cual los aminoácidos incorrectos se insertan o la translación termina prematuramente. Las eliminaciones de dos o más codones resulta típicamente en un corte completo de la actividad enzimática. Las instrucciones para producir tales mutaciones pertenecen al arte previo y podrían encontrarse en los libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tal como por ejemplo el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6th edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), por Winnacker ("Gene und Klone", VCH Ver lagsgesells cha t f , Weinheim, Alemania, 1990) o por Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) .

Un ejemplo de la mutagénesis de inserción es el plásmido pMCl (Figura 2) , por medio del cual el gen pgi podría mutarse. El plásmido pMCl consiste del plásmido pBGS8, descrito por Spratt et al. (Gene 41: 337 (1986) ) , en el cual un fragmento interno del gen pgi, mostrado en la SEC ID no. 3, se ha insertado. Después de la transformación y la recombinación homologa en el gen pgi (inserción), este plásmido provoca una pérdida completa de la función de la enzima. Las instrucciones y las explicaciones que se refieren a la mutagénesis de inserción podrían encontrarse, por ejemplo, en Schwarzer & Pühler ( Bi o/Technology 9, 84-87 (1991)) o Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) .

Además de la atenuación del gen pgi, adicionalmente podría ser ventajoso para la producción de nucleótidos, vitaminas y en particular L-aminoácidos, muy particularmente L-lisina y L-triptófano, amplificar, en particular sobre-expresar, una o más enzimas de la ruta biosintética particular.

Por ejemplo, cuando se producen nucleótidos, de esta manera es posible sobre-expresar simultáneamente el gen purF que codifica la amidotrans f erasa glut amina-PRPP y/o sobre-expresar simultáneamente el gen carAB que codifica la carbamoilfosfato sintetasa.

Por ejemplo, cuando se produce L-lisina, de esta manera es posible sobre-expresar simultáneamente el gen dapA que codifica la dihidrodipicolinato sintasa (EP-B 0 197 335) , y/o sobre-expresar simultáneamente el gen gdh que codifica la glutamato deshidrogenasa (Bromann et al., Molecular Microbiology 6, 317-326 (1992) ) y/o amplificar simultáneamente un fragmento de ADN que imparte resistencia S - ( 2 - a inoetil) cisteína (EP-A 0 088 166) .

Por ejemplo, cuando se produce L-triptófano, de esta manera es posible sobre-expresar simultáneamente el gen tkt que codifica la transquetolasa y/o sobre-expresar simultáneamente el gen prs que codifica la fos foribos i lpi rofosfa t o sintasa.

Además de la atenuación del gen pgi, además podría ser ventajoso para la producción de nucleótidos, vitaminas y en particular L-amí noácidos , muy particularmente L-lisina y L-triptófano, cortar las reacciones secundarias indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Mi cro-organi sms" , en: Overproduct ion of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982) .

Los microorganismo que contienen el polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 1, también se proporcionan por la invención y podrían cultivarse continua o discontinuamente usando el proceso intermitente o el proceso intermitente de alimentación o el proceso intermitente de alimentación repetida para el propósito de producir nucleótidos, vitaminas y en particular L-aminoácidos, muy particularmente L-lisina y L-triptófano. Un resumen de los métodos de cultivo conocidos se da en el libro de texto por Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrens techni k ( Gustav Fi scher Ver lag , Stuttgart, 1991) ) o en este libro de texto por Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Weisbaden , 1994) ) .

El medio de cultivo que va a usarse debe satisfacer adecuadamente los requerimientos de las cepas particulares, Los medios de cultivo para varios microorganismos se describen en "Manual of Methods for General Biotechnology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) . Las fuentes de carbono que podrían usarse incluyen azúcares y carbohidratos, tal como por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, molasas, almidón y celulosa, aceites y grasas, tal como por ejemplo aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate, y aceite de coco, ácidos grasos, tal como por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, tal como por ejemplo glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, tal como por ejemplo ácido acético. Estas sustancias podrían usarse individualmente o como una mezcla. Las fuentes de nitrógeno que podrían usarse comprenden compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, tal como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor con exceso de maíz, harina de soya y urea o compuestos inorgánicos, tal como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno podrían usarse indi idualmente o como una mezcla. Las fuentes de fósforo que podrían usarse son ácido fosfórico, fosfato diácido de potasio o fosfato diácido de dipotasio o las sales correspondientes que contienen sodio. El medio de cultivo además debe contener sales metálicas, tal como por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, las sustancias esenciales promotoras del crecimiento, tal como aminoácidos y vitaminas también podrían usarse además de las sustancias establecidas anteriormente. Los precursores apropiados además, podrían adicionarse al medio de cultivo. Las sustancias de alimentación establecidas podrían adicionarse al cultivo como un lote simple o alimentarse apropiadamente durante la cultivación.

Los compuestos básicos, tal como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o agua amoniacal, o compuestos ácidos, tal como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, se usan apropiadamente para controlar el pH del cultivo. Los agentes ant iespumant es tal como por ejemplo poliglicol esteres de ácidos grasos, podrían usarse para controlar la espuma. Las sustancias de accionamiento selectivamente apropiadas, tal como por ejemplo antibióticos, podrían adicionarse al medio para mantener la estabilidad del plásmido. Oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, tal como por ejemplo aire, se introducen en el cultivo para mantener las condiciones aerobias. La temperatura del cultivo es normalmente de 20°C a 45°C y preferentemente de 25°C a 40°C. El cultivo se continua hasta que se ha formado una cantidad máxima del producto deseado. Este objetivo se logra normalmente dentro de 10 horas a 160 horas.

El flujo metabólico a través del ciclo de pentosa fosfato se determina usando e.g. un cultivo que contiene glucosa de 13C marcada con C-1 como la fuente de carbono. Este método analítico se basa en el hecho conocido de que cuando la glucosa se cataboliza por el ciclo de pentosa fosfato, la posición C-1 se convierte en dióxido de carbono, mientras que cuando se cataboliza por glicólisis, el marcado 13C-1 se pasa a 1 a posición C-3 del piruvato. El contenido de 13C de la posición C-3 del piruvato se determina en el tiempo apropiado usando los métodos de resonancia magnética nuclear o espectroscopia de masas para investigar los metabolitos extracelulares, tal como por ejemplo, lactato y en particular lisina. Alternativamente, después podrían determinarse los aminoácidos que podrían obtenerse por hidrólisis acida de la biomasa y el contenido de 13C en los átomos de carbono individuales del aminoácido particular. El experto en el arte podrían encontrar las instrucciones completas, en particular en relación con la evaluación de resultados asistido por computadora del contenido de 13C en vario átomos de carbono de los metabolitos investigados en Sonntag et al. (European Journal of Biochemistry 213, 1325-1331 (1993)), Sonntag et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 44, 489-495 (1995)), Marx et al. (Biotechnology and Bioengineering 49, 111-129 (1996) y Marx et al. (Biotechnology and Bioengineering 56, 168-180 (1997)) .

Los métodos para determinar los nucleótidos, vitaminas y L-aminoácidos se conocen del arte previo. Los L-aminoácidos, por ejemplo, podrían analizarse usando cromatografía de intercambio iónico con la derivación de ninhidrina subsecuente, como se describe por Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190), o podrían analizarse por HPLC de fase inversa como se describe en Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) .

El siguiente microorganismo se ha depositado con Deutsche Sammlung für Mi krorgani smen und Zellkulturen (DSMZ, Brunswick, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest : cepa DH5oc/pMCl de Escherichia coli como DSM 12969 Ej emplos Los siguientes ejemplos ilustrarán además esta invención. Las técnicas de biología molecular, e.g. el aislamiento de ADN del plásmido, tratamiento de la enzima de restricción, ligaciones, transformaciones estándares de Escherichia coli etc. usadas (a menos que se establezca lo contrario), se describen por Sambrook et al., (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratories, USA) .

Ejemplo 1 Construcción de una biblioteca genómica de la cepa AS019 de Corynebacterium glutamicum Una biblioteca de ADN de la cepa AS019 de Corynebacterium glutamicum (Yoshihama et al., Journal of Bacteriology 162, 591-597 (1985)) se construyó usando el sistema ? Zap Express™, (Short et al., (1988) Nucleic Acids Research, 16: 7583-7600), como se describe por O'Donohue (O'Donohue, M. (1997) . The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway) . El estuche ? Zap Express™ se adquirió de Stratagene (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd . , La Jolla, California 92037) y se usa de acuerdo a las instrucciones del fabricante. AS019-ADN se digirió con la enzima de restricción Sau3A y se ligó a BamHI tratado y se desfosforiló los brazos de ? Zap Express' Ejemplo 2 Clonación y secuenciación del gen pgi 1. Clonación La cepa DF1311 de Escherichia coli, que porta las mutaciones en los genes pgi y pgl como se describe por Kupor & Fraenkel, (Journal of Bacteriology 100: 1296- 1301 (1969)), se transformó con aprox. 500 ng de la biblioteca del plásmido AS019 ? Zap Express™ descrita en el Ejemplo 1. La selección para las transformaciones se hizo en el medio mínimo M9, (Sambrook et al., (1989) .

Molecular Cloning. A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories, USA), que contiene canamicina a una concentración de 50 mg/l e incubación a 37°C durante 48 horas. El ADN del plásmido se aisló de una transformante de acuerdo a Birnboim & Doly (Nucleic Acids Research 7: 1513-1523 (1979)) y designado pAMCl ( Figura 1 ) . 2. Secuenciación Para el análisis de la secuencia de la inserción clonada de pAMCl, el método de Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463-5467 (1977) se aplicó usando los cebadores marcados di ferencialmente con una marca fluorescente coloreada. Se llevó a cabo usando el analizador genético del prisma ABI 310 de Perkin Elmer Applied Biosystems, (Perkin Elmer Corporation, Norwalk, Connecticut, U.S.A), y el estuche de reacción de secuenciación del ciclo terminador Big Die™ del prisma ABI también de Perkin Elmer.

El análisis de la secuencia inicial se lievó a cabo usando los cebadores M13 inversos y hacia adelante universales obtenidos de Pharmacia Biotech (St. Albans, Herts, AL1 3AW, UK) : Cebador hacia adelante universal: GTA, ATA CGA CTC ACT ATA GGG C, cebador inverso M13: GGA AAC AGC TAT GAC CAT G. Los cebadores internos se diseñaron subsecuentemente de la secuencia obtenida, la cual permitió que se dedujera el gen pgi completo. La secuencia de los cebadores internos es como sigue: Cebador interno 1: GGA AAC AGG GGA GCC GTC Cebador interno 2: TGC TGA GAT ACC AGC GGT La secuencia obtenida después se analizó usando el programa DNA Strider (Marck, (1988)) . Nucleic Acids Research 16: 1829-1836), versión 1.0 en una computadora Apple Macintosh. Este programa permitió los análisis, tal como uso del sitio de restricción, análisis del marco de lectura abierto y determinación del uso de codón. Las búsquedas entre la secuencia de ADN obtenida y las de las bases de datos en EMBL y Genbank se lograron usando el programa BLAST (Altschul et al., (1997) . Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402) . Las secuenciad de ADN y proteínas se alinearon usando los programas Clustal V y Clustal W (Higgins and Sharp, 1988 Gene 73 : 237-244 ) .

De esta manera, la secuencia obtenida se muestra en la SEC ID NO 1. El análisis de la secuencia nucleótida obtenida reveló un marco de lectura abierto de 1650 pares de bases que se designó como el gen pgi. Codifica una proteína de 550 aminoácidos mostrada en la SEC ID NO 2.

Ejemplo 3 Mutagénesis del gen pgi 1. Construcción de un vector de corte pgi Un segmento interno del gen pgi se amplificó por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando ADN genómico aislado de Corynebacterium glutamicum AS019, (Heery *** Dunican, (1993) Applied and Enviromental Microbiology 59: 791-799), como el molde. Los cebadores pgi usados fueron: fwd. Cebador: ATG GAR WCC AAY GGH AA rev. Cebador: YTC CAC GCC CCA YTG RTC con R=A+G; Y=C+T; W=A+T; H=A+T+C.

Los parámetros de PCR fueron como sigue: 35 ciclos 94°C durante 1 min. 47°C durante 1 min. 72°C durante 30 seg . MgCl2 1.5 mM aprox. 150-200 ng de molde de ADN.

El producto de PCR obtenido se clonó en el vector pGEM-T comercialmente disponible recibido de Promega Corp., (Promega UK, Southampton) usando la cepa de E. coli JM109, (Yanish-Perron et al., 1985. Gene, 33: 103-119), como un huésped. La secuencia del producto de PCR se muestra como la SEC ID No. 3. La inserción clonada después se suprimió como un fragmento de EcoRI y se ligó al plásmido pBGSd (Spratt et al., Gene 41: 337-342 (1986)) pretratado con EcoRI . Las enzimas de restricción usadas se obtuvieron de Boehringer Mannheim UK Ltd., (Bell Lañe, Lewes, East Sussex BN7 1LG, UK) y se usaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante. JM109 de E. coli después se transformó con esta mezcla de ligación y las electrotrans formaciones se seleccionaron en agar Luria suplementado con IPTG ( isopropil-ß-D-t iogalact opiranos ida ) , XGAL (5-bromo-4-cloro-3 -indol il-D-galact opyranos ida ) y canamicina a una concentración de 1 nM, 0.02% y 50 mg/l respectivamente. Las placas de agar se incubaron durante doce horas a 37CC. El ADN del plásmido se aisló de una transformante, caracterizada por el análisis de la enzima de restricción usando EcoRI, BamHI y Salí designado pMCl (Figura 2) . 2. Mutagénesis de inserción del gen pgi en la cepa DSM5715 La cepa DSM 5715 después se transformó con el plásmido pMCl usando el método de electroporación descrito por Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303 (1989)) . La selección de la transformante procedió en agar LBHIS que consiste de 18.5 g/1 de caldo de infusión de cerebro-corazón, sorbitol 0.5 M, 5 g/1 de Bacto triptona, 2.5 g/1 de extracto de levadura Bacto, 5 g/1 de NaCl y 18 g/1 de agar Bacto, que se habían suplementado con 15 mg/l de canamicina y 1% de fructosa. La incubación se realizó durante 2 días a 33°C. Se obtuvieron las transformaciones 1, 2 y 3.

Las transformaciones resultantes se probaron usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Para este propósito, el ADN cromosomal se aisló de las transformaciones obtenidas y de la cepa DSM5715 como se describe en Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817 -1828 (1994) ) . Los siguientes cebadores de oligonucleótidos se seleccionaron para PCR en la base de la secuencia de ADN del gen pgi, que se muestra en la SEC ID no. 1 : pgi-1: 5' ACC CAC GCT GTC CTA CCT TA 3* pgi-2: 5' TGT CCC AAA TCA CGC CCT AG 3' pgi-3: 5' gat gat age ggc cag tgc at 3' Los cebadores mostrados se sintetizaron por la compañía MWG Biotech (Ebersberg, Alemania) y la reacción PCR realizada usando el método PCR estándar de Innis et al. (PCR- Protocols. A guide to methods and applications , 1990, Academic Press) . El ADN cromosomal de las transformaciones se usó como el molde, y el ADM cromosomal de DSM5715 se usó como el control. Cada molde se usó en dos reacciones PCR, una con el par cebador pgi-l/pgi-2 y una con el par cebador pgi-1/pgi-3.

Los lotes de PCR se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 0.8%. Usando el par cebador de pgi-l/pgi-2, cada una de las cuatro reacciones de PCR produjo un fragmento de ADN de una longitud de 0.5 kb . Usando el par cebador pgi-l/pgi-3, solo el control con DSM5715 ADN mostró un producto de amplificación de una longitud de 0.7 kb . No pudo detectarse el producto por PCR en los lotes con ADN cromosomal de las trans formaciones .

La transformante no. 3 caracterizada de esta manera se nombró la cepa DSM5715 : : pMCl .

Ejemplo 4 Formación de lisina La cepa DSM5715 : : pMCl de C. glutamicum obtenida en el Ejemplo 3 se cultivó en un medio nutriente apropiado para producir lisina y se determinó • el contenido de lisina en el sobrenadante de cultivo.

Para este propósito, la cepa primero se incubó toda en placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar de cerebro-corazón con canamicina (25 mg/l)) durante 24 horas a 33°C. Un precultivo se inoculó usando este cultivo de placa de agar (10 mi de medio en un matraz Erlenmeyer de 100 mi) . El medio de CglII completo (Kase & Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry 36 (9) 1611-1621 (1972)) se usó como el medio para el precultivo. La canamicina (25 mg/l) se adicionó a este precultivo. El precultivo se incubó durante 24 horas a 33°C a 240 rpm en un agitador. Un cultivo principal se inoculó de este precultivo, de modo que el OD inicial (660 nm) del cultivo principal fue de 0.1. El medio CGC se usó para el cultivo principal.

Medio CGC: (NH4) 2S04 5 g/1 Urea 5 g/1 Licor con exceso de maíz (CSL) 5 g/1 Glucosa (sometida a autoclave 36 g/1 separadamente) KH2P04/K2HPO 0.5 g/1 de cada uno MgS04 * 7 H20 0.25 g/1 CaCl, * 2 H,0 10 mg/l Bioton (filtrado estéril 0.2 mg/l FeSO, * 7 H,0 10 mg/l MnSO, H20 10.0 mg/l CuS04 0.2 mg/l ZnSO, X 1 H,0 1 mg/l N1C1, * 6 H,0 0.02 mg/l Leucina 0.15 mg/l El CSL y la solución salina se ajustaron a pH 7 con agua amoniacal y se sometieron a autoclave. Después se adicionaron las soluciones de vitaminas del sustrato estéril .

La cultivación se llevó a cabo en lotes de 10 mi de volumen en un matraz Erlenmeyer de 100 mi con mamparas. Se adicionó canamicina (25 mg/l) . La cultivación se llevó a cabo a 33°C y 80% de humedad atmosférica.

Después de 48 horas se determinó el OD a una medición de longitud de onda de 660 nm usando un Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich) . La concentración de la lisina formada se determinó con un analizador de aminoácidos de Eppendorf -BioTroni k (Hamburg, Alemania) por cromatografía de intercambio iónico y derivación de post-columna con detección de ninhidrina .

Los resultados del experimento se muestran en la Tabla 1 Tabla 1 Ejemplo 5 Amplificación del flujo metabólico por medio de la ruta pentosa fosfato (PPP) Las células se precul tivarón en 10 mL de CGIII (Menkel et al., 1989. Applied and Enviromental Microbiology 55: 684-688) . Se usó un matraz de 100 mL con mamparas con agitación y la cultivación se llevó a cabo durante 24 horas a un pH inicial de 7.0, a 33°C, y a 250 rpm en un agitador con un diámetro de rotación de 50 mm . Las células se lavaron en 9 g/L de NaCl y se usaron para inocular el cultivo principal con una densidad óptica a 660 nm de 0.1 (Biochrom Novaspec 4049, LKB Instrument GmbH, Gráfelfing, Alemania, ancho del tubo de experimentación de 10 mm) . El cultivo principal se realizó en 10 mL de CGC (Schrumpf et al., 1991. Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) que se modificó por la adición de 5 g/L de licor con exceso de maíz. Además, 30 g/L [ 1 -13C ] dextrosa (experimento A) o 15 g/L de dextrosa no marcada más 15 g/L [ 6-13C ] dextrosa (experimento B) se adicionó al medio. [ 1 -13C ] dextrosa (99% de enriquecimiento) y [ 6-13C ] dextrosa (99% de enriquecimiento) se adquirió de Cambridge Isotope Laboratories, Cambridge, MA, USA. Un matraz con agitación de 100 mL con mamparas se usó y la cultivación se llevó a cabo durante 72 horas a un.pH inicial de 7.0, a 33°C, y a 250 rpm en un agitador con una diámetro de rotación de 50 mm . Al final de la fermentación, se determinó la densidad óptica a 660 nm y la concentración de lisina-HCl (analizador de aminoácidos, Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Alemania) . Además, la biomasa se removió por centrifugación a 15000 g y el sobrenadante libre de células se secó con congelado.

El polvo seco se redisolvió en 1 L de D20 (99.98%, Deutero GmbH, Kastellaun, Alemania) y 3-t rimet ilsilil-propiona t o-2 , 2 , 3 , 3 , d4 (MSD Isotopes, Montreal, Canadá) se adicionó como estándar. Los experimentos de espectroscopia de resonancia magnética nuclear que incluyen la técnica de eco del espín y el análisis de la diferencia de espectro se realizaron en un espectrómetro AMX 400-WB (Bruker Analytik GmbH, Karlsruhe, Alemania) como se describe por Marx et al., 1996 (Biotechnology and Bioengineering 49: 111-129), Marx et al., 1999 (Metabolic Engineering 1: 35-48) y Wendisch et al., 1997 (analytical Biochemistry 245: 196-202) . El enriquecimiento de 13C en las posiciones de los átomos de carbono de lisina se determinó y los principios como se describe por Marx et al., 1996 (Biotechnology and Bioengineering 49: 111-129), Marx et al., 1997 (Biotechnology and Bioengineering 56: 168-180), Marx et al., 1999 (Metabolic Engineering 1: 35-48), Sonntag et al., 1993 (European Journal of Biochemistry 213: 1325-1331) y Sonntag et al., 1995 (Applied Microbiology and Biotechnology 44: 489-495) se usaron para llevar a cabo la estimación del flujo metabólico a través de la ruta pentosa fosfato (PPP) como se describe posteriormente.

Los resultados de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear se muestran en la Figura 3 a la Figura 6. Los paneles muestran las integrales para el espectro 13C desacoplado. Se obtuvieron las diferencias de las integrales, las cuales se muestran en los paneles b cuando las integrales para el enriquecimiento 13C para una posición de átomo de carbono particular se obtuvo cuando la integral de los paneles b se dividió por la integral de los paneles a. Para la posición C-4 del átomo de carbono de lisina (indicada como L-4 en la Figura 3a y la Figura 3b) la diferencia de la integral de espectro de 38.286 se dividió por la integral para el espectro de 13C desacoplado de 198.867 y el resultado se dividió por 1.95, lo cual resultó en un enriquecimiento de 9.9% (Tabla 2) . La eficiencia de los experimentos de eco del espín fue diferente para las posiciones de los átomos de carbono simples de lisina como se describe por Wendisch et al., 1997 (analytical Biochemistry 245: 196-202), de modo que el coeficiente de división varía de 1.80 a 1.99. Los resultados descritos en la Figura 3 y 5 se obtuvieron para la cultivación en donde se adicionó [ 6-13C ] dextrosa (experimento B) al medio. Los resultados descritos en la Figura 4 y la Figura 6 se obtuvieron para la cultivación, en donde se adicionó [ 1-13C ] dextrosa al medio (experimento A) .

Tabla 2 Enriquecimiento de 13C en las posiciones de los átomos de carbono de lisina para la cepa madre DSM5715 y DSM5715 : : pMCl mutante de pgi. Las posiciones de los átomos de carbono de lisina se indican por L-2 a L-6 (cf . Figura 3 a la Figura 6) . En la última columna, se indica el flujo de metabolito a través de la ruta de pentosa fosfato normalizada por la velocidad de la toma de dextrosa. En la octava columna se indica que la relación de enriquecimiento es (B-A)/B.

Cepa Dex1 L-2 L-3 L-4 L-5 L-6 e . r , Flu j o l2 [l-13] 11.6 28.0 17.0 28.4 5.6 l2 [6-13] 11.9 23.6 8.4 24.5 1.4 43±4 60 + 6 23 [l-13] 1.7 1.5 14.6 1.7 1.4 23 [6-13] 5.0 27.7 9.9 28.1 4.3 98±1 98±2 1 Dextrosa enriquecida 2 La cepa 1 es DMS5715. 3 La cepa 2 es DSM5715 : : pMCl e.r. es la relación de enriquecimiento (B-A)/B Para el crecimiento de las células en el experimento A y el crecimiento en el experimento B, se obtuvieron diferentes enriquecimiento de 13C en las posiciones de los átomos de carbono de lisina (Tabla 2) . Especialmente, la pérdida de enriquecimiento en a posición C3 y C5 de lisina en el experimento A para la cepa DSM5715 : : pMCl indica un alto flujo de PPP. El flujo a través de PPP se derivó de la relación (B-A)/B, en donde A indica el enriquecimiento de 13C total en la lisina que se preparó del experimento A y B indica el enriquecimiento de 13C total en la lisina que se preparó del experimento B (Ec. 1; Ec. 2; Ec. 3; Tab. 2) LYS 2 A e.g. es el enriquecimiento de 13C en la posición 2 del átomo de carbono de lisina en el experimento A y GLC_6_B es el enriquecimiento 13C en la posición del átomo del carbono 6 del sustrato de dextrosa en el experimento A. Con el uso de la Ec. 3 en enriquecimiento se normalizó por la división por el enriquecimiento de la posición Cl de dextrosa de 99% y C6 de 49% en el experimento A y el experimento B respectivamente. Para la cepa DSM5715 el enriquecimiento de 13C en trahalosa reveló que el equilibrio total entre los pozos ci toplásmicos de glucosa 6-fosfato y fructosa 6-fosfato existe, el cual es importante para la determinación del flujo a través de PPP como se deriva de la relación (B-A)/B.

LYS_A = LYS_2_A + LYS_3_A + LYS_5_A + LYS_6_A - 4.4 Ec. 1 LYS B = LYS 2 B + LYS 3 B + LYS 5 B + LYS 6 B 4.4 Ec. 2 (B-A) = [LYS_B*99/ (GLC_6_B - 1.1) - LYS_A* 99 / ( GLC_1_A 1.1) ] / [LYS_B*99/ (GLC_6_B - 1.1)] Ec . 3 Mediante estimulación por computadora y con el uso de modelos metabólicos como se describe por Marx et al., 1996 (Biotechnology and Bioengineering 49: 111-129), Marx et al., 1997 (Biotechnology and Bioengineering 56: 168-180), Marx et al., 1999 (Metabolic Engineering 1: 35-48), Sonntag et al., 1993 (European Journal of Biochemistry 213: 1325-1331) y Sonntag et al., 1995 (Applied Microbiology and Biotechnology 44: 489-495) se encontró una función hiperbólica o lineal para la correlación entre el flujo de PPP y la relación de enriquecimiento (B-A) /B para la red metabólica cuando estuvo presente fosfoglucoi somerasa y totalmente equilibrado o ausente, respecti amente (Figura 7) . La comparación de los resultados experimentales para la relación (B-A)/B como se indica en la Tabla 2, con los resultados que se calcularon por la estimulación por computadora mostraron que para la cepa madre DSM5715 el flujo molar de PPP fue de aproximadamente 60 mol por 100 mol de dextrosa (Figura 5) . Esto compara bien con los resultados del flujo metabólico de la literatura para la cepa DSM5715 (Marx et al., 1996. Biotechnology and Bioengineering 49: 111-129), Marx et al., 1997 (Biotechnology and Bioengineering 56: 168-180), Marx et al., 1998. Preprints of the l th International Conference on Computer Applications in Biotechnology, Osaka Japón, 31 de mayo al 4 de junio de 1998. PP. 387-392; Marx et al., 1999 (Metabolic Engineering 1: 35-48), Sonntag et al., 1995. Applied Microbiology and Biotechnology 44: 489-495) . Para la cepa DSM5715 : : pMCl se reveló que el flujo molar de PPP fue de 98 mol por 100 mol de dextrosa .

Los resultados muestran claramente que como una consecuencia de la mutación eliminada del gen pgi, el flujo metabólico total de la toma de dextrosa se re-dirigió a la PPP.

Ejemplo 6 Reducción de la formación del subproducto Las cepas DSM5715 y DSM5715 : : pMCl se cultivaron y analizaron como se describió en el Ejemplo 5. La inspección del espectro de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear del sobrenadante del cultivo (Figura 3 a la Figura 6) reveló que las concentraciones de los subproductos (e.g. trehalosa, malato de isopropilo, lactato, oxoglutarato y valina) para la cepa DSM5715 : : pMCl se redujeron significativamente comparado con la cepa madre DSM5715 Los resultados se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3 Concentración de los varios compuestos extracelulares (mM) después de 72 horas de fermentación en el matraz de agitación como se determina por la espectroscopia de resonancia magnética nuclear protónica. Para la evaluación de los cambios químicos en el espectro de la resonancia magnética nuclear, ver las Figuras 5 y 6.

Se anexan las siguientes figuras: Figura 1: Mapa del plásmido pAMCl Figura 2: Mapa del plásmido pMCl Las abreviaciones y nombres usados en las Figuras y 2 se definen como sigue: Neo r : resistencia de neomicina/canami ciña ColEl ori origen de replicación del plásmido ColEl CMV: promotor de citomegalovirus lacP promotor de lactosa pgi: gen de fosfoglucosa isomerasa lacZ extremo 5' del gen ß-galactos idasa apareamiento sitio de apareamiento 31 del virus 40 SV40 3': de simio SV40 polyA sitio de poliadenilación del virus 40 de simio f 1 ( - ) ori origen de replicación del fago filamentoso fl SV40 ori: origen de replicación del virus 40 de simio kan r resistencia de canamicina inserción fragmento interno del gen pgi pgi op : origen de replicación del plásmido pBGS8 Accl sitio de corte de la enzima de restricción Accl Apa I : sitio de corte de la enzima de restricción Apal BamHI : sitio de corte de la enzima de restricción BamHI Clal : sitio de corte de la enzima de restricción Clal Dral : sitio de corte de la enzima de restricción Dral EcoRI : sitio de corte de la enzima de restricción EcoRI HindIII : sitio de corte de la enzima de restricción HindIII Mlul : sitio de corte de la enzima de restricción Mlul MstII sitio de corte de la enzima de restricción MstII Nhel sitio de corte de la enzima de restricción Nhel Nsil : sitio de corte de la enzima de restricción Nsil PstI sitio de corte de la enzima de restricción PstI PvuII sitio de corte de la enzima de restricción PvuII Sacl: sitio de corte de la enzima de restricción Sacl Salí : sitio de corte de la enzima de restricción Salí Smal : sitio de corte de la enzima de restricción Smal Spel sitio de corte de la enzima de restricción Spel SspI sitio de corte de la enzima de restricción SspI Figura 3 Espectro de resonancia magnética nuclear para la cepa DSM5715 : : pMCl cultivada en [ 6-13C ] dext rosa . Abreviaciones: L-2 a L-6, resonancia magnética nuclear del enlace de protones a las posiciones de los átomos de carbono C-2 a C-6 de lisina de las mediciones con 13C-desacoplamient o (a) y adquisición de resultados del eco de espín sin 13C-desacoplamient o (b) .

Figura 4 : Espectro de resonancia magnética nuclear para la cepa DSM5715 : : pMCl cultivada en [ 1 -13C ] dext ros a . Abreviaciones: L-2 a L-6, resonancia magnética nuclear del enlace de protones a las posiciones de los átomos de carbono C-2 a C-6 de lisina de las mediciones con 13C-desacoplamiento (a) y adquisición de resultados del eco de espín sin 13C-desacoplamient o (b) .

Figura 5 Espectro de resonancia magnética nuclear para la cepa DSM5715 cultivada en [6-13C] dextrosa. Abreviaciones: L-2 a L-6, resonancia magnética nuclear del enlace de protones a las posiciones de los átomos de carbono C-2 a C-6 de lisina de las mediciones con :3C-desacoplamiento (a) y adquisición de resultados del eco de espín sin 13C-desacoplamient o (b) .

Figura 6 : Espectro de resonancia magnética nuclear para la cepa DSM5715 cultivada en [1-13C] dextrosa. Abreviaciones: L-2 a L-6, resonancia magnética nuclear del enlace de protones a las posiciones de los átomos de carbono C-2 a C-6 de lisina de las mediciones con 13C-desacoplamient o (a) y adquisición de resultados del eco de espín sin 13C-desacoplamient o (b) .

Figura 7 Correlación entre el flujo de la ruta de pentosa fosfato y la relación de enriquecimiento (B-A)/B. Mediante la estimulación por computadora y con el uso de los modelos metabólicos como se describe por Marx et al., 1996 (Biotechnology and Bioengineering 49: 111-129), Marx et al., 1997 (Biotechnology and Bioengineering 56: 168-180), Marx et al., 1999 (Metabolic Engineering 1: 35-48), Sonntag et al., 1993 (European Journal of Biochemistry 213: 1325-1331) y Sonntag et al., 1995 (Applied Microbiology and Biotechnology 44: 489-495) se encontró una función hiperbólica o lineal para la correlación entre el flujo de PPP y la relación de enriquecimiento (B-A)/B para la red metabólica cuando estuvo presente fos foglucoisomerasa (Pgi) y totalmente equilibrado ( ü ) o ausente (-), respectivamente. El flujo a través de PPP se derivó de la relación (B-A)/B en donde A indica el en iquecimiento 13C total en lisina que se preparó del experimento A y B indica el enriquecimiento 13C total en lisina que se preparó del experimento B (Tabla 2) . Los valores experimentales para (B-A)/B y los flujos de PPP correspondientes se indican por las cepas DSM5715 (D) y DSM5715 : : pMC 1 (D) . El flujo de PPP se expresa como mol por 100 mol de la velocidad de la toma de dextrosa y la relación de enriquecimiento (B-A)/B se indica en por ciento.

LISTA DE SECUENCIAS <110> National University of Ireland, Galway Degussa-Huls AG <120> Nuevas secuencias nucleótidas que codifican el gen pgi <130> 990128BT <140> <141> <160> 3 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2811 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (373) .. (2022) <400> 1 aaaacccgag gggcgaaaat tccaccctaa cttttttggg atcccctttt tccggggaat 60 taattggttt gggtttcaat gggaaaacgg gaaacaatgg gccaaaggtt caaaaacccc 120 aaaagggggc cgggttcaaa ttcccaaaaa aaatggcaaa aaaggggggg ccaaaaccaa 180 gttggccccc aaaccaccgg ggcaacggcc cacccacaaa ggggttgggt taaaggaagg 240 acgcccaaag taagcccgga atggcccacg ttcgaaaaag caggccccaa ttaaacgcac 300 cttaaatttg tcgtgtttcc cactttgaac actcttcgat gcgcttggcc acaaaagcaa 360 gctaacctga ag atg tta ttt aac gac aat aaa gga gtt ttc atg gcg gac 411 Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp 1 5 10 att teg acc acc cag gtt tgg ca gac ctg acc gat cat tac tea aac 459 lie Ser Thr Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn 15 20 25 ttc cag gca acc act ctg cgt gaa ctt ttc aag gaa gaa aac cgc gcc 507 Phe Gln Ala Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala 30 35 40 45 gag aag tac acc ttc tec gcg gct ggc etc cae gtc gac ctg teg aag 555 Glu Lys Tyr Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys aat ctg ctt gac gac gcc acc etc acc aag etc ctt gca ctg acc gaa 603 Asn Leu Leu Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu, Ala Leu Thr Glu 65 70 75 gaa tet ggc ctt cgc gaa cgc att gac gcg atg ttt gcc ggt gaa cae 651 Glu Ser Gly Leu Arg Glu Arg lie Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His 80 85 90 etc aac aac acc gaa gac cgc gct gtc etc cae acc gcg ctg cgc ctt 699 Leu Asn Asn Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu 95 100 105 ect gcc gaa gct gat ctg tea gta gat ggc caá ga.t gtt gct gct gat 747 Pro Ala Glu Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val Ala Ala Asp 110 115 120 125 gtc cae gaa gtt ttg gga cgc atg cgt gac ttc gct act gcg ctg cgc 795 Val His Glu Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg 130 135 140 tea ggc aac tgg ttg gga cae acc ggc cae acg ate aag aag ate gtc 843 Ser Gly Asn Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr lie Lys Lys lie Val 145 150 155 aac att ggt ate ggt ggc tet gac etc gga cea gcc atg gct acg aag 891 Asn lie Gly lie Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys 160 165 170 gct ctg cgt gca tac gcg acc gct ggt ate tea gca gaa ttc gtc tec 939 Ala Leu Arg Ala Tyr Ala Thr Ala Gly lie Ser Ala Glu Phe Val Ser 175 180 185 aac gtc gac cea gca gac etc gtt tet gtg ttg gaa gac etc gat gca 987 Asn Val Asp Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala 190 195 200 205 gaa tec acá ttg ttc gtg ate gct teg aaa act ttc acc acc cag gag 1035 Glu Ser Thr Leu Phe Val lie Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu 210 215 220 acg ctg tec aac gct cgt gca gct cgt gct tgg ctg gta gag aag etc 1083 Thr Leu Ser Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu 225 230 235 ggt gaa gag gct gtc gcg aag cae ttc gtc gca gtg tec acc aat gct 1131 Gly Glu Glu Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala 240 245 250 gaa aag gtc gca gag ttc ggt ate gac acg gac aac atg ttc ggc ttc 1179 Glu Lys Val Ala Glu Phe Gly lie Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe 255 260 265 tgg gac tgg gtc gga ggt cgt tac tec gtg gac tec -gca gtt ggt ctt 1227 Trp Asp Trp Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu 270 275 280 285 tec etc atg gca gtg ate ggc ect cgc gac ttc atg cgt ttc etc ggt 1275 Ser Leu Met Ala Val lie Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly 290 295 _ 300 gga ttc cae gcg atg gat gaa cae ttc cgc acc acc aag ttc gaa gag 1323 Gly Phe Hxs Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu 305 310 315 aac gtt cea ate ttg atg gct ctg etc ggt gtc tgg tac tec gat ttc 1371 Asn Val Pro lie Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe 320 325 330 tat ggt gca gaa acc cae gct gtc cta ect tat tec gag gat etc age 1419 Tyr Gly Ala Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser 335 340 345 cgt ttt gct gct tac etc cag cag ctg acc atg gag acc aat ggc aag 1467 Arg Phe Ala Ala Tyr Leu Gln Gln Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys 350 355 360 365 tea gtc cae cgc gac ggc tec ect gtt tec act ggc act ggc gaa att 1515 Ser Val His Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu lie 370 375 380 tac tgg ggt gag ect ggc acá aat ggc cag cae gct ttc ttc cag ctg 1563 Tyr Trp Gly Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Phe Gln Leu 385 390 395 ate cae cag ggc act cgc ctt gtt cea gct gat ttc att ggt ttc gct 1611 lie His Gln Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe lie Gly Phe Ala 400 405 410 cgt cea aag cag gat ctt ect gcc ggt gag cgc acc atg cat gac ctt 1659 Arg Pro Lys Gln Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu 415 420 425 ttg atg age aac ttc ttc gca cag acc aag gtt ttg gct ttc ggt aag 1707 Leu Met Ser Asn Phe Phe Ala Gln Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys 430 435 440 445 aac gct gaa gag ate gct gcg gaa ggt gtc gca ect gag ctg gtc aac 1755 Asn Ala Glu Glu lie Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn 450 455 460 cae aag gtc gtg cea ggt aat cgc cea acc acc acc att ttg gcg gag 1803 His Lys Val Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr lie Leu Ala Glu 465 470 475 gaa ctt acc ect tet att etc ggt gcg ttg ate gct ttg tac gaa cae 1851 Glu Leu Thr Pro Ser lie Leu Gly Ala Leu lie Ala Leu Tyr Glu His 480 485 490 acc gtg atg gtt cag ggc gtg att tgg gac ate aac tec ttc gac caá 1899 Thr Val Met Val Gln Gly Val lie Trp Asp lie Asn Ser Phe Asp Gln 495 500 505 tgg ggt gtt gaa ctg ggc aaa cag cag gca aat gac etc gct c_cg gct 1947 Trp Gly Val Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala 510 515 520 525 gtc tet ggt gaa gag gat gtt gac teg gga gat tet tec act gat tea 1995 Val Ser Gly Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser 530 535 540 ctg att aag tgg tac cgc gca aat agg tagtcgcttg cttatagggt 2042 Leu lie Lys Trp Tyr Arg Ala Asn Arg 545 550 caggggcgtg aagaatcetc gcctcatagc actggecgct atcatcctga cctcgtt caa2102 tetgegaaca gctattactg ctttagctcc gctggtttct gagattcggg a tga tt tagg2162 ggttagtgct tctcttattg gtgtgttggg catgatcccg actgctatgt t cgcggt tgc2222 tgcgtttgcg cttccgtcgt tgaagaggaa gttcactact tcccaactgt tga t gt t tgc2282 catgctgttg actgctgccg gtcagattat tcgtgtcgct ggacctgctt cgc tgt t gat 2342 ggtcggtact gtgttcgcga tgtttgcgat cggagttacc aatgtgttgc t tccga t tgc2 02 tgttagggag tattttccgc gtcacgtcgg tggaatgtcg acaacttatc t gg t gt cgt t 2462 ccagattgtt caggcacttg ctccgacgct tgccgtgccg atttctcagt gggc tacaca2522 tgtggggttg accggttgga gggtgtcgct cggttcgtgg gcgctgctgg ggt tggt tgc2582 ggcgatttcg tggattccgc tgttgagttt gcagggtgcc agggttgttg cg_gcgccgtc2642 gaaggtttct cttcctgtgt ggaagtcttc ggttggtgtg ggjjctcgggt tga tgt t t gg2702 gtttacttcg tttgcgacgt atatcctcat gggttttatg ccgcagatgg t aggt gat cc2762 aaagaattca aaaagcttct cgagagtact tctagagcgg ccgcgggcc 2811 <210> 2 <211> 550 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp I Le Ser Thr 5 10 15 Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn Phe Gln Ala 20 25 - 30 Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala Glu Lys Tyr 35 40 45 Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Lei Ser Lys Asn Leu Leu 50 55 60 Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Leu Thr Glu Glu Ser Gly 65 70 75 80 Leu Arg Glu Arg lie Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His Leu Asn Asn 85 90 95 Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu Pro Ala Glu 100 105 110 Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val Ala Ala Asp Val His Glu 115 120 125 Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg Ser Gly Asn 130 135 ' 140 Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr lie Lys Lys He Val Asn He Gly 145 150 155 160 He Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys Ala Leu Arg 165 170 175 Ala Tyr Ala Thr Ala Gly He Ser Ala Glu Phe Val Ser Asn Val Asp 180 185 190 Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala Glu Ser Thr L95 200 205 Leu Phe Val He Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu Thr Leu Ser 210 215 220 Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu Gly Glu Glu 225 230 235 240 Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala Glu Lys Val 245 250 255 Ala Glu Phe Gly He Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe Trp Asp Trp 260 265 270 Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu Ser Leu Met 275 280 285 Ala Val He Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly Gly Phe His 290 295 300 Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu Asn Val Pro 305 ' 310 315 320 He Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe Tyr Gly Ala 325 330 335 Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser Arg Phe Ala 340 345 - 350 Ala Tyr Leu Gln Gln Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys Ser Val His 355 360 365 Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu He Tyr Trp Gly 370 375 380 Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Phe Gln Leu He His Gln 385 390 395 400 Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe He Gly Phe Ala Arg Pro Lys 405 410 415 Gln Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu Leu Met Ser 420 425 430 Asn Phe Phe Ala Gln Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys Asn Ala Glu 435 440 445 Glu He Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn His Lys Val 450 455 460 Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr He Lea Ala Glu Glu Leu Thr 465 470 475 480 Pro Ser He Leu Gly Ala Leu He Ala Leu Tyr Glu His Thr Val Met 485 490 495 Val Gln Gly Val He Trp Asp He Asn Ser Phe Asp Gln Trp Gly Val 500 505 510 Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala Val Ser Gly 515 520 525 Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser Leu'lle Lys 530 535 540 Trp Tyr Arg Ala Asn Arg 545 550 <210> 3 <211> 462 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 atggagacca atggcaagtc agtccaccgc gacggctccc ctgtttccac tggcactggc 60 gaaatttact ggggtgagcc tggcacaaat ggccagcacg ctttcttcca gctgatccac 120 cagggcactc gccttgttcc agctgatttc attggtttcg ctcgtccaaa gcaggatctt 180 cctgccggtg agcgcaccat gcatgacctt ttgatgagca acttcttcgc acagaccaag 240 gttttggctt tcggtaagaa cgctgaagag atcgctgcgg aaggtgtcgc acctgagctg 300 gtcaaccaca aggtcgtgcc aggtaatcgc ccaaccacca ccattttggc ggaggaaett 360 accccttcta ttctcggtgc gttgatcgct ttgtacgaac acacegtgat ggttcagggc 420 gtgatttggg acatcaactc cttcgaccaa tggggcgtgg aa 462 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. El polinucleótido aislado, caracterizado porque contiene una secuencia polinucleót ida seleccionada del grupo a) polinucleótido que es al menos 70% idéntico a un polinucleótido que codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID no. 2, b) polinucleótido que codifica un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácido que es al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de la SEC ID no. 2, c) polipéptido que es complementario a los polinucleótidos de a) o b) , y d) polinucleótido que contiene al menos 15 bases sucesivas de la secuencia polinucleót ida de a) , b) o c) .

2. El polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido es un ADN replicable, preferentemente recombinante .

3. El polinucleótido como se reivindica en la rei indicación 1, caracterizado porque el polinucleótido es un ARN.

4. El polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 2, caracterizado porque contiene la secuencia nucleótida como se muestra en la SEC ID no. 1.

5. La secuencia pol inucleót ida como se reivindica en la rei indicación 2, caracterizada porque codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID no. 2.

6. El vector, caracterizado porque contiene el polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 1, corte d, en particular pMCl, depositado en DSM12969 de E . coli .

7. La corinebacteria que actúa como célula huésped, caracterizada porque contiene el vector como se reivindica en la reivindicación 6.

8. El proceso para aumentar el flujo metabólico a través del ciclo de pentosa fosfato en corinebacterias, caracterizado porque el polinucleótido como se reivindica en la rei indicación 1 se atenúa, en particular se expresa a un nivel inferior o cortado y estas bacterias se fermentan.

9. El proceso como se reivindica en la reivindicación 8, caracterizado porque las corinebacterias se fermentan las cuales producen nucleótidos, vitaminas y en particular L-aminoácidos.

10. El proceso como se reivindica en la rei indicación 8, caracterizado porque se reduce la expresión del polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 1.

11. El proceso como se reivindica en la reivindicación 8, caracterizado porque se reducen las propiedades catalíticas del polipéptido (proteína de la enzima) para el cual se codifica el polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 1.

12. El proceso como se reivindica en la reivindicación 8, caracterizado porque la atenuación se logra usando el método de mutagénesis de integración por medio del plásmido pMCl, mostrado en la Figura 2 y depositado como DSM12969.

13. El proceso como se reivindica en la reivindicación 9, caracterizado porque los nucleótidos se producen por fermentación bacteriana en la que a) el gen purF codifica la glut ami na- PRPP amidotransferasa y/o b) el gen carAB codifica la carbamoi 1 fos fa t o sintasa se sobre-expresan simultáneamente.

14. El proceso como se reivindica en la reivindicación 9, caracterizado porque la L-lisina se produce por fermentación bacteriana en la que el gen dapA que codifica la dihidropicol ina t o sintasa se sobre-expresa simultáneamente, y/o el gen gdh que codifica la glutamato de s h i drogena s a s e s obre - exp re s a simultáneamente, y/o un fragmento de ADN que imparte la resistencia S - ( 2 - a m i n o e t i 1 ) c i s t e i n a se amplifica simultáneamente .

15. El proceso como se reivindica en la reivindicación 9, caracterizado porque el L-triptófano se produce por fermentación bacteriana en la que el gen tkt que codifica la t ransquet ola sa se sobre-expresa simultáneamente, y/o el gen prs que codifíca la fosforibos ilpirofos fa to sintasa se sobre- expresa simultáneamente.

16. El proceso para la producción de nucleótidos, vitaminas o L-aminoácidos caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes etapas: fermentación de microorganismos de acuerdo a una o más de las reivindicaciones precedentes, en las que al menos el gen pgi se atenúa o corta, opcionalmente en combinación con amplificación de los genes adicionales, b) acumulación del producto deseado en el medio o en las células de los microorganismos y c) aislamiento del producto.

17. El proceso de acuerdo a una o más de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se usan los microorganismos del género Corynebacterium glutamicu .