CN104797598A

CN104797598A - 重组的细胞表面捕捉蛋白

Info

Publication number: CN104797598A
Application number: CN201380059198.4A
Authority: CN
Inventors: D·德施潘德; 陈刚; D·布拉科夫; J·凡德尔; T·奥尔德里奇; V·卡马特
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2012-11-14
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2033-11-14
Also published as: AU2013344769A1; AU2013344769B2; DK2949667T3; JP2015536345A; TW201439121A; IL238176A0; EP2949667A3; EA202190266A1; JP6856593B2; SG11201502629TA; AU2021202371A1; TW201920289A; BR112015010758A2; ES2805526T3; CN109485728A; JP6668074B2; HK1214612A1; TWI745610B; KR20230119245A; EP2920208A2

Abstract

提供了用于分离和检测产生分泌的异二聚体目标蛋白(POI)的细胞的重组的细胞表面捕捉蛋白和检测分子，所述POI具有免疫球蛋白CH3结构域和/或经置换的CH3结构域。还提供了分离和检测双特异性抗体的重组的细胞表面捕捉蛋白和检测分子。本发明还提供了能够识别和结合目标蛋白的重组的抗原结合蛋白，所述目标蛋白包含CH3结构域和/或经修饰的CH3结构域，例如在H95和Y96(IMGT)上具有或不具有氨基酸置换的CH3结构域。

Description

重组的细胞表面捕捉蛋白

背景

相关申请的交叉参考

本申请要求2012年11月14日提交的美国临时专利申请No.61/726,040的35 USC§119(e)下的利益，所述申请特别地通过引用整体并入本文。

序列表

本申请通过引用并入以计算机可读形式提交为创建于2013年11月12日的文件8600WO_ST25.txt(86,267字节)的序列表。

发明领域

本发明的领域涉及用于鉴定、分离和富集产生分泌的蛋白的细胞的重组的细胞表面捕捉蛋白和方法，所述分泌的蛋白是异二聚体例如双特异性蛋白。更具体地，所述细胞表面捕捉蛋白和方法允许快速有效地分离高表达重组抗体产生细胞系，包括快速有效地分离分泌异二聚体蛋白例如双特异性抗体的特定杂交瘤和细胞，从而富集异二聚体种类(双特异性分子)并优选从同二聚体种类分离异二聚体。

用于在宿主细胞中表达目的基因(GOI)的现有技术方法是已知的。简要地，将携带GOI的表达载体引入所述细胞中。在稳定整合后，用于分离高表达细胞的标准方法包括细胞库的收集、从平板手选菌落、通过有限稀释分离单个细胞或本领域中已知的其它方法。随后扩增库或个体克隆并通过直接测量目的蛋白(POI)活性、通过免疫检测POI或通过其它适当的技术来针对POI的产生进行筛选。这些程序是费力、低效、昂贵的，并且可被分析的克隆的数量通常限于数百个。

细胞在稳定整合后的蛋白表达中的高度异质性需要将许多个体克隆进行筛选以鉴定稀少的导致稳定的高表达产生细胞系的整合事件。此需要要求使得能够快速鉴定和分离表达最高水平的蛋白产生的细胞的方法。此外，克隆库的收集或手选的菌落冒着丢失通常生长得较为缓慢的高表达细胞至更快生长的低表达细胞的风险。因此，存在对于允许快速筛选和分离能够高水平表达分泌的POI的个体细胞的方法的需求。当POI包含多于一个亚基时，需要优选地相对于同二聚体种类选择期望的异二聚体种类。

在用于分离稳定表达细胞系的方法中并入流式细胞术已改善了筛选大量个体克隆的能力，然而，目前可用的方法因多种原因而仍然是不适当的。具有不同特征的细胞之间的POI扩散也是一个问题。

概述

本发明描述了用于通过直接筛选目标蛋白(POI)来快速分离分泌蛋白的那些细胞的高通量筛选方法。本发明还允许在生产过程中在单细胞基础上方便地监测POI表达。此外，此技术可直接地应用于筛选产生双特异性抗体的细胞或产生异二聚体蛋白的任何细胞。所述技术还可直接地应用于筛选产生经修饰的T细胞受体的细胞，例如产生T细胞受体的可溶性形式的细胞。

在一个方面，本发明提供了检测和分离产生分泌的目标蛋白(POI)的细胞的方法，其包括：a)构建编码能够结合POI的细胞表面捕捉分子的核酸分子；b)用步骤a)的核酸分子转染表达所述POI的细胞；c)通过使所述细胞与检测分子接触来检测呈现在表面的POI，其中所述检测分子结合所述POI；和d)基于所述检测分子分离细胞。

在多个实施方案中，目标蛋白包括配体、可溶性受体蛋白、生长因子、融合蛋白、抗体、双特异性抗体、Fab、单链抗体(ScFv)或其片段。当所述目标蛋白是抗体时，抗体选自IgM、IgG、IgA、IgD或IgE，以及这些的各种亚型或变体。在具体的实施方案中，抗体是抗-DII4抗体，抗-ErbB3抗体，抗-EGFR抗体，双特异性的抗-ErbB3/EGFR双特异性抗体，或抗-IL-6受体抗体。

在更具体的实施方案中，目标蛋白是生长因子，其选自白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、睫状神经营养因子(CNTF)、红细胞生成素、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素1(Ang-1)、血管生成素2(Ang-2)、TNF、干扰素-γ、GM-CSF、TGFβ和TNF受体。

在多个实施方案中，目标蛋白包含T细胞受体的可变结构域。在具体的实施方案中，目标蛋白是可溶性T细胞受体(sTCR)或包含融合至Fc的T细胞受体胞外结构域的蛋白(TCR-Fc)，在具体的实施方案中，所述Fc是人Fc。在多个实施方案中，所述蛋白包含T细胞受体胞外结构域的可变结构域。在多个实施方案中，所述蛋白包含T细胞受体胞外结构域的可变结构域和恒定区。

编码目标蛋白的核酸可以来自任何来源(天然存在的或通过重组技术构建的)，并且可以选择自DNA文库。

在多个实施方案中，所述细胞表面捕捉分子是配体特异性受体、受体特异性配体、抗体结合蛋白、抗体或抗体片段例如ScFv或者是肽。当捕捉分子是肽时，所述肽可分离自噬菌体展示文库。在更具体的实施方案中，捕捉分子可以是Ang1、Ang2、VEGF、Tie1、Tie2、VEGFRI(Flt1)、VEGFRII(Flk1或KDR)、CNTF、CNTFR-α、细胞因子受体组分、两种或更多种细胞因子受体组分的融合体或其片段。当捕捉分子是抗体结合蛋白时，所述抗体结合蛋白可以是Fc受体、抗-免疫球蛋白抗体、抗-免疫球蛋白(抗-Ig)ScFv、抗-Fc抗体、抗-Fc*抗体、蛋白A、蛋白L、蛋白G、蛋白H或其功能性片段。如此，在一些实施方案中，捕捉分子是包含融合至跨膜结构域或GPI接头的抗原、蛋白A或抗-Ig ScFv的融合蛋白。

在其中目标蛋白包含T细胞受体可变结构域的多个实施方案中，所述细胞表面捕捉分子包含能够被所述T细胞受体的可变结构域识别的Fc受体或膜相关抗原。

在其中目标蛋白是异二聚体蛋白例如具有第一亚基和第二亚基的异二聚体蛋白的一些实施方案中，所述细胞表面捕捉分子包含能够结合所述第一亚基而不结合所述第二亚基的抗原、蛋白A或ScFv，或者这样的细胞表面捕捉分子结合所述第二亚基而不结合所述第一亚基。

在其中目标蛋白是IgG1、IgG2、IgG4或具有一个包含废除与蛋白A的结合的突变的CH3结构域和另一个能够结合蛋白A的CH3结构域的双特异性抗体；或者是包含来自IgG1、IgG2、IgG4的Fc区或具有一个包含废除与蛋白A的结合的突变的CH3结构域和另一个能够结合蛋白A的CH3结构域的Fc区的融合蛋白的多个实施方案中，所述细胞表面捕捉分子包含抗-免疫球蛋白ScFv例如抗-Fc或抗-Fc*ScFv。

在几个实施方案中，本发明的方法还包括用于将POI锚定至细胞膜、暴露于细胞外部并因而用作细胞表面捕捉分子的膜锚定物。在具体的实施方案中，所述膜锚定物是跨膜锚定物或GPI连接。具体的跨膜锚定物的实例包括Fc受体的跨膜结构域，例如人FcγRI的跨膜结构域，其实例示于SEQ ID NO:17中。膜锚定物可以是对于细胞为天然的、重组的或合成的。

在多个实施方案中，目标蛋白包含T细胞受体可变区，并且细胞表面捕捉分子包含膜相关抗原。在具体的实施方案中，膜相关抗原是包含融合至膜锚定物的能够被T细胞受体可变区识别的抗原的重组融合蛋白，其中所述抗原与细胞表面结合。在具体的实施方案中，所述重组融合蛋白包含融合至跨膜锚定物或GPI连接的抗原。在另一个具体的实施方案中，细胞表面捕捉分子包含重组融合蛋白，其包含膜锚定物和能够结合主要组织相容性(MHC)分子的抗原，包括但不限于例如肿瘤抗原和经转化表型的自身蛋白。

在其它实施方案中，将信号序列添加至POI的氨基末端，以使得所述蛋白被转运至细胞表面并用作细胞表面捕捉分子。所述信号序列可以是对于细胞为天然的、重组的或合成的。

在多个实施方案中，添加结合细胞表面捕捉分子的封闭分子以减少POI从表达细胞至相邻细胞的扩散。在另一个实施方案中，通过增加培养基的黏度来减少POI从表达细胞至相邻细胞的扩散及其与该细胞的附着。

通过本发明的方法分离的细胞可以是融合至永生化细胞的抗体产生细胞。在更具体的实施方案中，所述抗体产生细胞是B-细胞或其衍生体。B-细胞衍生体可以是浆细胞、杂交瘤、骨髓瘤或重组细胞。

此外，本发明的方法可用于鉴定表达具有期望的特异性、亲和力或同种型的分泌抗体的杂交瘤或者B-细胞及其衍生体。本发明还可用于分离表达期望水平的抗体或抗体片段的细胞。

具有呈现的POI的细胞的检测可通过使用任何能够直接或间接结合所述呈现的POI的分子来完成。这样的检测分子可促进呈现所述POI的细胞的检测和/或分离。在一个实施方案中，使用两种彼此结合并被差异标记的分子。检测和/或分离可通过本领域中已知的标准技术来完成。

在另一个方面，本发明表征了检测和分离产生分泌的目标蛋白(POI)的细胞的方法，其包括：a)用编码细胞表面捕捉分子的核酸转染细胞，其中所述细胞表面捕捉分子能够结合所述POI；b)同时地或随后地，用编码POI的第二核酸转染a)的细胞，其中所述POI被表达和分泌；c)通过使所述细胞与检测分子接触来检测呈现在表面的POI，所述检测分子结合所述POI；和d)基于所述检测分子分离细胞。

在另一个方面，本发明表征了检测和分离产生POI的细胞的方法，其包括：a)检测以高产率表达细胞表面捕捉分子的细胞；b)分离和培养在a)中检测到的细胞；c)用编码POI的核酸转染b)中的细胞，其中这样的POI被分泌；d)通过使所述细胞与结合POI的检测分子接触来检测呈现在表面的POI；和e)基于所述检测分子分离细胞。

在另一个方面，本发明提供了检测和分离产生高水平的目标蛋白(POI)的细胞的方法，其包括：a)用编码这样的能够结合POI的细胞表面捕捉分子的核酸转染细胞，其中所述细胞表达POI；b)检测来自a)的以高产率表达所述细胞表面捕捉分子的细胞；c)分离和培养高产率细胞；d)通过使所述细胞与结合POI的检测分子接触来检测呈现在表面的POI；和e)分离所检测到的细胞。

在另一个方面，本发明提供了检测和分离产生高水平的异二聚体蛋白的细胞的方法，其包括：(a)用编码细胞表面捕捉分子的核酸转染细胞，所述细胞表面捕捉分子是包含膜锚定结构域的融合蛋白并且能够结合异二聚体蛋白的第一亚基，其中所述细胞表达所述异二聚体蛋白；(b)检测(a)中的以高产率表达表面捕捉分子的细胞；(c)分离和培养以高产率表达表面捕捉分子的细胞；(d)用结合异二聚体蛋白的第二亚基的检测分子检测步骤(c)的经分离和培养的细胞的表面上的异二聚体蛋白；和(e)分离在步骤(d)中检测到的在其表面上具有所检测的异二聚体蛋白的细胞。

在另一个方面，本发明提供了检测和分离产生高水平的免疫球蛋白的细胞的方法，其包括：(a)用编码能够结合免疫球蛋白的细胞表面捕捉分子的核酸转染细胞，其中所述细胞表达所述免疫球蛋白；(b)检测(a)中的以高产率表达表面捕捉分子的细胞；(c)分离和培养以高产率表达表面捕捉分子的细胞；(d)用结合免疫球蛋白的检测分子检测步骤(c)的经分离和培养的细胞的表面上的免疫球蛋白；和(e)分离在步骤(d)中检测到的在其表面上具有所检测的免疫球蛋白的细胞。

在另一个方面，本发明提供了检测和分离产生高水平的双特异性抗体的细胞的方法，其包括：(a)用编码细胞表面捕捉分子的核酸转染细胞，所述细胞表面捕捉分子是包含膜锚定结构域的融合蛋白例如ScFv融合蛋白，并且能够结合所述双特异性抗体，其中所述细胞表达所述双特异性抗体；(b)检测(a)中的以高产率表达表面捕捉分子的细胞；(c)分离和培养以高产率表达表面捕捉分子的细胞；(d)用结合双特异性抗体的检测分子检测步骤(c)的经分离和培养的细胞的表面上的双特异性抗体；和(e)分离在步骤(d)中检测到的在其表面上具有所检测的双特异性抗体的细胞。

在另一个方面，提供了用于检测产生期望水平的亲和剂的细胞的方法，所述亲和剂包含T-细胞受体(TCR)可变区。

在另一个方面，提供了用于检测产生期望水平的TCR-Fc的细胞的方法，其包括：(a)用编码能够结合TCR-Fc的Fc受体的核酸转染细胞，其中所述细胞表达被所述TCR-Fc识别的抗原；(b)检测(a)中的以高产率表达TCR-Fc的细胞；(c)分离和培养以高产率表达TCR-Fc的细胞；(d)用检测分子检测步骤(c)的经分离和培养的细胞的表面上的抗原；和(e)分离在步骤(d)中检测到的在其表面上具有所检测的抗原的细胞。

在多个实施方案中，TCR选自人TCR和啮齿目动物TCR例如大鼠、小鼠或仓鼠TCR。在具体的实施方案中，Fc是人Fc。在另一个具体的实施方案中，Fc是人Fc并且Fc受体是高亲和力人Fc受体。在具体的实施方案中，所述高亲和力人Fc受体是人FcγRI。

在多个实施方案中，细胞表面捕捉蛋白是表面结合的抗原。在具体的实施方案中，抗原通过融合至跨膜结构域或GPI接头结合至表面。

在用于选择增强的产生目标蛋白的细胞的方法的一些方面，重组的抗原结合蛋白可用作细胞表面捕捉蛋白(CSCP)、检测分子(DM)和/或封闭分子。因此，本发明提供了重组的抗原结合蛋白。

在一个方面，本发明提供了结合人IgG1-Fc结构域、人IgG2-Fc结构域或人IgG4-Fc结构域或结合包含例如SEQ ID NO:26的氨基酸序列(其编码人Fc)的任何蛋白的重组的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，所述重组的抗原结合蛋白以如在表面等离子体共振测定中测量的低于约40nM的K_D结合多肽。

在一些实施方案中，重组的抗原结合蛋白包含重链可变区(HCVR)或轻链可变区(LCVR)的一个或多个互补决定区(CDR)，所述重链可变区(HCVR)具有与SEQ ID NO:15至少95％同一的氨基酸序列，所述轻链可变区(LCVR)具有与SEQ ID NO:16至少95％同一的氨基酸序列。在一个实例中，所述蛋白包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR-1(HCDR-1)、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HCDR-2、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR-3、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链CDR-1(LCDR-1)和具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LCDR-2。在一些实例中，所述蛋白包含具有与SEQ ID NO:15至少95％同一的氨基酸序列(其中一些与SEQ ID NO:15相同)的HCVR和具有与SEQ ID NO:16至少95％同一的氨基酸序列(其中一些与SEQ ID NO:16相同)的LCVR。

其为抗体的重组的抗原结合蛋白可用作检测分子(DM)。

在一些实施方案中，重组的抗原结合蛋白是ScFv融合蛋白，其在一些实例中包含具有与SEQ ID NO:15至少95％同一(或相同)的氨基酸序列的重链可变结构域、具有与SEQ ID NO:16至少95％同一(或相同)的氨基酸序列的轻链可变结构域和膜锚定结构域。在一个实施方案中，膜锚定结构域来源于Fc受体，例如人FcγR1蛋白的跨膜结构域，如由SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:21所代表的，其不仅包含跨膜结构域，还包含C-末端胞质结构域(SEQ ID NO:18)。在一个具体的实施方案中，ScFv融合蛋白具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列。其为ScFv融合蛋白的重组的抗原结合蛋白可用作CSCP和用作DM。

在另一个方面，本发明提供了编码前述方面的抗原结合蛋白的多核苷酸。在一个实施方案中，例如在其中抗原结合蛋白是抗体的实例中，多核苷酸编码轻链。同样地，多核苷酸可编码重链。在其中抗原结合蛋白是ScFv融合蛋白的实例中，多核苷酸可编码SEQ ID NO:19的ScFv-FcγRTM-cyto融合蛋白。例如，SEQ ID NO:20的多核苷酸编码SEQ ID NO:19。

在另一个方面，本发明提供了包含前述方面的多核苷酸的核酸载体。在一个实施方案中，载体包含多核苷酸，所述多核苷酸编码抗原结合蛋白、有效连接至上游启动子并接在下游多腺苷酸化序列之前。启动子可以是任何启动子，例如CMV启动子。因此在一个实例中，载体可包含SEQ ID NO:25的序列。在一个实施方案中，载体可包含编码可选择标记例如新霉素抗性的核酸序列。在一个实施方案中，载体可包含编码能量转移蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)或其衍生物例如黄色荧光蛋白(YFP)的核酸序列。因此在一个实例中，载体可包含SEQID NO:24的序列。

载体可以是环状的或线性的、附加于宿主细胞基因组或整合至宿主细胞基因组。在一些实施方案中，载体是环状质粒，其在一个具体的实施方案中具有用于ScFv-FcγR-TM-cyto-编码多核苷酸的SEQ IDNO:23的核酸序列，其在另一个具体的实施方案中包含抗体重链编码多核苷酸的核酸序列，并且其在另一个具体的实施方案中包含抗体轻链编码多核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，载体是线性构建体，其可被整合至宿主细胞染色体中。在一个具体的实施方案中，线性构建体具有用于ScFv-FcγR-TM-cyto-编码多核苷酸的SEQ ID NO:22的核酸序列。在另一个具体的实施方案中，线性构建体包含抗体重链编码多核苷酸的核酸序列。在另一个具体的实施方案中，线性构建体包含抗体轻链编码多核苷酸的核酸序列。

宿主细胞可以是任何细胞，原核的或真核的。然而，在一个具体的实施方案中，宿主细胞是CHO细胞，例如CHO-K1细胞。

在另一个方面，本发明提供了表达前述方面的抗原结合蛋白和/或包含前述方面的多核苷酸或核酸载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。在具体的实施方案中，宿主细胞是CHO-K1细胞。在一个实施方案中，宿主细胞用于产生目标蛋白，并且抗原结合蛋白用作根据本申请中公开的方法的细胞表面捕捉蛋白。

在一个方面，本发明提供了可用于产生目标蛋白的宿主细胞。宿主细胞具有前述方面的多核苷酸或核酸载体并且产生前述方面的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白用作细胞表面捕捉蛋白。细胞表面捕捉蛋白结合至宿主细胞内部的目标蛋白，通过细胞的分泌装置进行转运，并被表达在宿主细胞的表面上。因此，在一个实施方案中，宿主细胞包含位于宿主细胞质膜中的细胞表面捕捉蛋白，其中捕捉部分面向细胞外部。在一个实施方案中，细胞表面捕捉分子结合至目标蛋白，其位于质膜上并定向于细胞外部。

在一个实施方案中，宿主细胞产生或能够产生结合目标蛋白的ScFv融合蛋白，所述目标蛋白包含Fc结构域，其在IMGT位置95上包含组氨酸并在IMGT位置96上包含酪氨酸。实例包括IgG1、IgG2和IgG4蛋白。在一个实施方案中，ScFv融合蛋白包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，ScFv融合蛋白包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在具体的实施方案中，宿主细胞包含位于质膜上并且结合至IgG1、IgG2或IgG4或双特异性抗体的细胞表面捕捉蛋白，所述双特异性抗体包含IgG1、IgG2或IgG4的至少一条重链并且可具有第二重链，所述第二重链为另一种类型或包含一种或多种氨基酸置换。

在一个方面，本发明提供了结合经置换的CH3多肽或包含例如SEQ ID NO:42的氨基酸序列(其编码经置换的人Fc(也被称作为Fc*))的任何蛋白的重组的抗原结合蛋白，所述经置换的CH3多肽包含选自下列的一种或多种氨基酸置换：根据IMGT外显子编号系统的(a)95R和(b)95R和96F，或者根据EU编号系统的(a’)435R和(b’)435R和436F。在一些实施方案中，重组的抗原结合蛋白以如在表面等离子体共振测定中测量的低于约60nM的K_D结合多肽。

在一些实施方案中，重组的抗原结合蛋白包含重链可变区(HCVR)或轻链可变区(LCVR)的一个或多个互补决定区(CDR)，所述重链可变区(HCVR)具有与SEQ ID NO:38至少95％同一的氨基酸序列，所述轻链可变区(LCVR)具有与SEQ ID NO:39至少95％同一的氨基酸序列。在一个实例中，所述蛋白包含具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链CDR-1(HCDR-1)、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HCDR-2、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HCDR-3、具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR-1(LCDR-1)和具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的LCDR-2。在一些实例中，所述蛋白包含具有与SEQ ID NO:38至少95％同一的氨基酸序列(其中一些与SEQ ID NO:38相同)的HCVR和具有与SEQ ID NO:39至少95％同一的氨基酸序列(其中一些与SEQ ID NO:39相同)的LCVR。

在一些实施方案中，重组的抗原结合蛋白是抗体，其包含重链和轻链。所述重链可包含与SEQ ID NO:40至少95％同一(或100％同一)的氨基酸序列。所述轻链可包含与SEQ ID NO:41至少95％同一(或100％同一)的氨基酸序列。其为抗体的重组的抗原结合蛋白可用作检测分子(DM)。

在一些实施方案中，重组的抗原结合蛋白是ScFv融合蛋白，其在一些实例中包含具有与SEQ ID NO:38至少95％同一(或相同)的氨基酸序列的重链可变结构域、具有与SEQ ID NO:39至少95％同一(或相同)的氨基酸序列的轻链可变结构域和膜锚定结构域。在一个实施方案中，膜锚定结构域来源于Fc受体，例如人FcγR1蛋白的跨膜结构域，如由SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:21所代表的，其不仅包含跨膜结构域，还包含SEQ ID NO:19的C-末端胞质结构域。在一个具体的实施方案中，ScFv融合蛋白具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列。其为ScFv融合蛋白的重组的抗原结合蛋白可用作CSCP和用作DM。

在另一个方面，本发明提供了编码前述方面的抗原结合蛋白的多核苷酸。在一个实施方案中，例如在其中抗原结合蛋白是抗体的实例中，多核苷酸编码轻链，例如SEQ ID NO:41的轻链。同样地，多核苷酸可编码重链，例如SEQ ID NO:40的重链。在其中抗原结合蛋白是ScFv融合蛋白的实例中，多核苷酸可编码SEQ ID NO:43的ScFv-FcγR-TM-cyto融合蛋白。代表性的示例性多核苷酸包括分别地SEQ ID NO:49、50和51的那些多核苷酸。

在另一个方面，本发明提供了包含前述方面的多核苷酸的核酸载体。在一个实施方案中，载体包含多核苷酸，所述多核苷酸编码抗原结合蛋白、有效连接至上游启动子并接在下游多腺苷酸化序列之前。启动子可以是任何启动子，例如CMV启动子。因此在一个实例中，载体可包含SEQ ID NO:47的序列。在一个实施方案中，载体可包含编码可选择标记例如新霉素抗性的核酸序列。在一个实施方案中，载体可包含编码能量转移蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)或其衍生物例如黄色荧光蛋白(YFP)的核酸序列。因此在一个实例中，载体可包含SEQID NO:46的序列。

载体可以是环状的或线性的、附加于宿主细胞基因组或整合至宿主细胞基因组。在一些实施方案中，载体是环状质粒，其在一个具体的实施方案中具有用于ScFv-FcγR-TM-cyto-编码多核苷酸的SEQ IDNO:44的核酸序列，其在另一个具体的实施方案中具有抗体重链编码多核苷酸的核酸序列，并且其在另一个具体的实施方案中具有抗体轻链编码多核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，载体是线性构建体，其可被整合至宿主细胞染色体中。在一个具体的实施方案中，线性构建体包含用于ScFv-FcγR-TM-cyto-编码多核苷酸的SEQ ID NO:51的核酸序列。在另一个具体的实施方案中，线性构建体包含用于抗体重链编码多核苷酸的SEQ ID NO:50的核酸序列。在另一个具体的实施方案中，线性构建体包含用于抗体轻链编码多核苷酸的SEQ ID NO:49的核酸序列。

在一个实施方案中，宿主细胞产生或能够产生结合目标蛋白的ScFv融合蛋白，所述目标蛋白包含Fc结构域，其在IMGT位置95上包含精氨酸并在IMGT位置96上包含苯丙氨酸(Fc*)。实例包括IgG3和IgG1、IgG2和IgG4蛋白的经置换的CH3区。在一个实施方案中，ScFv融合蛋白包含SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，ScFv融合蛋白包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列。在具体的实施方案中，宿主细胞包含位于质膜上并且结合至IgG3或经置换的IgG1、IgG2或IgG4(其在IMGT位置95上包含精氨酸并在IMGT位置96上包含苯丙氨酸(“Fc*”))或双特异性抗体的细胞表面捕捉蛋白，所述双特异性抗体包含Fc*类型的至少一条重链和另一条IgG1、IgG2或IgG4野生型的重链。

在另一个方面，本发明提供了检测、分离或富集稳定表达目标蛋白(POI)的细胞的方法。所述方法包括在宿主细胞中表达细胞表面捕捉蛋白(CSCP)和POI的步骤。根据此方法，CSCP结合至POI上的“第一位点”以在宿主细胞内部形成CSCP-POI复合物。此CSCP-POI复合物随后通过宿主细胞的分泌系统进行转运并从细胞分泌。由于CSCP包含膜结合结构域(例如SEQ ID NO:17)，所述CSCP-POI复合物被呈现在宿主细胞的表面上，其中POI被暴露在细胞外部。根据所述方法，宿主细胞随后与检测分子(DM)进行接触，所述DM结合至POI上的“第二位点”。将结合DM的那些细胞选择用于鉴定、分离、合并和/或富集。在一个实施方案中，通过荧光激活细胞分选来选择DM结合的宿主细胞。

在一个实施方案中，所述方法还包括在选择宿主细胞之前使细胞与封闭分子接触的步骤。所述封闭分子结合未与POI结合的任何CSCP。所述封闭分子不结合CSCP-POI复合物。

在一些实施方案中，POI包含多个亚基，例如包含两条重链和两条轻链的抗体。在该实例中，POI上的第一位点可存在于第一亚基上，并且POI上的第二位点可存在于第二亚基上。在一些实施方案中，POI包含多个亚基，例如异二聚体蛋白。在异二聚体蛋白的实例中，POI上的第一位点可存在于第一亚基上，例如第一受体，并且POI上的第二位点可存在于第二亚基上，例如第二受体或共同受体。在一些实施方案中，异二聚体蛋白是相互作用以形成异二聚体的不同受体。当POI是抗体时，POI上的第一位点可存在于第一重链上，并且POI上的第二位点可存在于第二重链上。在一些实施方案中，抗体包含在至少一个氨基酸上不同的亚基，例如抗体具有至少一条具有野生型CH3结构域的重链并且另一条重链在CH3结构域中具有至少一个氨基酸置换。在此实例中，CSCP可以是如本文中描述的抗原结合蛋白，例如抗原或抗-Ig ScFv融合蛋白。在此处，检测分子(DM)可包含被标记的如本文中描述的抗原结合蛋白，例如被标记的抗原或抗-Ig抗体或ScFv分子。

在一些实例中，例如当POI是双特异性抗体时，第一位点可存在于具有这样的CH3结构域的重链上，所述CH3结构域在根据IMGT外显子编号系统的位置95上包含组氨酸残基并且在根据IMGT外显子编号系统的位置96上包含酪氨酸残基(Fc)。而且，第二位点可存在于具有这样的CH3结构域的重链上，所述CH3结构域在根据IMGT外显子编号系统的位置95上包含精氨酸残基并且在根据IMGT外显子编号系统的位置96上包含苯丙氨酸残基(Fc*)。在此实例中，CSCP可以是在前述方面中描述的抗原结合蛋白，例如包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的氨基酸序列的ScFv融合蛋白；其在具体的实施方案中包含SEQ IDNO:19。同样地在此处，检测分子(DM)可包含被标记的在前述方面中描述的重组的抗原结合蛋白，例如包含SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ IDNO:37的氨基酸序列的抗体或ScFv分子；其在具体的实施方案中包含SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41(抗-Fc*抗体)，或SEQ IDNO:43(ScFv*)。在此处，封闭分子可以是Fc多肽(例如单链)，例如hFc，或可结合至CSCP而不同时结合DM的任何分子。在一个实施方案中，检测分子可以是被标记的抗-人IgG F(ab’)₂。

在其中POI是双特异性抗体的其它实例中，第一位点可存在于具有这样的CH3结构域的重链上，所述CH3结构域在根据IMGT外显子编号系统的位置95上包含精氨酸残基并且在根据IMGT外显子编号系统的位置96上包含苯丙氨酸残基(Fc*)。而且，第二位点可存在于具有这样的CH3结构域的重链上，所述CH3结构域在根据IMGT外显子编号系统的位置95上包含组氨酸残基并且在根据IMGT外显子编号系统的位置96上包含酪氨酸残基(Fc*)。在此实例中，CSCP可以是在前述方面中描述的抗原结合蛋白，例如包含SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37的氨基酸序列的ScFv融合蛋白；其在具体的实施方案中包含SEQ ID NO:43。同样地在此处，检测分子(DM)可包含被标记的在前述方面中描述的重组的抗原结合蛋白，例如包含SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:31的氨基酸序列的抗体或ScFv分子；其在具体的实施方案中包含重链和轻链(抗-hFc抗体)，或SEQ ID NO:19(ScFv)。在此处，封闭分子可以是Fc*多肽(例如单链)，或可结合至CSCP而不同时结合DM的任何分子。在一个实施方案中，检测分子可以是被标记的抗-人IgG F(ab’)₂。

在一些方面，本发明提供了检测或分离稳定表达异二聚体蛋白的细胞的方法，其包括下列步骤：(a)在宿主细胞中表达细胞表面捕捉蛋白(CSCP)和异二聚体蛋白，其中(i)所述CSCP结合至所述异二聚体蛋白上的第一位点以在所述宿主细胞内部形成CSCP-异二聚体蛋白复合物，(ii)所述CSCP-异二聚体蛋白复合物通过所述宿主细胞进行转运，和(iii)随后呈现在所述宿主细胞的表面上；(b)将所述宿主细胞与检测分子接触，其中所述检测分子结合至所述异二聚体蛋白上的第二位点；和(c)选择结合所述检测分子的宿主细胞。在一些实施方案中，异二聚体蛋白包含多个亚基并且异二聚体蛋白上的第一位点存在于第一亚基上，异二聚体蛋白上的第二位点存在于第二亚基上。在一些实施方案中，细胞表面捕捉分子包括能够结合第一亚基而不能结合第二亚基的抗原、蛋白A或ScFv。

在一个方面，本发明提供了产生双特异性抗体的方法，其包括在宿主细胞中表达细胞表面捕捉蛋白(“CSCP”)、抗体轻链、第一抗体重链和第二抗体重链的步骤，所述第一抗体重链包含在IMGT位置95上具有组氨酸并在IMGT位置96上具有酪氨酸的CH3结构域，所述第二抗体重链包含在IMGT位置95上具有精氨酸并在IMGT位置96上具有苯丙氨酸的CH3结构域。当在宿主细胞内部时，CSCP结合至第一抗体重链但不结合至第二抗体重链，所述第二抗体重链结合至第一抗体重链，并且所述轻链结合至重链，从而形成CSCP-抗体三元复合物。此三元复合物被分泌和呈递在宿主细胞的表面上。可以将宿主细胞与封闭分子接触，所述封闭分子结合至细胞表面上的CSCP，但仅在其中CSCP未结合至目标抗体(即“空的”CSCP)的那些情形中进行结合。随后使宿主细胞与DM接触，所述DM结合或能够结合第二抗体重链。鉴定、选择和/或合并结合DM的宿主细胞。在一些实施方案中，选择、合并、培养和扩增结合DM的宿主细胞，并随后使其经历另一轮的表达、检测、选择、合并和扩增。可将此过程反复进行多次以富集高滴度的双特异性抗体的产生。

在一个实施方案中，所述方法中使用的CSCP是包含SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:31的氨基酸序列的ScFv融合蛋白。在一个实施方案中，CSCP包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述方法中使用的DM是包含SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37的氨基酸序列的蛋白。在一个实施方案中，DM是包含SEQ ID NO:40的重链序列和SEQID NO:41的轻链序列的抗体。在另一个实施方案中，DM是包含SEQID NO:43的氨基酸序列的ScFv融合蛋白。可将标记例如荧光部分如FITC或Alexa488连接至DM。可将荧光激活细胞分选用作检测和选择手段。

在备选的实施方案中，产生双特异性抗体的方法包括在宿主细胞中表达细胞表面捕捉蛋白(“CSCP”)、抗体轻链、第一抗体重链和第二抗体重链的步骤，所述第一抗体重链包含在IMGT位置95上具有精氨酸并在IMGT位置96上具有苯丙氨酸的CH3结构域(Fc*)，所述第二抗体重链包含在IMGT位置95上具有组氨酸并在IMGT位置96上具有酪氨酸的CH3结构域。当在宿主细胞内部时，CSCP结合至第一抗体重链但不结合至第二抗体重链，所述第二抗体重链结合至第一抗体重链，并且所述轻链结合至重链，从而形成CSCP-抗体三元复合物。此三元复合物被分泌和呈递在宿主细胞的表面上。可以将宿主细胞与封闭分子接触，所述封闭分子结合至细胞表面上的CSCP，但仅在其中CSCP未结合至目标抗体(即“空的”CSCP)的那些情形中进行结合。随后使宿主细胞与DM接触，所述DM结合或能够结合第二抗体重链。鉴定、选择和/或合并结合DM的宿主细胞。在一些实施方案中，选择、合并、培养和扩增结合DM的宿主细胞，并随后使其经历另一轮的表达、检测、选择、合并和扩增。可将此过程反复进行多次以富集高滴度的双特异性抗体的产生。

在此备选实施方案的一个实施方案中，所述方法中使用的CSCP是包含SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37的氨基酸序列的ScFv融合蛋白。在一个实施方案中，CSCP包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述方法中使用的DM是包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的氨基酸序列的蛋白。在一个实施方案中，DM是包含重链序列和轻链序列的抗体。在另一个实施方案中，DM是包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的ScFv融合蛋白。可将标记例如荧光部分如FITC或Alexa488连接至DM。可将荧光激活细胞分选用作检测和选择手段。

在第一实施方案和备选实施方案两者中，作为反复选择、合并和扩增的产物的宿主细胞能够产生或确实产生滴度为至少2g/L的双特异性抗体，其中双特异性抗体种类(Fc/Fc*)代表由宿主细胞产生的总的抗体(Fc/Fc+Fc*/Fc*+Fc/Fc*)的至少40％(按质量)。

其它目的和优势将根据下文的详述而变得明显。

详述

在描述本方法之前，应理解本发明不限制于具体的方法和所描述的实验条件，因为这样的方法和条件可发生变化。还应理解本文中使用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，并不意欲是限制性的，因为本发明的范围将仅受到所附权利要求的限制。

如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数的使用，除非上下文清楚地另外指明。因此，例如，“一个/一种方法”的使用包括一个或多个/一种或多种方法，和/或本文中描述的和/或在阅读本公开内容后将对于本领域技术人员而言变得明显的类型的步骤等等。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域中的普通技术人员所通常理解的相同意义。尽管可将相似于或等同于本文中描述的材料和方法的任何材料和方法用于本发明的实践或测试，但现描述优选的方法和材料。本文中提及的所有出版物均通过引用以其整体并入本文。

一般性描述

本发明的方法提供了相对于现有的用于分离和鉴定蛋白质分泌细胞的方法的实质性优势。例如，可基于期望的特异性、亲和力或同种型快速和方便地分离分泌抗体的细胞。此外，可直接定量产生的分泌蛋白的量，这不同于本领域中的许多方法，其中分泌蛋白的产生被间接地定量。

最近，已开发了两种另外的利用流式细胞术的方法来用于稳定高表达细胞系的高通量分离。第一种方法涉及修饰表达质粒以包含GOImRNA的转录读出。这最经常地通过在GOI的终止密码子和末端polyA部位之间插入内部核糖体进入位点(IRES)和基因(其蛋白产物通过流式细胞术来容易地监测，最常用的是绿色荧光蛋白(GFP))来实现(Meng et al.(2000)Gene 242:201)。IRES的存在允许POI和GFP从相同的mRNA进行翻译。因此，GFP基因的表达水平间接地相关于GOI的mRNA水平。以高水平积累GFP的克隆通过流式细胞术进行分离并随后针对POI产生进行筛选。由于此方法依赖于通过在重组构建中使用IRES来将GOI表达偶联至报告基因，因此其不可应用于杂交瘤的分离。

流式细胞术在表达克隆的分离中的使用允许以高通量形式快速分析大量的克隆。此外，流式细胞术的使用显著减少了细胞的直接处理。不幸的是，GFP产生的水平不是POI产生水平的直接测量。多种机制可将分泌的POI的产生与GFP的积累解偶联。POI和GFP报告因子的产生的差异可因这两种基因的翻译效率、POI的分泌效率或多顺反子mRNA的稳定性中的差异而引起。

另一种使用流式细胞术来分离表达克隆的方法涉及将细胞封装至琼脂糖微滴中(Weaver et al.(1990)Methods Enzymol.2:234)。在此方法中，特异于POI的生物素化抗体通过抗生蛋白链菌素结合至生物素化的琼脂糖以使得分泌的POI被捕捉并保持在微滴内(Gray et al.,(1995)J.Immunol.Methods 182:155)。被捕获的POI通过免疫染色利用特异于POI的抗体进行检测。为了减少封装琼脂糖吸收从邻近细胞分泌的POI，将细胞置于低渗透性培养基中。在包埋琼脂糖中具有最高的POI抗体染色的那些细胞被通过流式细胞术鉴定和分离。凝胶微滴法针对细胞分泌POI的能力来直接筛选细胞，而不是间接地筛选GOI mRNA的表达，但此法需要用于捕获和染色所分泌的POI的适当抗体的可用性，并且该程序需要特殊的设备来产生琼脂糖凝胶微滴。此外，一些细胞可对于封装过程是敏感的。

此方法的一种变型通过将特异于POI的抗体直接结合至细胞表面而绕开了将细胞包埋至基质中的需要(Manz et al.(1995)PNAS92:1921-1925)。在此方法中，用生物素-羟基丁二酰亚胺酯来非特异性生物素化细胞表面蛋白，随后使其与能够结合POI的抗生蛋白链菌素-缀合的抗体进行接触。分泌POI的细胞被POI点缀上，随后利用适当标记的第二抗体进行检测。然而，POI在相邻细胞之间的扩散是成问题的，并且此方法还需要高黏度培养基来减少POI离开表达细胞的扩散。由于这些高黏度培养基是区分细胞所需要的，因此细胞必须被洗涤并置于适合用于细胞分选(如果需要的话)的培养基中。

与鉴定和分离高表达重组细胞系相关的问题尤其适用于表达目标蛋白的杂交瘤的分离。然而，有用的杂交瘤的鉴定包括几个另外的问题；它们必须首先进行抗原结合活性的筛选，随后进行免疫球蛋白同种型的筛选。此外，基于GFP的方法不适用于杂交瘤的鉴定和分离，因为杂交瘤的构建不包括使得抗体基因的表达可被连接于转录报告因子例如GFP的重组构建体。杂交瘤筛选是缓慢的、费力的尝试，其中所筛选的克隆的数量受到现有技术的限制。

本发明描述了新型的且目前未知的鉴定和分离产生分泌蛋白的细胞的方法。本发明基于表达定位于细胞表面的结合POI的分子的细胞系的产生。呈现于细胞表面的POI随后可通过用各种检测分子标记来进行检测。在特定条件下呈现于细胞表面上的POI的量是分泌的POI的总量的直接测量。随后可将POI产生者与非产生者分离开来，并可辨别产生水平或POI特征。本发明的优势在于其直接定量分泌的POI而非间接测量mRNA。

本发明涉及构建或使用表达细胞表面捕捉分子的细胞，所述细胞表面捕捉分子结合产生POI的相同细胞中的各种被分泌的POI。随着细胞分泌POI，这些细胞表面捕捉分子结合其，或者POI和细胞表面捕捉分子的复合物可在细胞内形成并随后被分泌。结合可以以自分泌的方式发生或者在被分泌的时候发生。产生分泌的POI的细胞随后可被鉴定和分离。这样的鉴定和分离可基于POI的特性、POI的产生或其缺乏，或通过指定水平的产生来进行。细胞表面捕捉分子和/或POI可由细胞在其天然状态下产生，或者细胞表面捕捉分子和/或POI可重组地产生。通过构建或使用这样的细胞，任何分泌的蛋白可被细胞表面捕捉分子捕捉，前提是这两者之间存在相应的亲和力。如将进一步解释的，任何分子可被操作以使得其可用作为细胞表面捕捉分子。因此，本发明可用于分离分泌蛋白的任何细胞。

几乎任何蛋白具有用作如本发明描述的细胞表面捕捉分子的能力。所必需的是期望的蛋白被锚定至细胞膜并暴露于细胞外空间的能力。如果期望的细胞具有信号序列，那么仅需要将膜锚定物(包括但不限于跨膜锚定物或GPI连接信号)添加至细胞表面捕捉分子以使得其保持锚定在细胞膜中并暴露于细胞外部。此外，如果期望的蛋白缺乏信号序列，那么可将信号序列添加至期望蛋白的氨基末端，以使得其被转运至细胞表面。信号序列和膜锚定物可以是对细胞为天然的、重组的或合成的。

细胞通常内源地或在引入重组DNA之后分泌广泛多样的蛋白质。根据本发明的方法，任何分泌的蛋白可被鉴定并且产生其的细胞可被分离。这样的分泌的蛋白包括但不限于，生长因子、生长因子受体、配体、可溶性受体组分、抗体、双特异性抗体、重组的Trap分子、含Fc的融合蛋白、sTCR、TCR-Fc和肽激素。这样的分泌的蛋白可以是或可以不是重组的。即是说，一些目标蛋白从期望的细胞的分泌可不需要引入额外的核苷酸序列。例如，抗体从B-细胞或浆细胞的分泌不是重组核苷酸序列至B-细胞或浆细胞中的引入的结果。重组的分泌蛋白可通过本领域技术人员公知的标准分子生物学技术来产生(参见例如,Sambrook,J.,E.F.Fritsch And T.Maniatis.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Vols 1,2,and 3,1989；CurrentProtocols in Molecular Biology,Eds.Ausubel et al.,GreenePubl.Assoc.,Wiley Interscience,NY)。这些分泌的蛋白可用于许多商业和研究目的。本发明包括通过本发明的方法学产生这样的分泌的蛋白。利用所呈现的POI检测细胞可通过使用能够直接或间接结合所呈现的POI的任何分子来完成。这样的检测分子可促进呈现POI的细胞的检测和/或分离。

本发明适用于除其它以外：a)通过使用配体特异性受体作为细胞表面捕捉分子来分离配体产生细胞，b)通过使用表面结合的受体特异性配体作为细胞表面捕捉分子来分离可溶性受体产生细胞，c)通过使用抗体结合蛋白作为细胞表面捕捉分子来分离抗体产生细胞，d)通过使用s-TCR-结合蛋白(例如，以及被TCR识别的抗原)作为细胞表面捕捉分子来分离sTCR，e)通过使用Fc结合蛋白作为细胞表面捕捉分子来分离TCR-Fc，或f)通过使用包含融合至FcγR跨膜和胞质结构域的ScFv结构域的融合蛋白捕捉分子来分离在其CH3结构域的一个中具有废除蛋白A结合的突变的双特异性抗体。

按照本发明的方法学，首先用包含编码能够结合分泌的POI的细胞表面捕捉分子的核苷酸序列的载体在其中这样的细胞表面捕捉分子被表达的条件下转染细胞。随后检测和分离作为这样的细胞表面捕捉分子的适当产生者的转染细胞，并培养这样的细胞。这些细胞可天然地产生POI，或者POI可被重组地产生。如果细胞天然地产生POI，则它们已准备好用于检测和分离。如果POI将被重组地产生，那么用编码分泌的POI的第二核苷酸序列在其中分泌的POI被表达的条件下转染被分离和培养的表达指定的细胞表面捕捉分子的细胞。在表达后，分泌的POI结合至细胞表面捕捉分子并将呈现结合的POI的细胞进行检测和分离。

如果POI被细胞天然地产生，那么细胞浆不用编码POI的核苷酸序列进行转染。因此，本发明的此方面适用于任何和所有的产生POI的细胞。此外，如果细胞表面捕捉分子被细胞天然地产生，那么细胞不需要用编码细胞表面捕捉分子的核苷酸序列进行转染。因此，本发明的此方面适用于任何和所有的产生细胞表面捕捉分子的细胞。

可转染广泛多样的宿主细胞。这样的细胞可具有真核生物或原核生物来源。细胞通常将是永生化的真核生物细胞，特别是哺乳动物细胞，例如猴肾细胞(COS)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、Hela细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、人胚肾细胞(HEK293)、白细胞、骨髓瘤、用腺病毒基因例如AD5E1转染的细胞系，包括但不限于用腺病毒基因转染的永生化的人视网膜细胞，例如PER.C6^TM细胞，和胚胎干细胞。细胞还可以是非哺乳动物细胞包括细菌、真菌、酵母和昆虫细胞，包括但不限于例如，大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilus)、曲霉属(Aspergillus)种、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。可在适当的条件下于培养盘介质中或在协同作用宿主中生长所有细胞。最期望的细胞将是能够培养的哺乳动物细胞。

结合至细胞表面捕捉分子的分泌的POI可通过本领域已知的多种技术来检测和分离。呈现分泌的POI的培养细胞可与能够直接或间接结合分泌的POI的分子进行接触，其中这样的检测分子可包含检测标记，例如生色的、发荧光的、有色的、荧光的或磁性的标记。可使用多种方法检测结合至检测分子的标记和分离细胞。最优选地，将利用流式细胞术在细胞群内检测标记和分离细胞。可选择地，检测分子可用于直接分离呈现POI的细胞。这可通过将检测分子缀合至培养板、顺磁分子或任何其它颗粒或固体支持物来完成。此外，可通过检测分子或POI的性质来直接检测所呈现的POI。

在一个实施方案中，两种彼此结合并被不同标记的检测分子被用来检测所呈现的阻断该相互作用的分泌的POI。如果细胞呈现结合第一检测分子并阻断第一和第二检测分子之间的相互作用的分泌的POI，那么细胞可基于仅第一检测分子在其表面上的存在来进行分离。在另一方面，如果细胞呈现结合第一检测分子并不阻断第一和第二检测分子之间的相互作用的分泌的POI，那么细胞可基于两种检测分子在其表面上的存在来进行分离。例如，可鉴定表达特异性阻断或不阻断受体-配体复合物的形成的抗体的抗体产生细胞。如果检测分子是被不同地标记的受体及其配体，那么表达阻断受体-配体复合物的形成的抗体的抗体产生细胞可通过一种标记在其表面上的存在来进行检测，而表达不阻断受体-配体复合物的形成的抗体的抗体产生细胞可通过两种标记在其表面上的存在来进行检测。

在任何实施方案中以及关于分离表达细胞与非表达细胞或较少表达细胞，当POI是分泌的蛋白时，一个主要的困难是POI在相邻细胞之间的扩散。因此，关键的是任何被设计来捕捉细胞表面上的分泌的POI的系统必须阻止POI从表达细胞至相邻细胞的扩散和其至该细胞的附着。如果允许扩散发生，并且相邻细胞被分泌的POI点缀上，那么基于POI点缀程度的细胞分离将不能区分高表达细胞与具有低表达水平的细胞，并且可不能有效分离表达细胞与非表达细胞。

因此本发明的一个实施方案是阻断分泌的POI在相邻细胞之间的扩散。这可通过添加封闭分子来完成，所述封闭分子结合细胞表面捕捉分子或POI并且阻止分泌的POI与细胞表面捕捉分子的结合。在此方面，检测分子不结合封闭分子。例如，如果细胞表面受体是hFcγRI并且分泌的POI具有人IgG Fc片段，那么分泌的POI在相邻细胞之间的扩散可通过将外源大鼠IgG添加至培养基来进行阻断。呈现分泌的POI并且未结合大鼠IgG的细胞的检测可通过使用特异于人IgG Fc并不识别大鼠IgG的抗体来实现。在另一个实施方案中，分泌的POI在相邻细胞之间的结合通过增加培养基的黏度来减少。

在本发明的一个实施方案中，不使分泌的POI在培养基中积累。这可通过调节分泌的POI和/或细胞表面捕捉分子的表达以使得POI的瞬时表达导致足够的POI来结合细胞表面捕捉分子而不足够的用于扩散的量来完成。在另一个实施方案中，可将细胞从包含积累的POI的培养基移出，剥离结合至细胞的POI，并允许POI表达持续有限的时期以使得分泌的POI不在培养基中积累。可通过本领域中已知的方法例如用低pH缓冲液洗涤细胞来剥去蛋白。

根据本发明，细胞群中结合最多检测分子的那些细胞也表达最多的分泌的POI。事实上，个体细胞分泌的POI越多，越多的POI被呈现在细胞表面上。该细胞中呈现在表面的POI的量与POI的表达水平之间的此相关性允许从细胞群中快速鉴定具有期望的相对表达水平的细胞。

在一个实施方案中，可将DNA文库用于表达可通过细胞表面捕捉分子而被呈现在细胞表面上的分泌的蛋白。例如，还可从来自分离自经免疫的动物的B-细胞的抗体可变结构域的编码区产生DNA的文库。随后DNA文库可在表达特异于抗体的细胞表面捕捉分子的细胞中表达以使得具有期望的特异性、同种型或亲和力的克隆可通过本发明的方法进行鉴定和分离。在另一个实施方案中，可从来自T-细胞的并且融合至例如能够结合Fc-结合蛋白的Fc的T细胞受体可变结构域的编码区产生DNA的文库。随后DNA文库可在表达Fc-结合蛋白的细胞中表达以使得具有期望的特异性、同种型或亲和力的克隆可如本文中所描述的进行鉴定和分离。

在另一个实施方案中，可产生在一个或多个细胞类型中表达特定细胞表面捕捉分子的转基因哺乳动物。随后可针对POI的产生直接筛选来自这样的转基因哺乳动物的细胞。例如，可期望在浆细胞中表达特异于抗体的细胞表面捕捉分子。因此，可收获来自经免疫的小鼠的浆细胞，并通过本发明的方法分离产生特异于期望的抗原的抗体的那些细胞。

在本发明的其它实施方案中，通过使用表达人FcγR1受体(FcγRI)(其结合作为POI的特定抗体或TCR-Fc)的CHO细胞系来测量抗体产生。

在本发明的另一个方面，目标蛋白包含一个或多个T细胞受体可变结构域或可溶性T细胞受体。所述一个或多个T细胞受体可变结构域可共价连接至可结合细胞表面捕捉蛋白的部分。在具体的实施方案中，所述一个或多个T细胞受体可变结构域融合至Fc序列，例如人Fc序列，并且细胞表面捕捉蛋白是Fc受体，例如FcγR。

TCR可变结构域的一般性结构是已知的(参见例如,Lefranc andLefranc(2001)The T Cell Receptor FactsBook,Academic Press,其通过引用并入本文；参见例如,pp.17-20；还参见,Lefranc et al.(2003)IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptorvariable domains and Ig superfamily V-like domains,Developmentaland Comparative Immunology 27:55-77,和Lefranc et al.(2005)IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptorconstant domains and Ig superfamily C-like domains,Developmentaland Comparative Immunology 29:185-203,将其各自通过引用并入本文)。在一个实施方案中，TCR-Fc的TCR可变结构域包含具有104-125个氨基酸的可变结构域的N-末端区。在另一个实施方案中，TCR-Fc还包含含有91-129个氨基酸的TCR恒定区。在另一个实施方案中，TCR-Fc还包含含有21-62个氨基酸的连接肽。

在一个实施方案中，Fc序列直接地或通过接头融合至TCR可变结构域。在另一个实施方案中，TCR-Fc包含TCR可变区和TCR恒定区，并且Fc序列直接地或通过接头融合至TCR恒定区。在另一个实施方案中，TCR-Fc包含TCR可变区、TCR恒定区和连接肽，并且Fc序列直接地或通过接头融合至连接肽。

可选择包含一个或多个T细胞受体可变区的sTCR、TCR-Fc或融合蛋白以特异性结合目标抗原，例如由肿瘤细胞产生的物质，例如能够在宿主中产生免疫应答的肿瘤细胞物质。在具体的实施方案中，抗原是存在于肿瘤细胞表面上的(即肿瘤抗原)、被T细胞识别的并且在宿主中产生免疫应答的抗原。肿瘤抗原包括例如，α-胎甲球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶(例如对于恶性黑色素瘤)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)和其它蛋白例如ras、p53等的突变的或异常的形式。

在一个实施方案中，POI是TCR-Fc，并且TCR-Fc包含融合至Fc序列的TCR α链可变区和融合至Fc序列的TCR β链(各自直接地或通过接头进行融合)，其中TCR α链-Fc融合体和TCR β链-Fc融合体缔合以形成αβ TCR-Fc。在具体的实施方案中，αβ TCR-Fc包含下列两种多肽：(1)融合至与Fc序列融合的TCR α链恒定区的TCRα链可变区，和(2)融合至与Fc序列融合的TCR β链恒定区的TCR β链可变区。

在另一个实施方案中，POI是具有TCR α可变区和TCR β可变区和任选地TCR α恒定区和/或TCR β恒定区的TCR-Fc。在具体的实施方案中，TCR-Fc由如下核酸编码，所述核酸包含(5’至3’)：TCR α可变区序列，任选地之后是TCR α恒定区序列，TCR β可变区序列，任选地之后是TCR β恒定区序列，任选地接头，随后是Fc序列。在具体的实施方案中，TCR-Fc由如下核酸编码，所述核酸包含(5’至3’)：TCR β可变区序列，任选地之后是TCR β恒定区序列，TCR α可变区序列，任选地之后是TCR α恒定区序列，任选地接头，随后是Fc序列。在多个实施方案中，编码TCR-Fc的构建体之前是信号序列，例如分泌信号序列，以使得其是可分泌的。

在另一个实施方案中，POI是TCR-Fc，并且TCR-Fc包含这样的TCR-Fc，其包含融合至Fc序列的TCR γ链和融合至Fc序列的TCRδ链可变区以形成γδ TCR-Fc。在具体的实施方案中，γδ TCR-Fc包含下列两种多肽：(1)融合至与Fc序列融合的TCR γ链恒定区的TCRγ链可变区，和(2)融合至与Fc序列融合的TCR δ链恒定区的TCR δ链可变区。

T细胞受体可变区可通过本领域中已知的任何方法来进行鉴定和/或克隆。目标蛋白的T细胞受体可变区可通过例如在细胞中表达例如融合至人Fc序列的重排的T细胞受体可变区DNA来获得。特异于特定抗原的重排的T细胞受体可变区可通过本领域中已知的任何适当的方法(参见下文的参考资料)来获得，例如通过将小鼠暴露于抗原并分离小鼠的T细胞，产生小鼠的T细胞的杂交瘤，和用目标抗原筛选杂交瘤以获得目标杂交瘤。特异于目标抗原的重排的T细胞受体可变区可从目标杂交瘤克隆。特异于抗原的T细胞受体可变区还可通过使用噬菌体展示技术(例如如下文的参考资料中所提供的)来鉴定。随后可将可变区克隆并融合至例如人Fc以产生可结合至为FcγR的细胞表面捕捉分子的目标蛋白。

用于鉴定和/或克隆T细胞受体可变区的方法描述于例如美国专利No.5,635,354(引物和克隆方法)；Genevée et al.(1992)Anexperimentally validated panel of subfamily-specific oligonucleotideprimers(Vα1-w29/Vβ1-w24)for the study of human T cell receptorvariable V gene segment usage by polymerase chain reaction,Eur.J.Immunol.22:1261-1269(引物和克隆方法)；Gorski et al.(1994)Circulating T Cell Repertoire Complexity in Normal Individuals andBone Marrow Recipients Analyzed by CDR3 Size Spectratyping,J.Immunol.152:5109-5119(引物和克隆方法)；Johnston,S.et al.(1995)A novel method for sequencing members of multi-gene families,Nucleic Acids Res.23/15:3074-3075(引物和克隆方法)；Pannetier etal.(1995)T-cell repertoire diversity and clonal expansions in normaland clinical samples,Immunology Today 16/4:176-181(克隆方法)；Hinz,T.and Kabelitz,D.(2000)Identification of the T-cell receptoralpha variable(TRAV)gene(s)in T-cell malignancies,J.Immunol.Methods 246:145-148(克隆方法)；van Dongen et al.(2002)Design and standardization of PCR primers and protocols fordetection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor generecombinations in suspect lymphoproliferations:US PatentNo.6,623,957(克隆方法和引物)；Report of the BIOMED-2 ConcertedAction BMH4-CT98-3936,Leukemia 17:2257-2317(引物和克隆方法)；Hodges et al.(2002)Diagnostic role of tests for T cell receptor(TCR)genes,J.Clin.Pathol.56:1-11(克隆方法)；Moysey,R.et al.(2004)Amplification and one-step expression cloning of human T cellreceptor genes,Anal.Biochem.326:284-286(克隆方法)；Fernandes etal.(2005)Simplified Fluorescent Multiplex PCR Method forEvaluation of the T-Cell Receptor Vβ-Chain Repertoire,Clin.Diag.Lab.Immunol.12/4:477-483(引物和克隆方法)；Li,Y.etal.(2005)Directed evolution of human T-cell receptors with picomolaraffinities by phage display,Nature Biotech.23/3:349-354(引物和克隆方法)；Wlodarski et al.(2005)Pathologic clonal cytotoxic T-cellresponses:nonrandom nature of the T-cell receptor restriction inlarge granular lymphocyte leukemia,Blood 106/8:2769-2780(克隆方法)；Wlodarski et al.(2006)Molecular strategies for detection andquantitation of clonal cytotoxic T-cell responses in aplastic anemiaand myelodysplastic syndrome,Blood 108/8:2632-2641(引物和克隆方法)；Boria et al.(2008)Primer sets for cloning the human repertoire ofT cell Receptor Variable regions,BMC Immunology 9:50(引物和克隆方法)；Richman,S.and Kranz,D.(2007)Display,engineering,andapplications of antigen-specific T cell receptors,BiomolecularEngineering 24:361-373(克隆方法)中。sTCR的实例提供于例如美国专利No.6,080,840和7,329,731；以及Laugel,B et al.(2005)Design ofSoluble Recombinant T Cell Receptors for Antigen Targeting and TCell Inhibition,J.Biol.Chem.280:1882-1892中；将其通过引用并入本文。Fc序列公开于本文中；Fc序列的实例以及其在融合蛋白中的使用提供于例如Stahl等人的美国专利No.6,927,044中。所有前述参考资料均通过引用并入本文。

在本发明的其它实施方案中，细胞表面捕捉分子被设计来连接和呈现那些通常不能够以足够的亲和力结合或以低亲和力结合FcγR捕捉分子的目标蛋白。那些目标蛋白包括IgG4和IgG2分子。因此，基于融合至FcγR跨膜和胞质结构域的ScFv结构域设计和建立的模块化捕捉分子。ScFv结构域来源于高亲和力抗-人Fc抗体，并且包含融合至轻链可变结构域的重链可变结构域。FcγR-TM-胞质结构域被用来使得能够在质膜中进行适当的插入和取向。ScFv-FcγR-TM-cyto融合蛋白能够结合IgG4和其它含Fc的分子，和IgG2和IgG1亚型，以及那些包含至少一个野生型CH3结构域的异二聚体(例如双特异性抗体)，其中其它的CH3结构域可包含Fc*-型置换。

在本发明的其它实施方案中，细胞表面捕捉分子被设计来连接和呈现那些包含经修饰的CH3结构域的目标蛋白，例如Fc*多肽，其包含H95R和Y96F氨基酸置换(编号是根据IMGT系统的)，例如SEQID NO:42。那些目标蛋白包括双特异性抗体，例如可用于产生双特异性抗体的抗体异四聚体一般描述于2010年12月30日公开的美国专利申请公开No.US 2010/0331527 A1中，其通过引用以其整体并入本文。因此，基于融合至FcγR跨膜和胞质结构域的ScFv*结构域设计和建立的模块化捕捉分子。ScFv*结构域来源于高亲和力抗-Fc*抗体，并且包含融合至轻链可变结构域的重链可变结构域。FcγR-TM-胞质结构域被用来使得能够在质膜中进行适当的插入和取向。ScFv*-FcγR-TM-cyto融合蛋白结合任何含Fc*的分子，例如野生型IgG3，和IgG4、IgG2和IgG1的异二聚体，其包含至少一个Fc*多肽序列。

实施例

下列实施例被示出以给本领域技术人员提供如何产生和使用本发明的方法和组合物的完整公开内容和描述，并且其不意欲限制本发明人认为是其发明的内容的范围。已尽量确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的精确性，但应当将一些实验误差和偏差考虑在内。除非另有指明，否则几分之一是按重量计的几分之一，分子量是平均分子量，温度是摄氏度数，以及压强是或接近于大气压。

实施例1

pTE084的构建。通过将来自pCAE100的1436bp的Xba I片段(编码人FcγRI(hFcγRI；GenBank登录号M21091))连接至pRG821的Xba I位点来构建pTE084。通过限制性酶切作图利用Not I、Pst I、Eco RI和Stu I来检查由连接产生的期望质粒中hFcγRI的取向。pTE084被设计来用于hFcγRI(人IgG的Fc结构域的高亲和力细胞表面受体)的高水平表达。其包含两个独立的表达盒。一个盒是由CMV-MIE启动子驱动的hFcγRI基因，第二个盒是由SV40晚期启动子驱动的新霉素磷酸转移酶II(npt)基因，其赋予针对G418的抗性。

表达hFcγRI的CHO K1衍生体的构建。使用Lipofectamine^TM(Life Technologies；Rockville,MD)按照制造商的建议利用pTE084转染CHO K1细胞(4x 10⁶)。将细胞置于包含500μg/ml G418(LifeTechnologies)的培养基(10％胎牛血清、90％Ham’s F-12、2mM L-谷氨酰胺；所有试剂均来自Life Technologies,Rockville,MD)中15天。将在G418选择中存活下来的细胞进行胰蛋白酶化、合并并用FITC-缀合的人IgG Fc片段(FITC-hFc；Jackson ImmunoResearchLaboratories,West Grove,PA)进行染色。简要地，将在10cm培养板上生长的细胞用不含氯化钙和氯化镁的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(PBS)(Life Technologies)洗涤一次。添加3毫升0.25％胰蛋白酶(LifeTechnologies)至每个板中。旋转板直到细胞从板分离为止。立即添加10毫升培养基至每个分离的细胞的板中。随后通过在1,000x g下离心4分钟来收集细胞。在除去上清液后，将细胞重悬于4ml的在培养基中稀释的2μg/ml FITC-hFc中。随后将细胞置于摇床上并在室温染色一小时。为了除去未结合的FITC-hFc，将细胞用20ml PBS洗涤两次。通过流式细胞术在MOFLO^TM细胞分选仪(Cytomation；Fort Collins,CO)上测量细胞上FITC-hFc标记的程度。FITC-hFc不使模拟转染的亲代CHO K1细胞染色，但在G418抗性的pTE084转染的库中产生荧光分布。将来自经选择的库的前1％最多荧光的细胞通过流式细胞术以1个细胞/孔置于96孔板中。9天后，将96孔板中的88个细胞克隆扩增至24孔板中。3天后，将各个孔中的细胞用1ml PBS洗涤一次，用0.5ml的2μg/ml FITC-hFc染色1小时，用1ml PBS洗涤两次并在荧光显微镜下检查细胞表面染色。将33个最多荧光的克隆进行选择、扩增并随后通过流式细胞术进行筛选。

通过添加IgG阻断分泌的蛋白在细胞间的表达细胞和非表达细胞之间的扩散：由于hFcγRI克隆细胞系中的所有细胞均表达细胞表面hFcγRI，因此它们均具有结合IgG或由IgG的Fc结构域组成的融合蛋白的能力。因为hFcγRI结合来自许多物种的IgG(van de Winkeland Anderson,1991)，所以测试了一组动物IgG的阻断包含人IgG1(hIgG1)Fc标签的蛋白(4SC622)与hFcγRI表达细胞的结合的能力。4SC622是由融合至随后融合至hIgG1-Fc结构域的hIL-4Rγ胞外结构域的IL-2Rγ胞外结构域组成的嵌合分子。在此实验中，将RGC1(选自已用pTE084稳定转染的CHO K1细胞系的hFcγRI表达细胞系)的培养物用1μg/ml 4SC622在来自不同物种的1mg/ml IgG存在或不存在的情况下于37℃组织培养恒温箱中温育18小时。

按照对于使用FITC-hFC的细胞染色概述的程序，用特异于4SC622的hIL-2Rγ组分的藻红蛋白缀合的小鼠IgG1单克隆AG184(PE-AG184)(BD Pharmingen；San Diego,CA)对经洗涤的细胞进行染色后，通过流式细胞术测定4SC622的细胞表面结合。

发现hIgG完全阻断了4SC622与RGC1的表面上表达的hFcγRI的结合。大鼠、兔和狗来源的IgG也有效阻断结合但牛和绵羊来源的IgG不能阻断。外源添加的大鼠IgG阻断外源添加的hIgG1 Fc-标记的蛋白(4SC622)与细胞表面hFcγRI的结合的能力暗示大鼠IgG还可阻断以不同水平表达hIgG1 Fc-标记的蛋白的细胞之间的转移。为了测试此，从RGC1产生了两种可通过绿色荧光蛋白(EGFP)的存在或不存在进行区分的细胞系。简要地，为了用EGFP标记RGC1细胞，用0.5mg编码由磷酸甘油酸激酶启动子驱动的潮霉素B磷酸转移酶基因的PTE073和5mg编码由CMV-MIE启动子驱动的EGFP基因的pRG816-EGFP共转染2x 10⁶个RGC1细胞。用200μg/ml潮霉素B(Sigma；St.Louis,MO)选择转染的细胞两周。通过流式细胞术分离绿色荧光细胞。将一个EGFP和hFcγRI-表达克隆RGC2用于细胞混合实验。用于这些实验的其它细胞系RGC4通过用质粒pEE14.1-622稳定转染RGC1来产生。pEE14.1-622是其中4SC622的表达由CMV-MIE启动子驱动并且包含谷氨酰胺合成酶微基因(其赋予对类似物蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine，MSX)的抗性并允许选择稳定整合事件)的质粒。RGC4细胞在细胞表面上表达hFcγRI并且分泌hIgG1 Fc-标记的蛋白4SC622。在用PE-AG184进行染色之前，将一个平板的包含50％RGC2和50％RGC4细胞的混合细胞用1mg/ml大鼠IgG温育18小时，随后通过流式细胞术进行检查。RGC2细胞的EGFP荧光显示RGC2细胞也结合外源添加的4SC622(1μg/ml)，如通过PE-AG184荧光的增加所显示的。RGC4在EGFP门中不发荧光。显著地，外源添加的大鼠IgG不减少针对细胞表面4SC622阳性染色的RGC4细胞的百分比，暗示4SC622与hFcγRI的结合发生在蛋白被转移至细胞表面的时候。当RGC2和RGC4细胞被混合时，从RGC4细胞分泌的4SC622蛋白在培养基中积累并且结合大多数RGC2细胞。然而，1mg/ml大鼠IgG的添加显著减少了结合4SC622的RGC2细胞的百分比，表明大鼠IgG阻断了分泌的hIgG1Fc-标记的蛋白从表达细胞至非表达细胞的转移。

实施例2：细胞表面荧光与4SC622的表达水平相关

用pEE14.1-622转染RGC1细胞(4x 10⁶)，在包含10％经透析的胎牛血清、90％不含谷氨酰胺的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)、1x GS补充物和25μM MSX(所有试剂均来自JRHBiosciences,Lenexa,KS)的培养基中选择2周后，获得稳定转染子库。在免疫染色前18小时将大鼠IgG加入到培养基中至1mg/ml。将细胞胰蛋白酶化、用PBS洗涤，并用1.5μg/ml的多克隆FITC-缀合的抗-人IgG(H+L)F(ab’)₂片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories)按照如实施例1中针对FITC-hFc染色所描述的程序在室温染色1小时。随后通过流式细胞术分析细胞染色。荧光的分布暗示所选择的库包含具有广泛范围的4SC622表达水平的细胞。将针对其免疫荧光最高的3％(R3类别)、7-11％(R5类别)和15-19％(R7类别)的细胞分选至3个不同的库中并扩增9天。通过基于免疫的Pandex测定(Idexx；Westbrook,ME)按照制造商的推荐在3天的生长后测量培养基中的细胞数量和4SC622水平来测定这些库的平均4SC622产量/细胞。在Pandex测定中，将用山羊抗-人IgG,g-链特异性抗体(Sigma)涂覆的fluoricon聚苯乙烯测定颗粒用于从培养基捕获4SC622，并将FITC-缀合的山羊抗-人IgG,Fc特异性(Sigma)用于检测结合小珠的4SC622。将已知量的纯化的4SC622包含在测定中用于校准。发现最高的3％、7-11％和15-19％库中的细胞分别以1.42、0.36和0.22pg/细胞/天产生4SC622。因此，在细胞表面4SC622染色和特定蛋白产生之间存在相关性。此结果暗示以高水平表达4SC622的个体细胞可通过分离被多克隆FITC-缀合的抗-人IgG(H+L)F(ab’)₂片段最亮地染色的细胞来获得。

实施例3：RGC1中的表达克隆的分离：IL-4捕获

为了直接证明本发明方法学产生具有高水平的分泌蛋白产生的克隆细胞系的有效性，从RGC1产生了克隆性4SC622产生细胞系。用pEE14.1-622转染RGC1细胞(4x 10⁶)，并用25μM MSX选择2周以获得稳定转染子库。合并MSX-抗性细胞并在用PE-AG184染色前用1mg/ml人IgG温育18小时。分离并扩增来自如通过细胞表面4SC622染色的流式细胞术分析测定的最高的5％门的6个细胞。测定来自所述6个克隆系的4SC622产生，并将其与来自通过手挑所选择的集落随后通过稀释克隆和扩增获得的克隆的4SC622产生进行比较。一个RGC1来源的克隆RGC4以12pg/细胞/天产生4SC622。这个水平与通过手挑和分析2700个克隆所分离的最好的4SC622生产者的水平相似。因此，与手挑集落相比，本发明概述的方法学证实在高生产者的筛选和克隆中是远更高效的。

VEGF捕获。质粒pTE080和pTE081编码用于VEGF捕获的基因hVEGF-R1R2和hVEGF-R1R3。hVEGF-R1R2是由融合至随后融合至hIg1FC结构域的hVEGFR2的第二Ig结构域的hVEGFR1的第一Ig结构域组成的嵌合分子。hVEGF-R1R3是由融合至随后融合至hIgG1-Fc结构域的hVEGFR3的第二Ig结构域的hVEGFR1的第一Ig结构域组成的嵌合分子。在这些质粒中，用于VEGF捕获的基因由CMV-MIE启动子驱动并且表达赋予对MSX的抗性的谷氨酰胺合成酶微基因用于选择稳定整合事件。将RGC1细胞用这些质粒的任一种进行转染并生长在包含25μM MSX的培养基中进行2周以选择其中已稳定整合质粒的细胞。将MSX-抗性细胞用0.1μg/ml IgG2a和小鼠IgG3温育18小时，随后用1.5μg/ml多克隆FITC-缀合的抗-人IgG(H+L)F(ab’)₂片段进行染色。将细胞染色1小时随后在流式细胞术之前用PBS洗涤2次。从其荧光在最高的1％之间的细胞库中分选单个细胞至96孔组织培养板中。扩增各个孔中的细胞并通过Pandex测定来确定其生产率。表达hVEGF-R1R2和hVEGF-R1R3两者的RGC来源的克隆相较于最高表达的手挑MSX-抗性集落具有更高的单位生产率并通过筛选较少的克隆进行分离。参见表1。

实施例4：细胞表面结合的hIgG1 Fc-标记的蛋白被RGC1内化

已知hFcγRI诱导其细胞表面结合配体的内化。为了分析RGC1细胞是否能够内化细胞表面结合的4SC622，将1μg/ml 4SC622添加至RGC1细胞进行1小时，并随后立即处理细胞用于使用PE-AG184的4SC622免疫染色和流式细胞术分析。93％的细胞针对细胞表面4SC622阳性染色。可选择地，将1μg/ml 4SC622添加至RGC1细胞进行1小时，随后洗涤细胞并将其在不含4SC622的培养基中用PE-AG184温育18小时。在针对4SC622的免疫染色之后的流式细胞术分析显示9％的细胞将4SC622保持在细胞表面上。为了进一步表征表面结合的4SC622的丢失，将纯化的4SC622蛋白添加至RGC1和亲代CHO K1细胞的培养基中，随后随时间过去测量培养基中4SC622的水平。添加到10cm平板中的培养基中至2μg/ml的4SC622在3天的温育后在RGC1条件培养基中相较于CHO K1对照显著更低。这些结果显示hFcγRI在细胞表面上的存在减少了培养基中4SC622的浓度。结果暗示4SC622从培养基的损耗是hFcγRI-4SC622复合物内化的结果。受体-配体复合物的内化可促进在18小时封闭步骤期间在封闭性IgG的存在下从非表达细胞有效去除所有的4SC622。

实施例5：具有诱导性的hFcγRI表达的CHO K1细胞系的构建

利用hFcγRI的基于流式细胞术的自体分泌捕获(FASTR^TM)法允许快速分离高表达克隆。然而，如果hFcγRI介导Fc-标记的蛋白的代谢回转，那么如果可在生产期间抑制hFcγRI表达则通过工程化hFcγRI表达细胞所实现的分泌蛋白的产生会更高。为此，构建了其中hFcγRI的表达由四环素或类似物多西环素诱导的CHO K1细胞系。在此系统中，首先将CHO K1细胞工程化以表达四环素抑制因子蛋白(TetR)并将hFcγRI置于其活性受TetR调控的启动子的转录控制之下。将两个串联的TetR操纵子(TetO)紧接地置于pTE084中CMV-MIE启动子/增强子的下游以产生pTE158。pTE158中hFcγRI从CMV-MIE启动子的转录在四环素或某一其它适当诱导剂不存在的情况下受到TetR的阻断。在诱导剂存在的情况下，TetR蛋白不能够结合TetO，从而发生hFcγRI的转录。

用pcDNA6/TR转染CHO K1细胞，pcDNA6/TR是赋予针对杀稻瘟菌素的抗性的质粒，其中TetR的表达起源于CMV-MIE启动子。在用2.5μg/ml杀稻瘟菌素(Invitrogen)选择2周后，合并稳定的转染子。随后将此库用pTE158转染，pTE158是赋予针对G418的抗性的质粒，其中hFcγRI的表达依赖于CMV-MIE/TetO杂合启动子。将用pcDNA6/TR和pTE158连续转染的细胞用400μg/ml G418和2.5μg/ml杀稻瘟菌素选择12天随后进行合并。通过添加1μg/ml多西环素来将该库诱导2天随后用FITC-hFc进行染色以鉴定表达hFcγRI的细胞。将表达hFcγRI的细胞的最高的5％收集为库，在多西环素不存在的情况下扩增6天，并再次针对hFcγRI的存在用FITC-hFc进行染色。收集未针对hFcγRI染色的细胞并在包含1μg/ml多西环素的培养基中扩增3天。随后针对hFcγRI的存在对该库进行染色并通过流式细胞术进行分离。以1个细胞/孔将表达最高水平的hFcγRI的细胞(最高的1％)分选在96孔板上。这些细胞推测包含具有低的非诱导表达水平的FcγR1和高的诱导水平的hFcγRI的细胞。在扩增后，20个克隆中多西环素对hFcγRI的诱导通过使用FITC-hFc的免疫染色和流式细胞术进行确认。将一个克隆选择用于进一步的表征并命名为RGC10。

在多西环素不存在的情况下，RGC10不表达可检测水平的hFcγRI，而在用1μg/ml多西环素诱导3天的细胞中观察到高水平的hFcγRI。RGC10细胞的平均荧光在多西环素诱导后增加超过1000倍。

实施例6：4SC622产生细胞系从RGC10的分离

用pEE14.1-622转染RGC10细胞，并在用25mM MSX选择2周后合并MSX-抗性细胞。通过将1μg/ml多西环素添加至培养基中进行3天来诱导hFcγRI的表达。将1mg/ml大鼠IgG添加至含有多西环素的培养基中，18小时后，用多克隆FITC-缀合的抗-人IgG(H+L)F(ab’)₂片段进行染色并通过流式细胞术进行分析。以1个细胞/孔将表达最高水平的4SC622的细胞(最高的1％)分选在96孔板上。在不通过多西环素诱导hFcγRI表达的情况下，用多克隆FITC-缀合的抗-人IgG(H+L)F(ab’)₂片段进行的染色不能检测到细胞表面结合的4SC622。将60个克隆在多西环素不存在的情况下进行扩增。通过Pandex测定来确定13个最高生产者的单位生产率。克隆1C2的单位生产率为17.8pg/细胞/天，显著优于针对先前使用非调控hFcγRI细胞系RGC1分离的最好的4SC622细胞系所观察到的12pg/细胞/天。

实施例7：Sp2/0骨髓瘤细胞可被工程化以表达细胞表面捕捉蛋白

在此实施例中，将Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞系工程化以稳定表达hFcγRI以证明自体分泌捕获法可适用于非CHO的细胞系。将用于hFcγRI的基因通过逆转录病毒感染引入骨髓瘤细胞中。将质粒pLXRN(Clontech；Palo Alto,CA)用于产生编码hFcγRI基因的逆转录病毒，pLXRN是其中目标基因可从上游的Moloney鼠肉瘤病毒长末端重复(MoMuSV LTR)启动子表达的逆转录病毒DNA载体。将来自pTE084的编码人FcγRI基因的1363bp Xho I片段克隆至pLXRN的Xho I位点中。选择其中hFcγRI cDNA表达依赖于MoMuSV LTR的质粒并命名为pTE255。

基本上按照制造商的指导产生用于hFcγRI的表达的泛嗜性逆转录病毒。用各10mg的pVSV-G和pTE255共转染包装细胞系GP-293，其是稳定表达病毒gag和pol蛋白的基于HEK 293的细胞系(Clontech；Palo Alto,CA)。质粒pVSV-G允许表达赋予对感染颗粒的广泛宿主范围的病毒包膜蛋白VSV-G。

Sp2-hFcγRI-4的构建。将泛嗜性hFcγRI逆转录病毒以约10个感染颗粒/细胞的多重性用于感染1x10⁷ Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞(American Type Culture Collection；Manassas,VA)。感染后3天，将细胞染色1小时随后用PBS洗涤2次，随后通过流式细胞术进行分析。将如通过结合的FITC-hFc所显示的表达hFcγRI的那些细胞通过流式细胞术收集为库。将该库扩增13天随后再次用FITC-hFc进行染色并通过流式细胞术将表达hFcγRI的细胞收集为库。将这些经分选的细胞培养在具有4.5g/l葡萄糖和4mM谷氨酰胺的10％胎牛血清、90％Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)中进行3周，用FITC-hFc染色，并通过单细胞分选克隆具有群体的最高的1％的平均荧光的细胞。在扩增后，如上所述，通过流式细胞术检查24个克隆的hFcγRI的表达，并选择一个克隆Sp2-hFcγRI-4用于另外的表征。

表达4SC622蛋白的Sp2-hFcγRI-4细胞的分离。用pTE209转染Sp2-hFcγRI-4细胞(1x 10⁷)，pTE209是允许4SC622从CMV-MIE启动子组成型表达并赋予针对潮霉素的抗性的质粒。将转染的细胞置于包含10％FCS、90％D-MEM和400μg/ml潮霉素的培养基中进行14天。将潮霉素抗性细胞用1mg/ml兔IgG温育18小时，随后用多克隆FITC-缀合的抗-人IgG(H+L)F(ab’)₂片段进行染色。将细胞染色1小时随后用PBS洗涤2次，随后通过流式细胞术进行分析。将标记的细胞通过流式细胞术收集为库随后培养5天并如上所述进行分选。随后通过单细胞分选克隆来自结合最多的多克隆FITC-缀合的抗-人IgG(H+L)F(ab’)₂片段的扩增库(最高的1％群体)的细胞。通过ELISA分析4SC622从10个克隆的产生，发现所有10个克隆均表达4SC622；克隆5H11以0.5pg/细胞/天产生4SC622。这些数据显示通过自体分泌捕获法从来源于用pTE209对Sp2-hFcγRI-4细胞进行稳定转染的异质细胞库有效分离了分泌4SC622的克隆。

为了确认4SC622被自体地呈现在表达4SC622和hFcγRI两者的骨髓瘤细胞的表面上，用1mg/ml兔IgG温育克隆5H11进行18小时随后用FITC-缀合的抗-人IgG(H+L)F(ab’)₂片段进行染色，并发现其呈现细胞表面4SC622。分泌的蛋白在其中交叉供给被兔IgG阻断的条件下被呈现，证实了4SC622的自体呈现。这些数据显示上述自体分泌捕获法不限制于CHO细胞并且可扩展至骨髓瘤以及其它的细胞类型。

实施例8：蛋白G嵌合蛋白可用作细胞表面捕捉蛋白

为了证明自体分泌捕获法对非hFcγRI的细胞表面捕捉蛋白的适用性，构建了表达蛋白G的细胞系。蛋白G来自于链球菌属(Streptococcus)菌株G148，其结合所有的人和小鼠IgG子类，并且其本身具有用于分离表达抗体或IgG Fc融合蛋白的重组细胞的效用。为了证明蛋白G IgG Fc结合结构域可用作能够结合所有人和小鼠IgG子类的细胞表面捕捉蛋白，我们构建了表达包含融合至hFcγRI跨膜和胞内结构域的蛋白G的Fc结合结构域的嵌合蛋白的CHO系。蛋白G的Fc结合结构域包含具有55个氨基酸长度的3个同源重复序列(Guss et al.,(1986)EMBO 5:1567 and Sjobring et al.,(1991)J.Biol.Chem.266:399)并且每个重复序列能够结合一个IgG Fc。为了改善CHO细胞中此嵌合蛋白的表达，我们构建了其中来自小鼠ROR1基因的信号序列被融合至蛋白G的Fc结合结构域(氨基酸303至497)(登录号#X06173)(SEQ ID NO:1)的合成DNA。此合成DNA通过寡核苷酸退火、填缝和PCR扩增的组合来产生。随后通过PCR将合成DNA融合至编码hFcγRI(登录号M21091)的跨膜和胞内结构域(氨基酸279至374)(SEQ ID NO:2)的DNA。将所得的编码蛋白G/hFcγRI嵌合蛋白的DNA克隆至pTE158中CMV-MIE启动子的下游，取代编码hFcγRI的基因，以产生质粒pTE300。

用pTE300转染被适应于在无血清培养基中生长的CHO K1细胞系RGC14，在3天后，将400μg/ml G418添加至培养基以选择pTE300的稳定整合。在开始选择2周后，用FITC-hFc染色细胞以鉴定表达hFcγRI的细胞。通过流式细胞术分析这些细胞并将表达hFcγRI的细胞收集为库。将细胞扩增10天并通过流式细胞术再次分离表达hFcγRI的细胞群。再次将细胞扩增、用FITC-hFc染色，并通过流式细胞术分离表达高水平的蛋白G/hFcγRI嵌合蛋白的单个细胞。将针对FITC-hFc结合阳性染色的单个细胞分选至由10％胎牛血清、90％Ham’s F12和400μg/ml G418组成的培养基中。在2周的温育后，通过用FITC-缀合的抗-牛IgG F(ab’)₂片段(Jackson ImmunoResearchLaboratories,West Grove,PA)进行染色来检查48个克隆的对存在于培养基中的牛IgG的结合。将用此抗体阳性染色的1个克隆RGC18选择用于进一步的表征。

RGC18中表达克隆的分离：用pTE209转染RGC18细胞(6x10⁶)，并通过在400μg/ml潮霉素中生长18天来选择质粒的整合。将潮霉素抗性的细胞用1mg/ml兔IgG温育18小时，随后用多克隆FITC-缀合的抗-人IgG(H+L)F(ab’)₂片段进行染色。将细胞染色1小时随后用PBS洗涤2次，随后通过流式细胞术进行分析。通过单细胞分选分离最多荧光的细胞(最高的5％)并扩增3周。检查了10个克隆的4SC622分泌。所有测试的克隆均以高水平分泌4SC622，并且最好的克隆RGC19具有6.4pg/细胞/天的单位生产率。这个结果证实通过自体分泌捕获法从来源于用pTE209对RGC18的稳定转染的异质细胞库有效分离的4SC622表达细胞。此外，这些数据清楚地显示蛋白G的片段可被工程化以包含信号序列和跨膜结构域并用作细胞表面捕捉蛋白。

为了确认4SC622被自体地呈现在表达蛋白G/hFcγRI嵌合蛋白和4SC622两者的RGC19细胞的表面上，用1mg/ml兔IgG温育RGC19进行18小时随后用FITC-缀合的抗-人IgG(H+L)F(ab’)₂片段进行染色并通过流式细胞术进行分析。发现RGC19细胞在其中交叉供给被兔IgG阻断的这些条件下具有细胞表面4SC622，表面4SC622的自体呈现。兔IgG有效阻断了外源4SC622蛋白与RGC18细胞的结合，但不阻断4SC622在表达4SC622的细胞的细胞表面上的呈现。这些数据证实蛋白G/hFcγRI嵌合蛋白的性质与作为细胞表面捕捉蛋白的hFcγRI的性质是相似的，并且暗示自体分泌捕获法可使用其它的蛋白作为细胞表面捕捉蛋白。

实施例9：抗体产生细胞从RGC10的分离

为了证明自体分泌捕获法对于分离表达重组抗体的CHO细胞系的效用，我们克隆了编码来自KD5杂交瘤的可变轻链和可变重链基因的DNA。KD5是表达特异于人Tie-2受体的单克隆抗体的杂交瘤。

从500ng小鼠脾polyA+RNA(Clontech,Palo Alto,CA)克隆小鼠IgG恒定区基因序列。使用用于RT-PCR的SuperScript第一链合成系统利用50ng随机六聚物来引发(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)以合成单链cDNA。通过PCR使用引物5’mCLK1(Z37499)(5’-CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTC-3’)(SEQ ID NO:3)和3’mCLK1(Z37499)(5’-ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG-3’)(SEQID NO:4)从此cDNA扩增小鼠κ轻链恒定DNA序列(登录号#Z37499)。还通过PCR使用引物5’mCH2a(AJ294738)(5’-GCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCAC-3’)(SEQ ID NO:5)和3’mCH2a(AJ294738)(5’-TCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTTAGTCG-3’)(SEQ ID NO:6)从此cDNA扩增小鼠IgG2a恒定区DNA序列(登录号#AJ294738)。使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)将PCR产物克隆至pCR2.1-TOPO中并验证了恒定区的序列。

使用来自Amersham-Pharmacia Biotech(Piscataway,NJ)的重链和轻链可变区引物混合物，通过RT-PCR从KD5杂交瘤mRNA扩增KD5可变区基因并将其克隆至pCR2.1-TOPO中。使用pCR2.1-TOPO克隆的可变区作为模板，利用引物5’BspMI/KD5VH N-term(5’-GAGAGTACCTGCGTCATGCAGATGTGAAACTGCAGGAGTCTGGCCCT-3’)(SEQ ID NO:7)和3’BspMI/KD5VH C-term(5’-GAGAGACCTGCGTCAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3’)(SEQ ID NO:8)PCR扩增可变重链基因，用BspMI消化并连接至BsaI消化的IgG2a恒定重链基因PCR片段，所述gG2a恒定重链基因PCR片段用引物5’BsaI/CH2a N-term(5’-GAGAGGGTCTCACAGCCAAAACAACAGCCCCATCG-3’)(SEQ ID NO:9)和3’BsaI/CH2a C-term(5’-GAGAGGGTCTCCGGCCGCTCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAA-3’)(SEQ ID NO:10)扩增而来。随后将此片段连接至pRG882的BspMI和NotI位点中。所得的质粒pTE317能够从CMV-MIE启动子表达融合至mROR1信号序列的KD5重组重链基因。使用pCR2.1-TOPO克隆的可变区作为模板，利用引物5’BsmBI/KD5VL N-term(5’-GAGAGCGTCTCATGCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3’)(SEQ ID NO:11)和3’BsmBI/KD5VL C-term(5’-GAGAGCGTCTCACAGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3’)(SEQ IDNO:12)PCR扩增可变轻链基因，用BsmBI消化并连接至BsaI消化的κ恒定轻链基因PCR片段，所述κ恒定轻链基因PCR片段用引物5’BsaI/CLK N-term(5’-GAGAGGGTCTCAGCTGATGCTGCACCAACTGTATCC-3’)(SEQ ID NO:13)和3’BsaI/CLK C-term(5’-GAGAGGGTCTCAGGCCGCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTGAC-3’)(SEQ ID NO:14)扩增而来。随后将此片段连接至pRG882的BspMI和NotI位点中。所得的质粒pTE316能够从CMV-MIE启动子表达融合至mROR1信号序列的KD5重组轻链基因。

将来自pTE317的编码KD5重链基因的1450bp EcoRI-NotI片段克隆至pRG980的EcoRI和NotI位点中以产生质粒pTE322，pRG980是赋予对潮霉素的抗性并且允许针对UbC启动子的重组基因表达的载体。类似地，将来自pTE316的编码KD5轻链基因的750bpEcoRI-NotI片段克隆至pRG985的EcoRI和NotI位点中以产生质粒pTE324，pRG985是赋予对嘌呤霉素的抗性并且允许针对UbC启动子的重组基因表达的载体。用3μg pTE322和3μg pTE322转染RGC10细胞(5x10⁶)，并使用20μg嘌呤霉素和400μg/ml潮霉素通过在补充有10％胎牛血清的F12培养基中生长14天来选择质粒的整合。通过将1μg/ml多西环素添加至培养基中进行3天来诱导hFcγRI的表达。将双抗性细胞用1mg/ml兔IgG温育18小时，随后用山羊多克隆FITC-缀合的抗-小鼠IgG(Fcγ)F(ab’)₂片段(JacksonImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)进行染色。将细胞染色1小时随后用PBS洗涤2次随后通过流式细胞术进行分析。将最多荧光的细胞(最高的5％)分离为库并扩增10天，随后重复进行该方案但将最高的1％的最多荧光的细胞分离为库。将此库扩增10天随后将最高的0.1％的最多荧光的细胞分离为单个细胞至96孔板中。通过ELISA分析克隆的抗体表达并从53个经分析的克隆中选择7个克隆。这些克隆的平均单位生产率为35pg/细胞/天，最好的克隆以54pg/细胞/天表达重组的KD5单克隆抗体。

实施例10：FASTR^TM筛选不受CSCP表达水平的影响

为了证明CSCP的表达水平不显著影响分离表达相关的sPOI的细胞，比较了两个不同宿主细胞系(各自表达相同的CSCP但以高水平或低水平表达CSCP)中针对相同sPOI的FASTR^TM筛选。

通过稳定整合pTE158针对hFcγRI的高水平表达选择了FASTR^TM宿主细胞系RGC10，并发现其包含40个hFcγRI整合的基因拷贝。从CHO K1在稳定转染和针对单拷贝基因整合进行选择后产生了新的细胞系RS527，其以低水平表达hFcγRI蛋白。如通过FASTR^TM细胞系的全细胞裂解物的Western印迹分析所测定的，RS527细胞表达比RGC10细胞显著更少的hFcγRI蛋白。

简要地，用pTE462转染RGC10和RS527细胞，pTE462是能够表达分泌的hFc-融合蛋白Rc1-hFc并赋予对潮霉素的抗性的质粒。将转染的培养物用潮霉素选择2周。将潮霉素抗性细胞用1μg/ml多西环素(Dox)诱导并用兔IgG封闭过夜，随后进行如本文中描述的FASTR^TM法。第二天，通过特异于hFc的FITC-缀合的抗体对RGC10/pTE462和RS527/pTE462进行染色并随后通过流式细胞术进行分析。将分别具有低、中等和高的荧光的3个细胞库R4、R5和R6标记细胞从每个宿主系中进行分选并在组织培养中进行扩增。

为了比较来自6个细胞库的Rc1-hFc蛋白产生水平，针对每个库使用相等数量的细胞建立了6个培养物。3天后，收集条件培养基。通过ELISA测定条件培养基中的Rc1-hFc蛋白滴度并针对各个细胞库的平均荧光进行作图。对于RGC10和RS527宿主系，在所分离的细胞库的平均荧光(呈现在细胞表面上的Rc1-hFc的量)和sPOI蛋白产生水平之间存在相似的相关性。最显著地，在来源于RGC10和RS527的两个高荧光R6库中的sPOI滴度是相似的。这些数据证实FASTR^TM宿主细胞系中CSCP的表达水平不显著影响该宿主用于基于sPOI的表达水平分离转染细胞的用途。

实施例11：Tie2受体作为细胞表面捕捉蛋白

非FcγR1的细胞表面捕捉蛋白(CSCP)可用于本文中描述的方法。在此实施例中，Tie2受体用作为CSCP并被用于分离表达从特异性结合Tie2受体的胞外结构域的C1b单克隆抗体产生的Tie特异性的ScFv_C1b-Fc融合蛋白的细胞。尽管用于ScFv_C1b-Fc的CSCP可以是hFcgRI，本实施例证明Tie2也可用作用于ScFv_C1b-Fc的CSCP。

为了构建诱导性的Tie2CSCP细胞系，首先用TetR质粒pcDNA6/TR稳定转染CHO K1。随后用pTE259稳定转染杀稻瘟菌素抗性的细胞库，pTE259是允许包含Tie2的胞外结构域和跨膜结构域的蛋白的诱导性表达的质粒。在用特异于Tie2的抗体染色后通过流式细胞术分离诱导性细胞克隆。将RGC54克隆选择来研究FASTR^TM用于ScFv_C1b-Fc的表达的可行性。

用pTE988稳定转染RGC54细胞，pTE988是能够表达分泌的hFc-融合蛋白ScFv_C1b-Fc并且赋予对潮霉素的抗性的质粒。将转染的培养物用潮霉素选择2周。将潮霉素抗性的细胞用Dox进行诱导并用1mg/ml的纯化的C1b mAb进行封闭。C1b单克隆抗体是ScFv_C1b-Fc中可变区的来源。第二天，通过特异于hFc的FITC-缀合的抗体对细胞库进行染色并随后通过流式细胞术进行分析。分选了分别具有高、中等和低的荧光的3个细胞库R6、R7和R8标记细胞并在组织培养中进行扩增。针对每个库使用相等数量的细胞建立了3个培养物以确定如通过ELISA测定的ScFv_C1b-Fc蛋白产生。在所分离的细胞库的平均荧光(呈现在细胞表面上的与Tie2结合的ScFv_C1b-Fc的量)和ScFv_C1b-Fc蛋白产生水平之间存在相关性。

这些数据显示非hFcγRI的CSCP可用作为CSCP，并且还暗示任何受体可通过去除其胞质结构域而被转化至CSCP。这些数据还证实抗原可被制造为CSCP并用于FASTR^TM筛选表达抗原特异性的抗体相关分子的细胞。

实施例12：使用具有低亲和力的CSCP:sPOI配对的有效FASTR^TM筛选

血管生成素-1是Tie2受体的配体。包含血管生成素-1受体结合结构域和hFc的嵌合蛋白(FD1-hFc)以174nM的亲和常数结合Tie2，如通过BIAcore^TM测定的。分别将FD1-hFc和Tie2选择为sPOI和CSCP以确定CSCP和sPOI之间的最小亲和力是否是FASTR^TM筛选所需要的。

在细胞点缀实验中，外源添加的FD1-hFc通过Tie2特异性结合至RGC54细胞。为了确定Tie2和FD1-hFc之间的亲和力是否足以允许FASTR^TM筛选，用pTE942稳定转染RGC54细胞，pTE942是能够表达分泌的hFc-融合蛋白FD1-hFc并且赋予对潮霉素的抗性的质粒。将转染的培养物用潮霉素选择2周。将潮霉素抗性的细胞用Dox进行诱导并用1mg/ml的纯化的包含小鼠IgG1 Fc的FD1-mFc进行封闭。第二天，通过特异于hFc的FITC-缀合的抗体对细胞库进行染色并随后通过流式细胞术进行分析。收集了分别具有高、中等和低的荧光的3个细胞库R6、R7和R8标记细胞。针对每个库使用相等数量的细胞建立了培养物以确定条件培养基中的如通过ELISA测定的FD1-hFc蛋白产生水平。在所分离的细胞库的平均荧光(与细胞表面结合的Tie2结合的FD1-Fc)和FD1-hFc蛋白产生水平之间存在相关性。具有最高荧光的库产生最多的FD1-hFc。

这些数据证实具有低亲和力(174nM KD)的CSCP:sPOI配对可用于有效的FASTR^TM筛选。重要的是，FD1-Fc:Tie2结合的解离t_1/2低于2分钟，表明任何具有可测量亲和力的CSCP:sPOI配对可用于FASTR^TM筛选。此外，此实验还显示非FcγRI受体可用作CSCP来分离表达其配体的细胞。

实施例12：跨膜结构域至ScFv上的融合产生功能性CSCP

CSCP可以是任何具有对于sPOI的可测量亲和力的细胞表面结合的蛋白。为了证明此，通过将来自PDGF受体的跨膜结构域融合至包含来自鼠κ链特异性单克隆抗体HB58的可变区的ScFv来构建了完全合成的CSCP。构建了表达此嵌合蛋白(ScFv_HB58-TM_PDGFR)的FASTR^TM宿主并将其用于分离表达血管生成素-2FD结构域特异性P12抗体的细胞。

来源于CHO K1的RS655细胞系组成型地表达ScFv_HB58-TM_PDGFR。表达ScFv_HB58-TM_PDGFR的细胞可通过用P12 mAb、FD2-hFc连续温育来染色，并且被HB58ScFv捕捉到细胞表面上的FITC-缀合的抗-hIgG-P12通过其对于FD2的亲和力来进行检测，所述FD2进而通过hFc标签的识别来进行检测。RS656细胞来源于在用编码eYFP的基因的质粒进行稳定转染后的RS655细胞。接近100％的RS656细胞是eYFP阳性的，并且大多数(76％)保持ScFv_HB58-TM_PDGFR的表达，如通过与FD2-hFc的结合所检测的。

用pTE693稳定转染RS655细胞，pTE693是能够表达P12抗体的重链和轻链并且赋予对嘌呤霉素的抗性的质粒。将转染的培养物用嘌呤霉素选择2周以产生对于P12 mAb表达为异质性的细胞库(RS655/pTE693)。

为了确定ScFv_HB58-TM_PDGFR是否可用作CSCP并促进抗体产生细胞与非生产者的分离，将相等数量的RS656细胞和RS655/pTE693细胞混合并进行共培养。当允许从RS655/pTE693细胞表达的P12进行扩散并结合至RS656细胞表面上的ScFv_HB58时，黄色细胞的大量群体也针对FD2-hFc的结合是阳性的。然而，如果RS656表面上的ScFv_HB58与过量的鼠IgG结合，那么只有非黄色细胞针对FD2-hFc的结合是阳性的，表明有效分离了表达细胞与非表达细胞。

这些数据证实ScFv可通过将其靶向至细胞膜而被制作为功能性CSCP。数据还显示FASTR^TM允许用抗体的抗原来检测表达分泌的抗体的细胞。

实施例13：包含T细胞受体可变区的目标蛋白

以与制备表达目标蛋白的细胞系相似的方式制定用于分离表达目标蛋白(其为TCR-Fc)的细胞系的高表达克隆的基于流式细胞术的自体分泌捕获(FASTR^TM)法。通过筛选在其表面上呈现结合至hFcγRI的目标TCR-Fc的细胞来鉴定高表达克隆。

在这些实施例中，使用了包含诱导性FcγR1作为细胞表面捕捉分子的CHO K1细胞系RGC10。通过将TCR可变区在框内地克隆至人Fc区(直接地在框内地或使用TCR可变区和人Fc区之间的接头序列来进行)来使得RGC10表达重组的TCR-Fc。

为了产生作为包含Fc-连接的TCR α可变结构域和Fc-连接的TCR β可变结构域的二聚体的目标蛋白，用两种载体转染RGC10：能够表达具有人Fc序列的TCR α可变结构域融合蛋白的第一载体，和能够表达具有相同的人Fc序列的TCR β结构域融合蛋白的第二载体。每个载体包含在针对TCR可变区的5’的前导序列(例如分泌信号序列)和作为药物抗性基因的可选择标记。在每个载体转染之后，通过适当的药物选择来选择包含载体的细胞。该选择导致具有第一和第二载体两者的RGC10细胞系。表达目标蛋白的细胞可通过针对β可变结构域的抗体、针对α可变结构域的抗体和针对Fc结构域的抗体中的一种或多种来进行检测。

为了产生作为包含融合至Fc的α和βTCR可变结构域的二聚体的目标蛋白，用如下构建的编码目标蛋白的单个载体转染RGC10：前导序列(例如分泌信号序列)，之后是融合至接头的TCR可变β结构域，其中所述接头进而融合至TCR可变α结构域，其进而融合至Fc序列。可选择地，可如下构建单个载体：前导序列(例如分泌信号序列)，之后是融合至接头的TCR可变α结构域，其中所述接头进而融合至TCR可变β结构域，其进而融合至Fc序列。表达目标蛋白的细胞可通过针对β可变结构域的抗体、针对α可变结构域的抗体和针对Fc结构域的抗体中的一种或多种来进行检测。

为了产生如上所述的目标蛋白，其还包含TCRα和/或TCRβ恒定结构域，将TCR可变结构域(α或β)融合至TCR恒定结构域(例如TCR可变结构域α被融合至TCR恒定结构域α，并且TCR可变结构域β被融合至TCR恒定结构域β)，并将TCR可变+恒定结构域直接地或通过接头融合至Fc结构域。表达目标蛋白的细胞可通过针对β可变结构域的抗体、针对α可变结构域的抗体和针对Fc结构域的抗体中的一种或多种来进行检测。

通过使用针对α可变结构域的抗体、针对β可变结构域的抗体、针对α恒定结构域的抗体、针对β恒定结构域的抗体和针对Fc结构域的抗体中的一种或多种，使用与在本文中描述的分离4SC622产生细胞系中所使用的相同的程序来分离表达期望量的TCR-Fc的细胞。将表达最高水平的TCR-Fc的细胞选择为TCR-Fc产生细胞系。

实施例14：用于分离多种IgG同种型和双特异性抗体的基于ScFv的CSCP

用人IgG4蛋白的Fc片段(hFc或简单地Fc；SEQ ID NO:26)或包含二肽突变的人ΔAdpFc多肽(IMGT的H95R、Y96F；也称作为Fc*；SEQ ID NO:42)免疫其中其基因组的免疫球蛋白重链VDJ区和免疫球蛋白κ链VJ区被人直向同源物替换的遗传修饰的小鼠(即小鼠；参见美国专利No.7,105,348，将其通过引用整体并入本文)。从小鼠获得单克隆抗体并针对其结合Fc、Fc*或包含Fc和/或Fc*的抗体的能力进行筛选。将3种能够结合Fc的抗体(Ab1,Ab2,Ab3)和3种能够结合Fc*的抗体(Ab4,Ab5,Ab6)针对其结合具有下列形式中的一种的分子的能力进行测试：Fc/Fc、Fc/Fc*(其可以是双特异性抗体)和Fc*/Fc*。

在Biacore2000仪器上进行测量以测定结合亲和力和动力学常数。将抗体(Ab1-Ab8的每一个)捕捉在抗-小鼠-Fc感受器表面(Mab捕捉形式)上，并将人Fc(SEQ ID NO 26)同二聚体、人Fc*同二聚体(SEQID NO:42)或Fc/Fc*异二聚体注射在表面上。动力学缔合(k_a)和解离(k_d)速率常数通过使用Scrubber 2.0曲线拟合软件将数据处理和拟合至1:1结合模型来测定。将结合解离平衡常数(K_D)和解离半衰期(t_1/2)从动力学速率常数计算为：K_D(M)＝k_d/k_a；和t_1/2(分钟)＝(ln2/(60*k_d)。如表2中所显示的，抗体具有3种不同的类别：Fc特异性，Fc*特异性，以及在Fc和Fc*之间显示无区别的那些(非特异性)。Fc特异性抗体取决于氨基酸His95和/或Tyr96，因为这些抗体不结合具有二肽突变(H95R,Y96F)的人Fc*。相反Fc*特异性抗体取决于Arg 95和/或Phe 96，因为这些抗体不结合野生型人Fc。

实施例15：产生Ab2和Ab2-来源的ScFv-FcγR融合蛋白的细胞系

将Fc特异性Ab2的重链和轻链进行测序。为了产生重组的Ab2抗体，构建了编码重链的表达载体质粒并构建了编码轻链的表达载体质粒。这两种质粒使得能够在CHO细胞中表达和分泌各自的亚基。为了表达抗体，将这两种质粒转染至CHO-K1细胞中并分离稳定转化子。抗体链的表达由组成型CMV启动子驱动。

表2：抗体的亲和力-表面等离子体共振研究

将重链和轻链序列用于开发抗-Fc ScFv表面捕捉分子。为了产生编码Ab2-来源的抗-Fc ScFv-FcγR表面捕捉分子，将Ab2免疫球蛋白重链可变结构域(SEQ ID NO:15)和Ab2免疫球蛋白轻链可变结构域(SEQ ID NO:16)氨基酸序列进行逆翻译并进行密码子最优化用于CHO细胞表达。类似地，将人FcγRI的C-末端部分进行密码子最优化用于CHO细胞表达。将经密码子最优化的核苷酸序列通过聚合酶链式反应扩增并连接以形成编码SEQ ID NO:19的ScFv-FcγR融合蛋白的连续核酸序列(SEQ ID NO:20)。

使用标准PCR和限制性内切酶克隆技术将编码ScFv-FcγR-TM-cyto融合蛋白的核酸插入表达载体中。所得的环状质粒(示例于SEQ ID NO:23中)包含β-内酰胺酶-编码核酸序列和两个操纵子。第一个操纵子包含由SV40启动子驱动的与新霉素抗性标记在框内的编码黄色荧光蛋白(YFP)(绿色荧光蛋白的变体)的核酸序列(例如,SEQ ID NO:24)。第二个操纵子(其为了本发明此方面的目的而是载体的“商业-末端(business-end)”)包含由hCMV-IE启动子和hCMV内含子驱动的编码经密码子最优化的ScFv-FcγR融合蛋白的核酸序列(例如,SEQ ID NO:25)。

用SEQ ID NO:23的质粒转染CHO-K1细胞。分离已将SEQ IDNO:22的线性构建体整合至其基因组中的稳定整合体。

环状质粒包含两个侧接第一操纵子和第二操纵子的Lox位点以允许将那些操纵子作为线性构建体整合至宿主细胞的基因组中。从第一Lox位点跨越至第二Lox位点的线性构建体示例于SEQ ID NO:22中并且从5’至3’包含：SV40启动子，编码新霉素抗性的核酸，IRES，编码eYFP的核酸，SV40多腺苷酸化序列，hCMV-IE启动子，hCMV内含子，Tet-操纵基因序列(用于ScFv-FcγR-TM-cyto融合蛋白的受控表达)，编码mROR信号序列的核酸，编码Ab2ScFv的核酸，编码FcγR跨膜和胞质部分(SEQ ID NO:21)的核酸，和SV40多腺苷酸化序列。

实施例16：ScFv-FcγR-TM-cyto表面捕捉靶

用编码不同亚型的抗体(例如IgG1、IgG2、IgG4、包含一个具有95R/435R-96F/436F双置换的CH3结构域而另一个CH3结构域是野生型的IgG4双特异性抗体(IgG4 Fc/Fc*)和IgG1 Fc/Fc*形式的IgG1双特异性抗体)的质粒转染包含整合的SEQ ID NO:22的序列的CHO-K1细胞。用多西环素处理细胞以诱导捕捉分子以及抗体的产生。在抗体和捕捉分子的共表达后，在一些情况下用hFc封闭蛋白以及检测分子(FITC-标记的抗-hFab)处理细胞。表3概述了结果，并总体上显示了ScFv-FcγR表面捕捉融合蛋白结合IgG4、IgG2和IgG1分子，而野生型FcγR表面捕捉分子结合IgG1，但不结合IgG4或IgG2。

表3：封闭分子竞争测定

¹+Dox²–Dox

实施例17：产生Ab6和Ab6-来源的ScFv*-FcγR-TM-cyto的细胞系

将Fc*特异性Ab6的重链和轻链进行测序。轻链的氨基酸序列被测定为SEQ ID NO:41。重链的氨基酸序列被测定为SEQ ID NO:40。为了产生重组的Ab6抗体，构建了编码重链的表达载体质粒并构建了编码轻链的表达载体质粒。为了表达抗体，将这两种质粒转染至CHO-K1细胞中，分离稳定转化子，并且表达由组成型CMV启动子驱动。

为了产生编码Ab6-来源的抗-Fc*-特异性ScFv*-FcγR表面捕捉分子，将Ab6抗体的免疫球蛋白重链可变结构域(SEQ ID NO:38)和Ab6的免疫球蛋白轻链可变结构域(SEQ ID NO:39)氨基酸序列进行逆翻译并进行密码子最优化用于CHO细胞表达。类似地，将人FcγRI的C-末端部分(SEQ ID NO:21)进行密码子最优化用于CHO细胞表达。将经密码子最优化的核苷酸序列通过聚合酶链式反应扩增并连接以形成编码抗-Fc*ScFv*-FcγR融合蛋白(SEQ ID NO:43)的连续核酸序列(SEQ ID NO:45)。

使用标准PCR和限制性内切酶克隆技术将编码ScFv*-FcγR-TM-cyto融合蛋白的核酸插入表达载体中。所得的环状质粒(示例于SEQ ID NO:44中)包含β-内酰胺酶-编码核酸序列和两个操纵子。第一个操纵子包含由SV40启动子驱动的与新霉素抗性标记在框内的编码黄色荧光蛋白(YFP)(绿色荧光蛋白的变体)的核酸序列(例如,SEQ ID NO:46)。第二个操纵子(其为了本发明此方面的目的而是载体的“商业-末端”)包含由hCMV-IE启动子和hCMV内含子驱动的编码经密码子最优化的抗-Fc*ScFv-FcγR融合蛋白的核酸序列(例如,SEQ ID NO:47)。

用SEQ ID NO:44的质粒转染CHO-K1细胞。分离已整合了SEQID NO:48的线性构建体的稳定整合体。

环状质粒包含两个侧接第一操纵子和第二操纵子的Lox位点以允许将那些操纵子作为线性构建体整合至宿主细胞的基因组中。从第一Lox位点跨越至第二Lox位点的线性构建体示例于SEQ ID NO:48中并且从5’至3’包含：SV40启动子，编码新霉素抗性的核酸，IRES，编码eYFP的核酸，SV40多腺苷酸化序列，hCMV-IE启动子，hCMV内含子，Tet-操纵基因序列(用于抗-Fc*ScFv*-FcγR融合蛋白的受控表达)，编码mROR信号序列的核酸，编码Ab6-来源的抗-Fc*特异性ScFv*的核酸，编码FcγR跨膜和胞质部分(SEQ ID NO:21)的核酸，和SV40多腺苷酸化序列。

实施例18：分选双特异性抗体

抗-Fc捕捉&抗-Fc*检测

将Ab2-来源的抗-Fc-特异性ScFv-FcγR表面捕捉系统针对其检测和富集产生双特异性抗体的细胞的能力进行测试。为了评价检测双特异性抗体(其在一个CH3结构域中具有95R/435R-96F/436F置换(被命名为Fc*))的能力，使用hFc作为封闭分子和FITC-标记的Ab6抗-Fc*抗体(例如，具有SEQ ID NO:40的HC和SEQ ID NO:41的LC的mAb)作为检测分子，在Ab2-来源的抗-Fc-特异性ScFv-FcγR表面捕捉细胞系中表达多种抗体。Ab2-来源的抗-Fc-特异性ScFv-FcγR表面捕捉细胞系能够使用Fc*-特异性Ab6作为检测分子来相对于任何Fc*/Fc*或Fc/Fc单特异性抗体检测和区分双特异性抗体(Fc/Fc*)(表4)。野生型FcγR表面捕捉细胞系不能够区分Fc/Fc*、Fc*/Fc*和Fc/Fc IgG4种类，因为FcγR不能够结合或以非常低的亲和力结合IgG4。

抗-Fc*捕捉&抗-Fc检测

相反地，将Ab6-来源的抗-Fc*-特异性ScFv*-FcγR表面捕捉系统针对其检测和富集产生双特异性抗体的细胞的能力进行测试。为了评价检测双特异性抗体(其在一个CH3结构域中具有95R/435R-96F/436F置换(被命名为Fc*))的能力，使用hFc作为封闭分子和Alexa 488-标记的Ab2抗-Fc抗体(其识别未经置换的CH3)为检测分子，在Ab6-来源的抗-Fc*-特异性ScFv*-FcγR表面捕捉细胞系中表达多种抗体。Ab6-来源的抗-Fc*-特异性ScFv*-FcγR表面捕捉细胞系能够使用Fc-特异性Ab2作为检测分子来相对于Fc*/Fc*或Fc/Fc单特异性抗体检测和区分双特异性抗体(Fc/Fc*)(表4)。FcγR表面捕捉细胞系不能够区分Fc/Fc*、Fc*/Fc*和Fc/Fc IgG4种类。

表4：双特异性抗体的检测-平均荧光强度(MFI)

¹细胞表面捕捉蛋白 ²检测分子

实施例19：Fc/Fc*双特异性抗体的富集

为了评估(Ab2-来源的)ScFv-FcγR CSCP/(Ab6)抗-Fc*DM和(Ab6-来源的)ScFv*-FcγR CSCP/(Ab2)抗-Fc DM分选和富集双特异性抗体的能力，使用hFc作为封闭分子以及FITC-标记的抗-Fc*(Ab6)抗体作为检测分子，使共表达Fc/Fc*IgG4单克隆抗体(IgG4-mAb-2)和抗-Fc ScFv-FcγR融合蛋白的细胞系经历连续的荧光激活细胞分选和合并以富集Fc/Fc*种类的产生。将来自第五和第六系列库的产生Fc/Fc*的细胞针对总抗体滴度和每种抗体形式(Fc/Fc*、Fc/Fc和Fc*/Fc*)的滴度进行分析。由于细胞编码了编码未经置换的CH3结构域(“Fc”，即在IMGT位置95上包含组氨酸并在IMGT位置96上包含酪氨酸)的重链和编码经置换的CH3结构域(“Fc*”，即在IMGT位置95上包含精氨酸并在IMGT位置96上包含苯丙氨酸)的重链，因此通过纯数学庞尼特方格分析，理论上期望细胞产生25％Fc/Fc、50％Fc/Fc*和25％Fc*/Fc*。然而，在生物学上可期望(富集前)大多数被产生的抗体是Fc/Fc。

如表5中所显示的，经选择、合并和富集了双特异性抗体产生的细胞产生多至49％的Fc/Fc*种类，其中Fc/Fc*双特异性抗体的滴度为至少约3.2g/L。

表5：Fc/Fc*双特异性抗体IgG4-mAb-2的富集

尽管前述发明已通过举例说明和实施例的方式详细地进行了描述，但将对于本领域技术人员显而易见的是可对本发明的教导进行某些改变和修饰而不背离所附权利要求的精神或范围。

Claims

1.重组的抗原结合蛋白，其结合人IgG1-Fc结构域、人IgG2-Fc结构域或人IgG4-Fc结构域。

2.权利要求1的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的多肽。

3.权利要求1或权利要求2的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以在表面等离子体共振测定中测量的低于约40nM的K_D结合多肽。

4.权利要求1-3中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含重链可变区(HCVR)或轻链可变区(LCVR)的一个或多个互补决定区(CDR)，所述重链可变区(HCVR)具有与SEQID NO:15至少95％同一的氨基酸序列，所述轻链可变区(LCVR)具有与SEQ ID NO:16至少95％同一的氨基酸序列。

5.权利要求1-4中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR-1(HCDR-1)、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HCDR-2、具有SEQID NO:29的氨基酸序列的HCDR-3、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链CDR-1(LCDR-1)和具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LCDR-2。

6.权利要求1-5中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含具有与SEQ ID NO:15至少95％同一的氨基酸序列的HCVR和具有与SEQ ID NO:16至少95％同一的氨基酸序列的LCVR。

7.权利要求1-6中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCVR和具有SEQID NO:16的氨基酸序列的LCVR。

8.权利要求1-7中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是ScFv融合蛋白，其包含：(a)包含与SEQ ID NO:15至少95％同一的氨基酸序列的重链可变结构域，(b)包含与SEQ ID NO:16至少95％同一的氨基酸序列的轻链可变结构域，和(c)包含与SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:21至少95％同一的氨基酸序列的膜锚定结构域。

9.权利要求1-8中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是ScFv融合蛋白，其包含具有与SEQ ID NO:15相同的氨基酸序列的重链可变结构域和具有与SEQ ID NO:16相同的氨基酸序列的轻链可变结构域。

10.权利要求1-9中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的ScFv融合蛋白。

11.重组的抗原结合蛋白，其结合至与下述抗体相同的经置换的CH3多肽上的表位，所述抗体包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR-1(HCDR-1)、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HCDR-2、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR-3、具有SEQ IDNO:30的氨基酸序列的轻链CDR-1(LCDR-1)和具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LCDR-2。

12.分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-11中任一项的抗原结合蛋白的核酸序列。

13.权利要求12的分离的多核苷酸，其中所述核酸编码包含SEQID NO:19的氨基酸序列的多肽。

14.核酸载体，其包含：

(a)权利要求12或13的多核苷酸；

(b)启动子，其有效连接至所述多核苷酸；和

(c)多腺苷酸化序列。

15.权利要求14的核酸载体，其中所述启动子是CMV启动子。

16.权利要求14或15的核酸载体，其包含编码可选择标记的核酸。

17.权利要求16的核酸载体，其中所述可选择标记提供新霉素抗性。

18.权利要求14-17中任一项的核酸载体，其包含编码能量转移蛋白的核酸。

19.权利要求18的核酸载体，其中所述能量转移蛋白是绿色荧光蛋白的衍生物。

20.权利要求19的核酸载体，其中所述绿色荧光蛋白的衍生物是黄色荧光蛋白(“YFP”)。

21.权利要求14-20中任一项的核酸载体，其中所述载体是环状的。

22.权利要求14-20中任一项的核酸载体，其中所述载体是线性的。

23.权利要求22的核酸载体，其中所述载体整合至宿主细胞的基因组中。

24.权利要求14-23中任一项的核酸载体，其中所述宿主细胞是CHO细胞。

25.表达权利要求1-11中任一项的抗原结合蛋白的宿主细胞。

26.权利要求25的宿主细胞，其中所述细胞是CHO细胞。

27.特异性结合经置换的CH3多肽的重组的抗原结合蛋白，所述经置换的CH3多肽包含选自下列的一种或多种氨基酸置换：根据IMGT外显子编号系统的(a)95R和(b)95R和96F，或者根据EU编号系统的(a’)435R和(b’)435R和436F。

28.权利要求27的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的多肽。

29.权利要求27或28的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以在表面等离子体共振测定中测量的低于约60nM的K_D结合所述多肽。

30.权利要求27-29中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含重链可变区(HCVR)或轻链可变区(LCVR)的一个或多个互补决定区(CDR)，所述重链可变区(HCVR)具有与SEQ ID NO:38至少95％同一的氨基酸序列，所述轻链可变区(LCVR)具有与SEQ ID NO:39至少95％同一的氨基酸序列。

31.权利要求27-30中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链CDR-1(HCDR-1)、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HCDR-2、具有SEQID NO:34的氨基酸序列的HCDR-3、具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR-1(LCDR-1)、具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的LCDR-2和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的LCDR-3。

32.权利要求27-31中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含具有与SEQ ID NO:38至少95％同一的氨基酸序列的HCVR和具有与SEQ ID NO:39至少95％同一的氨基酸序列的LCVR。

33.权利要求27-32中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HCVR和具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的LCVR。

34.权利要求27-33中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是抗体，其包含含有与SEQ ID NO:40至少95％同一的氨基酸序列的重链和含有与SEQ ID NO:41至少95％同一的氨基酸序列的轻链。

35.权利要求27-34中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中抗体包含具有与SEQ ID NO:40相同的氨基酸序列的重链和具有与SEQID NO:41相同的氨基酸序列的轻链。

36.权利要求27-33中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是ScFv融合蛋白，其包含：(a)包含与SEQ ID NO:38至少95％同一的氨基酸序列的重链可变结构域，(b)包含与SEQ IDNO:39至少95％同一的氨基酸序列的轻链可变结构域，和(c)膜锚定结构域。

37.权利要求27-33和36中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是ScFv融合蛋白，其包含具有与SEQ ID NO:38相同的氨基酸序列的重链可变结构域和具有与SEQ ID NO:39相同的氨基酸序列的轻链可变结构域。

38.权利要求27-33、36和37中任一项的重组的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的ScFv融合蛋白。

39.重组的抗原结合蛋白，其与下述抗体结合至经置换的CH3多肽上的相同表位，所述抗体包含具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链CDR-1(HCDR-1)、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HCDR-2、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HCDR-3、具有SEQ IDNO:35的氨基酸序列的轻链CDR-1(LCDR-1)、具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的LCDR-2和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的LCDR-3。

40.分离的多核苷酸，其包含编码权利要求27-39中任一项的抗原结合蛋白的核酸序列。

41.权利要求40的分离的多核苷酸，其中所述核酸编码包含SEQID NO:40的氨基酸序列的多肽。

42.权利要求40的分离的多核苷酸，其中所述核酸编码包含SEQID NO:41的氨基酸序列的多肽。

43.权利要求40的分离的多核苷酸，其中所述核酸编码包含SEQID NO:43的氨基酸序列的多肽。

44.核酸载体，其包含：

(a)权利要求40-43中任一项的多核苷酸；

(b)启动子，其有效连接至所述多核苷酸；和

(c)多腺苷酸化序列。

45.权利要求44的核酸载体，其中所述启动子是CMV启动子。

46.权利要求44或45的核酸载体，其包含编码可选择标记的核酸。

47.权利要求46的核酸载体，其中所述可选择标记提供新霉素抗性。

48.权利要求44-47中任一项的核酸载体，其包含编码能量转移蛋白的核酸。

49.权利要求48的核酸载体，其中所述能量转移蛋白是绿色荧光蛋白的衍生物。

50.权利要求49的核酸载体，其中所述绿色荧光蛋白的衍生物是黄色荧光蛋白(“YFP”)。

51.权利要求44-50中任一项的核酸载体，其中所述载体是环状的。

52.权利要求44-50中任一项的核酸载体，其中所述载体是线性的。

53.权利要求52的核酸载体，其中所述载体整合至宿主细胞的基因组中。

54.权利要求44-53中任一项的核酸载体，其中所述宿主细胞是CHO细胞。

55.表达权利要求27-39中任一项的抗原结合蛋白的宿主细胞。

56.权利要求55的宿主细胞，其中所述细胞是CHO细胞。

57.检测或分离稳定表达异二聚体蛋白的细胞的方法，其包括下列步骤：

(a)在宿主细胞中表达细胞表面捕捉蛋白(CSCP)和异二聚体蛋白，其中(i)所述CSCP结合至所述异二聚体蛋白上的第一位点以在所述宿主细胞内部形成CSCP-异二聚体蛋白复合物，(ii)所述CSCP-异二聚体蛋白复合物转运穿过所述宿主细胞，和(iii)随后呈现在所述宿主细胞的表面上；

(b)将所述宿主细胞与检测分子接触，其中所述检测分子结合至所述异二聚体蛋白上的第二位点；和

(c)选择结合所述检测分子的宿主细胞。

58.权利要求57的方法，其包括在步骤(c)的选择宿主细胞之前使所述细胞与封闭分子接触的步骤，其中所述封闭分子与未结合至所述异二聚体蛋白的CSCP结合，但不与所述CSCP-异二聚体蛋白复合物结合。

59.权利要求57或58的方法，其中所述选择步骤(c)通过荧光激活细胞分选来进行。

60.权利要求57-59中任一项的方法，其中所述异二聚体蛋白包含多个亚基，并且所述异二聚体蛋白上的所述第一位点位于第一亚基上，所述异二聚体蛋白上的所述第二位点位于第二亚基上。

61.权利要求60的方法，其中所述异二聚体蛋白包括抗体。

62.权利要求61的方法，其中所述抗体上的所述第一位点位于包含野生型CH3结构域的重链上。

63.权利要求57-62中任一项的方法，其中所述抗体上的所述第一位点位于包含CH3结构域的重链上，所述CH3结构域在根据IMGT外显子编号系统的位置95上包含组氨酸残基并且在根据IMGT外显子编号系统的位置96上包含酪氨酸残基。

64.权利要求57-63中任一项的方法，其中所述CSCP包括结合人IgG1-Fc结构域、人IgG2-Fc结构域或人IgG4-Fc结构域的重组的抗原结合蛋白。

65.权利要求57-64中任一项的方法，其中所述抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的多肽。

66.权利要求57-65中任一项的方法，其中所述抗原结合蛋白包括蛋白A或蛋白A的功能性片段。

67.权利要求66的方法，其中所述抗原结合蛋白是包含蛋白A的Fc结合结构域的嵌合蛋白。

68.权利要求67的方法，其中所述嵌合蛋白包含蛋白A的Fc结合结构域和膜锚定物。

69.权利要求68的方法，其中所述嵌合蛋白包含蛋白A的Fc结合结构域和Fc受体的跨膜结构域。

70.权利要求57-64中任一项的方法，其中所述抗原结合蛋白以在表面等离子体共振测定中测量的低于约40nM的K_D结合多肽。

71.权利要求57-70中任一项的方法，其中所述CSCP包括ScFv融合蛋白，所述ScFv融合蛋白包含：(a)包含与SEQ ID NO:15至少95％同一的氨基酸序列的重链可变结构域，(b)包含与SEQ ID NO:16至少95％同一的氨基酸序列的轻链可变结构域，和(c)膜锚定结构域。

72.权利要求71的方法，其中所述检测分子(DM)包括抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:38至少95％同一的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含与SEQ ID NO:39至少95％同一的氨基酸序列的轻链可变结构域。

73.权利要求57-59中任一项的方法，其中所述CSCP包括包含ScFv融合蛋白的抗原结合蛋白，所述ScFv融合蛋白包含：(a)包含与SEQ ID NO:38至少95％同一的氨基酸序列的重链可变结构域，(b)包含与SEQ ID NO:39至少95％同一的氨基酸序列的轻链可变结构域，和(c)膜锚定结构域。

74.权利要求73的方法，其中所述检测分子(DM)包括抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包括包含与SEQ ID NO:15至少95％同一的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含与SEQ ID NO:16至少95％同一的氨基酸序列的轻链可变结构域。

75.权利要求57-74中任一项的方法，其中所述封闭分子是非人IgG或人Fc分子。

76.检测和分离产生高水平的异二聚体蛋白的细胞的方法，其包括：

(a)用编码细胞表面捕捉蛋白(CSCP)的核酸转染细胞，所述CSCP是包含膜锚定结构域的融合蛋白并且能够结合异二聚体蛋白的第一亚基，其中所述细胞表达所述异二聚体蛋白；

(b)检测(a)的以高产率表达所述CSCP的细胞；

(c)分离和培养所述以高产率表达所述CSCP的细胞；

(d)用检测分子检测步骤(c)的所述分离和培养的细胞的表面上的异二聚体蛋白，所述检测分子结合所述异二聚体蛋白的第二亚基；和

(e)分离在步骤(d)中检测的在其表面上具有被检测的异二聚体蛋白的细胞。

77.权利要求76的方法，其中所述异二聚体蛋白包括抗体。

78.权利要求76或77的方法，其中所述异二聚体蛋白的所述第一亚基包括包含野生型CH3结构域的重链结构域。

79.权利要求76-78中任一项的方法，其中所述异二聚体蛋白的所述第一亚基包括包含CH3结构域的重链，所述CH3结构域在根据IMGT外显子编号系统的位置95上具有组氨酸残基并且在根据IMGT外显子编号系统的位置96上具有酪氨酸残基。

80.权利要求76-79中任一项的方法，其中所述CSCP包括结合人IgG1-Fc结构域、人IgG2-Fc结构域或人IgG4-Fc结构域的重组的抗原结合蛋白。

81.权利要求76-80中任一项的方法，其中所述重组的抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的多肽。

82.权利要求76-81中任一项的方法，其中所述重组的抗原结合蛋白包括蛋白A或蛋白A的功能性片段。

83.权利要求82的方法，其中所述重组的抗原结合蛋白是包含蛋白A的Fc结合结构域的融合蛋白。

84.权利要求82或83的方法，其中所述融合蛋白包含蛋白A的Fc结合结构域和膜锚定物。

85.权利要求82-84中任一项的方法，其中所述融合蛋白包含蛋白A的Fc结合结构域和Fc受体的跨膜结构域。

86.权利要求76-81中任一项的方法，其中所述重组的抗原结合蛋白以在表面等离子体共振测定中测量的低于约40nM的K_D结合所述多肽。

87.权利要求76-81中任一项的方法，其中所述重组的抗原结合蛋白包含重链可变区(HCVR)或轻链可变区(LCVR)的一个或多个互补决定区(CDR)，所述重链可变区(HCVR)具有与SEQ ID NO:15至少95％同一的氨基酸序列，所述轻链可变区(LCVR)具有与SEQID NO:16至少95％同一的氨基酸序列。

88.权利要求76-81或87中任一项的方法，其中所述重组的抗原结合蛋白包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR-1(HCDR-1)、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HCDR-2、具有SEQID NO:29的氨基酸序列的HCDR-3、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链CDR-1(LCDR-1)和具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LCDR-2。

89.权利要求76-81、87或88中任一项的方法，其中所述重组的抗原结合蛋白与下述抗体结合至CH3结构域上的相同表位，所述抗体包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR-1(HCDR-1)、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HCDR-2、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR-3、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链CDR-1(LCDR-1)和具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LCDR-2。

90.权利要求76-81或87-89中任一项的方法，其中所述抗原结合蛋白包含具有与SEQ ID NO:15至少95％同一的氨基酸序列的HCVR和具有与SEQ ID NO:16至少95％同一的氨基酸序列的LCVR。

91.权利要求76-81或87-90中任一项的方法，其中所述抗原结合蛋白包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCVR和具有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的LCVR。

92.权利要求76-81中任一项的方法，其中所述CSCP是ScFv融合蛋白，其包含：(a)包含与SEQ ID NO:15至少95％同一的氨基酸序列的重链可变结构域，(b)包含与SEQ ID NO:16至少95％同一的氨基酸序列的轻链可变结构域，和(c)包含与SEQ ID NO:17或SEQ IDNO:21至少95％同一的氨基酸序列的膜锚定结构域。

93.权利要求76-81或92中任一项的方法，其中所述CSCP是ScFv融合蛋白，其包含具有与SEQ ID NO:15相同的氨基酸序列的重链可变结构域和具有与SEQ ID NO:16相同的氨基酸序列的轻链可变结构域。

94.权利要求76-81、92或93中任一项的方法，其中所述CSCP是包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的ScFv融合蛋白。

95.权利要求76-94中任一项的方法，其中所述异二聚体蛋白的所述第二亚基包括包含CH3结构域的重链，所述CH3结构域在根据IMGT外显子编号系统的位置95上包含精氨酸残基并且在根据IMGT外显子编号系统的位置96上包含苯丙氨酸残基。

96.权利要求95的方法，其中所述检测分子(DM)包括被标记的重组的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白结合人IgG1-Fc结构域、人IgG2-Fc结构域或人IgG4-Fc结构域，其中所述Fc结构域在根据IMGT外显子编号系统的位置95上包含精氨酸残基并且在根据IMGT外显子编号系统的位置96上包含苯丙氨酸残基。

97.权利要求95或96的方法，其中所述检测分子包括被标记的抗-人IgG F(ab’)2。

98.权利要求96或97的方法，其中所述被标记的重组的抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的多肽。

99.权利要求96-98中任一项的方法，其中所述被标记的重组的抗原结合蛋白以在表面等离子体共振测定中测量的低于约60nM的K_D结合所述多肽。

100.权利要求96-99中任一项的方法，其中所述被标记的重组的抗原结合蛋白包含重链可变区(HCVR)或轻链可变区(LCVR)的一个或多个互补决定区(CDR)，所述重链可变区(HCVR)具有与SEQ ID NO:38至少95％同一的氨基酸序列，所述轻链可变区(LCVR)具有与SEQ ID NO:39至少95％同一的氨基酸序列。

101.权利要求96-100中任一项的方法，其中所述被标记的重组的抗原结合蛋白包含具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链CDR-1(HCDR-1)、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HCDR-2、具有SEQID NO:34的氨基酸序列的HCDR-3、具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR-1(LCDR-1)、具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的LCDR-2和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的LCDR-3。

102.权利要求96-101中任一项的方法，其中所述被标记的重组的抗原结合蛋白包含具有与SEQ ID NO:38至少95％同一的氨基酸序列的HCVR和具有与SEQ ID NO:39至少95％同一的氨基酸序列的LCVR。

103.权利要求96-102中任一项的方法，其中所述被标记的重组的抗原结合蛋白包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HCVR和具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的LCVR。

104.权利要求96-103中任一项的方法，其中所述被标记的重组的抗原结合蛋白是被标记的抗体，其包含含有与SEQ ID NO:40至少95％同一的氨基酸序列的重链和含有与SEQ ID NO:41至少95％同一的氨基酸序列的轻链。

105.权利要求104的方法，其中所述被标记的抗体包含具有与SEQ ID NO:40相同的氨基酸序列的重链和具有与SEQ ID NO:41相同的氨基酸序列的轻链。

106.权利要求76-78中任一项的方法，其中所述异二聚体蛋白的所述第一亚基包括包含CH3结构域的重链结构域，所述CH3结构域在根据IMGT外显子编号系统的位置95上具有精氨酸残基并且在根据IMGT外显子编号系统的位置96上具有苯丙氨酸残基，并且所述异二聚体蛋白的所述第二亚基包括包含CH3结构域的重链结构域，所述CH3结构域在根据IMGT外显子编号系统的位置95上具有组氨酸残基并且在根据IMGT外显子编号系统的位置96上具有酪氨酸残基。

107.权利要求106的方法，其中所述CSCP包括ScFv融合蛋白，其包含：(a)包含与SEQ ID NO:38至少95％同一的氨基酸序列的重链可变结构域，(b)包含与SEQ ID NO:39至少95％同一的氨基酸序列的轻链可变结构域，和(c)膜锚定结构域。

108.权利要求107的方法，其中所述ScFv融合蛋白包含具有与SEQ ID NO:38相同的氨基酸序列的重链可变结构域和具有与SEQ IDNO:39相同的氨基酸序列的轻链可变结构域。

109.权利要求107或108的方法，其中所述ScFv融合蛋白包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。

110.权利要求106-109中任一项的方法，其中所述检测分子(DM)包括被标记的重组的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含重链可变区(HCVR)或轻链可变区(LCVR)的一个或多个互补决定区(CDR)，所述重链可变区(HCVR)具有与SEQ ID NO:15至少95％同一的氨基酸序列，所述轻链可变区(LCVR)具有与SEQ ID NO:16至少95％同一的氨基酸序列。

111.权利要求110的方法，其中所述被标记的重组的抗原结合蛋白包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR-1(HCDR-1)、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HCDR-2、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR-3、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链CDR-1(LCDR-1)和具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LCDR-2。

112.权利要求106的方法，其中所述检测分子(DM)包括被标记的重组的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白与下述抗体结合至CH3结构域上的相同表位，所述抗体包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR-1(HCDR-1)、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HCDR-2、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR-3、具有SEQ IDNO:30的氨基酸序列的轻链CDR-1(LCDR-1)和具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LCDR-2。

113.权利要求112的方法，其中所述被标记的抗原结合蛋白包含具有与SEQ ID NO:15至少95％同一的氨基酸序列的HCVR和具有与SEQ ID NO:16至少95％同一的氨基酸序列的LCVR。

114.权利要求112或113的方法，其中所述被标记的抗原结合蛋白包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCVR和具有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的LCVR。

115.权利要求76-114中任一项的方法，其中所述封闭分子是非人IgG或人Fc分子。