MX2015006112A

MX2015006112A - Proteinas de captura de superficie celular recombinantes.

Info

Publication number: MX2015006112A
Application number: MX2015006112A
Authority: MX
Inventors: Gang Chen; Darya Burakov; Dipali Deshpande; James Fandl; Thomas Aldrich; Vishal Kamat
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2012-11-14
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2015-08-06
Also published as: IL238176A0; KR20150084028A; KR20230119245A; CA3204343A1; AR121002A2; JP6668074B2; IL285015A; EP2949667A2; KR20210014766A; TW201439121A; AU2021202371A1; US20180118852A1; US9758592B2; CN104797598A; TWI675044B; PL2949667T3; IL275270B; SG10201804124XA; AU2018253474A1; CN104797598B

Abstract

Se proveen proteínas de captura de superficie celular recombinantes y moléculas de detección que son útiles para aislar y detectar células que producen una proteína de interés (P01) heterodimérica secretada, que tiene un dominio CH3 y/o dominio CH3 sustituido de inmunoglobulina. También se proveen proteínas de captura de superficie celular recombinantes y moléculas de detección que aíslan y detectan anticuerpos biespecíficos. La invención también provee proteínas de unión de antígeno recombinantes que son capaces de reconocer y unirse a proteínas de interés que contienen un dominio CH3 y/o un dominio CH3 modificado, tal como un dominio CH3 con o sin sustituciones de aminoácidos en H95 y Y96 (IMGT).

Description

PROTEÍNAS DE CAPTURA DE SUPERFICIE CELULAR RECOM BINANTES INTERREFERENCIA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de acuerdo con 35 USC § 1 19(e) de la solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 61/726,040, presentada el 14 de noviembre de 2012, dicha solicitud se incorpora aquí específicamente como referencia en su totalidad.

LISTADO DE SECUENCIAS Esta solicitud incorpora como referencia el listado de secuencias presentado en forma legible en computadora como el archivo 8600WO_ST25.txt, creado el 12 de noviembre de 2013 (86,267 bytes).

CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de esta invención está relacionado con proteínas de captura de superficie celular recombinantes y métodos para identificar, aislar y enriquecer células que producen proteínas secretadas que son heterodímeros, por ejemplo, proteínas biespecíficas. Más específicamente, las proteínas de captura de superficie celular y los métodos permiten el aislamiento rápido y eficiente de líneas celulares productoras de anticuerpo recombinante de alta expresión que incluyen aislamiento rápido y eficiente de hibridomas específicos y células que secretan proteínas heterodiméricas, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, enriqueciendo así las especies heterodiméricas (molécula biespecífica) y aislando preferencialmente la especie heterodimérica de las especies homodiméricas.

Los métodos de la téenica anterior para expresar un gen de interés (GOI) en una célula hospedera son conocidos. Brevemente, un vector de expresión que lleva el GOI se introduce en la célula. Después de integración estable, los métodos estándares para aislamiento de células de alta expresión incluyen la recolección de agrupaciones de células, recogiendo manualmente las colonias de las placas, aislamiento de células solas por dilución limitada, u otros métodos conocidos. Después, las agrupaciones o clones individuales se expanden y se criban para la producción de la proteína de interés (POI) por medición directa de la actividad de la POI, por detección inmunológica de la POI, o por otras técnicas adecuadas. Estos procedimientos son laboriosos, ineficientes, caros, y usualmente el número de clones que pueden ser analizados está limitado a unos cuantos cientos.

El grado alto de heterogeneidad en la expresión de la proteína por las células después de integración estable, requiere cribar muchos clones individuales para tratar de identificar el evento de integración raro que resulte en una línea de producción estable de alta expresión. Este requerimiento necesita métodos que permitan la identificación y aislamiento rápido de las células que expresan el nivel más alto de producción de proteína. Además, la recolección de agrupaciones de clones o colonias recogidas manualmente tiene el riesgo de perder celulas de alta expresión, que frecuentemente crecen más lentamente, por células de baja expresión que crecen más rápido. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos que permitan el cribado y aislamiento rápido de células individuales capaces de expresión de alto nivel de una POI secretada. Cuando la POI contiene más de una subunidad, es necesario seleccionar preferencialmente una especie heterodimérica deseada contra una especie homodimérica.

La incorporación de citometría de flujo en los métodos usados para el aislamiento de líneas celulares de expresión estable ha mejorado la capacidad de cribar grandes cantidades de clones individuales; sin embargo, los métodos actualmente disponibles siguen siendo inadecuados por diversas razones. La difusión de la POI entre células de diferentes características también fue un problema.

BREVE DESCRIPCIÓN La presente invención describe un método de cribado de alto rendimiento para el aislamiento rápido de las células que secretan proteína, cribando directamente la proteína de interés (POI). Esta invención también permite el monitoreo conveniente de la expresión de la POI sobre la base de células solas durante el proceso de fabricación. Además, esta teenología puede aplicarse directamente para el cribado de células productoras de anticuerpo biespecífico, o cualquier célula que produce una proteína heterodimérica. La tecnología también se puede aplicar directamente para cribar celulas que producen receptores de células T modificados, tales como por ejemplo células que producen formas solubles de receptores de células T.

En un aspecto, la invención provee un método de detección y aislamiento de células que producen una proteína de interés (POI) secretada, que comprende: a) construir una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de captura de superficie celular capaz de unirse a una POI; b) transfectar una célula que expresa la POI con la molécula de ácido nucleico del paso a); c) detectar la POI presentada en la superficie poniendo en contacto las células con una molécula de detección, en donde la molécula de detección se une a la POI; y d) aislar las células basándose en la molécula de detección.

En varias modalidades, la proteína de interés incluye un ligando, una proteína receptora soluble, un factor de crecimiento, una proteína de fusión, un anticuerpo, un anticuerpo biespecífico, un Fab, un anticuerpo de una sola cadena (ScFv), o un fragmento de los mismos. Cuando la proteína de interés es un anticuerpo, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en IgM, IgG, IgA, IgD o IgE, y también de varios subtipos o variantes de éstas. En una modalidad específica, el anticuerpo es un anticuerpo anti-DI 14 , un anticuerpo anti-ErbB3, un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo biespecífico anti-ErbB3/EGFR doblemente especifico, o un anticuerpo anti-receptor de IL-6.

En modalidades más específicas, la proteína de interés es un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en interleucina (IL)-1 , IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21 , Factor Neurotrófico Ciliar (CNTF), eritropoyetina, Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF), angiopoyetina 1 (Ang-1), angiopoyetina 2 (Ang-2), TNF, interferón gamma, GM-CSF, TGF y receptor de TNF.

En diversas modalidades, la proteína de interes comprende un dominio variable de un receptor de células T. En modalidades específicas, la proteína de interés es un receptor soluble de células T (sTCR), o una proteína que comprende un dominio extracelular del receptor de células T, fusionado con Fe (TCR-Fc). En una modalidad específica, el Fe es un Fe humano. En varias modalidades, la proteína comprende un dominio variable de un dominio extracelular del receptor de células T. En varias modalidades, la proteína comprende un dominio variable y una región constante de un dominio extracelular de receptor de células T.

El ácido nucleico que codifica la proteína de interés puede ser de cualquier fuente, natural o construida por medio de teenología recombinante, y se puede seleccionar de una colección de ADN.

En varias modalidades, la molécula de captura de superficie celular es un receptor específico del ligando, un ligando específico de receptor, una proteína de unión de anticuerpo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tal como un scFv, o un péptido. Cuando la molécula de captura es un péptido, el péptido se puede aislar de una colección de presentación de fago. En modalidades más específicas, la molécula de captura puede ser Ang1 , Ang2, VEGF, Tie1 , Tie2, VEGFRI ( F It 1 ) , VEGFRII (Flk1 o KDR), CNTF, CNTFR-a, componentes del receptor de citocina, fusiones de dos o más componentes de receptor de citocina, o un fragmento de los mismos. Cuando la molécula de captura es una proteína de unión de anticuerpo, la proteína de unión de anticuerpo puede ser un receptor de Fe, un anticuerpo anti-inmunoglobulina, un scFv de anti-inmunoglobulina (anti-lg), un anticuerpo anti-Fc, un anticuerpo anti-Fc*, proteína A, proteína L, proteína G, proteína H, o fragmentos funcionales de los mismos. Por lo tanto, en algunas modalidades, la molécula de captura es una proteína de fusión que comprende un antígeno, proteína A, o ScFv de anti-lg fusionado con un dominio de transmembrana o un enlazador de GPI.

En varias modalidades en donde la proteína de interés comprende un dominio variable del receptor de células T, la molécula de captura de superficie celular comprende un receptor de Fe, o un antígeno asociado a membrana capaz de ser reconocido por el dominio variable del receptor de células T.

En algunas modalidades en donde la proteína de interés es una proteína heterodimérica, tal como una proteína heterodimérica que tiene una primera subunidad y una segunda subunidad, la molécula de captura de superficie celular comprende un antígeno, proteína A, o scFv capaz de unirse a la primera subunidad y no a la segunda subunidad, o tal molécula de captura de superficie celular se une a la segunda subunidad y no a la primera subunidad.

En varias modalidades en donde la proteína de interés es una I g G 1 , lgG2, lgG4, o un anticuerpo biespecífico que tiene un dominio CH3 que comprende una mutación que anula la unión de la proteína A y el otro dominio CH3 es capaz de unirse a la proteína A; o una proteína de fusión que comprende una región Fe de IgG 1 , lgG2, lgG4, o una región Fe que tiene un dominio CH3 que comprende una mutación que anula la unión a la proteína A y el otro dominio CH3 es capaz de unirse a la proteína A, la molécula de captura de superficie celular comprende un scFv de antí-inmunoglobulina, tal como un ScFv anti-Fc o anti-Fc*.

En varias modalidades, los métodos de la invención comprenden adicionalmente una ancla de membrana que sirve para anclar la POI a la membrana celular, expuesta al exterior de la célula, y funciona así como una molécula de captura de superficie celular. En modalidades específicas, el ancla de membrana es un ancla de transmembrana o un eslabón de GPI. Los ejemplos de anclas de membrana específicas incluyen el dominio de transmembrana de un receptor de Fe, tal como el dominio de transmembrana de FcyRI humano, un ejemplo del cual se cita en el SEQ ID NO:17. El ancla de membrana puede ser nativa para la célula, recombinante o sintética.

En varias modalidades, la proteína de interés comprende una región variable del receptor de células T, y la molécula de captura de superficie celular comprende un antígeno asociado con la membrana. En una modalidad específica, el antígeno asociado con la membrana es una proteína de fusión recombinante que comprende un antígeno susceptible de ser reconocido por la región variable del receptor de células T, fusionado con un ancla de membrana, en donde el antígeno está asociado con la superficie celular. En una modalidad específica, la proteina de fusión recombinante comprende un antígeno fusionado con una ancla de transmembrana o un eslabón de GPI. En otra modalidad específica, la molécula de captura de superficie celular comprende una proteína de fusión recombinante que comprende un ancla de membrana y un antígeno que es capaz de unirse a una molécula de histocompatibilidad mayor (MHC), que incluye sin limitación, por ejemplo, antígenos de tumor y auto-proteínas de fenotipo transformado.

En modalidades adicionales, se añade una secuencia señal al extremo amino de una POI, de tal manera que la proteína es transportada a la superficie celular, y funciona como una molécula de captura de superficie celular. La secuencia señal puede ser nativa para la célula, recombinante o sintética.

En varias modalidades, se agrega una molécula bloqueadora que se une a la molécula de captura de superficie celular para reducir la difusión de la POI de la célula expresadora a una célula vecina. En otra modalidad, la difusión de la POI de la célula expresadora a una célula vecina y su adherencia a esa célula son reducidas aumentando la viscosidad del medio.

La célula aislada mediante los métodos de la invención puede ser una célula productora de anticuerpo fusionada con una célula inmortalizada. En modalidades más específicas, la célula productora de anticuerpo es una célula B o derivada de la misma. La célula B derivada puede ser una célula plasmática, un hibridoma, un mieloma, o una célula recombinante.

Además, los métodos déla invención son útiles para la identificación de células B y derivados de las mismas, o hibridomas que g expresan anticuerpos secretados de una especificidad, afinidad o isotipo deseado. La invención tambien se puede usar para el aislamiento de células que expresan los niveles deseados de un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo.

La detección de las células con la POI presentada puede ser realizada usando cualquier molécula capaz de unirse directa o indirectamente a la POI presentada. Tales moléculas de detección pueden facilitar la detección y/o aislamiento de las células que presentan la POI. En una modalidad, se utilizan dos moléculas que se unen una a otra y se marcan diferencialmente. La detección y/o aislamiento se puede lograr por medio de téenicas estándares conocidas.

En otro aspecto, la invención presenta un método de detección y aislamiento de células que producen una proteína de interés (POI) secretada, que comprende: (a) transfectar una célula con un ácido nucleico que codifica una molécula de captura de superficie celular, en donde la molécula de captura de superficie celular es capaz de unirse a la POI; b) transfectar la célula de a) simultánea o subsiguientemente con un segundo ácido nucleico que codifica una POI, en donde la POI es expresada y secretada; c) detectar la POI presentada en superficie poniendo en contacto la célula con una molécula de detección que se une a la POI; y d) aislar las células basándose en la molécula de detección.

En otro aspecto, la invención presenta un método de detección y aislamiento de células que producen una POI, que comprende: a) detectar una célula que expresa una molécula de captura de superficie celular con alto rendimiento; b) aislar y cultivar la célula detectada en (a); c) transfectar la célula de (b) con un ácido nucleico que codifica una POI, en donde dicha POI es secretada; d) detectar la POI presentada en la superficie poniendo en contacto las células con una molécula de detección que se une a la POI; y e) aislar las células basándose en la molécula de detección.

En otro aspecto, la invención provee un método de detección y aislamiento de células que producen altos niveles de una proteína de interés (POI), que comprende: transfectar células con un ácido nucleico que codifica dicha molécula de captura de superficie celular capaz de unirse a la POI, en donde la célula expresa la POI; b) detectar una célula de (a) que expresa dicha molécula de captura de superficie celular con alto rendimiento; c) aislar y cultivar una célula de alto rendimiento; d) detectar la POI presentada en la superficie poniendo en contacto la célula con una molécula de detección que se une a la POI; y e) aislar la célula detectada.

En otro aspecto, la invención provee un método de detección y aislamiento de células que producen altos niveles de una proteína heterodimérica, que comprende: (a) transfectar células con un ácido nucleico que codifica una molécula de captura de superficie celular, que es una proteína de fusión que comprende un dominio de ancla de membrana y es capaz de unirse a una primera subunidad de la proteína heterodimérica, en donde la célula expresa la proteína heterodimérica; (b) detectar una célula de (a) que expresa la molécula de captura de superficie con alto rendimiento; (c) aislar y cultivar la célula que expresa la molécula de captura de superficie con alto rendimiento; (d) detectar la proteína heterodimérica sobre la superficie de la célula aislada y cultivada del paso (c) con una molécula de detección que se une a una segunda subunidad de la proteína heterodimérica; y (e) aislar la célula detectada en el paso (d) que lleva la proteína heterodimérica detectada sobre su superficie.

En otro aspecto, la invención provee un método de detección y aislamiento de células que producen altos niveles de una ¡nmunoglobulina, que comprende; (a) transfectar células con un ácido nucleico que codifica una molécula de captura de superficie celular capaz de unirse a la ¡nmunoglobulina, en donde la célula expresa la inmunoglobulina; (b) detectar una célula de (a) que expresa la molécula de captura de superficie con alto rendimiento; (c) aislar y cultivar la célula que expresa la molécula de captura de superficie con alto rendimiento; (d) detectar la inmunoglobulina sobre la superficie de la célula aislada y cultivada del paso (c) con una molécula de detección que se une a la inmunoglobulina; y (e) aislar la célula detectada en el paso (d) que lleva la inmunoglobulina detectada sobre su superficie.

En otro aspecto, la invención provee un método de detección y aislamiento de células que producen altos niveles de un anticuerpo biespecífico, que comprende: (a) transfectar células con un ácido nucleico que codifica una molécula de captura de superficie celular, que es una proteína de fusión que comprende un dominio de ancla de membrana, tal como una proteína de fusión de ScFv, y es capaz de unirse al anticuerpo biespecífico, en donde la célula expresa el anticuerpo biespecífico; (b) detectar una célula de (a) que expresa la molécula de captura de superficie con alto rendimiento; (c) aislar y cultivar la célula que expresa la molécula de captura de superficie con alto rendimiento; (d) detectar el anticuerpo biespecífico sobre la superficie de la célula aislada y cultivada del paso (c) con una molécula de detección que se une al anticuerpo biespecífico; y (e) aislar la célula detectada en el paso (d) que lleva el anticuerpo biespecífico detectado sobre su superficie.

En otro aspecto se provee un método para detectar células que producen una cantidad deseada de un agente de afinidad que comprende una región variable del receptor de células T (TCR).

En otro aspecto se provee un método para detectar células que producen una cantidad deseada de una TCR-Fc, que comprende (a) transfectar células con un ácido nucleico que codifica un receptor de Fe capaz de unirse a una TCR-Fc, en donde la célula expresa un antígeno reconocido por la TCR-Fc; (b) detectar una célula de (a) que expresa TCR-Fc con alto rendimiento; (c) aislar y cultivar la célula que expresa TCR-Fc con alto rendimiento; (d) detectar el antígeno sobre la superficie de la célula aislada y cultivada del paso (c) con una molécula de detección; y (e) aislar la célula detectada en el paso (d) que lleva el antígeno detectado sobre su superficie.

En varias modalidades, el TCR se selecciona de TCR de humano y TCR de roedor, tal como un TCR de rata, ratón o hámster. En una modalidad específica, el Fe es un Fe humano. En otra modalidad específica, el Fe es un Fe humano y el receptor de Fe es un receptor de Fe humano de alta afinidad. En una modalidad específica, el receptor de Fe humano de alta afinidad es un FcyRI de humano.

En varias modalidades, la proteína de captura de superficie celular es un antígeno enlazado en la superficie. En una modalidad específica, el antígeno se enlaza en la superficie por fusión con un dominio de transmembrana o un enlazador de GPI.

En algunos aspectos del método para seleccionar células mejoradas que producen una proteína de interés, se pueden usar proteínas de unión de antígeno recombinantes como proteínas de captura de superficie celular (CSCP), moléculas de detección (DM), y/o moléculas bloqueadoras. Por lo tanto, la invención provee proteínas de unión de antígeno recombinantes.

En un aspecto, la invención provee una proteína de unión de antígeno recombinante que se une a un dominio lgG1 -Fc de humano, un dominio lgG2-Fc de humano, o un dominio lgG4-Fc de humano, o cualquier proteína que comprende, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26, que codifica un Fe humano. En algunas modalidades, la proteína de unión de antígeno recombinante se une al polipéptido con una KD menor de aproximadamente 40 nM, medida en un ensayo de resonancia de plasmón de superficie.

En algunas modalidades, la proteína de unión de antígeno recombinante comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 15, o de una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 16. En un caso, la proteína comprende una CDR-1 de cadena pesada (HCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27, una HCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una HCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29, una CDR-1 de cadena ligera (LCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30, y una LCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31. En algunos casos, la proteína comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 15 (algunas de las cuales son idénticas a SEQ ID NO: 15) y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica al SEQ ID NO: 16 (algunas de las cuales son idénticas a SEQ ID NO:16).

Las proteínas de unión de antígeno recombinantes, que son anticuerpos, son útiles como moléculas de detección (DM).

En algunas modalidades, la proteína de unión de antígeno recombinante es una proteína de fusión de ScFv, que en algunos casos comprende un dominio variable de cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a (o idéntica a) SEQ ID NO:15, un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a (o idéntica a) SEQ ID NO:16, y un dominio de ancla de membrana. En una modalidad, el dominio de ancla de membrana se deriva de un receptor de Fe, tal como el dominio de transmembrana de la proteína FcyR1 humana, representado por el SEQ ID NO: 17, o SEQ ID NO:21 , que no solo contiene el dominio de transmembrana, sino también el dominio citoplásmico C-terminal (SEQ ID NO: 18). En una modalidad específica, la proteína de fusión de ScFv tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. Las proteínas de unión de antígeno recombinantes, que con proteínas de fusión de ScFv, son útiles como CSCPs y como DMs.

En otro aspecto, la invención provee un polinucleótido que codifica la proteína de unión de antígeno del aspecto precedente. En una modalidad, como cuando la proteína de unión de antígeno es un anticuerpo, el polinucleótido codifica la cadena ligera. Similarmente, el polinucleótido puede codificar la cadena pesada. Cuando la proteína de unión de antígeno es una proteína de fusión de ScFv, el polinucleótido puede codificar la proteína de fusión ScFv-FcyRTM-cyto de SEQ ID NO: 19. Por ejemplo, el polinucleótido de SEQ ID NO:20 codifica SEQ ID NO:19.

En otro aspecto, la invención provee un vector de ácido nucleico que abarca el polinucleótido del aspecto precedente. En una modalidad, el vector comprende el polinucleótido, que codifica la proteína de unión de antígeno, enlazado operativamente a un promotor secuencia arriba (“upstream”), y seguido por una secuencia de poliadenilación secuencia abajo (“downstream”). El promotor puede ser cualquier promotor, tal como por ejemplo un promotor de CMV. Así, en un caso, el vector puede contener la secuencia de SEQ ID NO:25. En una modalidad, el vector puede contener una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable, tal como por ejemplo resistencia a neomicina.

En una modalidad, el vector puede contener una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de transferencia de energía, tal como la proteína fluorescente verde (GFP), o un derivado de la misma, tal como la proteína fluorescente amarilla (YFP). Así, en un caso, el vector puede contener la secuencia de SEQ ID NO:24.

El vector puede ser circular o lineal, episómico para el genoma de una célula hospedera o puede estar integrado en el genoma de la célula hospedera. En algunas modalidades, el vector es un plásmido circular, que en una modalidad específica tiene la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:23 para el polinucleótido que codifica ScFv-FcyR-TM-cyto; en otra modalidad específica comprende la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido codificante de la cadena pesada del anticuerpo; y en otra modalidad específica más, comprende la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido codificante de la cadena ligera del anticuerpo. En algunas modalidades, el vector es una construcción lineal, que puede ser integrada en un cromosoma de la célula hospedera. En una modalidad específica, la construcción lineal tiene la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:22 para el polinucleótido codificante de ScFv-FcyR-TM-cyto. En otra modalidad específica, la construcción lineal comprende la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido codificante de la cadena pesada del anticuerpo. En otra modalidad específica más, la construcción lineal comprende la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido codificante de la cadena ligera del anticuerpo.

La célula hospedera puede ser cualquier célula, procariota o eucariota. Sin embargo, en una modalidad específica, la célula hospedera es una célula CHO, tal como una célula CHO-K1.

En otro aspecto, la invención provee una célula hospedera que expresa la proteína de unión de antígeno del aspecto precedente, y/o contiene el polinucleótido o vector de ácido nucleico de los aspectos precedentes. En algunas modalidades, la célula hospedera es una célula CHO. En una modalidad específica, la célula hospedera es una célula CHO-K1. En una modalidad, la célula hospedera se usa en la producción de una proteína de interés, y la proteína de unión de antígeno se usa como una proteína de captura de superficie celular de acuerdo con los métodos revelados en esta solicitud.

En un aspecto, la invención provee una célula hospedera útil en la producción de una proteína de interés. La célula hospedera aloja un polinucleótido o vector de ácido nucleico de un aspecto precedente, y produce una proteína de unión de antígeno de un aspecto precedente, que sirve como una proteína de captura de superficie celular. La proteína de captura de superficie celular se une a la proteína de interés dentro de la célula hospedera, y es transportada a través del aparato secretor de la célula, y es expresada sobre la superficie de la célula hospedera. De esta manera, en una modalidad, la célula hospedera comprende una proteína de captura de superficie celular ubicada en la membrana plasmática de la célula hospedera, con la porción de captura de frente hacia el exterior de la célula. En una modalidad, la molécula de captura de superficie celular se enlaza a una proteína de interés, que es ubicada en la membrana plasmática y orientada hacia fuera de la celula.

En una modalidad, la célula hospedera produce, o es capaz de producir, una proteína de fusión de ScFv que se une a una proteína de interés que contiene un dominio Fe, que contiene una histidina en la posición IMGT 95 y una tirosina en la posición IMGT 96. Los ejemplos incluyen proteínas IgG 1 , lgG2 e lgG4. En una modalidad, la proteína de fusión de ScFv contiene las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 y SEQ ID NO:31. En una modalidad específica, la proteína de fusión de ScFv comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En una modalidad específica, la célula hospedera comprende una proteína de captura de superficie celular ubicada en la membrana plasmática y enlazada a una I g G 1 , lgG2 o lgG4, o un anticuerpo biespecífico que contiene por lo menos una cadena pesada de una I g G 1 , lgG2 o lgG4, y que puede tener una segunda cadena pesada que es de otro tipo o contiene una o más sustituciones de aminoácido.

En un aspecto, la invención provee una proteína de unión de antígeno recombinante que se une a un polipéptido CH sustituido que comprende una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste en (a) 95R, y (b) 95R y 96F, de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT, o (a’) 435R, y (b’) 435R y 436F de acuerdo con el sistema de numeración EU, o cualquier proteína que comprende, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42, que codifica un Fe humano sustituido (conocido también como Fe*). En algunas modalidades, la proteína de unión de antígeno recombinante se une al polipéptido con una KD de aproximadamente 60 nM, medida en un ensayo de resonancia de plasmón de superficie.

En algunas modalidades, la proteína de unión de antígeno recombinante comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:38, o de una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:39. En un caso, la proteína comprende una CDR-1 de cadena pesada (HCDR1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32, una HCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33, una HCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-1 de cadena ligera (LCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35, y una LCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36. En algunos casos, la proteína comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:38 (algunos de los cuales son idénticos a SEQ ID NO:38) y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:39 (algunos de los cuales son idénticos a SEQ ID NO:39).

En algunas modalidades, la proteína de unión de antígeno recombinante es un anticuerpo, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera. La cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica (o 100% idéntica) a SEQ ID NO:40. La cadena ligera puede comprender una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica (100% idéntica) a SEQ ID NO:41. Las proteínas de unión de antígeno recombinantes, que son anticuerpos, son útiles como moléculas de detección (DMs).

En algunas modalidades, la proteína de unión de antígeno recombinante es una proteína de fusión de ScFv, que en algunos casos comprende un dominio variable de cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica (o idéntica) a SEQ ID NO:38, un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica (o idéntica) a SEQ ID NO:39, y un dominio de ancla de membrana. En una modalidad, el dominio de ancla de membrana se deriva de un receptor de Fe, tal como el dominio de transmembrana de la proteína FcyR1 humana, representado por SEQ ID NO: 17, o SEQ ID NO:21 , que contiene no solo el dominio de transmembrana, sino también el dominio citoplásmico C-terminal de SEQ ID NO: 19. En una modalidad específica, la proteína de fusión de ScFv tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43. Las proteínas de unión de antígeno recombinantes, que son proteínas de fusión de ScFv, son útiles como CSCPs y como DMs.

En otro aspecto, la invención provee un pollnucleótido que codifica la proteína de unión de antígeno del aspecto precedente. En una modalidad, tal como cuando la proteína de unión de antígeno es un anticuerpo, el polinucleótido codifica la cadena ligera, tal como por ejemplo la cadena ligera de SEQ ID NO:41. Asimismo, el polinucleótido puede codificar la cadena pesada, tal como por ejemplo la cadena pesada de SEQ ID NO:40. Cuando la proteína de unión de antígeno es una proteína de fusión de ScFv, el polinucleótido puede codificar la proteína de fusión ScFv-FcYR-TM-cyto de SEQ ID NO:43. Polinucleótidos ejemplares representativos incluyen los polinucleótidos de SEQ ID NO:49, 50 y 51 , respectivamente.

En otro aspecto, la invención provee un vector de ácido nucleico que abarca el polinucleótido del aspecto precedente. En una modalidad, el vector comprende el polinucleótido, que codifica la proteína de unión de antígeno, enlazado operativamente a un promotor secuencia arriba, y seguido por una secuencia de poliadenilación secuencia abajo. El promotor puede ser cualquier promotor, tal como por ejemplo un promotor de C V. De esta manera, en un caso, el vector puede contener la secuencia de SEQ ID NO:47. En una modalidad, el vector puede contener una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable, tal como por ejemplo resistencia a neomicina. En una modalidad, el vector puede contener una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de transferencia de energía, tal como la proteína fluorescente verde (GFP), o un derivado de la misma, tal como la proteína fluorescente amarilla (YFP). De esta manera, en un caso, el vector puede contener la secuencia de SEQ ID NO:46.

El vector puede ser circular o lineal, episómico para el genoma de una célula hospedera o puede estar integrado en el genoma de la célula hospedera. En algunas modalidades, el vector es un plásmido circular, que en una modalidad específica tiene la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:44 para el polinucleótido codificante de ScFv-FcyR-TM-cyto; en otra modalidad específica tiene la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido codificante de la cadena pesada del anticuerpo; y en otra modalidad específica tiene la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido codificante de la cadena ligera del anticuerpo. En algunas modalidades, el vector es una construcción lineal que puede ser integrada en el cromosoma de una célula hospedera. En una modalidad específica, la construcción lineal comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:51 para el polinucleótido codificante de ScFv-FcyR-TM-cyto. En otra modalidad específica, la construcción lineal comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:50 para el polinucleótido codificante de la cadena pesada del anticuerpo. En otra modalidad específica más, la construcción lineal comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:49 para el polinucleótido codificante de la cadena ligera del anticuerpo.

En otro aspecto, la invención provee una célula hospedera que expresa la proteína de unión de antígeno del aspecto precedente, y/o contiene el polinucleótido o vector de ácido nucleico de los aspectos precedentes. En algunas modalidades, la célula hospedera es una célula CHO. En una modalidad específica, la célula hospedera es una célula CHO-K1 . En una modalidad, la célula hospedera se usa en la producción de una proteína de interés, y la proteína de unión de antígeno se usa como una proteína de captura de superficie celular de acuerdo con los métodos revelados en esta solicitud.

En un aspecto, la invención provee una célula hospedera útil en la producción de una proteína de interés. La célula hospedera aloja un polinucleótido o vector de ácido nucleico de un aspecto precedente, y produce una proteína de unión de antígeno de un aspecto precedente, que sirve como una proteína de captura de superficie celular. La proteína de captura de superficie celular se une a la proteína de interés dentro de la célula hospedera, y es transportada a través del aparato secretor de la célula, y es expresada sobre la superficie de la célula hospedera. De esta manera, en una modalidad, la célula hospedera comprende una proteína de captura de superficie celular ubicada en ia membrana plasmática de la célula hospedera, con la porción de captura de frente hacia el exterior de la célula. En una modalidad, la molécula de captura de superficie celular se enlaza a una proteína de interés, que es ubicada en la membrana plasmática y orientada hacia fuera de la célula.

En una modalidad, la célula hospedera produce o es capaz de producir una proteína de fusión de ScFv que se una a una proteína de interés que contiene un dominio Fe, que contiene una arginina en la posición IMGT 95 y una fenilalanina en la posición IMGT 96 (Fe*). Los ejemplos incluyen lgG3 y regiones CH3 sustituidas de proteínas I g G 1 , lgG2 e lgG4. En una modalidad, la proteína de fusión de ScFv contiene las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 y SEQ ID NO:37. En una modalidad específica, la proteína de fusión de ScFv comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43. En una modalidad específica, la celula hospedera comprende una proteína de captura de superficie celular ubicada en la membrana plasmática y enlazada a una lgG3 o una IgG 1 , lgG2 o lgG4 sustituida, que contiene la arginina en la posición IMGT 95 y fenilalanina en la posición IMGT 96 (“Fe*”), o un anticuerpo biespecífico que contiene por lo menos una cadena pesada del tipo Fe* y la otra cadena pesada de la I g G 1 , lgG2 o lgG4 de tipo silvestre.

En otro aspecto, la invención provee un método de detección, aislamiento o enriquecimiento de una célula que expresa establemente una proteína de interés (POI). El método incluye el paso de expresar en la célula hospedera una proteína de captura de superficie celular (CSCP) y una POI. De acuerdo con este método, la CSCP se une a un “primer sitio” sobre la POI para formar un complejo CSCP-POI dentro de la célula hospedera. Este complejo CSCP-POI es transportado entonces a través del sistema secretorio de la célula hospedera, y se secretado de la célula. Puesto que la CSCP contiene un dominio de unión de membrana (p. ej . , SEQ ID NO: 17), el complejo CSCP-POI es presentado sobre la superficie de la célula hospedera, con la POI expuesta fuera de la célula. De acuerdo con este método, la célula hospedera después hace contacto con una molécula de detección (DM) que se une a un “segundo sitio” sobre la POI. Las células que se unen a la DM son seleccionadas para identificación, aislamiento, acumulación y/o enriquecimiento. En una modalidad, la célula hospedera unida a la DM es seleccionada por clasificación de células activada por fluorescencia.

En algunas modalidades, la POI contiene muchas subunidades, tal como un anticuerpo que comprende dos cadena pesadas y dos cadenas ligeras. En ese caso, el primer sitio sobre la POI puede residir sobre una primera subunidad, y el segundo sitio sobre la POI puede residir sobre una segunda subunidad. En algunas modalidades, la POI contiene muchas subunidades, tal como una proteína heterodimérica. En el caso de una proteína heterodimérica, el primer sitio sobre la POI puede residir sobre una primera subunidad, tal como un primer receptor, y el segundo sitio sobre la POI puede residir sobre una segunda subunidad, tal como un segundo receptor o correceptor. En algunas modalidades, las proteínas heterodiméricas son diferentes receptores que interaccionan para formar el heterodímero. Cuando la POI es un anticuerpo, el primer sitio sobre la POI puede residir sobre una primera cadena pesada, y el segundo sitio sobre la POI puede residir sobre una segunda cadena pesada. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende subunidades que difieren en por lo menos un aminoácido, tal como un anticuerpo que tiene por lo menos una cadena pesada con un dominio CH3 de tipo silvestre y la otra cadena pesada que tiene por lo menos una sustitución de aminoácido en el dominio CH3. En este caso, la CSCP puede ser una proteína de unión de antígeno como la que se describe en la presente, tal como un antígeno o proteína de fusión de ScFv anti-lg. Aquí, la molécula de detección (DM) puede comprender una proteína de unión de antígeno recombinante marcada como se describe en la presente, tal como un antígeno marcado o anticuerpo anti-lg o molécula de ScFv.

En algunos casos, por ejemplo cuando la POI es un anticuerpo biespecíf ico , el primer sitio puede residir sobre una cadena pesada que tiene un dominio CH3 que contiene un residuo de histidina en la posición 95 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT, y un residuo de tirosina en la posición 96 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT (Fe). Entonces, el segundo sitio puede residir sobre una cadena pesada que tiene un dominio CH3 que contiene un residuo de arginina en la posición 95 de acuerdo con el sistema de numeración de exón de IMGT, y un residuo de fenilalanina en la posición 96 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT (Fe*). En este caso, la CSCP puede ser una proteína de unión de antígeno descrita en un párrafo precedente, tal como una proteína de fusión de ScFv que contiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 y SEQ ID NO:31 ; que en una modalidad específica comprende SEQ ID NO: 19. Aquí también, la molécula de detección (DM) puede comprender una proteína de unión de antígeno recombinante marcada descrita en un párrafo precedente, tal como un anticuerpo o molécula de ScFv que contiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 y SEQ ID NO:37; que en una modalidad específica comprende SEQ ID NO:40 y SEQ ID NO:41 (anticuerpo anti-Fc*), o SEQ ID NO:43 (ScFv*). Aquí, la molécula bloqueadora puede ser un polipéptido Fe (p. ej., cadena sencilla), tal como hFc, o cualquier molécula que se puede unir a la CSCP sin unirse también a la DM. En una modalidad, la molécula de detección puede ser un F(ab’)2 de anti-IgG de humano marcado.

En otros casos en los que la POI es un anticuerpo biespecífico, el primer sitio puede residir sobre una cadena pesada que tiene un dominio CH3 que contiene un residuo de arginina en la posición 95 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT, y un residuo de fenilalanina en la posición 96 acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT (Fe*). Entonces, el segundo sitio puede residir sobre una cadena pesada que tiene un dominio CH3 que contiene un residuo de histidina en la posición 95 de acuerdo con el sistema de numeración de exón de IMGT, y un residuo de tirosina en la posición 96 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT. En este caso, la CSCP puede ser una proteína de unión de antígeno descrita en un párrafo precedente, tal como una proteína de fusión de ScFv que contiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 y SEQ ID NO:37; que en una modalidad específica comprende SEQ ID NO:43. Aquí también, la molécula de detección (DM) puede comprender una proteína de unión de antígeno recombinante marcada descrita en un aspecto precedente, tal como un anticuerpo o molécula de ScFv que contiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 y SEQ ID NO:31 ; que en una modalidad específica comprende una cadena pesada y una cadena ligera (anticuerpo anti-hFc), o SEQ ID NO: 19 (ScFv). Aquí, la molécula bloqueadora puede ser un polipéptido Fe* (p. ej . , cadena sencilla), o cualquier molécula que se puede unir a la CSCP sin unirse también a la DM. En una modalidad, la molécula de detección puede ser un F(ab’)2 de anti-lgG de humano marcado.

En algunos aspectos, la invención provee un metodo de detección o aislamiento de una célula que expresa establemente una proteína heterodimérica, que comprende los pasos de: (a) expresar una proteína de captura de superficie celular (CSCP) y una proteína heterodimérica en una célula hospedera, en donde (i) la CSCP se une a un primer sitio sobre la proteína heterodimérica para formar un complejo de CSCP-proteína heterodimérica dentro de la célula hospedera, (ii) el complejo CSCP-proteína heterodimérica es transportado a través de la célula hospedera, y (i¡¡) luego es presentado sobre la superficie de la célula hospedera; (b) poner en contacto la célula hospedera con una molécula de detección, en donde la molécula de detección se une a un segundo sitio sobre la proteína heterodimérica; y (c) seleccionar la célula hospedera que se une a la molécula de detección. En algunas modalidades, la proteína heterodimérica comprende múltiples subunidades y el primer sitio sobre la proteína heterodimérica reside sobre una primera subunidad, y el segundo sitio reside sobre la proteína heterodimérica reside sobre una segunda subunidad. En algunas modalidades, la molécula de captura de superficie celular comprende un antígeno, proteína A, o ScFv capaz de unirse a la primer subunidad y no a la segunda subunidad.

En un aspecto, la invención provee un método de producción de un anticuerpo biespecífico, que comprende el paso de expresar en una célula hospedera una proteína de captura de superficie celular (“CSCP”), una cadena ligera de anticuerpo, una primera cadena pesada de anticuerpo, que contiene un dominio CH3 que comprende una histidina en la posición IMGT 95 y una tirosina en la posición IMGT 96, y una segunda cadena pesada de anticuerpo, que contiene un dominio CH3 que comprende una arginina en la posición IMGT 95 y una fenilalanina en la posición IMGT 96. Aunque está dentro de la célula hospedera, la CSCP se une a la primera cadena pesada de anticuerpo, pero no se une a la segunda cadena pesada de anticuerpo, la segunda cadena pesada de anticuerpo se une a la primera cadena pesada de anticuerpo, y las cadenas ligeras se unen a las cadena pesadas, formando así un complejo ternario CSCP-anticuerpo. Este complejo ternario es secretado y presentado sobre la superficie de la célula hospedera. La célula hospedera se puede poner en contacto con una molécula bloqueadora, que se une a CSCP sobre la superficie celular, pero solo en las situaciones en las que la CSCP no está unida al anticuerpo de interés, esto es, una CSCP “desocupada”. La célula hospedera se pone en contacto entonces con una DM que se une a, o es capaz de unirse a, la segunda cadena pesada de anticuerpo. La célula hospedera que se une a la DM es identificada, seleccionada y/o agrupada. En algunas modalidades, las células hospederas que se unen a la DM son seleccionadas, agrupadas, cultivadas y expandidas, y luego se someten a otra ronda de expresión, detección, selección, agrupación y expansión. Este proceso se puede reiterar muchas veces para enriquecer la producción de anticuerpos biespecíficos con altos títulos.

En una modalidad, la CSCP utilizada en el método es una proteína de fusión de ScFv que contiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NQ:30 y SEQ ID NO:31. En una modalidad, la CSCP comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En una modalidad, la DM utilizada en el método es una proteína que contiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 y SEQ ID NO:37. En una modalidad, la DM es un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:40, y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:41. En otra modalidad, la DM es una proteína de fusión de ScFv que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43. A la DM se le puede añadir una etiqueta, por ejemplo una porción fluorescente como FITC o Alexa Fluor® 488. Se puede usar clasificación celular activada por fluorescencia como método de detección y selección.

En una modalidad alternativa, el método de producción de un anticuerpo biespecífico comprende el paso de expresar en una célula hospedera una proteína de captura de superficie celular (“CSCP”), una cadena ligera de anticuerpo, una primera cadena pesada de anticuerpo, que contiene un dominio CH3 que comprende una arginina en la posición IMGT 95 y una fenilalanina en la posición IMGT 96 (Fe*), y una segunda cadena pesada de anticuerpo, que contiene un dominio CH3 que comprende una histidina en la posición IMGT 95 y una tirosina en la posición IMGT 96. Aunque está dentro de la célula hospedera, la CSCP se une a la primera cadena pesada de anticuerpo, pero no se une a la segunda cadena pesada de anticuerpo, la segunda cadena pesada de anticuerpo se une a la primera cadena pesada de anticuerpo, y las cadenas ligeras se unen a las cadenas pesadas, formando así un complejo temario CSCP-anticuerpo. Este complejo ternario es secretado y presentado sobre la superficie de la célula hospedera. La célula hospedera se puede poner en contacto con una molécula bloqueadora, que se une a CSCP sobre la superficie celular, pero solo en las situaciones en las que la CSCP no está unida al anticuerpo de interés, esto es, una CSCP “desocupada”. La célula hospedera se pone en contacto entonces con una DM que se une a, o es capaz de unirse a, la segunda cadena pesada de anticuerpo. La célula hospedera que se une a la DM es identificada, seleccionada y/o agrupada. En algunas modalidades, las células hospederas que se unen a la DM son seleccionadas, agrupadas, cultivadas y expandidas, y luego se someten a otra ronda de expresión, detección, selección, agrupación y expansión. Este proceso se puede reiterar muchas veces para enriquecer la producción de anticuerpos biespecíficos con altos títulos.

En una modalidad de esta modalidad alternativa, la CSCP utilizada en el método es una proteína de fusión de ScFv que contiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 y SEQ ID NO:37. En una modalidad, la CSCP comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43. En una modalidad, la DM utilizada en el método es una proteína que contiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 y SEQ ID NO:31. En una modalidad, la DM es un anticuerpo que comprende una secuencia de cadena pesada y una secuencia de cadena ligera. En otra modalidad, la DM es una proteína de fusión de ScFv que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19. A la DM se le puede añadir una etiqueta, por ejemplo una porción fluorescente como FITC o Alexa Fluor® 488. Se puede usar clasificación celular activada por fluorescencia como método de detección y selección.

Tanto en la primera modalidad como en la modalidad alternativa, la célula hospedera, que es el producto de la selección, agrupación y expansión iterativas, es capaz de producir, o produce, el anticuerpo biespecífico en un título de por lo menos 2 g/L, en donde las especies de anticuerpo biespecífico (Fc/Fc*) representan por lo menos 40% en masa del total de anticuerpo producido por la célula hospedera (Fc/Fc + Fc*/Fc* + Fc/Fc*).

Otros objetos y ventajas serán evidentes a partir de una revisión de la descripción detallada subsiguiente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Antes de describir los presentes métodos, se entiende que esta invención no se limita a los métodos y condiciones experimentales particulares descritas, ya que tales métodos y condiciones pueden variar. También se entiende que la terminología usada en la presente únicamente tiene la finalidad de describir modalidades particulares y no se considera limitativa, ya que el alcance de la presente invención será limitado únicamente por las reivindicaciones anexas.

Como se usa en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen las referencias plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Así, por ejemplo, una referencia a “un método” incluye uno o más métodos, y/o pasos del tipo descrito en la presente, y/o que serán evidentes para los expertos en la materia tras la lectura de esta descripción, y así sucesivamente.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos téenicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado entendido comúnmente por el experto en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o prueba de la presente invención se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los que aquí se describen, ahora se describirán los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones aquí mencionadas se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.

Descripción general El método de la invención provee ventajas sustanciales sobre los métodos actuales de aislamiento e identificación de células secretadoras de proteína. Por ejemplo, las células que secretan anticuerpos pueden aislarse rápida y convenientemente basándose en la especificidad, avidez o isotipo deseado. Además, la cantidad de proteína secretada producida puede ser cuantificada directamente, a diferencia de muchos métodos de la técnica anterior en donde la producción de la proteína secretada se cuantifica indirectamente.

Recientemente se han desarrollado dos métodos adicionales que utilizan citometría de flujo para el aislamiento de alto rendimiento de líneas celulares estables de alta expresión. El primer metodo incluye la modificación del plásmido de expresión para incluir una lectura transcripcional para el ARNm de GOI. Esto se realiza más frecuentemente insertando un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) y un gen cuyo producto de proteína es monitoreado fácilmente por citometría de flujo, más frecuentemente proteína fluorescente verde (GFP), entre el codón de terminación del GOI y el sitio poli-A terminal (Meng et al. (2000) Gene 242:201 ). La presencia de un IRES permite que la POI y GFP sean traducidas desde el mismo ARNm. Por lo tanto, el grado de expresión del gen GFP está relacionado indirectamente con el nivel de ARNm para la GOI. Los clones que acumulan la GFP a altos niveles son aislados por citometría de flujo y después cribados para la producción de POI. Como este método depende del acoplamiento de la expresión de GOI con el gen reportero usando un IRES en una construcción recombinante, no es aplicable al aislamiento de hibridomas.

El uso de citometría de flujo en el aislamiento de clones de expresión permite un análisis rápido de grandes cantidades de clones en un formato de alto rendimiento. Además, el uso de citometría de flujo reduce significativamente el manejo directo de las células. Desafortunadamente, el grado de producción de GFP no es una medida directa del grado de producción de la POI. Varios mecanismos pueden desacoplar la producción de POI secretada de la acumulación de GFP. Pueden resultar diferencias en la producción de la POI y el reportero GFP de diferencias de la eficiencia de traducción de los dos genes, la eficiencia de secreción de la POI, o la estabilidad del ARNm policistrónico.

Otro método que utiliza citometría de flujo para aislar clones de expresión incluye la encapsulación de células dentro de microgotas de agarosa (Weaver et al. (1990) Methods Enzymol. 2:234). En este método, anticuerpos biotinilados específicos para la POI se enlazan a la agarosa biotinilada por medio de estreptavidina, de tal manera que la POI secretada es capturada y retenida dentro de la microgota (Gray et al. (1995) J. Immunol. Methods 182: 155). La POI atrapada es detectada por inmunomarcación con un anticuerpo específico para la POI. Para evitar que la agarosa encapsulante absorba la POI secretada de células adyacentes, las células se colocan en un medio de baja permeabilidad. Las células con la marcación más alta de anticuerpo de la POI en la agarosa de incrustación son identificadas y aisladas por citometría de flujo. El enfoque de microgota de gel criba directamente células por su capacidad para secretar POI, en lugar de cribar indirectamente la expresión de ARNm de GOI, pero requiere la disponibilidad de anticuerpos adecuados para atrapar y marcar la POI secretada, y el procedimiento requiere equipo especial para generar las microgotas de gel de agarosa. Además, algunas células pueden ser sensibles al proceso de encapsulación.

Una variación de este método supera el requerimiento de incrustar las células en esta matriz uniendo directamente un anticuerpo, específico para la POI, a la superficie celular (Manz et al. (1995) PNAS 92:1921 -1925). En este método, la biotinilación no específica de proteínas de superficie celular con biotina-éster de hidroxisuccinimida es seguida por contacto con un anticuerpo conjugado con estreptavidina capaz de unirse a la POI. Las células que secretan la POI se decoran con la POI que entonces es detectada con un segundo anticuerpo marcado apropiadamente. Sin embargo, la difusión de POI entre las células vecinas es problemática, y este método también requiere un medio de alta viscosidad para reducir la difusión de la POI en alejamiento de las células expresadoras. Como estos medios de alta viscosidad son necesarios para discriminar las células, las células se deben lavar y poner en un medio adecuado para clasificación celular si así se desea.

Los problemas asociados con la identificación y aislamiento de líneas celulares recombinantes de alta expresión se aplican especialmente al aislamiento de hibridomas que expresan un anticuerpo de interés. Sin embargo, la identificación de hibridomas útiles incluye varios problemas adicionales; deben ser cribados primero por actividad de unión de antígeno, luego por isotipo de inmunoglobulina. Además, los métodos basados en GFP no son aplicables a la identificación y aislamiento de hibridomas porque la construcción de hibridomas no incluye una construcción recombinante, de tal manera que la expresión de los genes de anticuerpo puede ser ligada a un reportero transcripcional tal como GFP. El cribado de hibridoma es una tarea lenta y laboriosa en donde el número de clones cribados es limitado por las teenologías existentes.

La presente invención describe un método novedoso y previamente desconocido para identificar y aislar células que producen proteínas secretadas. La invención se basa en la producción de una línea celular que expresa una molécula, localizada hacia la superficie celular, que se une a la POI. La POI presentada en la superficie celular puede ser detectada entonces por marcación con varias moléculas de detección. La cantidad de POI presentada sobre la superficie celular, bajo condiciones específicas, es una medida directa de la cantidad total de POI secretada. Las células productoras de POI se pueden aislar entonces de las células no productoras, y los grados de producción o características de POI pueden ser diferenciados. La ventaja de la invención es que cuantifica directamente la POI secretada en lugar de medir indirectamente el ARNm.

Esta invención se refiere a la construcción o uso de células que expresan moléculas de captura de superficie celular que se unen a varias POI secretadas en la misma célula que produce la POI. Como la célula secreta la POI, estas moléculas de captura de superficie celular se unen a la misma, o se pueden formar íntracelularmente complejos de POI y moléculas de captura de superficie celular y luego ser secretadas. La unión puede ocurrir de una manera autocrina o mientras son secretadas. Entonces pueden ser identificadas y aisladas las células que producen la POI secretada. Esta identificación y aislamiento se pueden basar en las características de la POI, la producción de la POI o la falta de la misma, o mediante los grados de producción especificados. La molécula de captura de superficie celular o la POI pueden ser producidas por la célula en su estado nativo, o las moléculas de captura de superficie celular y/o la POI puede ser producida recombinantemente. Mediante la construcción o uso de tal célula, cualquier proteína secretada puede ser capturada por la molécula de captura de superficie celular, siempre que exista una afinidad correspondiente entre las dos. Como se explica adicionalmente, cualquier molécula puede ser manipulada de tal manera que puede ser usada como una molécula de captura de superficie celular. Por lo tanto, esta invención puede ser utilizada para aislar cualquier célula que secreta una proteína.

La mayor parte de cualquiera proteína tiene la capacidad de funcionar como una molécula de captura de superficie celular como describe la invención. Lo que es necesario es la capacidad de la proteína deseada para ser anclada a la membrana celular y expuesta al espacio extracelular. Si la célula deseada tiene una secuencia señal, entonces sólo se requiere añadir un ancla de membrana, que incluye sin limitación un ancla de transmembrana o señal de enlace de GPI, de tal manera que permanezca anclada en la membrana celular expuesta al exterior de la célula. Además, si la proteína deseada carece de una secuencia señal, se puede añadir una secuencia señal al extremo amino de la proteína deseada, de tal manera que sea transportada a la superficie celular. Una secuencia señal y un ancla de membrana pueden ser nativas para la célula, recombinantes o sintéticas.

Las células frecuentemente secretan una amplia variedad de proteínas, endógenamente o después de la introducción de ADN recombinante. Cualquier proteína secretada puede ser identificada, y la célula que la produce puede aislarse de acuerdo con el método de esta invención. Estas proteínas secretadas incluyen, sin limitación, factores de crecimiento, receptores de factor de crecimiento, ligandos, componentes de receptor solubles, anticuerpos, anticuerpos biespecíficos, moleculas Trap recombinantes, proteínas de fusión que contienen Fe, sTCRs, TCR-Fc, y hormonas de péptido. Estas proteínas secretadas pueden o no ser recombinantes. Esto es, la secreción de algunas proteínas de interés a partir de la célula deseada puede no requerir la introducción de secuencias de nucleótido adicionales. Por ejemplo, la secreción de anticuerpos a partir de células B o células de plasma no es el resultado de la introducción de secuencias de nucleótidos recombinantes en la célula B o célula plasmática. Las proteínas secretadas recombinantes pueden ser producidas mediante téenicas estándares de biología molecular muy conocidas para el experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook, J. , E. F. Fritsch y T. Maniatis, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edición, volúmenes 1 , 2 y 3, 1989; “Current Protocols in Molecular Biology”, Eds. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wilcy Interscience, NY). Estas proteínas secretadas son útiles para muchos fines comerciales y de investigación. Esta invención abarca la producción de estas proteínas secretadas mediante las metodologías de la invención. La detección de las células con la POI presentada puede realizarse utilizando cualquier molécula capaz de unirse directa o indirectamente a la POI presentada. Tales moléculas de detección pueden facilitar la detección y/o aislamiento de las células que presentan la POI.

La invención es aplicable al aislamiento, entre otras, de a) células productoras de ligando utilizando como molécula de captura de superficie celular el receptor específico de ligando, b) células productoras de receptor soluble utilizando como molécula de captura de superficie celular un ligando específico de receptor específico enlazado a superficie, c) células productoras de anticuerpo utilizando como molécula de captura de superficie celular una proteína de unión de anticuerpo, d) sTCRs utilizando como molécula de captura de superficie celular una proteína de unión de s-TCR (por ejemplo, y antígeno reconocido por el TCR), e) TCR-Fc, utilizando como molécula de captura de superficie celular una proteína de unión de Fe, o f) anticuerpos biespecíficos que alojan una mutación en uno de sus dominios CH3 que anula la unión de la proteína A, utilizando una molécula de captura de proteína de fusión que comprende un dominio scFv fusionado a un dominio de transmembrana y citoplásmico de FcyR.

De acuerdo con la metodología de esta invención, primero una célula se transfecta con un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de captura de superficie celular que es capaz de unirse a la POI secretada, bajo condiciones en las cuales dicha molécula de captura de superficie celular es expresada. Entonces son detectadas y aisladas las células transfectadas que son productores apropiados de dichas moléculas de captura de superficie celular, y estas células se cultivan. Estas células pueden producir naturalmente la POI, o la POI puede ser producida recombinantemente. Si las células producen naturalmente la POI, están listas para detección y aislamiento. Si la POI se produce recombinantemente, entonces las celulas aisladas y cultivadas que expresan la molécula de captura de superficie celular son transfectadas con una segunda secuencia de nucleótidos que codifica la POI secretada, bajo condiciones en las cuales se expresa la POI secretada. Después de la expresión, la POI secretada se une a las moléculas de captura de superficie celular y las células que presentan la POI enlazada son detectadas y aisladas.

Si la POI es producida naturalmente por la célula, la célula no será transfectada con la secuencia de nucleótidos que codifica la POI. Por lo tanto, este aspecto de la invención es aplicable a todas y cada una de las células que producen una POI. Además, si la molécula de captura de superficie celular es producida naturalmente por la célula, no es necesario transfectar la célula con secuencias de nucleótido que codifican la molécula de captura de superficie celular. Por lo tanto, este aspecto de la invención es aplicable a todas y cada una de las células que producen una molécula de captura de superficie celular.

Se pueden transfectar una amplia variedad de células hospederas. Estas células pueden ser de origen eucariótico o procariótico. Las células frecuentemente serán células eucariotas inmortalizadas y en particular células de mamífero, por ejemplo, células de riñón de mono (COS), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster crio (BHK), células de riñón embrionarias humanas (HEK293), leucocitos, mielomas, líneas celulares transfectadas con genes de adenovirus, por ejemplo, AD5 E1 , que incluyen sin limitación, células retínales humanas inmortalizadas transfectadas con un gen de adenovirus, por ejemplo, células PER.C6™, y células madre embrionarias. Las células también pueden ser células que no son de mamífero que incluyen células bacterianas, de hongos, levadura e insecto, que incluyen, sin limitación, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilus, especies de Aspergillus, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Todas las células se pueden desarrollar en medio de charolas de cultivo bajo condiciones apropiadas o en un hospedero sinérgico. Las células más convenientes serán las células de mamífero susceptibles de cultivo.

La POI secretada enlazada a la molécula de captura de superficie celular se puede detectar y aislar mediante varias téenicas conocidas. Las células de los cultivos que presentan la POI secretada se pueden poner en contacto con (a) moléculas capaces de unirse directa o indirectamente a la POI secretada, en donde tal molécula de detección puede contener una marca de detección, tal como por ejemplo una marca cromogénica, fluorogénica, coloreada, fluorescente o magnética. La marca enlazada a la molécula de detección puede ser detectada y la célula se aísla usando varios métodos. Muy preferiblemente, la marca será detectada en una población celular, y la célula se aísla utilizando citometría de flujo. Alternativamente, la molécula de detección se puede usar para el aislamiento directo de células que presentan la POI. Esto se puede realizar por conjugación de la molécula de detección en una placa de cultivo, moléculas paramagnéticas, o cualquier otra partícula o soporte sólido. Además, la POI presentada puede ser detectada directamente por medio de una propiedad de la molécula de detección o la POI.

En una modalidad se usan dos moléculas de detección que se unen una a la otra y se marcan diferencialmente para detectar una POI secretada presentada que bloquea esa interacción. Si una célula presenta una POI secretada que se une a la primera molécula de detección y bloquea la interacción entre la primera y segunda molécula de detección, esa célula se puede aislar basándose en la presencia de sólo la primera molécula de detección sobre su superficie. Por otra parte, si una célula presenta una POI secretada que se une a la primera molécula de detección pero no bloquea la interacción entre la primera y segunda molécula de detección, esa célula se puede aislar basándose en la presencia de ambas moléculas de detección sobre su superficie. Por ejemplo, pueden ser identificadas células productoras de anticuerpo que expresan anticuerpos que bloquean específicamente, o no bloquean, la formación de un complejo receptor-ligando. Si las moléculas de detección son un receptor y su ligando que están marcados diferencialmente, entonces una célula productora de anticuerpo que expresa anticuerpos que bloquean la formación del complejo receptor-ligando, puede ser detectada por la presencia de una marca sobre su superficie, mientras que una célula productora de anticuerpo que expresa anticuerpos que no bloquean la formación del complejo receptor-ligando puede ser detectada por la presencia de ambas marcas sobre su superficie.

En cualquiera de las modalidades y con respecto al aislamiento de células expresadoras de las células no expresadoras o células menos expresadoras, una de las principales dificultades, cuando la POI es una proteína secretada, es la difusión de la POI entre las células vecinas. Por lo tanto, es crítico que cualquier sistema diseñado para capturar la POI secretada sobre la superficie celular, debe prevenir la difusión de la POI de la célula expresadora a una célula vecina y su adherencia a esa célula. Si se deja ocurrir difusión y las células vecinas se llegan a decorar con la POI secretada, entonces la separación de células basada en el grado de decoración de la POI no podrá discriminar entre células de alta expresión y células de baja expresión, y no se pueden aislar eficientemente las células expresadoras de las células no expresadoras.

Por lo tanto, una modalidad de esta invención es bloquear la difusión de la POI secretada entre células vecinas. Esto se puede realizar mediante la adición de una molécula bloqueadora que se une a la molécula de captura de superficie celular o la POI e impide la unión de la POI secretada con la molécula de captura de superficie celular. En este aspecto, las moléculas de detección no se unen a la molécula de bloqueo. Por ejemplo, si el receptor de superficie celular es el hFcyRI y la POI secretada posee el fragmento Fe de IgG humana, entonces la difusión de la POI secretada entre células vecinas puede ser bloqueada por la adición de IgG exógena de rata al medio de cultivo. La detección de células que presentan la POI secretada, y no enlazadas a IgG de rata, se obtiene utilizando anticuerpos específicos para Fe de IgG humana que no reconocen la IgG de rata. En otra modalidad, la unión de la POI secretada entre células vecinas se reduce aumentando la viscosidad del medio.

En una modalidad de esta invención, la POI secretada no se deja acumular en el medio. Esto se puede lograr regulando la expresión de la POI secretada y/o la molécula de captura de superficie celular, de tal manera que la expresión breve de la POI resulta en cantidades de POI suficientes para unirse a la molécula de captura de superficie celular, pero insuficientes para la difusión. En otra modalidad, las células pueden ser retiradas del medio que contiene POI acumulada, la POI enlazada a las células se separa, y la expresión de la POI se deja seguir durante un periodo limitado de tal manera que la POI secretada no se acumula en el medio. Las proteínas pueden ser separadas por métodos conocidos, por ejemplo, lavando las células con amortiguador de pH bajo.

De acuerdo con esta invención, las células de una población celular que se unen a la mayoría de las moléculas de detección, también expresan la POI más secretada. De hecho, mientras más POI secreta una célula individual, más POI será presentada sobre la superficie celular. Esta correlación entre la cantidad de POI presentada en la superficie y el grado de expresión de la POI en esa célula permite, identificar rápidamente las células con un grado de expresión relativa deseado de una población de células.

En una modalidad se puede usar una colección de ADN para expresar una proteína secretada que puede ser presentada sobre la superficie celular por la molécula de captura de superficie celular. Por ejemplo, también se puede generar una colección de ADN de las regiones codificantes de los dominios variables de anticuerpo de células B aisladas de animales inmunizados. La colección de ADN puede ser expresada entonces en una célula que expresa una molécula de captura de superficie celular específica para anticuerpos, de tal manera que los clones de la especificidad, isotipo o avidez deseada pueden ser identificados y aislados por el método de la invención. En otra modalidad, se puede generar una colección de ADN a partir de las regiones codificantes de dominios variables del receptor de células T a partir de células T, y fusionarse, por ejemplo, con un Fe capaz de unirse a una proteína de unión de Fe. Entonces, la colección de ADN puede ser expresada en una célula que expresa una proteína de unión de Fe, de tal manera que los clones de la especificidad, isotipo o avidez deseada pueden ser identificados y aislados como se describe en la presente.

En otra modalidad, se pueden crear mamíferos transgénicos que expresan una molécula de captura de superficie celular particular en uno o más tipos de célula. Las células de tales mamíferos transgénicos pueden ser cribadas entonces directamente para la producción de una POI. Por ejemplo, puede ser conveniente expresar una molécula de captura de superficie celular, específica para anticuerpos, en células plasmáticas. Por consiguiente, las células plasmáticas de los ratones inmunizados se pueden cosechar y las células que producen los anticuerpos específicos para el antígeno deseado se pueden aislar mediante el método de la invención.

En una modalidad adicional de la invención, la producción de anticuerpo se mide mediante el uso de una línea celular CHO que expresa el receptor FcyRI (FcyRI) humano que se une al anticuerpo particular o TCR-Fc que es la POI.

En otro aspecto de la invención, la proteína de interés comprende uno o más dominios variables del receptor de células T o un receptor de células T soluble. Los dominios variables del receptor de células T se pueden enlazar covalentemente a una porción que se puede unir a una proteína de captura de superficie celular. En una modalidad específica, los dominios variables del receptor de células T se fusionan con una secuencia de Fe, por ejemplo, una secuencia de Fe humana, y la proteína de captura de superficie celular es un receptor de Fe, por ejemplo, un FcyR.

Las estructuras generales de los dominios variables de TCR son conocidas (véase, por ejemplo, Lefranc y Lefranc (2001), “The T Cell Receptor FactsBook”, Academic Press, que se incorpora en la presente como referencia; véase, por ejemplo, p. 17-20; véase también, Lefranc et al. (2003), “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains”, Developmental and Comparative Immunology 27:55-77, y Lefranc et al. (2005), “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains”, Developmental and Comparative Immunology 29:185-203, cada una incorporada en la presente por referencia). En una modalidad, un dominio variable de TCR de una TCR-Fc comprende una región N-terminal que tiene un dominio variable de 104-125 aminoácidos. En otra modalidad, la TCR-Fc comprende además una región constante de TCR que comprende 91-129 aminoácidos. En otra modalidad, la TCR-Fc comprende además un péptido de conexión que comprende 21-62 aminoácidos.

En una modalidad, la secuencia de Fe está fusionada directamente o por medio de un enlazador al dominio variable de TCR. En otra modalidad, la TCR-Fc comprende una región variable de TCR y una región constante de TCR, y la secuencia de Fe está fusionada directamente o por medio de un enlazador con la región constante de TCR. En otra modalidad, la TCR-Fc comprende una región variable de TCR, una región constante de TCR, y un péptido de conexión, y la secuencia de Fe está fusionada directamente o por medio de un enlazador con el péptido de conexión.

El sTCR, TCR-Fc, o proteína de fusión que comprende una o más regiones variables del receptor de células T, se pueden seleccionar a fin de unirse específicamente al antígeno de interés, por ejemplo una sustancia producida por una célula de tumor, por ejemplo, una sustancia de célula de tumor que es capaz de producir una respuesta inmune en un hospedero. En una modalidad específica, el antígeno es un antígeno que está presente sobre la superficie de una célula de tumor (esto es, un antígeno de tumor), es reconocido por una célula T, y que produce una respuesta inmune en un hospedero. Los antígenos de tumor incluyen, por ejemplo, alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), MUC-1 , antígeno de tumor epitelial (ETA), tirocinasa (por ejemplo, para melanoma maligno), antígeno asociado a melanoma (MAGE), y formas mutadas o anormales de otras proteínas tales como por ejemplo, ras, p53, etc.

En una modalidad, la POI es una TCR-Fc, y la TCR-Fc comprende una región variable de la cadena a de TCR fusionada con una secuencia Fe y una cadena b de TCR fusionada con la secuencia Fe (cada una directamente o por medio de un enlazador), en donde la fusión [cadena a de TCR-Fc] y la fusión [cadena b de TCR-Fc] se asocian para formar una abTCR-Fc. En una modalidad específica, la o^TCR-Fc comprende los siguientes dos péptidos: (1) una región variable de la cadena a de TCR fusionada con una región constante de la cadena a de TCR fusionada con una secuencia Fe, y (2) una región variable de la cadena b de TCR fusionada con una región constante de la cadena b de TCR fusionada con una secuencia Fe.

En otra modalidad, la POI es una PCR-Fc que tiene una región variable a de TCR y una región variable b de TCR, y opcionalmente una región constante a de TCR y/o una región constante b de TCR. En una modalidad específica, la TCR-Fc es codificada por un ácido nucleico que comprende (de 5’ a 3’) una secuencia de la región variable b de TCR, seguida opcionalmente por una secuencia de la región constante a de TCR, una secuencia de la región variable b de TCR, seguida opcionalmente por una secuencia de la región constante b de TCR, opcionalmente un enlazador, después una secuencia Fe. En una modalidad específica, la TCR-Fc es codificada por un ácido nucleico que comprende (de 5’ a 3’) una secuencia de la región variable b de TCR, seguida opcionalmente por una secuencia de la región constante b de TCR, una secuencia de la región variable a de TCR, seguida opcionalmente por una secuencia de la región constante a de TCR, opcionalmente un enlazador, después una secuencia Fe. En varias modalidades, las construcciones que codifican TCR-Fcs son precedidas por secuencias señal, por ejemplo secuencias de señal de secreción, para hacerlas secretables.

En otra modalidad, la POI es una TCR-Fc, y la TCR-Fc comprende una TCR-Fc que comprende una cadena g de TCR fusionada con una secuencia Fe, y una región variable de la cadena d de TCR fusionada con una secuencia Fe, para formar una yóTCR-Fc. En una modalidad específica, la yóTCR-Fc comprende los siguientes dos polipéptidos: una región variable de la cadena g de TCR fusionada con una región constante de la cadena g de TCR fusionada con una secuencia Fe, y (2) una región variable de la cadena d de TCR fusionada con una región constante de la cadena d de TCR fusionada con una secuencia Fe.

Las regiones variables del receptor de células T se pueden identificar y/o clonar mediante cualquier método conocido. Las regiones variables del receptor de células T de la proteina de interés son obtenibles, por ejemplo, expresando ADN reordenado de la región variable del receptor de células T en una célula, por ejemplo, fusionado con una secuencia Fe humana. Las regiones reordenadas variables del receptor de células T específicas para un antígeno particular se pueden obtener mediante cualquier método adecuado conocido (véanse las referencias más abajo), por ejemplo, exponiendo un ratón a un antígeno y aislando las células T del ratón, haciendo hibridomas de las células T del ratón, y cribando los hibridomas con el antígeno de interés para obtener un hibridoma de interés. Las regiones variables reordenadas de células T específicas para el antígeno de interés se pueden clonar a partir de los hibridomas de interes. Las regiones variables del receptor de células T específicas para un antígeno también se pueden identificar usando teenología de presentación de fago, por ejemplo como se provee en las referencias más abajo. Después, las regiones variables se pueden clonar y fusionar, por ejemplo con un Fe humano para hacer una proteína de interés que se puede unir a una molécula de captura de superficie celular que es un FcyR.

Los métodos para identificar y/o clonar regiones variables del receptor de células T se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. No. 5,635,354 (cebadores y métodos de clonación); Genevee et al. (1992), “An experimentally validated panel of subfamily-specific oligonucleotide primers (Va1 -w29/vpi -w24) for the study of human T cell receptor variable V gene segment usage by polymerase Chain reaction”, Eur. J. Immunol. 22: 1261 -1269 (cebadores y métodos de clonación); Gorski et al. (1994), “Circulating T Cell Repertoire Complexity in Normal Individuáis and Bone Marrow Recipients Analyzed by CDR3 Size Spectratyping”, J. Immunol. 152:5109-51 19 (cebadores y métodos de clonación); Johnston, S. et al. (1995), “A novel method for sequencing members of multi-gene families”, Nucleic Acids Res. 23/15:3074-3075 (cebadores y métodos de clonación); Pannetier et al. (1995), “T-cell repertoire diversity and clonal expansions in normal and el in ica I samples”, Immunology Today 16/4: 176-181 (métodos de clonación); Hinz, T. y Kabelitz, D. (2000), “Identification of the T-cell receptor alpha variable (TRAV) gene(s) in T-cell malignancies”, J. Immunol. Methods 246: 145-148 (métodos de clonación); van Dongen et al. (2002), “Design and standardization of PCR primers and protocole for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations”: patente de EE. UU. No. 6,623,957 (métodos de clonación y cebadores); “Report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936”, Leukemia 17:2257-2317 (cebadores y métodos de clonación); Hodges et al. (2002), “Diagnostic role of tests for T cell receptor (TCR) genes", J. Clin. Pathol. 56: 1 -11 (métodos de clonación); Moyscy, R. et al. (2004), “Amplification and one-step expression cloning of human T cell receptor genes”, Anal. Biochem. 326:284-286 (métodos de clonación); Fernandes et al. (2005), “Simplified Fluorescent Multiplex PCR Method for Evaluation of the T-Cell Receptor nb-Chain Repertoire”, Clin. Diag. Lab. Immunol. 12/4:477-483 (cebadores y métodos de clonación); Li, Y. et al. (2005), “Directed evolution of human T-cell receptors with picomolar affinities by phage display”, Nature Biotech. 23/3:349-354 (cebadores y métodos de clonación); Wlodarski et al. (2005), “Pathologic clonal cytotoxic T-cell responses: nonrandom nature of the T-cell receptor restriction in large granular lymphocyte leukemia”, Blood 106/8:2769-2780 (métodos de clonación); Wlodarski et al. (2006), “Molecular strategies for detection and quantitation of clonal cytotoxic T-cell responses in aplastic anemia and myelodysplastic syndrome”, Blood 108/8:2632-2641 (cebadores y métodos de clonación); Boria et al. (2008), “Primer sets for cloning the human repertoire of T cell Receptor Variable regions”, BMC Immunology 9:50 (cebadores y métodos de clonación); Richman, S. y Kranz, D. (2007) “Display, engineering, and applications of antigen-specific T cell receptors”, Biomolecular Engineering 24:36 -373 (métodos de clonación). Ejemplos de sTCRs se proveen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. Nos. 6,080,840 y 7,329,731 ; y Laugel, B et al. (2005), “Design of Soluble Recombinant T Cell Receptors for Antigen Targeting and T Cell Inhibition”, J. Biol. Chem. 280: 1882-1892; que se incorporan aquí como referencia. Las secuencia de Fe se describen en la presente; ejemplos de secuencia de Fe y su uso en proteínas de fusión, se proveen por ejemplo en la patente de EE. UU. No. 6,927,044 de Stahl et al. Todas las referencias anteriores se incorporan como referencia.

En una modalidad adicional de la invención, la molécula de captura de superficie celular está diseñada para captar y presentar las proteínas de interés que normalmente son incapaces de unirse con afinidad suficiente o se unen con baja afinidad a una molécula de captura de FcyR. Las proteínas de interés incluyen moléculas de lgG4 e lgG2. De esta manera, se diseñó una molécula de captura modular y se construyó basándose en un dominio ScFv fusionado con un dominio de transmembrana y citoplásmico de FcyR. El dominio ScFv se derivó de un anticuerpo anti-Fc humano de alta afinidad, y contiene un dominio variable de cadena pesada fusionado con un dominio variable de cadena ligera. El dominio citoplásmico FcyR-TM se usó para permitir la inserción y orientación apropiada en la membrana plasmática. La proteína de fusión citoplásmica ScFv-FcyR-TM-cyto es capaz de unirse a lgG4 y otras moléculas que contienen Fe, y también los subtipos lgG2 e IgG 1 , y los heterodiméricos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) que comprenden por lo menos un dominio CH3 de tipo silvestre, en donde el otro dominio CH3 puede contener una sustitución del tipo Fe*.

En una modalidad adicional de la invención, la molécula de captura de superficie celular está diseñada para captar y presentar las proteínas de interés que contienen un dominio CH3 modificado, tal como el polipéptido Fe*, que comprende sustituciones de aminoácido H95R y Y96F (la numeración se basa en el sistema IMGT), por ejemplo, SEQ ID NO:42. Las proteínas de interés incluyen anticuerpos biespecíficos, tales como heterotetrámeros de anticuerpo que son útiles en la fabricación de anticuerpos biespecíficos y se describen en general en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. US 2010/0331527 A1 , 30 de diciembre de 2010, que se incorpora en la presente en su totalidad como referencia. De esta manera, se diseñó una molécula de captura modular y se construyó basándose en un dominio ScFv* fusionado con un dominio de transmembrana y citoplásmico de FcyR. El dominio ScFv* se derivó de un anticuerpo anti-Fc* de alta afinidad, y contiene el dominio variable de cadena pesada fusionado con un dominio variable de cadena ligera. La FcyR-TM-dominio citoplásmico se usó para permitir la inserción y orientación apropiada en la membrana plasmática. La proteína de fusión ScFv*-FcyR-TM-cyto se une a cualquier molécula que contiene Fe*, tal como lgG3 de tipo silvestre, y heterodímeros de lgG4, lgG2, e I g G 1 , que contienen por lo menos una secuencia de polipéptido Fe*.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se exponen a fin de proveer al experto en la materia una revelación y descripción completa de cómo hacer y utilizar los métodos y composiciones de la invención, y se considera que no limitan el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben tomarse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura es en grados centígrados y la presión es la atmosférica o cercana a la misma.

Ejemplo 1 Construcción de pTE084. Se construyó pTE084 ligando el fragmento Xba I de 1 ,436 p.b. del pCAE100 que codifica el FcyRI humano (hFcyRI; número de registro GenBank M21091 ) en el sitio Xba I de pRG821. La orientación de hFcyRI en los plásmidos deseables que resultan de la ligación se examinó mediante mapeo de restricción con Not I, Pst I, Eco Rl y Stu I. El pTE084 se diseñó para expresión de alto nivel de hFcyRI, el receptor de superficie celular de alta afinidad para el dominio Fe de IgG humana. Contiene dos casetes de expresión independientes. Un casete es un gen de hFcyRI manejado por el promotor CMV-MIE, y el segundo casete es el gen de neomicina fosfotransferasa II (npf), que confiere resistencia a G418, manejado por el promotor tardío de SV40.

Construcción de un derivado de CHO K1 que expresa hFcYRI.

Celulas CHO K1 (4 x 106) se transfectaron con pTE084 usando Lipofectamine™ (Life Technologies; Rockville, MD) siguiendo las sugerencias del fabricante. Las células se pusieron en el medio de cultivo (suero bovino fetal al 10%, F-12 de Ham al 90%, L-glutamina 2 mM; todos los reactivos eran de Life Technologies, Rockville, MD) conteniendo 500 mg/ml de G418 (Life Technologies) por 15 días. Las células que sobrevivieron a la selección de G418 se sometieron a tripsinización, se reunieron y se marcaron con el fragmento Fe de IgG humana conjugado con FITC (FITC-hFc; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Brevemente, las células desarrolladas sobre placas de cultivo de 10 cm se lavaron una vez con solución salina amortiguadora de fosfato (PBS) de Dulbecco sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio (Life Techologies). A cada placa se le agregaron tres mililitros de tripsina al 0.25% (Life Technologies). Las placas se agitaron hasta que las células se desprendieron de la placa. Inmediatamente se agregaron diez mililitros de medio de cultivo a cada placa de las células desprendidas. Después, las células se recogieron por centrifugación a 1 ,000 x g durante 4 minutos. Después de separar el sobrenadante, las células se resuspendieron en 4 mL de 2 pg/ml de FITC-hFc diluido en medio de cultivo. Después las células se pusieron en un agitador de plataforma y se marcaron durante una hora a temperatura ambiente. Para separar FITC-hFc no enlazado, las células se lavaron dos veces con 20 mi de PBS. El grado de marcación de FITC-hFc sobre las células se midió por citometría de flujo en un clasificador celular MOFLO™ (Cytomation; Fort Collins, CO). El FITC-hFc no marca células CHO K1 progenitoras transfectadas en falso, pero produce una distribución de fluorescencia en la agrupación transfectada con pTE084 resistente a G418. Las células más fluorescentes de 1 % superior de la agrupación seleccionada se pusieron en placas de 96 pocilios, a 1 célula/pocillo por citometría de flujo. Nueve días después, 88 clones celulares de las placas de 96 pocilios se expandieron en placas de 24 pocilios. Después de 3 días, las células de los pocilios individuales se lavaron una vez con 1 mi de PBS, se marcaron con 0.5 mi de 2 mg/ml de FITC-hFc por 1 hora, se lavaron dos veces con 1 mi de PBS y se examinaron para determinar la marcación de superficie celular bajo un microscopio fluorescente. Se escogieron los treinta y tres clones más fluorescentes, se expandieron y después se cribaron por citometría de flujo.

La difusión de proteína secretada entre células expresadoras y células no expresadoras entre las células se bloqueó agregando IgG: Como todas las células de una línea celular hFcyRI clonal expresan un hFcyRI de superficie celular, todas poseen la capacidad de unirse a IgG o proteínas de fusión que consisten en el dominio Fe de IgG. Como hFcyRI se une a IgG de una variedad de especies (van de Winkel y Anderson, 1991 ), se probó un panel de IgGs de animal para determinar su capacidad para bloquear la unión de una proteína que contiene una marca de Fe (4SC622) de I gG 1 humana (hlgG1 ) a células expresadoras de hFcyRI. 4SC622 es una molecula quimérica que consiste en el dominio extracelular de IL-2Ry fusionado con el dominio extracelular hlL-4Ry, que entonces se fusiona con el dominio hlgG1 -Fc. En este experimento, los cultivos de RGC1 , una línea celular que expresa hFcyRI seleccionada de células CHO K1 , que ha sido transfectada establemente con pTE084, se incubó con 1 mg/ml de 4SC622 durante 18 horas en presencia o ausencia de 1 mg/ml de IgG de diferentes especies, en una incubadora de cultivo de tejido a 37°C.

La unión en superficie celular de 4SC622 se determinó por citometría de flujo después de que las células lavadas se marcaron con AG184 de lgG1 monoclonal de ratón conjugado con ficoeritrina (PE-AG184), específico para el componente hlL-2Ry de 4SC622 (BD Pharmingen; San Diego, CA), siguiendo los procedimientos descritos para la marcación celular con FITC-hFc.

Se encontró que la hlgG bloqueó completamente la unión de 4SC622 al hFcyRI expresado sobre la superficie de RGC1. La IgG derivada de rata, conejo y canino también bloqueó eficientemente la unión, mientras que la IgG derivada de bovino y ovino no la bloqueó. La capacidad de la IgG de rata añadida exógenamente para boquear la unión de una proteína hlgG1 Fc-marcada añadida exógenamente (4SC622) a hFcyRI de superficie celular, sugiere que la IgG de rata también puede boquear la transferencia entre células que expresan una proteína h I gG 1 Fc-marcada a diferentes grados. Para probar esto, a partir de RGC1 se generaron dos líneas celulares que pueden ser distinguidas por la presencia o ausencia de la proteína fluorescente verde (EGFP). Brevemente, para marcar celulas RGC1 con EGFP, se cotransfectaron 2 x 106 células RGC1 con 0.5 mg de PTE073 que codifica un gen de higro icina B fosfotransferasa, manejado por el promotor de fosfoglicerato cinasa, y 5 mg de pRG816-EGFP que codifica el gen EGFP manejado por el promotor de CMV-MIE. Las células transfectadas se seleccionaron con 200 mg/ml de higromicina B (Sigma; San Luis Misuri) por dos semanas. Las células fluorescentes verdes se aislaron por citometría de flujo. Un clon que expresa EGFP y hFcyRi, RGC2, se usó en experimentos de mezclado de células. La otra línea celular usada en estos experimentos, RGC4, se generó por transfección estable de RGC1 con el plásmido pEE14.1-622. El pEE14.1 -622 es un plásmido en el que la expresión de 4SC622 es manejada por el promotor CMV-MIE e incluye un minigen de glutamina sintetasa, que confiere resistencia al análogo metionina sulfoximina (MSX), y permite la selección de eventos de integración estables. Las células RGC4 expresan hFcyRi sobre la superficie celular y secretan la proteína h IgG 1 marcada con Fe, 4SC622. Una placa de células mixtas que comprende 50% de células RGC2 y 50% de RGC4 se incubó con 1 mg/ml de IgG de rata por 18 horas antes de marcar con PE-AG184, y luego se examinaron por citmetría de flujo. La fluorescencia de EGFP de las células RGC2 muestra que las células RGC2 también se unen a la 4SC622 añadida exógenamente (1 pg/ml), como lo indica un aumento en la fluorescencia de PE-AG184. RGC4 no fluoresce en el marco de EGFP. Significativamenhte, la IgG de rata añadida exógenamente no reduce el porcentaje de células RGC4 marcadas positivamente para 4SC622 de superficie celular, sugiriendo que la unión de 4SC622 a IIFCYRI ocurrió mientras las proteínas estaban en tránsito hacia la superficie celular. Cuando se mezclaron las células RGC2 y RGC4, la proteína 4SC622 secretada de las células RGC4 se acumuló en el medio y se enlazó a la mayor parte de las células RGC2. Sin embargo, la adición de 1 mg/ml de IgG de rata redujo significativamente el porcentaje de células RGC2 que se enlazan a 4SC622, demostrando que la IgG de rata bloqueó la transferencia de la proteína hlgG1 Fc-marcada secretada, de las células expresadoras a las células no expresadoras.

Ejemplo 2 La fluorescencia de la superficie celular se correlaciona con el grado de expresión de 4SC622 Células RGC1 (4 x 106) se transfectaron con pEE14.1-622, y se obtuvo una agrupación de transfectantes estables después de selección por 2 semanas en un medio comprendido de suero bovino fetal dializado al 10%, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) al 90% libre de glutamina, suplemento GS 1x, y MSX 25 mM (todos los reactivos de JRH Biosciences, Lenexa, KS). Dieciocho horas antes de la inmunomarcación se agregó IgG de rata al medio de cultivo a 1 mg/ml. Las células se tripsinizaron, se lavaron con PBS y se marcaron con 1.5 mg/ml de un fragmento F(ab’)2 de anti-lgG humana (H + L) policlonal conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories), durante una hora a temperatura ambiente, siguiendo los procedimientos descritos para la marcación con FITC-hFc del ejemplo 1. Después, la marcación celular se analizó por citometría de flujo. La distribución de la fluorescencia sugirió que la agrupación de células seleccionada contenía células con una amplia gama de grados de expresión de 4SC622. Las células en la parte superior de 3% (paréntesis R3), 7-1 1 % (paréntesis R5) y 15-19% (paréntesis R7) con respecto a su inmunofluorescencia se separaron en tres agrupaciones distintas y se expandieron durante 9 días. La producción promedio de 4SC622 por célula de las agrupaciones se determinó midiendo el número de células y los niveles de 4SC622 en el medio después de 3 días de crecimiento, por medio de un ensayo Pandex basado en inmunología (Idexx, Westbrook, ME) siguiendo las recomendaciones del fabricante. En el ensayo Pandex, se usaron partículas de fluoricon poliestireno recubiertas con anticuerpo específico de cadena g, anti-lgG humana de cabra (Sigma) para capturar 4SC422 del medio, y se usó un anti-lgG humana de cabra, específico de Fe, conjugado con FITC (Sigma) para detectar 4SC622 enlazado a la perlas. Para la calibración se incluyeron en el ensayo cantidades conocidas de 4SC622 purificada. Se encontró que las células en la parte superior de la agrupación de 3%, 7-1 1 % y 15-19% producen 4SC622 a 1.42, 0.36 y 0.22 mg/célula/día, respectivamente. Así, hubo una correlación entre la marcación de 4SC622 en la superficie celular y la producción de proteína específica. Este resultado sugiere que pueden obtenerse células individuales que expresan 4SC622 en altos niveles aislando las células que se marcaron más brillantemenmte con el fragmento F(ab’)2 de anti-lgG humana (H + L) policlonal conjugado con FITC.

Ejemplo 3 Aislamiento y expresión de clones en RGC1 : Trampa de IL-4 Para demostrar directamente la eficiencia para generar líneas celulares clónales con producción de proteína secretada en altos niveles mediante la metodología de los presentes inventores, se generaron líneas celulares clónales productoras de 4SC622 a partir de RGC1. Células RGC1 (4 x 106) se transfectaron con pEE14.1 -622, y se seleccionaron por 2 semanas con MSX a 25 mM para obtener una agrupación de transfectantes estables. Las células resistentes a MSX se agruparon e incubaron con 1 mg/ml de IgG humana por 18 horas, antes de la marcación con PE-AG184. Se aislaron y expandieron seis células del marco superior de 5%, determinado por análisis de citometría de flujo de la marcación de 4SC622 en la superficie celular. La producción de 4SC622 de las seis líneas clónales se determinó y se comparó con la producción de 4SC622 de clones obtenidos escogiendo manualmente las colonias, seguido por clonación por dilución y amplificación. Un clon derivado de RGC1 , RGC4, produjo 4SC622 a 12 mg/célula/día. Este nivel es similar al del mejor productor de 4SC622 aislado por selección manual y análisis de 2,700 clones. De esta manera, en comparación con las colonias seleccionadas manualmente, la metodología descrita en esta invención muestra ser mucho más eficiente en el cribado y clonación de productores superiores.

Trampa de VEGF. Los plásmidos pTE080 y pTE081 codifican los genes para las trampas de VEGF, hVEGF-R1 R2 y hVEGF-R1 R3. El hVEGF-R1 R2 es una molécula quimérica que consiste en el primer dominio de Ig de hVEGFRI fusionado con el segundo dominio de Ig de hVEGFR2, que entonces se fusiona con el dominio de h I g 1 FC . hCEGF-R1 R3 es una molécula quimérica que consiste en el primer dominio de hVEGFR fusionado con el segundo dominio de Ig de hVEGFR3, que entonces se fusiona con el dominio hlgG1 -Fc. En estos plásmidos, el gen para la trampa de VEGF es manejado por el promotor CMV-MIE, y un minigen de glutamina sintetasa, que confiere resistencia a MSX, es expresado para selección de eventos de integración estables. Las células RGC1 se transfectaron con cualquiera de estos plásmidos y se desarrollaron en medio que contenía MSX 25 mM por 2 semanas para seleccionar células en las que el plásmido se ha integrado establemente. Las células MSX-resistentes se incubaron con 0.1 mg/ml de lgG2a e lgG3 de ratón por 18 horas antes de marcación con 1.5 pg/ml de fragmento F(ab’)2 de anti-lgG humana (H+L) policlonal conjugado con FITC. Las células se marcaron durante 1 hora y después se lavaron 2 veces con PBS antes de la citometría de flujo. Las células solas se distribuyeron en placas de cultivo de tejido de 96 pocilios de la agrupación de células cuya fluorescencia estuvo entre el 1 % superior. Las células en los pocilios individuales se expandieron y su productividad se determinó mediante ensayos Pandex. Los clones derivados de RGC que expresan tanto hVEGF-R1 R2 como hVEGF-R1 R3 tuvieron una productividad específica más alta y se aislaron cribando menos clones en comparación con las colonias resistentes a MSX de alta expresión seleccionadas manualmente. Véase la tabla 1.

Tabla 1 Comparación de productividad específica Ejemplo 4 La proteína hlgG1 Fc-marcada enlazada a la superficie celular es internada por RGC1 Se sabe que hFcyRI induce internamiento de su ligando enlazado a la superficie celular. Para analizar si las células RGC1 pueden internar 4SC622 enlazada a la superficie celular, se agregó 1 mg/ml de 4SC622 a células RGC1 durante 1 hora e inmediatamente después las células se procesaron para inmunomarcación de 4SC622 con PE-AG184 y análisis de citometría de flujo. El 93% de las células se marcaron positivamente para 4SC622 en la superficie celular. Alternativamente, se agregó 1 pg/ml de 4SC622 a células RGC1 durante 1 hora, después las células se lavaron y se incubaron en medio de cultivo sin 4SC622 con PE-AG184 por 18 horas. El análisis de citometría de flujo después de inmunomarcación de 4SC622 mostró que 9% de las células retuvieron 4SC622 sobre la superficie celular. Para caracterizar más la pérdida de 4SC622 enlazada a la superficie, se agregó 4SC622 purificada al medio de RGC1 y celulas CHO K1 progenitores, y luego se midieron los niveles de 4SC622 en el medio. La 4SC622, agregada a 2 mg/ml al medio de cultivo en una placa de 10 cm, fue significativamente más baja en el medio acondicionado con RGC1 después de 3 días de incubación, en comparación con el control de CHO K1. Ests resultados muestran que la concentración de 4SC622 en el medio de cultivo se reduce por la presencia de hFCyRI sobre la superficie celular. Los resultados sugieren que el agotamiento de 4SC622 del medio fue resultado del internamiento del complejo hFcyRI-4SC622. Este internamiento de los complejos receptor-ligando puede facilitar la eliminación eficaz de toda la 4SC622 de las células no expreasadoras en presencia de IgG de bloqueo durante el paso de bloqueo de 18 horas.

Ejemplo 5 Construcción de líneas celulares CHO K1 con expresión inducible de IIFCYRI Los métodos de trampa de secreción autóloga basados en citometría de flujo (FASTR™) que utilizan el hFcyRI permiten el aislamiento rápido de clones de alta expresión. Sin embargo, si hFcyRI media el recambio de proteínas marcadas con Fe, entonces la producción realizada de la proteína secretada por medio de las células que expresan hFcyRI modificadas por ingeniería sería más alta si la expresión de hFcyRI pudiera ser inhibida durante el periodo de producción. Para este fin, se construyó una línea celular CHO K1 en la que la expresión de hFcyRI es inducida por tetracielina, o el análogo doxicielina. En este sistema, primero las células CHO K1 se modificaron por ingeniería para expresar la proteína represora de tetraciclina (TetR) y hFcyRI se puso bajo el control transcripcional de un promotor cuya actividad fue regulada por TetR. Se pusieron dos operadores de TetR (TetO) en tándem inmediatamente secuencia abajo del promotor/potenciador CMV-MIE en pTE084 para generar pTE158. La transcripción de hFcyRI a partir del promotor CMV-MIE en pTE158 fue bloqueada por TetR en ausencia de tetraciclina o algún otro inductor adecuado. En presencia del inductor, la proteína TetR fue incapaz de unirse a TetO y ocurrió transcripción de hFcyRI.

Las células CHO K1 se transfectaron con pcDNA6/TR, un plásmido que confiere resistencia a blasticidina en el que la expresión de TetR se origina desde el promotor CMV-MIE (Invitrogen; Carlsbad, CA). Después de dos semanas de selección con 2.5 mg/ml de blasticidina (Invitrogen), los transfectantes estables se agruparon. Esta agrupación fue transfectada entonces con pTE158, un plásmido que confiere resistencia a G418 en el que la expresión de hFcyRI es dependiente de un promotor híbrido CMV-MIE/TetO. Las células transfectadas consecutivamente con pcDNA6/TR y pTE158 se seleccionaron con 400 pg/ml de G418 y 2.5 pg/ml de blasticidina durante 12 días y se agruparon. La agrupación se indujo durante dos días agregando 1 pg/ml de doxiciclina y después se marcó con FITC-hFc para identificar células que expresan hFcyRI. El 5% superior de las células que expresan hFcyRI se agruparon, se expandieron durante 6 días en ausencia de doxiciclina y se marcaron de nuevo con FITC-hFc para detectar la presencia de hFcyRI. Las células que no se marcaron para hFcyRI se recolectaron y expandieron en medio de cultivo que contenía 1 mg/ml de doxicielina durante tres días. Después la agrupación se marcó para detectar la presencia de hFcyRI y se sometió a aislamiento por citometría de flujo. Las células que expresan los niveles más altos de hFcyRI (1 % superior) se distribuyeron sobre placas de 96 pocilios a una célula por pocilio. Estas células presumiblemente contenían célula que tuvo niveles bajos de expresión no inducida de FcyRI y altos niveles inducibles de FcyRI. Después de la expansión, la inducción de hFcyRI por doxiciclina en 20 clones fue confirmada por inmunomarcación con FITC-hFc y citometría de flujo. Se escogió un clon para caracterización ulterior y se le llamó RGC10.

En ausencia de doxiciclina, RGC10 no expresó niveles detectadles de hFcyRI, mientras que se observaron altos niveles de hFcyRI en células que fueron inducidas con 1 pg/ml de doxiciclina durante tres días. La fluorescencia media de las células RGC10 aumentó más de 1000 veces después de inducción con doxiciclina.

Ejemplo 6 Aislamiento de línea celulares productoras de 4SC622 a partir de RGC10 Células RGC10 se transfectaron con pEE14.1-622, y células resistentes a MSX se agruparon después de selección con MSX 25 mM durante dos semanas. La expresión de hFcyRI se indujo con la adición de 1 pg/ml de doxiciclina al medio de cultivo durante tres días. Dieciocho horas antes de marcación con el fragmento F(ab’)2 de anti-lgG humana (H + L) policlonal conjugado con FITC y el análisis por citometría de flujo, se agregó 1 mg/ml de IgG de rata al medio de cultivo que contenía doxiciclina. Las células que expresan los niveles más altos de 4SC622 (1 % superior) se distribuyeron en placas de 96 pocilios a 1 célula por pocilio. Sin inducción de expresión de hFcyRI por doxiciclina, la marcación con el fragmento F(ab’)2 de anti-lgG humana (H + L) policlonal conjugado con FITC no puede detectar 4SC622 enlazada a la superficie celular. Se expandieron 60 clones en ausencia de doxiciclina. La productividad específica de los 13 productores más altos se determinó con un ensayo Pandex. La productividad específica del clon 1 C2 fue de 17.8 mg/célula/día, significativamente mejor que los 12 pg/célula/día observados para la mejor línea celular de 4SC622 aislada previamente usando la línea celular de hFcyRI no regulado, RGC1.

Ejemplo 7 Células de mieloma Sp2/0 pueden ser modificadas por ingeniería para expresar una proteína de captura de superficie celular En este ejemplo, la línea celular de mieloma Sp2/0-Ag14 se modificó por ingeniería para expresar establemente hFcyRI para mostrar que el método de trampa de secreción autóloga era aplicable a líneas celulares diferentes de CHO. El gen para hFcyRI se introdujo en la célula de mieloma por infección retroviral. El plásmido pLXRN (Clontech; Palo Alto, CA), un vector de ADN retroviral en donde un gen de interés puede ser expresado a partir del promotor de la repetición terminal larga del virus de sarcoma murino de Moloncy (MoMuSV LTR) secuencia arriba, se usó para generar retrovirus que codifica el gen de hFcYRI. El fragmento Xho I de 1 ,363 p.b. de pTE084, que codifica el gen FCYRI humano, se clonó en el sitio Xho I de pLXRN. Se escogió un plásmido en el que la expresión del ADNc de hFcyRI era dependiente de MoMuSV LTR y se le llamó pTE255.

Se generó un retrovirus pantrópico para la expresión de hFcYRI, siguiendo esencialmente las guías del fabricante. La línea celular de empaquetamiento GP-293, una línea celular basada en HEK 293 que expresa establemente las proteínas gag y pol virales (Clontech; Palo Alto, CA), se cotransfectó con 10 mg de cada uno de pVSV-G y pTE255. El plásmido pVSV-G permite la expresión de la proteína de envoltura viral VSV-G que confiere amplia gama de hospedero sobre las partículas infecciosas.

Construcción de Sp2-hFcYRI-4. El retrovirus pantrópico hFcYRI se usó para infectar 1 x 107 células de mieloma Sp2/0-Ag14 (American Type Culture Collection; Manassas, VA) a una multiplicidad de aproximadamente 10 partículas infecciosas por célula. Tres días después de la infección, las células se marcaron durante 1 hora y luego se lavaron dos veces con PBS antes de su análisis por citometría de flujo. Las células que expresan hFcYRI, indicado por FITC-hFc enlazado, se agruparon por citometría de flujo. La agrupación se expandió durante 13 días y después se marcó nuevamente con FITC-hFc, y las células que expresan hFcyRI se agruparon por citometría de flujo. Estas células clasificadas se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) a 90% con suero bovino fetal a 10%, con 4.5 g/l de glucosa y glutamina 4 mM durante 3 semanas; se marcaron con FITC-hFc y las células con fluorescencia media en el 1 % superior de la población se clonaron por medio de clasificación de células solas. Después de la expansión se examinaron 24 clones por citometría de flujo para determinar la expresión de hFcyRI, como se describe arriba, y se escogió un clon, Sp2-hFcyRI-4 para caracterización adicional.

Aislamiento de células Sp2-hFcYRI-4 que expresan la proteína 4SC622. Las células Sp2-hFcyRI-4 (1 x 107) se transfectaron con pTE209, un plásmido que permite la expresión constitutiva de 4SC622 a partir del promotor CMV-MIE y confiere resistencia a la higromicina. Las células transfectadas se pusieron en un medio que contiene 10% FCS y 90% D-MEM y 400 mg/ml de higromicina, durante 14 días. Las células resistentes a la higromicina se incubaron con 1 mg/ml de IgG de conejo durante 18 horas antes de marcar con el fragmento F(ab’)2 de anti-lgG humana (H + L) policlonal conjugado con FITC. Las células se marcaron durante 1 hora y luego se lavaron dos veces con PBS antes del análisis por citometría de flujo. Las células marcadas se agruparon por citometría de flujo y luego se cultivaron durante 5 días y se clasificaron como se describe arriba. Las células de la agrupación expandida que se enlazaron a la mayor parte del fragmento F(ab’)2 de anti-lgG humana (H+L) policlonal conjugado con FITC, población 1 % superior, se clonaron entonces por clasificación de células solas. La producción de 4SC622 de diez clones se analizó por ELISA y se encontró que los 10 clones expresan 4SC622; el clon 5H11 produjo 4SC622 a 0.5 mg por célula por día. Estos datos mostraron que los clones que secretan 4SC622 fueron aislados eficientemente con el método de trampa de secreción autóloga a partir de una agrupación heterogénea de células derivadas de transfección estable de células Sp2-hFcyRI-4 con pTE209.

Para confirmar que 4SC622 fue presentada de forma autóloga sobre la superficie de células de mieloma que expresan tanto 4SC622 como hFcyRI, el clon 5H1 1 se incubó con 1 mg/ml de IgG de conejo por 18 horas, después se marcó con el fragmento F(ab’)2 de anti-lgG humana (H + L) conjugado con FITC y se encontró que presenta 4SC622 en la superficie celular. La proteína secretada fue presentada bajo condiciones en las que la alimentación cruzada fue bloqueada por IgG de conejo, demostrando la presentación autóloga de 4SC622. Estos datos indican que el método de trampa de secreción autóloga arriba descrito no estuvo limitado a las células CHO y se puede extender también a células de mieloma y otros tipos de células.

Ejemplo 8 La proteína quimérica de la proteína G puede funcionar como una proteína de captura de superficie celular Para mostrar la aplicación del método de trampa de secreción autóloga para una proteína de captura de superficie celular diferente de hFcyRI, se construyó una línea celular que expresa la proteína G. La proteína G, de la cepa G148 de Streptococcus, se une a todas las subclases de IgG de humano y de ratón, y por tanto es de utilidad para el aislamiento de células recombinantes que expresan anticuerpos o proteínas de fusión IgG Fe. Para mostrar que el dominio de unión de Fe de IgG de la proteína G se puede usar como una proteína de captura de superficie celular capaz de unirse a todas las subclases de IgG de humano y de ratón, los presentes inventores construyeron una línea CHO que expresa una proteína quimérica comprendida del dominio de unión de Fe de la proteína G, fusionado con el dominio transmembrana e intracelular de hFcyRI. El dominio de unión de Fe de la proteína G contiene tres repeticiones homologas de 55 aminoácidos de largo (Guss et al. (1986) EMBO 5: 1567, y Sjobring et al. (1991 ) J. Biol. Chem. 266:399) y cada repetición es capaz de unirse a un Fe de IgG. Para mejorar la expresión de esta proteína quimérica en las células CHO, los presentes inventores construyeron un ADN sintético en el que la secuencia señal del gen ROR1 de ratón fue fusionada con el dominio de unión de Fe, los aminoácidos 303 a 497 de la proteína G (registro # X06173) (SEQ ID NO: 1). Este ADN sintético fue generado por una combinación de apareamiento de oligonucleótido, llenado de huecos y amplificación de PCR. Después, el ADN sintético se fusionó, por PCR, con ADN que codifica los dominios de transmemembrana e intracelular, aminoácidos 279 a 374 (SEQ ID NO:2), de hFcyRI (registro M21091 ). El ADN resultante que codifica la proteína quimérica proteína G/hFcyRI se clonó en pTE158 secuencia abajo del promotor CMV-MIE, reemplazando el gen que codifica hFcyRI, para producir el plásmido pTE300.

Una línea celular CHO K1 adaptada para crecer en medio libre de suero, RGC14, se transfectó con pTE300 y, después de 3 días, se agregaron 400 mg/ml de G418 al medio de cultivo para seleccionar la integración estable de pTE300. Dos semanas después de empezar la selección, las células se marcaron con FITC-hFc para identificar las células que expresaron hFcyRI. Estas células se analizaron por citometría de flujo y las células que expresan hFcyRI se agruparon. Las células se expandieron durante 10 días y la población de células que expresan hFcyRI se aislaron de nuevo por citometría de flujo. Nuevamente, las células se expandieron, se marcaron con FITC-hFc, y las células solas que expresan altos niveles de la proteína quimérica proteína G/hFcyRI se aislaron por citometría de flujo. Las células solas que se marcaron positivamente para la unión de FITC-hFc se clasificaron en un medio compuesto de 10% de suero bovino fetal, 90% de F12 de Ham y 400 mg/ml de G418. Después de dos semanas de incubación, se examinaron 48 clones para determinar la unión a la IgG presente en el medio de cultivo por marcación con el fragmento F(ab’)2 de anti-lgG de bovino conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Se escogió un clon, RGC18, que se marcó positivamente con este anticuerpo, para caracterización ulterior.

Aislamiento de clones de expresión en RGC18: Células RGC18 (6 x 106) se transfectaron con pTE209 y se seleccionaron para la integración del plásmido desarrollándolas en 400 pg/ml de higromicina durante 18 días. Las células resistentes a la higromicina se incubaron con 1 mg/ml de IgG de conejo durante 18 horas antes de marcación con el fragmento F(ab’)2 de anti-lgG de humano (H + L) policlonal conjugado con FITC. Las células se marcaron durante 1 hora y después se lavaron dos veces con PBS antes del análisis de citometría de flujo. Las células más fluorescentes (5% superior) se aislaron por medio de clasificación de celulas solas y se expandieron durante 3 semanas. Se examinaron 10 clones para determinar la secreción de 4SC622. Todos los clones probados secretaron 4SC622 en alto nivel y el mejor clon, RGC19, tuvo una productividad específica de 6.4 mg/célula/día. Este resultado muestra que las células que expresan 4SC622 fueron aisladas eficientemente de una agrupación de células heterogéneas derivadas de transfección estable de RGC18 con pTE209, por medio del método de trampa de secreción autóloga. Además, estos datos muestran claramente que un fragmento de la proteína G pudo ser modificado por ingeniería para incluir una secuencia señal y un dominio transmembrana, y funciona como una proteína de captura de superficie celular.

Para confirmar que 4SC622 fue presentada autólogamente sobre la superficie de las células RGC19 que expresan tanto la proteína quimérica proteína G/hFcyRI como 4SC622, RGC19 se incubó con 1 mg/ml de IgG de conejo durante 18 horas, y luego se marcó con el fragmento F(ab’)2 de anti-lgG de humano (H + L) conjugado con FITC y se analizó por citometría de flujo. Se encontró que las células RGC19 poseen 4SC622 en su superficie celular bajo estas condiciones, en las que la alimentación cruzada fue bloqueada por IgG de conejo, sugiriendo la presentación autóloga de 4SC622. La IgG de conejo bloqueó eficientemente la unión de la proteína 4SC622 exógena a las células RGC18, pero no bloqueó la presentación de 4SC622 sobre la superficie celular de las células que expresan 4SC622. Estos datos muestran que las propiedades de la proteína quimerica proteína G/IIFCYRI fueron similares a las de IIFCYRI como una proteína de captura de superficie celular, y sugieren que el método de trampa de secreción autóloga puede usar otras proteínas como proteína de captura de superficie celular.

Ejemplo 9 Aislamiento de células productoras de anticuerpo a partir de RGC10 Para mostrar la utilidad del método de trampa de secreción autóloga para el aislamiento de líneas celulares CHO que expresan anticuerpos recombinantes, los presentes inventores clonaron el ADN que codifica genes ligeros variables y pesados variables del hibridoma KD5. KD5 es un hibridoma que expresa un anticuerpo monoclonal específico para el receptor de Tie-2 de humano.

Las secuencias del gen de la región constante de IgG de ratón se clonaron a partir de 500 ng de ARN poliA+ de bazo de ratón (Clontech, Palo Alto, CA). Se sintetizó ADNc de cadena sencilla usando el sistema de síntesis Superscript First-Strand Synthesis System para RT-PCR, cebando con 50 ng de hexámeros aleatorios (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). La secuencia de ADN constante de la cadena ligera kappa de ratón (registro # Z37499) se amplificó a partir de este ADNc por PCR usando los cebadores 5' mCLK1 (Z37499) (5'-CGGGCTGATG CTGCACCAAC TGTATCCATC TTC-3') (SEQ ID NO:3) y 3' mCLK1 (Z37499) (5'-ACACTCTCCC CTGTTGAAGC TCTTGACAAT GGG-3') (SEQ ID N0:4). La secuencia de ADN de la región constante de lgG2a de ratón (registro # AJ294738) también se amplificó a partir de este ADNc por PCR usando los cebadores 5' mCH2a (AJ294738) (5'-GCCAAAACAA CAGCCCCATC GGTCTATCCA C-3') (SEQ ID NO:5) y 3' mCH2a (AJ294738) (5'-TCATTTACCC GGAGTCCGGG AGAAGCTCTT AGTCG-3') (SEQ ID NO:6). Los productos de PCR se clonaron en pCR2.1 -TOPO usando el kit de clonación TOPO TA Cloning kit (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), y la secuencia de las regiones constantes se verificó.

Los genes de la región variable de KD5 se amplificaron por RT- PCR a partir de ARNm del hibridoma KD5 y se clonaron en pCR2.1 - TOPO usando las mezclas de cebador de la región variable de cadena pesada y ligera de Amersham-Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). El gen de la cadena pesada variable se amplificó por PCR usando como molde la región variable clonada pCR2.1 -TOPO con los cebadores 5' BspMI/KD5VH extremo N (5'-GAGAGTACCT GCGTCATGCA GATGTGAAAC TGCAGGAGTC TGGCCCT-3’) (SEQ ID NO:7) y 3' BspMI/KD5VH extremo C (5'-GAGAGACCTG CGTCAGCTGA GGAGACGGTG ACCGTGGT-3') (SEQ ID NO:8), se digirió con BspMI y se ligó al fragmento de PCR del gen de la cadena pesada constante de lgG2a digerido con Bsal amplificado con los cebadores 5' Bsal/CH2a extremo N (5'-GAGAGGGTCT CACAGCCAAA ACAACAGCCC CATCG-3') (SEQ ID NO:9) y 3' Bsal / CH2a extremo C (5'-GAGAGGGTCT CCGGCCGCTC ATTTACCCGG AGTCCGGG AGAA-3') (SEQ ID NO: 10). Después, este fragmento se ligó en los sitios BspMI y Notl de pRG882.

El plásmido resultante, pTE317, fue capaz de expresar el gen de la cadena pesada recombinante de KD5, fusionado con la secuencia señal mROR1 , desde el promotor CMV-MIE. El gen de la cadena ligera variable se amplificó por PCR usando como molde la región variable clonada pCR2.1 -TOPO con los cebadores 5' BsmBI/KD5VL extremo N (5'-GAGAGCGTCT CATGCAGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA-3') (SEQ ID NO:11) y 3' BsmBI/KD5VL extremo C (5’-GAGAGCGTCT CACAGCCCGT TTTATTTCCA GCTTGGTCCC-3’) (SEQ ID NO: 12), se digirió con BsmBI y se ligó al fragmento de PCR del gen de la cadena ligera constante kappa digerido con Bsal amplificado con los cebadores 5’ Bsal/CLK extremo N (5’-GAGAGGGTCT CAGCTGATGC TGCACCAACT GTATCC-3’) (SEQ ID NO: 13) y 3' Bsal/CLK extremo C (5'-GAGAGGGTCT CAGGCCGCTC AACACTCTCC CCTGTTGAAG CTCTTGAC-3') (SEQ ID NO: 14). Después, este fragmento se ligó en los sitios BspMI y Notl de pRG882. El plásmido resultante, pTE316, fue capaz de expresar el gen de cadena ligera recombinante de KD5, fusionado a la secuencia señal mROR1 , desde el promotor CMV-MIE.

El fragmento EcoRI-Notl de 1450 p.b. de pTE317, que codifica el gen de cadena pesada de KD5, se clonó en los sitios EcoRI y Notl de pRG980, un vector que confiere resistencia a la higromicina y permite la expresión de genes recombinantes para el promotor UbC, para producir el plásmido pTE322. Similarmente, el fragmento EcoRI-Notl de 750 p.b. de pTE316, que codifica el gen de la cadena ligera de KD5, se clonó en los sitios EcoRI y Notl de pRG985, un vector que confiere resistencia a la puromicina y permite la expresión de genes recombinantes para el promotor de UbC, para producir el plásmido pTE324. Celulas RGC10 (5 x 106) se transfectaron con 3 mg de pTE322 y 3 pg de pTE322 y se seleccionaron para la integración de los plásmidos, desarrollándolas en medio F12 suplementado con suero fetal de becerro al 10% con 20 pg de puromicina y 400 mg/ml de higromicina durante 14 días. La expresión de hFcyRI se indujo agregando 1 pg/ml de doxicielina al medio de cultivo durante tres días. Las células doblemente resistentes se incubaron con 1 mg/ml de IgG de conejo durante 18 horas antes de marcación con el fragmento F(ab’)2 de anti-lgG de ratón (Fcy) policlonal de cabra, conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Las células se marcaron durante 1 hora y luego se lavaron dos veces con PBS antes del análisis por citometría de flujo. Las células más fluorescentes (5% superior) se aislaron como una agrupación y se expandieron durante 10 días, después de los cuales el protocolo se repitió, pero se aislaron como agrupación las células más fluorescentes del 1 % superior. Esta agrupación se expandió durante 10 días y luego las células más fluorescentes del 0.1 % superior se aislaron como células solas en placas de 96 pocilios. Los clones se analizaron por ELISA para determinar la expresión de anticuerpo y se escogieron siete clones de 53 clones analizados. La productividad específica promedio de estos clones fue de 35 pg/célula/día, y el mejor clon expresó el anticuerpo monoclonal recombinante de KD5 a 54 pg/célula/día.

Ejemplo 10 El cribado por FASTR™ no afecta el grado de expresión de CSCP Para demostrar que el grado de expresión de la CSCP no afecta significativamente la capacidad de aislar las células que expresan una sPOI asociada, se compararon los cribados de FASTR™ para las mismas sPOI en dos líneas celulares hospederas diferentes que expresan, cada una, la misma CSCP, pero a un grado alto o un grado bajo.

La línea celular hospedera FASTR™ RGC10 se seleccionó para expresión de alto nivel de la proteína hFcyRI por integración estable de pTE158, y se encontró que contiene 40 copias del gen hFcyRI integradas. Se generó una línea celular nueva, RS527, que expresa la proteína hFcyRI a un grado más bajo, a partir de CHO K1 después de transfección estable y selección para la integración de gen de una sola copia. Las células RS527 expresaron significativamente menos proteína hFcyRI que las células RGC10, determinado por análisis Western blot de los Usados de células enteras de las línea celulares de FASTR™.

Brevemente, las células RGC10 y RS527 se transfectaron con pTE462, un plásmido capaz de expresar una proteína de fusión de hFc secretada, Rc1-hFc, y que confiere resistencia a la higromicina. Los cultivos transfectados se seleccionaron con higromicina durante dos semanas. Las células resistentes a higromicina se indujeron con 1 mg/ml de doxicielina (Dox) y se bloquearon con IgG de conejo durante la noche, siguiendo el método de FASTR™ descrito en la presente. Al día siguiente, los cultivos de RGC10/pTE462 y RS527/pTE462 se marcaron con un anticuerpo conjugado con FITC específico para hFc y después se analizaron por citometría de flujo. Tres casillas de células, R4, R5 y R6 que marcan las células con fluorescencia baja, media y alta, respectivamente, se separaron de cada línea hospedera y se expandieron en cultivo de tejido.

Para comparar la producción de la proteína Rc1-hFc de las seis casillas de células, se prepararon seis cultivos usando igual número de células para cada casilla. Tres días después se recogió el medio acondicionado. Los títulos de proteína Rc1 -hFc en el medio acondicionado se determinaron por medio de ELISA y se graficaron contra la fluorescencia media de las casillas de las células respectivas. Para ambas líneas de hospedero, RGC10 y RS527, hubo una correlación similar entre la fluorescencia media (cantidad de Rc1-hFc presentada sobre la superficie celular) y la producción de proteína sPOI de las agrupaciones de células aisladas. Más significativamente, los títulos de las sPOI en las dos casillas R6 de alta fluorescencia derivadas de RGC10 y RS527 fueron similares. Estos datos muestran que el grado de expresión de la CSCP en una línea celular hospedera de FASTR™ no afecta significativamente el uso de ese hospedero para aislar células transfectadas basándose en el grado de expresión de una sPOI.

Ejemplo 11 Receptor de Tie2 como una proteína de captura de superficie celular En los métodos descritos en la presente se pueden usar proteínas de captura de superficie celular (CSCP) diferentes de FcyR1. En este ejemplo, el receptor de Tie2 funciona como una CSCP y se usa para aislar células que expresan una proteína de fusión ScFvCib-Fc específica de Tie, hecha del anticuerpo monoclonal C1 b que se une específicamente al dominio extracelular del receptor de Tie2. Aunque la CSCP para ScFvCib-Fc puede ser hFcgRI, este ejemplo muestra que Tie2 también se puede usar como la CSCP para ScFvCib-Fc.

Para construir una línea celular de CSCP de Tie2 inducible, primero CHO K1 se transfectó establemente con el plásmido de TetR pcDNA6/TR. Luego, la agrupación de células resistentes a blasticidina se transfectó establemente con pTE259, un plásmido que permite la expresión inducible de una proteína comprendida del dominio extracelular y dominio transmembrana de Tie2. Los clones celulares inducibles se aislaron por citometría de flujo después de marcación con un anticuerpo específico para Tie2. El clon RGC54 se escogió para estudiar la factibilidad de FASTR™ para la expresión de ScFvCib-Fc.

Las células RGC54 se transfectaron establemente con pTE988, un plásmido capaz de expresar la proteína de fusión de hFc secretada, ScFVdb-Fc, y que confiere resistencia a la higromicina. El cultivo transfectado se seleccionó con higromicina durante dos semanas. Las células resistentes a higromicina se indujeron con Dox y se bloquearon con 1 mg/ml de mAb C1b purificado. El anticuerpo monoclonal C1 b fue la fuente de las regiones variables en ScFvCib-Fc. Al día siguiente, la agrupación de células se marcó con un anticuerpo conjugado con FITC específico para hFc, y después se analizó por citometría de flujo. Tres casillas de células, R6, R7 y R8 que marcan las células con fluorescencia alta, media y baja, respectivamente, se separaron y se expandieron en cultivo de tejido. Para determinar la producción de la proteína ScFvCib-Fc por medio de ELISA, se prepararon tres cultivos usando igual número de células para cada casilla. Existe una correlación entre la fluorescencia media (cantidad de unión de ScFvCib-Fc a Tie2 sobre la superficie celular) y la producción de proteína ScFVdb-Fc de las agrupaciones de células aisladas.

Estos datos muestran que CSCP diferentes de hFcyRI pueden servir como una CSCP, y también sugieren que cualquier receptor puede ser convertido en una CSCP por eliminación de su dominio citoplásmico. Estos datos también muestran que se puede hacer un antígeno en una CSCP y usarse para cribar mediante FASTR™ células que expresan una molécula relacionada con anticuerpo específico de antígeno.

Ejemplo 12 Cribados FASTR™ eficaces con pares CSCP:sPOI que tienen baja afinidad La angiopoyetina 1 es un ligando para el receptor de Tie2. Una proteína quimérica que comprende el dominio de unión del receptor de angiopoyetina 1 (FD1 -hFc) se une a Tie2 con una constante de afinidad de 174 nM, determinada por BIAcore™. Se eligieron FD1 -hFc y Tie2 como sPOI y CSCP, respectivamente, para determinar si se requiere una afinidad mínima entre CSCP y sPOI para los cribados de FASTR™.

En experimentos de decoración de celulas, la FD1-hFc añadida exógenamente se enlaza específicamente a células RGC54 por medio de Tie2. Para determinar si la afinidad entre Tie2 y FD1 -hFc es suficiente para permitir el cribado de FASTR™, las células RGC54 se transfectaron establemente con pTE942, un plásmido capaz de expresar la proteína de fusión de hFc secretada, FD1-hFc, y que confiere resistencia a la higromicina. El cultivo transfectado se seleccionó con higromicina durante dos semanas. Las células resistentes a higromicina se indujeron con Dox y se bloquearon con 1 mg/ml de FD1 -mFc purificada que comprende Fe de lgG1 de ratón. Al día siguiente, la agrupación de células se marcó con un anticuerpo conjugado con FITC específico para hFc, y después se analizó por citometría de flujo. Se recolectaron tres casillas de células, R6, R7 y R8 que marcan las células con fluorescencia alta, media y baja, respectivamente. Se prepararon cultivos usando igual número de células para cada casilla para determinar la producción de la proteína FD1 -hFc en el medio acondicionado, por medio de ELISA. Hubo una correlación entre la fluorescencia media (unión de FD1 -Fc a Tie2 enlazado a la superficie celular) y la producción de proteína FD1 -hFc de las agrupaciones de células aisladas. La casilla con la fluorescencia más alta produjo la mayor parte de FD1-hFc.

Estos datos muestran que se puede usar un par CSCP:sPOI con baja afinidad (KD 174 nM) para hacer cribados eficaces de FASTR™. De manera importante, el t1/2 de disociación para la unión de FD1 -Fc : Tie2 es menor de 2 minutos, sugiriendo que cualquier par CSCP:sPOI con una afinidad mensurable puede funcionar en los cribados de FASTR™. Además, este experimento también muestra que se puede usar un receptor no FcyRI como la CSCP para aislar células que expresan su ligando.

Ejemplo 12A La fusión de un dominio de transmembrana sobre un ScFv hace funcional a una CSCP Una CDCP puede ser cualquier proteína enlazada a la superficie celular que tiene una afinidad mensurable por la sPOI. Para demostrar esto, se construyó una CSCP totalmente sintética fusionando el dominio de transmembrana del receptor de PDGF con un ScFv que contiene las regiones variables del anticuerpo monoclonal HB58 específico de la cadena kappa de murino. Se construyó un hospedero para FASTR™ que expresa esta proteína quimérica (SCFVHB58-TMP DGFR) y se usó para aislar células que expresan el anticuerpo P12 específico del dominio FD de angiopoyetina 2.

La línea celular RS655, derivada de CHO K1 , expresa constitutivamente SCFVHB58-TMPDGFR· Las células que expresan SCFVHBSS-TMPDGFR se pueden marcar por incubación secuencial con mAb P12, FD2-hFc y anti-hlgG-P12 conjugado con FITC, capturado sobre la superficie celular por HB58; el ScFv fue detectado por su afinidad por FD2, que a su vez fue detectado por reconocimiento de la etiqueta hFc. Las células RS656 se derivan de las células RS655 después de transfección estable con un plás ido que codifica el gen para eYFP. Casi 100% de las células RS656 fueron eYFP positivas, y la mayor parte (76%) mantuvieron la expresión de SCFVHB58-TMPDGFR, detectada por la unión a FD2-hFc.

Las células RS655 se transfectaron establemente con pTE693, un plásmido capaz de expresar las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo P12, y que confiere resistencia a puromicina. El cultivo transfectado se seleccionó con puromicina durante dos semanas para producir una agrupación de células que eran heterogéneas con respecto a la expresión de mAb P12 (RS655/pTE693).

Para determinar si SCFVHB58-TMPDGFR podría funcionar como un CSCP y facilitar el aislamiento de células productoras de anticuerpo de las no productoras, se mezclaron y cocultivaron números iguales de células RS656 y células RS655/pTE693. Cuando P12 expresada de las células RS655/pTE693 se dejó difundir y unirse a SCFVHB58 sobre la superficie de las células RS656, una población grande de células amarillas también fueron positivas para la unión de FD2-hFc. Sin embargo, si el SCFVHBSS sobre la superficie de RS656 se enlazó con exceso de IgG murina, entonces sólo las células no amarillas fueron positivas para la unión de FD2-hFc, demostrando que las células expresadoras fueron separadas eficazmente de las células no expresadoras.

Estos datos demuestran que un ScFv se puede convertir en una CSCP funcional dirigiendola a la membrana celular. Los datos también muestran que FASTR™ permite que las células expresen un anticuerpo secretado para ser detectado con el antígeno del anticuerpo.

Ejemplo 13 Una proteína de interés que comprende una región variable del receptor de células T Un método de trampa de secreción autóloga basado en citometría de flujo (FASTR™) para aislar clones de alta expresión de una línea celular que expresa una proteína de interés que es una TCR-Fc se prepara de manera análoga a la preparación de una línea celular que expresa un anticuerpo de interés. Los clones de alta expresión se identifican cribando células que presentan sobre su superficie la TCR-Fc de interés enlazada a hFcyR.

En estos ejemplos es utilizada la línea de células CHO K1 RGC10, que comprende un FC7R1 inducible como molécula de captura de superficie celular. Se hace que la RGC10 exprese TCR-Fcs recombinantes clonando regiones variables de TCR en marco con una región Fe humana, directamente en marco o con una secuencia enlazadora entre las regiones variables de TCR y la región Fe humana.

Para hacer una proteína de interés que es un dímero que comprende un dominio variable a de TCR enlazado a Fe y un dominio variable b de TCR enlazado a Fe, RGC10 es transfectada con dos vectores: un primer vector capaz de expresar una proteína de fusión del dominio variable a de TCR con una secuencia Fe humana, y un segundo vector capaz de expresar una proteína de fusión del dominio b de TCR con la misma secuencia Fe humana. Cada vector incluye secuencia guía (por ejemplo, una secuencia de señal de secreción) 5’ con respecto a la región variable de TCR, y un marcador seleccionable que es un gen de resistencia a fármaco. Después de cada transfección de vector, las células que contienen el vector se seleccionan mediante una selección de fármaco apropiada. La selección resulta en una línea celular RGC10 que tiene tanto el primero como el segundo vector. Las células que expresan las proteínas de interés pueden ser detectadas por uno o más de un anticuerpo para el dominio variable b, un anticuerpo para el dominio variable a, y un anticuerpo para el dominio Fe.

Para hacer una proteína de interés que es un dímero que comprende tanto un dominio variable a como b de TCR fusionado a un Fe, RGC10 es transfectada con un solo vector que codifica una proteina de interés que se construye de la siguiente manera: una secuencia guía (por ejemplo una secuencia de señal de secreción), seguida por un dominio variable b de TCR fusionado con un enlazador, en donde el enlazador es, a su vez, fusionado con un dominio variable a de TCR, que a su vez se fusiona con una secuencia Fe. Alternativamente, el vector único puede ser construido como sigue: una secuencia guía (por ejemplo, una secuencia de señal de secreción), seguido por un dominio variable a de TCR fusionado con un enlazador, en donde el enlazador, a su vez, está fusionado con un dominio variable b de TCR, que a su vez se fusiona con una secuencia Fe. Las células que expresan las proteínas de interés pueden ser detectadas por uno o más de un anticuerpo para el dominio variable b, un anticuerpo para el dominio variable a, y un anticuerpo para el dominio Fe.

Para hacer las proteínas de interes, como arriba, que también comprenden un dominio constante a de TCR y/o b de TCR, el dominio variable de TCR (a o b) se fusiona con un dominio constante de TCR (por ejemplo, el dominio variable a de TCR se fusiona con el dominio constante a de TCR, y el dominio variable b de TCR se fusiona con el dominio constante b de TCR), y el dominio variable + constante de TCR se fusiona directamente o por medio de un enlazador con el dominio Fe. Las células que expresan proteínas de interés pueden ser detectadas por uno o más de un anticuerpo para el dominio variable b, un anticuerpo para el dominio variable a, y un anticuerpo para el dominio Fe.

Las células que expresan las cantidades deseadas del TCR/Fc se aíslan usando el mismo procedimiento usado para aislar líneas celulares productoras de 4SC622 descritas en la presente, usando uno o más de un anticuerpo para el dominio variable a, un anticuerpo para el dominio variable b, un anticuerpo para el dominio constante a, y un anticuerpo para el dominio constante b, y un anticuerpo para el dominio Fe. Las células que expresan los niveles más altos del TCR-Fc se seleccionan como líneas celulares productoras de TCR-Fc.

Ejemplo 14 CSCP basada en ScFv para el aislamiento de múltiples isotipos de IgG y anticuerpos biespecíficos Ratones geneticamente modificados, cuya región VDJ de cadena pesada de inmunoglobulina y región VJ de cadena kappa de inmunoglobulina de sus genomas fueron reemplazados con los ortólogos humanos (esto es, ratones Velocimmune™; véase la patente de EE. UU. No. 7, 105,348, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad), se inmunizaron con un fragmento Fe de una proteína lgG4 humana (hFc, o simplemente Fe; SEQ ID NO:26), o un polipéptido AAdpFc humano que contiene la mutación de dipéptido (H95R, Y96F según IMGT; también conocido como Fe*; SEQ ID NO:42). Se obtuvieron anticuerpos monoclonales a partir de los ratones y se cribaron por su capacidad para unirse a Fe, Fe*, o anticuerpos que comprenden Fe y/o Fe*. Tres anticuerpos que fueron capaces de unirse a Fe (Ab1 , Ab2, Ab3) y tres que fueron capaces de unirse a Fe* (Ab4, Ab5, Ab6) se probaron para determinar su capacidad para unirse a moléculas que tienen uno de los siguientes formatos: Fc/Fc, Fc/Fc* (que puede ser un anticuerpo biespecífico) y Fc*/Fc*.

Se hicieron mediciones para determinar las afinidades de unión y las constantes cinéticas en un instrumento Biacore 2000. Los anticuerpos (cada uno de Ab1 -Ab8) se capturaron sobre una superficie sensora de anti-Fc de ratón (formato de captura Mab), y homodímeros de Fe humano (SEQ ID NO:26), homodímeros de Fe* humano (SEQ ID NO:42), o heterodímeros Fc/Fc*, se inyectaron sobre la superficie. Las constantes cinéticas de velocidad de asociación (Ka) y disociación (Kd) se determinaron procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1 : 1 usando el software de ajuste de curva Scrubber 2.0. Las constantes de disociación de unión al equilibrio (KD) y las vidas medias disociativas (t1/2) se calcularon a partir de las constantes cinéticas de velocidad como: KD (M) = kd/ka; y t1/2 (min) = (In2/(60*kd). Como se muestra en la tabla 2, los anticuerpos fueron de tres categorías distintas: específicos de Fe, específicos de Fe*, y los que no muestran discriminación entre Fe y Fe* (no específicos). Los anticuerpos específicos de Fe fueron dependientes de los aminoácidos His 95 y/o Tyr 96, puesto que estos anticuerpos no se unen a Fe* humano con su mutación de dipéptido (H95R, 696F). En contraste, los anticuerpos específicos de Fe* fueron dependientes de Arg 95 y/o Phe 96, puesto que estos anticuerpos no se unen a Fe humano de tipo silvestre.

Ejemplo 15 Líneas celulares que producen Ab2 y la proteína de fusión ScFv-FcyR derivada de Ab2 Se determinó la secuencia de la cadena pesada y la cadena ligera del Ab2 específico de Fe. Para fabricar el anticuerpo Ab2 recombinante se construyó un vector plasmídico de expresión que codifica la cadena pesada, y se construyó un vector plasmídico de expresión que codifica la cadena ligera. Ambos vectores permiten la expresión y secreción de las subunidades respectivas en una célula CHO. Para expresar el anticuerpo, ambos plásmidos se transfectaron en una célula CHO-K1 y los transformantes estables se aislaron. La expresión de las cadenas de anticuerpo fue manejada por el promotor CMV constitutivo.

Tabla 2 Afinidad de anticuerpos -Estudios de resonancia de plasmón de superficie Las secuencias de cadena pesada y cadena ligera se usaron para desarrollar una molecula de captura de superficie anti-Fc ScFv. Para fabricar el ácido nucleico que codifica la molécula de captura de superficie anti-Fc ScFv-FcyR derivada de Ab2, las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina Ab2 (SEQ ID NO:15) y el dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina Ab2 (SEQ ID NO: 16) se tradujeron inversamente y se optimizó el codón para expresión en la célula CHO. Similarmente, se optimizó el codón de la porción C-terminal de FcyRI humano para expresión en la célula CHO. Las secuencias de nucleótidos de codón optimizado se amplificaron mediante reacción en cadena de polimerasa y se ligaron para formar una secuencia de ácido nucleico contigua (SEQ ID NO:20) que codifica la proteína de fusión ScFv-FcyR de SEQ ID NO: 19.

El ácido nucleico que codifica la proteína de fusión ScFv-FcyR-TM-cyto se insertó en un vector de expresión usando téenicas estándares de PCR y clonación con endonucleasa de restricción. El plásmido circular resultante, ejemplificado en SEQ ID NO:23, comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica b-lactamasa, y dos operones. El primer operón comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína fluorescente amarilla (YFP), una variante de la proteína fluorescente verde, en marco con un marcador de resistencia a neomicina, manejado por un promotor de SV40 (por ejemplo, SEQ ID NO:24). El segundo operón, que es el “extremo de incumbencia” del vector para los fines de este aspecto de la invención, comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión ScFv- FcyR de codón optimizado, manejada por un promotor hCMV-IE y el intrón de hCMV (por ejemplo, SEQ ID NO:25).

Células CHO-K1 se transfectaron con el plásmido de SEQ ID NO:23. Se aislaron los integrantes estables que han integrado la construcción lineal de SEQ ID NO:22 en sus genomas.

El plásmido circular contiene dos sitios Lox que flanquean el primer operón y el segundo operón, para permitir la integración de los operones como una construcción lineal en el genoma de la célula hospedera. La construcción lineal que abarca desde el primer sitio Lox hasta el segundo sitio Lox es ejemplificada en SEQ ID NO:22, y comprende de 5’ a 3’: promotor de SV40, ácido nucleico que codifica resistencia a neomicina, IRES, ácido nucleico que codifica eYFP, secuencia de poliadenilación de SV40, promotor hCMV-IE, intrón de hCMV, secuencia operadora de Tet (para la expresión controlada de la proteína de fusión ScFv-FcyR-TM-cyto), ácido nucleico que codifica la secuencia señal mROR, ácido nucleico que codifica ScFv de Ab2, ácido nucleico que codifica la porción de transmembrana y citoplásmica de FcyR (SEQ ID NO: 21 ) , y secuencia de poliadenilación de SV40.

Ejemplo 16 Objetivos de captura de superficie de ScFv-FcyR-TM-cyto Células CHO-K1 que contienen la secuencia integrada de SEQ ID NO:22 se transfectaron con plásmidos que codifican anticuerpos de varios subtipos, por ejemplo, anticuerpo biespecífico de I g G 1 , lgG2, lgG4 e lgG4, que contienen un dominio CH3 con la sustitución doble 95R/435R-96F/436F, mientras que el otro dominio CH3 es de tipo silvestre (lgG4 Fc/Fc*), y un anticuerpo biespecífico de IgG 1 del formato Fc/Fc*. Las celulas se trataron con doxicielina para inducir la producción de la molécula de captura junto con el anticuerpo. Después de la coexpresión del anticuerpo y molécula de captura, en algunos casos las células se trataron con la proteína bloqueadora hFc, y la molécula de detección (anti-hFab marcado con FITC). La tabla 3 resume los resultados y muestra en general que la proteína de fusión de captura de superficie ScFv-FcyR se une a las moléculas de lgG4, lgG2 e IgG 1 , mientras que la molécula de captura de superficie FcyR de tipo silvestre se une a Ig G 1 , pero no a lgG4 o lgG2.

Tabla 3 Ensayos de competencia de molécula bloqueadora 1 +Dox 2 -Dox Ejemplo 17 Líneas celulares que producen Ab6 y scFv*-FcyR-TM-cyto derivado de Ab6 Se determinó la secuencia de la cadena pesada y la cadena ligera del Ab6 específico de Fe*. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera se determinó que es el SEQ ID NO:41. Se determinó que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es el SEQ ID NO:40. Para fabricar el anticuerpo Ab6 recombinante, se construyó un vector plasmídico de expresión que codifica la cadena pesada, y se construyó un vector plasmídico de expresión que codifica la cadena ligera. Para expresar el anticuerpo, los dos plásmidos se transfectaron en una célula CHO-K1 , los transformantes estables se aislaron y la expresión fue manejada por el promotor de CMV constitutivo.

Para fabricar el ácido nucleico que codifica la molécula de superficie ScFv*-FcyR específica de anti-Fc* derivada de Ab6, las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina del anticuerpo Ab6 (SEQ ID NO:38) y el dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina de Ab6 (SEQ ID NO:39), se tradujeron inversamente y se optimizó su codón para la expresión en la célula CHO. Asimismo, la porción C-terminal de FcyRI humano (SEQ ID NO:21 ) se optimizó en su codón para expresión en la célula CHO. Las secuencias de nucleótidos de codón optimizado se amplificaron por reacción en cadena de polimerasa y se ligaron para formar una secuencia de ácido nucleico contigua (SEQ ID NO:45) que codifica la proteína de fusión ScFv*-FcyR anti-Fc* (SEQ ID NO:43).

El ácido nucleico que codifica la proteína de fusión ScFv*-FcyR-TM-cyto se insertó en un vector de expresión usando téenicas estándares de PCR y clonación con endonucleasa de restricción. El plásmido circular resultante, ejemplificado en SEQ ID NO:44, comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica beta-lactamasa y dos operones. El primer operón comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína fluorescente amarilla (YFP), una variante de la proteína fluorescente verde, en marco con un marcador de resistencia a neomicina, manejado por un promotor de SV40 (por ejemplo, SEQ ID NO:46). El segundo operón, que es el “extremo de incumbencia” del vector para los fines de este aspecto de la invención, comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión ScFv-FcyR anti-Fc* de codón optimizado, manejado por un promotor hCMV-IE y el intrón de hCMV (por ejemplo, SEQ ID NO:47).

Células CHO-K1 se transfectaron con el plásmido de SEQ ID NO:44. Se aislaron los integrantes estables que han integrado la construcción lineal de SEQ ID NO:48.

El plásmido circular contiene dos sitios Lox que flanquean el primer operón y el segundo operón, para permitir la integración de los operones como una construcción lineal en el genoma de la célula hospedera. La construcción lineal que abarca desde el primer sitio Lox hasta el segundo sitio Lox es ejemplificada en SEQ ID NO:48, y comprende de 5’ a 3’: promotor de SV40, ácido nucleico que codifica resistencia a neomicina, IRES, ácido nucleico que codifica eYFP, secuencia de poliadenilación de SV40, promotor hCMV-IE, intrón de hCMV, secuencia operadora de Tet (para la expresión controlada de la proteína de fusión ScFv*-FcyR anti-Fc*), ácido nucleico que codifica la secuencia señal mROR, ácido nucleico que codifica el ScFv* específico de anti-Fc* derivado de Ab6, ácido nucleico que codifica el polipeptido del dominio de transmembrana y citoplásmico de FcyR (SEQ ID NO:21), y secuencia de poliadenilación de SV40.

Ejemplo 18 Clasificación de anticuerpos biespecíficos Captura de anti-Fc v detección de anti-Fc* El sistema de captura de superficie ScFv-FcyR específico de anti-Fc derivado de Ab2 se probó para determinar su capacidad para detectar y enriquecer células que producen anticuerpos biespecíficos. Para evaluar la capacidad para detectar anticuerpos biespecíficos, que alojan la sustitución 95R/435R-96F/436F en uno de los dominios CH3 (designados Fe*), se expresaron varios anticuerpos en la línea celular de captura de superficie ScFv-FcyR específico de anti-Fc derivado de Ab2, usando hFc como la molécula bloqueadora, y un anticuerpo anti-Fc* de Ab6 marcado con FITC (por ejemplo, mAb con HC de SEQ ID NO:40 y LC de SEQ ID NO:41 ) como la molécula de detección. La línea celular de captura de superficie ScFv-FcyR específico de anti-Fc derivado de Ab2 fue capaz de detectar y distinguir el anticuerpo biespecífico (Fc/Fc*) sobre cualquier anticuerpo monoespecífico Fc*/Fc* o Fc/Fc, usando el Ab6 específico de Fe* como la molécula de detección (tabla 4). La línea celular de captura de superficie de FcyR de tipo silvestre no fue capaz de distinguir entre las especies Fc/Fc*, Fc*/Fc* y Fc/Fc de lgG4, puesto que FcyR es incapaz de unirse, o se une con una afinidad muy baja, a lgG4.

Captura de anti-Fc* v detección de anti-Fc Inversamente, el sistema de captura de superficie ScFv*-FcyR específico de anti-Fc* derivado de Ab6 se probó para determinar su capacidad para detectar y enriquecer células que producen anticuerpos biespecíficos. Para evaluar la capacidad para detectar anticuerpos biespecíficos, que alojan la sustitución 95R/435R-96F/436F en uno de los dominios CH3 (designado Fe*), se expresaron varios anticuerpos en la línea celular de captura de superficie ScFv*-FcyR específico de anti-Fc* derivado de Ab6, usando hFc como la molécula de bloqueo, y un anticuerpo anti-Fc de Ab2 marcado con Alexa 488, que reconoce CH3 no sustituido, como la molécula de detección. La línea celular de captura de superficie ScFv*-FcyR específico de anti-Fc* derivado de Ab6 fue capaz de detectar y distinguir el anticuerpo biespecífico (Fc/Fc*) sobre los anticuerpos monoespecíficos Fc*/Fc* o Fc/Fc, usando el Ab2 específico de Fe como la molécula de detección (tabla 4). La línea celular de captura de superficie FcyR no fue capaz de distinguir entre las especies Fc/Fc*, Fc*/Fc* y Fc/Fc de lgG4.

Tabla 4 Detección de anticuerpo biespecífico -Intensidad de fluorescencia media (MFI) 1 Proteína de captura de superficie celular.2 Molécula de detección.

Ejemplo 19 Enriquecimiento de anticuerpos biespecíficos Fc/Fc* Para evaluar la capacidad de los sistemas CSCP ScFv-FcyR (Ab2-derivado) /DM anti-Fc* (Ab6) y CSCP ScFv*-FcyR (Ab6-derivado) /DM anti-Fc (Ab2) para clasificar y enriquecer anticuerpos biespecíficos, lineas celulares que expresan un anticuerpo monoclonal Fc/Fc* lgG4 (lgG4-mAb-2) y la proteína de fusión ScFv-FcyR anti-Fc, usando hFc como la molécula bloqueadora, y el anticuerpo anti-Fc* (Ab6) marcado con FITC como la molécula de detección, se sometieron a clasificación celular activada por fluorescencia en serie y se agruparon para enriquecer para la producción de las especies Fc/Fc*. Las células que producen Fc/Fc* de la qumta y sexta agrupación en serie se analizaron para determinar el título total de anticuerpo y los títulos de cada formato de anticuerpo: Fc/Fc*, Fc/Fc y Fc*/Fc*. Puesto que las células codifican tanto una cadena pesada que codifica el dominio CH3 no sustituido (“Fe”, esto es, que comprende una histidina en la posición IMGT 95 y una tirosina en la posición IMGT 96), y una cadena pesada que codifica el dominio CH3 sustituido (“Fe*”, esto es, que comprende una arginina en la posición IMGT 95 y una fenilalanina en la posición IMGT 96), mediante análisis de cuadrados de Punnett puramente matemático, se espera teóricamente que la célula produzca 25% de Fc/Fc, 50% de Fc/Fc* y 25% de Fc*/Fc*. Sin embargo, biológicamente se podría esperar (pre-enriquecimiento) que la mayor parte del anticuerpo producido sea Fc/Fc.

Como se muestra en la tabla 5, las células seleccionadas, agrupadas y enriquecidas para la producción de anticuerpo biespecífico produjeron hasta 49% de especies Fc/Fc*, con títulos de anticuerpos biespecíficos Fc/Fc* de por lo menos aproximadamente 3.2 g/L.

Tabla 5 Enriquecimiento del anticuerpo biespecífico Fc/Fc* lgG4-mAb-2 Aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle a manera de ilustración y ejemplo, será evidente para los expertos en la materia que se pueden hacer algunos cambios y modificaciones a las enseñanzas de la invención sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión de antígeno recombinante que se une a un dominio lgG1 -Fc de humano, un dominio lgG2-Fc de humano, o un dominio lgG4-Fc de humano.

2. La proteína de unión de antígeno recombinante de la reivindicación 1 , en donde la proteína de unión de antígeno se une a un polipeptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26.

3. La proteína de unión de antígeno recombinante de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la proteína de unión de antígeno se une al polipéptido con una KD menor de aproximadamente 40 nM, medida en un ensayo de resonancia de plasmón de superficie.

4. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proteína de unión de antígeno comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 15, o de una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 16.

5. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la proteína de unión de antígeno comprende una CDR-1 de cadena pesada (HCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27, una HCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una HCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29, una CDR-1 de cadena ligera (LCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30, y una LCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31.

6. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la proteína de unión de antígeno comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 15, y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:16.

7. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la proteína de unión de antígeno comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16.

8. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la proteína de unión de antígeno es una proteína de fusión de ScFv que comprende (a) un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:15, (b) un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 16, y (c) un dominio de ancla de membrana que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO:21 .

9. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la proteína de unión de antígeno es una proteína de fusión de ScFv que comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO: 15, y un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO:16.

10. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la proteína de unión de antígeno es una proteína de fusión de ScFv que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

1 1. Una proteína de unión de antígeno recombinante que se une al mismo epítopo sobre el polipéptido CH3 sustituido que un anticuerpo que comprende una CDR-1 de cadena pesada (HCDR1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27, una HCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una HCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29, una CDR-1 de cadena ligera (LCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30, y una LCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31.

12. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de unión de antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 -11.

13. El polinucleótido aislado de la reivindicación 12, en donde el ácido nucleico codifica un polipeptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19.

14. Un vector de ácido nucleico que comprende: (a) un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 12 o 13; (b) un promotor, que está enlazado operativamente al polinucleótido; y (c) una secuencia de poliadenilación.

15. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 14, en donde el promotor es un promotor de CMV.

16. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 14 o 15, que comprende un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable.

17. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 16, en donde el marcador seleccionable provee resistencia a la neomicina.

18. El vector de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de transferencia de energía.

19. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 18, en donde la proteína de transferencia de energía es un derivado de la proteína fluorescente verde.

20. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 19, en donde el derivado de proteína fluorescente verde es la proteína fluorescente amarilla ("YFP").

21. El vector de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, en donde el vector es circular.

22. El vector de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, en donde el vector es lineal.

23. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 22, en donde el vector está integrado en el genoma de una célula hospedera.

24. El vector de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 23, en donde la célula hospedera es una célula CHO.

25. Una célula hospedera que expresa la proteína de unión de antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1.

26. La célula hospedera de la reivindicación 25, en donde la célula es una célula CHO.

27. Una proteína de unión de antígeno recombinante que se une específicamente a un poli péptido CH3 sustituido que comprende una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste en (a) 95R, y (b) 95R y 96F, de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT; o (a') 435R, y (b') 435R y 436F, de acuerdo con el sistema de numeración EU.

28. La proteína de unión de antígeno recombinante de la reivindicación 27, en donde la proteína de unión de antígeno se une a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42.

29. La proteína de unión de antígeno recombinante de la reivindicación 27 o 28, en donde la proteína de unión de antígeno se une al polipéptido con una KD menor de aproximadamente 60 nM, medida en un ensayo de resonancia de plasmón de superficie.

30. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, en donde la proteína de unión de antígeno comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% identica a SEQ ID NO:38, o de una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:39.

31. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, en donde la proteína de unión de antígeno comprende una CDR-1 de cadena pesada (HCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32, una HCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33, una HCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-1 de cadena ligera (LCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35, una LCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36, y una LCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37.

32. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31 , en donde la proteína de unión de antígeno comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:38, y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:39.

33. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, en donde la proteína de unión de antígeno comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38 y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39.

34. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en donde la proteína de unión de antígeno es un anticuerpo que comprende a cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% identica a SEQ ID NO:40, y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:41.

35. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 34, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO:40 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO:41.

36. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en donde la proteína de unión de antígeno es una proteína de fusión de ScFv que comprende (a) un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:38, (b) un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:39, y (c) un dominio de ancla de membrana.

37. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33 y 36, en donde la proteína de unión de antígeno es una proteína de fusión de ScFv que comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO:38, y un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO:39.

38. La proteína de unión de antígeno recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, 36 y 37, en donde la proteína de unión de antígeno es una proteína de fusión de ScFv que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43.

39. Una proteína de unión de antígeno recombinante que se une al mismo epítopo sobre el polipéptido CH3 sustituido que un anticuerpo que comprende una CDR-1 de cadena pesada (HCDR1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32, una HCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33, una HCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-1 de cadena ligera (LCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35, una LCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36, y una LCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37.

40. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de unión de antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 39.

41. El polinucleótido aislado de la reivindicación 40, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40.

42. El polinucleótido aislado de la reivindicación 40, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41.

43. El polinucleótido aislado de la reivindicación 40, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43.

44. Un vector de ácido nucleico que comprende: (a) un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43; (b) un promotor, que está enlazado operativamente al polinucleótido; y (c) una secuencia de poliadenilación.

45. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 44, en donde el promotor es un promotor de CMV.

46. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 44 o 45, que comprende un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable.

47. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 46, en donde el marcador seleccionable provee resistencia a la neomicina.

48. El vector de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 44 a 47, que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de transferencia de energía.

49. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 48, en donde la proteína de transferencia de energía es un derivado de la proteína fluorescente verde.

50. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 49, en donde el derivado de la proteína fluorescente verde es la proteína fluorescente amarilla ("YFP").

51. El vector de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 44 a 50, en donde el vector es circular.

52. El vector de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 44 a 50, en donde el vector es lineal.

53. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 52, en donde el vector está integrado en el genoma de una célula hospedera.

54. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 53 y cualquiera de las reivindicaciones 44 a 53, en donde la célula hospedera es una célula CHO.

55. Una célula hospedera que expresa una proteína de unión de antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 39.

56. La célula hospedera de la reivindicación 55, en donde la célula es una célula CHO.

57. Un método de detección o aislamiento de una célula que expresa establemente una proteína heterodimérica, que comprende los pasos de: (a) expresar en una célula hospedera una proteína de captura de superficie celular (CSCP) y una proteína heterodimérica, en donde (i) la CSCP se une a un primer sitio sobre la proteína heterodimérica para formar un complejo CSCP-proteína heterodimérica dentro la célula hospedera, (ii) el complejo CSCP-proteína heterodimérica es transportado a través de la célula hospedera, y (iii) después es presentado sobre la superficie de la célula hospedera; (b) poner en contacto la célula hospedera con una molécula de detección, en donde la molécula de detección se une a un segundo sitio sobre la proteína heterodimérica; y (c) seleccionar la célula hospedera que se une a la molécula de detección.

58. El método de la reivindicación 57, caracterizado además porque comprende el paso de poner en contacto la célula con una molécula bloqueadora antes de seleccionar la célula hospedera en el paso (c), en donde la molécula bloqueadora se une a la CSCP que no está enlazada a la proteína heterodimérica, pero no se une al complejo CSCP-proteína heterodimérica.

59. El método de las reivindicaciones 57 o 58, en donde el paso de selección (c) se realiza por clasificación celular activada por fluorescencia.

60. El método de cualquiera de las reivindicaciones 57 a 59, en donde la proteína heterodimérica comprende múltiples subunidades, y el primer sitio sobre la proteína heterodimérica reside en una primera subunidad, y el segundo sitio sobre la proteína heterodimérica reside en una segunda subunidad.

61. El método de la reivindicación 60, en donde la proteína heterodimérica comprende un anticuerpo.

62. El método de la reivindicación 61 , en donde el primer sitio sobre el anticuerpo reside en una cadena pesada que comprende un dominio CH3 de tipo silvestre.

63. El método de cualquiera de las reivindicaciones 57 a 62, en donde el primer sitio sobre el anticuerpo reside en una cadena pesada que comprende un dominio CH3 que comprende un residuo de histidina en la posición 95 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT, y un residuo de tirosina en la posición 96 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT.

64. El método de cualquiera de las reivindicaciones 57 a 63, en donde la CSCP comprende una proteína de unión de antígeno recombinante que se une a un dominio lgG1 -Fc de humano, un dominio lgG2-Fc de humano, o un dominio lgG4-Fc de humano.

65. El método de cualquiera de las reivindicaciones 57 a 64, en donde la proteína de unión de antígeno se une a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26.

66. El método de cualquiera de las reivindicaciones 57 a 65, en donde la proteína de unión de antígeno comprende la proteína A o un fragmento funcional de la proteína A.

67. El método de la reivindicación 66, en donde la proteína de unión de antígeno es una proteína quimérica que comprende el dominio de unión de Fe de la proteína A.

68. El método de la reivindicación 67, en donde la proteína quimérica comprende el dominio de unión de Fe de la proteína A y un ancla de membrana.

69. El método de la reivindicación 68, en donde la proteína quimérica comprende el dominio de unión de Fe de la proteína A y un dominio de transmembrana de un receptor de Fe.

70. El método de cualquiera de las reivindicaciones 57 a 64, en donde la proteína de unión de antígeno se une al polipéptido con una KD menor de aproximadamente 40 nM, medida en un ensayo de resonancia de plasmón de superficie.

71. El método de cualquiera de las reivindicaciones 57 a 70, en donde la CSCP comprende una proteína de fusión de ScFv que comprende (a) un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 15, (b) un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 16, y (c) un dominio de ancla de membrana.

72. El método de la reivindicación 71 , en donde la molécula de detección (DM) comprende una proteína de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:38, y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:39.

73. El método de cualquiera de las reivindicaciones 57 a 59, en donde la CSCP comprende una proteína de unión de antígeno comprende una proteína de fusión de ScFv que comprende (a) un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:38, (b) un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:39, y (c) un dominio de ancla de membrana.

74. El método de la reivindicación 73, en donde la molécula de detección (DM) comprende una proteína de unión de antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 15, y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 16.

75. El método de cualquiera de las reivindicaciones 57 a 74, en donde la molécula bloqueadora es una IgG no humana o una molécula Fe humana.

76. Un método de detección y aislamiento de células que producen altos niveles de una proteína heterodimérica, que comprende: (a) transfectar células con un ácido nucleico que codifica una proteína de captura de superficie celular (CSCP), que es una proteína de fusión que comprende un dominio de ancla de membrana y es capaz de unirse a una primera subunidad de la proteína heterodimérica, en donde la célula expresa la proteína heterodimérica; (b) detectar una célula de (a) que expresa la CSCP con alto rendimiento; (c) aislar y cultivar la célula que expresa la CSCP con alto rendimiento; (d) detectar la proteína heterodimérica sobre la superficie de la célula aislada y cultivada del paso (c) con una molécula de detección que se une a una segunda subunidad de la proteína heterodimérica; y (e) aislar la celula detectada en el paso (d) que lleva la proteína heterodiméríca detectada sobre su superficie.

77. El método de la reivindicación 76, en donde la proteína heterodiméríca comprende un anticuerpo.

78. El método de la reivindicación 76 o 77, en donde la primera subunidad de la proteína heterodiméríca comprende un dominio de cadena pesada que comprende un dominio CH3 de tipo silvestre.

79. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 78, en donde la primera subunidad de la proteína heterodiméríca comprende una cadena pesada que comprende un dominio CH3 que tiene un residuo de histidina en la posición 95 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT, y un residuo de tirosina en la posición 96 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT.

80. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 79, en donde la CSCP comprende una proteína de unión de antígeno recombínante que se une a un dominio lgG1 -Fc de humano, un dominio lgG2-Fc de humano, o un dominio lgG4-Fc de humano.

81. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 80, en donde la proteína de unión de antígeno recombinante se une a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26.

82. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 81 , en donde la proteína de unión de antígeno recombinante comprende la proteína A o un fragmento funcional de la proteína A.

83. El método de la reivindicación 82, en donde la proteína de unión de antígeno recombinante es una proteína de fusión que comprende el dominio de unión de Fe de la proteína A.

84. El método de la reivindicación 82 o 83, en donde la proteína de fusión comprende el dominio de unión de Fe de la proteína A y un ancla de membrana.

85. El método de cualquiera de las reivindicaciones 82 a 84, en donde la proteína de fusión comprende el dominio de unión de Fe de la proteína A y un dominio de transmembrana de un receptor de Fe.

86. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 81 , en donde la proteína de unión de antígeno recombinante se une al polipéptido con una KD menor de aproximadamente 40 nM, medida en un ensayo de resonancia de plasmón de superficie.

87. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 81 , en donde la proteína de unión de antígeno recombinante comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 15, o de una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 16.

88. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 81 u 87, en donde la proteína de unión de antígeno recombinante comprende una CDR-1 de cadena pesada (HCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27, una HCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una HCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29, una CDR-1 de cadena ligera (LCDR-1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30, y una LCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31.

89. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 81 , 87 u 88, en donde la proteína de unión de antígeno recombinante se une al mismo epítopo sobre el dominio CH3 que un anticuerpo que comprende una CDR-1 de cadena pesada (HCDR1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27, una HCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una HCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29, una CDR-1 de cadena ligera (LCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.30, y una LCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31.

90. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 81 , u 87 a 89, en donde la proteína de unión de antígeno comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:15 y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:16.

91. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 81 , u 87 a 90, en donde la proteína de unión de antígeno comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

92. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 81 , en donde la CSCP es una proteína de fusión de ScFv que comprende (a) un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 15, (b) un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 16, y (c) un dominio de ancla de membrana que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO:21.

93. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 81 o 92, en donde la CSCP es una proteína de fusión de ScFv que comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO: 15, y un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO: 16.

94. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 81 , 92, o 93, en donde la CSCP es una proteína de fusión de ScFv que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

95. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 94, en donde la segunda subunidad de la protema heterodimérica comprende una cadena pesada que comprende un dominio CH3 que comprende un residuo de arginina en la posición 95 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT, y un residuo de fenilalanina en la posición 96 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT.

96. El método de la reivindicación 95, en donde la molécula de detección (DM) comprende una proteína de unión de antígeno recombinante marcada que se une a un dominio lgG1 -Fc de humano, un dominio lgG2-Fc de humano, o un dominio lgG4-Fc de humano, en donde el dominio Fe comprende un residuo de arginina en la posición 95 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT, y un residuo de fenilalanina en la posición 96 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT.

97. El método de la reivindicación 95 o 96, en donde la molécula de detección comprende un F(ab')2 de anti-lgG de humano marcado.

98. El método de la reivindicación 96 o 97, en donde la proteína de unión de antígeno recombinante marcada se une a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43.

99. El método cualquiera de las reivindicaciones 96 a 98, en donde la proteína de unión de antígeno recombinante marcada se une al polipéptido con una KD menor de aproximadamente 60 nM, medida en un ensayo de resonancia de plasmón de superficie.

100. El método de cualquiera de las reivindicaciones 96 a 99, en donde la proteína de unión de antígeno recombinante marcada comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:38, o de una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:39.

101. El método de cualquiera de las reivindicaciones 96 a 100, en donde la proteína de unión de antígeno recombinante marcada comprende una CDR-1 de cadena pesada (HCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32, una HCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33, una HCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-1 de cadena ligera (LCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35, una LCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36, y una LCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37.

102. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 96 a 101 , en donde la proteína de unión de antígeno recombinante marcada comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:38, y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:39.

103. El método de cualquiera de las reivindicaciones 96 a 102, en donde la proteína de unión de antígeno recombinante marcada comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38 y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39.

104. El método de cualquiera de las reivindicaciones 96 a 103, en donde la proteína de unión de antígeno recombinante marcada es un anticuerpo marcado que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:40, y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:41.

105. El método de la reivindicación 104, en donde el anticuerpo marcado comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO:40 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos identica a SEQ ID NO:41.

106. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 78, en donde la primera subunidad de la proteína heterodimérica comprende un dominio de cadena pesada que comprende un dominio CH3 que tiene un residuo de arginina en la posición 95 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT, y un residuo de fenilalanina en la posición 96 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT, y la segunda subunidad de la proteína heterodimérica comprende un dominio de cadena pesada que comprende un dominio CH3 que tiene un residuo de histidina en la posición 95 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT, y un residuo de tirosina en la posición 96 de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT.

107. El método de la reivindicación 106, en donde la CSCP comprende una proteína de fusión de ScFv que comprende (a) un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:38, (b) un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:39, y (c) un dominio de ancla de membrana.

108. El método de la reivindicación 107, en donde la proteína de fusión de ScFv comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO:38 y un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO:39.

109. El método de la reivindicación 107 o 108, en donde la proteína de fusión de ScFv comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43.

1 10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 106 a 109, en donde la molécula de detección (DM) comprende una proteína de unión de antígeno recombinante marcada que comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 15, o de una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 16.

11 1. El método de la reivindicación 1 10, en donde la proteína de unión de antígeno recombinante marcada comprende una CDR-1 de cadena pesada (HCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27, una HCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una HCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29, una CDR-1 de cadena ligera (LCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30, y una LCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31.

112. El método de la reivindicación 106, en donde la molécula de detección (DM) comprende una proteína de unión de antígeno recombinante marcada que se une al mismo epítopo sobre el dominio CH3 que un anticuerpo que comprende una CDR-1 de cadena pesada (HCDR1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27, una HCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una HCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29, una CDR-1 de cadena ligera (LCDR-1 ) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30, y una LCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31.

1 13. El metodo de la reivindicación 1 12, en donde la proteína de unión de antígeno marcada comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 15 y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 16.

1 14. El método de la reivindicación 1 12 o 113, en donde la proteína de unión de antígeno marcada comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

115. El método de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 1 14, en donde la molécula bloqueadora es una IgG no humana o una molécula Fe humana.